KR20220106238A - 향상된 단백질 발현 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로, 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변화를 갖는 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 sin 오페론에서의 유전자의 발현을 감소시킴으로써 관심 대상의 하나 이상의 단백질의 발현을 향상시키는 하나 이상의 유전자 변화(genetic alteration)를 갖는 변경된 그람(Gram) 양성 미생물을 포함한다.

Description

향상된 단백질 발현{ENHANCED PROTEIN EXPRESSION}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 35 U.S.C. § 119 하에, 2014년 12월 16일자로 출원된 미국 가출원 제62/092,461호의 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 일반적으로 분자 생물학, 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 생성 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본원에 개시된 다양한 실시 양태에서, 본 발명은 관심 대상의 단백질(protein of interest; POI)의 발현의 증가로 이어지는 유전자 변화(genetic alteration)를 갖는 그람(Gram) 양성 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

서열 목록의 언급

NB40772-WO-PCT_SequenceListing.txt로 명명된 텍스트 파일 서열 목록의 전자 제출 내용은 2015년 10월 29일자로 생성되었으며, 크기가 11 KB이고, 본원에 참고로 포함된다.

유전 공학은 미생물의 개선이 산업용 생물반응기, 세포 공장으로서 그리고 식품 발효에서 사용되게 하였다. 다수의 바실루스(Bacillus) 종을 포함하는 그람-양성 유기체가 다수의 유용한 단백질 및 대사 산물을 생성하는 데 사용된다 (예를 들어 문헌[Zukowski, “Production of commercially valuable products”, Doi and McGlouglin (eds.) Biology of Bacilli: Applications to Industry, Butterworth-Heinemann, Stoneham. Mass pages 311-337, 1992] 참조). 산업계에서 사용되는 일반적인 바실루스 종은 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 비. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens) 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)를 포함한다. 이러한 바실루스 종의 주(strain)는, 그의 GRAS(일반적으로 안전하다고 인정됨) 상태 때문에, 식품 및 제약 산업에서 이용되는 단백질의 생성을 위한 천연 후보이다. 그람-양성 유기체에서 생성되는 단백질의 예는 효소, 예컨대 α-아밀라아제, 중성 프로테아제, 알칼리 (또는 세린) 프로테아제 등을 포함한다.

박테리아 숙주 세포에서의 단백질 생성의 이해에 있어서의 진전에도 불구하고, 본 기술 분야에서 증가된 수준의 관심 대상의 단백질을 발현하는 새로운 재조합 박테리아 주를 개발할 필요성이 여전히 남아있다.

본 발명의 특정 실시 양태는 증가된 수준의 관심 대상의 단백질을 발현하는 재조합 그람 양성 세포 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 특정 실시 양태는 유전자 변화를 갖지 않는 박테리아 세포와 비교하여 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변화를 갖는 박테리아 세포에 관한 것이다.

따라서, 본원에 개시된 특정 실시 양태는 그람 양성 박테리아 세포에서 관심 대상의 단백질(이하, “POI”)의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 특정 실시 양태는 (a) POI를 생성하는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 수득하는 단계 (여기서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함함) 및 (b) 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 POI가 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계 (여기서, POI의 양은 비변경된 그람 양성 박테리아 세포에서의 상기 POI의 발현에 비하여 증가됨)를 포함하는, 그람 양성 박테리아 세포에서 POI의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

다른 실시 양태에서, 본 발명은 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 본 발명은 비변경된 그람 양성 박테리아 대조 세포에서의 POI의 발현에 비하여 증가된 양의 POI를 발현하는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 제공하며, 여기서, 변경된 박테리아 세포는 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함한다.

본 발명의 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스 속의 임의의 구성원일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스(B.　lentus), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 스테아로서모필루스(B. stearothermophilus), 비. 알칼로필루스(B. alkalophilus), 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 소노렌시스(B. sonorensis), 비. 할로두란스(B.　halodurans), 비. 푸밀루스(B. pumilus), 비. 라우투스(B. lautus), 비. 파불리(B. pabuli), 비. 세레우스(B. cereus), 비. 아가라드하에렌스(B. agaradhaerens), 비. 아키바이(B akibai), 비. 클라르키이(B. clarkii), 비. 슈도피르무스(B. pseudofirmus), 비. 레헨시스(B. lehensis), 비. 메가테륨(B. megaterium), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 서큐란스(B. circulans), 비. 깁소니이(B. gibsonii), 및 비. 튜린기엔시스(B. thuringiensis)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 특정 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스 또는 비. 리케니포르미스이다. 다른 특정 실시 양태에서, 바실루스 세포는 비. 서브틸리스 또는 비. 리케니포르미스이다.

특정 실시 양태에서, POI는 변경된 박테리아 세포에 대하여 외인성인 유전자 또는 변경된 박테리아 세포에 대하여 내인성인 유전자에 의해 코딩된다. 특정 실시 양태에서, POI는 효소이다. 다른 실시 양태에서, POI는 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티다아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 키티나아제, 키모신, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, 에스테라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α- 글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코아밀라아제, 글루코스 옥시다아제, α-글루코시다아제, β-글루코시다아제, 글루쿠로니다아제, 헤미셀룰라아제, 헥소스 옥시다아제, 하이드롤라아제, 인버타아제, 이소머라아제, 락카아제, 리파아제, 라이아제, 만노시다아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제, 펙테이트 라이아제, 펙틴 아세틸 에스테라아제, 펙틴 데폴리머라아제, 펙틴 메틸 에스테라아제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 퍼옥시다아제, 페놀옥시다아제, 피타아제, 폴리갈락투로나아제, 프로테아제, 람노-갈락투로나아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라아제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나아제, 자일라나아제, 헥소스 옥시다아제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소이다.

특정 실시 양태에서, POI는 프로테아제이다. 특정 실시 양태에서, 프로테아제는 서브틸리신이다. 다른 특정 실시 양태에서, 서브틸리신은 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN’, 서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg), 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 서브틸리신 309, 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시 양태에서, 그러한 변경된 그람 양성 박테리아 세포 및 이의 방법은 POI의 회수를 추가로 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 비변경된 그람 양성 대조 세포에 비하여 발현 POI의 양의 증가는 10% 이상이다.

다른 특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포 (및 이의 방법)는 degU, degQ, degS, scoC4, 및 oppA로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자의 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 돌연변이는 degU(Hy)32이다.

다른 특정 실시 양태는 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 야생형 sinR 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 변이체에 관한 것이며, 여기서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 미스센스(missense) 돌연변이, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 넌센스(nonsense) 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 330에 상응하는 뉴클레오티드 위치에서의 침묵 돌연변이를 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 침묵 돌연변이는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 330에 상응하는 위치에 있으며, 여기서, 침묵 돌연변이는 G에서 A로의 뉴클레오티드 치환이다.

다른 특정 실시 양태는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 다른 실시 양태에서, 벡터는 상동 재조합에 의해 내인성 염색체 sinR 유전자를 대체하는 표적화 벡터이다.

다른 특정 실시 양태는 그람 양성 박테리아 세포에서 관심 대상의 단백질(POI)의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 이는 (a) 모(parental) 그람 양성 박테리아 세포를 폴리뉴클레오티드 변이체를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계 (여기서, 상기 벡터와 모 sinR 유전자의 상응하는 영역 사이의 상동 재조합은 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 생성함) 및 (b) 변경된 세포를 POI의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 (여기서, POI의 증가된 발현은 비변경된 그람 양성 박테리아 세포에서의 상기 POI의 발현과 비교한 것임)를 포함한다.

특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 관심 대상의 단백질을 발현하며, 여기서, POI를 코딩하는 발현 카세트는 모 그람 양성 박테리아 세포 내로 도입된다.

다른 실시 양태에서, 방법 (및 이의 조성물)은 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 관심 대상의 단백질이 변경된 그람 양성 박테리아 세포에 의해 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 특정한 실시 양태에서, 조성물 및 이의 방법은 POI의 회수를 추가로 포함한다.

특정 실시 양태에서, 적어도 하나의 돌연변이는 침묵 돌연변이며, 여기서, 상기 돌연변이는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 729에 상응하는 뉴클레오티드 위치에 있다. 특정 실시 양태에서, 돌연변이는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 729에 상응하는 뉴클레오티드 위치에서의 C에서 T로의 돌연변이이다. 특정 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이 서열은 전부의 또는 일부분의 서열 번호 3의 서열에 대하여 적어도 90% 동일하다. 특정 실시 양태에서, 변이 서열은 전부의 또는 일부분의 서열 번호 3의 서열과 동일하다. 특정 실시 양태에서, 변이 서열은 길이가 적어도 20개 뉴클레오티드이다. 특정 실시 양태에서, 변이 서열은 길이가 적어도 50개 뉴클레오티드이다. 특정 실시 양태에서, 변이 서열은 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드이다.

도 1은 pKSV7-sinR의 플라스미드 지도의 개략도를 나타낸다.
도 2는 sinR 결실 (ΔsinR)의 유전자 지도의 개략도를 나타낸다. 도 3a는 FNA 프로테아제를 발현하는 바실루스 서브틸리스 세포의 세포 밀도 그래프를 나타낸다. WT는 “비변경된” (모) 바실루스 서브틸리스 (대조) 세포이며, sinR*은 sinR 유전자의 뉴클레오티드 330에 상응하는 침묵 돌연변이를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이며, ΔsinR은 결실된 sinR 유전자를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이다 (예를 들어, 도 2 참조).
도 3b는 도 3a에 제시된 WT 및 변경된 바실루스 서브틸리스 세포에서의 FNA 프로테아제 발현의 그래프를 나타낸다. WT는 “비변경된” (모) 바실루스 서브틸리스 (대조) 세포이며, sinR*은 sinR 유전자의 뉴클레오티드 330에 상응하는 침묵 돌연변이를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이며, ΔsinR은 결실된 sinR 유전자를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이다.
도 4a는 WT 및 변경된 바실루스 서브틸리스 세포에서의 AmyE 발현의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다. WT는 “비변경된” (모) 바실루스 서브틸리스 (대조) 세포이며, sinR*은 sinR 유전자의 뉴클레오티드 330에 상응하는 침묵 돌연변이를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이며, ΔsinR은 결실된 sinR 유전자를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이다.
도 4b는 WT 및 변경된 바실루스 서브틸리스 세포에서의 AmyE 아밀라아제 발현의 그래프를 나타낸다. WT는 “비변경된” (모) 바실루스 서브틸리스 (대조) 세포이며, sinR*은 sinR 유전자의 뉴클레오티드 330에 상응하는 침묵 돌연변이를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이며, ΔsinR은 결실된 sinR 유전자를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이다.
도 5a는 WT 및 변경된 바실루스 서브틸리스 세포의 세포 밀도의 그래프를 나타낸다. WT는 “비변경된” (모) 바실루스 서브틸리스 (대조) 세포이며, sinR*은 sinR 유전자의 뉴클레오티드 330에 상응하는 침묵 돌연변이를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이며, ΔsinR은 결실된 sinR 유전자를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이다.
도 5b는 WT 및 변경된 바실루스 서브틸리스 세포에서의 pelC 발현의 그래프를 나타낸다. WT는 “비변경된” (모) 바실루스 서브틸리스 (대조) 세포이며, sinR*은 sinR 유전자의 뉴클레오티드 330에 상응하는 침묵 돌연변이를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이며, ΔsinR은 결실된 sinR 유전자를 포함하는 “변경된” (딸) 바실루스 서브틸리스 세포이다.

일반적으로 본 발명은 관심 대상의 단백질(이하, “POI”)의 발현을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변화를 갖는 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물 및 방법을 더 상세하게 설명하기 전에, 본 발명의 조성물 및 방법은 기술된 특정한 실시 양태에 한정되지 않으며, 따라서 물론 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 범주가 단지 첨부된 청구범위에 의해 한정될 것이기 때문에, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정한 실시 양태를 기술할 목적을 위한 것이며, 한정하고자 하는 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.

값의 범위가 제공될 경우, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의, 문맥이 명확히 달리 지시하지 않는 한 하한치의 단위의 십분의 일까지의, 각각의 개재값(intervening value) 및 그 진술된 범위 내의 임의의 다른 진술된 값 또는 개재값이 본 발명의 조성물 및 방법 내에 포함된다는 것이 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 그 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있으며, 본 발명의 조성물 및 방법 내에 또한 포함된다 (이는 그 진술된 범위에서의 임의의 구체적으로 배제된 한계치를 조건으로 한다). 진술된 범위가 한계치들 중 하나 또는 이들 둘 모두를 포함할 경우, 그 포함된 한계치들 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두가 배제된 범위가 본 발명의 조성물 및 방법에 또한 포함된다.

본원에서 “약”이라는 용어가 선행하는 수치 값을 이용하여 특정 범위가 제시된다. 본원에서 “약”이라는 용어는 이것이 선행하는 정확한 수와, 이 용어가 선행하는 수의 근사치이거나 대략적으로 이 수인 수의 문자 그대로의 뒷받침을 제공하기 위하여 사용된다. 소정의 수가 구체적으로 인용된 수의 근사치이거나 대략적으로 이 수인지를 결정하는 데 있어서, 비인용된 수의 근사치 또는 근삿값은 이것이 제시된 문맥에서 그 구체적으로 인용된 수의 실질적으로 등가인 수를 제공하는 수일 수 있다. 예를 들어, 수치 값과 관련하여, “약”이라는 용어는 이 용어가 달리 구체적으로 문맥에서 정의되어 있지 않으면, 그 수치 값의 -10% 내지 +10%의 범위를 나타낸다. 또 다른 실시예에서, “약 6의 pH 값”이라는 어구는 그 pH 값이 구체적으로 달리 정의되지 않으면 5.4 내지 6.6의 pH 값을 나타낸다.

본원에 제공된 제목은 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 측면 또는 실시 양태의 제한이 아닌데, 이는 전체로서 본 명세서에 대하여 참고로 있을 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 전체로서 본 명세서에 대하여 참고로 더 충분히 정의된다.

본 문서는 읽기의 용이함을 위하여 다수의 섹션으로 정리되어 있지만, 독자라면 하나의 섹션에서 이루어진 진술이 다른 섹션에 적용될 수 있음을 알 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 상이한 섹션들에 사용되는 제목은 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 테스트에서 또한 사용될 수 있지만, 이제 대표적인 예시적 방법 및 재료를 설명한다.

본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허는 마치 각각의 개별 간행물 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시되는 것처럼 본원에 참고로 포함되며, 방법 및/또는 재료 (이와 관련하여 간행물이 인용됨)를 개시하고 설명하기 위하여 본원에 참고로 포함된다. 임의의 간행물의 인용은 본 발명의 출원일 이전의 그의 개시를 위한 것이며, 본 발명의 조성물 및 방법이 종래 발명에 의해 그러한 간행물 이후라는 자격이 주어진다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 제공된 공개일은 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과는 상이할 수 있다.

이러한 상세한 설명에 따라, 하기 약어 및 정의가 적용된다. 단수형(“a”, “an” 및 “the”)은 그 문맥이 달리 명백하게 기술하지 않으면 복수형 지시 대상을 포함함을 주지한다. 따라서, 예를 들어, “효소”의 언급은 복수형의 그러한 효소를 포함하며, “투여량”의 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 투여량 및 이의 등가물의 언급을 포함하며, 다른 것도 마찬가지이다.

청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 초안 작성될 수 있음이 추가로 주지된다. 그와 같이, 이러한 진술은 청구항 요소의 인용, 또는 “부정적인” 제한의 이용과 관련하여 “오로지”, “단지” 등과 같은 그러한 배타적 용어의 사용을 위한 선행 근거로서의 역할을 하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “~로 본질적으로 이루어진”이라는 용어는, 이 용어 앞의 성분(들)이 전체 조성물의 30 중량% 미만인 총 양의 다른 공지된 성분(들)의 존재 하에 있으며 이러한 다른 공지된 성분은 상기 용어 앞의 성분(들)의 작용 또는 활성에 기여하지 않거나 이를 간섭하지 않는 조성물을 나타낸다는 것이 추가로 주지된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “포함하는”이라는 용어는 “포함하는”이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아님을 의미한다는 것이 추가로 주지된다. “포함하는”이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적이지만, 이 성분(들)을 포함하는 조성물은 다른 비-의무적 또는 선택적 성분(들)을 추가로 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “~으로 이루어진”이라는 용어는 “~으로 이루어진”이라는 용어 앞의 성분(들)을 포함하며 이에 한정되지 않음을 의미한다는 것이 또한 주지된다. 따라서 “~으로 이루어진”이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적인 것이며, 다른 성분(들)이 조성물에 전혀 존재하지 않는다.

이 개시 내용을 읽자마자 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 개시되고 예시된 개별 실시 양태 각각은 본원에 개시된 본 발명의 조성물 및 방법의 범주 또는 사상으로부터 벗어나지 않고서 쉽게 임의의 다른 몇몇 실시 양태의 특징으로부터 분리되거나 이와 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특징을 갖는다. 임의의 열거된 방법은 열거된 사건의 순서대로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.

정의

일반적으로 본 발명은 관심 대상의 하나 이상의 단백질을 발현하고/하거나 생성하는 능력이 증가되도록 변경된 (또는 변형된) 그람 양성 박테리아 세포 (및 이의 제조 및 사용 방법)에 관한 것이다.

본원에서 정의되는 바와 같이, “변형된 세포”, “변경된 세포”, “변형된 박테리아 세포”, “변경된 박테리아 세포”, “변형된 숙주 세포” 또는 “변경된 숙주 세포”는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, sin 오페론의 하나 이상의 유전자의 발현을 변경하거나 변화시키는(즉, 발현의 증가 또는 발현의 감소) 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하는 재조합 그람 양성 박테리아 세포를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 “변경된” 그람 양성 박테리아 세포는 모 박테리아 세포로부터 유래되는 “변경된 세포”로서 추가로 정의될 수 있으며, 여기서, 변경된 (딸) 세포는 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함한다.

본원에서 정의되는 바와 같이, “비변형된 세포”, “비변경된 세포”, “비변형된 박테리아 세포”, “비변경된 박테리아 세포”, “비변형된 숙주 세포” 또는 “비변경된 숙주 세포”는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, sin 오페론의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 상기 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하지 않는 “비변경된” ‘모’ 그람 양성 박테리아 세포를 나타낼 수 있다. 특정 실시 양태에서, 비변경된 그람 양성 박테리아 세포는 “대조 세포” 또는 “비변경된 그람 양성 박테리아 ‘대조’ 세포”로 칭해진다.

예를 들어, 본 발명의 특정 실시 양태는 증가된 양의 POI를 발현하는 “변경된” 그람 양성 박테리아 세포에 관한 것이며, 여기서, POI의 증가된 양은 “비변경된” 그람 양성 박테리아 세포(즉, 비변경된 그람 양성 박테리아 “대조” 세포)에서의 상기 POI의 발현과 비교한 것이다.

따라서, 본원에서 정의되는 바와 같이, “비변경된 박테리아 세포(들)”, “비변경된 그람 양성 박테리아 세포(들)”, “비변경된 그람 양성 박테리아 ‘대조’ 세포(들)” 등의 용어 또는 어구가 본 발명의 상기 하나 이상의 “변경된 박테리아 세포”와의 비교 맥락에서 사용될 때, 변경된 (딸) 세포 및 비변경된 모 (대조) 세포 둘 모두는 본질적으로 동일한 조건 및 배지 하에 성장/배양됨이 이해된다.

본원에서 정의되는 바와 같이, sin (포자형성 저해(sporulation inhibition)) 오페론은 적어도 sinI (sinR의 저해자) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 sinR (억제자) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, sinR 및/또는 sinI 유전자 또는 이의 폴리뉴클레오티드 서열과 작동가능하게 연결되거나 이것에 산재된 5’ 및 3’ 조절 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Gaur et al., J Bacteriol 168:860-869, 1986] 참조). 특정 실시 양태에서, sin 오페론의 sinR 유전자 (또는 sinR 유전자로부터 유래된 sinR 폴리뉴클레오티드)는 서열 번호 1의 sinR 폴리뉴클레오티드에 대하여 적어도 60%의 핵산 서열 동일성을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “오페론”은 공통 프로모터로부터 단일 전사 단위로서 전사될 수 있고 이에 의해 공동 조절(co-regulation)되는 연접 유전자들의 군을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 오페론은 다수의 상이한 mRNA의 전사를 구동시키는 다수의 프로모터를 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 1에 도식화되어 있는 phd 오페론에서의 프로모터를 참조).

본원에서 정의되는 바와 같이, “증가된 발현”, “POI의 증가된 발현”, “증가된 생성”, “POI의 증가된 생성” 등은 sin 오페론의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하는 “변경된” (딸) 박테리아 세포를 나타내며, 여기서, “증가”는 항상 상기 POI를 발현하는 “비변경된” (모) 박테리아 (대조) 세포와 비교한 것이다 (이에 대한 것이다).

본원에서 정의되는 바와 같이, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF), 또는 이의 유전자, 또는 이의 벡터를 “박테리아 세포 내로 도입하는”과 같은 어구에서 사용되는 바와 같이, “도입하는”이라는 용어는 원형질체 융합, 형질전환 (예를 들어, 염화칼슘법, 전기천공법), 형질도입, 형질감염, 콘쥬게이션(conjugation) 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하는 본 기술 분야에 공지된 방법을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Ferrari et al., “Genetics”, Hardwood et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., pages 57-72, 1989] 참조).

본원에서 정의되는 바와 같이, “오픈 리딩 프레임” (이하, “ORF”)이라는 용어는 (i) 개시 코돈, (ii) 아미노산을 나타내는 일련의 두 개 (2개) 이상의 코돈, 및 (iii) 종결 코돈으로 이루어진 연속된(uninterrupted) 리딩 프레임을 포함하는 핵산 또는 핵산 서열 (천연 발생적이든지, 천연-비발생적이든지, 합성이든지 간에)을 의미하며, ORF는 5’에서 3’ 방향으로 판독된다 (또는 번역된다).

본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 “유전자”를 포함하며, 본원에 개시된 핵산 분자는 “벡터” 또는 “플라스미드”를 포함함이 이해된다. 따라서, “유전자”라는 용어는 단백질 전부 또는 단백질의 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절(비-전사) DNA 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사 영역은 코딩 서열뿐만 아니라 인트론, 5’-비번역 영역(UTR), 및 3'-UTR을 포함하는 비번역 영역(UTR)도 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “프로모터”라는 용어는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3’(하류)에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래되는 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 핵산 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터들은 상이한 세포 유형에서의, 또는 상이한 발달 단계에서의, 또는 상이한 환경 조건 또는 생리학적 조건에 응답하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 “구성적 프로모터(constitutive promoter)”로 칭해진다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계는 완전히 정의되어 있지는 않기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편들은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인정된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “작동가능하게 연결된”이라는 용어는 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 된 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열들의 회합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열의 발현을 초래할 수 있을 때 (즉, 그 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있음) 그 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 코딩 서열은 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

벡터는 또한 자연에서 에피좀이 아닌 네이키드(naked) DNA 폴리뉴클레오티드, 동일 가닥 내의 DNA 및 RNA 둘 모두로 구성된 폴리뉴클레오티드, 폴리-라이신-콘쥬게이션된 DNA 또는 RNA, 펩티드-콘쥬게이션된 DNA 또는 RNA, 리포좀-콘쥬게이션된 DNA 등일 수 있거나, 이것은 아그로박테륨(agrobacterium) 또는 박테리아와 같은 상기 폴리뉴클레오티드 구성물 중 하나 이상을 포함하는 유기체일 수 있다.

본원에서 정의되는 바와 같이, 유전자 서열, ORF 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 “발현” 또는 “발현된”이라는 용어는 그 유전자, ORF 또는 폴리뉴클레오티드의 전사와, 적절할 경우, 생성된 mRNA 전사체의 단백질로의 번역을 나타낸다. 따라서, 문맥으로부터 명백한 바와 같이, 단백질의 발현은 오픈 리딩 프레임 서열의 전사 및 번역에서 생긴다. 숙주 미생물에서의 요망되는 생성물의 발현 수준은 숙주에 존재하는 상응하는 mRNA의 양, 또는 선택된 서열에 의해 코딩되는 요망되는 생성물의 양을 기반으로 하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 PCR에 의해 또는 노던(northern) 혼성화에 의해 정량화될 수 있다 (문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조). 선택된 서열에 의해 코딩되는 단백질은 다양한 방법에 의해 (예를 들어, ELISA에 의해, 단백질의 생물학적 활성의 분석에 의해, 또는 그 단백질을 인식하여 이에 결합하여 반응하는 항체를 사용한, 웨스턴(western) 블로팅 또는 방사면역측정법과 같은, 그러한 활성과는 관계없는 분석법의 이용에 의해) 정량화될 수 있다. “유전자 (또는 이의 폴리뉴클레오티드)의 맥락에서 “발현”이라는 용어는 단백질이 그 유전자 (또는 이의 폴리뉴클레오티드)의 핵산 서열을 기반으로 하여 생성되는 과정이며, 따라서 전사 및 번역 둘 모두를 포함한다.

본원에서 정의되는 바와 같이, sin 오페론으로부터 유래되는 메신저 RNA(mRNA) 전사체는 적어도 전부의 또는 일부분의 sinR 단백질을 코딩하는 mRNA 전사체를 포함한다.

본원에서 정의되는 바와 같이, sin 오페론의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 “유전자 변화”는 미스센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 삽입 돌연변이, 결실 돌연변이 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “돌연변이”라는 용어는 변경된 핵산 또는 코딩 폴리펩티드 (즉, 야생형 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여)로 이어지는 핵산의 임의의 변형을 나타낸다. 돌연변이는 조절 또는 프로모터 서열과 같은 그러나 이에 한정되는 것은 아닌 단백질-코딩 서열 밖의 영역에서의 변화뿐만 아니라 유전자의 단백질-코딩 영역 내에서 발생하는 변화도 포함한다. 따라서, 유전자 변화는 임의의 유형의 돌연변이일 수 있다.

특정 실시 양태에서, 유전자 변경된(변형된) 미생물 게놈의 일부분은 하나 이상의 이종성(외인성) 폴리뉴클레오티드로 대체될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “바실루스 속” 또는 “바실루스 속의 구성원”은 당업자에게 공지된 바와 같이 “바실루스” 속 내의 모든 종을 포함하며, 이는 비. 서브틸리스, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 클라우시이, 비. 소노렌시스, 비. 할로두란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 파불리, 비. 세레우스, 비. 아가라드하에렌스, 비. 아키바이, 비. 클라르키이, 비. 슈도피르무스, 비. 레헨시스, 비. 메가테륨, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 깁소니이, 및 비. 튜린기엔시스를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

바실루스 속은 분류학적 재편성을 계속 겪고 있음이 인정된다. 따라서, 상기 속은 현재 “게오바실루스 스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus)”로 명명된 비. 스테아로서모필루스와 같은 유기체를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 재분류된 종을 포함하는 것으로 의도된다. 산소의 존재 하에서의 저항성 내생포자의 생성은 바실루스 속의 정의적 특징으로 간주되지만, 이러한 특성은 현재 명명된 알리시클로바실루스(Alicyclobacillus), 암피바실루스(Amphibacillus), 아네우리니바실루스(Aneurinibacillus), 아녹시바실루스(Anoxybacillus), 브레비바실루스(Brevibacillus), 필로바실루스(Filobacillus), 그라실리바실루스(Gracilibacillus), 할로바실루스(Halobacillus), 파에니바실루스(Paenibacillus), 살리바실루스(Salibacillus), 서모바실루스(Thermobacillus), 우레이바실루스(Ureibacillus), 및 비르기바실루스(Virgibacillus)에도 적용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “핵산”은 센스 가닥을 나타내든지 안티센스 가닥을 나타내든지 간에, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA뿐만 아니라 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편 또는 일부도 나타낸다. 유전자 코드의 축퇴성의 결과로서, 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 코딩할 수 있음이 이해된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “벡터”라는 용어는 핵산을 유기체들, 세포들 또는 세포 성분들 사이에서 전파하고/하거나 이전시킬 수 있는 임의의 수단이다. 벡터는 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스(pro-virus), 플라스미드, 파지미드(phagemid), 트랜스포존(transposon), 및 인공 염색체, 예컨대 YAC(효모 인공 염색체(yeast artificial chromosomes)), BAC(박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome)), 및 PLAC(식물 인공 염색체(plant artificial chromosomes)) 등 (이들은 “에피좀”으로서, 즉, 자율적으로 복제되거나 숙주 미생물의 염색체 내에 통합될 수 있음)을 포함한다. “발현 벡터”는 외래 세포 내에 포함되어 외래 세포에서 이종성 DNA를 발현하는 능력을 갖는 벡터를 나타낸다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 구매가능하다. “표적화 벡터”는 이것이 형질전환시키는 숙주 세포의 염색체 내의 영역에 상동성이고 그 영역에서 상동 재조합을 구동시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 표적화 벡터는 상동 재조합을 통하여 세포의 염색체 내에 돌연변이를 도입하는 데 있어서 그 용도가 발견된다. 일부 실시 양태에서, 표적화 벡터는 예를 들어 말단에 부가된 다른 비-상동성 서열(즉, 스터퍼(stuffer) 서열 또는 측면(flanking) 서열)을 포함한다. 말단들은 표적화 벡터가 예를 들어 벡터 내로의 삽입과 같이 폐쇄된 원을 형성하도록 폐쇄될 수 있다. 적절한 벡터의 선택 및/또는 구성은 당업자의 지식 내에 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “플라스미드”라는 용어는 클로닝 벡터로서 사용되는, 그리고 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 염색체외 자가-복제 유전 요소를 형성하는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구성물을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈 내로 포함되게 된다.

“정제된” 또는 “단리된” 또는 “풍부화된”은 생체분자 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이것이 결부되어 있는 천연 발생 구성 성분의 일부 또는 이들 전부로부터 이를 분리함에 의해 그의 자연 상태로부터 변경됨을 의미한다. 그러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 요망되지 않는 전 세포, 세포 잔사, 불순물, 외부 단백질 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에서의 분리와 같은 본 기술 분야에서 인정된 분리 기술에 의해 성취될 수 있다. 그 후 추가 이득을 제공하는 구성 성분, 예를 들어 활성화제, 항-저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “선발가능 마커” 또는 “선발 마커”라는 용어는 숙주 세포에서 발현이 가능한 핵산 (예를 들어, 유전자)으로서 그 핵산을 포함하는 숙주의 용이한 선발을 허용하는 핵산을 나타낸다. 그러한 선발가능 마커의 예는 항미생물제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, “선발가능 마커”라는 용어는 숙주 세포가 관심 대상의 유입 DNA를 흡수했거나 일부 다른 반응이 일어났다는 표시를 제공하는 유전자를 나타낸다. 전형적으로, 선발가능 마커는 외인성 DNA를 포함하는 세포와 형질전환 동안 어떠한 외인성 서열도 받지 않은 세포의 구별을 허용하기 위하여 숙주 세포에 항미생물적 내성 또는 대사적 이점을 부여하는 유전자이다. 본 발명에 따른 유용한 다른 마커는 영양요구성 마커, 예컨대 트립토판; 및 검출 마커, 예컨대 β-갈락토시다아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

유전자의 “불활성화”는 유전자의 발현 또는 그의 코딩된 생체분자의 활성이 차단되거나 달리 그의 공지된 기능을 발휘할 수 없음을 의미한다. 불활성화는 임의의 적합한 수단을 통하여, 예를 들어 상기에 기술된 바와 같이 유전자 변화를 통하여 일어날 수 있다. 일 실시 양태에서, 불활성화된 유전자의 발현 생성물은 그 단백질의 생물학적 활성에 있어서의 상응하는 변화를 갖는 절두형(truncated) 단백질이다. 일부 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 주는 하나 이상의 유전자의 불활성화를 포함하며, 상기 불활성화는 바람직하게는 안정한 비-복귀 불활성화로 이어진다.

일부 실시 양태에서, 불활성화는 결실에 의해 달성된다. 일부 실시 양태에서, 결실에 대하여 표적화된 영역 (예를 들어, 유전자)은 상동 재조합에 의해 결실된다. 예를 들어, 결실에 대하여 표적화되는 영역에 대하여 상동성인 서열들 (여기서, 상기 서열들은 본원에서 “상동성 박스(homology box)”로서 칭해질 수 있음)이 양측에 있는 선발 마커를 갖는 유입 서열을 포함하는 DNA 구성물이 사용된다. DNA 구성물은 숙주 염색체의 상동 서열에 맞추어 정렬되며, 이중 교차 사건(double crossover event)에서 결실에 대한 표적화된 영역은 숙주 염색체에서 절단된다.

“삽입” 또는 “부가”는 천연 발생 서열 또는 모 서열과 비교하여, 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 부가된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “치환”은 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 대체하여 생긴다.

유전자를 돌연변이시키는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 부위 지정 돌연변이(site-directed mutation), 랜덤 돌연변이의 생성, 및 갭 형성 이중가닥 접근법을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, 미국 특허 제4,760,025호; 문헌[Moring et al., Biotech. 2:646,1984]; 및 문헌[Kramer et al., Nucleic Acids Res., 12:9441, 1984] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 유전자”는, 상이하지만 일반적으로 관련된 종으로부터의 유전자쌍을 나타내며, 이는 서로에게 상응하고 서로 동일하거나 매우 유사하다. 상기 용어는 유전자 중복(genetic duplication)에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 유사 유전자(paralogous gene))뿐만 아니라 종분화(speciation)(즉, 새로운 종의 발생)에 의해 분리된 유전자 (예를 들어, 이종상동성 유전자(orthologous gene))도 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “오르소로그(ortholog)” 및 “이종상동성 유전자”는 종분화에 의해 공통 조상 유전자(즉, 상동 유전자)로부터 진화된 상이한 종에서의 유전자를 나타낸다. 전형적으로, 오르소로그는 진화 과정 동안 동일 기능을 유지한다. 오르소로그의 확인은 새롭게 서열결정된 게놈에서의 유전자 기능의 신뢰가능한 예측에서 그 용도가 발견된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “파라로그(paralog)” 및 “유사 유전자”는 게놈 내에서의 중복에 의해 연관된 유전자를 나타낸다. 오르소로그는 진화 과정 내내 동일한 기능을 유지하지만, 파라로그에서는, 심지어 일부 기능이 흔히 원래의 것에 연관된다 해도, 새로운 기능이 발달된다. 유사 유전자의 예는 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제, 및 트롬빈 (이들 전부는 세린 프로테이나아제이며, 동일 종 내에서 함께 나타남)을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동성”은 서열 유사성 또는 동일성을 나타내며, 이때 동일성이 바람직하다. 이러한 상동성은 본 기술 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 결정된다 (예를 들어, 문헌[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]]; 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]]; 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]]; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]] 참조).

본원에서 사용되는 바와 같이, “상사(analogous) 서열”은 유전자의 기능이 바실루스 서브틸리스 주 168로부터의 표기된 유전자와 본질적으로 동일한 것이다. 부가적으로, 상사 유전자는 바실루스 서브틸리스 주 168 유전자의 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 다르게는, 상사 서열은 비. 서브틸리스 168 영역에서 발견되는 유전자의 70 내지 100%에 정렬되고/되거나 비. 서브틸리스 168 염색체에서의 유전자와 정렬되는 영역에서 발견되는 적어도 5 내지 10개의 유전자를 갖는다. 추가의 실시 양태에서, 상기 특성들 중 하나 초과의 특성이 서열에 적용된다. 상사 서열은 공지된 서열 정렬 방법에 의해 결정된다. 일반적으로 사용되는 정렬 방법으로는 BLAST가 있지만, 상기 및 하기에 나타낸 바와 같이, 서열들의 정렬에서 그 용도가 또한 발견되는 다른 방법이 있다.

유용한 알고리즘의 하나의 예로는 PILEUP이 있다. PILEUP은 진행식 쌍정렬(pairwise alignment)을 이용하여 관련 서열들의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 이것은 또한 정렬을 생성하는 데 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 트리(tree)를 나타낼 수 있다. PILEUP은 펭(Feng) 및 둘리틀(Doolittle)의 진행식 정렬 방법의 단순화를 이용한다 (문헌[Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360 [1987]]). 상기 방법은 히긴스(Higgins) 및 샤프(Sharp)에 의해 설명된 것과 유사하다 (문헌[Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153 [1989]]). 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중치, 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 가중 말단 갭을 포함한다.

유용한 알고리즘의 또 다른 예로는 알츠슐(Altschul) 등에 의해 설명된 BLAST 알고리즘이 있다 (문헌[Altschul et al., J. Mol.Biol., 215:403-410, [1990]]; 및 문헌[Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 [1993]]). 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이다 (문헌[Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460-480 [1996]] 참조). WU-BLAST-2는 몇몇 검색 파라미터를 이용하며, 이들 중 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능한 파라미터는 하기 값으로 설정된다: 중첩 범위(overlap span) =1, 중첩 분율(overlap fraction) = 0.125, 워드 역치(word threshold) (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값(dynamic value)이며, 관심 대상의 서열을 검색하는 특정 데이터베이스의 구성 및 특정 서열의 구성에 따라 프로그램 그 자체에 의해 확립된다. 그러나, 상기 값은 민감도를 증가시키기 위하여 조정될 수 있다. 아미노산 서열 동일성 % 값은 정렬된 영역에서 매칭 동일 잔기의 수를 “더 긴” 서열의 잔기의 총 수로 나누어서 결정된다. “더 긴” 서열은 정렬된 영역에서 가장 실제적인 잔기를 갖는 것이다 (정렬 스코어(score)를 최대화하기 위하여 WU-Blast-2에 의해 도입된 갭은 무시됨).

본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 확인된 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 관련하여 "서열 동일성 퍼센트(%)”는 관심 대상의 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의되며, 이는 상기 서열들을 정렬하고 갭을 도입하여 (필요할 경우) 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고서 정의된다.

“상동체” (또는 “호모로그(homolog)”)는 당해 아미노산 서열 및 당해 뉴클레오티드 서열과 특정한 정도의 동일성을 갖는 엔티티(entity)를 의미한다. 상동 서열은 통상적인 서열 정렬 툴(tool) (예를 들어, Clustal, BLAST 등)을 이용할 경우 당해 서열에 대하여 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 심지어 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상동체는 달리 특정되지 않으면 당해 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 잔기를 포함한다.

서열 정렬 수행 방법 및 서열 동일성 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 과도한 실험 없이 수행될 수 있고, 동일성 값의 계산은 명확함을 가지고서 얻어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)]; 및 ALIGN 프로그램 (문헌[Dayhoff (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl.3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.)]을 참조한다. 다수의 알고리즘이 서열 정렬 및 서열 동일성 결정에 이용가능하며, 이는 예를 들어 문헌[Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌[Smith et al.(1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국부 상동성 알고리즘; 문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444]의 유사성 검색 방법; 스미스(Smith)-워터맨(Waterman) 알고리즘 (문헌[Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997)]); 및 BLASTP, BLASTN, 및 BLASTX 알고리즘 (문헌[Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 참조)을 포함한다.

이러한 알고리즘을 이용한 전산화 프로그램이 또한 이용가능하며, 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어, 또는 WU-BLAST-2 (문헌[Altschul et al., Meth. Enzym., 266:460-480 (1996)]); 또는 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨팅 그룹(GCG)의 패키지, 버전 8에서 이용가능한 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA; 및 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 인텔리제네틱스(Intelligenetics)에 의한 PC/Gene 프로그램에서의 CLUSTAL. 당업자라면, 비교되는 서열들의 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 알고리즘을 포함하여 정렬 측정에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 서열 동일성은 프로그램에 의해 결정되는 디폴트 파라미터를 이용하여 결정된다. 구체적으로, 서열 동일성은 Clustal W (문헌[Thompson J.D. et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680])를 이용하여 결정될 수 있으며, 이때 디폴트 파라미터, 즉, 하기의 것을 이용한다:

갭 오프닝 페널티(Gap opening penalty): 10.0

갭 연장 페널티(Gap extension penalty): 0.05

단백질 가중치 매트릭스(Protein weight matrix): BLOSUM 시리즈

DNA 가중치 매트릭스: IUB

딜레이 디버전트(Delay divergent) 서열 %: 40

갭 분리 거리: 8

DNA 전이 가중치(transitions weight): 0.50

친수성 잔기의 목록: GPSNDQEKR

음의 매트릭스의 이용: OFF

토글 잔기의 특정 페널티(Toggle Residue specific penalties): ON

토글 친수성 페널티(Toggle hydrophilic penalties): ON

토글 말단 갭 분리 페널티: OFF

본원에서 사용되는 바와 같이, “혼성화”라는 용어는 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 핵산의 한 가닥이 염기쌍 형성을 통하여 상보성 가닥과 연결되는 과정을 나타낸다.

핵산 서열은 두 서열이 중간 정도의 엄격도 내지 고 엄격도의 혼성화 및 세척 조건 하에서 서로에게 특이적으로 혼성화될 경우 기준 핵산 서열에 “선택적으로 혼성화가능”한 것으로 간주된다. 혼성화 조건은 핵산 결합 복합체 또는 프로브의 용융 온도(Tm)를 기반으로 한다. 예를 들어, “최대 엄격도”는 전형적으로 대략 Tm-5℃ (프로브의 Tm보다 5° 아래)에서 나타나며; “고 엄격도”는 Tm보다 대략 5 내지 10℃ 아래에서 나타나며; “중간 엄격도”는 프로브의 Tm보다 대략 10 내지 20℃ 아래에서 나타나며; “저 엄격도”는 Tm보다 대략 20 내지 25℃ 아래에서 나타난다. 기능적으로, 최대 엄격도 조건은 혼성화 프로브와 엄격한 동일성 또는 거의 엄격한 동일성을 갖는 서열을 확인하는 데 사용될 수 있는 반면, 중간 또는 저 엄격도 혼성화는 폴리뉴클레오티드 서열 상동체를 확인하거나 검출하는 데 사용될 수 있다.

중간 정도의 엄격도의 혼성화 조건 및 고 엄격도 혼성화 조건은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 고 엄격도 조건의 예는 약 42℃에서의 50% 포름아미드, 5X SSC, 5X 덴하르트 용액(Denhardt’s solution), 0.5% SDS 및 100 μg/ml의 변성 캐리어(carrier) DNA에서의 혼성화, 이어서 실온에서의 2X SSC 및 0.5% SDS에서의 2회의 세척 및 42℃에서의 0.1X SSC 및 0.5% SDS에서의 추가의 2회의 세척을 포함한다. 중간 정도의 엄격도의 조건의 예는 37℃에서의, 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성 분쇄(sheared) 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에서의 하룻밤 인큐베이션, 이어서 약 37 내지 50℃에서의 1x SSC에서의 필터의 세척을 포함한다. 당업자라면 인자, 예컨대 프로브 등을 수용하기 위하여 필요할 경우 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알고 있다.

“재조합”이라는 용어는, 생물학적 성분 또는 조성물 (예를 들어, 세포, 핵산, 폴리펩티드/효소, 벡터 등)과 관련하여 사용될 때, 생물학적 성분 또는 조성물이 자연에서는 발견되지 않는 상태로 있음을 나타낸다. 환언하면, 생물학적 성분 또는 조성물은 인간 개입에 의해 그의 자연 상태로부터 변형되었다. 예를 들어, 재조합 세포는 그의 천연 모(즉, 비-재조합) 세포에서는 발견되지 않는 하나 이상의 유전자를 발현하는 세포, 하나 이상의 천연 유전자를 그의 천연 모 세포와는 상이한 양으로 발현하는 세포, 및/또는 하나 이상의 천연 유전자를 그의 천연 모 세포와는 상이한 조건 하에 발현하는 세포를 포함한다. 재조합 핵산은 천연 서열과 하나 이상의 뉴클레오티드만큼 상이할 수 있고/있거나 이종성 서열 (예를 들어, 이종성 프로모터, 비-천연 또는 변이형 신호 서열을 코딩하는 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있고/있거나, 인트론 서열이 없을 수 있고/있거나 단리된 형태로 존재할 수 있다. 재조합 폴리펩티드/효소는 천연 서열과는 하나 이상의 아미노산만큼 상이할 수 있고/있거나, 이종성 서열과 융합될 수 있고/있거나, 절두되거나 아미노산의 내부 결실을 가질 수 있고/있거나, 천연 세포에서는 발견되지 않는 방식으로 (예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 발현 벡터의 세포에서의 존재로 인하여 폴리펩티드를 과다발현하는 재조합 세포로부터) 발현될 수 있고/있거나 단리된 형태로 있을 수 있다. 일부 실시 양태에서, 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드/효소는 그의 야생형 대응물과 동일하지만 비-천연 형태로 (예를 들어, 단리되거나 풍부화된 형태로) 존재하는 서열을 갖는다는 것이 강조된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “표적 서열”이라는 용어는 유입 서열이 숙주 세포 게놈 내에 삽입되는 것이 요망될 경우 당해 서열을 코딩하는 숙주 세포에서의 DNA 서열을 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 표적 서열은 기능성 야생형 유전자 또는 오페론을 코딩하는 반면, 다른 실시 양태에서, 표적 서열은 기능성 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비-기능성 유전자 또는 오페론을 코딩한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “측면 서열”은 논의되고 있는 서열의 상류 또는 하류에 있는 임의의 서열을 나타낸다 (예를 들어, 유전자 A-B-C의 경우, 유전자 B의 측면에 A 및 C 유전자 서열이 있다). 일 실시 양태에서, 유입 서열에는 양측에 상동성 박스가 있다. 또 다른 실시 양태에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 양측에 스터퍼 서열이 있는 단위를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 측면 서열은 단지 한 측면에 (3’ 또는 5’에) 존재하지만, 실시 양태들에서 이것은 측면에 있게 되는 서열의 양측에 있다. 각각의 상동성 박스의 서열은 바실루스 염색체에서의 서열에 대하여 상동성을 갖는다. 이러한 서열은 바실루스 염색체에서 새로운 구성물이 통합되게 되는 장소 및 바실루스 염색체의 어떤 부분이 유입 서열에 의해 대체될 것인지를 지시한다. 일 실시 양태에서, 선발 마커의 5’ 및 3’ 말단의 측면에는 불활성화 염색체 절편의 섹션을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이 있다. 일부 실시 양태에서, 측면 서열은 단지 한 측면에 (3’ 또는 5’에) 존재하지만, 실시 양태들에서 이것은 측면에 있게 되는 서열의 양측에 존재한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭가능한 마커”, “증폭가능한 유전자” 및 “증폭 벡터”라는 용어는 적절한 성장 조건 하에 유전자의 증폭을 가능케 하는, 유전자를 코딩하는 벡터 또는 유전자를 나타낸다.

“주형 특이성”은 효소의 선택에 의해 대부분의 증폭 기술에서 달성된다. 증폭 효소는 이것이 사용되는 조건 하에서 핵산의 이종성 혼합물 중 핵산의 단지 특정 서열을 프로세싱하는 효소이다. 예를 들어, Qβ 레플리카아제의 경우, MDV-1 RNA는 이 레클리카아제의 특이적 주형이다 (예를 들어, 문헌[Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038 [1972]] 참조). 다른 핵산은 이 증폭 효소에 의해 복제되지 않는다. 이와 유사하게, T7 RNA 폴리머라아제의 경우, 이 증폭 효소는 그 자신의 프로모터에 대하여 엄격한 특이성을 갖는다 (문헌[Chamberlin et al., Nature 228:227 [1970]] 참조). T4 DNA 라이가아제의 경우, 이 효소는 두 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 라이게이션시키지 않으며, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 기질과 주형 사이에는 라이게이션 연결부에 미스매치가 있다 (문헌[Wu and Wallace, Genomics 4:560 [1989]]). 마지막으로, Taq 및 Pfu 폴리머라아제는, 고온에서 기능하는 그의 능력 덕분에, 결합되는 그리고 이에 따라 프라이머에 의해 규정되는 서열들에 대하여 높은 특이성을 나타내는 것으로 밝혀져 있으며; 고온은 프라이머의 표적 서열과의 혼성화를 유리하게 하고 비-표적 서열과의 혼성화는 그렇게 하지 않는 열역학적 조건으로 이어진다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭가능한 핵산”이라는 용어는 임의의 증폭 방법에 의해 증폭될 수 있는 핵산을 나타낸다. “증폭가능한 핵산”은 일반적으로 “샘플 주형”을 포함할 것으로 사료된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “샘플 주형”이라는 용어는 “표적” (하기에 정의됨)의 존재에 대하여 분석되는 샘플로부터 기원하는 핵산을 나타낸다. 이와는 대조적으로, “배경 주형”은 샘플에 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 샘플 주형 이외의 핵산과 관련하여 사용된다. 배경 주형은 가장 흔히는 우연한 것이다. 이것은 이월(carryover)의 결과일 수 있거나, 이것은 샘플로부터 정제해 내고자 하는 핵산 오염물의 존재로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 검출할 것 이외의 유기체로부터의 핵산이 테스트 샘플에서 배경으로 존재할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “프라이머”라는 용어는 정제된 제한효소 절단물에서와 같이 천연 발생적이든지 합성에 의해 생성된 것이든지 간에, 핵산 가닥에 상보성인 프라이머 신장 생성물의 합성이 유도되는 조건 하에 (즉, 뉴클레오티드 및 유도 에이전트(agent), 예컨대 DNA 폴리머라아제의 존재 하에 그리고 적합한 온도 및 pH에서) 두었을 때 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥일 경우, 프라이머는 신장 생성물의 제조에 사용되기 전에 먼저 그의 가닥들이 분리되도록 처리된다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도 에이전트의 존재 하에 신장 생성물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머의 소스(source) 및 방법의 용도를 포함하는 많은 인자에 의존할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “프로브”라는 용어는, 정제된 제한효소 절단물에서와 같이 천연 발생적이든지 합성에 의해, 재조합적으로 또는 PCR 증폭에 의해 생성되든지 간에, 관심 대상의 또 다른 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드들의 시퀀스(sequence))를 나타낸다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정한 유전자 서열의 검출, 확인 및 단리에서 유용하다. 본 발명에서 사용되는 임의의 프로브는 효소 (예를 들어, ELISA와, 효소-기반 조직화학 분석법), 형광, 방사성, 및 발광 시스템을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 임의의 검출 시스템에서 검출가능해지도록 임의의 “리포터(reporter) 분자”로 표지될 것으로 사료된다. 본 발명은 임의의 특정 검출 시스템 또는 표지체에 한정되는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “표적”이라는 용어는, 폴리머라아제 연쇄 반응과 관련하여 사용될 때, 폴리머라아제 연쇄 반응에 사용되는 프라이머가 결합하는 핵산 영역을 나타낸다. 따라서, “표적”을 다른 핵산 서열과 구분하고자 한다. “절편”은 표적 서열 내의 핵산 영역으로 정의된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “폴리머라아제 연쇄 반응” (“PCR”)이라는 용어는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제4,683,195호, 미국 특허 제4,683,202호 및 미국 특허 제4,965,188호의 방법을 나타내며, 이는 클로닝 또는 정제 없이 게놈 DNA의 혼합물 중 표적 서열의 절편의 농도를 증가시키는 방법을 포함한다. 표적 서열을 증폭시키기 위한 이러한 방법은 큰 과량의 두 올리고뉴클레오티드 프라이머를 요망되는 표적 서열을 포함하는 DNA 혼합물에 도입하는 것, 이어서 DNA 폴리머라아제의 존재 하에서의 정확한 시퀀스의 서멀 사이클링(thermal cycling)으로 이루어진다. 상기 두 프라이머는 이중 가닥 표적 서열의 그의 각각의 가닥에 상보적이다. 증폭을 초래하기 위하여, 상기 혼합물을 변성시키고, 그 후 프라이머들을 표적 분자 내의 그의 상보성 서열에 어닐링시킨다. 어닐링 후, 프라이머들을 폴리머라아제로 신장시켜서 상보성 가닥들의 새로운 쌍을 형성한다. 변성, 프라이머 어닐링, 폴리머라아제 신장의 단계를 여러 번 반복하여(즉, 변성, 어닐링 및 신장은 하나의 “사이클”을 구성하며; 다수의 “사이클”이 있을 수 있음) 요망되는 표적 서열의 고농도의 증폭 절편을 수득할 수 있다. 요망되는 표적 서열의 증폭된 절편의 길이는 서로에 대한 프라이머들의 상대적인 위치에 의해 결정되며, 따라서 이 길이는 제어가능한 파라미터이다. 이 과정의 반복되는 측면에 의해, 이 방법은 “폴리머라아제 연쇄 반응” (이하, “PCR”)으로 칭해진다. 표적 서열의 요망되는 증폭 절편은 상기 혼합물에서 주된 서열 (농도 면에서)이 되기 때문에, 이 절편은 “PCR 증폭되었다”고 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “증폭 시약”이라는 용어는 프라이머, 핵산 주형 및 증폭 효소를 제외하고서 증폭에 필요한 시약 (데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, 완충액 등)을 나타낸다. 전형적으로, 증폭 시약은 다른 반응 성분과 함께 반응 용기 (테스트 튜브, 마이크로웰 등) 내에 두어지고 담겨진다.

PCR을 이용하여, 몇몇 상이한 방법 (예를 들어, 표지된 프로브를 이용한 혼성화; 바이오티닐화(biotinylated) 프라이머의 혼입, 이어서 아비딘-효소 콘쥬게이트 검출; ³²P-표지된 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 예컨대 dCTP 또는 dATP의 증폭 절편 내로의 혼입)에 의해 게놈 DNA 내의 특정 표적 서열의 단일 카피를 검출가능한 수준까지 증폭시키는 것이 가능하다. 게놈 DNA에 더하여, 임의의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 적절한 프라이머 분자 세트를 이용하여 증폭될 수 있다. 특히, PCR 과정 그 자체에 의해 생성된 증폭 절편 그 자체는 후속적인 PCR 증폭을 위한 효율적인 주형이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “PCR 생성물”, “PCR 단편” 및 “증폭 생성물”이라는 용어는 변성, 어닐링 및 신장의 PCR 단계의 2회 이상의 사이클이 완료된 후 화합물들의 생성된 혼합물을 나타낸다. 이러한 용어는 하나 이상의 표적 서열의 하나 이상의 절편의 증폭이 있었던 경우를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "RT-PCR"이라는 용어는 RNA 서열의 복제 및 증폭을 나타낸다. 이 방법에서, 가장 흔히는 열안정성 폴리머라아제가 이용되는 하나의 효소의 절차를 이용하여 역전사가 PCR에 커플링되며, 이는 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,322,770호에 기술된 바와 같다. RT-PCR에서, RNA 주형은 폴리머라아제의 역전사효소 활성으로 인하여 cDNA로 전환되며, 그 후 폴리머라아제의 중합 활성을 이용하여 증폭된다(즉, 다른 PCR 방법에서와 같이).

본원에서 사용되는 바와 같이, “유전자 변경된 숙주 주” (예를 들어, 유전자 변경된 바실루스 주)는 재조합 숙주 세포로도 칭해지는 유전자 엔지니어링된(engineered) 숙주 세포를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 유전자 변경된 숙주 주는 본질적으로 동일한 성장 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 숙주 주에서의 관심 대상의 단백질의 발현 및/또는 생성과 비교하여 관심 대상의 단백질의 향상된 (증가된) 발현을 갖는다. 일부 실시 양태에서, 상기 향상된 발현 수준은 sin 오페론으로부터의 하나 이상의 유전자, 예를 들어 sinR 유전자의 감소된 발현에서 생긴다. 일부 실시 양태에서, 변경된 주는 하나 이상의 결실된 내인성 염색체 영역 또는 이의 단편을 갖는 유전자 엔지니어링된 바실루스 sp.이며, 여기서 관심 대상의 단백질은 본질적으로 동일한 성장 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 바실루스 숙주 주와 비교하여 향상된 발현 또는 생성 수준을 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “염색체 통합”이라는 용어는 유입 서열이 숙주 세포 (예를 들어, 바실루스)의 염색체 내에 도입되는 과정을 나타낸다. 형질전환 DNA의 상동성 영역들은 염색체의 상동성 영역들에 맞추어 정렬된다. 후속적으로, 상동성 박스들 사이의 서열은 이중 교차(즉, 상동 재조합)에서 유입 서열에 의해 대체된다. 본 발명의 일부 실시 양태에서, DNA 구성물의 불활성화 염색체 절편의 상동성 섹션들은 바실루스 염색체의 고유 염색체 영역의 측면 상동성 영역들에 맞추어 정렬된다. 후속적으로, 고유 염색체 영역은 이중 교차(즉, 상동 재조합)에서 DNA 구성물에 의해 결실된다.

“상동 재조합”은 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오티드 서열들의 부위에서의 두 DNA 분자 또는 쌍형성 염색체 사이에서의 DNA 단편의 교환을 의미한다. 일 실시 양태에서, 염색체 통합은 상동 재조합이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 서열”은 비교를 위하여 최적으로 정렬될 때 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 대하여 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 88%, 85%, 80%, 75%, 또는 70%의 서열 동일성을 갖는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 상동 서열들은 85% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 반면, 다른 실시 양태에서, 90% 내지 100%의 서열 동일성이 있으며, 더 많은 실시 양태에서 95% 내지 100%의 서열 동일성이 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “아미노산”은 펩티드 또는 단백질 서열 또는 이의 일부를 나타낸다. “단백질”, “펩티드” 및 “폴리펩티드”라는 용어는 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “관심 대상의 단백질” 및 “관심 대상의 폴리펩티드”는 요망되고/되거나 평가 중인 단백질/폴리펩티드를 나타낸다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 세포내 단백질인 반면, 다른 실시 양태에서, 이것은 분비형 폴리펩티드이다. 특히 폴리펩티드는 전분 분해 효소(amylolytic enzyme), 단백질 분해 효소, 셀룰로오스 분해 효소(cellulytic enzyme), 옥시도리덕타아제 효소 및 식물 세포벽 분해 효소로부터 선택되는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 효소를 포함한다. 더욱 구체적으로, 이러한 효소는 아밀라아제, 프로테아제, 자일라나아제, 리파아제, 락카아제, 페놀 옥시다아제, 옥시다아제, 큐티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 에스테라아제, 퍼옥시다아제, 카탈라아제, 글루코스 옥시다아제, 피타아제, 펙티나아제, 퍼하이드롤라아제, 폴리올 옥시다아제, 펙테이트 라이아제, 글루코시다아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 갈락토시다아제 및 키티나아제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 특정한 실시 양태에서, 관심 대상의 폴리펩티드는 프로테아제이다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 신호 펩티드(즉, 분비될 단백질 상의 아미노-말단 신장부)에 융합된 분비형 폴리펩티드이다. 거의 모든 분비형 단백질은 막에의 표적화 및 막을 가로지르는 전구체 단백질의 전좌에서 결정적인 역할을 하는 아미노-말단 단백질 신장부를 이용한다. 이러한 신장부는 막 이전 동안 또는 막 이전 직후 신호 펩티다아제에 의해 단백질 분해에 의해 제거된다.

본 발명의 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 폴리펩티드는 호르몬, 항체, 성장 인자, 수용체 등으로부터 선택된다. 본 발명에 포함되는 호르몬은 난포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 부신 피질 자극 호르몬 방출 인자, 소마토스타틴, 성선 자극 호르몬, 바소프레신, 옥시토신, 에리트로포이에틴, 인슐린 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자, 사이토카인, 예컨대 인터류킨 (예를 들어, IL-1 내지 IL-13), 인터페론, 콜로니 자극 인자 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체는 항체를 생성하는 것이 바람직한 임의의 종으로부터 직접적으로 수득된 면역글로불린을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 게다가, 본 발명은 변형된 항체를 포함한다. 다클론 및 단클론 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 특정한 실시 양태에서, 항체는 인간 항체이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 “유도체” 또는 “변이체”는 C- 및 N-말단 중 어느 하나에의 또는 이들 둘 모두에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열에서의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 폴리펩티드의 어느 하나의 말단 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입, 및 이들의 임의의 조합에 의해 전구체 폴리펩티드 (예를 들어, 천연 폴리펩티드)로부터 유래되는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드의 유도체 또는 변이체의 제조는 임의의 편리한 방식으로, 예를 들어, 천연 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 변형, 그 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키는 것, 및 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체형/변이체형 폴리펩티드를 형성하는 것에 의해 달성될 수 있다. 유도체 또는 변이체는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “이종 단백질”이라는 용어는 숙주 세포에서 천연적으로는 나타나지 않는 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 이종 단백질의 예는 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라아제, 카르보하이드라아제 및 리파아제를 포함하는 하이드롤라아제; 이소머라아제, 예컨대 라세마아제, 에피머라아제, 토토머라아제, 또는 뮤타아제; 트랜스퍼라아제, 키나아제 및 포스파타아제와 같은 효소를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 단백질은 백신 및 항체뿐만 아니라 성장 인자, 사이토카인, 리간드, 수용체 및 저해제도 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 치료적으로 유의한 단백질 또는 펩티드이다. 추가의 실시 양태에서, 단백질은 상업적으로 중요한 산업용 단백질/펩티드 (예를 들어, 프로테아제, 카르보하이드라아제, 예컨대 아밀라아제 및 글루코아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제 및 리파아제)이다. 일부 실시 양태에서, 단백질을 코딩하는 유전자는 천연 발생 유전자인 반면, 다른 실시 양태에서, 돌연변이 및/또는 합성 유전자가 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, “상동 단백질”은 세포에서 천연 발생되거나 천연인 단백질 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 실시 양태들에서, 세포는 그람 양성 세포인 한편, 특정한 실시 양태에서, 세포는 바실루스 숙주 세포이다. 대안적인 실시 양태에서, 상동 단백질은 이. 콜라이(E. coli)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다른 유기체에 의해 생성된 천연 단백질이다. 본 발명은 재조합 DNA 기술을 통하여 상동 단백질을 생성하는 숙주 세포를 포함한다.

본 발명은 일반적으로, 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변화를 갖는 박테리아 세포 및 그러한 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 sin 오페론에서의 유전자의 발현을 감소시키고 관심 대상의 단백질의 발현을 향상시키는 (예를 들어, sinR 유전자의 발현의 감소) 유전자 변화를 갖는 그람 양성 미생물, 예컨대 바실루스 종을 포함한다.

상기에 요약된 바와 같이, 본 발명의 측면은 그람 양성 박테리아 세포로부터의 관심 대상의 단백질의 발현을 증가시키는 방법을 포함하며, 이는 관심 대상의 단백질의 생성이 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 감소된 발현을 갖도록 유전자 변경된 그람 양성 세포에서, 상응하는 유전자-비변경된 그람 양성 세포 (예를 들어, 야생형 및/또는 모 세포)에서의 관심 대상의 상기 단백질의 발현 수준과 비교하여 증가된다는 관찰을 기반으로 한다. 유전자 변화는 예를 들어 에피좀 부가 및/또는 염색체 삽입, 결실, 역위(inversion), 염기 변화 등에 의해 숙주 세포의 유전자 메이크업(make-up)을 변화시키는 숙주 세포에서의 임의의 변화를 의미한다. 이와 관련하여 한정하려는 의도는 없다.

특정 실시 양태에서, 본 방법은 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함하며 관심 대상의 단백질을 생성할 수 있는 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 생성하거나 수득하는 단계 및 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 관심 대상의 단백질이 변경된 그람 양성 박테리아 세포에 의해 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함한다. 이에 의해 관심 대상의 단백질의 발현은 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 성장시킨 상응하는 비변경된 그람 양성 박테리아 세포에서의 관심 대상의 단백질의 발현과 비교하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 증가된다.

특정 실시 양태에 따르면, 유전자 변경된 그람 양성 박테리아 세포 (또는 유전자 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 생성하는 모 세포)는 바실루스 주일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 바실루스 주는 호알칼리성이다. 다수의 호알칼리성 바실루스 주가 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,217,878호; 및 문헌[Aunstrup et al., Proc IV IFS: Ferment. Technol. Today, 299-305 [1972]] 참조). 일부 실시 양태에서, 관심 대상의 바실루스 주는 산업용 바실루스 주이다. 산업용 바실루스 주의 예는 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스(B. lentus), 비. 서브틸리스, 및 비. 아밀로리쿠에파시엔스를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 실시 양태에서, 바실루스 숙주 주는 비. 렌투스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 푸밀루스, 비. 튜린기엔시스, 비. 클라우시이, 및 비. 메가테륨과, 바실루스 속 내의 다른 유기체 (상기에 논의된 바와 같음)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정한 실시 양태에서, 비. 서브틸리스가 사용된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,264,366호 및 미국 특허 제4,760,025호 (RE 34,606)에는 본 발명에서 그 용도가 발견되는 다양한 바실루스 숙주 주가 기술되어 있지만, 다른 적합한 주가 본 발명에서의 사용용으로 고려된다.

본원에 개시된 바와 같은 유전자 변경된 세포의 모 주 (예를 들어, 모 바실루스 주)는 산업용 주일 수 있으며, 이는 비-재조합 주, 천연 발생 주의 돌연변이 주, 또는 재조합 주를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 모 주는 관심 대상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 내에 도입된 재조합 숙주 주이다. 관심 대상의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입이 모 주에서 행해질 수 있지만, 이러한 단계는 또한 본원에 상술된 바와 같이 폴리펩티드 생성의 증가를 위하여 이미 유전자 변경된 주에서 수행될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 숙주 주는 바실루스 서브틸리스 숙주 주, 예를 들어, 재조합 비. 서브틸리스 숙주 주이다.

본 발명의 측면에서 그 용도가 발견되는 다수의 비. 서브틸리스 주가 공지되어 있으며, 이는 1A6 (ATCC 39085), 168 (1A01), SB19, W23, Ts85, B637, PB1753 내지 PB1758, PB3360, JH642, 1A243 (ATCC 39,087), ATCC 21332, ATCC 6051, MI113, DE100 (ATCC 39,094), GX4931, PBT 110, 및 PEP 211 주 (예를 들어, 문헌[Hoch et al., Genetics, 73:215-228 [1973]]; 미국 특허 제4,450,235호; 미국 특허 제4,302,544호; 및 유럽 특허 제0134048호 참조)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 발현 숙주로서의 비. 서브틸리스의 사용은 팔바(Palva) 등과 다른 이들에 의해 추가로 기술되어 있다 (문헌[Palva et al., Gene 19:81-87 [1982]] 참조; 또한 문헌[Fahnestock and Fischer, J. Bacteriol., 165:796-804 [1986]]; 및 문헌[Wang et al., Gene 69:39-47 [1988]] 참조).

특정 실시 양태에서, 산업용 프로테아제 생성 바실루스 주는 모 발현 숙주로서의 역할을 할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 발명에서의 이러한 주의 사용은 프로테아제 생성 및 효율의 추가의 향상을 제공한다. 2가지 일반적인 유형의 프로테아제, 즉 중성 (또는 “메탈로프로테아제” 및 알칼리 (또는 “세린”) 프로테아제가 전형적으로 바실루스 sp.에 의해 분비된다. 세린 프로테아제는 활성 부위에 필수 세린 잔기가 있는, 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 세린 프로테아제는 25,000 내지 30,000의 범위의 분자량을 갖는다 (문헌[Priest, Bacteriol. Rev., 41:711-753 [1977]] 참조). 서브틸리신은 본 발명에서 사용하기 위한 세린 프로테아제이다. 매우 다양한 바실루스 서브틸리신, 예를 들어 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 309가 확인되었고 서열결정되었다 (예를 들어, 유럽 특허 제414279 B호; 국제 공개 제89/06279호 및 문헌[Stahl et al., J. Bacteriol., 159:811-818 [1984]] 참조). 본 발명의 일부 실시 양태에서, 바실루스 숙주 주는 돌연변이 (예를 들어, 변이체형) 프로테아제를 생성한다. 다수의 참고 문헌이 변이체형 프로테아제 및 참고 문헌의 예를 제공한다 (예를 들어, 국제 공개 제99/20770호; 국제 공개 제99/20726호; 국제 공개 제99/20769호; 국제 공개 제89/06279호; RE 34,606; 미국 특허 제4,914,031호; 미국 특허 제4,980,288호; 미국 특허 제5,208,158호; 미국 특허 제5,310,675호; 미국 특허 제5,336,611호; 미국 특허 제5,399,283호; 미국 특허 제5,441,882호; 미국 특허 제5,482,849호; 미국 특허 제5,631,217호; 미국 특허 제5,665,587호; 미국 특허 제5,700,676호; 미국 특허 제5,741,694호; 미국 특허 제5,858,757호; 미국 특허 제5,880,080호; 미국 특허 제6,197,567호; 및 미국 특허 제6,218,165호 참조).

본 발명은 관심 대상의 단백질로서의 프로테아제에 한정되지 않음이 여기서 주지된다. 실제로, 본 발명은 그람 양성 세포에서의 증가된 발현이 요망되는 관심 대상의 매우 다양한 단백질 (하기에 상술됨)을 포함한다.

다른 실시 양태에서, 본 발명의 측면에서 사용하기 위한 주는 유익한 표현형을 제공하는 다른 유전자에서의 추가의 유전자 변화를 가질 수 있다. 예를 들어, 하기 유전자 중 적어도 하나에서 돌연변이 또는 결실을 포함하는 바실루스 sp.가 이용될 수 있다: degU, degS, degR 및degQ.일부 실시 양태에서, 돌연변이는 degU 유전자 내에 있으며, 예를 들어 degU(Hy)32 돌연변이이다. (문헌[Msadek et al., J. Bacteriol., 172:824-834 [1990]]; 및 문헌[Olmos et al., Mol. Gen. Genet., 253:562-567 [1997]] 참조). 따라서, 본 발명의 측면에서 그 용도가 발견되는 모/유전자 변경 그람 양성 주의 하나의 예로는 degU32(Hy) 돌연변이를 지닌 바실루스 서브틸리스 세포가 있다. 추가의 측면에서, 바실루스 숙주는 scoC4에서의 돌연변이 또는 결실 (문헌[Caldwell et al., J. Bacteriol., 183:7329-7340 [2001]] 참조);oppA 또는 opp 오페론의 기타 유전자에서의 돌연변이 또는 결실 (문헌[Perego et al., Mol. Microbiol., 5:173-185 [1991]] 참조)을 포함할 수 있다. 실제로, oppA 유전자에서의 돌연변이와 동일한 표현형을 야기하는 opp 오페론에서의 임의의 돌연변이는 본 발명의 변경된 바실루스 주의 일부 실시 양태에서 그 용도를 발견할 것으로 사료된다. 일부 실시 양태에서, 이러한 돌연변이는 단독으로 나타나는 한편, 다른 실시 양태에서, 돌연변이들의 조합이 존재한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 변경된 바실루스는 전술한 유전자들 중 하나 이상에 대한 돌연변이를 이미 포함하는 모 바실루스 숙주 주로부터 수득된다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 이전에 유전자 변경된 바실루스는 전술한 유전자들 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하도록 추가로 엔지니어링된다.

상기에 나타낸 바와 같이, sin 오페론의 적어도 하나의 유전자의 발현은 야생형 및/또는 모 세포 (본질적으로 동일한 조건 하에 성장시킴)와 비교하여 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 감소된다. 이러한 발현 감소는 임의의 편리한 방식으로 달성될 수 있으며, 전사 수준, mRNA 안정성, 번역에서의 것일 수 있거나, sin 오페론으로부터 생성되는 폴리펩티드들 중 하나 이상에서의 변이의 존재로 인한 것일 수 있는데 이는 그의 활성을 감소시킨다(즉, 이것은 폴리펩티드의 활성을 기반으로 할 경우 “기능적” 발현 감소이다). 이와 같이, sin 오페론에서의 적어도 하나의 유전자의 발현을 감소시키는 방식 또는 유전자 변화의 유형의 제한은 의도되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 그람 양성 세포에서의 유전자 변화는 sin 오페론에서의 프로모터들 중 하나 이상을 변경시키는 것으로서 이는 전사 활성을 감소시킨다. 특정 실시 양태에서, 상기 변화는 (예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같이) mRNA 전사체의 수준을 감소시키는 sin 오페론에서의 (예를 들어, sinR 유전자에서의) 침묵 돌연변이이다. 대안적으로, 그람 양성 세포에서의 유전자 변화는 sin 오페론에서의 뉴클레오티드를 변경시키는 것일 수 있으며, 이는 상기 세포에서 감소된 안정성을 갖는 전사체를 생성한다. 특정 실시 양태에서, sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 하나 초과의 유전자 변화가 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 존재할 수 있다.

특정 실시 양태에서, sin 오페론에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현은 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 배양된 야생형 및/또는 모 세포에서의 발현 수준의, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 또는 약 80%를 포함하여 3%까지 감소된다. 이와 같이, sin 오페론에서의 상기 하나 이상의 유전자의 발현 감소의 범위는 약 3% 내지 약 80%, 약 4% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 6% 내지 약 65%, 약 7% 내지 약 60%, 약 8% 내지 약 50%, 약 9% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 11% 내지 약 35%, 약 12% 내지 약 30%, 약 13% 내지 약 25%, 약 14% 내지 약 20% 등일 수 있다. 상기에 개시된 범위 내의 임의의 하위 발현 범위가 고려된다.

특정 실시 양태에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포에서의 이러한 유전자의 발현과 비교하여 sinR 유전자의 감소된 발현을 갖는다. 특정한 실시 양태에서, 유전자 변화는 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 sinR 유전자로부터 유래된 mRNA 전사체의 수준을 감소시킨다.

특정 실시 양태에서, 유전자 변화 (또는 돌연변이)는 sin 오페론에서의 sinR 유전자의 발현을 감소시키는 것이다. 이러한 실시 양태 중 일부에서, 유전자 변화는 sin 오페론의 sinR 유전자에서의 것이다. 모 그람 양성 세포(즉, 본원에 기술된 바와 같이 유전자 변경되기 전)에서의 sinR 유전자는 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100% 동일한 것을 포함하여, 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 60% 동일한 유전자이다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 전부의 또는 일부분의 sinR 유전자의 결실이다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 침묵 돌연변이이며, 여기서 침묵 돌연변이는 번역될 (본 기술 분야에서 잘 이해되는 용어) 때 코딩된 폴리펩티드에서의 아미노산 변화로 이어지지 않는 유전자의 코딩 영역의 핵산 서열에서의 돌연변이를 의미한다. 특정 실시 양태에서, 변이 서열에서의 침묵 돌연변이는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 330에 상응하는 뉴클레오티드 위치에 있다. 특정 실시 양태에서, sinR 침묵 돌연변이는 야생형 sinR 유전자의 코딩 서열의 센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 330에서의 구아닌(G)으로부터 아데닌(A)으로의 단일 뉴클레오티드 변화이다 (서열 번호 1은 sinR 야생형 뉴클레오티드 서열을 나타내며; 서열 번호 2는 SinR 아미노산 서열을 나타내며; 서열 번호 3은 G330A 침묵 돌연변이를 갖는 변이체형 sinR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다).

상기에 나타낸 바와 같이, 많은 상이한 단백질들은 그람 양성 세포에서 관심 대상의 단백질로서 그 용도가 발견된다(즉, 발현이 유전자 변경된 세포에서 증가된 단백질). 관심 대상의 단백질은 상동 단백질 또는 이종 단백질일 수 잇으며, 야생형 단백질 또는 천연 또는 재조합 변이체일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 효소이며, 특정한 예에서, 효소는 프로테아제, 셀룰라아제, 풀룰라나아제, 아밀라아제, 카르보하이드라아제, 리파아제, 이소머라아제, 트랜스퍼라아제, 키나아제 및 포스파타아제로부터 선택된다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 프로테아제이며, 여기서 프로테아제는 서브틸리신, 예를 들어, 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN’, 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 서브틸리신 309, 및 이들의 변이체로부터 선택되는 서브틸리신일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 관심 대상의 단백질은 형광 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP)이다.

특정 실시 양태에서, 방법은 관심 대상의 단백질의 회수 단계를 추가로 포함한다. 관심 대상의 단백질의 발현/생성 수준은 (야생형 또는 모 세포와 비교하여) 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 증가되기 때문에, 회수되는 관심 대상의 단백질의 양은 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 (그리고 동일한 규모로) 배양된 상응하는 야생형 및/또는 모 세포와 비교하여 증가된다. 세포내 및 세포외 발현 폴리펩티드의 발현 수준/생성을 검출 및 측정하기 위한 당업자에게 공지된 다양한 분석법이 있다. 그러한 분석법은 본 발명의 사용자에 의해 결정되며, 관심 대상의 단백질의 아이덴티티(identity) 및/또는 활성 (예를 들어, 효소 활성)에 의존할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 경우, 280 nm에서의 흡광도로서 또는 폴린법(Folin method)을 이용하여 비색법에 의해 측정되는 카제인 또는 헤모글로빈으로부터의 산-용해성 펩티드의 방출을 기반으로 하는 분석법이 있다 (예를 들어, 문헌[Bergmeyer et al., “Methods of Enzymatic Analysis” vol. 5, Peptidases, Proteinases and their Inhibitors, Verlag Chemie, Weinheim [1984]] 참조). 다른 분석법은 발색 기질(chromogenic substrate)의 가용화를 포함한다 (예를 들어, 문헌[Ward, “Proteinases,” in Fogarty (ed.)., Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science, London, [1983], pp 251-317] 참조). 분석법의 다른 예는 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-파라 니트로아닐리드 분석법(SAAPFpNA) 및 2,4,6-트리니트로벤젠 술포네이트 소듐 염 분석법(TNBS 분석법)을 포함한다. 당업자에게 공지된 다수의 추가의 참고 문헌은 적합한 방법을 제공한다 (예를 들어, 문헌[Wells et al., Nucleic Acids Res. 11:7911-7925 [1983]]; 문헌[Christianson et al., Anal. Biochem., 223:119 -129 [1994]]; 및 문헌[Hsia et al., Anal Biochem., 242:221-227 [1999]] 참조).

상기에 나타낸 바와 같이, 숙주 세포에서의 관심 대상의 단백질의 분비 수준의 결정 수단 및 발현된 단백질의 검출 수단은 관심 대상의 단백질에 특이적인 다클론 또는 단클론 항체를 이용한 면역분석법의 사용을 포함한다. 예는 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 형광 면역분석법(FIA), 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 포함한다. 그러나, 다른 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 관심 대상의 단백질의 평가에서 그 용도가 발견된다 (예를 들어, 문헌[Hampton et al., Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN [1990]]; 및 문헌[Maddox et al., J. Exp. Med., 158:1211 [1983]] 참조). 본 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명을 이용하여 생성된 변경된 바실루스 세포를 세포 배양물로부터의 관심 대상의 폴리펩티드의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에 유지하고 성장시킨다 (예를 들어, 문헌[Hardwood and Cutting (eds.) Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & Sons [1990]] 참조). 본원에 기술된 바와 같은 유전자 변경된 세포는 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상, 5가지 이상, 6가지 이상, 7가지 이상, 8가지 이상, 9가지 이상, 10가지 이상 등을 포함하여 1가지 초과의 관심 대상의 단백질을 발현할 수 있음이 추가로 주지된다. 일부 실시 양태에서, 박테리아 세크레톰(secretome)에서의 단백질의 증가된 발현이 요구되는데, 이는 세포로부터 분비되는 다수의 상이한 단백질들을 포함한다.

본 발명의 측면은 개선된 단백질 생성 능력을 갖는 변경된 그람 양성 박테리아 세포의 수득 방법을 포함한다. 일반적으로, 본 방법은 (상기에 정의된 바와 같이) sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현이 감소된 유전자 변경된 주를 생성하도록 모 그람 양성 세포를 유전자 변경시키는 단계를 포함한다.

특정 실시 양태에서, 본 방법은 염색체 내에 통합되거나 에피좀 유전 요소로서 유지될 때 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 감소된 유전자 변경된 그람 양성 세포를 생성하는 모 그람 양성 박테리아 세포 내로의 폴리뉴클레오티드 서열의 도입 단계를 포함한다.

폴리뉴클레오티드 벡터 (예를 들어, 플라스미드 구성물)를 이용하여 바실루스의 염색체를 변경시키거나 바실루스에서의 에피좀 유전 요소를 유지하기 위한 바실루스 종의 형질전환을 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 바실루스 세포 내로의 폴리뉴클레오티드 서열의 도입에 적합한 방법은 예를 들어 문헌[Ferrari et al., “Genetics,” Harwood et al.(ed.), Bacillus, Plenum Publishing Corp. [1989], pages 57-72]에서 발견되며; 또한 문헌[Saunders et al., J. Bacteriol., 157:718-726 [1984]]; 문헌[Hoch et al., J. Bacteriol., 93:1925-1937 [1967]]; 문헌[Mann et al., Current Microbiol., 13:131-135 [1986]]; 및 문헌[Holubova, Folia Microbiol., 30:97 [1985]]을 참조하며; 비. 서브틸리스의 경우 문헌[Chang et al., Mol. Gen. Genet., 168:11-115 [1979]]; 비. 메가테륨의 경우 문헌[Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett., 7:261-263 [1980]]; 비. 아밀로리쿠에파시엔스의 경우 문헌[Smith et al., Appl. Env. Microbiol., 51:634 (1986)]; 비. 튜린기엔시스의 경우 문헌[Fisher et al., Arch. Microbiol., 139:213-217 [1981]]; 및 비. 스파에리쿠스(B. sphaericus)의 경우 문헌[McDonald, J. Gen. Microbiol., 130:203 [1984]]을 참조한다. 실제로, 원형질체 형질전환을 포함하는 형질전환 및 회합(congression), 형질도입, 및 원형질체 융합과 같은 방법은 공지되어 있으며 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 형질전환 방법은 특히 본 발명에 의해 제공되는 DNA 구성물을 숙주 세포 내에 도입하기 위한 것이다.

게다가, 숙주 세포 내로의 DNA 구성물의 도입은 표적화 DNA 구성물의 플라스미드 또는 벡터 내로의 삽입 없이 DNA를 숙주 세포 내에 도입하기 위한 본 기술 분야에 공지된 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 그러한 방법은 염화칼슘 침전법, 전기천공법, 네이키드 DNA 리포좀 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가의 실시 양태에서, DNA 구성물은 플라스미드 내로의 삽입 없이 플라스미드와 함께 공동 형질전환될 수 있다.

선발가능 마커 유전자를 이용하여 안정한 형질전환체를 선발하는 실시 양태에서, 임의의 편리한 방법을 이용하여 유전자 변경 그람 양성 주로부터 선발 마커를 결실시키는 것이 바람직할 수 있으며, 이때 다수의 방법이 본 기술 분야에 공지되어 있다 (문헌[Stahl et al., J. Bacteriol., 158:411-418 [1984]]; 및 문헌[Palmeros et al., Gene 247:255 -264 [2000]] 참조).

일부 실시 양태에서, 2가지 이상의 DNA 구성물들(즉, 각각이 숙주 세포를 유전자 변경하도록 설계된 DNA 구성물들)을 모 그람 양성 세포 내에 도입하여 세포 내에 2가지 이상의 유전자 변화, 예를 들어, 2개 이상의 염색체 영역에서의 변화를 도입한다. 일부 실시 양태에서, 이러한 영역은 연접 영역인 반면 (예를 들어, sin 오페론 내의 또는 sin 오페론과 인접 유전자 또는 오페론 내의 두 영역), 다른 실시 양태에서 상기 영역들은 분리되어 있다. 일부 실시 양태에서, 유전자 변화 중 하나 이상은 에피좀 유전 요소의 부가에 의한 것이다.

일부 실시 양태에서, 숙주 세포는 변경된 바실루스 주를 생성하기 위하여 본 발명에 따른 하나 이상의 DNA 구성물로 형질전환되며, 여기서, 2가지 이상의 유전자가 숙주 세포에서 불활성화되었다. 일부 실시 양태에서, 2가지 이상의 유전자가 숙주 세포 염색체로부터 결실된다. 대안적인 실시 양태에서, 2가지 이상의 유전자가 DNA 구성물의 삽입에 의해 불활성화된다. 일부 실시 양태에서, 불활성화된 유전자는 연접 유전자인 반면 (결실에 의해 불활성화되든지 및/또는 삽입에 의해 불활성화되든지 간에), 다른 실시 양태에서 상기 유전자는 연접 유전자가 아니다.

일단 유전자 변경된 숙주 세포가 생성되면, 이것은 관심 대상의 단백질이 발현되는 조건 하에 배양될 수 있으며, 여기서, 특정 실시 양태에서 관심 대상의 단백질은 회수된다.

본 발명의 측면은 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 포함하며, 여기서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 유전자 변화를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 유전자 변경된 그람 양성 세포는 상기에 기술된 바와 같이 생성된다. 상기에서 추가로 주지되는 바와 같이, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 바실루스 sp. 주, 예를 들어, 비. 리케니포르미스, 비. 렌투스, 비. 서브틸리스, 비. 아밀로리쿠에파시엔스, 비. 브레비스, 비. 스테아로서모필루스, 비. 알칼로필루스, 비. 코아굴란스, 비. 서큐란스, 비. 푸밀루스, 비. 라우투스, 비. 클라우시이, 비. 메가테륨, 또는 비. 튜린기엔시스 주일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 바실루스 sp. 주는 비. 서브틸리스 주이다. 일부 측면에서, 변경된 그람 양성 박테리아 세포는 세포의 표현형을 개선시키는 추가의 돌연변이, 예를 들어, degU, degQ, degS, scoC4, 및 oppA로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자에서의 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 돌연변이는 degU(Hy)32이다.

특정 실시 양태에서, sin 오페론의 적어도 하나의 유전자의 발현은 야생형 및/또는 모 세포 (본질적으로 동일한 조건 하에 성장시킴)와 비교하여 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 감소된다. 이러한 발현 감소는 임의의 편리한 방식으로 달성될 수 있으며, 전사 수준, mRNA 안정성, 번역에서의 것일 수 있거나, sin 오페론으로부터 생성되는 폴리펩티드들 중 하나 이상에서의 변이의 존재로 인한 것일 수 있는데 이는 그의 활성을 감소시킨다(즉, 이것은 폴리펩티드의 활성을 기반으로 할 경우 “기능적” 발현 감소이다). 이와 같이, sin 오페론에서의 적어도 하나의 유전자의 발현을 감소시키는 방식 또는 유전자 변화의 유형의 제한은 의도되지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 그람 양성 세포에서의 유전자 변화는 sin 오페론에서의 프로모터들 중 하나 이상을 변경시키는 것으로서 이는 전사 활성을 감소시킨다. 특정 실시 양태에서, 상기 변화는 (예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같이) mRNA 전사체의 수준을 감소시키는 sin 오페론에서의 침묵 돌연변이이다. 대안적으로, 그람 양성 세포에서의 유전자 변화는 sin 오페론에서의 뉴클레오티드를 변경시키는 것일 수 있으며, 이는 상기 세포에서 감소된 안정성을 갖는 전사체를 생성한다. 특정 실시 양태에서, sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시키는 하나 초과의 유전자 변화가 유전자 변경된 그람 양성 세포에서 존재할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 유전자 변화는 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 성장시킨 상응하는 비변경 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 sin 오페론으로부터 유래된 mRNA 전사체의 수준을 감소시킨다.

일부 실시 양태에서, 본 발명은 (상기에 상세하게 기술된 바와 같이) 숙주 세포 내에 안정하게 포함될 때 sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현이 감소되도록 세포를 유전자 변경시키는 유입 서열을 포함하는 DNA 구성물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, DNA 구성물은 시험관 내에서 어셈블링되며(assembled), 이어서 이 구성물을 적격성(competent) 그람 양성 (예를 들어, 바실루스) 숙주 내로 직접적으로 클로닝하여 DNA 구성물이 숙주 세포 염색체 내에 통합되도록 한다. 예를 들어, PCR 융합 및/또는 라이게이션을 이용하여 시험관 내에서 DNA 구성물을 어셈블링할 수 있다. 일부 실시 양태에서, DNA 구성물은 비-플라스미드 구성물인 반면, 다른 실시 양태에서 이것은 벡터 (예를 들어, 플라스미드) 내에 포함된다. 일부 실시 양태에서, 원형 플라스미드가 사용된다. 실시 양태들에서, 원형 플라스미드는 적절한 제한 효소(즉, DNA 구성물을 파괴하지 않는 것)를 사용하도록 설계된다. 따라서, 선형 플라스미드는 본 발명에서 그 용도가 발견된다. 그러나, 당업자에게 공지된 바와 같이, 다른 방법이 본 발명에서 사용하기에 적합하다 (예를 들어, 문헌[Perego, “Integrational Vectors for Genetic Manipulation in Bacillus subtilis,” (Sonenshein et al.(eds.), Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, American Society for Microbiology, Washington, DC [1993]] 참조).

특정 실시 양태에서, DNA 표적화 벡터는 전부의 또는 일부의 sinR 유전자를 결실시키도록 (또는 이의 결실을 허용하도록) 설계된다. 예를 들어, DNA 표적화 벡터는 전부의 또는 일부의 sinR 유전자의 제거를 허용하는 요소를 포함할 수 있다 (예를 들어, 본 기술 분야에 공지된 바와 같이 cre-lox 시스템을 이용함). 특정 실시 양태에서, DNA 표적화 벡터의 유입 서열은 sinR 유전자로부터 유래되는 변이 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시 양태 중 일부에서, 변이 서열은 길이가 적어도 약 15개 뉴클레오티드이며, 전부의 또는 일부의 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 60% 동일하며, 돌연변이가 그람 양성 박테리아 세포의 내인성 sinR 유전자에 존재할 때 sin 오페론에서의 유전자의 감소된 발현을 초래하는 sinR 유전자에서의 소정 뉴클레오티드 위치에서의 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다. 변이 서열은 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 60개 뉴클레오티드, 약 80개 뉴클레오티드, 약 90개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 약 200개 뉴클레오티드, 약 300개 뉴클레오티드, 약 400개 뉴클레오티드, 약 500개 뉴클레오티드, 약 600개 뉴클레오티드, 약 700개 뉴클레오티드, 약 800개 뉴클레오티드, 약 900개 뉴클레오티드, 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1100개 뉴클레오티드, 약 1200개 뉴클레오티드, 약 1300개 뉴클레오티드, 약 1400개 뉴클레오티드 또는 이보다 더 많은 뉴클레오티드일 수 있다. 상기에서 추가로 주지되는 바와 같이, 변이 서열은 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일한 것을 포함하여, 서열 번호 1의 서열에 대하여 적어도 60% 동일할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 변이 서열에서의 유전자 변화는 침묵 돌연변이이며, 여기서 침묵 돌연변이는 번역될 (본 기술 분야에서 잘 이해되는 용어) 때 코딩된 SinR 폴리펩티드에서의 아미노산 변화로 이어지지 않는 sinR 유전자의 코딩 영역의 변이 서열에서의 돌연변이를 의미한다. 특정 실시 양태에서, 변이 서열에서의 침묵 돌연변이는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 330에 상응하는 뉴클레오티드 위치에 있다. 특정 실시 양태에서, sinR 침묵 돌연변이는 야생형 sinR 유전자의 코딩 서열의 센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 330에서의 구아닌(G)으로부터 아데닌(A)으로의 단일 뉴클레오티드 변화이다 (서열 번호 1은 sinR 야생형 뉴클레오티드 서열을 나타내며; 서열 번호 2는 SinR 아미노산 서열을 나타내며; 서열 번호 3은 G330A 침묵 돌연변이를 갖는 변이체형 sinR 뉴클레오티드 서열을 나타낸다).

본 발명의 측면은 상기에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 벡터는 그람 양성 박테리아 세포를 형질전환시킬 때 상동 재조합에 의해 그람 양성 박테리아 세포의 sin 오페론에서의 상응하는 위치 내로 폴리뉴클레오티드 서열에서의 상기 적어도 하나의 돌연변이를 도입하도록 설계된 표적화 벡터이다. 일부 실시 양태에서, 유입 서열/벡터는 선발 마커를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 2개의 loxP 부위 (문헌[Kuhn and Torres, Meth. Mol. Biol., 180:175-204 [2002]] 참조)와, 항미생물성 유전자 사이에 위치한 선발 마커는 그 후에 Cre 단백질의 작용에 의해 결실된다.

본 발명의 측면은 그람 양성 박테리아 세포에서 관심 대상의 단백질의 발현을 향상시키는 방법을 포함하며, 이는 모 그람 양성 박테리아 세포를 상기에 기술된 DNA 구성물 또는 벡터(즉, 숙주 세포 내에 안정하게 포함될 때, sin 오페론에서의 하나 이상의 유전자의 발현이 감소되도록 세포를 유전자 변경시키는 유입 서열을 포함하는 것, 예를 들어, 상기에 개시된 바와 같이 sinR 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 것)로 형질전환시켜서, 상기 벡터와, 모 그람 양성 박테리아 세포의 sin 오페론에서의 상응하는 영역의 상동 재조합을 허용하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 생성하는 단계; 및 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 관심 대상의 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 성장시키는 단계를 포함하고, 여기서 관심 대상의 단백질의 생성은 단계에서 형질전환 전의 그람 양성 박테리아 세포와 비교하여 변경된 그람 양성 박테리아 세포에서 증가된다. 그람 양성 주, 돌연변이 및 이러한 본 발명의 측면에서 그 용도가 발견되는 기타 특징의 예가 상기에 상세하게 기술되어 있다.

DNA 구성물이 벡터 내에 포함되든지 플라스미드 DNA의 존재 없이 사용되든지 간에, 이것은 미생물의 형질전환에 사용된다. 임의의 적합한 형질전환 방법이 본 발명에서 그 용도가 발견될 것으로 사료된다. 실시 양태들에서, DNA 구성물의 적어도 하나의 카피가 숙주 바실루스 염색체 내에 통합된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 DNA 구성물이 숙주 세포의 형질전환에 사용된다.

본 발명의 실시에 대한 방식 및 방법은 하기 실시예의 참조에 의해 당업자에 의해 더 충분히 이해될 수 있으며, 실시예는 본 발명의 또는 이에 대한 청구범위의 범주를 어떠한 방식으로든지 한정하고자 하는 것이 아니다.

실험

본 발명의 특정 실시 양태 및 측면을 입증하고 추가로 예시하기 위하여 하기 실시예를 제공하며, 하기 실시예는 이의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

하기의 실험에 대한 개시 내용에서, 특정한 하기 약어가 적용된다: ℃ (섭씨 온도); rpm (분당 회전수); μg (마이크로그램); mg (밀리그램); μl　(마이크로리터); ml (밀리리터); mM (밀리몰랄); μM　(마이크로몰랄); sec (초); min (분); hr (시간); OD₂₈₀ (280 nm에서의 광학 밀도); OD₆₀₀ (600 nm에서의 광학 밀도); PCR (폴리머라아제 연쇄 반응); RT-PCR (역전사 PCR); SDS (소듐 도데실 술페이트); Abs (흡광도).

실시예 1

sinR 유전자에서의 돌연변이에 의한 바실루스에서의 증가된 단백질 발현

A. 바실루스 서브틸리스에서의 sinR 유전자에서의 돌연변이

문헌[Janes and Stibitz (Infection and Immunity, 74(3):1949, 2006)]에 기술된 마커-무함유(marker-less) 유전자 대체법을 이용하여 sinR 유전자에서의 침묵 돌연변이를 모 바실루스 서브틸리스 주 내에 도입하였다 (oppA::tetR, ΔaprE, ΔnprE, degUHy32, 본원에서 “모 주”로 칭해짐). sinR 침묵 돌연변이는 야생형 sinR 의 코딩 서열의 센스 가닥의 뉴클레오티드 위치 330에서의 구아닌(G)에서 아데닌(A)으로의 단일 뉴클레오티드 변화이다 (서열 번호 1은 야생형 서열을 나타내며; 서열 번호 2는 SinR 아미노산 서열을 나타내며, 서열 번호 3은 G330A 침묵 돌연변이를 나타냄) (침묵 돌연변이는 유전자의 코딩 영역 내의 부위의 핵산 서열을 변화시키지만 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 변화시키지 않는 돌연변이임).

sinR 유전자의 위치 330에서의 sinR G>A 동의 돌연변이(synonymous mutation)를 포함하는 게놈 영역을 하기 프라이머를 이용하여 주 FCM102로부터 증폭시켰다:

EcoRI sinR 정방향:

서열 번호 4

BamHI sinR 역방향 :

서열 번호 5

증폭시킨 단편을 pKSV7-I-Sce-Km 벡터 내에 클로닝하였으며 (도 1); 이 플라스미드는 pKSV7 (문헌[Smith K. and Youngman P. Biochimie (1992) 74, 705-711])로부터 유래된 것이고, 클로람페니콜 내성 마커를 카나마이신 내성 마커로 대체하였으며, I-Sce 제한효소 부위를 상기 플라스미드의 폴리링커에 부가하였다. 자네스(Janes) 및 스티비츠(Stibitz)의 방법을 이용하여 단일 뉴클레오티드 다형성을 sinR 유전자 내에 도입하였다. 생성된 주 CB15-14 sinR은 때로 본원에서 “sinR 돌연변이 주” “sinR*”, “돌연변이 주” 또는 이의 등가물로 칭해진다. 비-돌연변이 주(CB15-14)는 때로 본원에서 “모 주” 또는 이의 등가물로 칭해진다.

B. 바실루스 서브틸리스 주에서의 sinR 유전자의 결실

비. 서브틸리스 168로부터 유래된 sinR 결실된 주 (BKE24610)를 바실루스 유전자 스톡 센터(Bacillus Genetic Stock Center)(http://www.bgsc.org/)로부터 획득하였다. BKE24610의 염색체 DNA를 추출하고, 비. 서브틸리스 “모 주”를 형질전환시켰다. 결실을 sinR 유전자좌의 PCR 및 서열결정에 의해 확인하였다. 생성된 주를 비. 서브틸리스 ΔsinR 또는 sinR::ermR로 나타낸다. 도 2는 sinR 결실의 유전자 지도를 나타낸다. sinR 유전자의 ORF를 결실시키고, 플라스미드 코딩된 cre 리콤비나아제를 이용하여 에리트로마이신 내성 마커를 용이하게 제거하기 위하여 loxP 부위들 (lox 71 및 lox 66)이 측면에 있는 에리트로마이신 내성 카세트로 대체하였다. 측면 sinI 및 tasA 유전자의 ORF는 sinR 유전자의 넉아웃(knockout)에 의해 변화되지 않은 채로 남아있다.

C. sinR 돌연변이 또는 sinR 결실 바실루스 주에서의 프로테아제 발현

FNA 프로테아제의 발현에 대한 sinR 돌연변이 및 결실 (Y217L 치환을 포함하는 서브틸리신 BPN'; 서열 번호 6)의 영향을 테스트하기 위하여, 구성물 nprE::PrrnE2/3-FNA-catR (바실루스 서브틸리스의 rrnE 2/3 리보좀 프로모터로부터 FNA를 발현하며 클로람페니코 아세틸트랜스퍼라아제 내성(catR) 마커 유전자를 포함함)을 모 주 및 sinR* 및 ΔsinR 주의 nprE 유전자좌 내에 도입하였다. 형질전환체를 5 ppm의 클로람페니콜을 포함하는 루리아 한천(Luria Agar) 플레이트 상에서 선발하였다. 야생형/모 주 및 돌연변이 주(sinR* 및 sinR::ermR)를 LB 배지에서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 10 마이크로리터의 예비배양물을 이용하여 165 마이크로리터의 뇌 심장 침출(Brain Heart Infusion; BHI) 배지에 접종하였다. 상기 주들을 37℃에서 성장시키고, 샘플을 3시간 성장시킨 것으로부터 취하였다. 20배 희석시킨 전 브로스의 세포 밀도를 스펙트라맥스(SpectraMax) 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정하였다. 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 3a에 나타낸다. 도 3a는 FNA 발현 모 주 (WT) 및 sinR* 및 ΔsinR 주의 세포 성장이 7시간의 성장에서 동등하였음을 나타낸다.

프로테아제 발현을 국제 공개 제2010/144283호에 기술된 바와 같이 N-suc-AAPF-pNA 기질 (시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.))을 이용하여 모니터링하였다. 간략하게는, 전 브로스를 분석용 완충액 (100 mM 트리스(Tris), 0.005% 트윈(Tween) 80, pH 8.6)에서 40배 희석시키고, 10 μl의 희석 샘플을 마이크로타이터(microtiter) 플레이트에 배열시켰다. AAPF 스톡을 희석시키고, 분석용 완충액 (DMSO 중 100 mg/ml AAPF 스톡의 100배 희석물) 및 190 μl의 이 용액을 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 상기 용액의 흡광도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 405 nm에서 측정하였다. 405 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 3b에 나타낸다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, FNA 생성은 야생형 주 (WT)와 비교하여 돌연변이 주 (sinR* 및 ΔsinR)에서 증가하였다.

D. sinR 돌연변이 또는 sinR 결실 바실루스 주에서의 아밀라아제 발현

아밀라아제 발현 (서열 번호 7)에 대한 sinR 돌연변이 및 결실의 영향을 결정하기 위하여, 구성물 PaprE-amyE catR을 sinR 유전자가 결실되거나 sinR 돌연변이를 포함하는 비. 서브틸리스 모 주 내에 도입하였다. 형질전환체를 5 ppm의 클로람페니콜을 포함하는 LA 플레이트 상에서 선발하였다. WT 주 (CB15-14) 및 돌연변이 주 (sinR* 및 sinR::ermR)를 루리아 브로스 배지에서 하룻밤 성장시켰다. 10 마이크로리터의 예비배양물을 이용하여 165 마이크로리터의 트립틱 소이 브로스(Tryptic Soy Broth) (박토 트립톤(Bacto Tryptone) 17 g/L, 박토 소이톤(Soytone) 3 g/L, 글루코스 2.5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, 인산수소이칼륨 2.5 g/L pH7.3)에 접종하고, 주들을 30℃에서 성장시켜 amyE 아밀라아제의 발현을 테스트하였다. 세포 밀도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정하였다. 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 4a에 나타낸다. 도 4a는 AmyE 발현 모 주의 세포 성장을 나타내며 AmyE 발현 sinR* 및 ΔsinR 주는 동등한데, 이는 비. 서브틸리스 주에서의 sinR 유전자의 돌연변이 또는 결실이 세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸다.

전 브로스의 AmyE 아밀라아제 활성을 세랄파(Ceralpha) 시약 (아일랜드 위크로우 소재의 메가자임(Megazyme))을 이용하여 측정하였다. 세랄파 HR 키트로부터의 세랄파 시약 믹스를 처음에 10 ml의 밀리큐(MilliQ) 물에 용해시키고, 이어서 30 ml의 50 mM 말레이트 완충액 (pH 5.6)을 첨가하였다. 배양 상청액을 밀리큐 물에 40배 희석시키고, 5 μl의 희석 샘플을 55 μL의 희석시킨 표준 기질 용액(diluted working substrate solution)에 첨가하였다. MTP 플레이트를 진탕 후 실온에서 4분 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 70 μl의 200 mM 보레이트 완충액 (pH 10.2) (정지 용액)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 상기 용액의 흡광도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 400 nm에서 측정하였다. 400 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 4b에 나타낸다. 도 4b에서의 그래프는 야생형 (WT) 주와 비교하여 sinR* 및 ΔsinR 주에서의 증가된 AmyE 발현을 나타낸다.

E. sinR 돌연변이 또는 sinR 결실 바실루스 주에서의 내인성 유전자 발현

내인성 유전자 발현에 대한 sinR 돌연변이 또는 sinR 결실의 영향을 테스트하기 위하여, sinR 돌연변이 또는 sinR 결실을 이전에 설명한 바와 같이 모 주 내에 도입하였다. 펙테이트 라이아제 (서열 번호 8) 단백질의 활성을 진탕 플라스크에서 BHI 배지에서 평가하였다. WT 모 주 및 돌연변이 주 (sinR* 및 sinR::ermR)를 LB 배지에서 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 1 밀리리터의 예비배양물을 이용하여 진탕 플라스크 내의 20 ml의 BHI 배지에 접종하였다. 상기 주들을 37℃에서 성장시켜 펙테이트 라이아제 효소의 발현을 테스트하였다. 세포 밀도를 스펙트라맥스 분광광도계 (미국 펜실베이니아주 다우닝턴 소재의 몰레큘러 디바이시즈)를 이용하여 1시간 간격으로 600 nm에서 측정하였다. 600 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 5a에 나타낸다. 도 5a는 모 주 및 sinR* 및 ΔsinR 주의 세포 성장이 동등함을 나타내며, 이는 상기 주에서의 sinR 유전자의 돌연변이 또는 결실이 세포 성장에 영향을 주지 않음을 나타낸다.

펙테이트 라이아제 활성을 폴리갈락튜론산 칼륨 염 (시그마 P0853) 기질을 이용하여 모니터링하였다. 0.6% (w/v) 폴리갈락튜론산 칼륨 염을 트리스 분석용 완충액 (0.1 M 트리스, 1 mM CaCl₂, 1% PEG-8000 (pH 7.73))에 용해시킴으로써 기질 용액을 제조하였다. 100 마이크로리터의 기질 용액을 20 마이크로리터의 샘플 상청액에 첨가하였다. 상기 반응물을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 200 마이크로리터의 정지 용액 (0.05 M 인산)을 샘플에 첨가하고, 용액의 흡광도를 석영 96웰 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 235 nm에서 측정하였다. 235 nm에서의 흡광도를 시간의 함수로서 도시하고, 그 결과를 도 5b에 나타낸다. 도 5b에서의 그래프는 야생형 (WT) 주와 비교하여 sinR* 및 ΔsinR 주에서의 증가된 펙테이트 라이아제 발현을 나타낸다.

전술한 조성물 및 방법을 이해의 명확함을 위하여 예시 및 예로서 약간 상세하게 기술하였지만, 본원에서의 교시를 고려하면 이에 대하여 특정 변화 및 변형이 첨부된 청구범위의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음이 당업자에게 기꺼이 명백하다.

따라서, 전술한 것은 단지 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 예시한다. 당업자라면, 본원에 명백하게 기술되어 있지 않거나 예시되어 있지 않지만 본 발명의 조성물 및 방법의 원리를 구현하는 그리고 그의 사상 및 범주 내에 포함되는 다양한 처리 방식을 고안할 수 있음이 인정된다. 더욱이, 본원에 상술된 모든 실시예 및 조건적 언어는 주로 독자가 본 발명의 조성물 및 방법의 원리와 본 기술 분야의 심화에 본 발명자가 기여하는 개념을 이해하는 것을 돕고자 하는 것이며, 그렇게 구체적으로 상술된 실시예 및 조건을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 게다가, 본 발명의 조성물 및 방법의 원리, 측면 및 실시 양태와, 이의 특정 실시예를 상술하는 본원에서의 모든 진술은 이의 구조적 등가물 및 기능적 등가물 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 그러한 등가물은 현재 공지된 등가물 및 미래에 개발될 등가물, 즉, 구조와는 관계 없이, 동일 기능을 수행하는 개발될 임의의 요소 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법의 범주는 본원에 예시되고 설명된 예시적인 실시 양태에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니다.

서열

서열 번호 1 - sinR 야생형 코딩 서열, 센스 가닥 (종결 코돈을 포함함)

서열 번호 2 - sinR 단백질 서열

서열 번호 3 - sinR 돌연변이체 코딩 서열, 센스 가닥 (볼드체의 밑줄이 그어진 G330A 침묵 돌연변이를 포함함; 종결 코돈을 포함함)

서열 번호 4: sinR 유전자의 증폭을 위한 정방향 프라이머

서열 번호 5: sinR 유전자의 증폭을 위한 역방향 프라이머

서열 번호 6: FNA 단백질 서열 (프로-도메인을 포함함)

서열 번호 7: AmyE 단백질 서열

서열 번호 8: 펙테이트 라이아제 C 단백질 서열

<110> DANISCO US INC. <120> ENHANCED PROTEIN EXPRESSION <130> 40772-WO-PCT <150> 62/092461 <151> 2014-12-16 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 336 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 1 ttgattggcc agcgtattaa acaataccgt aaagaaaaag gctactcact atcagaacta 60 gctgaaaaag ctggggtagc gaagtcttat ttaagctcaa tagaacgaaa tctacaaacg 120 aacccctcca ttcaatttct cgaaaaagtc tccgctgttc tggacgtctc ggttcatact 180 ttgctcgatg agaaacatga aaccgaatac gatggtcaat tagatagtga atgggagaaa 240 ttggttcgcg atgcgatgac atccggggta tcgaaaaaac aatttcgtga atttttagat 300 tatcaaaaat ggagaaaatc ccaaaaagag gagtag 336 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 2 Met Ile Gly Gln Arg Ile Lys Gln Tyr Arg Lys Glu Lys Gly Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Ser Glu Leu Ala Glu Lys Ala Gly Val Ala Lys Ser Tyr Leu Ser 20 25 30 Ser Ile Glu Arg Asn Leu Gln Thr Asn Pro Ser Ile Gln Phe Leu Glu 35 40 45 Lys Val Ser Ala Val Leu Asp Val Ser Val His Thr Leu Leu Asp Glu 50 55 60 Lys His Glu Thr Glu 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Bacillus sp. <400> 6 Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu 1 5 10 15 His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp 20 25 30 Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala 130 135 140 Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala 165 170 175 Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr 195 200 205 Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn 225 230 235 240 Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys 245 250 255 Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala 260 265 270 Ala Ala Gln 275 <210> 7 <211> 425 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 7 Leu Thr Ala Pro Ser Ile Lys Ser Gly Thr Ile Leu His Ala Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ser Phe Asn Thr Leu Lys His Asn Met Lys Asp Ile His Asp Ala 20 25 30 Gly Tyr Thr Ala Ile Gln Thr Ser Pro Ile Asn Gln Val Lys Glu Gly 35 40 45 Asn Gln Gly Asp Lys Ser Met Ser Asn Trp Tyr Trp Leu Tyr Gln Pro 50 55 60 Thr Ser Tyr Gln Ile Gly Asn Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe 65 70 75 80 Lys Glu Met Cys Ala Ala Ala Glu Glu Tyr Gly Ile Lys Val Ile Val 85 90 95 Asp Ala Val Ile Asn His Thr Thr Ser Asp Tyr Ala Ala Ile Ser Asn 100 105 110 Glu Val Lys Ser Ile Pro Asn Trp Thr His Gly Asn Thr Gln Ile Lys 115 120 125 Asn Trp 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Asn Arg Phe His Asn Val Met Ala Gly Gln Pro Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Asn Pro Asn Gly Asn Asn Gln Ile Phe Met Asn Gln Arg Gly Ser 355 360 365 His Gly Val Val Leu Ala Asn Ala Gly Ser Ser Ser Val Ser Ile Asn 370 375 380 Thr Ala Thr Lys Leu Pro Asp Gly Arg Tyr Asp Asn Lys Ala Gly Ala 385 390 395 400 Gly Ser Phe Gln Val Asn Asp Gly Lys Leu Thr Gly Thr Ile Asn Ala 405 410 415 Arg Ser Val Ala Val Leu Tyr Pro Asp 420 425 <210> 8 <211> 221 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bacillus sp. <400> 8 Met Lys Lys Ile Val Ser Ile Leu Phe Met Phe Gly Leu Val Met Gly 1 5 10 15 Phe Ser Gln Phe Gln Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Asp Lys Val Val 20 25 30 His Glu Thr Ile Ile Val Pro Lys Asn Thr Thr Tyr Asp Gly Lys Gly 35 40 45 Gln Arg Phe Val Ala Gly Lys Glu Leu Gly Asp Gly Ser Gln Ser Glu 50 55 60 Asn Gln Asp Pro Val Phe Arg Val Glu Asp Gly Ala Thr Leu Lys Asn 65 70 75 80 Val Val Leu Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly Val His Thr Tyr Gly Asn 85 90 95 Val Asn Ile Gln Asn Val Lys Trp Glu Asp Val Gly Glu Asp Ala Leu 100 105 110 Thr Val Lys Lys Glu Gly Lys Val Thr Ile Asp Gly Gly Ser Ala Gln 115 120 125 Lys Ala Ser Asp Lys Ile Phe Gln Ile Asn Lys Ala Ser Thr Phe Thr 130 135 140 Val Lys Asn Phe Thr Ala Asp Asn Gly Gly Lys Phe Ile Arg Gln Leu 145 150 155 160 Gly Gly Ser Thr Phe His Val Asp Val Ile Ile Asp Lys Cys Thr Ile 165 170 175 Thr Asn Met Lys Glu Ala Ile Phe Arg Thr Asp Ser Lys Thr Ser Thr 180 185 190 Val Arg Met Thr Asn Thr Arg Tyr Ser Asn Val Gly Gln Lys Trp Ile 195 200 205 Gly Val Gln His Ile Tyr Glu Asn Asn Asn Thr Gln Phe 210 215 220

Claims (4)

1. 서열 번호 1 의 330 번 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드 위치에서 sinR 유전자 내 G 에서 A 로의 침묵 돌연변이을 포함하는, 서열 번호 1 의 서열에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 야생형 sinR 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 변이체.
2. 제1항의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
3. 제2항에 있어서, 상동 재조합에 의해 내인성 염색체 sinR 유전자를 대체하는 표적화 벡터인 벡터.
4. 그람 양성 박테리아 세포에서 관심 대상의 단백질(POI)의 발현을 증가시키는 방법으로서,
   (a) 모(parental) 그람 양성 박테리아 세포를 제3항의 벡터로 형질전환시키는 단계 (여기서, 상기 벡터와 모 sinR 유전자의 상응하는 영역 사이의 상동 재조합은 변경된 그람 양성 박테리아 세포를 생성함), 및
   (b) 변경된 세포를 POI의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계 (여기서, POI의 증가된 발현은 비변경된 그람 양성 박테리아 대조 세포에서의 동일한 POI의 발현과 비교한 것임)를 포함하는 방법.

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