KR20150046958A

KR20150046958A - 마이크로어레이 칩을 이용한 흰반점바이러스 진단용 멀티플렉스 키트

Info

Publication number: KR20150046958A
Application number: KR1020130126596A
Authority: KR
Inventors: 김은주; 최은진; 송재영; 김준배
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부)
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2015-05-04
Also published as: KR101566402B1

Abstract

본 발명은 마이크로어레이 칩을 이용한 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV) 진단용 멀티플렉스 키트 및 흰반점바이러스를 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 흰반점바이러스의 감염 여부 뿐 만 아니라 흰반점바이러스의 유전자형을 정확하게 분석할 수 있다. 또한, 본 발명은 흰반점바이러스를 정확하게 진단할 수 있는 키트 및 방법을 제공함으로써 수산물 정밀 검역에 소요되는 시간 및 공정을 줄여줄 뿐 만 아니라 비용 면에서도 경제적인 효과를 거둘 수 있는 장점을 갖는다.

Description

마이크로어레이 칩을 이용한 흰반점바이러스 진단용 멀티플렉스 키트{Diagnostic Multiplex Kit for White Spot Syndrome Virus Using Microarray Chip}

본 발명은 마이크로어레이 칩을 이용한 흰반점바이러스 진단용 멀티플렉스 키트에 관한 것이다.

수산물 검역에 있어서 흰반점병(white spot disease, WSD)은 정밀검역 분야의 57% 비율을 차지하는 매우 중요한 수산질병이다. 흰반점병의 원인체인 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)는 대표 숙주가 새우이지만 새우 이외에도 매개체가 다양하여 어류를 제외한 대부분의 수산동물이 동 질병의 정밀 검역 대상이며, 국내에서는 흰반점병의 유입으로 대하(새우 품종) 양식이 거의 불가능한 실정이다. 흰반점병은 1993년 전북, 충남일대에서 발생한 이후 풍토병으로 정착하였으며 이로 인해 국내 양식 새우 품종이 흰다리 새우로 거의 대체된 상태이다. 새우흰반점바이러스의 진단은 OIE 매뉴얼에 따른 PCR법을 이용하고 있으나 전체 소요시간이 길어 검역에 적용하기에는 한계가 있으며 이를 극복하기 위하여 대만의 OIE 표준 실험실에서 개발한 PCR 진단키트를 수입하여 사용하고 있는 실정이다. 하지만 이 키트는 검사 단가가 매우 높아 지속적으로 사용할 시에 예산 부담에 대한 문제 발생함으로 국내에서 흰반점병에 대한 진단법을 확립하고자 하였고 마이크로어레이법을 활용하여 진단과 동시에 유전형까지 확인해 볼 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.

유전자 칩의 경우 검출하고자 하는 유전부위와 상보적인 염기서열(올리고)을 칩 위에 얹어 교잡반응을 통하여 결합을 유도하고 그 결과를 유전자 칩 스캐너(scanner)로 확인하는 진단 기법이다. 증폭된 유전 산물에 상보적인 염기를 올려 염기의 그 결합을 이용하는 실험법이기 때문에 동시에 다양한 유전자를 검출하여 더 많은 정보를 제공할 수 있는 기술이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 수산물 시료로부터 흰반점바이러스의 감염여부 및 유전자형을 정확하게 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 상기 흰반점바이러스에 특이적으로 결합 가능한 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭시킨 후, 증폭된 중합효소연쇄반응 산물에 특이적인 프로브를 혼성화하여 흰반점바이러스를 높은 감도로 진단할 수 있을 뿐만 아니라 흰반점바이러스의 유전자형을 정확하게 분석할 수 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 흰반점바이러스 진단용 멀티플렉스 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 흰반점바이러스를 진단하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제2서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1프라이머 세트;

(b) 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2프라이머 세트; 및

(c) 서열목록 제5서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제6서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3프라이머 세트를 포함하는 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV) 진단용 멀티플렉스 키트를 제공한다.

본 발명자들은 수산물 시료로부터 흰반점바이러스의 감염여부 및 유전자형을 정확하게 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 노력한 결과, 상기 흰반점바이러스에 특이적으로 결합 가능한 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭시킨 후, 증폭된 중합효소연쇄반응 산물에 특이적인 프로브를 혼성화하여 흰반점바이러스를 높은 감도로 진단할 수 있을 뿐만 아니라 흰반점바이러스의 유전자형을 정확하게 분석할 수 있다는 것을 규명하였다.

본 발명의 흰반점바이러스 진단용 프라이머 세트는 흰반점바이러스 진단에 최적화된 프라이머로서 이를 이용하면 다양한 수산물 시료로부터 흰반점바이러스 감염 여부를 진단할 수 있으며, 흰반점바이러스의 다양한 유전자형(예컨대, 태국, 베트남, 인도, 대만/중국)을 정확하게 분석할 수 있다.

본 발명자들은 흰반점바이러스의 각 유전형 마다 결손 부위가 다른 ORF14/15부위를 프라이머로 디자인하고, 이를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 흰반점바이러스의 유전형을 구분하고자 하였다.

본 발명에서 이용하는 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 프라이머의 길이는 10-50개이며, 보다 바람직하게는 10-40개이고, 보다 더 바람직하게는 15-30개이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 흰반점바이러스 진단용 키트에서 제1프라이머 세트로서 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드이며, 서열목록 제2서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제2서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 흰반점바이러스 진단용 키트에서 제2프라이머 세트로서 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드이며, 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 흰반점바이러스 진단용 키트에서 제3프라이머 세트로서 서열목록 제5서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제5서열의 올리고뉴클레오티드이며, 서열목록 제6서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열목록 제6서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 흰반점바이러스 진단용 키트는 멀티플렉스 PCR 방법을 이용한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행한 다음, 아가로오스 겔에 PCR 산물을 전기영동하여 산물의 크기를 분석함으로써 수산물 시료의 흰반점바이러스 감염 여부와 유전자형을 확인한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 제1프라이머 세트에 의해 증폭된 산물(652 bp)이 확인된 경우, 흰반점바이러스에 감염되었다고 판정하며 제2프라이머 및 제3프라이머 세트에 의해 증폭된 산물 크기를 확인하여 구체적인 유전자형을 판정한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 키트는 서열목록 제7서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브, 서열목록 제8서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브 및 서열목록 제9서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 추가적으로 포함한다.

본 발명에서 이용하는 프로브의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 용도에 따라 변화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 프로브의 길이는 10-50개이며, 보다 바람직하게는 10-40개이고, 보다 더 바람직하게는 20-35개이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 프로브는 서열목록 제7서열의 올리고뉴클레오티드, 서열목록 제8서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제9서열의 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 서열목록 제10서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브, 서열목록 제11서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브 및 서열목록 제12서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 진단 시 혼성화에 대한 양성대조구로서 서열목록 제11서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있고, 음성대조구로서 서열목록 제12서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있으며, 흰반점바이러스 진단에 대한 양성대조구로서 서열목록 제10서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 유리판, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기질 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

상기 프라이머에 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 표지(labeling)할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 흰반점바이러스 진단용 키트는 멀티플렉스 PCR 방법 및 마이크로 어레이 방법을 이용한다.

본 발명의 흰반점바이러스 진단용 멀티플렉스 키트는 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응 및 상기 중합효소연쇄반응 산물을 기질상에 고정화시킨 프로브와 반응시키는 마이크로 어레이가 결합된 멀티플렉스 키트이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 멀티플렉스 키트는 기질상(예컨대, 유리 판)에 고정화된 프로브의 상보적인 서열에 결합한 중합효소연쇄반응 산물에서 발생하는 혼성화 시그널을 검출함으로써 흰반점바이러스를 진단한다.

본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 완전 상보적(perfectly complementary)으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 흰반점바이러스를 진단하는 방법을 제공한다:

(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 분석하는 단계.

본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다;

단계 (a): 시료(sample)로부터 DNA의 준비

본 발명의 방법에 따르면, 우선 흰반점바이러스의 DNA를 포함하는 시료 또는 상기 바이러스에 감염되었는지 여부를 판단하고자 하는 시료를 준비한다. 본 발명의 시료는 수산물 시료로서 갑각류, 예를 들면, 게, 대하, 가재, 민물새우의 몸통, 꼬리, 머리, 내장 또는 추출물 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 검출방법을 이용하면 흰반점바이러스를 검출하고, 검출된 흰반점바이러스의 유전자형을 확인할 수 있다.

본 발명의 시료로부터 DNA를 준비하는 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

단계 (b): 중합효소 연쇄반응(PCR)의 수행

이어서, 상기 DNA 및 유전자 증폭반응을 위한 프라이머를 포함하는 중합효소 연쇄반응액을 제조한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

본 발명의 중합효소 연쇄반응액은 상기한 DNA 및 프라이머 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 중합효소 연쇄반응액이 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 중합효소 연쇄반응액은 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

상기 중합효소 연쇄반응액을 이용하여 원하는 DNA 서열에 대한 증폭반응을 수행한다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 올리고뉴클레오타이드 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 올리고뉴클레오타이드 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 흰반점바이러스 유전자의 존재를 조사한다.

본 발명에서 중합효소 연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 어닐링(annealing) 단계 및 신장(extension) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 본 발명에서 용어 “사이클”은 표적 핵산의 1 카피(copy)를 생성하는 과정을 의미한다. 상기 변성, 어닐링 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 중합효소 연쇄 반응은 (i) 90-100℃에서 25-35초간의 변성(denaturation) 과정, (ⅱ) 50-60℃에서 25-35초간의 어닐링(annealing) 과정 및 (ⅲ) 70-75℃에서 30-50초간 신장(extension) 과정을 20-50회 반복하는 단계를 포함한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단방법은 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제2서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제1프라이머 세트, 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제2프라이머 세트 및 서열목록 제5서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제6서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 제3프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응으로 실시된다.

단계 (c): 중합효소 연쇄반응 결과물의 분석

본 발명의 검출방법은 단계 (b)를 마친 다음, 중합효소 연쇄반응의 결과물을 분석하는 단계를 수행한다. 분석과정을 통해 중합효소 연쇄반응에서 제1프라이머 세트에 의해 원하는 크기의 DNA가 증폭된 것으로 분석되면, 시료에 흰반점바이러스가 있는 것으로 판정하며, 제2프라이머 세트 또는 제3프라이머 세트에 의해 원하는 크기의 DNA가 증폭되었는지 여부를 분석하여 흰반점바이러스의 유전자형을 판정한다. 중합효소 연쇄반응의 결과물의 분석은 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 흰반점바이러스 유전자의 존재 및 유전자형을 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 시료(samples)에서 흰반점바이러스 유전자가 증폭된 경우에는 흰반점바이러스에 감염된 것으로 진단된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시하고, 그 결과의 크기를 분석함으로써 흰반점바이러스 유전자의 존재 및 유전자형을 조사할 수 있다. PCR 산물은 PCR 조건(예컨대, 신장(extension) 시간 등)에 따라 검출 여부가 달라질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 DNA가 증폭된 경우, 652 bp의 PCR 생성물을 얻을 수 있으며 이 경우, 시료는 흰반점바이러스에 감염되었다고 판정한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 세트 및 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 각각 249 bp 및 492 bp의 PCR 생성물을 얻는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 TH라고 판단한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 249 bp의 PCR 생성물을 얻고, 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 VN이라고 판단한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 492 bp의 PCR 생성물을 얻고, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 CN이라고 판단한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 492 bp의 PCR 생성물을 얻고, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 세트 및 서열목록 제3서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 TW라고 판단한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 904 bp의 PCR 생성물을 얻고, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 세트 및 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 IN-07라고 판단한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 시료로부터 538 bp의 PCR 생성물을 얻고, 서열목록 제3서열 및 서열목록 제4서열의 프라이머 세트 및 서열목록 제5서열 및 서열목록 제6서열의 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 IN-05라고 판단한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 방법은 상기 중합효소 연쇄반응의 결과물을 본 발명의 프로브에 반응시키는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 멀티플렉스 키트에 있어서, 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다.

본 발명에서 이용 가능한 기질은 당업계에 공지된 다양한 기질을 포함한다. 기질 표면의 형상, 크기 및 화학적 조성은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 적합한 고체 기질은 예를 들어, 실리콘 와퍼, 유리, 석영, 융합 실리카, 금과 같은 금속, 플라스틱 및 중합체[예컨대, 사이클로올레핀 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스틸렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌]를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 키트에서 기질 상에 고정화된 프로브에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있다. 시료 DNA의 표지는 프라이머에 표지자를 결합시킴으로써 실시한다. 중합효소 연쇄반응의 결과물로서 표지된 시료 DNA는 마이크로어레이(기질)상의 어레이 요소(프로브)와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 프로브를 본 발명에서 이용하는 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의해 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 CG양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널 검출은 예컨대, 프라이머에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다.

본 발명의 바이오칩에 적용될 수 있는 일반적인 설명은, 미국 특허 제5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,412,087, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,889,165, 5,936,324, 5,959,098, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,147,205, 6,262,216, 6,269,846, 6,310,189 및 6,428,752호에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 프라이머 세트에 의해 증폭된 DNA 분자가 본 발명의 서열목록 제7서열, 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열의 프로브와 혼성화한 후, 그 결과로서 혼성화 시그널을 검출함으로써 흰반점바이러스의 유전자형을 구분한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열목록 제7서열의 프로브에서만 혼성화 시그널이 검출된 경우, 흰반점바이러스의 유전자형은 베트남(vietnam, VN)으로 판정한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 서열목록 제7서열 및 서열목록 제9서열의 프로브에서 혼성화 시그널이 검출된 경우, 흰반점바이러스의 유전자형은 인도-05(India-05, IN-05)로 판정한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열의 프로브에서 혼성화 시그널이 검출된 경우, 흰반점바이러스의 유전자형은 대만/중국(Taiwan/China, TW/CN)으로 판정한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 서열목록 제7서열, 서열목록 제8서열 및 서열목록 제9서열의 프로브에서 혼성화 시그널이 검출된 경우, 흰반점바이러스의 유전자형은 태국(Thailand)으로 판정한다.

본 발명에 따르면, 흰반점바이러스 진단에 대한 양성대조구인 서열목록 제10서열의 프로브에서 혼성화 시그널이 검출된 경우, 시료는 흰반점바이러스에 감염된 것으로 판정한다. 또한, 진단 시 혼성화에 대한 양성대조구로서 서열목록 제11서열을 갖는 프로브를 사용되며, 음성대조구로서 서열목록 제12서열을 갖는 프로브를 사용할 수 된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV) 진단용 멀티플렉스 키트 및 흰반점바이러스를 진단하는 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 흰반점바이러스의 감염 여부 뿐 만 아니라 흰반점바이러스의 유전자형을 정확하게 분석할 수 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 흰반점바이러스를 정확하게 진단할 수 있는 키트 및 방법을 제공함으로써 수산물 정밀 검역에 소요되는 시간 및 공정을 줄여줄 뿐 만 아니라 비용 면에서도 경제적인 효과를 거둘 수 있는 장점을 갖는다.

도 1은 새우흰반점바이러스의 유전자 칩의 모식도로 새우흰반점바이러스의 유전형에 따른 실험결과 예측도를 나타낸다.
각각의 유전형[TH(Thailand), VN(vietnam), IN-07(India-07), TW/CN(Taiwan/China), IN-05(India-05), other(only WSSV positive)]에 따라 ORF14/15의 존재 영역이 다르므로 이를 이용하여 유전형을 확인 할 수 있도록 하였다.
도 2는 표준/야외시료를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과이다.
도 3은 실제 유전형이 확인된 새우시료를 적용하여 마이크로 어레이 상에서 얻은 결과를 보여주는 그림으로 TH, IN-05, TW 및 other에 대한 실험 결과이다. 실제 염기서열 분석을 통해서 유전형이 확인된 시료를 이용하여 마이크로 어레이 상에서 그 결과가 일치하는 지에 대해서 확인하였고 염기서열 분석과 동일한 결과가 나옴을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)는 중국, 태국, 타이완 3개 유전형에 대한 염기서열 분석이 모두 완료되었고 이를 바탕으로 다양한 종류의 유전형이 지속적으로 보고되고 있다. 위의 유전형에 대한 염기를 분석해 본 결과 2개의 커다란 결손 부위가 보고되었는데 이 중 하나가 ORF14/15 지역이다. 결손 부위의 크기가 유전형에 따라 다른 것을 바탕으로 각각의 유전형을 확인해 볼 수 있도록 마이크로 어레이 칩을 설계하였다. OIE 진단법에서 사용 중인 ORF167지역과 ORF14/15 2개 지역에 대한 프라이머를 이용하여 3개의 증폭 산물을 이용하여 유전형을 확인할 수 있도록 멀티플렉스 PCR 키트를 제작하였다. PCR 증폭 후 마이크로 어레이 칩 위에 고정된 올리고와 교잡하여 그 결과를 스캔하여 결과를 분석하였다.

흰반점바이러스의 검출은 멀티플렉스 PCR로 3개의 염기를 동시에 증폭하는 방법을 이용하였다. 첫 번째 증폭산물은 흰반점바이러스의 검출 시 널리 활용되고 있는 ORF167 유전자로 OIE의 진단법에서 검출되는 부위이다. 두 번째 및 세 번째 증폭산물은 ORF14/15 지역을 중심으로 각 유전형에 따라서 증폭 산물의 사이즈가 다르게 설계하였고, 이를 활용하여 유전자 칩 상에서의 교잡 여부에 따라 유전형을 확인할 수 있도록 하였다. 또한 유전자 칩 상에서 결과를 확인 할 수 있도록 프라이머(primer)제작 시 Cy5 다이(dye)를 붙여 유전자 칩 상에서 스캔이 가능하도록 하였다.

실험법은 다음과 같다. 감염이 의심되는 수산물 시료의 DNA를 추출하고 이를 이용하여 위에서 언급한 멀티플렉스 PCR을 수행한다.

시료의 경우 10% 유제액이 되도록 1x PBS를 이용하여 조직유제액을 만들고 여기서 300 ㎕의 유제액을 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 바이러스 유전자 스핀 DNA/RNA 추출 키트(intron, 한국)를 이용하였다. 300 ㎕의 유제액에 500 ㎕의 바이러스 유전자 스핀 버퍼를 넣고 15초간 잘 혼합한 후, 상온에서 10분간 반응하고, 700 ㎕의 바인딩 버퍼를 넣고 잘 혼합하였다. 스핀 컬럼에 용해물을 넣고 13,000rpm에서 1분간 원심분리하고, 컬렉션 튜브에 내려간 용액을 버리고, 나머지를 다시 스핀 컬럼에 넣어서 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 컬렉션 튜브에 내려간 용액을 버리고 500 ㎕의 세척 버퍼 A를 넣고 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 컬렉션 튜브에 내려간 용액은 버리고 500 ㎕의 세척 버퍼 B를 넣고 다시 13,000rpm에서 1분간 원심분리 후 용액을 버리고 13,000rpm에서 3분간 원심분리하여 남은 에탄올을 모두 제거하였다. 50 ㎕의 용출 버퍼를 넣고 상온에서 1분간 반응한 후 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 추출한 DNA는 -20℃에 보관하고, 실험에 이용하였다.

추출한 DNA 5 μl를 제공된 PCR 믹스(PCR premix, Intron, 한국)와 섞고 95℃ 3분간 반응 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 40초로 40 사이클을 실행하고 최종적으로 72℃에서 5분간 반응 후 종료하였다. 유전자 칩을 꺼내서 준비하고 각 웰에 대하여 교잡용액(SSC 버퍼, Tween20, 포름아마이드)을 20 μl씩 넣어준 뒤 그 위에 증폭산물 10 μl를 넣어 잘 혼합하였다. 48℃에서 한 시간 반응하고 미리 준비한 세척액 I(SC 버퍼, TW20)을 충분히 잠기도록 넣어 주고(약 10 ml) 1분간 세척을 실시하였다. 세척액 I을 이용한 세척을 1회 반복하며 이때에 슬라이드 위에 얹어져 있는 웰 플라스틱을 핀셋을 이용하여 제거하였다. 세척액 II(SSC 버퍼)를 10 ml 넣고 1분간 세척 한 후 슬라이드 글라스 원심분리기를 이용하여 건조시키고 레이저 스캐너(Luxscan 10K, Biocapital)를 이용하여 결과를 판독하였다. 마이크로 칩 결과 분석을 통하여 흰반점바이러스의 감염 여부 및 유전형에 대한 정보를 확인하였다.

흰반점바이러스의 검출 및 유전형을 분석할 수 있는 프라이머를 표 1과 같이 디자인하고, 이를 이용한 각 유전형 별 PCR 검출법을 확립하였다(도 1).

멀티플렉스 프라이머 서열

No.	프라이머명	프라이머 서열(5’-3’)	PCR 결과물 크기	타겟 유전자
1	J1000F	CCTCTCCAACTCTGGCATGAC	652	ORF167
	J1002R	TGCACCTTGTTCGGCGTTCT
2	J990F	AGCTGGTTTCATACCTCCCTTG	492	ORF14/15
	J992R	ATAATGGAGGCGAGACTTGC
3	J997F	TCTCTCCCGTTAATGACGTAG	249	ORF14/15
	J987R	CTGCAGGAGCTCAAAGGAC

멀티플렉스 PCR 결과로 예측되는 PCR 산물의 크기 및 유전자형

WSSV Strain	WSSV ORF14/15			WSSV ORF167
WSSV Strain	J990F/J992R	J997F/J987R	J990F/J987R	J1000F/J1002R
TH	249bp	492bp	1172bp* (candidate)	652bp
VN	249bp	-	-	652bp
CN	-	492bp	1357bp* (candidate)	652bp
TW	-	492bp	-	652bp
IN-07	-	-	904bp* (candidate)	652bp
IN-05	-	-	538bp	652bp

*, PCR 산물이 1 kb 이상 신장 가능한 PCR 조건에서 확인 가능.

표 1의 프라이머를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하고 결과물로써 PCR 반응물의 사이즈를 분석함으로써, 흰반점바이러스를 검출하고 이의 유전자형을 검출할 수 있다(표 2). 표 2에 기재된 PCR 산물은 이상적인 PCR 조건 하에서 검출 가능한 것으로 PCR 조건(예컨대, 신장(extension) 시간 등)에 따라 검출 여부가 달라질 수 있다.

표 2에 기재된 바와 같이, J1000F 및 J1002R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 DNA가 증폭된 경우, 652 bp의 PCR 생성물을 얻을 수 있으며 이 경우, 시료는 흰반점바이러스에 감염되었다고 판정한다.

J990F-J992R 프라이머 세트 및 J997F-J987R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 각각 249 bp, 492 bp의 PCR 생성물을 얻는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 TH라고 판단한다.

J990F-J992R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 249 bp의 PCR 생성물을 얻고, J997F-J987R 프라이머 세트 및 J990F-J987R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 VN이라고 판단한다.

J997F-J987R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 492 bp의 PCR 생성물을 얻고, J990F-J992R 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 CN이라고 판단한다.

J997F-J987R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 492 bp의 PCR 생성물을 얻고, J990F-J992R 프라이머 세트 및 J990F-J987R 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 TW라고 판단한다.

J990F-J987R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 904 bp의 PCR 생성물을 얻고, J990F-J992R 프라이머 세트 및 J997F-J987R 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 IN-07라고 판단한다.

J990F-J987R 프라이머 세트에 의해 시료로부터 538 bp의 PCR 생성물을 얻고, J990F-J992R 프라이머 세트 및 J997F-J987R 프라이머 세트에 의해 PCR 생성물을 얻지 못하는 경우, 흰반점바이러스에 감염된 시료의 유전자형은 IN-05라고 판단한다.

표준/야외 시료를 사용하여 PCR을 실시하고, 결과물로부터 흰반점바이러스의 유전자형을 판별한 결과는 도 3과 같다. 표준/야외시료 중 OIE 샘플에서는 PCR 결과, 652 bp, 492 bp 및 249 bp의 PCR 생성물이 검출되어 흰반점바이러스의 유전자형을 TH로 판정하였다.

표준/야외시료의 #48에서는 PCR 결과, 652 bp 및 538 bp의 PCR 생성물이 검출되어 흰반점바이러스의 유전자형을 IN-05로 판정하였다. 표준/야외시료의 #2B에서는 PCR 결과, 652 bp 및 492 bp의 PCR 생성물이 검출되어 흰반점바이러스의 유전자형을 TW로 판정하였다.

흰반점바이러스의 ORF14/15 유전자에 상보적인 염기서열을 포함하는 프로브 서열은 표 3과 같으며, 표 3의 서열로 제작된 프로브는 마이크로 어레이 칩에 삽입된다. 멀티플렉스 PCR 산물을 마이크로 어레이 칩과 반응하게 한 후, 결과를 분석한 결과, 흰반점바이러스의 유전형을 효과적으로 정확하게 확인할 수 있었다(도 3).

마이크로 어레이 프로브 서열

No.	섹션	서열(5'-3')
1	타이핑	GGGGGGGGG TTTAAACGAATATCATGAAAAGCAC
5	타이핑	GGGGGGGGG TTTAGAGTAAAATGTGATGACCAAG
6	타이핑	GGGGGGGGG ATTGATTGAAAATCTTCACATGAGTG
8	일반	GGGGGGGGG TCCTAGTACACTTCTTGCATTATTTG
H	대조군	GGGGGGGGG TTTGTCATGCCAGAGTTGGAGAGG
n	대조군	GGGGGGGGG AAAGCTGCTGCTCGTCGTCGTCGT

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> Diagnostic Multiplex Kit for White Spot Syndrome Virus <130> PN130561 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1 forward <400> 1 cctctccaac tctggcatga c 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 1 reverse <400> 2 tgcaccttgt tcggcgttct 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2 forward <400> 3 agctggtttc atacctccct tg 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 2 reverse <400> 4 ataatggagg cgagacttgc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3 forward <400> 5 tctctcccgt taatgacgta g 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer set 3 reverse <400> 6 ctgcaggagc tcaaaggac 19 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Typing probe 1 <400> 7 gggggggggt ttaaacgaat atcatgaaaa gcac 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Typing probe 5 <400> 8 gggggggggt ttagagtaaa atgtgatgac caag 34 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Typing probe 6 <400> 9 ggggggggga ttgattgaaa atcttcacat gagtg 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Typing probe 6 <400> 10 gggggggggt cctagtacac ttcttgcatt atttg 35 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive control probe <400> 11 gggggggggt ttgtcatgcc agagttggag agg 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative control probe <400> 12 ggggggggga aagctgctgc tcgtcgtcgt cgt 33

Claims

(a) 서열목록 제1서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제2서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1프라이머 세트;
(b) 서열목록 제3서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2프라이머 세트; 및
(c) 서열목록 제5서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제6서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3프라이머 세트를 포함하는 흰반점바이러스(white spot syndrome virus, WSSV) 진단용 멀티플렉스 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제7서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브, 서열목록 제8서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브 및 서열목록 제9서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 추가적으로 포함하는 멀티플렉스 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 제1프라이머 세트는 서열목록 제1서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제2서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 제2프라이머 세트는 서열목록 제3서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제4서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 제3프라이머 세트는 서열목록 제5서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제6서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 프로브는 서열목록 제7서열의 올리고뉴클레오티드, 서열목록 제8서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제9서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제10서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브, 서열목록 제11서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브 및 서열목록 제12서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
제 7 항에 있어서, 상기 프로브는 서열목록 제10서열의 올리고뉴클레오티드, 서열목록 제11서열의 올리고뉴클레오티드 및 서열목록 제12서열의 올리고뉴클레오티드로 구성된 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
제 2 항 및 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 기체(substrate) 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 프라이머로서 올리고뉴클레오티드는 표지된 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 멀티플렉스 키트.
다음의 단계를 포함하는 흰반점바이러스를 진단하는 방법:
(a) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 키트에 포함된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 분석하는 단계.
제 11 항에 있어서, 상기 진단 방법은 상기 단계 (b)의 결과물을 제 2 항 및 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 키트에 포함된 프로브에 반응시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.