CN1759179A - 形成复合物的方法 - Google Patents

Abstract

一种形成由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物的方法，其特征在于包括下述步骤：将双链核酸与至少一种寡核苷酸混合，制备反应混合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员以及一个核糖核苷酸并且具有与如上所述双链核酸的两条链之一的碱基序列基本互补的序列的嵌合寡核苷酸；以及将所述反应混合物在上述双链核酸不变性的条件下保温，以形成复合物。

Description

形成复合物的方法

技术领域

本发明涉及在遗传工程领域有用的形成由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物的方法、在核酸上创建复制起点的方法和复制核酸的方法。

背景技术

分子生物学领域的研究进展带来了各种各样的研究技术。其中，核酸杂交技术是相当有用的技术，使得可以对目标核酸进行检测和定量，除应用于分子生物学领域外，已经以适合于相应目的的方式应用于各个领域。

从根本上讲，杂交是相互互补的单链核酸进行碱基配对的反应。因此，必需首先将双链核酸分离(变性)为两条单链，以便在双链核酸和单链核酸之间杂交，或者在双链核酸之间杂交。使用加热或碱处理进行变性。然而，在存在蛋白质等的情况下实施这种处理而不损失蛋白质的活性是不可能。

此外，在使用双链核酸杂交的过程中，以一定的频率形成原始双链核酸是不可避免的。

已知在未变性双链核酸和单链核酸之间可以形成三链螺旋(Nucleic Acids Research，16：11431-11440(1988))。然而，这样的三链螺旋形成的应用限于由特定序列、即高嘌呤含量的序列和高嘧啶含量的序列形成的双链核酸区。

已知在参与同源重组的RecA蛋白存在下，在非变性条件下形成双链核酸和单链核酸的复合物。然而，这种现象基于RecA蛋白的活性，并且已知没有非酶促形成相似复合物的技术。

对于基因工程领域的研究而言，用于保持或扩增分离的核酸分子的技术是必不可少的。通常通过将分离的核酸插入到合适的载体中，制备重组DNA分子，来完成保持或扩增。这样一种重组DNA分子可以以分离状态或者包含在合适的宿主中而稳定地保持。此外，必要时，通过培养带有所述重组DNA分子的宿主以增加细胞数，有可能增加分子数。

已知许多衍生于质粒、噬菌体、病毒等的载体。另外，已经开发了经人工修饰而具有适合其用途的各种功能的载体，并且这种载体是市售的。

宿主的利用对于用载体保持或扩增基因是必不可少的。因此，难以构建其中目标核酸分子加入到载体中的重组DNA分子，例如当目标核酸分子对宿主有害时(例如当载体含有编码使宿主致死的产物的基因时)。

可以考虑在无宿主介导的情况下，通过在宿主细胞外(即在体外)复制重组DNA分子而扩增目标核酸分子。然而，由于每种已知的载体都通过固有的机制从确定的复制起点开始复制，因此不知道人工复制核酸分子的通用方法。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种无需变性而形成由双链核酸和单链核酸构成的复合物的方法、和一种不用宿主生物体而复制核酸分子的方便的通用方法。

发明概要

作为深入研究的结果，本发明人发现，含有核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸在体外退火于未变性的双链核酸上，形成复合物，所述复合物在所述核酸上充当复制起点，并且所述核酸可以从该复制起点开始复制。从而完成了本发明。

本发明的第一个方面涉及一种形成由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物的方法，所述方法包括：

(a)将双链核酸与至少一种寡核苷酸混合，制备反应混合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸，并且具有与所述双链核酸的两条链之一的核苷酸序列基本互补的序列；且

(b)将所述反应混合物在所述双链核酸不变性的条件下保温，以形成复合物。

在第一方面中使用的双链核酸的实例包括线性DNA、环状DNA和基因组DNA。

所述寡核苷酸可以用作引物，来合成与所述双链核酸的两条链之一互补的DNA，和/或可以将其标记。

本发明的第二个方面涉及一种检测具有靶核苷酸序列的双链核酸的方法，所述方法包括：

(a)按照第一方面的方法，形成由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸，并且具有与靶核苷酸序列基本互补的序列；且

(b)检测形成所述复合物的所述寡核苷酸。

本发明的第三个方面涉及一种在双链核酸上创建复制起点的方法，所述方法包括：

(a)将双链核酸与至少一种寡核苷酸混合，制备反应混合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸，允许由DNA聚合酶从其3’末端开始延伸，并且具有与所述双链核酸的两条链之一的核苷酸序列基本互补的序列；且

(b)将所述反应混合物在所述双链核酸不变性的条件下保温，以形成复合物。

在第三个方面使用的双链核酸的实例包括线性DNA、环状DNA和基因组DNA。

本发明的第四个方面涉及一种复制核酸的方法，所述方法包括：在DNA聚合酶存在下，从按照第三个方面的方法创建的复制起点，合成与双链核酸的两条链之一互补的DNA。

在第四个方面使用的DNA聚合酶例如为具有链置换活性的酶。

附图简述

图1：显示从按照本发明的方法创建的复制起点扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

图2：显示从按照本发明的方法创建的复制起点扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

图3：显示从按照本发明的方法创建的复制起点扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

图4：显示从按照本发明的方法创建的复制起点扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果的图。

发明详述

在本文中使用时，由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物是指其中双链核酸和寡核苷酸相互非共价结合的复合物。对于其形式没有特别的限制。例如，包括形成三链螺旋的形式和其中寡核苷酸仅与双链核酸的两条链之一碱基配对的形式。由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物在下文可能仅仅被称为“复合物”。

按照本发明，核苷酸通常为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。可以任选地包括核苷酸的类似物或衍生物(修饰物)。

在本文中使用时，脱氧核糖核苷酸是指其糖部分由D-2-脱氧核糖构成的核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括例如具有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶作为碱基部分的脱氧核糖核苷酸。此外，脱氧核糖核苷酸也包括具有修饰碱基例如7-脱氮鸟苷或肌苷作为碱基部分的脱氧核糖核苷酸类似物。

在本文中使用时，核糖核苷酸是指其糖部分由D-核糖构成的核苷酸。核糖核苷酸包括具有腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶作为碱基部分的核糖核苷酸。核糖核苷酸也包括核糖核苷酸类似物和经修饰的核糖核苷酸，例如其中α位磷酸基团的氧原子被硫原子取代的经修饰的核糖核苷酸(一种(α-S)核糖核苷酸)。

在本文中使用时，复制起点是指可以用作双链核酸复制(即合成具有所述核酸的核苷酸序列的DNA)的反应起始点的位点。所述位点不限于特征为某些核苷酸序列的位点。

以下将详细地描述本发明。

(1)按照本发明使用的嵌合寡核苷酸

在本发明方法中使用的嵌合寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸。所述嵌合寡核苷酸包括含有至少一个选自经修饰核糖核苷酸、经修饰脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物和脱氧核糖核苷酸类似物的成员的寡核苷酸。

例如，具有诸如肌苷或7-脱氮鸟嘌呤的碱基作为碱基部分的核苷酸类似物、或者具有诸如闭合核酸(locked nucleic acid)(LNA；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：5633-5638(2000)；WO 99/14226)的核糖衍生物的核苷酸类似物可以用作按照本发明使用的核苷酸类似物。经修饰核糖核苷酸例如为其中与磷酸基因连接的氧原子被硫原子取代的(α-S)核苷酸、或者添加了标记化合物的核苷酸。此外，按照本发明的嵌合寡核苷酸可以含有肽核酸(PNA；Nature，365：566-568(1993))。

对于按照本发明使用的嵌合寡核苷酸没有特别的限制，只要它可以与目标双链核酸形成复合物。对于含有核糖核苷酸的位点也没有特别的限制。例如，可以使用其中核糖核苷酸位于所述引物的3’末端或者3’末端一侧的嵌合寡核苷酸。此外，核糖核苷酸的数目没有特别的限制。例如为其中一半或一半以下的构成碱基是核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸。

在本文中使用时，3’末端一侧是指从核酸例如寡核苷酸的中心至3’末端的部分。同样，5’末端一侧是指从核酸的中心至5’末端的部分。

在本发明方法中使用的嵌合寡核苷酸具有与所述双链核酸的核苷酸序列中所述嵌合寡核苷酸与之形成复合物的部分基本互补的核苷酸序列。在本文中使用时，“基本互补的核苷酸序列”是指在核酸可以呈现双链形式的条件下，例如在实施本发明的条件下，可以退火至所述双链核酸的两条链之一的核苷酸序列。

尽管在本发明方法中使用的嵌合寡核苷酸的长度没有特别的限制，例如为12-100个核苷酸，但优选长15-40个核苷酸。

将核苷酸类似物掺入嵌合寡核苷酸对于抑制所述嵌合寡核苷酸自身高级结构的形成是有效的。掺入可以形成强碱基配对键的核苷酸类似物例如LNA，对于高效形成复合物是有用的。

可以用Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成仪，按照亚磷酰胺法合成具有所需核苷酸序列的这样一种嵌合寡核苷酸。另一方面，可以用包括磷酸三酯法、H-磷酸酯法和硫代磷酸酯法的任何方法，来合成所述嵌合寡核苷酸。

(2)形成本发明复合物的方法

本发明提供一种形成复合物的方法，其中所述复合物由以上(1)中所述的嵌合寡核苷酸和具有与所述嵌合寡核苷酸基本互补的核苷酸序列的双链核酸构成。

对于在本发明方法中使用的双链核酸没有特别的限制。所述方法可以应用于线性和环状双链核酸。例如，人们可以在质粒DNA、基因组DNA、其片段、通过PCR扩增的DNA片段等上创建复制起点。本发明的方法可以应用于天然存在的核酸或者人工制备的核酸。

按照本发明，在体外仅仅通过将以上(1)中所述的嵌合寡核苷酸与双链核酸在合适的条件下、在不使所述双链核酸变性为单链的情况下混合而形成复合体是可能的。尽管对于所述条件没有特别的限制，但通常使用不使待使用的双链核酸变性为单链的条件。例如，可以在0-70℃的温度、pH 6.0-9.5、优选pH 7.0-9.2下，形成复合物。

形成复合物的反应混合物可以含有用以保持适当pH的缓冲成分、用于调节离子强度的中性盐或者其它成分。此外，它可以含有允许作用于所形成的复合物的酶和表现出所述酶活性所需的各种成分。此外，预期添加二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙二醇和/或甲酰胺将减少嵌合寡核苷酸的非特异性退火。

虽然对于所述嵌合寡核苷酸的用量没有特别的限制，但例如50μl反应体积中的用量可以在1-1000pmol之间变动，优选为10-150pmol。

人们可以通过用按照本发明方法形成的复合物，从嵌合寡核苷酸的3’末端合成DNA，从而合成具有与双链核酸的两条链之一互补的序列的DNA链。在这种情况下，在含有DNA聚合酶、作为底物的脱氧核糖核苷酸三磷酸、镁盐等的反应混合物中形成复合物以便同时进行DNA合成是可能的。

虽然并不打算限制本发明，但本发明的形成复合物的方法可以在存在核糖核酸酶H(RNA酶H)的情况下进行。按照本发明，可以优选使用嗜常温核糖核酸酶H，也可以使用耐热性核糖核酸酶H。例如，除得自大肠杆菌的RNA酶H之外，可以使用市售的Hybridase^TMThermostable RNase H(热稳定RNA酶H)(Epicenter Technologies)以及得自芽孢杆菌属(Bacillus)的嗜热细菌、栖热菌属(thermus)细菌、热球菌属(Pyrococcus)细菌、热袍菌属(Thermotoga)细菌等的RNA酶。另外，天然存在的核糖核酸酶和变异体都可以优选使用。按照本发明，可以优选使用得自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的耐热性RNA酶H。这种RNA酶H可以得自激烈热球菌DSM3638。或者，可以用编码以下参比实施例中所述的酶的基因，获得所述RNA酶H。

如果在存在核糖核酸酶H的情况下实施本发明，则优选在所用的核糖核酸酶H可以表现出其活性的反应混合物中实施本发明。

虽然这取决于所用的RNA酶H的类型，但通常使用含有适当缓冲成分和镁盐和/或锰盐的反应混合物。虽然并非打算限制本发明，但例如优选使用终浓度为1mM-20mM、优选2mM-10mM的氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰或硫酸锰作为镁盐/锰盐。可以使用含有例如Bicine、Tricine、HEPES、Tris和磷酸盐(例如磷酸钠和磷酸钾)作为缓冲成分的反应混合物。使用含有终浓度为5mM-100mM、优选10mM-50mM、pH 6.0-9.5、优选7.0-9.2的反应混合物，但不限于此。

本发明并非仅限于形成复合物，而是包括包含在不变性的情况下形成上述复合物的步骤的各种操作。

如下所述，可以用本发明的形成复合物的方法来检测核酸。另外，通过在核酸内具有特定功能的区(例如启动子区)中形成复合物，有可能抑制所述功能。

(3)本发明检测核酸的方法

基于上述形成复合物的方法，本发明提供一种检测具有靶核苷酸序列的双链核酸的方法。

在上述(1)中所述的嵌合寡核苷酸与具有与所述嵌合寡核苷酸基本互补的核苷酸序列的双链核酸形成复合物。因此，通过检查所述复合物的形成，可以检测具有与所述嵌合寡核苷酸基本互补的核苷酸序列的双链核酸。

在这一实施方案中，优选使用标记嵌合寡核苷酸。对于标记的类型没有特别的限制。例如，可以使用放射性同位素(³²P等)、染料、荧光物质、发光物质、各种配体(生物素、洋地黄毒苷等)、酶等。标记嵌合寡核苷酸的存在可以通过适用于所述标记的检测方法来证实。就不能直接检测的配体而言，它可以与能够与所述配体结合并用可检测标记来标记的物质联合使用。例如，通过联合使用用配体标记的嵌合寡核苷酸和用酶标记的抗配体抗体，并且扩增所述信号，可以以高灵敏度检测靶核酸。

此外，本发明的检测靶核酸的方法可以在存在以上(2)中所述核糖核酸酶H的情况下实施。

(4)本发明的创建复制起点的方法本发明的创建复制起点的方法包括：

(a)将双链核酸与至少一种寡核苷酸混合，制备反应混合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸，允许由DNA聚合酶从其3’末端开始延伸，并且具有与所述双链核酸的两条链之一的核苷酸序列基本互补的序列；且

(b)将所述反应混合物在所述双链核酸不变性的条件下保温，以使所述寡核苷酸退火至所述双链核酸上。

对于在本发明的创建复制起点的方法中使用的双链核酸没有特别的限制。可以使用以上(2)中所述的任何一种。也可以使用以上(2)中所述的本发明的形成复合物的方法所用的反应条件。

以上(1)中所述的允许DNA聚合酶从其3’末端延伸的嵌合寡核苷酸，可以用作引物，以供当其与双链核酸形成复合物时由DNA聚合酶合成DNA。所述DNA聚合酶从所述嵌合寡核苷酸的3’末端合成与所述双链核酸的两条链之一互补的DNA，复制所述DNA。因此，所述复合物用作所述双链核酸上的复制起点。

按照本发明，有可能基于所述嵌合寡核苷酸的核苷酸序列，在双链核酸上的任何位置创建复制起点。待创建的复制起点的数目并不限于1个。可以用多种嵌合寡核苷酸引物，同时创建多个复制起点。

此外，本发明的创建复制起点的方法可以在存在以上(2)中所述的核糖核酸酶H的情况下实施。

(5)本发明的复制核酸的方法

通过DNA聚合酶的作用，从在按照以上(4)中所述方法在双链核酸上创建的复制起点中所包含的嵌合寡核苷酸的3’末端，合成与所述双链核酸的两条链之一互补的DNA链，可以实现本发明的复制核酸的方法。

所述DNA合成利用嵌合寡核苷酸作为引物来起始，利用所述双链核酸的两条链中具有与所述嵌合寡核苷酸基本互补的核苷酸序列的链作为模板来进行。

在本发明的复制核酸的方法中使用的DNA聚合酶并不限于具体的DNA聚合酶，只要它具有用一条DNA链作为模板合成新的DNA链的活性。例如，可以按照本发明使用pol I型DNA聚合酶(大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段、Taq DNA聚合酶等)、α型DNA聚合酶[一种得自激烈热球菌的DNA聚合酶(Stratagene)、VENT DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)、KOD DNA聚合酶(Toyobo)、DEEP VENT DNA聚合酶(New England Biolabs)]和非α非pol I型DNA聚合酶(WO 97/24444中描述的DNA聚合酶)。此外，可以混合并使用多种DNA聚合酶。优选使用缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，来复制线性双链核酸。

可以按照本发明使用对DNA具有链置换活性的DNA聚合酶。“链置换活性”是指可以实现链置换、即可以基于作为模板的核酸的序列进行DNA复制、同时置换所述DNA链以释放已经退火至模板链的互补链的活性。另外，由于链置换而从作为模板的核酸序列释放的DNA链在本文被称为“置换链”。

在一个优选实施方案中，本发明的复制核酸的方法在高温条件(例如45-70℃)下进行。在这一实施方案中，使用耐热性DNA聚合酶，优选来源于芽孢杆菌属的嗜热细菌例如热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶以及缺乏其5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶的突变体。这些DNA聚合酶具有上述的链置换活性。

复制反应可以在含有作为DNA聚合酶底物的四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)和表现出所述酶活性所需的其它成分的反应混合物中，在适合于所用酶的反应条件下进行。自然，根据所用的酶或待复制的核酸，可以适当调节反应混合物中相应成分的组成和浓度、反应混合物的pH、反应温度、反应时间等。

复制反应的步骤可以在创建复制起点的步骤之后进行。或者，这些步骤可以同时进行。在这种情况下，选择所使用的DNA聚合酶和其它酶，测定反应条件，使得它们足以表现出其活性。

复制反应的步骤可以用一种核酸复制法连续进行，在所述方法中联合使用具有链置换活性的DNA聚合酶和核糖核酸酶H。这样一种方法在WO 00/56877中有描述，可以如上所述用具有链置换活性的DNA聚合酶和核糖核酸酶H来进行。在这种情况下，优选制备适用于这种方法的形式的嵌合寡核苷酸。

另外，通过同时从两个复制起点复制核酸，置于从面对面配置的两个复制起点之间的区域扩增核酸片段是可能的。本发明包括这样的

实施方案。

实施例

以下实施例进一步详细描述本发明，但不可解释为限制本发明的范围。

参比实施例

激烈热球菌RNA酶HII基因的克隆

(1)从激烈热球菌制备基因组DNA

将含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母膏(DifcoLaboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO₄、0.001％NaCl、0.0001％FeSO₄·7H₂O、0.0001％CoSO₄、0.0001％CaCl₂·7H₂O、0.0001％ZnSO₄、0.1ppm CuSO₄·5H₂O、0.1ppmKAl(SO₄)₂、0.1ppm H₃BO₄、0.1ppm Na₂MoO₄·2H₂O和0.25ppmNiCl₂·6H₂O的2L培养基置于2L培养瓶中，于120℃灭菌20分钟，通入氮气，以除去溶解氧，然后在培养基中接种激烈热球菌(从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(德意志微生物保藏中心)购买；DSM3638)，于95℃不振荡培养16小时。培养后，通过离心收集细胞。

然后将所得细胞悬浮于4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl缓冲液(pH8.0)中。加入04ml 10mg/ml氯化溶菌酶(lysozyme chloride)(NacalaiTesque)的水溶液。让混合物于20℃反应1小时。反应后，向反应混合物中加入含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl缓冲液(pH8.0)的24ml混合物、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)和2ml10％十二烷基硫酸钠水溶液。将混合物于37℃温育1小时。

反应后，混合物经过苯酚-氯仿抽提，然后乙醇沉淀，制备约1mg基因组DNA。

(2)RNA酶HII基因的克隆

Pyrococcus horikoshii的完整基因组序列已经发表[DNA Research，5：55-76(1998)]。已知在基因组中存在一个编码RNA酶HII同源物的基因(PH1650)(SEQ ID NO：1，National Institute of Technology andEvaluation：http：//www.nite.go.jp/的主页)。

搜索了PHl650基因(SEQ ID NO：1)和激烈热球菌的部分发表的基因组序列(University of Utah，Utah Genome Center：http：//www.genome.utah.edu/sequence.html的主页)之间的同源性。结果，发现一个高度同源的序列。

根据所述同源序列，合成引物1650Nde(SEQ ID NO：2)和1650Bam(SEQ ID NO：3)。

用在参比实施例(1)中获得的200ng激烈热球菌基因组DNA作为模板，用20pmol 1650Nde和20pmol 1650Bam作为引物，在100μl体积中进行PCR。用TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)作为DNA聚合酶，按照所附的方案进行PCR。如下进行PCR：94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟，进行30个循环。约0.7kb的扩增DNA片段用NdeI和BamHI(都得自Takara Shuzo)消化。将所得的DNA片段插入到质粒载体pET3a(Novagen)的NdeI位点和BamHI位点之间，制备质粒pPFU220。

(3)合RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列的测定

按照双脱氧法，测定在参比实施例(2)中获得的插入到pPFU220中的所述DNA片段的核苷酸序列。

所测定的核苷酸序列的分析揭示出一个推定编码RNA酶HII的可读框(ORF)。所述可读框的核苷酸序列示于SEQ ID NO：4中。从所述核苷酸序列导出的RNA酶HII的氨基酸序列示于SEQ ID NO：5中。

用质粒pPFU220转化的大肠杆菌JM109被命名和指定为大肠杆菌JM109/pPFU220，并且于2000年9月5日(原始保藏日)保藏于国际专利生物体保藏机构-National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology(独立行政法人产业技术综合研究所)，AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，Japan，保藏号为FERM BP-7654。

(4)经纯化的RNA酶HII制剂的制备

用参比实施例(2)中获得的pPFU220转化大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen)。将所得的带有pPFU220的大肠杆菌HMS174(DE3)接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的2L LB培养基中，于37℃振荡培养16小时。培养后，将经离心收集的细胞悬浮于66.0ml超声处理缓冲液[50mM tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA、2mM苯基甲磺酰氟(PMSF)]中，进行超声处理。将通过超声处理悬浮液以12,000rpm离心10分钟而获得的上清液于60℃加热15分钟。然后再次以12,000rpm离心10分钟，以收集上清液。从而获得61.5ml热处理上清液。

将所述热处理上清液经过用缓冲液A[50mM tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mM EDTA]平衡的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)，用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分离。结果，RNA酶HII流过RESOURSE Q柱。

将60.0ml所述流通RNA酶HII流分经过用缓冲液A平衡的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用FPLC系统，以0-500mM NaCl线性梯度洗脱。获得用约150mM NaCl洗脱出的含RNA酶HII的流分。

用Centricon-10(Amicon)，通过超滤浓缩2.0ml所述RNA酶HII流分。将250μl所述浓缩液经过用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.0)平衡的Superdex 200凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用同一种缓冲液洗脱。结果，RNA酶HII在相当于17千道尔顿分子量的位置洗脱出来。这一分子量对应于单体形式的RNA酶HII的分子量。

将如此洗脱出的RNA酶HII用作Pfu RNA酶HII制剂。

如下测定如此获得的Pfu RNA酶HII制剂的RNA酶H活性。

将10mM tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、1mM二硫苏糖醇(DTT，NacalaiTesque)、0.003％牛血清白蛋白(fraction V，Sigma)、4％甘油、20μg/mlpoly(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)和30μg/ml poly(rA)(AmershamPharmacia Biotech)混合在一起。让混合物于37℃保温10分钟，用作供测量RNA酶H活性用的底物溶液。

加入1μl 1M MnCl₂至100μl底物溶液中。让混合物于40℃保温。加入适当稀释的Pfu RNA酶HII制剂至所述混合物中，以起始反应。于40℃反应30分钟后，加入10μl 0.5M EDTA以终止反应。然后测量260nm的吸光度。

结果，加入Pfu RNA酶HII制剂的反应混合物的260nm吸光度高于用在加入Pfu RNA酶HII制剂之前加入10μl 0.5M EDTA的反应混合物观测到的吸光度。因此，表明该制剂具有RNA酶H活性。

实施例1

(1)将RAW264.7细胞(ATCC TIB 71)以1.5×10⁵细胞/ml的浓度，悬浮于含有10％胎牛血清(Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(Bio Whittaker，12-604F)中。向6孔微量滴定板的各孔中加入5ml所述悬浮液，将平板在5％CO₂存在下于37℃温育过夜。向孔中加入50μl100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma，L-2012)的水溶液和50μl 1000U/μl干扰素-γ(IFN-γ，Genzyme Techne，3485)水溶液。将平板再温育4小时。然后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen，74104)，按照试剂盒所附的说明，从所述细胞制备RNA。

通过用热循环仪(GeneAmp PCR System 9600，AppliedBiosystems)，将含有3μg如此制备的RNA、10mM tris-盐酸缓冲液(pH8.3)、50mM KCl、5mM MgCl₂、dNTPs各1mM、150pmol随机六聚体引物、60U核糖核酸酶抑制剂(Takara Shuzo，2310A)和15U ReverseTranscriptase(逆转录酶)XL(AMV)(Takara Shuzo，2620A)的60μl混合物于30℃保温10分钟，于42℃保温1小时，然后于99℃保温5分钟，以使所述酶失活，制备cDNA。

(2)根据小鼠诱导型NO合酶(iNOS)mRNA的核苷酸序列(GeneBank登记号：NM-010927)，合成分别具有由SEQ ID NO：6和SEQID NO：7表示的核苷酸序列的引物NS-PCR1和NS-PCR2。用所述引物对和实施例1-(1)中制备的cDNA作为模板进行PCR，扩增741bp的DNA片段。用Suprec02(Takara Shuzo)纯化所述片段，然后用于以下实验。

(3)根据小鼠诱导型NO合酶mRNA的核苷酸序列，合成分别由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9表示的嵌合寡核苷酸引物NS5和NS6。

将含有1μl含10fg-100pg/μl浓度的实施例1-(2)中获得的PCR扩增的DNA片段的溶液或者水(阴性对照)、引物NS5和NS6各50pmol、dNTPs各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.01％牛血清白蛋白、1％二甲基亚砜、0.0156μg在参比实施例中描述的Pfu RNA酶HII和1U BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的50μl反应混合物，在热循环仪中于60℃保温1小时。

反应后，通过在3.0％琼脂糖凝胶上电泳，分析5μl每种反应混合物。电泳照片示于图1中。

图1是反应产物的电泳照片。第1泳道：100bp DNA梯式标记；第2泳道：阴性对照(水)；第3泳道：10fg模板；第4泳道：100fg模板；第5泳道：1pg模板；第6泳道：10pg模板；以及第7泳道：100pg模板。

如图1所示，表明当在反应中使用1pg或1pg以上的模板时，扩增了对应于模板上所述嵌合寡核苷酸引物之间区域的DNA片段。这些结果表明，由于所述嵌合寡核苷酸引物退火至模板DNA上而形成复制起点，虽然所述模板DNA未变性，并且所述DNA聚合酶从所述复制起点实现DNA合成，扩增了所述复制起点之间的DNA片段。

实施例2

(1)基于质粒pDON-AI DNA(Takara Shuzo)中包装区的核苷酸序列，合成了分别在3’末端具有3个RNA残基的嵌合寡核苷酸引物pDON-AI-1和pDON-AI-2。这些引物的核苷酸序列示于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11中。

(2)将含有1μl含10fg-1ng/μl浓度的pDON-AI DNA(环状)的溶液或者水(阴性对照)、引物pDON-AI-1和pDON-AI-2各50pmol、dNTPs各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.01％牛血清白蛋白、1％二甲基亚砜、0.0156μg在参比实施例中描述的Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶的50μl反应混合物，在热循环仪中于60℃保温1小时。

通过在3.0％琼脂糖凝胶上电泳，分析5μl每种反应混合物。结果示于图2中。

图2是反应产物的电泳照片。第1泳道：100bp DNA梯式标记；第2泳道：阴性对照(水)；第3泳道：10fg模板；第4泳道：100fg模板；第5泳道：1pg模板；第6泳道：10pg模板；第7泳道：100pg模板；以及第8泳道：1ng模板。

如图2所示，当在使用10fg或10fg以上的模板时，扩增了对应于所用嵌合寡核苷酸之间区域的DNA片段。因此表明，用RNA酶H和嵌合寡核苷酸引物，在环状DNA分子上创建了一个复制起点。

实施例3

(1)基于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)肠毒素A基因区的核苷酸序列，合成了分别在3’末端具有3个RNA残基的嵌合寡核苷酸引物SEA-1和SEA-2。引物SEA-1是有义引物，而引物SEA-2是反义引物。引物SEA-1和SEA-2的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中。

(2)制备含有1μl含0.115ng或1.15ng金黄色葡萄球菌(ATCC13565)基因组DNA的溶液或者1μl水(阴性对照)、引物SEA-1和SEA-2各50pmol、dNTPs各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.01％牛血清白蛋白、1％二甲基亚砜、0.0156μg在参比实施例中描述的Pfu RNA酶H和1UBcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的50μl反应混合物。所述反应混合物在热循环仪中于58℃保温1小时。

通过在3.0％琼脂糖凝胶上电泳，分析5μl每种反应混合物。结果示于图3中。

图3是反应产物的电泳照片。第1泳道：100bp DNA梯式标记；第2泳道：阴性对照(水)；第3泳道：0.115ng模板；以及第4泳道：115ng模板。证实了当在反应中使用1.15ng模板DNA时，产生了特异性扩增的产物。因此表明，按照本发明的方法在基因组DNA上创建复制起点是可能的。

实施例4

(1)从通过磷酸钙法导入了质粒pDON-AI的包装细胞GP+E-86(ATCC CRL-9642)的培养上清液中，制备亲嗜性逆转录病毒。用所述逆转录病毒感染NIH-3T3细胞(ATCC CRL-1658)，在含有G418的培养基中培养14天，以制备转化细胞。按照常规方法，从4×10⁴所述逆转录病毒感染的细胞中，制备27μg基因组DNA。

(2)引物的制备

根据质粒pDON-AI中包装区的核苷酸序列，合成两种分别在3’末端具有3个RNA碱基的嵌合寡核苷酸引物pDON-AI-68-1(有义引物)和pDON-AI-68-2(反义引物)。pDON-AI-68-1和pDON-AI-68-2的核苷酸序列分别示于SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15中。

(3)无需模板变性的DNA片段的扩增

制备50μl反应混合物，所述反应混合物含有1μl含有10fg或1ngpDON-AI的溶液、1μl含有1ng、10ng或100ng得自导入了pDON-AI的NIH/3T3细胞的基因组DNA的溶液、或者1μl水(作为阴性对照)，还含有在以上实施例4-(2)中制备的引物各50pmol、dNTPs各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH 7.8)、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.01％牛血清白蛋白、1％二甲基亚砜、18.5U参比实施例中所述的Pfu RNA酶HII和4U BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)。将反应混合物在热循环仪中于64℃保温1小时。

在反应后，用每种反应混合物5μl在3％琼脂糖凝胶上电泳，以证实反应产物。结果示于图4中。

图4是所述反应产物的电泳照片。M泳道：100bp DNA梯式标记；第1泳道：阴性对照(水)；第2泳道：10fg作为模板的pDON-AI；第3泳道：1pg作为模板的pDON-AI；第4泳道：1ng得自具有pDON-AI的NIH/3T3细胞的、作为模板的基因组DNA；第5泳道：10ng得自具有pDON-AI的NIH/3T3细胞的、作为模板的基因组DNA；第6泳道：100ng得自具有pDON-AI的NIH/3T3细胞的、作为模板的基因组DNA。

如图4中所示，或者使用pDON-AI，或者使用含有整合的pDON-AI的基因组DNA，观察到一个DNA片段的特异性扩增。因此表明，即使用基因组DNA作为模板，在反应前不使模板DNA变性的情况下扩增目标DNA片段是可能的。

实施例5

(1)嵌合寡核苷酸和引物的合成

根据人c-Ki-ras基因的核苷酸序列，设计并合成在3’末端具有3个RNA残基并且在5’末端用异硫氰酸X-罗丹明(XRITC)标记的嵌合寡核苷酸k-ras-X。k-ras-X的核苷酸序列示于SEQ ID NO：16中。

合成引物ras-F(有义)和ras-R(反义)作为PCR的引物对，用于制备待用作模板的PCR片段。ras-F和ras-R的核苷酸序列分别示于SEQID NO：17和SEQ ID NO：18中。

(2)嵌合寡核苷酸与模板的反应

用1μl人基因组DNA作为模板，使用引物ras-F和ras-R进行PCR，合成待用作模板的、具有与k-ras-X互补的序列的DNA片段。制备50μl具有以下组成、含有270ng这种DNA片段和25pmol k-ras-X的反应混合物：dNTPs各0.5mM、32mM HEPES-氢氧化钾缓冲液(pH7.8)、100mM乙酸钾、4mM乙酸镁、0.01％牛血清白蛋白和1％二甲基亚砜。反应混合物在热循环仪中于52℃保温5分钟。制备加有无与k-ras-X互补序列的200bp PCR扩增片段的反应混合物作为阴性对照，并且以相似方式保温。

用20μl所述反应混合物在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳后，用FMBIO-II Multi-View(Takara Shuzo)分析凝胶，以证实k-ras-X的电泳位置。结果，在与具有互补核苷酸序列的DNA片段一起保温的情况下，在对应于所述DNA片段大小的电泳位置上观察到来自k-ras-X的荧光，证实所述嵌合寡核苷酸与所述DNA片段形成复合物。另一方面，对于阴性对照，没有观察到所述引物与所述DNA片段的这种结合。因此表明，具有与DNA片段互补的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸，在未使所述DNA片段变性的情况下，以不依赖于酶的方式与所述DNA片段的核苷酸序列特异性地结合。

工业应用性

本发明提供了一种在核酸分子上人工创建复制起点并且利用所述复制起点复制所述核酸分子的方法。

按照本发明的所述方法，可以在体外方便地复制核酸分子，而无需将所述核酸分子插入到载体中。此外，由于可以随意放置复制起点，所以有可能仅特异性地复制核酸的必需部分，或者同时从多个复制起点进行复制反应。

序列表的独立文本

SEQ ID NO：2：PCR引物1650Nde，用于从激烈热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。

SEQ ID NO：3：PCR引物1650Bam，用于从激烈热球菌克隆编码具有RNA酶HII活性的多肽的基因。

SEQ ID NO：6：设计的寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分。

SEQ ID NO：7：设计的寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分。

SEQ ID NO：8：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。

SEQ ID NO：9：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分。“核苷酸19-22是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。

SEQ ID NO：10：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增质粒pDON-AI的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。

SEQ ID NO：11：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增质粒pDON-AI的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。

SEQ ID NO：12：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。

SEQ ID NO：13：设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”。

                        序列表

<110>宝酒造株式会社(Takara Shuzo Co.，Ltd.)

<120>形成复合物的方法

<130>662808

<150>JP 2000-284420

<151>2000-09-19

<150>JP 2001-139286

<151>2001-05-09

<150>JP 2001-177537

<151>2001-06-12

<160>18

<210>1

<211>663

<212>DNA

<213>Pyrococcus horikoshii

<400>1

atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt     60

ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac    120

tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta    180

gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg    240

aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag    300

aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct    360

gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata    420

gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag    480

caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt    540

gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc    600

gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag    660

tga                                                                  663

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物1650Nde，用于从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)克隆编码具有RNA酶

HII活性的多肽的基因

<400>2

aaggaggaga gacatatgaa aataggggga att                                 33

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物1650Bam，用于从激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)克隆编码具有RNA酶

HII活性的多肽的基因

<400>3

gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta                                 33

<210>4

<211>672

<212>DNA

<213>激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)

<400>4

atgaaaatag ggggaattga cgaagcagga agaggaccag cgatagggcc attagtagta     60

gctactgtcg tcgttgatga gaaaaacatt gagaagctca gaaacattgg agtaaaagac    120

tccaaacaac taacacccca tgaaaggaag aatttatttt cccagataac ctcaatagcg    180

gatgattaca aaatagtgat agtatcccca gaagaaatcg acaatagatc aggaacaatg    240

aacgagttag aggtagagaa gtttgctctc gccttaaatt cgcttcagat aaaaccagct    300

cttatatacg ctgatgcagc ggatgtagat gccaatagat ttgcaagctt gatagagaga    360

agactcaatt ataaggcgaa gattattgcc gaacacaagg ccgatgcaaa gtatccagta    420

gtttcagcag cttcaatact tgcaaaggtt gttagggatg aggaaattga aaaattaaaa    480

aagcaatatg gagactttgg ctctgggtat ccaagtgatc caaaaaccaa gaaatggctt    540

gaagagtact acaaaaaaca caactctttc cctccaatag tcagacgaac ctgggaaact    600

gtaagaaaaa tagaggaaag cattaaagcc aaaaaatccc agctaacgct tgataaattc    660

tttaagaaacct                                                         672

<210>5

<211>224

<212>PRT

<213>激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)

<400>5

Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile

  1               5                  10                  15

Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile

                 20                  25                  30

Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr

                 35                  40                  45

Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala

                 50                  55                  60

Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn

                 65                  70                  75

Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu

                 80                  85                  90

Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp

                 95                 100                 105

Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg

                110                 115                 120

Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp

                125                 130                 135

Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val

                140                 145                 150

Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp

                155                 160                 165

Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu

                170                 175                 180

Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg

                185                 190                 195

Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala

                200                 205                 210

Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro

                215                 220

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分

<400>6

cacaaggcca catcggattt c             21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分

<400>7

tgcataccact tcaacccga g             21

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>8

ctcatgccat tgagttcatc aac         23

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增得自小鼠的iNOS编码序列的一部分。“核苷酸19-22是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>9

gctggtaggt tcctgttgtu uc          22

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增质粒pDON-AI的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>10

agctctgtat ctggcggac              19

<210>11

<21l>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增质粒pDON-AI的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>11

gatcgggatt tttggactca g           21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>12

tgtatgtatg gtggtgtaac g           21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>13

taaccgtttc caaaggtacu g           21

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增质粒pDON-AI的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>14

actagctctg tatctggcgg ac          22

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的嵌合寡核苷酸引物，用于扩增质粒pDON-AI的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>15

acgatcggga tttttgcact cag         23

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的与人ki-ras基因互补的嵌合寡核苷酸。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，而其它核苷酸是脱氧核糖核苷酸”

<400>16

gactgaatat aaacttgugg                   20

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增人ki-ras基因的一部分。

<400>17

tgacatgttc taatatagtc ac                22

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的寡核苷酸引物，用于扩增人ki-ras基因的一部分。

<400>18

actcatgaaa atggtcagag                   20

Claims (9)

1.一种形成由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物的方法，所述方法包括：

(a)将双链核酸与至少一种寡核苷酸混合，制备反应混合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸，并且具有与所述双链核酸的两条链之一的核苷酸序列基本互补的序列；且

(b)将所述反应混合物在所述双链核酸不变性的条件下保温，以形成复合物。

2.权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸是选自线性DNA、环状DNA和基因组DNA的核酸。

3.权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸可以用作引物，来合成与所述双链核酸的两条链之一互补的DNA。

4.权利要求1所述的方法，其中标记所述寡核苷酸。

5.一种检测具有靶核苷酸序列的双链核酸的方法，所述方法包括：

(a)按照权利要求1所限定的方法，形成由双链核酸和寡核苷酸构成的复合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸，并且具有与靶核苷酸序列基本互补的序列；且

(b)检测形成所述复合物的所述寡核苷酸。

6.一种在双链核酸上创建复制起点的方法，所述方法包括：

(a)将双链核酸与至少一种寡核苷酸混合，制备反应混合物，其中所述寡核苷酸是一种含有至少一个核糖核苷酸以及一个选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物的成员的嵌合寡核苷酸，允许由DNA聚合酶从其3’末端开始延伸，并且具有与所述双链核酸的两条链之一的核苷酸序列基本互补的序列；且

(b)将所述反应混合物在所述双链核酸不变性的条件下保温，以形成复合物。

7.权利要求6所述的方法，其中所述双链核酸是选自线性DNA、环状DNA和基因组DNA的核酸。

8.一种复制核酸的方法，所述方法包括：

在DNA聚合酶存在下，从按照权利要求6所限定的方法创建的复制起点，合成与双链核酸的两条链之一互补的DNA。

9.权利要求8所述的方法，其中所述DNA聚合酶为具有链置换活性的酶。

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