CN1869224A - 基因突变类型及基因测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了中国人肝豆状核变性(Wilson’sdisease，WD)患者ATP7B基因的突变及分布特征，建立了利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测Wilson病基因突变位点的方法，其包括以下步骤：提取DNA样本；进行引物设计；进行PCR扩增；取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性条件下进行突变检测分析；对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后，直接测序以确认突变或多态位点；对DHPLC检测阴性的标本，将其与野生型样品等比例混合，经过变性－复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型。
Description
技术领域
本发明涉及到基因及其检测方法，特别涉及肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson’s Disease，WD)基因突变类型及突变位点的检测方法。
背景技术
肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson’s Disease，WD)是一种伴随铜代谢障碍的常染色体隐性遗传性疾病，国外的流行病学调查资料显示，其患病率为1.5-3.0/10万，基因频率为0.3％-0.7％，杂合子频率估计1/100。本病在我国尚无大宗资料的流行病学报告，根据中山医科大学第一附属医院神经科1981-1991年神经遗传专科门诊初诊病例分析，Wilson病居全部单基因遗传病的第二位。
1912年，英国神经病学家Wilson首次报道了一个由7个患者组成的家系，其主要症状为伴随有豆状核变性肝硬化的多系统疾病。同年，Fleischer又进一步详细描述了该病同时会出现角膜色素沉着、精神症状及肝硬化。目前公认的Wilson病的临床症状主要表现为肝硬化、神经精神系统功能障碍、角膜色素环(Kayser-Fleischerring，KF环)及肾功能异常等。
1948年，Cumings在病人的肝和脑中检测到了大量的金属铜离子，从而确定了铜在Wilson病中的致病作用，以上症状均系由铜在体内蓄积所致。4年后，Scheinberg和Gitlin报道了Wilson病人的血清铜蓝蛋白缺乏，这一发现为Wilson病的实验室诊断方法奠定了基础。
1960年，Bearn通过研究证实了Wilson病为常染色体隐性遗传病；1985年，Frydman等通过连锁分析发现WD基因与esterase D基因紧密连锁，从而将其定位于13q14.3；1993年，WD基因被成功克隆，它基因全长约80kb，含有21个外显子和20个内含子，其cDNA编码一种相对分子质量为159KD的由1411个氨基酸组成的P型铜转运ATP酶(ATP7Base)，所以，WD基因又被称为ATP7B基因。
Wilson病是由于铜代谢障碍引起的，但铜代谢障碍的原因尚未完全阐明，但从分子发病机制来看，目前WD基因突变的致病机理得到了广泛的认可。1993年以来的分子生物学研究表明，由于WD基因发生突变，其编码的P型ATP酶(也称ATP7B)发生功能改变，ATP7B的功能主要是负责铜转运，若其功能部分或全部丧失，就不能将多余的铜离子从细胞内转运出去，使铜离子在特定的器官和组织沉积而致病。可见，ATP7B基因的异常是导致Wilson病的重要因素，所以寻找ATP7B基因(即WD基因)突变位点成为诊断和研究Wilson病的关键。目前，国内外已发现ATP7B基因突变200余种，详细资料可见HUGO Database(http://www.uofa-medical-genetics.org/wilson/index.html)或HumanGene Mutation Database，这些突变位点几乎分布于WD基因的各个外显子，甚至有的还分布在内含子或剪接区内，突变类型包括错义突变、无义突变、缺失和插入等，并且在不同地域人群中所发现的热点突变区明显不同。
1995年，加拿大学者Thomas在对34个北欧裔(共研究了58个WD患者，其中34个是北欧裔)WD患者的基因突变研究中，发现His1069Gln(位于第14外显子)和Gly1266Lys(位于第18外显子)的突变频率(以染色体数计)分别为28％和10％，而其他外显子仅有1％-3％的突变率，初步表明第14和第18外显子为北欧裔WD患者的高频率突变点(Thomas GR，Forbes JR，Roberts EA，etal.The Wilson disease gene：spectrum of mutations and theirconsequences.Nat Genet，1995，9：210-217)。此后，多位学者检测到His1069Gln的突变，尤其波兰人该突变频率高达70％以上(Czlonkowska A，Rodo M，Gajda J，et al.Very high frequency of theHis1069Gln mutation in Polish Wilson disease patients.J Neurol，1997，244：591-592)，进一步说明该突变是北欧裔WD患者的突变热点。另外，奥地利和东德的His1069Gln突变频率为60％(Maier-Dobersberger T，Ferenci P，Polli C，et al.Detection of theHis1069Gln mutation in Wilson disease by rapid polymerase chainreaction.Ann Int Med，1997，127：21-26)，因此，可以认为欧洲血统中Wilson病的基因突变绝大部分来自His1069Gln。与此截然相反，在印度、亚洲和意大利撒丁岛人群中，His1069Gln突变极少出现，撒丁岛Wilson病人中常出现WD基因5’-UTR区15个碱基的缺失，该突变频率高达60％以上(Morris PA，Curtis D，Quarrell OW，et al.Screening for the common mutation His1069Gln in the Wilson’sdisease gene.Ger J Gastroenterol，1995，8：476；Figus A，Angius A，Loudianos G，et al.Molecular pathology and haplotype analysis ofWilson disease in Mediterranean populations.Am J Hum Genet，1995，57：1318-1324；Loudianos G，Dessi V，Lovicu M，et al.Molecularcharacterization of Wilson disease in Sardinian population-evidence ofa founder effect.Hum Mutat，1999，14：294-303)。
值得一提的是，Thomas对仅有的两名来自香港WD患者的研究显示，他们的WD基因上都存在Arg778Leu纯合突变，而这一突变在所研究的北欧裔及其他种族中从未出现。这一发现提示东方与西方人在WD基因突变形式上有所不同，并在WD发病的分子遗传学方面可能存在差异。
1996年，台湾学者Chuang(Chuang LM，Wu HP，Jang MH，et al.High frequency of two mutations in codon 778 in exon 8 of the ATP7Bgene in Taiwanese families with Wilson disease.J Med Genet，1996，33：521-523)在对22个无血缘关系的WD患者的研究中，发现有27％的患者在WD基因778密码子上存在突变，且突变形式有两种即Arg778Leu和Arg778Gln，突变率分别为11.4％和9.1％。另外，他们最先报道了在第8外显子还存在一种多态位点即C2310G。以后，国内外学者相继开始对WD基因进行了突变分析，目前的研究结果显示，第8外显子Arg778Leu突变频率为11.4％-37.5％已被公认为是中国人的高频突变点，同时，日本和韩国的研究结果也表明Arg778Leu是高频突变点；而其他外显子中只有第12外显子Thr935Met的突变率达6.3％-10.0％，所以，有的学者认为第12外显子可以看作是中国人第二个突变热点。
根据国外文献报道，在所有已发现的WD基因突变中，50％以上的是罕见的突变类型，并且大部分突变是复合杂合型，也就是说，WD基因具有广谱突变的特点，突变类型繁多，并且一个Wilson病人往往存在两个位点的杂合突变。另外，Wilson病的临床表现也有不同，有的表现为肝病型，有的表现为神经系统型，有的则为复合型，这一特点说明了Wilson病具有明显的遗传异质性，因此，在进行基因型与临床表型的关系分析时，将遇到极大的困难。
Wilson病是常见的神经系统遗传病，发病年龄一般在青少年，是目前少数几个治疗效果较好的遗传代谢病之一，但其治疗效果与治疗的时期有很大关系，如果能够早期诊断、早期治疗，则可以达到良好的预后效果。以往，只能依据临床表现和铜代谢指标进行诊断，错过了对症状前患者的早期诊断和治疗。因此，早期诊断是改善本病预后的关键。近年来，随着分子生物学技术的发展，尤其是ATP7B基因的定位及克隆，使Wilson病的早期诊断成为可能。
20世纪90年代初期，通过限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)和短串联重复序列(shorttandem repeat，STR)多态进行的家系连锁分析，成为常用的基因诊断方法，选用的微卫星标记有D13S314，D13S316，D13S133，D13S301，D13S296，D13S297，D13S298等。虽然家系连锁分析可以对症状前患者进行早期诊断，但却受家族史的限制，而且作为一种间接的诊断方法并不能检出WD致病突变，并受到重组风险及多态信息含量等因素的影响。
直接检测WD基因致病突变是进行Wilson病基因诊断最可靠的方法。所以，直接对WD基因编码区进行扩增并检测突变，成为目前应用最多的方法。其中包括聚合酶链反应-单链构像多态性(PCR-SSCP)技术、PCR-酶切法和直接测序。
1989年，日本学者Orita首次报道了PCR-SSCP技术，其原理是双链DNA变性的单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率随其构象改变的性质，可检出小至一个碱基顺序的差异。SSCP技术虽然简单且费用低廉，但是费时费力，操作繁琐，不适合大样本筛查，对技术人员熟练程度要求较高，且易出现假阳性和假阴性结果，准确率为70％左右。直接测序的方法则避免了以上缺陷，尤其机械化自动化的实现，使测序工作更加简便快捷，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，成为检测基因突变最可靠的方法。然而，测序费用不菲，如果对每个病例都进行测序，则需要有大笔的经费支持，且应考虑患者是否能够承受。可以说，测序不是一项十分经济的诊断方法并不太适用于临床。PCR-酶切法分析基因突变虽然方便快速成本低，但要求所分析的突变必须是已知突变且有适宜的酶切位点，此技术的局限性决定了它不能适用于进行大样本突变筛查。随着荧光PCR仪的出现，有的学者利用此技术进行WD基因突变检测，但是其缺点依然是只能筛查已知突变位点且需要设计针对特异突变的探针。
变性高效液相色谱(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)技术是20世纪90年代末开发的一项新技术，其原理基于离子对反向高效液相色谱法，在DNA部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物分别形成同源双链和异源双链，异源双链与同源双链熔解温度(melting temperature，Tm)的差异使其在固定相中停留的时间不同，形成不同的色谱峰，从而将野生型与突变型有效地区分开，之后，进行有目的地测序以确认突变位点。目前，这一技术在肿瘤基因筛查方面得到很好的应用，它具有快速、敏感、准确且经济的特点，减少了盲目测序带来的不必要的支出，适用于筛查大样本已知及未知突变。
发明内容
为了解决上述问题，本发明目的在于分析中国人肝豆状核变性(Wilson’s disease，WD)患者ATP7B基因的突变及分布特征，建立利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测Wilson病基因突变位点的方法。
根据本发明的第一方面提供的WD基因突变类型，是外显子Exon3中的Gln511Term。
根据本发明的第二方面提供的WD基因突变类型，是外显子Exon3中的Gly515Val。
根据本发明的第三方面提供的WD基因突变类型，外显子Exon8中的2305InsC。
根据本发明的第四方面提供的WD基因突变类型，是内含子IVS8中的2355-2A＞G。
根据本发明的第五方面提供的WD基因突变类型，是外显子Exon12中的2806delTTG。
根据本发明的第六方面提供的WD基因突变类型，是外显子Exon12中的2816InsA。
根据本发明的第七方面提供的WD基因突变类型，是外显子Exon13中的Ser975Tyr。
根据本发明的第八方面提供的WD基因突变类型，是外显子Exon13中的Cys980Tyr。
根据本发明的第九方面提供的WD基因突变类型，是外显子Exon21中的4154InsG。
根据本发明的第十方面提供的WD基因多态类型，是5’-UTR中的-134InsGGCTC。
根据本发明的第十一方面提供的WD基因多态类型，是内含子IVS12中的2866-13C＞G。
根据本发明的第十二方面提供的WD基因多态类型，是外显子Exon15中的Ala1135Thr。
根据本发明的第十三方面提供的检测WD基因突变类型或多态类型的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：提取DNA样本；步骤2：进行引物设计；步骤3：进行PCR扩增；步骤4：取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性条件下进行突变检测分析；步骤5：对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后，直接测序以确认突变或多态位点；对DHPLC检测阴性的标本，将其与野生型样品等比例混合，经过变性-复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型。
根据本发明全面了解中国人Wilson病患者WD基因的突变特征。WD基因的突变形式繁多，突变几乎分散在各个外显子，形成了广谱突变的特征，且纯合突变很少，大部分为复合杂合型。
根据本发明建立DHPLC技术检测WD基因突变方法并探讨其临床应用价值，为将来基因诊断奠定基础。
附图说明
图1为根据本发明的检测框图；
图2为外显子Exon2的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；
图3为外显子Exon3的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；
图4为外显子Exon5的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；
图5为外显子Exon7的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；
图6和图7分别为外显子Exon8的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；
图8为外显子Exon9的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；
图9为外显子Exon12的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；
图10为外显子Exon13的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果；以及
图11为外显子Exon18的基因突变类型的DHPLC检测结果及相应的基因测序结果。
具体实施方式
图1所示为根据本发明的检测框图。在本发明的实施形式中，首先将符合Wilson病临床诊断标准的患者入选，并选择健康对照组。
本发明的检测中国人WD基因突变类型及基因多态类型的方法包括以下步骤：
步骤1：提取DNA样本，抽取Wilson病患者和正常人的静脉血，利用盐析法从血液白细胞中提取基因组DNA，并进行定量和纯化。
步骤2：进行引物设计，对于第1外显子的引物、第4外显子的引物WD4R、以及第13外显子的引物WD13F-n根据Genebank公布的ATP7B基因序列，应用Primer-primer和Oligo软件自行设计引物，其它引物序列参考文献。
步骤3：进行PCR扩增，对各个外显子进行聚合酶链反应，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相。如为相应长度的单一PCR扩增条带，即认为扩增成功，待DHPLC检测。
步骤4：取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性条件下进行突变检测分析，应用Transgenomic公司WAVE-DNA核酸片段分析仪，经WAVE MAKER软件分析扩增的WD基因21个外显子片段，得到相应Tm值及洗脱条件，选择合适的柱温，取扩增产物进行DHPLC检测。
目前对于未知基因突变的筛查技术包括：直接测序(directsequence，DS)、单链构象多态性(single-strand conformationpolymorphism，SSCP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)等。但是，这些技术均存在一定的局限性，如广泛应用的SSCP方法虽然简单，但敏感性较低。相对来说，DHPLC技术是一种经济，可以大规模、自动化筛查未知突变的有效方法，它是在SSCP和DGGE基础上发展起来的一种新的杂合双链突变检测技术，其原理是通过DHPLC在部分变性的条件下，将发生错配的异源杂合双链DNA与完全匹配的同源双链DNA分离开来。
所有基因组DNA的单拷贝，均可通过PCR反应大量扩增，杂合子个体的DNA经扩增产生杂合二倍体，它与纯合子个体的DNA扩增产物完全匹配的纯合二倍体的解链特征不同，在部分加热变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在分离柱中保留时间(retentiontime)的差异，而发现DNA的突变，即DNA通过疏水作用与柱子结合的能力随温度的升高(50-65℃)而变化，在乙腈(acetonitrile)(由美国Fisher提供，色谱纯)梯度增加时，DNA将从柱子中被洗脱出来，异源双链(杂合二倍体)将先于同源双链(纯合二倍体)被洗脱出来，据此可用于检测反向柱中单个碱基置换、插入或缺失杂合二倍体的片段。在绝大多数情况下，异源双链的存在表现为色谱峰数目的改变，由野生型的单峰变为2、3或4个峰，不过大多数变异呈双峰。
DHPLC检测技术的主要特点是：1.高通量检测：应用于大样本及多外显子的检测，本发明对WD基因进行筛查，因外显子数量多，直接测序检测费用过高，可行性差，也较难应用于临床，使用DHPLC进行筛查大大降低了实验成本，加快了实验进度；2.自动化程度高：全自动进样设备减轻了劳动强度，检测一个样品仅需8分钟，提高了检测效率；3.灵敏度和特异性较高：与直接测序结果相当，尤其在变异等位基因频率较低的情况下，DHPLC的检出率更高，Kwok等研究表明，变异等位基因频率在20％时，DHPLC的检出率为100％，而直接测序仅为80％。
步骤5：对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后，直接测序以确认突变或多态位点；对DHPLC检测阴性的标本，将其与野生型样品等比例混合，经过变性-复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型。
另外，在另一样本中验证该方法的敏感性和特异性。
通过上述各个步骤，明确中国人WD基因突变分布特点，建立依据DHPLC的检测方法。
为了便于理解，下面的实施例对WD的DHPLC的基因测序方法及基因突变类型及多态类型进行了具体描述，应该注意到它不是对发明的限制。
实施例
本发明首先选取三组人群为研究对象，分别为：
1.Wilson病患者：50例Wilson病患者来自中山大学第一附属医院神经内科，其临床诊断标准为(1)肝病史或肝病征/锥体外系病征；(2)血清铜蓝蛋白显著降低和/或肝铜增高；(3)角膜K-F环阳性；(4)阳性家族史。符合以上(1)(2)(3)或(1)(2)(4)条即临床确诊为Wilson病。
2.正常对照组：50例健康对照组均来自首都医科大学宣武医院神经内科和流行病学调查研究的健康查体者，无神经系统遗传病和精神病、无神经系统疾病家族史。年龄、性别与Wilson病患者相匹配。
3.青岛市计划生育研究所提供的24例临床诊断为Wilson病患者的DNA样本。
下面详细说明各个步骤的具体内容：
步骤1提取DNA样本
在本步骤中所使用的试剂为：
蛋白酶K，由美国Sigma提供，规格20mg/ml，100mg蛋白酶K溶于5ml高压去离子水中，分装，-20℃保存备用。
红细胞裂解液，自配，将氯化铵78g、碳酸氢铵8g、EDTA18g溶解至1000ml蒸馏水中，PH调定至7.8，使用时稀释10倍，4℃保存。
白细胞裂解液，自配，将10mmol/L Tris Cl(pH 7.6)、2mmol/LEDTA、400mmol/L NaCl稀释至1000ml。
饱和酚，自配，在国产重蒸酚中，加入0.1g/100ml 8-羟基喹啉，以等体积1mol/L Tris·Cl(pH 8.0)抽提二次，继续以0.5mol/L Tris·Cl(pH 8.0)抽提一次，至上层水相pH 7.6，4℃避光保存。
氯仿(三氯甲烷)，由北京化学试剂厂提供，分析纯。
异戊醇，由北京化学试剂厂提供，分析纯。
Tris·Base，由美国promega提供。
3mol/L乙酸钠(pH 5.2)，由北京化学试剂厂提供，分析纯，在100ml去离子水中溶解51.0g无水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加去离子水定容至125ml，高压灭菌后室温保存。
氯化钠，由北京化学试剂厂提供，分析纯，29.2g NaCl溶于80ml去离子水中，加热溶解，定容至100ml，高压灭菌后室温保存。
饱和氯化钠，由北京化学试剂厂提供，分析纯，NaCl 146.2g溶解至500ml蒸馏水中。
10％十二烷基硫酸钠(SDS)，由北京化学试剂厂提供，分析纯，900ml高压去离子水溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节pH至7.2，加水定容至1L。
0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，由北京化学试剂厂提供，分析纯，称取186.1g EDTA·2Na，加去离子水800ml溶解，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，NaOH调节pH值至8.0，定容至1L，分装，高压灭菌备用。
1)提取人类基因组DNA
抽取Wilson病患者和正常人的静脉血，参考《分子克隆》，利用盐析法从血液白细胞中提取基因组DNA，具体步骤如下：
(1)肘静脉血5～10ml，3.2％枸橼酸钠0.5～1ml(1∶9)抗凝；
(2)将装有抗凝血的15ml离心管离心3000转/分15分钟，弃上层血浆；
(3)加入两倍体积红细胞裂解液，混匀静置20分钟，离心3000转/分15分钟后，弃上清液；
(4)重复第三步2次，分离出白细胞；
(5)加入白细胞裂解液3ml、10％SDS 200μl、蛋白酶K 200μl，55℃裂解过夜；
(6)加入饱和NaCl 1ml，混匀后离心3000转/分15分钟，取出上清液；
(7)加入两倍体积的无水乙醇，轻摇数次后可见DNA析出，吸出DNA；
(8)75％乙醇清洗DNA两次，放置烘箱中烘烤30分钟；
(9)加500μl去离子水，将DNA充分溶解；
(10)加入500μl酚/氯仿，混匀后离心10000转/分15分钟，吸出上清液，加入2倍体积无水乙醇，轻摇后吸出DNA；
(11)加入TE 500μl充分溶解，置于-80℃冰箱保存。对被检测者采取肘静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝)，4℃保存，两周内用以下方法提取DNA备用。
2)DNA的定量
具体步骤如下：
(1)取5μl完全溶解的DNA，加去离子水至500μl，混匀，转移到比色杯中；
(2)用紫外分光光度计比色，波长分别置于260nm和280nm，记录光密度值(OD260和OD280值)，OD260的读数用于计算核酸浓度，OD260与OD280的比值代表DNA的纯度；
(3)1个OD260值相当于50μg/ml DNA，故DNA的含量计算公式为：OD260×50μg/ml×100(稀释倍数)；
(4)DNA纯度＝OD260/OD280，若比值＜1.6，表明DNA样品中含有蛋白质，需重新纯化；若比值＞2.0，表明样品中含有RNA，可用RNA酶进行处理。
3)DNA的纯化
加入20μl蛋白酶K(10mg/ml)于DNA溶液中，42℃水浴震荡4小时，加等体积酚混匀5分钟，12000转/分离心5分钟，取上层水相，加等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，12000转/分离心5分钟，取上层水相，加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，12000转/分离心10分钟，取上层水相，加1/2体积的3M NaAc及2倍体积的冰冻无水乙醇，混匀沉淀DNA，用吸管将透明絮状DNA吸出，转移至1.5ml离心管中，70％乙醇洗涤2次，10000转/分离心30分钟，弃上清，于室温自然干燥DNA后，加适当体积的TE重新溶解DNA。
步骤2引物设计
对于第1外显子的引物、第4外显子的引物WD4R、以及第13外显子的引物WD13F-n根据Genebank公布的ATP7B基因序列，应用Primer-primer和Oligo软件自行设计引物，其它引物序列参考文献Thomas GR，Forbes JR，Roberts EA，et al.The Wilson diseasegene：spectrum of mutations and their consequences.Nat Genet，1995，9：210-217，由上海生工生物技术服务有限公司合成。
Exon1：WD1e1 CGC AAC TTT GAA TCA TCC GT；
WD1e2 AAC GCG GGG AGG AAA ATC CT；
Exon2-1：WD2e1 GTT TCA AGG TTA AAA AAT GT；
WD2e2 GGC ACA TAT TTC ACA GTG G；
Exon2-2：WD2e3 GGC CAC CAG CAC AGT C；
WD2e4 CTG GGC AGG CAA GGA C；
Exon2-3：WD2e5 GAG GCC AGC ATT GCA GA；
WD2e6 AGC CAC TTT GCT CTT GAT G；
Exon2-4：WD2e7 ATG ACA TGG GAT TTG AAG；
WD2e8 TCC GAC AGG AAG AGA AAC；
Exon2-5：WD2e9 GCC CAA GTA AAG TAT GAC CC；
WD2e10 GAC ACC GAT ATT TGC TGC AC；
Exon2-6：WD2e11 GGC ACA TGC AGT ACC ACT CT；
WD2e12 AGG GCT ACC TAT ACA CCA TCC；
Exon3：WD3F GAT ATT TCT GAC ATT TTA TCC；
WD3R GCA GCA TTC CTA AGT TCA；
Exon4：WD4F CCA CCC AGA GTG TTA CAG CC；
WD4R GTA ACG CAC CCA CAG TAC TTA C；
Exon5：WD5A CCT GGG TCT GTG GGA TTC T；
WD5B AAA GGT GAC TAC AAT TTT TAA TGA；
Exon6：WD6F CTG CCA ATG CAT ATT TTA AC；
WD6R GGT AGA GGA AGG GAC TTA GA；
Exon7：WD7F TGT AAT CCA GGT GAC AAG CAG；
WD7R CAC AGC ATG GAA GGG AGA G；
Exon8：WD8A AAC CCT TCA CTG TCC TTG TC；
WD8B AGG CAG CTC TTT TCT GAA C；
Exon9：WD9F TTT CGA TAG CTC TCA TTT CAC A；
WD9R TGC CCA CAC TCA CAA GGT C；
Exon10：WD10F AGT CGC CAT GTA AGT GAT AA；
WD10R CTG AGG GAA CAT GAA ACA A；
Exon11：WD11F CTG TCA GGT CAC ATA GTG CT；
WD11R TTT CCC AGA ACT CTT CAC A；
Exon12：WD12F CTT GTG GTG TTT TAT TTC TTC；
WD12R ACC ACC ATA TAG CCC AAG；
Exon13：WD13F TGA ACT CTC AAC CTG CCT；
WD13R TCT CAG ATG GGA AAG CCG；WD13F-n CCA ACAAGC ACA TCT CCC AG；
Exon14：WD14A TCC ATC TGT ATT GTG GTC AG；
WD14B CAG CTA GGA GAG AAG GAC AT；
Exon15：WD15F CTT TCA CTT CAC CCC TCT；
WD15R AGC TGA CAG AGA CAA AAG C；
Exon16：WD16F CCA TTT AGA AAT AAC CAC AG；
WD16R AGG AAG GCA GAA GCA GA；
Exon17：WD17F CAA GTG TGG TAT CTT GGT G；
WD17R CTG GTG CTT ACT TTT GTC TC；
Exon18：WD18A ACC TTT TGC CAA CAC TAG CAT；
WD18B TCC CAG CAC CCA CAG CC；
Exon19：WD19F GGC AGA CCC CTT CCT CAC；
WD19R CCT GGG AGA GAG AAG CCT TT；
Exon20：WD20F CTA GGT GTG AGT GCG AGT T；
WD20R CAG CAT TTG TCC CAG GT；
Exon21：WD21e1 AAT GGC TCA GAT GCT GTT；
WD21e2 GCT TGT GGT GAG TGG AGG。
步骤3 进行PCR扩增
在本步骤中所使用的试剂为：
生工Taq plus，由上海生工提供，5U/μl。
博亚Taq酶，由上海博亚提供，5U/μl。
dNTP，由北京鼎国生物技术有限公司提供。浓度10mmol/μl，使用时稀释为2.5mmol/μl。
10mg/ml溴化乙锭(EB)，由美国Sigma提供，分析纯，在100ml去离子水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹，4℃保存。
TE，自配，10mmol/L Tris Cl，1mmol/L EDTA。
载样缓冲液(loading Buffer)，自配，规格为6×，0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青FF、50％甘油水溶液。
5mol/L电泳缓冲液(TBE)，自配，Tris·Base 30.25g、EDTA-2Na1.6g、硼酸13.35g，使用时稀释10倍，为0.5mol/L电泳缓冲液。
琼脂糖，由西班牙BIOWEST提供。
100bp DNA ladder，由北京鼎国提供，10mmol/L。
1)对各个外显子进行聚合酶链反应(PCR)：
a)PCR扩增体系：
反应体系总体积50μl，包括以下成分：
表1
| 成分 | 浓度 | 加入量 | 终浓度 |
| 去离子水10×BufferMgCl2dNTP上游引物下游引物Taq酶DNA模板 | 25mM10mM10pmol/ul10pmol/ul5u/μl50-100μg/ml | 38μl5μl4μl1μl1μl1μl0.5μl1μl | 1×2mM0.2mM0.2mM0.2mM2.5u50-100ng |
b)PCR反应的设备：
Express PCR仪：由英国HYBAID公司提供。
c)PCR反应条件：其中各外显子PCR扩增的热循环条件如下：
i.95℃预变性5min；
ii.95℃，50sec，[Exon1(60℃)；Exon2-1(54-55℃)；Exon2-2(55-58℃)；Exon2-3(60℃)；Exon2-4(52℃)；Exon2-5(60℃)；Exon2-6(60℃)；Exon3(50-57℃)；Exon4(55-63℃)；Exon5(58-60℃)；Exon6(57℃)；Exon7(64℃)；Exon8(50-54℃)；Exon9(58-60℃)；Exon10(50-53℃)；Exon11(50-56℃)；Exon12(53℃)；Exon13WD13F，WD13R(56℃)；Exon13WD13F-n(54℃)；Exon14(58-60℃)；Exon15(58-60℃)；Exon16(55-58℃)；Exon17(58-60℃)；Exon18(58-60℃)；Exon19(63℃)；Exon20(58-60℃)；Exon21(61℃)；]45sec，72℃，45sec，33个循环；72℃延伸10min。
iii.引物序列：见前述。
2)凝胶电泳：上述PCR反应结束后，取5μl PCR产物加入6×电泳载样缓冲液1μl，用恒压恒流电泳仪(国产)进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压130V，30分钟后在紫外分析仪(美国Kodak公司凝胶成像系统)上观察结果并照相。如为相应长度的单一PCR扩增条带，即认为扩增成功，待DHPLC检测。
通过上述PCR扩增体系，WD基因1-21号外显子片段均扩增成功，1.5％琼脂糖凝胶电泳显示为相应特异长度的单一条带。含外显子Exon1、Exon2-1、Exon2-2、Exon2-3、Exon2-4、Exon2-5、Exon2-6、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6、Exon7、Exon8、Exon9、Exon10、Exon11、Exon12、Exon13(WD13F，WD13R)、Exon13(WD13F-n)、Exon14、Exon15、Exon16、Exon17、Exon18、Exon19、Exon20、以及Exon21的PCR扩增条带长度分别为：339bp、298bp、253bp、282bp、386bp、290bp、308bp、323bp、224bp、233bp、199bp、276bp、295bp、241bp、193bp、290bp、230bp、268bp、225bp、303bp、254bp、201bp、280bp、281bp、215bp、253bp、361bp。
步骤4 进行DHPLC检测
应用Transgenomic公司WAVE-DNA核酸片段分析仪，经WAVEMAKER软件分析扩增的WD基因21个外显子片段，得到相应Tm值及洗脱条件(见表2)，选择合适的柱温，取3-5μl扩增产物进行DHPLC检测，如发现杂合子色谱峰(非单峰)则进行二次PCR扩增并测序，如为纯合子色谱峰(单峰)，则在该样品中混入等比例野生型样品(已经测序证实)后，再进行DHPLC检测以筛查纯合突变。
柱温的选择是检测突变的关键，文献报道，部分变性过程中，当双链DNA在待测样品中所占比例在70％-85％时，分离效果最好。我们认为，柱温的选择应根据WAVE MAKER软件提供的Tm值及DNA解链的溶解曲线，针对不同片段大小及范围进行多个柱温的调整，以提高检出率。一般情况下，大多数柱温的选择应在推荐的Tm值范围上下浮动1-3℃。值得注意的是，如果在同一DNA片段上存在两个以上的变异位点，则需要用两个或两个以上的柱温才能完全筛查，例如WD基因的第1号外显子，我们分别选择了63℃和64℃，才将两个多态有效地区分开。另外，还可以再次设计引物以排除多态的干扰，例如WD基因的第13号外显子，为了避免2866-13C＞G多态的干扰，另外设计了引物以便单独筛查Pro992Leu这一突变位点。本实验已建立了适宜的筛查柱温(见表2)，为今后开展Wilson病的临床基因诊断提供了依据。
表2 DHPLC突变检测条件
| 外显子 | Tm | ％Buffer B | 柱温 |
| Exon1Exon2-1Exon2-2Exon2-3Exon2-4Exon2-5Exon2-6Exon3Exon4Exon5Exon6Exon7Exon8Exon9Exon10Exon11Exon12Exon13Exon13(WD13F-n)Exon14Exon15Exon16Exon17Exon18Exon19Exon20Exon21 | 64℃59℃61℃60℃58℃61℃59℃59℃62℃58℃58℃58℃61℃58℃61℃56℃57℃62℃63℃59℃60℃61℃60℃62℃61℃61℃63℃ | 55％54％55％54％56％54％54％55％51％52％50％53％54％52％50％54％52％53％51％54％51％50％54％54％51％53％56％ | 63&64℃59℃60℃59℃58℃60℃59℃59℃61℃60℃57℃58℃61℃58℃60℃60℃58℃63℃63℃59℃60℃61℃60℃62℃61℃61℃63℃ |
本发明中，利用DHPLC技术所筛查到的突变全部经过测序一一证实，符合率为100％，提示DHPLC在对WD基因突变筛查中起到了重要的作用。
本发明中，利用DHPLC技术所筛查到的突变全部经过测序一一证实，符合率为100％，提示DHPLC在对WD基因突变筛查中起到了重要的作用。
步骤5 基因测序
应用日本TaKaRa公司PCR Fragment Recovery Kit对PCR产物进行纯化，采用ABI PRISM Big Dye Terminator循环测序试剂盒进行测序反应，以ABI 377 DNA测序仪电泳测序，测序结果应用NCBI的Blast软件在GenBank确定靶序列并找出突变。
如图2至图11所示，通过DHPLC检测出的杂合突变样品，均经测序证实确认其突变类型，并且DHPLC峰型非常特异，与其突变类型一一对应。
通过对50例中国人Wilson病患者WD基因的分析，WD基因的突变形式繁多，包括错义突变、无义突变、缺失、插入等，并且突变几乎分散在各个外显子(有的位于剪接区内)，形成了广谱突变的特征，在所有筛查到的突变中，纯合突变很少，大部分为复合杂合型。
本发明中，共检测出WD基因突变22种，这些突变类型均未在100条正常对照的健康染色体中发现。其中9种为新的突变类型，目前国内外尚无人报道，是我们首次发现的(见表3)，它们分别是，Gln511Term(Exon3)，Gly515Val(Exon3)，2305InsC(Exon8)，2355-2A＞G(IVS8)，2806DelTTG(Exon12)，2816InsA(Exon12)，Ser975Tyr(Exon13)，Cys980Tyr(Exon13)，4154InsG(Exon21)。另外，在我们检测到的11种多态(SNPs)中有3种也从未见报道(见表4)，分别是-134InsGGCTC(5’-UTR)，2866-13C＞G(IVS12)，Ala1135Thr(Exon15)。以上突变及多态类型已获得Genbank接受号AY972085-972097。
在我们发现的22种WD基因突变类型中，绝大部分突变只存在于一个患者的一条染色体上。但是，唯有第8号外显子例外，共有16例Wilson病患者在8号外显子的778密码子上存在突变，且突变类型有两种即Arg778Leu和Arg778Gln，其中，15例患者为Arg778Leu(12例杂合突变，3例纯合突变)，1例为杂合Arg778Gln，Arg778Leu的突变率为17.6％。非常有趣的是，一种多态位点C2310G与Arg778Leu杂合突变同时存在，这在12例的Arg778Leu杂合突变中均得到证实，说明C2310G多态与Arg778Leu杂合突变完全连锁，以上结果与台湾学者及国内学者的研究相符合。另外，在8号外显子上还发现有1例患者存在2305InsC的杂合突变，这是目前文献未见报道的。
为了验证以上结果，我们利用青岛市计划生育研究所提供的24例Wilson病患者的样品用同样的方法对WD基因第8外显子进行了筛查，发现Arg778Leu突变17例(2例纯合突变，15例杂合突变)，Arg778Leu的突变率高达39.6％，并且C2310G多态与Arg778Leu杂合突变完全连锁，完全验证了我们的结果，青岛样品Arg778Leu突变比中山大学的突变率高，可能是由于南方与北方地域差别造成的。
综上所述，中国人的WD基因突变热点位于第8外显子，尤其是Arg778Leu，其突变频率为17.6％和39.6％(两批样品Arg778Leu总突变率为25％)，是WD基因的第一突变热点，这一结果与目前国内的研究结果(Arg778Leu的突变频率为11.4％-37.5％)基本一致；在我们所研究的50例Wilson病患者中突变率居于第二位的是2355-2A＞G剪接区突变(位于第8内含子)，其突变率为5％；另外，我们没有筛查到位于第12外显子的Thr935Met，据报道，其突变率达6.3％-10.0％，被有些学者认为是WD基因的第二突变热点，但是，在我们检测的50例Wilson病患者中有4例存在Arg919Gly杂合突变(也位于第12外显子)，其突变频率为4％。其它外显子的突变率均在1％-2％之间。
表3 DHPLC检测出的WD基因突变类型
| 外显子或内含子 | 核甘酸突变 | 氨基酸突变 | 突变类型 | 突变频率 | 蛋白质区域 | 备注 |
| Exon2Exon3Exon3IVS4Exon7Exon8Exon8Exon8Exon8Exon8IVS8Exon12Exon12Exon12Exon13Exon13Exon13Exon13Exon14Exon18Exon18Exon21 | 523InsAC1531TG1545T1708-1G＞CC1985GG2333TG2333AA2305G2305InsCG2128A2355-2A＞G2806delTTG2816InsAC2755GC2924AC2930TG2939AC2975TC3155TA3809GG3890A4154InsG | Codon 175Gln511TermGly515ValSer662CysArg778LeuArg778GlnMet769ValCodon 769Gly710SerDelete936LeuCodon 939Arg919GlySer975TyrThr977MetCys980TyrPro992LeuPro1052LeuAsn1270SerVal1297IleCodon 1385 | 移码突变无义突变错义突变剪接突变错义突变错义突变错义突变错义突变移码突变错义突变剪接突变移码突变移码突变错义突变错义突变错义突变错义突变错义突变错义突变错义突变错义突变移码突变 | 2％(2/50)2％(2/50)2％(2/50)1％(1/50)1％(1/50)18％(15/50)1％(1/50)2％(1/24)1％(1/50)2％(1/24)5％(3/50)1％(1/50)1％(1/50)4％(4/50)2％(1/24)2％(1/24)1％(1/50)2％(2/50)2％(1/50)1％(1/50)1％(1/50)1％(1/50) | 铜结合区铜结合区铜结合区铜结合区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区跨膜区ATP结合区ATP结合区ATP结合区ATP结合区 | 本发明本发明本发明本发明本发明本发明本发明本发明本发明本发明 |
表4 DHPLC检测出的多态类型
| 外显子 | 核甘酸突变 | 氨基酸突变 | 备注 |
| 5′-UTR5′-UTRExon2Exon3Exon8Exon12IVS12IVS14E15E16IVS18 | -75C＞A-134InsGGCTCG1216TC1366GC2310GA2855G2866-13C＞G3244+37A＞GG3403AC3419T3903+6C＞T | Ala406SerLeu456ValLeu770LeuArg952LysAla1135ThrAla1140Val | 本发明本发明本发明 |
由表3可以看出，我们筛查到的22种WD基因突变中，有14种突变位点处在编码ATP7B的跨膜功能区，尤其突变频率较高的几种突变均处在该区域，而位于铜离子结合区和ATP结合区的突变却很少，提示中国人Wilson病基因突变的位点集中在跨膜功能区。ATP7B共有7个跨膜功能区(Tm1-Tm7)，此区域的主要功能是负责铜离子的转运，如果该区域某一位点发生突变则可导致某一跨膜区结构和功能异常，但其它跨膜区仍具有正常的转运功能，所以，这一区域的突变只能减弱铜离子的转运，而不可能完全终止转运。所以，有的学者认为，处于跨膜功能区的突变类型可能是较温和的突变，其临床表现一般较轻，发病年龄也较晚。
表5致病性突变与临床表型关系
| 突变类型 | 样本来源 | 性别 | 发病年龄 | 临床表现 |
| 纯合2355-2A＞G纯合2355-2A＞G纯合Arg778Leu纯合Arg778Leu纯合Arg778Leu纯合Pro1052Leu杂合Arg778Leu+杂合Ser662Cys杂合Arg778Leu+杂合Gln511Ter杂合523InsA+杂合2355-2A＞G杂合Pro1052Leu+杂合4154InsG | 中山大学中山大学中山大学青岛青岛中山大学中山大学中山大学中山大学中山大学 | 男男男女男男女男男男 | 91023151452091810 | 关节痛神经症状神经症状、肝神经症状神经症状肝、神经症状神经症状神经症状神经症状、肝神经症状、肝 |
在我们筛查到的8例带有纯合突变的Wilson病患者中，只有4例具有临床资料，其中3例是Arg778Leu纯合突变，1例是Pro1052Leu纯合突变。通过对其临床资料的分析发现，3例带有Arg778Leu的患者其发病年龄较晚(最小14岁，最大25岁)，表现以神经症状为主，且症状较轻。而1例带有Pro1052Leu的患者5岁发病，表现为严重的肝损害并伴有锥体外系症状，此患者在行肝移植后2个月后死亡，通过家系调查发现，此患者的一个哥哥和一个姐姐都由于不明原因而死亡。Arg778Leu位于跨膜功能区，而Pro1052Leu位于ATP结合区，通过以上病例分析提示，这两个区域如发生突变，其导致的后果可能是完全不同的。
目前，国内已公认Arg778Leu是中国人Wilson病的突变热点，其突变频率在11.4％-37.5％之间，它位于WD基因第8外显子，该区编码P型铜转运ATP酶的第四跨膜功能区(即Tm4)，此区域主要负责铜离子的转运，如发生突变则破坏了Tm4的形成，由于其它6个跨膜功能区仍具有功能，所以突变的后果只减弱了铜的转运，但并没有完全终止铜的转运。
据文献报道，目前欧洲和北美地区的Wilson病基因突变热点主要集中在His1069Gln，其突变频率为10％-60％，它位于WD基因第14外显子，该区编码P型铜转运ATP酶的ATP结合区，此区域主要功能是结合ATP为转运铜离子提供能量，突变的后果主要是改变了ATP7B蛋白上的ATP环，导致蛋白质二级结构的改变，从而影响ATP的结合能力。
通过对国内外文献的系统分析，中国人Wilson病基因突变主要分布在第8、12、7和13号外显子(均位于跨膜功能区)上，除了本发明发现的新突变外，还有Thr935Met(Exon12)、Gln914Term(Exon12)、2810delT(Exon12)、Ser662Cys(Exon7)、Trp650Term(Exon7)等突变类型在西方人中从未发现过，尤其中国人Wilson病基因突变热点Arg778Leu在西方人中也同样没有出现过。与此截然相反，西方人的突变主要分布在第14和18号外显子(均位于ATP结合区)，其中最普遍的突变点His1069Gln和Gly1266Lys在中国人群中也从未发现过，这一现象充分提示Wilson病在分子发病机制方面存在种族差异。
在我们研究的50例Wilson病患者中，纯合突变仅有8例，复合杂合突变(含有两个杂合突变位点)13例，只检测到一个杂合突变位点的有18例，另外还有11例则未检测到任何突变。从这一结果来看，只有21例患者找到了致病性突变，突变检出率为42％。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种WD基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon3中的Gln511Term。
2.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon3中的Gly515Val。
3.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon8中的2305InsC。
4.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是内含子IVS8中的2355-2A＞G。
5.根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon12中的2806delTTG。
6 根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon12中的2816InsA。
7 根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon13中的Ser975Tyr。
8 根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon13中的Cys980Tyr。
9 根据权利要求1所述的基因突变类型，其特征在于，所述突变类型是外显子Exon21中的4154InsG。
10 一种WD基因多态类型，其特征在于，所述多态类型是5’-UTR中的-134InsGGCTC。
11 根据权利要求9所述的基因多态类型，其特征在于，所述多态类型是内含子IVS12中的2866-13C＞G。
12 根据权利要求9所述的基因多态类型，其特征在于，所述多态类型是外显子Exon15中的Ala1135Thr。
13 一种检测权利要求1至12所述的WD基因突变类型或多态类型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取DNA样本；
步骤2：进行引物设计；
步骤3：进行PCR扩增；
步骤4：取PCR扩增产物运用DHPLC技术在部分变性条
件下进行突变检测分析；
步骤5：对DHPLC检测阳性的标本进行重新PCR扩增后，直接测序以确认突变或多态位点；对DHPLC检测阴性的标本，将其与野生型样品等比例混合，经过变性-复性后再进行DHPLC检测以确认纯合突变或野生型。
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| CN103820555A (zh) * | 2014-02-28 | 2014-05-28 | 李卫东 | 一种利用连锁不平衡在家系中筛查Wilson disease基因突变的方法 |
| CN107955832A (zh) * | 2017-09-08 | 2018-04-24 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一套同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病的引物组及方法 |
| CN114438198A (zh) * | 2022-03-08 | 2022-05-06 | 绍兴博英诊断技术有限公司 | 一种检测肝豆状核变性基因高频突变的引物组合及试剂盒 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20061129 |