CN113755648B - Wssv实时荧光定量pcr检测引物探针组合、试剂盒及方法 - Google Patents

Wssv实时荧光定量pcr检测引物探针组合、试剂盒及方法 Download PDF

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明提出WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法，其引物探针组合包括WSSV上游引物、WSSV下游引物和WSSV探针；所述WSSV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述WSSV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述WSSV探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述WSSV探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。采用该引物探针组合能够实现高灵敏度、高特异性的WSSV检测，为对虾白斑综合症病毒的早期检测和精准防控提供重要的技术支撑，对保障我国对虾养殖业健康发展具有重要意义。

Description

WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物病原检测技术领域，尤其涉及WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法。
背景技术
对虾白斑综合症病毒(WSSV)自20世纪90年代开始在亚洲地区养殖对虾中不断爆发并流行，感染的对虾死亡率高达100％。白斑综合症病毒是在已经报道的对虾病毒中，毒力最强，危害最大，感染宿主的范围和分布地域十分广泛的一种病毒，可以感染多种对虾(如中国对虾、南美白对虾、日本对虾、斑节对虾等)造成死亡，而且能被许多水生生物如蟹类、桡足类、轮虫类、卤虫和一些昆虫幼虫携带而到处传播，甚至对虾饵料如保存处理不当也会携带白斑病毒从而感染养殖对虾。全世界各国对虾产量仅由于白斑病就损失近一半，我国也不例外，每年各水产养殖大省也都会受到白斑病毒的侵袭，给养殖户造成巨大的经济损失。
截止到目前，对虾白斑综合症尚无有效的治疗手段。实践证明，预防并切断传播途径是控制疾病爆发和流行的最为有效的途径和方法，其中主要关键技术就是早期敏感诊断，不仅要加强亲虾、虾苗、仔虾、成虾等的养殖动物日常检测，同时还要加强养殖水体中微小生物、池塘底泥以及对虾投喂饵料的实时监测，才能使整个养殖流程形成无疫病的闭环，为对虾白斑综合症病毒的防控提供保障。
因此，高灵敏度、高特异性的对虾白斑综合症病毒检测方法是有效控制对虾白斑综合症病毒传播，避免疫病大面积爆发的基础和前提，也是各级水生动物疫病防控机构、科研机构以及大规模对虾养殖场对该病监测、检疫的迫切需要。
发明内容
本发明针对上述技术问题，提出WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法，能够实现高灵敏度、高特异性的WSSV检测，为对虾白斑综合症病毒的早期检测和精准防控提供重要的技术支撑，对保障我国对虾养殖业健康发展具有重要意义。
为了达到上述目的，本发明第一方面提供了一种WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合，包括WSSV上游引物、WSSV下游引物和WSSV探针；所述WSSV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述WSSV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述WSSV探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述WSSV探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。
本发明第二方面提供了一种WSSV实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒包括上述的引物探针组合。
作为优选，该试剂盒还包括无菌无核酸酶水、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。
作为优选，所述阳性对照品为重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV。
作为优选，所述阴性对照品为DEPC水。
作为优选，所述定量PCR反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。
本发明第三方面提供了采用上述试剂盒的WSSV实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)设计、合成引物和探针：根据GenBank中公布的对虾白斑综合症病毒WSSV基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针；其中，WSSV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，WSSV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针WSSV的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述WSSV探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM；
(2)制备对照品：制备重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV作为阳性对照品，以DEPC水作为阴性对照品；
(3)WSSV荧光定量PCR扩增：提取待测样品DNA，使用步骤(1)中设计的引物与探针，以待测样品DNA为模板，对待测样品进行Taqman荧光定量RT-PCR扩增反应；
(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。
作为优选，所述步骤(2)的阳性对照品制备方法为：使用WSSV质粒扩增上游引物：5'-GTAACTGCCCCTTCCATCT-3'和下游引物：5'-TACGGCAGCTGCTGCAC-3',以对虾白斑综合症病毒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所得PCR产物经回收后与pUC57载体连接，以构建重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV，作为阳性对照品。
作为优选，所述步骤(2)的扩增反应体系为：上游引物(10μmol)1μl；下游引物(10μmol)1μl；模板1μl；2×Premix Taqbuffer 12.5μl；DEPC水9.5μl，总体积为25μl。
作为优选，所述步骤(2)的扩增反应条件为：95℃5min，95℃1min，57℃50s，72℃1min，共35个循环；72℃10min，4℃保存。
作为优选，所述步骤(3)的扩增反应体系为：WSSV上游引物(10μmol)0.5μL，WSSV下游引物(10μmol)0.5μL，WSSV探针(10μmol)1μL，模板2μL，2×Probe PCRbufferMix 12.5μL，DEPC水8.5μL，总体积为25μL。
作为优选，所述步骤(3)的扩增反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环，在每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。
作为优选，所述步骤(4)的检测结果的判定标准为：待检样品Ct值≤38，判为对虾白斑综合症病毒核酸阳性；待检样品Ct值＞40或显示为None，判为对虾白斑综合症病毒核酸阴性；待检样品FAM通道38＜Ct值＜40，判为可疑，需重新检测，若重新检测38＜Ct值＜40，且有明显的扩增曲线，则判为对虾白斑综合症病毒核酸阳性。
此外，本发明还提供了上述的WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合在制备WSSV检测产品中的应用，该引物探针组合可为用于非疾病的诊断和治疗目的中的对虾白斑综合症病毒的检测，包括用于对虾白斑综合症病毒的检疫和流行病学监测，用于对动物受精卵、苗种、幼体、成体、亲本的对虾白斑综合症病毒检测，或用于进行环境、水体、饲料、工具的检测等。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：提出了WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法。本发明利用对虾白斑综合症病毒基因组保守区序列设计一对引物及荧光探针，通过优化荧光定量PCR反应条件和反应体系，建立起对虾白斑综合症病毒的荧光定量PCR检测方法，该试剂盒检测灵敏度高，特异性强、可重复性好，定量线性范围广，可用于所有海水、半咸水及淡水十足目甲壳类易感宿主和非十足类甲壳动物，如桡足类、轮虫类、卤虫等白斑病毒携带者的检测工作，且该发明更适用于在对虾养殖水体、底泥、饵料等环境样本的对虾白斑综合症病毒痕量检测，还能用于与该病原绝对定量相关的基础科学研究，具有较高的科学及实用价值。
附图说明
图1为重组质粒pUC57-WSSV酶切图谱，其中：1为重组质粒pUC57-WSSV经BamHI和HindIII酶切后的质粒片段和目标基因片段，M为DL10000分子质量标准；
图2为重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV与WSSV核酸同源性比对结果图；
图3为通过WSSV实时荧光定量PCR检测方法建立的标准曲线；
图4为WSSV实时荧光定量PCR检测方法灵敏度检测结果图，其中1-12分别为4.2×109copies/μl、4.2×108copies/μl、4.2×107copies/μl、4.2×106copies/μl、4.2×105copies/μl、4.2×104copies/μl、4.2×103copies/μl、4.2×102copies/μl、4.2×101copies/μl，2.1×101copies/μl，10copies/μl，5copies/μl，13为阴性对照品；
图5为WSSV实时荧光定量PCR检测方法特异性检测结果图，其中1为阳性质控，2-5分别为对虾白斑综合症病毒、对虾传染性皮下与造血器官坏死病病毒、对虾高致病性副溶血弧菌、对虾虹彩病毒，6为阴性对照品；
图6为WSSV实时荧光定量PCR检测方法对临床样品检测的结果，其中1为阳性质控，2为待测样品，3为阴性对照品；
图7为实施例7的“套式PCR”方法灵敏度检测结果图，其中1-5分别为1.4×105copies/μl、1.4×104copies/μl、1.4×103copies/μl、1.4×102copies/μl、1.4×101copies/μl，6为阴性质控，M为DL2000 Marker；
图8为实施例7的WSSV实时荧光定量PCR检测结果图，其中1-5分别为1.4×105copies/μl、1.4×104copies/μl、1.4×103copies/μl、1.4×102copies/μl、1.4×101copies/μl，6为阴性对照品；
图9为实施例7的“套式PCR”检测方法为对养殖水体和池边泥土对虾WSSV携带情况的检测结果，其中1为养殖水体WSSV携带情况、2为池边泥土WSSV携带情况，3为阴性对照品、4为阳性对照品、M为DL2000 Marker；
图10实施例7的WSSV实时荧光定量PCR检测方法为对养殖水体和池边泥土对虾WSSV携带情况的检测结果，其中1为养殖水体WSSV携带情况、2为池边泥土WSSV携带情况，3为阴性对照品、4为阳性对照品。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1WSSV实时荧光定量PCR检测方法的建立
1.1特异性引物和探针设计
根据GenBank(登录号：MN840357.1)中公布的对虾白斑综合症病毒WSSV基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针，利用Taqman探针技术，建立了快速、特异、灵敏的对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法。
引物、探针序列如下：
WSSV上游引物：5'-ATGGTCCCGTCCTCATCTCA-3'，SEQ ID NO.1
WSSV下游引物：5'-GCACCTTGTTCGGCGTTCTT-3'，SEQ ID NO.2
WSSV探针：5'-FAM-ATGAAGAATGCCGTCTATCACACACTAA-TAMRA-3'，SEQ ID NO.3，WSSV探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM。
1.2WSSV阳性质控和阴性质控的建立
1.2.1阳性质控构建
将感染对虾白斑综合症病毒(WSSV)的对虾鳃丝组织采用海洋动物基因组提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)进行DNA提取，以所提取的对虾白斑综合症病毒基因组DNA作为PCR反应模板，使用WSSV质粒扩增上游引物：5'-GTAACTGCCCCTTCCATCT-3'(SEQID NO.4)和下游引物：5'-TACGGCAGCTGCTGCAC-3'(SEQ ID NO.5)，进行PCR扩增，其中：
扩增反应体系(总体积25μl)为：上游引物(10μmol)1μl，下游引物
(10μmol)1μl，模板1μl，2×PremixTaqbuffer 12.5μl，DEPC水9.5μl；
反应条件为：95℃5min，95℃1min，57℃50s，72℃1min，共35个循环；72℃10min，4℃保存。
所得PCR产物经回收后与pUC57载体连接，以构建重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV，作为阳性对照品(阳性质控)，即完成阳性质控构建，扩增的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
验证实验：将重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，构建对虾白斑综合症病毒重组大肠杆菌pUC57-WSSV-TOP10株，并对重组菌进行了鉴定。结果表明，重组菌株为革兰氏阴性杆菌，在LB琼脂平板上培养后形成大小为1-2mm、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽的黄白色圆形菌落；pUC57-WSSV重组质粒经通用引物M13扩增，能够扩增出大小约为941bp的条带，且重组质粒pUC57-WSSV经BamHI和HindIII酶切后能够得到与目标片段大小一致的酶切片段(如图1所示)，PCR产物经测序比对与GenBank中登录的对虾白斑综合症病毒WSSV基因序列一致性为100％(如图2所示)。表明该PCR产物构建的质粒适用于WSSV核酸检测的阳性质控。
1.2.2阴性质控构建
以DEPC水(DNase、RNase free，购自天根生物公司)作为阴性对照品(阴性质控)。通过观察溶液的颜色及性状，该批次的DEPC水为无色澄清液体，按《中国兽药典》2015年版三部附录进行检验，该批次的DEPC水无菌生长。用对虾白斑综合症病毒荧光PCR检测方法进行检测，结果对虾白斑综合症病毒核酸均为阴性。
1.3WSSV荧光定量PCR扩增
使用1.1步骤中设计的引物与探针，以待测样品DNA为模板，进行PCR扩增，其中：
扩增反应体系为：WSSV上游引物(10μmol)0.5μL；WSSV下游引物(10μmol)0.5μL；WSSV探针(10μmol)1μL；模板2μL；2×Probe PCRbufferMix 12.5μL；DEPC水8.5μL，总体积为25μL。
扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s；共40个循环，在每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。
1.4结果判定
通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值。实验成立的条件为：阳性对照Ct值均≤30，阴性对照的Ct值均显示为None，则判定实验成立。检测结果的判定标准为：待检样品Ct值≤38，判为对虾白斑病毒核酸阳性；待检样品Ct值＞40或显示为None，判为对虾白斑病毒核酸阴性；待检样品FAM通道38＜Ct值＜40，判为可疑，需重新检测，若重新检测38＜Ct值＜40，且有明显的扩增曲线，则判为对虾白斑病毒核酸阳性。
1.5WSSV实时荧光定量PCR检测标准曲线的建立
使用Easy dilution(购自宝日医)将重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV进行10倍梯度稀释(4.24×109copies/μl～4.24×101copies/μl)，以9个浓度梯度的重组质粒作为建立标准曲线的模板，进行荧光定量PCR扩增，所用引物探针、扩增反应体系及反应条件均与步骤1.3相同。
上述9个浓度梯度，每个浓度重复3次，取3次的均值，以循环数为横坐标，荧光强度的对数值为纵坐标，绘制得标准曲线如图3所示，得到的相关系R2＝0.9989，方程式为Y＝-0.2977x+13.014，从图3可以看出，4.24×109copies/μl～4.24×101copies/μl浓度的PCR扩增曲线均有效。
实施例2灵敏度评价
采用了Easy dilution(购自宝日医)梯度稀释的重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV作为灵敏度检验的模板，进行PCR扩增，所用引物探针、扩增反应体系及反应条件均与步骤1.3相同。
以拷贝数来衡量灵敏度，实验结果如图4所示，从该实验结果可以看出，本发明的检测方法对重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV的最低检出限为5copies/μl(以核酸浓度来衡量灵敏度，最低检出限为2×10-8ng/μl)。
实施例3特异性评价
采用实施例1的WSSV实时荧光定量PCR检测方法对对虾白斑综合症病毒、对虾肝肠胞虫、对虾传染性皮下及造血组织坏死病病毒、对虾虹彩病毒、高致病性副溶血弧菌进行检测，用于评价该方法区别鉴定对虾白斑综合症病毒(WSSV)与其它对虾常见几种重大疫病病原的特异性，检测结果如图5所示，从图5的检测结果可以看出，除对虾白斑综合症病毒外，其他病原菌均未出现有效扩增曲线，表明所述试剂盒及检测方法在检测鉴定对虾常见几种病原间具有良好的特异性。
实施例4重复性评价
以重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV标准品浓度为4.24×107copies/μl、4.24×106copies/μl、4.24×105copies/μl为模板，采用实施例1的WSSV实时荧光定量PCR检测方法进行重复性试验，结果如表1所示。
表1对虾白斑综合症病毒实时荧光定量PCR检测方法的重复性评价
标准品浓度 CT值 平均值X±SD 变异系数％CV
4.24×107copies/μl 17.330、17.486、17.450 17.422±0.08 0.04％
4.24×106copies/μl 20.865、20.845、20.811 20.84±0.03 0.01％
4.24×105copies/μl 24.198、24.191、24.190 24.193±0.004 0.018％
从表1的结果可以看出，不同浓度标准品组内的变异系数(CV)在0.01％～0.04％之间，表明该方法具有较好的重复性。
实施例5检测试剂盒
一种WSSV实时荧光定量PCR检测试剂盒采用实施例1中步骤1.1设计的WSSV上游引物、WSSV下游引物、WSSV探针，该试剂盒的组成还包括：无菌无核酸酶水、PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品。
其中，阳性对照品为重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV；阴性对照为DEPC水，PCR反应液(购自宝日医，主要成分为Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液)。
实施例6临床样品定量检测实验
采用实施例1的WSSV实时荧光定量PCR检测方法对1份对虾体内白斑综合症病毒载量进行定量检测，用不同稀释度的待测样品获得的Ct值与相应的拷贝数的对数做标准曲线(如图6所示)，获得用y代表的对虾白斑综合症病毒拷贝数对数，与用x代表的Ct值的二元一次方程Y＝-0.2977x+13.014，根据此二元一次方程可计算出待测样品的对虾白斑综合症病毒拷贝数，实现定量检测。
检测结果：本实施例的样品获得的Ct值为26.486，代入方程Y＝-0.2977x+13.014，获得样品对虾白斑综合症病毒拷贝数对数(y)为5.13，所以所测样品的对虾白斑综合症病毒拷贝数为105.13copies/μl，约为1.4×105copies/μl。
实施例7检测效果对比试验
对比本发明的WSSV实时荧光定量PCR检测方法与中华人民共和国国家标准(GB/T28630.2-2012)中白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分的“套式PCR”的检测效果，评价二者在检出率和灵敏度检测结果的优劣。具体试验如下：
7.1与标准中“套式PCR”检测方法检出率的比较
采用实施例1的WSSV实时荧光定量PCR检测方法和标准中“套式PCR”检测方法分别对50尾疑似感染WSSV的对虾进行检测(该50尾对虾样品采集自已经确认感染WSSV的对虾养殖池塘)，检测结果如表2所示。
表2实施例1的检测方法与“套式PCR”检测方法的检测结果对比表
从表2的实验结果可以看出，套式PCR检测方法的阳性检出率为88％，而实施例1的WSSV实时荧光定量PCR检测方法的阳性检出率为100％，同时，采用“套式PCR”检测方法检出的6个阴性样品，通过实施例1的WSSV实时荧光定量PCR检测方法的重新检测判定为阳性，证明了本发明的WSSV实时荧光定量PCR检测方法与“套式PCR”检测方法相比较，灵敏度更高，可以降低对虾白斑综合症病毒的漏检率。
7.2与标准中“套式PCR”检测方法灵敏度的比较
将实施例6中用于检测WSSV拷贝数的样品用Easy dilution进行10倍梯度稀释，稀释后的样品WSSV拷贝数分别为1.4×105copies/μl、1.4×104copies/μl、1.4×103copies/μl、1.4×102copies/μl、1.4×101copies/μl，采用标准中“套式PCR”方法将上述5个稀释后样品分别进行“套式PCR”和荧光定量PCR扩增(检测结果如图7所示)，结果显示套式PCR检测方法最低检出限为1400个拷贝。而上述5个稀释后样品采用实施例1的检测方法可以全部检出(检测结果如图8所示)，说明本发明的检测方法较“套式PCR”检测方法灵敏度提高了近100倍。
7.3对环境样本检测结果的比较
采用实施例1的WSSV实时荧光定量PCR检测方法和标准中“套式PCR”检测方法分别检测采集自已经确认感染WSSV的对虾养殖池塘水体、塘边泥土的对虾WSSV携带情况，检测结果分别如图9和图10所示，结果表明：水体浮游生物样品和泥土样本经本申请的WSSV实时荧光定量PCR检测方法检测结果都显示出对虾白斑病毒的弱阳性，而“套式PCR”方法未检出，表明本申请的WSSV实时荧光定量PCR检测方法可以适用于对对环境样本的WSSV检测，且灵敏度较高。
由实施例7的实验结果可以看出，本申请的WSSV实时荧光定量PCR检测方法相较国家标准中“套式PCR”检测方法灵敏度更高，更适用于在对虾组织样本、环境样本、生物和非生物饵料等样品的对虾白斑病毒痕量检测。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 天津市动物疫病预防控制中心
<120> WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合、试剂盒及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggtcccgt cctcatctca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcaccttgtt cggcgttctt 20
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgaagaatg ccgtctatca cacactaa 28
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtaactgccc cttccatct 19
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tacggcagct gctgcac 17
<210> 6
<211> 941
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtaactgccc cttccatctc caccacactt ttactccctc agataacgag catctggtat 60
cctctttcgc attcgcccgc ccagaagtct ccatggaaga aattagagcc acaccctatc 120
aggccaacaa gcttattagt gacaaacatt acgtgatgaa catgtccaag atcgattcta 180
gagtaacagg atcttccctc cttaagaagg ttagcgaatg gactgaaatg agaatgaact 240
ccaactttaa tggaacattt gaaccatcaa gactcgccct ctccaactct ggcatgacaa 300
cggcaggagt caacctcgac gttattgtca aaccaaataa tgcaagaagt gtactaggaa 360
tattggaatg tcatcgccag cacgtgtgca ccgccgacgc caagggaact gtcgcttcag 420
ccatgccagc cgtcttccag gcaaccgatg gaaacggtaa cgaatctgaa ctgatccaga 480
atgctctgcc aaggaacaga tacatccaaa agagcacaat gaacgctcaa actgtcgtgt 540
ttgctaatgt tttggaacaa cttatcgccg atcttggaaa ggttatcgtg aacgaactgg 600
ccggcaccat cgctgaatct gtaccagaaa gcgtatatga aaacaccaag gaaatgattg 660
atagactagg ctctgacgac ctcttcaaat ctaataataa tggaggagta gaatcaatgg 720
attatgaaga tagcgaaaca acatccaaca atggtcccgt cctcatctca gaagccatga 780
agaatgccgt ctatcacaca ctaatttccg gcaaggcagc tcgcccggaa aatgtaccat 840
tcgcctcatg cgccagcggc cctctcgcct ttgatttcct tctgtcaaag ggagatacat 900
tcgaagaaaa gaacgccgaa caaggtgcag cagctgccgt a 941

Claims (10)

1.一种WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合，其特征在于，包括WSSV上游引物、WSSV下游引物和WSSV探针；所述WSSV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述WSSV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述WSSV探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述WSSV探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM；所述检测引物探针组合的最低检出限为5copies/μl。
2.权利要求1所述的WSSV实时荧光定量PCR检测引物探针组合在制备WSSV检测产品中的应用，其特征在于，用于非疾病的诊断和治疗目的的对虾白斑综合症病毒的检测，包括用于对虾白斑综合症病毒的检疫和流行病学监测，用于对动物受精卵、苗种、幼体、成体的对虾白斑综合症病毒检测，或用于进行环境、饲料、工具的检测。
3.一种WSSV实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物探针组合。
4.根据权利要求3所述的WSSV实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括无菌无核酸酶水、PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。
5.根据权利要求4所述的WSSV实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV，所述阴性对照品为DEPC水。
6.一种用于非疾病的诊断和治疗目的WSSV实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，采用权利要求3至5中任一项所述的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：
(1)设计、合成引物和探针：根据GenBank中公布的对虾白斑综合症病毒WSSV基因序列的分析比对，设计引物和荧光探针；其中，WSSV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，WSSV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针WSSV的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述WSSV探针的5'端有荧光标记FAM、3'端连接荧光淬灭基团TAM；
(2)制备对照品：制备重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV作为阳性对照品，以DEPC水作为阴性对照品；
(3)WSSV荧光定量PCR扩增：提取待测样品DNA，使用步骤(1)中设计的引物与探针，以待测样品DNA为模板，对待测样品进行Taqman荧光定量RT-PCR扩增反应；
(4)结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值，判定待测样品阳性或阴性。
7.根据权利要求6所述的WSSV实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的阳性对照品制备方法为：使用WSSV质粒扩增上游引物：5'-GTAACTGCCCCTTCCATCT-3'和下游引物：5'-TACGGCAGCTGCTGCAC-3',以对虾白斑综合症病毒基因组DNA为模板，进行PCR扩增，所得PCR产物经回收后与pUC57载体连接，以构建重组对虾白斑综合症病毒质粒pUC57-WSSV，作为阳性对照品。
8.根据权利要求7所述的WSSV实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的扩增反应体系为：上游引物10μmol、1μl；下游引物10μmol、1μl；模板1μl；2×PremixTaqbuffer 12.5μl；DEPC水9.5μl；反应条件为：95℃5min；95℃1min，57℃50s，72℃1min，共35个循环；72℃10min，4℃保存，总体积为25μl。
9.根据权利要求6所述的WSSV实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s；共40个循环，在每一循环退火结束时收集FAM荧光信号。
10.根据权利要求6所述的WSSV实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的检测结果的判定标准为：若待检样品Ct值≤38，则判定该样品对虾白斑综合症病毒核酸阳性；若待检样品Ct值＞40或无Ct值，则判定该样品对虾白斑综合症病毒核酸阴性；若待检样品38＜Ct值＜40，则判定为可疑样品，需重新检测，若重新检测结果仍为38＜Ct值＜40，且有明显的扩增曲线，则判定该样品对虾白斑综合症病毒核酸阳性。
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