CN102952902B - 对虾白斑综合症病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成：试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水制成；试剂B：蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；试剂C：乙醇水溶液；试剂D：用含MgCl₂的PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、灭菌双蒸水混合制成；试剂E：引物P1，引物P2，脱氧核糖核苷酸混合制成；试剂F:荧光探针预混溶液；试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒；灭菌双蒸水；DNA吸附柱。本发明的试剂盒检测灵敏度高，可用于养殖对虾白斑综合症病毒早期感染及跟踪监测，还能用于与该病毒增殖相关的基础科学研究。

Description

对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种对虾白斑综合症病毒的检测试剂盒及检测方法。

背景技术

自上世纪九十年代以来，对虾白斑综合症病毒引起世界范围内养殖对虾的急性、致死性传染病，造成对虾养殖业的巨大经济损失。对虾白斑综合症病毒是一种具有囊膜的双链DNA病毒。除了对虾，该病毒也侵染海、淡水中的甲壳动物如蟹和小龙虾等。目前，该病毒引发的对虾疾病已经成为一个世界性的流行性疾病，它不仅是对虾养殖业的一个巨大的威胁，同时也危害到了整个海洋生态环境。对于甲壳动物病毒性疾病，目前还没有有效的治疗方法，病毒的早期检测和诊断仍是最重要的防治手段。因此，建立快速灵敏实用的对虾白斑综合症病毒检测技术，不仅能及时预报预测该病毒所致病害的发生，同时也是今后加强科学养殖管理，建立苗种检验检疫体系所必须的。

对虾病毒病检测技术主要包括现场目视观察法、光学显微镜检查法、电子显微镜检查法、免疫荧光检查法等。但这些技术各有其局限性。现场目视观察和光学显微镜检查法不太适用于早期检测，通常在病毒严重感染，产生明显的不可逆转的组织病变时才可得到确证；电子显微镜检查耗时长，费用高并需要特殊的实验器材；免疫荧光检测法操作繁琐，灵敏度低。PCR技术检测灵敏度高，特异性强，检测周期短，操作相对简便，目前已广泛应用于对虾白斑综合症病毒的检测。但是这些方法仅是用于病毒的定性检测，不能定量。

由于目前还没有对对虾病毒敏感的细胞系，因此定量检测对虾病毒一直比较困难。最近发展的实时荧光定量PCR技术提供了病毒定量检测的新途径。该技术巧妙地利用了PCR技术的高效扩增，探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及定量分析的优点，克服了常规PCR不能定量检测等一些不足，极大地提高了检测的敏感性和特异性。Dhar报道了利用SYBR Green定量检测对虾白斑综合症病毒。由于该染料能与所有的DNA双链相结合，对模板没有选择性，所以特异性差，定量相对不准确。王忠发等初步建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测对虾白斑综合症病毒，但是没有制备标准曲线，因此尚未达到真正的定量检测。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的第二个目的是提供一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有1.5-3g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为1.3-1.5M，乙二胺四乙酸的浓度为15-25mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为15-25mM,调节pH＝7.5制成试剂A；

试剂B：浓度为20-30mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；

试剂C：体积百分浓度为70-80%的乙醇水溶液；

试剂D：按比例用10倍含MgCl₂的PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、灭菌双蒸水17.7μl混合制成；

试剂E：按比例用0.5μL，10μM的用SEQ ID NO.1所示的引物P1，0.5μl，10μM的用SEQID NO.2所示的引物P2，1.5μl，10mM脱氧核糖核苷酸混合制成；

试剂F:1.0μl，10μM的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’-TET-SEQID NO.3-TAMRA-3’表示；

试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒；

灭菌双蒸水；

DNA吸附柱。

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一：模板的制备：

（1）取待测对虾的鳃丝组织20-50mg，加入500-700μl试剂A，用剪刀充分剪碎；

（2）加入15-25μl试剂B,55℃水浴2-8小时；

（3）转入到一个DNA吸附柱中,12000rpm 1min；

（4）向吸附柱中加入500-700μl试剂C，12000rpm 1min；

（5）再向吸附柱中加入500-700μl试剂C，12000rpm 1min；

（6）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附柱中加入50μl灭菌双蒸水，12000rpm 2min，收集DNA溶液为待测模板；

步骤二：荧光PCR扩增：

（7）将试剂D 20.5μl,试剂E 2.5μl,试剂F 1.0μl混合，加入1μl待测模板；

（8）再将试剂D 164μl,试剂E 20μl,试剂F 8.0μl混合，平均分为8份；

（9）将试剂G用灭菌双蒸水做8个十倍系列梯度稀释，分别加入到步骤（8）获得的每个混合液中，每个稀释度分别取1μl作为阳性质控模板；

（10）在荧光定量PCR仪上扩增；反应条件为95℃预处理30s，95℃5s，60℃30s，40个循环，60℃时测定荧光值；

步骤三：数据处理

（11）用试剂G不同稀释度获得的Ct值与相应的拷贝数的对数做标准曲线，获得用x代表的Ct值，与用y代表的病毒拷贝数对数的二元一次方程，根据此二元一次方程计算出待测样品的病毒拷贝数。

所述对虾为南美白对虾，中国对虾，斑节对虾或日本对虾。

优选的是，对虾白斑综合症病毒阳性质粒是用下述方法制成的：PCR扩增对虾白斑综合症病毒的一段保守区序列，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中重新培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，分光光度计测定质粒浓度，计算出质粒的拷贝数，作为试剂盒的阳性质控。

本发明的优点：

利用对虾白斑综合症病毒的基因组保守区序列设计一对引物及荧光探针，优化荧光定量PCR反应条件和反应体系，建立起对虾白斑综合症病毒的荧光定量PCR检测方法，在此基础上装配出简便、灵敏、特异的对虾白斑综合症病毒荧光定量检测试剂盒，该试剂盒检测灵敏度高，可用于对养殖南美白对虾、中国对虾、斑节对虾等的对虾白斑综合症病毒早期感染及跟踪监测，还能用于与该病毒增殖相关的基础科学研究。具有很高的科学及实用价值。

附图说明

图1荧光定量PCR标准曲线。

图2对虾白斑综合症病毒不同浓度标准品的荧光PCR扩增动力学曲线（1-7：6.2×10⁷～6.2×10¹拷贝）

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有2g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为1.4M，乙二胺四乙酸的浓度为20mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为20mM,调节pH＝7.5制成试剂A；

试剂B：浓度为25mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；

试剂C：体积百分浓度为75%的乙醇水溶液；

试剂D：按比例用10倍含MgCl₂的PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、灭菌双蒸水17.7μl混合制成；

试剂E：按比例用0.5μL，10μM的用SEQ ID NO.1所示的引物P1，0.5μl，10μM的用SEQID NO.2所示的引物P2，1.5μl，10mM脱氧核糖核苷酸混合制成；

试剂F:1.0μl，10μM的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’-TET-SEQID NO.3-TAMRA-3’表示；

试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒（实施例4制备）；

灭菌双蒸水；

DNA吸附柱。

实施例2

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有1.5g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为1.3M，乙二胺四乙酸的浓度为15mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为15mM,调节pH＝7.5制成试剂A；

试剂B：浓度为20mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；

试剂C：体积百分浓度为70%的乙醇水溶液；

试剂D：按比例用10倍含MgCl₂的PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、灭菌双蒸水17.7μl混合制成；

试剂E：按比例用0.5μL，10μM的用SEQ ID NO.1所示的引物P1，0.5μl，10μM的用SEQID NO.2所示的引物P2，1.5μl，10mM脱氧核糖核苷酸混合制成；

试剂F:1.0μl，10μM的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’-TET-SEQID NO.3-TAMRA-3’表示；

试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒（实施例4制备）；

灭菌双蒸水；

DNA吸附柱。

实施例3

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，由下述试剂组成：

试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有3g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为1.5M，乙二胺四乙酸的浓度为25mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为25mM,调节pH＝7.5制成试剂A；

试剂B：浓度为30mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；

试剂C：体积百分浓度为80%的乙醇水溶液；

试剂D：按比例用10倍含MgCl₂的PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、灭菌双蒸水17.7μl混合制成；

试剂E：按比例用0.5μL，10μM的用SEQ ID NO.1所示的引物P1，0.5μl，10μM的用SEQID NO.2所示的引物P2，1.5μl，10mM脱氧核糖核苷酸混合制成；

试剂F:1.0μl，10μM的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’-TET-SEQID NO.3-TAMRA-3’表示；

试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒（实施例4制备）；

灭菌双蒸水；

DNA吸附柱。

实施例4

对虾白斑综合症病毒阳性质粒可以采用公知的方法制备，本发明实施例1-实施例3对虾白斑综合症病毒阳性质粒是用下述方法制成：PCR扩增对虾（中国对虾）白斑综合症病毒的一段保守区序列，琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接到pMD-18T载体上并转化到TOP10细胞中，测序鉴定阳性克隆子，把测序正确的阳性克隆子在LB培养基中重新培养，用质粒提取试剂盒提取质粒，分光光度计测定质粒浓度，计算出质粒的拷贝数，作为试剂盒的阳性质控。

实验证明，使用不同的PCR扩增片段，载体和转化用细胞，都可以制备出对虾白斑综合症病毒阳性质粒。实施例4制备的阳性质粒是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，用其它的方法制备的对虾白斑综合症病毒阳性质粒也可以用于本发明。

实施例5

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一：模板的制备：

（1）取待测中国对虾的鳃丝组织35mg，加入600μl试剂A，用剪刀充分剪碎；

（2）加入20μl试剂B,55℃水浴6小时；

（3）转入到一个DNA吸附柱中,12000rpm 1min；

（4）向吸附柱中加入600μl试剂C，12000rpm 1min；

（5）再向吸附柱中加入600μl试剂C，12000rpm 1min；

（6）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附柱中加入50μl灭菌双蒸水，12000rpm 2min，收集DNA溶液为待测模板；

步骤二：荧光PCR扩增：

（7）将试剂D 20.5μl,试剂E 2.5μl,试剂F 1.0μl混合，加入1μl待测模板；

（8）再将试剂D 164μl,试剂E 20μl,试剂F 8.0μl混合，平均分为8份；

（9）将试剂G用灭菌双蒸水做8个十倍系列梯度稀释，分别加入到步骤（8）获得的每个混合液中，每个稀释度分别取1μl作为阳性质控模板；

（10）在荧光定量PCR仪上扩增；反应条件为95℃预处理30s，95℃5s，60℃30s，40个循环，60℃时测定荧光值；

步骤三：数据处理

（11）用试剂G不同稀释度获得的Ct值与相应的拷贝数的对数做标准曲线，获得用y代表的Ct值，与用x代表的病毒拷贝数对数的二元一次方程，根据此二元一次方程计算出待测样品的病毒拷贝数。

（12）检测结果：样品获得的Ct值为19.64，获得的二元一次方程为y＝-3.1695x+41.913，如图1。将Ct（y）值代入方程，获得样品病毒拷贝数对数（y）为7.03，所以所测样品的病毒拷贝数为10^7.03拷贝。

实施例6

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一：模板的制备：

（1）取待测南美白对虾的鳃丝组织20mg，加入500μl试剂A，用剪刀充分剪碎；

（2）加入15μl试剂B,55℃水浴2小时；

（3）转入到一个DNA吸附柱中,12000rpm 1min；

（4）向吸附柱中加入500μl试剂C，12000rpm 1min；

（5）再向吸附柱中加入500μl试剂C，12000rpm 1min；

（6）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附柱中加入50μl灭菌双蒸水，12000rpm 2min，收集DNA溶液为待测模板；

步骤二：荧光PCR扩增：

（7）将试剂D 20.5μl,试剂E 2.5μl,试剂F 1.0μl混合，加入1μl待测模板；

（8）再将试剂D 164μl,试剂E 20μl,试剂F 8.0μl混合，平均分为8份；

（9）将试剂G用灭菌双蒸水做8个十倍系列梯度稀释，分别加入到步骤（8）获得的每个混合液中，每个稀释度分别取1μl作为阳性质控模板；

（10）在荧光定量PCR仪上扩增；反应条件为95℃预处理30s，95℃5s，60℃30s，40个循环，60℃时测定荧光值；

步骤三：数据处理

（11）用试剂G不同稀释度获得的Ct值与相应的拷贝数的对数做标准曲线，获得用x代表的Ct值，与用y代表的病毒拷贝数对数的二元一次方程，根据此二元一次方程计算出待测样品的病毒拷贝数。

（12）检测结果：样品获得的Ct值为26.5，获得的二元一次方程为y＝-3.1695x+41.913，如图1。将Ct（y）值代入方程，获得样品病毒拷贝数对数（y）为4.86，所以所测样品的病毒拷贝数为10^4.86拷贝。

实施例7

一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一：模板的制备：

（1）取待测斑节对虾的鳃丝组织50mg，加入700μl试剂A，用剪刀充分剪碎；

（2）加入25μl试剂B,55℃水浴8小时；

（3）转入到一个DNA吸附柱中,12000rpm 1min；

（4）向吸附柱中加入700μl试剂C，12000rpm 1min；

（5）再向吸附柱中加入700μl试剂C，12000rpm 1min；

（6）将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附柱中加入50μl灭菌双蒸水，12000rpm 2min，收集DNA溶液为待测模板；

步骤二：荧光PCR扩增：

（7）将试剂D 20.5μl,试剂E 2.5μl,试剂F 1.0μl混合，加入1μl待测模板；

（8）再将试剂D 164μl,试剂E 20μl,试剂F 8.0μl混合，平均分为8份；

（9）将试剂G用灭菌双蒸水做8个十倍系列梯度稀释，分别加入到步骤（8）获得的每个混合液中，每个稀释度分别取1μl作为阳性质控模板；

（10）在荧光定量PCR仪上扩增；反应条件为95℃预处理30s，95℃5s，60℃30s，40个循环，60℃时测定荧光值；

步骤三：数据处理

（11）用试剂G不同稀释度获得的Ct值与相应的拷贝数的对数做标准曲线，获得用x代表的Ct值，与用y代表的病毒拷贝数对数的二元一次方程，根据此二元一次方程计算出待测样品的病毒拷贝数。

用日本对虾替代本发明的斑节对虾，可以对其进行实时荧光定量PCR检测。

（12）检测结果：样品获得的Ct值为32.83，获得的二元一次方程为y＝-3.1695x+41.913，如图1。将Ct（y）值代入方程，获得样品病毒拷贝数对数（y）为2.87，所以所测样品的病毒拷贝数为10^2.87拷贝。

本发明通过在对虾白斑综合症病毒的基因组保守区设计引物和探针，建立了快速简便的对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法，并通过组分优化组装了检测试剂盒。

本发明在前人工作的基础上，在对虾白斑综合症病毒的保守区设计合成了一对特异性引物，并根据引物扩增部分的核苷酸序列设计了一条荧光探针，序列如下：

P1:5’-CTGACGACCTCTTCAAAT-3’

P2:5’-TTCGCTATCTTCATAATC-3’

5’-TET-TAATAATAATGGAGGAGTAGAATCAAT-TAMRA-3’

通过优化扩增条件和反应体系，扩增出一条约65bp（ctgacgacctcttcaaatctaataataatggaggagtagaatcaatggattatgaagatagcgaa）的片段（用SEQ ID NO.4所示），与预期相符。将含扩增靶序列的阳性质粒按6.2×10⁸，6.2×10⁷，6.2×10⁶，6.2×10⁵，6.2×10⁴，6.2×10³，6.2×10²，6.2×10¹，6.2×10⁰拷贝数/μl梯度系列稀释，各取1μl做模板，在BioRad iQ5PCR仪上进行扩增反应，结果显示每个稀释梯度的荧光信号达到阈值所需的循环数（Ct值）和起始模板拷贝数的对数存在明显的线性关系（R²＝0.998）,检测的最小模板浓度为6.2×10¹拷贝数/μl,相当于62个病毒粒子。以正常南美白对虾鳃丝组织DNA，鲤春病毒(SVC)cDNA，诺达病毒（MrNV）cDNA作为阴性对照，进行PCR扩增以测试该方法检测的特异性，结果仅在对虾白斑综合症病毒感染的南美白对虾鳃丝组织中有扩增产物，其余的模板均无阳性扩增，证明该方法具有很好的扩增特异性。

本申请得到国家重点基础研究发展计划项目（2012CB114405）和国家高技术研究发展计划项目（2012AA10A401,2012AA092205）的资助。

Claims (1)

1.一种对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征是由下述试剂组成：

试剂A：将十六烷基三甲基溴化铵、NaCl、乙二胺四乙酸和羟基甲基氨基甲烷-盐酸加水100ml，使试剂A中含有1.5-3g的十六烷基三甲基溴化铵，NaCl的浓度为1.3-1.5M，乙二胺四乙酸的浓度为15-25mM，羟基甲基氨基甲烷-盐酸的浓度为15-25mM,调节pH=7.5制成试剂A；

试剂B：浓度为20-30mg/ml的蛋白酶K，溶剂是灭菌双蒸水；

试剂C：体积百分浓度为70-80%的乙醇水溶液；

试剂D：按比例用10倍含MgCl₂的PCR反应缓冲液2.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、灭菌双蒸水17.7μl混合制成；

试剂E：按比例用0.5μL，10μM的用SEQ ID NO.1所示的引物P1，0.5μl，10μM的用SEQID NO.2所示的引物P2，1.5μl，10mM脱氧核糖核苷酸混合制成；

试剂F:1.0μl，10μM的荧光探针预混溶液，溶剂是灭菌双蒸水；所述荧光探针用5’-TET-SEQID NO.3-TAMRA-3’表示；

试剂G：对虾白斑综合症病毒阳性质粒；

灭菌双蒸水；

DNA吸附柱。

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