CN101372714A

CN101372714A - 对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN101372714A
Application number: CNA2008101399494A
Authority: CN
Inventors: 黄倢; 张庆利; 宋晓玲; 杨冰; 刘莉
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2008-09-07
Filing date: 2008-09-07
Publication date: 2009-02-25
Anticipated expiration: 2028-09-07
Also published as: CN101372714B

Abstract

本发明涉及一种对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂盒及检测方法。是根据白斑综合症病毒基因保守区序列设计的一套LAMP引物为主体设计的。试剂盒汇集了WSSV检测所需的SEMP研磨液、核酸抽提液、UNG酶、TE缓冲液、酶解缓冲液和LAMP反应液等十一种试剂，实现了检测的程序化和标准化，因此本发明灵敏性极高，检出病毒的拷贝可低至26个，而且简便快速，安全，特异性好成本低，利用该试剂盒和检测方法仅需一个水浴锅即可在2小时内准确检测出对虾和养殖水体中的白斑综合症病毒。也解决了限制LAMP技术中的易被污染干扰的问题。有望替代对虾白斑综合症病毒之前的相关检测方法，如电镜观察法、TE染色法、病理切片法、抗体检测法、核酸探针杂交法和PCR检测法。

Description

对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体是对虾白斑综合症病毒(WSSV，White Spot SyndromeVirus)的核酸等温扩增检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

对虾白斑综合症病毒是可广泛感染虾蟹等十足类甲壳动物苗种、成体、亲体的一种大型杆状病毒，自1993年在养殖对虾中暴发以来，在世界范围内广泛传播，导致养殖对虾大量死亡，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。因此开发新的技术快速、准确、灵敏地检测WSSV，加强苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展具有重要意义。

目前，有关WSSV的检测方法主要有六种，第一种是电镜观察法，第二种是TE染色法，第三种是病理切片法，第四种是抗体检测法，第五种是核酸探针杂交法，第六种是PCR检测法。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；TE染色法和病理切片法都是基于病理学技术，不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测；抗体检测法和核酸探针杂交法是对病毒本身的蛋白质或核酸成分进行检测，不足之处在于其检测灵敏度较低，只能用于发病对虾或即将发病的对虾进行检测，WSSV尚未引发感染或在感染的极早期很难用这两种方法检测；WSSV的PCR检测法，虽然克服了前五种方法的缺点，在实验室条件下能实现对WSSV的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，这大大限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。

发明内容

本发明的目的是要提供一种检测灵敏度高且易操作的对虾WSSV检测方法，并将检测方法标准化，配套化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，力求克服已有技术的不足，使对虾白斑综合症病毒的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。

本发明是基于2000年由Notomi等发明的环介导等温扩增技术。本发明针对我们精心筛选的WSSV目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增。与其他报道的LAMP技术相比，本发明的核心之一是针对WSSV基因组，优选了目的基因区段来设计LAMP特异性引物，使得该引物能有效检测WSSV的所有毒株，而且检测特异性好；核心之二是采用专门设计的SEMP研磨液进行样品的处理，使得样品的处理过程极其简单；核心之三是采用尿嘧啶糖基化酶消除LAMP扩增产物的污染，避免了由于LAMP检测方法的产物扩增量非常大，极易使被检样品污染，造成假阳性的结果，而大大限制了其在检测中的广泛应用；核心之四是优化了整个操作过程的技术参数，并将之标准化、配套化，形成检测试剂盒，以便于现场应用。

因此，本发明的对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂盒包括：

(1)SEMP研磨液，1管，内装SEMP采样液，SEMP采样液由以下组份组成：1M的三羟甲基氨基甲烷(Tris·HCl，pH8.0)：0.5～15份；0.5M的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)：0.5～15份；10％的十二烷基硫酸钠(SDS)：0.5～15份；巯基乙醇：0.01～0.5份；8-羟基喹啉：0.01-0.5份；平衡酚：10～30份；氯仿10～30份；双蒸水：定容到100份；

(2)核酸抽提液A，1管，内装乙酸钠(NaAc，pH5.2)；

(3)核酸抽提液B，1管，内装无水乙醇；

(4)核酸抽提液C，1管，内装70％的乙醇；

(5)TE缓冲液，1管，内装TE缓冲液(含10mMTris-HCl和1mMEDTA，pH8.0)；

(6)UNG酶，1管，内装尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；

(7)酶解缓冲液，1管，内装尿嘧啶DNA糖基化酶的反应缓冲液；

(8)LAMP反应液，1管，内装LAMP反应液，其组成成分如下：LAMP引物WSSV-FIP和WSSV-BIP各1～2μM，LAMP引物WSSV-F3和WSSV-B3各0.1～0.4μM，dATP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，dTTP、dUTP各0.5～1.5mM，MgCl₂ 4～10mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.2M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄ 1～4mM，(NH₄)₂SO₄ 6～12mM，Triton X-1000.05％～1.0％；

(9)BstDNA聚合酶，1管，内装BstDNA聚合酶；

(10)显色剂，1管，内装核酸染料GeneFinder^TM；

(11)阳性对照核酸，1管，内装对虾WSSV阳性DNA；

(12)研磨棒，4支；

(13)盒子；

(14)一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中，泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管应放置于这些小孔中；

(15)试剂盒使用说明书，1份。

上述WSSV基因检测试剂盒中所述的LAMP引物是根据WSSV基因保守区序列设计的，LAMP引物设计的首选软件是PrimerExplore 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.htmL)，也可以使用常用的引物设计软件(如Primer Primier5.0或Omiga2.0)按照LAMP引物的设计要求进行引物设计。本发明中利用软件PrimerExplore4.0在线设计的一套LAMP引物的DNA序列如下：

WSSV-FIP：5′-GCTGTTCTTCTTCTTCTTCTGCGTTTTAAATATGGATGAAGACACTTGG

WSSV-BIP：5′-GCCGTTGAACGAGTTTATAGTTTCTTTTGTTCTCTCATTACAAGAAGTCTC

WSSV-F3：5′-GACAACACTCTTCTTTCTTGAA

WSSV-B3：5′-ACGGGAAGAAGAATTTTGTG

用本发明上述试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，按下列步骤进行：

(1)取样品对虾的胃、鳃或附肢组织约0.02～0.06g置于微型离心管中，加入研磨液，用研磨棒将样品充分磨碎至浆状；

(2)将研磨好的样品以5000～10000r/min，离心2～5min，取0.1mL上清液置于新的微型离心管中；

(3)加入核酸提取液A，混匀，再加入核酸提取液B(-20℃预冷)充分混合，以10000～15000r/min离心5～10min，弃上清液保留沉淀物；

(4)用核酸提取液C洗涤沉淀物，然后以10000～15000r/min离心5～10min，小心去上清并保留沉淀物；

(5)重复步骤(4)一次，然后将离心管底部沉淀物于室温晾干，加入TE缓冲液溶解沉淀物，得样品核酸；

(6)取上述溶解后的样品核酸，加入2～12个单位(U)的UNG酶和酶解缓冲液，消化样品核酸中可能存在的污染模板；

(7)将上述酶解后的样品核酸、阳性对照核酸于95℃保温3～6min，让DNA双链充分解链，然后再迅速置于碎冰块中2～10min，目的是使核酸DNA保持呈两条单链状态。

(8)取上述处理后的核酸分别置于新的小管中，每个管中再分别加入LAMP反应液和BstDNA聚合酶；

(9)将上述小管于60～65℃保温40～70min，然后于80℃保温5～10min进行LAMP反应；

(10)LAMP反应结束后，在每个小管中加入GeneFinder^TM，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的WSSV检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的WSSV检测结果为阴性。

本发明的积极效果在于：在试剂盒中汇集WSSV检测所需的SEMP样品研磨液、核酸抽提液A、核酸抽提液B等十一种试剂和三种器材，使得WSSV的检测能够有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明的试剂盒及检测方法是以根据WSSV基因保守区序列设计的一套LAMP引物为主体而设计的，因而使WSSV检测完全具有了LAMP技术灵敏、快速、安全和简便的特点；同时本发明的试剂盒及检测方法中采用UNG酶能彻底消除多次检测过程中核酸污染导致的假阳性，解决了限制LAMP技术广泛应用的易被污染干扰的问题。使用本发明的试剂盒及检测方法在2小时内就可完成对虾WSSV的检测，检测过程无需昂贵的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需有水浴锅或金属浴和离心机即可；而且检测结果非常容易判别；与对虾WSSV已有检测技术相比，本发明的试剂盒和检测方法成本低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，检出病毒的拷贝可低至26个。总之，该方法具有比普通PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，可以替代对虾白斑综合症病毒之前的相关检测方法如电镜观察法、TE染色法、病理切片法、抗体检测法、核酸探针杂交法和PCR检测法。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂盒

本发明的试剂盒由以下组成(4样份)：

(1)SEMP研磨液，1管，内装800μLSEMP采样液，SEMP采样液的特征在于是由1M的三羟甲基氨基甲烷(Tris·HCl，pH8.0)10份，0.5M的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)1份，10％的十二烷基硫酸钠(SDS)10份，巯基乙醇0.01份，8-羟基喹啉：0.01份，平衡酚10份，氯仿10份，以双蒸水定容到100份而成。

(2)核酸抽提液A，1管，内装400μL4M乙酸钠(NaAc，pH5.2)。

(3)核酸抽提液B，1管，内装800μL无水乙醇。

(4)核酸抽提液C，1管，内装800μL70％的无水乙醇。

(5)TE缓冲液，1管，内装200μLTE缓冲液(含10mMTris-HCl和1mMEDTA，pH8.0)。

(6)UNG酶，1管，内装20个单位(U)的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。

(7)酶解缓冲液，1管，内装10μL2×UNG酶酶解反应缓冲液。

(8)LAMP反应液，1管，内装100μLLAMP反应液，其特征在于它的组成成分和比例如下：引物WSSV-FIP和WSSV-BIP各1.6μM，引物WSSV-F3和WSSV-B3各0.2μM，dATP、dGTP和dCTP各1.4mM，dTTP、dUTP各0.7mM，MgCl₂ 6mM，Betaine1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，Triton X-1000.1％。

(9)BstDNA聚合酶，1管，内装4μLBstDNA聚合酶。

(10)显色剂，1管，内装8μL20倍稀释的核酸染料GeneFinder^TM。

(11)阳性对照核酸，1管，内装8μL对虾WSSV阳性DNA。

(12)研磨棒，4支。

(13)盒子(78×78×50mm)。

(14)一块泡沫板，泡沫板高22mm，有三列空，第一列和第二列都是三个空，孔径10mm，第三列五个空，孔径5.5mm，上述各小管放置于这些小孔中；泡沫板与上述盒子的底面大小，装于盒子中。

(15)试剂盒使用说明书一份。

试剂盒中所述的LAMP引物的DNA序列如下：

WSSV-FIP：5′-GCTGTTCTTCTTCTTCTTCTGCGTTTTAAATATGGATGAAGACACTTGG

WSSV-BIP：5′-GCCGTTGAACGAGTTTATAGTTTCTTTTGTTCTCTCATTACAAGAAGTCTC

WSSV-F3：5′-GACAACACTCTTCTTTCTTGAA

WSSV-B3：5′-ACGGGAAGAAGAATTTTGTG

该试剂盒中的阳性对照是包含WSSV病毒核酸的DNA质粒标准。其制备的具体操作是在PCR反应后，用试剂盒回收相关片段，然后连接到质粒载体上，转入大肠杆菌E.coli中，经氨苄培养基平板扩大培养，挑取阳性克隆并进行测序验证，提取阳性克隆的质粒并稀释到10⁴个拷贝，即可作为阳性对照标准。

实施例2本发明的对虾白斑综合症病毒LAMP检测方法

使用实施例1中的试剂盒，按下列步骤进行：

(1)取样品对虾的胃组织约0.05g置于微型离心管中，加入300μL研磨液，用研磨棒将样品充分磨碎。

(2)将研磨好的样品以4000r/min离心2min，取约0.1mL上清置于新的微型离心管中。

(3)加入100μL核酸提取液A，混匀后，再加入200μL核酸提取液B(-20℃预冷)充分混合，以12000r/min离心5min，弃上清液保留沉淀物。

(4)用100μL核酸提取液C洗涤沉淀物，然后以12000r/min离心5min，小心弃去上清液，保留沉淀物。

(5)重复步骤(4)一次，然后将离心管底部沉淀物于室温晾干，加入100μLTE缓冲液溶解沉淀物，得样品核酸。

(6)取上述溶解后的样品核酸2μL，加入5个单位(U)的UNG酶和2.5μL酶解缓冲液，于37℃保温5min进行酶解。

(7)将上述酶解后的样品核酸和阳性对照核酸于95℃保温5min，然后再迅速置于碎冰块中3min。

(8)取2μL上述处理后的核酸分别置于新的小管中，每个管中再分别加入22μLLAMP反应液和1μLBstDNA聚合酶。

(9)将上述小管于63℃保温60min，然后于80℃保温5min进行LAMP反应。

(10)LAMP反应结束后，在每个小管中加入2μL显色剂，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的WSSV检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的WSSV检测结果为阴性。

本试剂盒及检测方法所使用的试剂和材料：乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、醋酸钠、氯仿、平衡酚、巯基乙醇、8-羟基喹啉、MgCl₂购自上海生物工程有限责任公司；UNG酶、BstDNA聚合酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinder^TM购自厦门百维信生物科技有限公司。

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂盒及检测方法

<160>4

<210>1

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾白斑综合症病毒基因组序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作对虾白斑综合症病毒等温扩增检测的FIP引物

<400>1

gctgttc ttcttcttcttct gcgttttaaa tatggatgaa gacacttgg 49

<210>2

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾白斑综合症病毒基因组序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作对虾白斑综合症病毒等温扩增检测的BIP引物

<400>2

gccgttgaac gagtttatag tttcttttgt tctctcatta caagaagtctc 51

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾白斑综合症病毒基因组序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作对虾白斑综合症病毒等温扩增检测的F3引物

<400>3

gacaacactc ttctttcttgaa 22

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据对虾白斑综合症病毒基因组序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作对虾白斑综合症病毒等温扩增检测的B3引物

<400>4

acgggaagaa gaattttgtg 20

Claims

1.一种对虾白斑综合症病毒核酸等温扩增检测试剂盒，其特征是该试剂盒包括：

(1)研磨液，1管，内装SEMP采样液；

(2)核酸抽提液A，1管，内装乙酸钠；

(3)核酸抽提液B，1管，内装无水乙醇；

(4)核酸抽提液C，1管，内装70％的乙醇；

(5)TE缓冲液，1管，内装TE缓冲液；

(6)UNG酶，1管，内装尿嘧啶DNA糖基化酶；

(7)酶解缓冲液，1管，内装尿嘧啶DNA糖基化酶的反应缓冲液；

(8)LAMP反应液，1管，内装LAMP反应液；

(9)Bst DNA聚合酶，1管，内装Bst DNA聚合酶；

(10)显色剂，1管，内装核酸染料GeneFinder^TM；

(11)阳性对照核酸，1管，内装对虾WSSV阳性DNA；

(12)研磨棒，4支；

(13)盒子；

(14)一块泡沫板，置于盒子中，其上的若干小孔用于放置上述各小管；

(15)试剂盒使用说明书，1份。

2.如权利要求书1中所述的试剂盒，其特征在于作为研磨液的SEMP采样液是由以下组份按比例组成：1M pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷：0.5～15份；0.5M的乙二胺四乙酸二钠：0.5～15份；10％的十二烷基硫酸钠：0.5～15份；巯基乙醇：0.01～0.5份；8-羟基喹啉：0.01-0.5份；平衡酚：10～30份；氯仿10～30份；并以双蒸水定容到100份。

3.如权利要求书1中所述的试剂盒，其特征在于上述的LAMP反应液由以下组份组成：LAMP引物WSSV-FIP和WSSV-BIP各1～2μM，LAMP引物WSSV-F3和WSSV-B3各0.1～0.4μM，dATP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，dTTP、dUTP各0.5～1.5mM，MgCl₂ 4～10mM，Betaine0.6～1.2M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄ 1～4mM，(NH₄)₂SO₄ 6～12mM，Triton X-100 0.05％～1.0％。

4.如权利要求书3中所述的试剂盒，其特征在于LAMP引物的核酸序列如下：

WSSV-FIP：

5′-GCTGTTCTTCTTCTTCTTCTGCGTTTTAAATATGGATGAAGACACTTG

G；

WSSV-BIP：

5′-GCCGTTGAACGAGTTTATAGTTTCTTTTGTTCTCTCATTACAAGAAG

TCTC；

WSSV-F3：5′-GACAACACTCTTCTTTCTTGAA；

WSSV-B3：5′-ACGGGAAGAAGAATTTTGTG。

5.使用权利要求书1中所述试剂盒检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)取样品对虾的胃、鳃或附肢组织0.02～0.06g置于微型离心管中，加入研磨液，用研磨棒将样品充分磨碎至浆状；

(2)将研磨好的样品以5000～10000r/min离心2～5min，取0.1mL上清液置于新的微型离心管中；

(3)加入核酸提取液A，混匀，再加入-20℃预冷的核酸提取液B并充分混合，以10000～15000r/min离心5～10min，弃上清液保留沉淀物；

(4)用核酸提取液C洗涤上述沉淀物，然后以10000～15000r/min离心5～10min，弃去上清液并保留沉淀物；

(5)重复步骤(4)一次，然后将上述离心管底部的沉淀物于室温晾干，加入TE缓冲液溶解沉淀物，得到样品核酸；

(6)取上述样品核酸及试剂盒中的阳性对照核酸，加入UNG酶和酶解缓冲液，作为污染模板消除方法以酶解其中可能存在的污染模板；

(7)将上述酶解后的样品核酸和阳性对照核酸于95℃保温3～6min，然后再迅速置于碎冰块中2～10min；

(8)取上述处理后的样品核酸和阳性对照核酸分别置于新的小管中，每个管中再分别加入LAMP反应液和Bst DNA聚合酶；

(10)LAMP反应结束后，在每个小管中加入GeneFinder^TM，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的WSSV检测结果为阳性，若显示橙黄色则表示该样品的WSSV检测为阴性。

6.如权利要求5中所述的检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征是上述污染模板消除方法是通过在提取的对虾样品核酸中加入2～12个单位的UNG酶和酶解缓冲液，并于37℃，保温5～30min来消除污染模板对检测结果的干扰。