CN103421768B - 一种与猪初生重性状相关的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪的分子标记制备与应用技术领域，具体涉及一种与与猪初生重性状相关的分子标记及应用。该分子标记是从NNAT基因中克隆得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的350bp处有一个C/A等位基因突变，导致HinfⅠ-RFLP多态性。本发明公开了该分子标记的制备及应用。

Description

一种与猪初生重性状相关的分子标记及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择的与初生重性状相关的分子标记的克隆及应用。本发明的分子标记与NNAT基因有关。 

背景技术

猪是重要的经济动物之一，猪肉由于其肉嫩味美长期以来广受消费者的青睐，是我国人民食用的动物性蛋白的主要来源之一。近年来，人们对猪肉的消费量与日俱增，如何提高生产性能、降低生产成本成了猪育种工作者的工作重点之一。 

分子生物学技术的迅速发展为此提供了重要的契机，凭借这一技术手段，科学家们发掘出了一大批与猪的初生重，生长速度，断奶重，产仔数等重要的繁殖性状有着显著关联的分子标记。这为提高猪的生产性能提供了理论依据，并从实质上使之得到了很大的提高。 

猪的初生重作为一个重要的繁殖性状，与猪出生后的生长速度及育成率有着不可分割的密切联系。 

NNAT基因最早从胎儿大脑中分离发现而来,存在两个剪接体NNAT alpha和NNAT beta(Dou等，1996)。在人、鼠和牛中，该基因为母系印记、父系表达基因(Williamson等，1998；Kuerbitz等，2002)。与其它印记基因成簇分布不同，在鼠中，该基因单独位于2号染色体的末端Blcap基因内含子内，进化分析显示该基因呈现印记现象晚于其它基因，起源于真哺乳动物，它不共享组织专一表达或等位基因专一表达的调节元件，其表达需要区域上游或周围元件的共同参与(Evans等，2005；Evans等，2001)。在垂体腺瘤的研究中发现，该基因的低表达与其启动子CpG岛的超甲基化相关(Revill等，2009）。Dnmt1基因敲除鼠的垂体研究中也检测发现NNAT基因的表达发生了显著的变化(Dudley等，2008）。这些研究表明NNAT基因的表达和启动子甲基化水平紧密相关。 

在猪妊娠初期，胚胎很轻，绝对增重不高，在60天后增重速度加快，在90天后胎儿增重十分迅速，绝对增重很大，胎儿体重60％左右是在这个时期增长的，而仔猪初生重的71%是在妊娠80d以后生长的，因此在猪妊娠后期，胎儿能量的摄入量会直接影响仔猪的初生重（Pond & Mersmann,2001）。葡萄糖是胎儿代谢和生长所必需的也是主要的能量来源,特别是在妊娠后期，葡萄糖是胎儿骨骼肌和脂肪组织生长发育的重要营养物质基础，而胎儿所需的葡萄糖全部依靠母体通过胎盘供给，胎儿是否能得到足够的葡萄糖供给取决与三个主要的过程（1）母体通过增加葡萄糖产生和降低胰岛素的敏感性以维持相对恒定的母体血糖浓度，从而保证有充足的葡萄糖供应给胎儿；（2）葡萄糖通过胎盘由母体向胎儿的转运，该过程主要由葡萄糖转运蛋白完成；（3）随着胎儿胰岛的发育，胰岛素分泌增加，刺激葡萄糖向肌肉和脂肪细胞转 运变成三酞甘油，不仅促进胎儿细胞增生，也导致了葡萄糖利用的增加（Hay,2006）。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，克隆猪繁殖相关基因NNAT的片段，寻找NNAT基因片段的突变位点，筛选一种与猪初生重性状相关的分子标记，利用该分子标记作为猪的标记辅助选择的应用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

申请人通过基因克隆方法，从繁殖相关基因NNAT中获得一种与猪初生重相关的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列的第350bp处有一个碱基突变（C350-A350），该突变导致Hinf Ⅰ-RFLP多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism)。 

扩增NNAT基因cDNA序列测序查找SNP的引物如下所示： 

P001正向：5’-ACAGACATCCAGACACCCAC-3'， 

P002反向：5'–CCTCCAGGAGCTTACAATCTAG-3'。 

扩增NNAT基因检测C350-A350处碱基突变所用的突变引物序列如下所示： 

P003正向：5’-CAGCCCCTCACTGATCTTGAAT-3’， 

P004反向：5'-AATCTAGCCGGGGAGACA-3'。 

本发明所述的分子标记的制备方法是： 

用猪NNAT基因mRNA(GenBank收录号：NM_001122990.1)为模板设计引物，提取猪耳部组织DNA，PCR扩增（所用引物对为P001和P002）、PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。克隆测序，找到3’-UTR的一个SNP，位于SEQ ID NO：1所示的350位（C350-A350），由于没有现成的限制性内切酶可用，进一步设计突变引物（P003），将序列SEQ ID NO：1中第347位的C碱基突变为A碱基，获得如序列表SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，然后应用PCR-RFLP的方法（PCR所用引物对为P003和P004）对序列表SEQ ID NO：2所示的第23位碱基突变(该突变等同于SEQ ID NO：1中第350位的C350-A350)进行了检测，并初步进行其基因型与猪的平均出生窝重性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。 

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。 

本发明的优点在于 

本发明获得的3’-UTR区的SNP（等位基因C/A）可以作为猪初生重性状的一个分子标记（Marker）。 

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆的作为猪初生重的分子标记，即猪NNAT基因片段，序列全长459bp。 

序列表SEQ ID NO:2是突变引物扩增序列，序列长度为117bp。 

图1：是本发明技术流程图。 

图2：是本发明克隆的与猪初生重相关的分子标记SEQ ID NO：1（即猪NNAT基因的DNA片段），图中标注的M为突变位点用标有下划线的加粗字显示（括号中为突变的碱基，为等位基因突变），在该段序列的首尾用斜体加粗及阴影显示引物序列。 

图3：序列表SEQ ID NO：2是突变引物扩增序列，序列长度为117bp。其中在该序列的第23bp处有一个C23-A23的碱基突变，导致HinfⅠ-RFLP多态性。图中引入突变位点A（将序列SEQ ID NO：1中第347位的C碱基突变为A碱基）位于第20位，用方框表示，标有下划线字体为酶切识别碱基，所述的引物序列用斜体加粗及阴影显示。图中第23位标注的M为突变位点（括号中为突变的碱基，为等位基因突变），用标有下划线的加粗字显示。 

图4：是本发明中猪NNAT基因3’-UTR区的HinfⅠ-RFLP的两种基因型(AC CC)和基因组扩增电泳结果(P)，图中M：DNA分子量标准（DL50 ladder）。 

具体实施方式

实施例1 猪NNAT基因部分DNA序列扩增 

(1)引物设计 

用猪NNAT基因mRNA(GenBank收录号：NM_001122990.1)为模板设计引物克隆得到如序列表SEQ ID NO：1所示的部分3’-UTR（其核酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。其中，通过对不同品种（大白猪，梅山猪，来自中国湖北省武汉市华中农业大学精品猪场，为国内常用推广的品种）的扩增测序比对，于350bp处发现了1个碱基突变（C350-A350），对此突变进行酶切分析，发现该突变没有现成商业化的限制性内切酶识别，于是在靠近这个突变上游的第3个碱基通过引物扩增引入单碱基突变，具体的做法是将原序列上的C突变为A,形成一个内切酶HinfⅠ的识别序列。 

扩增NNAT基因DNA片段测序并查找SNP的引物的DNA序列如下所示： 

P001正向：5’-ACAGACATCCAGACACCCAC-3'， 

P002反向：5'–CCTCCAGGAGCTTACAATCTAG-3'； 

（2）PCR扩增 

10uL的反应体系中加入DNA模板0.5μL，双蒸水7.5μL，10×PCR buffer 1μL，dNTP 0.3μL,10mM引物（P001和P002）前后各0.3μL，Taq酶1U。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸35s，33个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的纯化和测序 

(3)PCR产物的纯化 

在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，于65℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒（购自Promega公司）纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μL融化的凝胶中加入1mL Resin试剂，混匀20s，将Resin/DNA混合物转移至带有吸附柱的离心管，离心除去液体。再向吸附柱中加入80%的异丙醇2mL，离心除去液体，取下吸附柱装入1.5mL Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将吸附柱装入另一个干净的1.5mLEpendorff管中，加入30-50μL灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。 

（4）连接反应 

将纯化PCR产物与pGEM-T easy载体（购自promega公司）连接，连接反应总体积是5μL，其中包 括2.5μL2×Buffer，0.5μL的T载体，1.5μL的纯化PCR产物，0.5μL的T4连接酶，置16℃水浴过夜。 

(5)感受态细胞的制备 

从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2mL LB中，于37℃振荡培养3h，转接1mL菌液于含有30mL LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。 

（6）转化 

无菌状态下取100-120μL感受态细胞于1.5mL Ependorff管中，将5μL的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μL无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μL涂布于已提前4h涂布了异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(英文名称：Isopropylthio-β-D-galactoside,英文简称：IPTG)，购自上海美季生物技术有限公司和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。 

（7）质粒的小量制备 

挑取平板上的单菌落，接种于2-3mL LB中，37℃300r/min培养6-8h。用1.5mL EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μL用冰预冷的溶液Ⅰ[50mM葡萄糖,25mM Tris.Cl(pH8.0),10mM EDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液Ⅱ[0.2M NaOH，1%十二烷基磺酸钠（SDS）]200μL，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液Ⅲ[5M乙酸钾，冰乙酸11.5mL,双蒸水28.5ml]150μL，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚：氯仿：异戊醇(按体积比为苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1)500μL，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE（Tris乙酸盐-EDTA缓冲液，pH7.4）20μL。 

（8）重组质粒的酶切鉴定 

取3μL质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为10μL，加入5U限制性内切酶EcoRⅠ及1μL相应的10×限制性内切酶反应缓冲液（购自MBI公司），轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μL反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。 

（9）DNA序列测定：序列测定由深圳华大基因科技有限公司完成，基因片段测正反两个反应。 

实施例2：PCR-RFLP诊断方法建立 

（1）PCR-RFLP引物序列 

突变引物检测SNP： 

P003正向：5’-CAGCCCCTCACTGATCTTGAAT-3’ 

P004反向：5'-AATCTAGCCGGGGAGACA-3' 

扩增片段长度为117bp。 

（2）PCR扩增条件 

10uL的反应体系中加入DNA模板0.5μL，双蒸水7.5μL，10×PCR buffer 1μL，dNTP 0.3μL,10mM引物（P003和P004）前后各0.3μL，Taq酶1U。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、64℃退火30s、72℃延伸35s，33个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的纯化和测序 

（3）RFLP检测 

将PCR产物3μL，10×Buffer 1μL，限制性内切酶HinfⅠ为0.2μL(2U)，加双蒸水补至10μL，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置12h，用3.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。 

利用突变引物扩增基因组DNA，导致一个HinfⅠ多态性。该基因突变位点由两个等位基因控制，其中A是没有形成酶切位点的等位基因，C是形成酶切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型其中AC型为杂合型（电泳检测时出现117bp和98bp两条DNA带）。CC型为发生酶切的纯合型（电泳检测时只能看见98bp一条DNA带，另一条19bp由于片段太小，已跑出胶外）。 

实施例3：PCR－HinfⅠ－RFLP多态性在各猪品种中的分布情况的检测的应用 

本实施例猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司大白猪群，250头大白母猪，F1代大白仔猪共598窝，对母本进行了基因型检测，子代出生0天测定体重。 

根据采集样品的群体结构，申请人运用混合模型来统计分析NNAT基因的不同基因型对测定平均出生窝重的影响，采用SAS（Version8.1）软件中Mixed Models程序进行最小二乘均数估计（Breslow,等，1993）与统计分析，模型如下： 

Y=u+parity+farrowing season+genotype+e 

其中Y为初生重性状测定值向量；u表示性状的均值；genotype表示基因型效应；farrowing season表示妊娠季节，parity表示窝次，为混合模型中的固定效应；e为随机残差效应。 

对猪NNAT基因3’-UTR区HinfⅠ-RFLP多态性位点与初生重性状进行关联分析。 

通过SAS8.1分析（下表），发现NNAT的基因型和与母猪窝产仔猪平均体重极其显著关联，AA基因型与AC或者CC存在显著差异，等位基因A为高窝产仔猪平均体重的优势基因。 

表1  猪NNAT基因HinfⅠ-RFLP不同基因型仔猪0日龄平均窝重的最小二乘均值 

由表1可知，AA基因型母猪的每窝平均窝重极显著高于AC基因型（p<0.001），也高于CC基因型。但AC基因型的窝产仔猪平均体重较CC型低，说明杂合子对窝产仔猪平均体重是最不利的。窝产仔猪平均体重是判断繁殖性状的重要指标，窝产仔猪平均体重高说明母猪的繁殖性状高。因此，AA基因型的母猪个体具有最好的繁殖性状，其次是CC型的，AC杂合型的繁殖性状最低。 

参考文献 

1.Dou D,Joseph R.Structure and organization of the human neuronatin gene.Genomics.1996,33(2):292-7 

2.Williamson CM,Beechey CV,Ball ST,Dutton ER,Cattanach BM,Tease C,Ishino F,Peters J.Localisation of the imprinted gene neuronatin,Nnat,confirms and refines the location of a second imprinting region on mouse chromosome2.Cytogenet Cell Genet.1998,81:73-8. 

3.Kuerbitz SJ,Pahys J,Wilson A,Compitello N,Gray TA.Hypermethylation of the imprinted NNAT locus occurs frequently in pediatric acute leukemia.Carcinogenesis.2002,23:559-64. 

4.Evans HK,Weidman JR,Cowley DO,Jirtle RL.Comparative phylogenetic analysis of blcap/nnat reveals eutherian-specific imprinted gene.Mol Biol Evol.2005,22:1740-8. 

5.Evans HK,Wylie AA,Murphy SK,Jirtle RL.The neuronatin gene resides in a"micro-imprinted"domain on human chromosome 20q11.2.Genomics.2001,77:99-104. 

6.Dudley KJ,Revill K,Whitby P,Clayton RN,Farrell WE.Genome-wide analysis in a murine Dnmt1knockdown model identifies epigenetically silenced genes in primary human pituitary tumors.Mol Cancer Res.2008,6:1567-74. 

7.Revill K,Dudley K,McNicol AM,Clayton R,Farrell W Professor.Loss of NNAT expression is associated with promoter hypermethylation in pituitary adenoma.Endocr Relat Cancer.2009,Feb23.[Epub ahead of print]. 

8.Pond WG，Mersmann HJ,Biology of the domestic pig.Cornell University Press,ISBN:978-0-8014-3468-6 

9.Hay W.W.，Placental-Fetal Glucose Exchange and Fetal Glucose Metabolism Trans Am Clin Climatol Assoc.2006,117:321-340. 

10.Breslow NE,Clayton DG.Approximate Inference in Generalized Linear Mixed Models[J].Journal of the American Statistical Association,1993,88(421):9–25.。 

Claims (4)

1.一种大白猪初生重性状检测的分子标记，其特征在于，该分子标记的核苷酸序列如下所示：

ACAGACATCCAGACACCCACACCAGCCAGCAGAATGGACAGTTCAACATCACCAGCTGAAGCCCTGAATCTTGGTGCAGCAGACAAGTGACAACTGCGTGCCTGTGTGGCGGGACTAGAGGGCGAGGGTGAGGGAGGAGGGTTAAGAAGCAGAGAGGGGCCCTCTCACTGTCCCTTGCCTACGGCGCATACATTCCAGCCTTGCTGCCTTTGCTCCTTCAATTCCCCTTTCCCCCCACTCCCACCCAAAAGAAATGCATCACTCAATTTGGACCTACTGAACAAGAAGACAAATCCCATCTTTACCAAAACACCTTCTCCAAGCCCCCAGCCCCTCACTGATCTTGCATMCCCCAGGTCTCACGCAATTGTGGTCAATATTGTGGTAATCGCTAACTGTAATGATTGTATAAGTGTGCATTAGTTGTGTCTCCCCGGCTAGATTGTAAGCTCCTGGAGG

上述序列中的M是C或A，导致Hinf Ⅰ-RFLP多态性。

2.一种检测如权利要求1所述的分子标记碱基突变的引物对，其核苷酸序列如下所示：

正向引物：CAGCCCCTCACTGATCTTGAAT，

反向引物：AATCTAGCCGGGGAGACA。

3.权利要求1所述的分子标记在大白猪初生重分子标记辅助选择中的应用。

4.权利要求2所述引物对在大白猪初生重分子标记辅助选择中的应用。