CN108342512A - 一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法 - Google Patents

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李云
于晓丹
戴习林
朱其建
周微微
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Abstract

本发明涉及一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，首先提取待测样品的基因组DNA；再设计引物和TaqMan探针，最后通过设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。发明的检测方法检测灵敏度高且特异性好，可以检测到的最低拷贝数为7.8，用时短且不会产生假阳性的情况，可应用于我国对虾养殖中的分子疾病检测和早期预警，具有良好的应用前景。

Description

一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种定量检测对虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术
对虾白斑综合症病毒(WSSV)在1992首次被发现以来已成为对虾养殖业中最危险的传染源，其在十足目甲壳动物中宿主范围广泛。WSSV基因组是一个均匀分布的圆形的dsDNA 分子，不同毒株基因组大小不同，是迄今为止已测序的最大的病毒基因组之一。三个WSSV 毒株的基因组的全序列已经测定，包括：泰国株293kbp，中国株305kbp和台湾地区株307kbp，它们之间的相似度为99.3％。WSSV基因组的不同区段具有重要的序列差异，这些差异可用于确定WSSV毒株的起源和传播，也用于区分野外的毒株，也可能导致PCR检测出现假阴性。WSSV无包涵体包被，完整的有囊膜的病毒粒子长210nm～380nm，宽70nm～167nm，一个尾状的附着器结构在病毒粒子的一端。囊膜厚6nm～7nm，核衣壳位于囊膜内，是由球状蛋白堆积形成的环状结构，球状蛋白直径约为10nm，排列在14个～15个垂直的环纹上，在长轴上每隔22nm有一个球状蛋白，最终形成一个交叉螺线状的结构。
在池塘中，感染白斑综合症病毒的对虾聚集在塘边，症状出现1或2天后发生死亡，10 天内累计死亡率可达到100％。在养成池，成年对虾和幼虾都对WSSV敏感，大规模的死亡通常发生在放养1或2个月后。许多感染WSSV的对虾外壳出现明显的直径在0.5mm～3.0mm的白点或白斑，同时伴随其他症状，包括身体和附肢变红、摄食减少、应激反应敏感、表皮易脱落、鳃盖肿胀，肝肿大颜色偏黄，血淋巴变稀、凝血延迟。
传统检测方法以病理学和电子显微镜观察为主，耗时长且不适用。近年来广泛建立的免疫检测技术、原位杂交、PCR检测法、核酸探针杂交法、荧光定量法，不仅迅速、简便、实用，而且大大提高了检测灵敏度，可以检测出潜在感染和早期感染。单种检测方法通常存在缺陷，而多种方法同时检测不仅耗时且结果有差异，所以需要建立一种准确的定量检测对虾白斑综合症病毒的方法。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法。
技术方案
一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)设计引物和TaqMan探针：
上游引物序列：5'-CAAGGGAAC TGT CGC TTC-3'
下游引物序列：5'-CCAAGATCG GCGATAAGT-3'
TaqMan探针的序列为：5'-CAT GCCAGC CGT CTT CCAG-3'；
(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。
进一步，步骤(3)中，所述荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括2×SuperRealcolor PreMix 10μL，上游引物、下游引物各0.6μL，TaqMan探针0.4μL，ddH2O 7.4μL，模板DNA 1μL。
进一步，步骤(3)中，所述荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，61℃退火60s，采集荧光信号，40个循环。
有益效果：本发明提供了一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，该检测方法检测灵敏度高且特异性好，可以检测到的最低拷贝数为7.8，用时短且不会产生假阳性的情况，可应用于我国对虾养殖中的分子疾病检测和早期预警，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的白斑综合症病毒不同浓度梯度的扩增曲线；
图2为本发明实施例1的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤：
(1)采集50份新鲜的虾苗肌肉样品，采集后迅速放入酒精中4℃保存。
病毒核酸提取：采用的天根公司的DNA提取试剂盒，步骤参考试剂盒中的说明书的方法进行。
(2)设计引物和TaqMan探针
引物探针的设计在NCBI上查找白斑综合症病毒(WSSV)的相关序列，通过BioEdit软件比对，分析出序列的保守区与特异性区域，确定引物及探针，然后用Primer Premier5进行引物探针的评估，进行初步筛选。合成引物及探针后用PCR验证是否扩增目的片段以及扩增的特异性，进一步确定可行的引物及探针。
上游引物序列：5'-CAAGGGAAC TGT CGC TTC-3'
下游引物序列：5'-CCAAGATCG GCGATAAGT-3'
TaqMan探针的序列为：5'-CAT GCCAGC CGT CTT CCAG-3'。
(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。
所述荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括2×SuperReal color PreMix 10μL，上游引物、下游引物各0.6μL，TaqMan探针0.4μL，ddH2O 7.4μL，模板DNA 1μL。
所述TaqMan探针法检测的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，61℃退火60s，采集荧光信号，40个循环。
图1为白斑综合症病毒不同浓度梯度的扩增曲线，曲线从左到右的浓度依次为7.8×107 copies/μL、7.8×106copies/μL、7.8×105copies/μL、7.8×104copies/μL、7.8×103copies/μL、 7.8×102copies/μL、7.8×101copies/μL、7.8×100copies/μL。
图2为本发明实施例1的标准曲线，是用不同浓度的阳性标准品跑荧光定量PCR，然后根据CT值和浓度作出的。该曲线y＝-3.16x+41.30；r＝0.998，y：扩增实验中所得到的CT值，x：所对应的模板浓度取对数。
TaqMan探针PCR检测结束后，无目的条带的为阴性，有明显的目的条带的为阳性。本实施例检测出14个阳性，检出率为28％。
对比例1
采用常规PCR方法(引物同上)对实施例1的50份虾苗进行检测：
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，延伸温度72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。
该方法检测出4个阳性，检出率为8％。
对比例2
采用SYBRGreenⅠ(引物同上)对实施例1的50份虾苗进行检测：
反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性15s，61℃退火30s，40个循环；溶解曲线：95℃15s，55℃15s，95℃15s。
该方法检测出4个阳性，检出率为8％。
由实施例和对比例的检出率可以看出：本发明的荧光探针法检出率最高，说明荧光探针法的检测灵敏度高且特异性好，适合含量极低和组织量小的虾苗中WSSV的检测，适用于我国养殖对虾WSSV微量感染的早期检测及预警。
TaqMan探针荧光定量PCR反应与传统PCR相比具有明显的优势：①能对PCR进行实时监控避免了传统的定量只能终点检测的局限。②有效的避免PCR污染问题，从配好反应体系到结果分析都是在封闭管中完成。③特异性更强，荧光信号的产生依赖于探针与目的模板的结合和目的模板的扩增。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)设计引物和TaqMan探针：
上游引物序列：5'-CAA GGG AAC TGT CGC TTC-3'
下游引物序列：5'-CCA AGA TCG GCG ATA AGT-3'
TaqMan探针的序列为：5'-CAT GCC AGC CGT CTT CCA G-3'；
(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。
2.如权利要求1所述的利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括2×SuperReal colorPreMix 10μL，上游引物、下游引物各0.6μL，TaqMan探针0.4μL，ddH2O 7.4μL，提取的基因组DNA 1μL。
3.如权利要求1或2所述的利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，其特征在于，步骤(3)中,所述荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，61℃退火60s，采集荧光信号，40个循环。
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