JP7012533B2 - タンパク質発現の増強 - Google Patents
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Description
本願は、米国特許法第119条の下、2014年12月16日に出願された米国仮特許出願第62/092,461号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的手段により提出された、2015年10月29日作成の11キロバイトのサイズを有するNB40772-WO-PCT_SequenceListing.txtという名の配列表テキストファイルの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般に、1種以上の目的タンパク質を発現および/または産生する能力が増大するよう変異(または改変)させたグラム陽性菌細胞(ならびに、その作製方法および使用方法)に関する。
Gap opening penalty:10.0
Gap extension penalty:0.05
Protein weight matrix:BLOSUM series
DNA weight matrix:IUB
Delay divergent sequences %:40
Gap separation distance:8
DNA transitions weight:0.50
List hydrophilic residues:GPSNDQEKR
Use negative matrix:OFF
Toggle Residue specific penalties:ON
Toggle hydrophilic penalties:ON
Toggle end gap separation penaltyOFF
で使用して決定することができる。
sinR遺伝子の変異によるバチルス属(Bacillus)のタンパク質発現の増加
A.バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のsinR遺伝子の変異
Janes and Stibitz(Infection and Immunity,74(3):1949,2006)に記載されたマーカーレス遺伝子置換法を用いて、親バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)株(oppA::tetR、ΔaprE、ΔnprE、degUHy32;本明細書では「親株」と呼ぶ)のsinR遺伝子にサイレント変異を導入した。sinRサイレント変異は、野生型sinRのコード領域のセンス鎖のヌクレオチド位330における、グアニン(G)からアデニン(A)への単一のヌクレオチド変化である(配列番号1は野生型配列を示し、配列番号2はSinRアミノ酸配列を示し、そして配列番号3はG330Aサイレント変異を示す)(サイレント変異は、遺伝子のコード領域の部位の核酸配列を変化させるが、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列は変化させない)。
EcoRI sinR FW:5’-caggaattcctgacgtctcaaatatgtgactattg-3’ 配列番号4
BamHI sinR RV:5’-ctcggatccgagaaattgaaagaaagacaaaagc-3’ 配列番号5
バチルス・サブチリス168(BKE24610)由来のsinR欠失株を、Bacillus Genetic Stock Center(http://www.bgsc.org/)から入手した。BKE24610の染色体DNAを抽出し、バチルス・サブチリス(B.subtilis)「親株」を形質転換した。欠失は、PCRおよびsinR遺伝子座の配列決定により確認した。得られた株を、B.subtilisΔsinRまたはsinR::ermRと表示する。図2にsinR欠失の遺伝子マップを示す。エリスロマイシン耐性マーカーの除去を容易にするために、プラスミドにコードされたcreリコンビナーゼを使用して、sinR遺伝子のORFを欠失させ、loxP部位(lox71およびlox66)隣接のエリスロマイシン耐性カセットで置換した。隣接するsinIおよびtasA遺伝子のORFは、sinR遺伝子がノックアウトされても不変であった。
FNAプロテアーゼ(Y217L置換を含むサブチリシンBPN’;配列番号6)の発現に対するsinR変異および欠失の影響を試験するために、親株ならびにsinR*およびΔsinR株のnprE遺伝子座に、コンストラクトnprE::PrrnE2/3-FNA-catR(バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)のrrnE2/3リボソームプロモーターからFNAを発現し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ耐性(catR)マーカー遺伝子を含む)を導入した。形質転換細胞を、5ppmのクロラモフェニコールを含むルリア寒天プレート上で選択した。LB培地により30℃で終夜、野生型/親株および変異株(sinR*およびsinR::ermR)を培養した。10マイクロリットルの前培養を使用して、165マイクロリットルのブレインハートインフュージョン(BHI)培地に播種した。37℃で菌株を培養し、3時間培養したものから試料を採取した。SpectraMax分光光度計(Molecular Devices、Downington,PA,USA)を使用し、20倍に希釈した培養液全体の細胞密度を600nmで1時間間隔で測定した。600nmの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図3Aに示す。図3Aは、FNA発現親株(WT)ならびにsinR*株およびΔsinR株の細胞増殖が、7時間の培養で同等であったことを示す。
アミラーゼ(配列番号7)発現に対するsinR変異および欠失株の影響を決定するために、sinR遺伝子が欠失した、またはsinR変異を含むパチリス・サブチリス(B.subtilis)親株に、コンストラクトPaprE-amyE catRを導入した。5ppmのクロラムフェニコールを含むLAプレート上で、形質転換体を選択した。ルリア培地中で終夜、WT株(CB15-14)および変異株(sinR*およびsinR::ermR)を培養した。10マイクロリットルの前培養を使用して、165マイクロリットルのトリプチックソイブロス(Bacto Tryptone 17g/L、Bacto Soytone 3g/L、グルコース2.5g/L、塩化ナトリウム5g/L、リン酸水素二カリウム2.5g/L pH7.3)に播種し、30℃で菌株を培養してamyEアミラーゼの発現を試験した。SpectraMax分光光度計(Molecular Devices、Downington,PA,USA)を使用し、細胞密度を600nmで1時間間隔で測定した。600nmの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図4Aに示す。図4Aは、AmyE発現親株と、AmyE発現sinR*およびΔsinR株の細胞増殖は同等であり、バチルス・サブチリス(B.subtilis)株のsinR遺伝子の変異または欠失が、細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す。
内在性遺伝子の発現に対するsinR変異またはsinR欠失の影響を試験するために、前述したように、sinR変異またはsinR欠失を親株に導入した。振盪フラスコ中、BHI培地で、ペクチン酸リアーゼ(配列番号8)タンパク質の活性を評価した。LB培地により30℃で終夜、野生型/親株および変異株(sinR*およびsinR::ermR)を培養した。1ミリリットルの前培養を使用して、振盪フラスコ中の20mlのBHI培地に播種した。37℃で株を培養し、ペクチン酸リアーゼ酵素の発現を試験した。SpectraMax分光光度計(Molecular Devices、Downington,PA,USA)を使用し、細胞密度を600nmで1時間間隔で測定した。600nmの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図5Aに示す。図5Aは、親株と、sinR*およびΔsinR株との細胞増殖は同等であり、菌株のsinR遺伝子の変異または欠失が、細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す。
5’-caggaattcctgacgtctcaaatatgtgactattg-3’
5’-ctcggatccgagaaattgaaagaaagacaaaagc-3’
Claims (35)
- グラム陽性菌細胞における目的タンパク質(POI)の発現を増大させる方法であって、
(a)目的タンパク質を産生する変異グラム陽性菌細胞を得る工程であって、前記変異グラム陽性菌細胞は、sinオペロンのsinR遺伝子の発現を減少させる少なくとも1つの遺伝子変異を含み、前記少なくとも1つの遺伝子変異は、前記sinR遺伝子における配列番号1の330番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にあるサイレント変異である工程と、
(b)前記POIを発現するような条件下で前記変異グラム陽性菌細胞を培養する工程と
を含み、
前記POI量の増大は、非変異グラム陽性菌細胞における同POIの発現に対するものである方法。 - 前記変異グラム陽性菌細胞は、バチルス(Bacillus)属のメンバーである請求項1に記載の方法。
- 前記バチルス(Bacillus)属細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・クラウシイ(B.clausii)、バチルス・ソノレンシス(B.sonorensis)、バチルス・ハロデュランス(B.halodurans)、バチルス・プミルス(B.pumilus)、バチルス・ラウツス(B.lautus)、バチルス・パブリ(B.pabuli)、バチルス・セレウス(B.cereus)、バチルス・アガラドハエレンス(B.agaradhaerens)、バチルス・アキバイ(B.akibai)、バチルス・クラーキイ(B.clarkii)、バチルス・シュードファーマス(B.pseudofirmus)、バチルス・レヘンシス(B.lehensis)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、バチルス・コアグランス(B.coagulans)、バチルス・サークランス(B.circulans)、バチルス・ギブソニイ(B.gibsonii)、およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)からなる群から選択される請求項2に記載の方法。
- バチルス属(Bacillus)細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)またはバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)である請求項3に記載の方法。
- 前記遺伝子変異は、さらに、前記sinオペロンに由来するmRNA転写レベルの減少と定義される請求項1に記載の方法。
- 前記mRNA転写レベルの減少は、sinR mRNA転写である請求項5に記載の方法。
- 前記sinR mRNA転写レベルの減少は、前記非変異細菌対照細胞に対して少なくとも10%である請求項6に記載の方法。
- 前記sinR遺伝子の核酸配列は、配列番号1と少なくとも90%同一である請求項1に記載の方法。
- 前記サイレント変異は、配列番号1の330番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置におけるGからAへの変異である請求項1に記載の方法。
- 前記変異は、さらに、前記sinR遺伝子の一部の欠失を含む請求項1に記載の方法。
- 前記POIは、前記変異細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または前記変異細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる請求項1に記載の方法。
- 前記POIは酵素である請求項1に記載の方法。
- 前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノぺプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項12に記載の方法。
- 前記POIを回収する工程をさらに含む請求項1に記載の方法。
- POIの発現増加量は、前記非変異グラム陽性対照細胞に対して少なくとも10%である請求項1に記載の方法。
- 目的タンパク質を、非変異グラム陽性菌対照細胞の同POIの発現に比べてより多く発現する変異グラム陽性菌細胞であって、前記変異グラム陽性菌細胞は、sinオペロンのsinR遺伝子の発現を減少させる少なくとも1つの遺伝子変異を含み、前記少なくとも1つの遺伝子変異は、前記sinR遺伝子における配列番号1の330番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にあるサイレント変異である変異細胞。
- バチルス(Bacillus)属のメンバーである請求項16に記載の変異細胞。
- 前記バチルス(Bacillus)属細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)、バチルス・レンツス(B.lentus)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・クラウシイ(B.clausii)、バチルス・ソノレンシス(B.sonorensis)、バチルス・ハロデュランス(B.halodurans)、バチルス・プミルス(B.pumilus)、バチルス・ラウツス(B.lautus)、バチルス・パブリ(B.pabuli)、バチルス・セレウス(B.cereus)、バチルス・アガラドハエレンス(B.agaradhaerens)、バチルス・アキバイ(B.akibai)、バチルス・クラーキイ(B.clarkii)、バチルス・シュードファーマス(B.pseudofirmus)、バチルス・レヘンシス(B.lehensis)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)、バチルス・コアグランス(B.coagulans)、バチルス・サークランス(B.circulans)、バチルス・ギブソニイ(B.gibsonii)、およびバチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)からなる群から選択される請求項17に記載の変異細胞。
- バチルス属(Bacillus)細胞は、バチルス・サブチリス(B.subtilis)またはバチルス・リケニホルミス(B.licheniformis)である請求項18に記載の変異細胞。
- 前記遺伝子変異は、さらに、前記sinオペロンに由来するmRNA転写レベルの減少と定義される請求項16に記載の変異細胞。
- 前記mRNA転写レベルの減少は、sinR mRNA転写である請求項20に記載の変異細胞。
- 前記sinR mRNA転写レベルの減少は、前記非変異細菌対照細胞に対して少なくとも10%である請求項21に記載の変異細胞。
- 前記sinR遺伝子の核酸配列は、配列番号1と少なくとも90%同一である請求項16に記載の変異細胞。
- 前記サイレント変異は、配列番号1の330番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置におけるGからAへの変異である請求項16に記載の変異細胞。
- 前記変異は、さらに、前記sinR遺伝子の一部の欠失を含む請求項16に記載の変異細胞。
- 前記POIは、前記変異細菌細胞に対し外来性の遺伝子、または前記変異細菌細胞に対し内在性の遺伝子によってコードされる請求項16に記載の変異細胞。
- 前記POIは酵素である請求項16に記載の変異細胞。
- 前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される請求項27に記載の変異細胞。
- POIの発現増加量は、前記非変異グラム陽性対照細胞に対して少なくとも10%である請求項16に記載の変異細胞。
- 前記目的タンパク質を発現するような条件下で請求項16に記載の変異細胞を培養する工程を含む、前記目的タンパク質を製造する方法。
- 配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有する野生型sinR遺伝子由来のポリヌクレオチド変異体であって、サイレント変異によって遺伝子の発現は減少しているがsinRタンパク質をコードしており、ミスセンス変異、フレームシフト変異、ナンセンス変異、挿入および/または欠失を含み、配列番号1の330番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチド位置にサイレント変異を含む、ポリヌクレオチド変異体。
- 前記配列番号1の330番目のヌクレオチドに対応する位置におけるサイレント変異は、GからAへのヌクレオチド置換である請求項31に記載のポリヌクレオチド変異体。
- 請求項31に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
- 相同組み換えによって内在性染色体sinR遺伝子を置換するターゲティングベクターである請求項33に記載のベクター。
- グラム陽性菌細胞における目的タンパク質(POI)の発現を増大させる方法であって、
(a)請求項34に記載のベクターで親グラム陽性菌細胞を形質転換する工程であって、前記ベクターと親sinR遺伝子の対応する領域との間の相同組み換えによって変異グラム陽性菌細胞が生成される工程と、
(b)前記POIを発現に適した条件下で前記変異細胞を培養する工程と
を含み、
前記POIの発現の増大は、非変異グラム陽性菌対照細胞における同POIの発現に対するものである方法。
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