CN101871013B - 检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒，特别是涉及以荧光定量聚合酶链反应技术检测临床样品中水痘-带状疱疹病毒的试剂盒。由于本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，因此通过本发明的试剂盒检测和定量分析水痘-带状疱疹病毒的多核苷酸，对早期感染病例的确认以及爆发疫情的应急诊断和监控具有重要意义。

Description

检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒，特别是涉及以荧光定量聚合酶链反应技术检测临床样品中水痘-带状疱疹病毒的试剂盒。 

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(VZV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科人类疱疹病毒3型。人是其唯一的自然宿主，并且对其普遍易感。同一种病毒可引起两种不同的病症，在儿童初次感染引起水痘，而潜伏体内的病毒受到某些刺激后复发引起起带状疱疹，多见于成年人和老年人。 

水痘是由VZV经呼吸道、口、咽、结膜、皮肤等处侵入人体。病毒先在局部淋巴结增殖，进入血液后散布到各个内脏继续大量增殖。经2～3周潜伏期后，全身皮肤广泛发生丘疹，水疱疹和脓疱疹，皮疹分布主要是向心性，以躯干较多。皮疹内含大量病毒，感染的棘细胞(Prickle cell)内生成嗜酸性核内包涵体和多核巨细胞。皮疹消失后不遗留疤痕，病情一般较轻，但偶有并发间质性肺炎和感染后脑炎(0.1％)。细胞免疫缺陷、白血病、肾脏病或使用皮质激素、抗代谢药物的儿童，病情较严重。 

带状疱疹是因是潜伏在体内的VZV复发感染。由于儿童时期患过水痘愈合，病毒潜伏在脊髓后根神经节或脑感染神经节中，当机体受到某些刺激，如发热、受冷、机械压迫，使用免疫抑制剂、X光照射，白血病及肿瘤等细胞免疫功能损害或低下时，导致潜伏病毒激活，病毒沿感觉神经轴索下行到达该神经所支配的皮肤细胞内增殖，在皮肤上沿着感觉神经的通路发生串联的水疱疹，形似带状，故名。多发生于腰腹和面部。1～4周内局部痛觉非常敏感，有剧痛。 

患水痘后机体产生特异性体液免疫和细胞免疫，终身不再感染。但对长期潜伏于神经节中病毒不能被清除，故不能阻止病毒激活而发生带状疱疹。 

水痘的传染性很强，可因直接碰触(如：水疱)或过于接近其它水痘患者(透过空气)而感染，也可能因接触染有水疱脓液的衣服而被传染；因此，住在一起的人特别容易互相传染，通常在皮疹出现前1、2天至皮疹出现后5、6天之间，是传染性最强的时期。水痘散布于全世界。根据我国的水痘流行病学调查结果，各地区人群均受到普遍感染，抗体平均阳性率为70％，且随着年龄增长，抗体流行率迅速上升。近年来，无论儿童还是成人，水痘发病均有上升趋势。 

目前的VZV检测方法为：刮取疱疹基底部细胞涂片染色检查嗜酸性核内包涵体和多核巨细胞，或用膜抗原单克隆抗体进行免疫荧光或免疫酶染色检查细胞内抗原。但这些方法存在时间长、灵敏度低等缺陷。 

因此，非常有必要开发一种快速准确的检测方法来进行水痘-带状疱疹临床早期感染病例的确认以及爆发疫情的应急诊断和监控。而使用实时荧光定量PCR检测VZV则很好地满足了上述要求。 

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。 

实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct)的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR将DNA扩增与检测过程融合为一体，动态检测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。 

TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology..Nucleic Acids Res.20025；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitativePCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion in Biotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。 

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些检测病原体的定量PCR诊断试剂盒，如用于HIV-1、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV-1和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。因此，开发一种能够检测VZV的实时荧光PCR试剂盒，对相关水痘、疱疹的诊 断，治疗检测以及爆发疫情的应急诊断和监控具有重要意义。 

众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，开发相应的试剂盒应用于VZV多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。 

发明内容

本发明的目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中水痘-带状疱疹病毒的试剂盒。 

为了实现本发明，我们采用了以下技术方案： 

1)使用适当的核酸分析软件对已知的VZV核苷酸序列进行同源性比较，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer Express 2)选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于VZV的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了VZV检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。 

2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。 

3)从来自受试者的血清或者疱疹液中提取DNA，然后用于继后的PCR扩增。 

4)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(c)2-脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的扩增反应体系，以及包括(d)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(e)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，以及(f)能够与双链靶多核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针的荧光检测体系。通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；退火后使所说的荧光发生基团通过探针与靶多核苷酸结合并产生荧光信号；检测并确定荧光发生基团所产生的荧光量；分析一次或多次扩增循环所发出的荧光量，以检测靶多核苷酸的存在。 

基于以上技术方案发明的试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性对照样品、阳性定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试 剂瓶或管的包装盒。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液包括能够与VZV双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，特征在于所使用的引物序列分别为：5’-CCGTTTTGCATTGGATTCGTA-3’(SEQ ID NO：1)、5′-TTTTCAAGAAGCGCCTTTGC-3′(SEQ ID NO：2)，寡核苷酸探针序列为：5’-TCACGTCCGCCGCGGACA-3’(SEQ ID NO：3)。其中SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3匹配在一起可以检测VZV。 

根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为：5’-ACGACCGGCGCTGAGATA-3’(SEQ ID NO：4)、5′-CAATGCCGTGACCACCAA-3′(SEQ IDNO：5)，寡核苷酸探针序列为：5’-CACCCGCCTTGGATTAGAGCCAGAAAA-3’(SEQ ID NO：6)。其中SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6匹配在一起可以检测VZV。 

根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为：5’-GGGTCAACTGTCCCTGGTCTT-3’(SEQ ID NO：7)、5’-GTTCCCATGTTTTATGGGAATACC-3’(SEQ ID NO：8)，寡核苷酸探针序列为：5’-AACGACCCCCCGAAGATGACGAACT-3’(SEQ ID NO：9)。SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9匹配在一起可以检测VZV。 

根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为：5’-TAGTCAGGCCATGAGTCATCGT-3’(SEQ ID NO：10)，5’-GGCAAGTCGCCAATTAACGT-3’(SEQ ID NO：11)，寡核苷酸探针序列为：5’-CGACATGCAGTCAATTTCAACGTCGC-3’(SEQID NO：12)。SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12匹配在一起可以检测VZV。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液，特征在于每人份的PCR缓冲液中加入1单位Taq酶，缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM KCl、5mM MgCl₂。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中阴性对照样品为去离子水，阳性定量参考品为携带有VZV核酸序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，阳性定量参考品浓度分别为1×10⁷拷贝/ml、1×10⁶拷贝/ml、1×10⁵拷贝/ml、1×10⁴拷贝/ml。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中DNA提取液可以为常规自配的DNA提取试剂或市售的DNA提取试剂盒。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品可选自但不局限于水痘、带状疱疹患者的临床样品。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的靶多核苷酸来自VZV的核酸序列。 

根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。 

特别值得说明的是，为了确保本发明的VZV检测方法的准确性，我们还使用携带有VZV核酸序列的重组质粒作为DNA阳性定量参考品。借助这些额外标准品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量控制标准。 

与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR试剂盒不同，实时定量聚合酶链反应试剂盒可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增体系中，同时加入引物和5’、3’末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAM amidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多核苷酸(模板)进行定量分析。 

利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以靶多核苷酸起始拷贝数的对数为横坐标，并以测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，基于上述的扩增反应结果推算出靶多核苷酸的量(起始拷贝数)。具体实现包括：(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多核苷酸的量。 

附图说明

图1显示VZV核酸的实时荧光PCR线性梯度实验结果。针对浓度为1×10³拷贝/ml～1×10⁹拷贝/ml的重组质粒进行实时荧光PCR检测分析，检测结果显示荧光扩增曲线有明显指数增长期，均可明确判为阳性。 

图2显示VZV核酸的实时荧光PCR灵敏度实验结果。针对浓度为1×10³拷贝/ml的重组质粒进行10次重复检测，检测结果显示荧光扩增曲线有明显指数增长期，均可明确判为阳性。 

图3显示VZV的阳性定量参考品的标准曲线。针对浓度为1.0×10⁴～1.0×10⁷拷贝/ml的阳性定量参考品进行实时荧光PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.40，在Y轴截距(Intercept)为33.31，相关系数的平方(R²)＝0.9994。 

图4显示VZV核酸的实时荧光PCR特异性实验结果。针对8例包括单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型患者样品进行实时荧光PCR检测分析，检测结果显示荧光扩增曲线无明显指数增长，均可明确判为阴性。 

图5显示3份水痘-带状疱疹患者的样本的检测结果。3个标本的Ct值分别是12.11、14.23、20.21，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。 

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 

实施例1：VZV检测试剂盒及其使用 

(1)制备包括下列组成成分的试剂盒：DNA提取液(10ml/管)1管、PCR反应液(470μl/管)1管、Taq酶(10μl/管)1管、阳性定量参考品(50μl/管)4管、阴性对照样品(50μl/管)1管。 

(2)标本采集、运送和保存：无菌操作取患者血清或者疱疹液，上述标本在2～8℃条件下保存应不超过72小时；-20℃可保存1个月；要长期保存的，需分装后储存于-70℃。如集中检验，标本需在0℃以下环境中运送并于24小时内送达实验室。 

(3)检测步骤和结果分析： 

一、DNA提取 

1.取50μl血清或疱疹液，加入等量的DNA提取液，充分混匀。 

2.100℃加热10分钟。 

3.12000rpm离心10分钟 

4.取上清至另一灭菌干净离心管备用。 

二、PCR扩增 

ABI Prism 7300操作(PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、DA7600、Line Gene、iCycler等市售的荧光定量PCR仪可参照此操作，具体仪器操作见各仪器的使用说明书) 

1.试剂准备：按比例(PCR反应液47μl/人份+Taq酶1μl/人份)取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按48μl/管分装至0.2ml离心管中，备用。 

2.加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，加入DNA样品(包括标本、阴性对照样品、阳性定量参考品)上清液2μl，8,000rpm瞬时离心，放入仪器样品槽。 

3.编辑 

3.1按对应顺序设置阴性对照样品、阳性定量参考品以及未知标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，选择探针模式设置，Reporter Dye:FAM，QuencherDye:TAMRA，Passive Reference:NONE，Data Collection:55℃ 45 second。(注意：使用ABI Prism 7000时探针模式设置，Reporter Dye:FAM，Quencher Dye:TAMRA，PassiveReference：NONE) 

3.2打开instrument窗口设置循环条件： 

93℃ 2分钟， 

93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环， 

93℃ 30秒→55℃ 45秒→30个循环。 

保存文件，运行。 

4.结果分析 

4.1反应结束后保存检测数据文件。 

4.2分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(用户可根据实际情况自行调整，start值可以在1～10、stop值可以在5～20、Value值可以在0.01～0.2范围选择)，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-0.97～-1.0(参见附图3所示)。在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。 

4.3到Tray窗口，记录未知标本数值(C)。“C”表示样品的浓度或含量。 

4.4ABI Prism 7300(PE GeneAmp 5700、ABI Prism 7000、DA7600、Line Gene、iCycler等参照此方法判定结果) 

1)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值＝30，则判样品的VZV的DNA总含量小于检测极限。 

2)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值＜30，则按以下方法判断： 

若样品的C＜1.00E+003，则判样品VZV的DNA总含量＜1.0×10³拷贝/ml； 

若样品的1.00E+003≤C≤1.00E+008，则判样品VZV的DNA总含量＝C拷贝/ml； 

若样品的C＞1.00E+008，则样品VZV的DNA总含量＞1.0×10⁸拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。 

实施例2：VZV检测试剂盒的灵敏度和特异性实验 

1)灵敏度实验：将浓度为1×10¹⁰拷贝/ml的携带有VZV核酸序列的重组质粒，10倍梯度稀释成1×10⁹拷贝/ml、1×10⁸拷贝/ml、1×10⁷拷贝/ml、1×10⁶拷贝/ml、1×10⁵拷贝/ml、1×10⁴拷贝/ml、1×10³拷贝/ml作为待检样本，使用本试剂盒进行检测，结果如附图1所示。对浓度为1×10³拷贝/ml的样本进行10次重复检测，结果均为阳性，如附图2所示。检测结果表明，本试剂盒的灵敏度可以达到1×10³拷贝/ml。 

2)特异性实验：选取8例包括单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型患者样品作为待检样本，使用本试剂盒进行检测，结果如附图4所示。检测结果表明，本试剂盒对非水痘-带状疱疹患者的样本检测均为阴性，试剂盒的特异性很好。 

实施例3：应用VZV检测试剂盒定量检测临床样品 

选取3份水痘-带状疱疹患者的样本作为待检样本，并以阳性定量参考品作为定量标准，使用本试剂盒进行检测，PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)，然后分析临床样品。临床样品的检测结果如附图5所示：3个临床标本扩增曲线的Ct值分别是12.11、14.23、20.21，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性；参照同一次试验中阳性定量参考品的标准曲线(如附图3所示)可以判定3个临床阳性标本的浓度分别为：5.21×10⁶拷贝/ml、8.12×10⁵拷贝/ml、1.05×10⁴拷贝/ml。 

序列表 

<110>中山大学达安基因股份有限公司 

<120>检测水痘-带状疱疹病毒的试剂盒 

<140> 

<141> 

<160>12 

<210>1 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>1 

ccgttttgcattggattcgta 

<210>2 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>2 

ttttcaagaagcgcctttgc 

<210>3 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 

<400>3 

tcacgtccgccgcggaca 

<210>4 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>4 

acgaccggcgctgagata 

<210>5 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>5 

caatgccgtgaccaccaa 

<210>6 

<211>27 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 

<400>6 

cacccgccttggattagagccagaaaa 

<210>7 

<211>21 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>7 

gggtcaactgtccctggtctt 

<210>8 

<211>24 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>8 

gttcccatgttttatgggaatacc 

<210>9 

<211>25 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 

<400>9 

aacgaccccccgaagatgacgaact 

<210>10 

<211>22 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>10 

tagtcaggccatgagtcatcgt 

<210>11 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 

<400>11 

ggcaagtcgccaattaacgt 

<210>12 

<211>26 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 

<400>12 

cgacatgcagtcaatttcaacgtcgc 

Claims (4)

1.一种检测样品中水痘-带状疱疹病毒的试剂盒，包括(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性对照样品、阳性定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，PCR扩增反应液包括正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，其特征在于所使用的正向引物序列为：

5’-CCGTTTTGCATTGGATTCGTA-3’(SEQ ID NO：1)；

反向引物序列为：

5′-TTTTCAAGAAGCGCCTTTGC-3′(SEQ ID NO：2)；

寡核苷酸探针序列为：

5’-TCACGTCCGCCGCGGACA-3’(SEQ ID NO：3)。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR缓冲液包含10mM pH为8.0的Tris-HCl、150mM KCl、5mM MgCl₂，每微升的PCR缓冲液中加入1单位Taq酶。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阳性定量参考品为携带有VZV核酸序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。

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