CN1210557A

CN1210557A - 用于在细胞中体内产生突变体文库方法

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Publication number: CN1210557A
Application number: CN97191974A
Authority: CN
Inventors: T·V·伯彻特; S·D·埃尔利克
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-01-10
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 1999-03-10
Also published as: JP2000502568A; DE69733059T2; AU1367897A; DK0873398T3; ATE293684T1; EP0873398A1; WO1997025410A1; CN101070537A; EP0873398B1; DE69733059D1

Abstract

本文描述了一种用于在包含许多突变的遗传元件的细胞中体内产生文库的方法,其中,一种易错聚合酶用于各祖代细胞复制所有或部分不依赖于宿主染色体复制机制的遗传元件。这些遗传元件包括:i)复制起点,从该起点开始复制,ii)可有可无的遗传标记,例如,赋予对抗生素的抗性的基因,iii)编码兴趣多肽的基因。本文也描述了用于产生编码所需的兴趣多肽变体的DNA序列以及测定这类DNA序列的方法。

Description

用于在细胞中体内产生突变体文库方法

发明领域

本发明涉及用于体内产生多肽变体文库，筛选这些变体以及选择那些显示所需性质的变体的方法。本发明还涉及用于产生要求的多肽变体的方法。

发明背景

日益增加的多肽(包括酶和非酶的蛋白质)正在工业上生产，这些多肽用于各种工业、家庭、食品/饲料、化妆品、医药等的用途。这些蛋白质的主要来源之一是而且一直是天然发现的微生物。

用于发现这些具有新和特殊性质的多肽的经典方法一直是筛选天然存在的野生型有机体。这曾经是获得多肽的一种十分成功的方法，其中所说的多肽用于如上述的应用的各种领域。

然而，如果因为在天然宿主系统中产生的数量太少而不能使得生产，往往不可能产生足够量的这类多肽，即使成本没有问题，要提供适合要求的足够量的多肽(例如人生长激素)，也可能遇到困难。

这类问题已通过用于产生多肽的重组技术的出现在很大程度上得以克服。在本领域，多肽通过利用生物系统产生。把编码某些多肽的基因克隆并转移到细胞中，其中该细胞将产生的多肽在量上比那些在原始有机体中产生的大得多。在最近的二十年中，按照这类技术，已发展了大量用于产生多肽的方法。

经常，来自天然源的蛋白质不满足某些应用的需要，修饰现有蛋白质使之具有一定活性或生物物理学性质将是必要的。

利用辐射(X射线和UV)或化学诱变剂，通过微生物的经典诱变，产生新的蛋白质变体是可能的。然而，由于这种方法是一种十分麻烦且耗时的过程，在相同的最近二十年中，研究者一直在通过利用更具特异性和选择性的重组技术(如用于创造人工多样性的蛋白质和基因工程)发展对现有多肽的改进。

利用结构功能的关系与普通蛋白质化学的知识，基于需要考虑的事，研究者已在设计多肽变体方面进行了很久，其中所说的多肽变体显示了各种性质的改进。

然而，也已认识到：多肽参与的各种相互作用是那么复杂，因此按照这些知识的合理设计有严重的局限性，近年来，利用随机诱变，接着从由诱变产生的大量变体中筛选或选择的方法已引起人们的兴趣。

为了这一目的，产生了突变体的微生物文库用于随后的表达与筛选，以测定具有要求的性质的变体。

多年来，许多用于创造多肽的大量不同变体的体外和体内DNA诱变技术都已发展。

考虑到事实：一种典型的天然存在的多肽由100-1000个氨基酸组成，每个氨基酸可以20种方式变化(仅在天然存在的氨基酸内发生)，特定多肽的可能变体的数量是巨大的。由于主要参数(规定或测量微生物收集品或文库的有效性以鉴定多肽的改进变体)是不同变体的数目N，其中所说的不同变体N包含于收集品，所以已出现对大文库的需要。

尤其在当一种强大的选择系统可供使用时，鉴定要求的多肽的限制因子是文库的大小。

在体外系统情况下，本领域状态下，对N的实际限制是大约10⁸。这主要由于操纵的DNA进入宿主有机体的转化(把DNA引入细胞)的低效能。这个数目从有机体到有机体变化很大，在现存的最好情况大肠杆菌下，通常操纵的DNA的体外转化(例如DNA片段的连接或DNA的化学处理)的效率，最多达到10⁸细菌的文库大小(Greg Winter，现代免疫学方法5:253-255,1993)。极少数这一大小的文库的例子已报导了。

在其它原核生物(如Bacillus sp.、Streptococcus sp.或Staphylococcussp.)中的体外文库构建，由于实际原因将是低于这个数目的数量级。

考虑到真核生物宿主(如酿酒酵母或各种Aspergillus sp.)，甚至更少数量的转化体可期待来自体外操纵的DNA。

已报导了大文库的一种特殊的情况是基于抗体轻链和重链文库的体内重组基于用于那种特殊情况的一个专门设计的系统(Griffiths,A.D.等，1994,EMBO J.14:3245-3260)。

许多方法可用以在微生物中体内产生多肽的变体，从十分简单的方法(如利用化学或物理诱变剂处理细胞)到相当复杂的方法，该方法依赖于包含易错的DNA聚合酶但缺乏纠正错误的错配修复系统的细胞(Stratagene,XL1-red(mutS、mutD、mutT)目录#200129)。但这些技术有一主要的弊端，由于诱变的目标不是基因组的特定部分(编码兴趣多肽)，且高频突变也在对细胞必须的基因以及靶基因中产生，导致大量细胞死亡，而且在高数量的细胞中所说的突变不影响兴趣多肽。这类“噪音”将限制突变在靶区域的积累。

因此，本发明的目的是提供一种特定区域的体内靶诱变方法以产生很大数量N的多肽变体。

本发明的第二目的涉及利用现有的和未来的技术，筛选或选择具有所需性质的变体。

发明概述

因此，本发明涉及用于在包含大量突变的遗传元件的细胞中体内产生文库的方法，其中易错聚合酶用于各祖代细胞复制所有或部分遗传元件，该遗传元件包含

ⅰ)复制起点，复制从该点开始，

ⅱ)可有可无的遗传标记，例如，编码具有抗抗生素抗性的基因，

ⅲ)编码兴趣多肽的基因，该基因不依赖于宿主染色体的复制机制。

本发明还涉及一种用于产生编码兴趣多肽的所需变体的DNA序列的方法，其中：

ⅰ)突变体文库利用上述方法产生，

ⅱ)在利于所说的兴趣基因表达的条件下，培养所说的文库以产生多肽变体，

ⅲ)筛选或选择所说的具有所需性质的变体多肽，鉴定并分离产生这类所需变体的宿主，

ⅳ)对所说的宿主中所说的遗传元件测序，以阐明编码所需变体的突变基因的DNA序列；

和用于测定编码所需的兴趣多肽的变体的DNA序列的方法，其中

(ⅰ)突变体文库用上述方法产生，

(ⅱ)把所说的文库在利于所说的兴趣基因表达的条件下培养，以产生变体多肽，

(ⅲ)筛选或选择具有所说的所需性质的变体多肽，鉴定并分离产生所需变体的宿主，

(ⅳ)对所说的宿主中所说的遗传元件测序，以阐明编码所需变体的突变基因的DNA序列。

文库的筛选或变体的选择取决于特定多肽，及它的所需改进和/或保持的性质。因此，对每种情况建立筛选方案是必要的。这类方案包括文献中描述的许多检验(Clackson等，自然352:624-628,1991,Bryan,P等，蛋白质1:326-334,1986)。

产生多样性的结合并选择具有所需性质的变体的优雅的途径将是本发明的以噬菌体显示系统体内产生多样性的方法的结合(Greg Winter，同上)。

兴趣多肽的特定例子是碱性蛋白酶，该酶用于从织物除去蛋白质污点的去污剂工业。在那种情况下，筛选可在实际去污剂组合物中完成以调查性质(如热稳定性、氧化稳定性、存储稳定性、底物特异性以及亲和性、对不含水的溶剂的稳定性、pH轮廓、离子强度依赖性、催化效率和洗涤性能)。

本发明还涉及用于产生所需的多肽变体的方法，其中

(ⅰ)把编码已经按照上述方法测定的兴趣多肽的DNA序列以一定的方式引入合适的宿主中，以便此序列可在所说的宿主中表达，

(ⅱ)在利于所说的DNA序列表达的条件下培养所说的宿主，并且

(ⅲ)回收所说的多肽变体。

用于引导选择的DNA序列进入合适的宿主系统的方法在(Sambrook等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，NY.)中描述。

选择合适的生长培养基和选择的宿主系统的其它条件也在技术人员的能力之内，这些条件利于兴趣多肽变体的表达。有关这些内容的指导可在(Sambrook等，同上)中找到。

用于多肽回收的大量方法也可供蛋白质的分离与纯化使用，例如，在(Scopes,R.K.,蛋白质纯化(1987)，Springer-Verlag)。

最后，本发明涉及用上述方法产生的多肽。

发明详述

本发明包括体内构建兴趣基因变体文库的方法。此方法包括利用遗传元件(如能够不依赖于宿主染色体复制系统复制的噬菌体或质粒)。通过利用分离宿主染色体的复制和遗传元件复制(噬菌体/质粒)的可能性，通过修饰一种复制系统以选择性地在保持宿主完整染色体的遗传元件(噬菌体/质粒)中引入突变是可能的。这意味着：在兴趣基因中产生变异不危及宿主的生存力。

DNA复制是一种高度精确的过程，在大肠杆菌中染色体复制的误导入率已估计为每轮复制每个碱基10^-10次。DNA复制期间进行的碱基配对导致对聚合酶的优先选择以在一定位置掺入正确的碱基，占全面复制保真性约为10⁵。如果一个不正确的碱基已掺入，聚合酶将停止，3’-5’外切核酸酶常除去3’不正确掺入的碱基。这部分表明的正确读框占全面复制保真性大约为10²。细胞的修复系统占最后10³的保真率。

大肠杆菌中染色体的复制大多数通过DNA聚合酶Ⅲ全酶进行，此酶是包含10种不同多肽(包括聚合酶(α-亚单位，polC基因)和3’-5’外切核酸酶(dnaQ基因))的多种蛋白质复合物。

另一种聚合酶(DNA聚合酶Ⅰ(DNA polⅠ,polA基因)包含三种不同的活性，即，DNA聚合酶活性、3’-5’外切核酸酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，尽管事实上它是一种单一的多肽。这种聚合酶在细胞中有多种功能。除DNA修复外，由于它在迟滞DNA链合成期间参与DNA片段的组装，染色体DNA复制也需要DNA polⅠ。然而，它复制的仅是基因组的十分次要的部分。

这种聚合酶还用于某些种类质粒DNA复制的起始，例如，基于ColEⅠ复制起点的质粒(如大肠杆菌和革兰氏阴性细菌中的pBR322或革兰氏阳性细菌中的pAMβ1样质粒)。这类质粒可在没有以活性形式存在的DNA聚合酶Ⅲ时(例如，如果这种酶由于基因原因机能不良，如在非允许温度下的温敏变体)，或细胞中仅存在有限量的DNA聚合酶Ⅲ的条件下，通过DNA聚合酶Ⅰ的活性完全复制。

众所周知某些突变导致DNA复制保真性的降低(或增加)。已把这些突变作图以主要驻留于聚合酶、外切核酸酶或修复系统的元件中。遗憾地，这些突变大多数改变/修复现存的完全基因组的保真率，且这类非靶突变也不理想。

这类突变的一个例子可以是DNA polⅠ的3’-5’外切核酸酶活性的灭活。

然而，按照本发明，利用的事实是：复制系统的某些元件可以暂时“关闭”(全部或部分)，因此，停止或大大地降低基因组的复制，而如本文限定的某些遗传元件的复制继续进行。

包含温敏DNA polⅢ(即聚合酶α-亚基或使全酶有条件地无功能的另一个温敏亚基)或染色体复制的起始所需的功能(如基于DnaA、易错的DNApolⅠ和colEⅠ的包含兴趣基因的质粒)的大肠杆菌菌株是按照本发明设计的遗传系统的例子，以在质粒(和兴趣基因)中特异性地引入突变。

在这类系统中，提高温度至非允许的值将具有的影响是使DNA polⅢ完全停止作用，而易错的DNA polⅠ将保持它的功能，并以减少的保真性复制质粒，产生质粒的突变拷贝。

由于突变的产生是随机的，每一种细胞将产生独特的突变，经降低温度，温敏功能将再一次变得活跃，细胞的正常复制继续。

变体将是具有polⅢ和polⅠ温敏等位基因的大肠杆菌菌株，且该菌株可(通过ts阻抑物(温敏)或通过化学诱导)诱导表达易错聚合酶。在一限制性温度下，且在诱导物存在时，突变将在遗传元件中积累。在允许温度下，且缺乏诱导物时，完全系统作为野生型细胞起作用。

因此，本发明的第一方面涉及用于在包含大量突变的遗传元件的细胞中体内产生突变体文库的方法，其中易错聚合酶用于各祖代细胞复制所有或部分遗传元件，该遗传元件包含

ⅰ)复制起点，复制由此开始，

ⅱ)可有可无的遗传标记，例如赋予对抗生素的抗性的基因，

因而，本发明包含用于在包含大量突变的遗传元件的细胞中体内产生突变体文库的方法，此方法包括

A)提供细胞，该细胞具有

ⅰ)易错聚合酶将复制全部或部分遗传元件，其中所说的酶不依赖于所说的细胞的染色体复制机制，所说的遗传元件包含

a)复制起点，复制由此开始，

b)可有可无的遗传标记，例如，赋予对抗生素的抗性的基因，

c)编码兴趣多肽的基因，和

ⅱ)染色体的复制机制，这可以可逆地诱导为实质上无功能的，

B)在利于这种细胞复制的条件下，培养这种细胞以获得大量祖代细胞，

C)在所说的祖代细胞中可逆地诱导所说的染色体的复制机制以成为实质上无功能的，达足够的时间以使得所说的遗传元件通过所说的异错聚合酶复制以在所说的遗传元件中产生突变，

D)在这类突变细胞中，可逆地诱导所说的染色体的复制机制以成为实质上无功能的，

E)在利于这类突变细胞复制的条件下，培养这类突变细胞。

在本文中，表达“突变体文库”意味着一套细胞(细菌或噬菌体)(典型地为10⁵-10¹³个细胞或噬菌体)，它们由于编码兴趣多肽的一种特殊基因而不同。典型地，人们将可能在文库的每个成员中，引入一种或多种不同的氨基酸以改变这种特殊的多肽。

在本文中，表达“易错聚合酶”意指：在DNA复制过程中，聚合酶将以比通常用于这一目的的聚合酶(例如大肠杆菌DNA polⅠ、枯草芽孢杆菌DNA polⅠ、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶)更高的频率掺入错误(在一个给定位置的一个错误的核苷酸或引起一个或几个核苷酸的缺失或插入)。

在本文中表达“祖代细胞”意指其中没有突变引入的这类细胞。在本发明的某些实施方案中，突变循环可以重复，在那种情况下，这类最初突变的细胞将成为第二个突变循环的祖代细胞，等等。

在本文中表达“宿主染色体复制机制”意指DNA聚合酶或DNA聚合酶全酶，这些酶主要负责宿主染色体的复制，例如，大肠杆菌中的DNA聚合酶Ⅲ。

在本文中，表达“遗传元件”意指由RNA或DNA组成的一种小(从1或2千个碱基到100千个碱基)实体，此实体可独立地复制，即它包含复制起点。典型地，遗传元件将是噬菌体、噬菌粒或质粒。按照本发明，遗传元件也必须包含编码兴趣多肽的基因，它还可包含遗传标记，例如赋予对抗生素的抗性的基因。

能够不依赖于宿主复制机制复制的病毒、逆转录病毒或转座子(例如逆转录转座子)也可用作“遗传元件”。

Kim和Loeb(1995,PNAS 92:684-688)已表明：HIV逆转录酶(HIV-RT)能够补充大肠杆菌DNApolⅠ关于染色体DNA的复制和质粒DNA复制的起始。HIV-RT(和相关的逆转录病毒的逆转录酶)的误掺入率比DNA polⅠ的比率高几个数量级的大小，即每轮复制中每个碱基10^-3-10^-4个误掺入。在本发明的实施方案中，这类聚合酶替代突变的易错大肠杆菌DNA polⅠ的利用将明显地增加上述系统中复制错误的频率。

在本发明的另一个实施方案中，上述的突变循环可重复，即开关诱变聚合酶数次，因此产生更多突变体。此外，如果多拷贝质粒用作遗传元件，这个步骤还可帮助质粒的分离。

在某些遗传元件中，人们可预见：仅部分定位在复制起点附近的遗传元件由易错聚合酶复制。在这种情况下，兴趣基因应该位于这一区域内。

在本发明的特定实施方案中，遗传元件是噬菌体，其中编码兴趣多肽的基因定位于基因座，在此表达的多肽从噬菌体表面显示，因此筛选可直接完成(参见，Greg Winther，同上)。为确保噬菌体的DNA序列和显示的蛋白质之间的对应，选择或筛选前，初级噬菌体库应以低感染复数通过野生型大肠杆菌。

为进一步增加突变的频率，本发明的方法包括实施方案，在这些实施方案中，所说的方法与修复缺损的宿主(例如mutL、mutS、mutH)或增变基因基因组类型的组合结合使用。

在本文中，表达“修复缺损的宿主”意指包含一种或多种基因变化的细胞，其中所说的基因编码已知直接或间接参与DNA修复的蛋白质。这类突变的结果是引入的更高频率的突变(通过聚合酶、化学药品、X-射线、UV线等)将被修复并将“永久地”掺入基因组中，成为所谓的增变基因表型。这类基因的例子是mutL、mutS、mutH、mutT。

作为遗传元件，如上述表明的，人们可能利用噬菌粒替代质粒，以将变体产生连接到显示系统上，例如M13、fI、fd。

在本文中，表达“噬菌粒”意指一种质粒，除它的质粒复制起点外，该质粒还含有噬菌体的复制起点。噬菌粒依赖于能够作为一种质粒或作为一种噬菌体(经用辅助噬菌体感染)复制的条件。

基于噬菌粒的系统将包括噬菌粒的构建，该噬菌粒包含：

1)质粒的复制起点，例如ColEⅠ

2)M13噬菌体的复制起点

3)由兴趣基因组成的嵌合基因，其中该兴趣基因融合于编码GⅢ蛋白质的基因(φrum,P等，核酸研究21:4491-4498,1993)。

第一个步骤是通过生长/保持大肠杆菌菌株产生多样性，其中所说的大肠杆菌菌株以如上述的这种噬菌粒转化。第二个步骤是以辅助噬菌体感染以构造将包装到噬菌体微粒中的单链噬菌粒。然后，可对显示变体蛋白质的噬菌体进行选择。

某些噬菌体(如大肠杆菌中的T4或T7或芽孢杆菌中的SPOⅡ及Phi29)也包含它们自己的DNA聚合酶，且按照本发明，人们能预见实施方案，其中如上述的遗传元件是包含易错DNA聚合酶的噬菌体。

按照本发明，易错聚合酶典型地选自DNA聚合酶Ⅰ或逆转录酶。一种优选的易错聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或HIV逆转录酶的变体。

作为一种兴趣多肽，大数量是可能的，尤其是，这类显示生物活性的多肽可论及。其中，这些多肽是对预防和治疗人类和动物中各种紊乱和疾病重要的酶、激素、受体、凝血因子、抗微生物剂及其它这类多肽。

用于工业目的的酶也可论及。在这类工业酶中，这些酶属于羰基水解酶、羧基水解酶、氧化还原酶、转移酶、植酸酶、抗微生物的多肽、氧化还原酶、异构酶、裂合酶及连接酶。

在本文中，表达“羰基水解酶”意指水解包含-C(=O)-X基团的化合物，其中所说的X是氧或氮的酶。

属于羰基水解酶的特定种类是如水解酶(脂酶)和肽水解酶(蛋白酶)。

本文蛋白酶意指作为按照国际生物化学联合会与分子生物学(IUBMB)的提议(1992)在酶分类号E.C.3.4下划分的酶。

实施例包括选自那些在酶分类(E.C.)号下划分的蛋白酶：

3.4.11(即所谓的氨肽酶)，包括3.4.11.5(脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.9(X-脯氨酰氨肽酶)、3.4.11.10(细菌亮氨酰氨肽酶)、3.4.11.12(嗜热杆菌氨肽酶)、3.4.11.15(赖氨酰氨肽酶)、3.4.11.17(色氨酰氨肽酶)、3.4.11.18(蛋氨酰氨肽酶))；

3.4.21(即所谓的丝氨酸内肽酶)，包括3.4.21.1(胰凝乳蛋白酶)、3.4.21.4(胰蛋白酶)、3.4.21.25(Cucumisin)、3.4.21.32(Brachyurin)、3.4.21.48(塞里维辛)和3.4.21.62(枯草菌素)；

3.4.22(即所谓的半胱氨酸内肽酶)，包括3.4.22.2(番木瓜酶)、3.4.22.3(无花果蛋白酶)、3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、3.4.22.7(萝摩蛋白酶)、3.4.22.14(Actinidain)、3.4.22.30(番木瓜蛋白酶)以及3.4.22.31(Ananain)；

3.4.23(即所谓的天冬氨酸内肽酶)，包括3.4.23.1(胃蛋白酶A)、3.4.23.18(曲霉胃蛋白酶Ⅰ)、3.4.23.20(青霉蛋白酶)以及3.4.23.25(酵母蛋白酶)；和

3.4.24(即所谓的有机金属内肽酶)，包括3.4.24.28(杆菌溶素)。

相关的枯草杆菌蛋白酶的例子包含枯草杆菌蛋白酶BPN＇、枯草杆菌蛋白酶amylosacchariticus、枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶肠膜菌素肽酶、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、thermitase、水溶素、芽孢杆菌PB92蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶TW7以及蛋白酶TW3。

这类易于得到的市售蛋白酶的特定例子包括Esperase、Alcalase、Neutrase、Dyrazym、Savinase、Pyrase、胰蛋白酶NOVO(PTN)、Bio-Feed^TM Pro、Clear-Lens Pro(由Novo Nordisk A/S提供所有酶)。

其它市售蛋白酶的例子包括由Gist-Brocades N.V.销售的Maxatase、Maxacal、Maxapem、由Solvay et Cie销售的Opticlean和由Genencor International销售的Purafect。

人们将理解：蛋白酶变体也期待作为兴趣多肽。这类蛋白酶变体的例子在EP 130.756(Genentech)、EP214.435(Henkel)、WO87/04461(Amgen)、WO 87/05050(Genex)、EP251.446(Genencor)、EP260.105(Genencor)、Thomas等，(1985)，自然318,p.375-376,Thomas等，(1987)，分子生物学杂志，193,pp.803-813,Russel等，(1987)，自然328,p.496-500,WO 88/08028(Genex)、WO88/08033(Amgen)、WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)、WO91/00345(Novo Nordisk A/S)、EP525 610(Solvay)和WO 94/02618(Gist-Brocades N.V.)中公开。

蛋白酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第5卷描述的测定。

本文的脂酶意指作为依据国际生物化学联合会与分子生物学(IUBMB)的提议(1992)，在酶分类号E.C.3.1.1(羧酸酯水解酶)下划分的酶。

实施例包括选自属于酶分类(E.C.):3.1.1(即所谓的羧酸酯水解酶)(包括(3.1.1.3)三酰甘油脂酶、(3.1.1.4.)磷脂酶A₂)的那些酶中的脂酶。

脂酶的例子包括来源于下列微生物的脂酶。指明的专利出版物本文一并参考：腐质霉属(例如H.brevispora、H.lanuginosa、H.brevis var.thermoidea和H.insolens(US 4,810,414))、假单胞菌属(例如莓实假单胞菌、施氏假单胞菌、葱头假单胞菌和荧光假单胞菌(WO 89/04361)或Pseudomonas plantarii或Pseudomonas gladioli(US专利号4,950,417(Solvay酶))或产碱假单胞菌和假产碱假单胞菌(EP 218 272)或门多萨假单胞菌(WO 88/09367；US 5,389,536))、镰孢属(例如尖镰孢(EP130,064)或腐皮镰孢pisi(WO 90/09446))、毛霉属(也称根毛霉属)(例如米黑毛霉(EP 238 023))、色素杆菌属(尤其是粘稠色素杆菌)、曲霉属(尤其是黑曲霉)、假丝酵母属(例如C.cylindracea(也称皱落假丝酵母)或C.antarctica(WO 88/02775)或C.antarctica脂酶A或B(WO 94/01541和WO89/02916))、地霉属(例如白地霉(Schimada等，(1989)，生物化学杂志，106,383-388))、青霉属(例如沙门柏干酪青霉(Yamaguchi等)，(1991)，基因，103,61-67))、根霉菌属(例如R.delemar(Hass等，(1991)，基因，109,107-113)或雪白根霉(Kugimiya等，(1992)，生物科学生物技术生物化学，56,716-719)或米曲霉))、芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌(Dartois等，(1993),Biochemica等，生物物理学学报，1131,253-260)或嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/7744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422))。

易于得到的市售脂酶的特定例子包括Lipolase、Lipolase^TMUltra、Lipozyme、Palatase、Novozym435、Lecitase(全部由Novo Nordisk A/S提供)

其它脂酶的例子是Lumafast^TM，来自Genencor Int.公司的门多萨假单胞菌脂酶、Lipomax^TM，来自Gist Brocades/Genencor Int.公司的假产碱假单胞菌脂酶、来自Unilever的腐皮镰孢脂酶(角质酶)、来自Solvayenzymes的Bacillus sp.脂酶。其它脂酶可由其它公司得到。

脂酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinhein，第4卷描述的，或如在AF 95/5 GB(可向Novo NordiskA/S请求获得)中描述的测定。

在本文中，表达“糖酶”意指所有能够打断五碳和六碳的特定环状结构的糖链(例如淀粉)的酶(即按照国际生物化学和分子生物学联合会(IUBMB)的提议(1992)，属于酶分类号E.C.3.2(糖苷酶)的酶。能够使碳水化合物，例如六碳环状结构的碳水化合物(如D-葡萄糖)异构化为例如五碳环状结构(如D-果糖)的酶也包括在本发明的糖酶组中。

糖酶的例子包括选自属于酶分类(E.C.)号的糖酶：α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶(3.2.1.3)、纤维素酶(3.2.1.4)、内-1,3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、内-1,4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、壳多糖酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、淀粉-1,6-葡糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1,4-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖内1,3-β-D-葡糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精内1,6-葡糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖内1,3-α-葡糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖内1,6-β-葡糖苷酶(3.2.1.75)、阿拉伯聚糖内1,5-α-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、壳多聚糖酶(chitonanase)(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)。

有关糖酶的例子包括来源于Trichoderma harzianum的α-1,3-葡聚糖酶、来源于阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、乳糖酶(3.2.1.108)、壳多聚糖酶(chitonanase)(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)的α-1,6-葡聚糖酶。

有关糖酶的例子包括来源于Trichoderma harzianum的α-1,3-葡聚糖酶、来源于拟青霉属菌株的α-1,6-葡聚糖酶、来源于枯草芽孢杆菌的β-葡聚糖酶、来源于Humicola insolens的β-葡聚糖酶、来源于黑曲霉的β-葡聚糖酶、来源于木霉属菌株的β-葡聚糖酶、来源于溶黄嘌呤厄氏菌菌株的β-葡聚糖酶、来源于黑曲霉的外-1,4-α-D-葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)、来源于枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶、来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶、来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶、来源于米曲霉的α-淀粉酶、来源于非病原微生物的α-淀粉酶、来源于黑曲霉的α-半乳糖苷酶、来源于Humicola insolens的戊聚糖酶(Pentosanases)、木聚糖酶、纤维二糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、来源于Trichoderma reesei的纤维素酶、来源于非病原霉菌的纤维素酶、来源于黑曲霉的果胶酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶(arabinases)、半纤维素酶、来源于薄青霉的葡聚糖酶、来源于非病原霉菌的内葡聚糖酶、来源于Bacillus acidopullyticus的pullulanases、来源于脆壁克鲁维酵母的β-半乳糖苷酶、来源于Trichoderma reesei的木聚糖酶。

易于得到的市售糖酶的特定例子包括Alpha-Gal^TM、Bio-Feed^TMAlpha、Bio-Feed^TM Beta、Bio-Feed^TM Plus、Bio-Feed^TM Plus、Novozyme188、Carezyme、Celluclast、Cellusoft、Ceremyl、Citrozym^TM、Denimax^TM、Dezyme^TM、Dextrozyme^TM、Finizym、Funeamyl^TM、Gamanase^TM、Glucanex、Lactozym、Maltogenase^TM、Pentopan^TM、Pectinex^TM、Promozyme、Pulpzyme^TM、Novamyl^TM、Termamyl、AMG(淀粉葡糖苷酶Novo)、Maltogenase、Sweetzyme、Aquazym(由Novo Nordisk A/S提供所有的酶)。其它糖酶可由其它公司得到。

人们将理解：这类糖酶变体也期待作为兴趣多肽。

糖酶的活性可如在“酶促分析方法”，第三版，1984,Vellag Chemie,Weinheim，第4卷中描述的测定。

本文氧化还原酶意指依据国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的提议(1992)，属于酶分类号E.C.1(氧化还原酶)下的酶。

氧化还原酶的例子包括选自属于酶分类(E.C.)号的氧化还原酶：甘油-3-磷酸脱氢酶(NAD⁺)(1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶NAD(p)⁺(1.1.1.94)、甘油-3-磷酸1-脱氢酶(NADP)(1.1.1.94)、葡萄糖氧化酶(1.1.3.4)、己糖氧化酶(1.1.3.5)、儿茶酚氧化酶(1.1.3.14)、胆红素氧化酶(1.3.3.5)、丙氨酸脱氢酶(1.4.1.1)、谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2)、谷氨酸脱氢酶(NAD(P)⁺)(1.4.1.3)、谷氨酸脱氢酶(NADP⁺)(1.4.1.4)、L-氨基酸脱氢酶(1.4.1.5)、丝氨酸脱氢酶(1.4.1.7)、缬氨酸脱氢酶(NADP⁺)(1.4.1.8)、亮氨酸脱氢酶(1.4.1.9)、甘氨酸脱氢酶(1.4.1.10)、L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酶(1.4.3.3)、L-谷氨酸氧化酶(1.4.3.11)、6-赖氨酸蛋白质氧化酶(1.4.3.13)、L-赖氨酸氧化酶(1.4.3.14)、L-天冬氨酸氧化酶(1.4.3.16)、D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)、蛋白质二硫化物还原酶(1.6.4.4)、硫氧还蛋白还原酶(1.6.4.5)、蛋白质二硫键还原酶(谷胱甘肽)(1.8.4.2)、漆酶(1.10.3.2)、过氧化氢酶(1.11.1.6)、过氧化物酶(1.11.1.7)、脂氧合酶(1.13.11.12)、超氧化物歧化酶(1.15.1.1)。

所说的葡萄糖氧化酶可来源于黑曲霉。

所说的漆酶可来源于Polyporus pinsitus、Myceliophtorathermophila、灰盖鬼伞、立枯丝核菌、Rhizoctonia praticola、Scytalidiumthermophilum和Rhus vernicifera。

胆红素氧化酶可来源于Myrothechecium verrucaria。

例如，过氧化物酶可来源于大豆、辣根或灰盖鬼伞。

蛋白质二硫键还原酶可以是任何DK专利申请no.768/93,265/94和264/94(Novo Nordisk A/S)中论及的任意一种，这些本文一并参考，也包括牛来源的蛋白质二硫键还原酶、来源于米曲霉或黑曲霉的蛋白质二硫键还原酶及来源于大肠杆菌的DsbA或DsbC。

易于得到的市售氧化还原酶的特定例子包括Gluzyme^TM(由NovoNordisk A/S提供的酶)。然而其它氧化还原酶可由其它公司得到。

人们将理解氧化还原酶变体也期待作为兴趣多肽。

氧化还原酶的活性可如在“酶促分析方法”，第三版，1984,VerlagChemie,Weinheim，第3卷中描述的测定。

在本文中，转移酶按照国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的提议(1992)，属于酶分类号E.C.2的酶。

转移酶可以是转移酶亚组的任何转移酶：转移一碳基团的转移酶(E.C.2.1)、转移醛或残基的转移酶(E.C.2.2)、酰基转移酶(E.C.2.3)、葡糖基转移酶(E.C.2.4)、转移烷基或芳基基团、其它甲基基团的转移酶(E.C.2.5)、转移含氮基团的转移酶(2.6)。

在一优选的实施方案中，转移酶是转谷氨酰胺酶E.C 2.3.2.13(谷氨酰胺蛋白质γ-谷氨酰胺转移酶)。

转谷氨酰胺酶是能够催化酰基转移反应的酶，其中结合肽的谷氨酰胺残基的γ-甲酰氨基是酰基供体。在各种化合物中，伯氨基基团可作为酰基受体起作用，随后形成结合肽的谷氨酸的单一取代的γ-酰胺。当肽链中赖氨酸残基的ε-氨基用作酰基受体时，转移酶形成分子内或分子间γ-谷氨酰基-ε-赖氨酰交叉连接。

转谷氨酰胺酶的例子在未决的DK专利申请990/94(Novo Nordisk A/S)中描述。

转谷氨酰氨酶可以是来源于人、动物(例如牛)或微生物的。

这类转谷氨酰胺酶的例子是动物衍生的转谷氨酰胺酶、FXⅢa；来源于Physarum polycephalum的微生物转谷氨酰胺酶(Klein等，细菌学杂志，174,p.2599-2605)；来源于Streptomyces sp.(包含Streptomycelavendulae、利迪链霉菌(以前的黎巴嫩链霉菌)及Streptoverticillium sp.(包括茂原链轮丝菌、肉桂链轮丝菌和灰肉色链轮丝菌)的转谷氨酰胺酶(Motoki等，US5,156,956；Andou等，US5,252,469；Kaempfer等，普通微生物学杂志，137,1831-1892；Ochi等，国际系统细菌学杂志，44，285-292；Andou等，US5,252,469；Williams等，普通微生物学杂志，129,1743-1813)。

人们将理解：转移酶变体也期待作为兴趣多肽。

转谷氨酰胺酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,VerlagChemie,Weinheim，第1-10卷中描述的测定。

在本文中，植酸酶依据国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)的提议(1992)，属酶分类号E.C.3.1.3(磷酸单酯水解酶)的酶。

植酸酶是由微生物产生的酶，该酶催化植酸酯转化为肌醇和无机磷。

产生植酸酶的微生物包含细菌(如枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和假单胞杆菌)、酵母(如酿酒酵母)及真菌(如黑曲霉、无花果曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、土曲霉或构巢曲霉以及各种其它曲霉属物种)。

植酸酶的例子包括选自属于酶分类(E.C.)号：3-植酸酶(3.1.3.8)和6-植酸酶(3.1.3.26)的那些植酸酶。

植酸酶的活性可如“酶促分析方法”，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷描述的测定，或可按照EP-A1-0 420 358，实施例2A中描述的方法测定。

在本文中，抗微生物多肽可以是任何显示抗微生物活性(如抗真菌、抗细菌和/或抗杀虫剂活性)的多肽。

这类多肽也可以显示其它活性，如酶活性。

按照本发明，抗微生物的多肽的例子包括：WO 94/01459(NovoNordisk A/S)中描述的，来源于霉菌弯孢霉属的杀真菌活性多肽；EP403.458(Kabigen AB)描述的抗细菌多肽；WO 92/15691(ImperialChem Ind.PLC)中描述的从Mirabilis种子分离的抗微生物蛋白质；WO92/22578(Boman等)中描述的从猪小肠的抽提物中分离的抗细菌多肽；如JP-60130599中描述的，具有由Hansenula spp.的酵母积累的酵母致死作用的多肽；Phytolacca insularis抗病毒蛋白质，此蛋白质可用作美国专利no.5,348,865(Jin Ro有限公司)中描述的抗微生物剂；来源于美国专利no.5,354,681(Novo Industri A/S)中描述的达松维尔拟诺卡氏菌的细菌裂解酶制剂。

其它抗微生物多肽的例子是爪蟾抗菌肽、protegrin、防卫素、假霉菌素、mutanolysin和N-乙酰溶菌酶。

另一方面，本发明涉及用于产生编码所需的兴趣多肽的变体的DNA序列的方法，其中

(ⅰ)突变体文库用上述方法产生，

(ⅱ)在利于所说的兴趣基因表达的条件下，培养所说的文库以产生变体多肽，

(ⅲ)筛选或选择具有所需性质的所说的变体多肽，以及鉴定并分离产生所需变体的宿主，

(ⅳ)分离编码所说的变体的DNA。

另一方面，本发明涉及用于测定编码兴趣多肽所需变体的DNA序列的方法，其中

(ⅰ)如上述的产生突变体文库，

(ⅱ)把所说的文库在利于所说的兴趣基因表达的条件下培养以产生变体多肽，

(ⅲ)筛选或选择具有所需性质的所说的变体多肽，及鉴定并分离产生所需变体的宿主，

本发明的这一方面可通过稀释(例如，在微滴定板上)并培养文库完成，因此，形成每一源于文库的一个成员的群体，筛选每个群体中产生的具有所需性质的变体多肽。作为选择，可把文库在包含所需的生长培养基的琼脂板上培养，其中所说的培养基可使得筛选或选择具有所需性质的变体多肽。

如果利用噬菌体显示方法，筛选或选择直接由噬菌体完成。

用于选择的标准将按照兴趣多肽变体的最终用途变化，但典型地，检验的性质可包括各种培养基的溶解性和半衰期、抗原性和变应原性、热稳定性、氧化稳定性、存储稳定性、底物特异性和亲和性、对非水溶剂的稳定性、pH轮廓、离子强度依赖性、催化效率以及与其它预见的终产品的组分的相容性，其中，多肽变体将形成终产品的一部分。

对将用于去污剂的酶，调查的进一步性质是洗涤性能和与各种表面尤其是织物的相容性。

其它的许多标准可能论及。

一经鉴定产生满足选择的标准的变体多肽的群体，便可利用本领域众所周知的方法，分离编码兴趣多肽变体的DNA，并测序。

本发明还包含用于产生所需的多肽变体的方法，其中

ⅰ)把如上表明的测定的DNA序列以一定方式引入合适的宿主中，因此，此序列可在所说的宿主中表达，

(ⅲ)回收所说的多肽变体。

本发明可以任何细胞，尤其是以任何微生物细胞利用，但通常适合于利用原核生物，尤其是细菌，优选地为芽孢杆菌属的细菌等。

在芽孢杆菌中，优选的是利用选自迟缓芽孢杆菌、地衣型芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等的菌株。

对于某些用途，优选的是利用微生物细胞，该细胞是真菌，尤其是丝状真菌，优选地是曲霉属、木霉属等的细胞。

在曲霉属中，优选的是利用选自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等的菌株。

在木霉属中，优选的是利用选自T.reseei等的菌株。

在其它的情况下，更有利的是利用选自BHK等细胞的哺乳动物细胞。

本发明不应该仅限于以上说明书中提及的特定例子或实施方案或以下实施例。

材料和方法

实施例

实施例1

利用的系统是大肠杆菌宿主细胞，该细胞由许多染色体突变来表征，这些突变是：

ⅰ)poIC基因的ts(温敏)突变，其中所说的基因编码DNA聚合酶Ⅲ，该酶是主要的复制聚合酶

ⅱ)poIA基因的突变，其中所说的基因编码DNA聚合酶Ⅰ，其中所说的突变3’-5’外切核酸酶活性的降低导致错误率增加。

ⅲ)由于mutL突变的修复缺陷。

体内诱变的靶是具有(ⅰ)读框变换突变或(ⅱ)引入到tet基因中的终止密码子的质粒pBR322(colEl起点)，编码具有抗四环素抗性的蛋白质。

每一种情况下，突变的修复导致一种显性四环素抗性表型。

pBR322也含有编码具有抗氨苄青霉素抗性的bla基因。平板培养暴露在“引入突变”的条件下的培养物后，靶区域的高频诱变被看作是四环素抗性菌落的高频出现。

把在37℃下生长至660nm处测得光密度为1的大肠杆菌培养物暴露于限制性温度(例如42℃)下2、4或16小时。在所述的这些时间点，把培养物的稀释系列铺覆在以1)氨苄青霉素(AmpR菌落)，2)四环素和氨苄青霉素(AmpR和tetR菌落)补充的LB琼脂平板上。

四环素抗性菌落与氨苄青霉素抗性菌落的比率表明：在含有修复的tet基因的一个拷贝的培养物中的细胞数目，其中所说的修复的tet基因表明一个特异性诱变事件。

这意指，如果克隆具有四环素抗性，至少已发生一种特异性突变，以修复最初引入的基因缺损。

说明书中引用的参考文献

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酶促分析方法，第三版，1984,Verlag Chemie,Weinheim，第1-10卷。

AF 95/5 GB(可以向Novo NordiskA/S请求获得)。

Claims

1．一种用于在包含许多突变的遗传元件的细胞中体内产生文库的方法，其中，一种易错聚合酶用于各祖代细胞复制所有或部分遗传元件，该遗传元件包括

ⅰ)复制起点，复制从此开始，

ⅱ)可有可无的遗传标记，例如，赋予对抗生素的抗性的基因，

2．一种用于在包含许多突变的遗传元件的细胞中体内产生文库的方法，该方法包括

A)提供微生物细胞，该细胞具有

ⅰ)易错聚合酶，该酶不依赖于所说的细胞的染色体复制机制，复制全部或部分遗传元件，该遗传元件包含

a)复制起点，复制从此开始，

c)编码兴趣多肽的基因，

ⅱ)染色体的复制机制，此机制可以可逆地诱导为实质上无功能，

B)在利于这类细胞复制的条件下，培养这类细胞以获得许多祖代细胞，

C)在所说的祖代细胞中可逆地诱导所说的染色体复制机制以成为实质上无功能的，达一段时间以使得足可通过所说的易错聚合酶复制所说的遗传元件，以在所说的遗传元件中产生突变，

D)在这类突变细胞中可逆地诱导所说的染色体复制机制成为实质上无功能的，

E)在利于这类突变细胞复制的条件下，培养这类突变细胞。

3．权利要求1或2的方法，其中所说的细胞还包含缺损修复系统。

4．权利要求1-3之任一的方法，其中所说的遗传元件是质粒、噬菌粒、噬菌体、病毒、逆转录病毒或逆转录转座子。

5．权利要求1-4之任一的方法，其中所说的细胞是微生物细胞。

6．权利要求1-5之任一的方法，其中所说的易错聚合酶选自DNA polⅠ、DNA pol Ⅱ、逆转录酶，更具体地说选自大肠杆菌DNA polⅠ、枯草芽孢杆菌DNA polⅠ、HIV逆转录酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶。

7．权利要求1-6之任一的方法，其中所说的可以可逆诱导为实质上无功能的染色体复制机制是温敏大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ。

8．一种用于测定编码所需的兴趣多肽的变体的DNA序列的方法，其中

(ⅰ)用权利要求1-7之任一的方法产生突变体文库，其中所说的遗传元件包含编码所说的兴趣多肽的基因，

(ⅲ)筛选或选择具有所需性质的所说的变体多肽，鉴定并分离产生所需变体的宿主，

9．一种用于产生编码所需的兴趣多肽的变体的DNA序列的方法，其中

(ⅳ)分离编码所说变体的DNA。

10．一种产生所需多肽变体的方法，其中

(ⅰ)把按照权利要求9获得的或按照权利要求8测定的DNA序列以一定方式引入合适的宿主中，以便该DNA序列可在所说的宿主中表达，

(ⅱ)在利于所说的DNA序列表达的条件下，培养所说的宿主，

(ⅲ)回收所说的多肽变体。

11．权利要求1-10之任一的方法，其中所说的兴趣多肽是一种酶。

12．权利要求11的方法，其中所说的酶是羰基水解酶、糖酶、氧化还原酶、转移酶、植酸酶、连接酶、裂合酶及抗微生物多肽。

13．权利要求12的方法，其中所说的羰基水解酶是蛋白酶或脂酶。

14．权利要求12的方法，其中所说的糖酶是淀粉酶、葡糖苷酶、纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、壳多糖酶、聚半乳糖醛酸酶、溶菌酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、乳糖酶、壳质酶、木糖异构酶、果胶酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶、内葡聚糖酶。

15．权利要求12的方法，其中所说的氧化还原酶是脱氢酶、氧化酶、还原酶、漆酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、脂氧合酶、超氧化物歧化酶。

16．权利要求12的方法，其中所说的转移酶是转移一碳基团的转移酶、转移醛或残基的转移酶、酰基转移酶、葡糖基转移酶、转移烷基或芳基、其它甲基基团的转移酶、转移含氮基团的转移酶。

17．权利要求1-16之任一的方法，其中所说的细胞是原核生物，尤其是细菌，优选的是芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、葡萄球菌属及链球菌属细菌。

18．权利要求17的方法，其中所说的埃希氏杆菌属是从大肠杆菌中选择的菌株。

19．权利要求17的方法，其中所说的芽孢杆菌是选自迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的菌株。

20．权利要求1-16之任一的方法，其中所说的细胞是真菌，尤其是酵母或丝状真菌，优选的是曲霉属、木霉属的真菌。

21．权利要求20的方法，其中所说的曲霉属选自米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉。

22．权利要求20的方法，其中所说的木霉属选自T.reseei。

23．权利要求1-16之任一的方法，其中所说的细胞是选自BHK细胞或昆虫细胞的哺乳动物细胞。