CN110452995A - 影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的gpr54基因分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的GPR54基因分子标记及其应用。以GPR54基因作为影响猪繁殖性状的候选基因，以嘉兴黑猪为试验群体，通过直接测序的方法检测GPR54基因的多态性，并对母猪的繁殖性能指标进行了关联分析。结果表明：GPR54基因在外显子2的3739bp处和3878bp处发生T→C突变及C→T突变，在外显子6的6789bp处发生T→C突变，均存在AB、BB 2种基因型。等位基因B为优势等位基因，BB基因型为优势等位基因型。通过关联分析表明GPR54基因B等位基因具有提高初产和经产嘉兴黑猪群体的总产仔数、产活仔数和初生窝重的趋势，且T3739C位点对总群体和初产群体的总产仔数、产活仔数有极显著影响（P＜0.01），对初产群体的初生窝重有显著影响（P＜0.05）。

Description

影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的GPR54基因分子标记及其应用

技术领域

本发明属于动物育种领域，具体涉及影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的GPR54基因分子标记及其应用。

背景技术

猪繁殖性状是养猪产业的重要经济性状，然而该性状属于低遗传力性状，遗传力在0.1左右。用常规育种方法，无法从根本上改良猪繁殖性状。随着分子生物学发展，通过现代分子育种技术对影响母猪繁殖性状的主效基因或相关基因开展遗传标记辅助选择，则可有效改善猪繁殖性状。

吴井生等在小梅山猪，枫泾猪和大白猪3个猪群中检测得到GPR54基因存在3个SNPs，分别是外显子1中的T245C，外显子5中的T3295C及内含子2中于1984-1985bp间插入一个碱基C。周梅等在黄牛、西门塔尔牛及其杂交群中检测到GPR54基因存在T754C和C816T两个多态位点。Chu等在绵羊中检测到GPR54基因也存在两个SNPs，为T2360C和A2411C。FENG等在济宁青山羊GPR54基因第1外显子和第5外显子共检测到5个SNPs，为C96T，T173C，G176A，G825A，C981T。以上研究结果共同表明GPR54基因多态位点分布存在明显差异，这可能与该基因的生物进化过程有关。

已有研究表明，人和小鼠中的GPR54基因发生突变或缺失会造成IHH疾病，导致性激素和促性腺激素分泌不足，性器官发育不良。De Roux N等对IHH患者血液进行GPR54基因测序得到，该基因中存在155个核苷酸的纯合缺失。Sandrine Funes等对GPR54突变小鼠研究表明雌性与雄性小鼠在生殖器发育上存在差别，对鼠生殖系统发育必不可少。目前，关于GPR54基因对动物繁殖性能的影响研究较少。FENG等研究表明济宁青山羊GPR54等位基因B和D具有高产仔数和性早熟的关联，BB型和AB型的产羔数分别显著高于AA型1.07头和0.40头（P＜0.05），DD型和CD型产羔数分别显著高于CC型1.80头和0.55头（P＜0.05）。在经产小梅山母猪群体中，GPR54基因P1位点上，BB型个体的产活仔数极显著高于AB型和AA型0.69头和1.65头（P＜0.01）。然而，关于GPR54基因对猪性发育和繁殖性能的影响研究报道较少。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的GPR54

基因分子标记及其应用。

影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的GPR54基因分子标记，具有一种或者多种突变；所述突变包括：

外显子2区域的3739bp处具有T→C突变，BB基因型初产母猪的总产仔数、产活仔数和死胎数都显著高于AB型初产母猪；整个群体而言，BB基因型母猪的总产仔数和产活仔数都要高于AB型；

外显子2区域的3878bp处具有C→T突变，AB基因型和BB基因型的母猪的繁殖性状差异并不显著；

外显子6区域的6789bp处具有T→C突变，AB基因型和BB基因型的母猪的繁殖性状差异并不显著。

所述的GPR54基因分子标记的应用，用于提高嘉兴黑猪繁殖性状的选育。

附图说明

图1 GPR54基因片段扩增结果；

图2 GPR54基因PCR产物测序结果。

具体实施方式

太湖猪是世界上产仔数最多的猪种，嘉兴黑猪作为太湖猪的一个类别，其繁殖性能是我们关注的重点。而不同的猪种由于选择及生产管理模式等不同，其进化程度也有不同，因此其基因的进化程度也是不一致的。譬如西方猪种的产仔数就没有地方猪种来的高。因此以嘉兴黑猪作为研究对象对GPR54基因多态性对地方猪种繁殖性能的影响更具有普遍性，对其他外来猪种繁殖性能的影响则具有参考性。西方猪种生长速度快，瘦肉率高，中国地方猪种生长速度慢，饲料报酬率低。近年来，随着西方猪种的大量引入，中国地方猪遭遇了前所未有的挑战，因此，对地方猪的保种及选育则显得尤为重要。嘉兴黑猪作为太湖猪的一个类别，素有繁殖性能优良的特性，但自2018年非洲猪瘟爆发，地方猪的生存状态堪忧。本发明首次将中国地方猪种嘉兴黑猪作为实验对象，探索GPR54基因多态性与其繁殖性状的关联，可以为嘉兴黑猪的选育提供依据。

我们总共对128头嘉兴黑猪（母猪）进行取样分析，母猪胎次在1~11不等，花了5年左右的时间进行追踪调查。

主要的实验流程包括：

1）GPR54基因扩增

以繁殖性能佳的地方猪种基因为模板，扩增GPR54-Exon2、GPR54-Exon6基因片段（结果表示只在2号外显子和6号外显子上存在突变），扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测；

2）GPR54基因分型

GPR54基因的PCR产物经纯化并测序后得到的峰图通过BioEdit以及DNA star等软件

进行比对分析，寻找SNPs位点；

3）基因型频率、基因频率及群体遗传特性

在嘉兴黑猪群体中，GPR54基因位点的优势等位基因，计算基因频率，χ2检验SNPs位点的平衡状态；

4）GPR54基因多态性及其与嘉兴黑猪繁殖性能的关联分析

所选地方猪各个基因位点的各基因型与母猪的总产仔数、产活仔数、死胎数和初生窝重等繁殖性能关联分析，找到GPR54基因中具有提高母猪总产仔数、产活仔数和初生窝重的趋势的等位基因；

检测到GPR54基因存在3个SNPs，分别在外显子2区域的3739bp处和3878bp处发生T→C突变及C→T突变，在外显子6区域的6789bp处发生T→C突变，且每个SNP位点都存在AB、BB2种基因型，处于Hardy-Weinberg平衡状态。在T3739C位点和C3878T位点处，嘉兴黑猪总群体、初产母猪和经产母猪群体中的各基因型的总产仔数、产活仔数和初生窝重均表现为BB＞AB。在T6789C位点，嘉兴黑猪总群体和经产母猪群体中产活仔数和初生窝重均表现为BB＞AB。

以下结合实施例和附图对本发明进行展开阐述。

实施例1

(1)耳样组织采集：

取猪耳组织样150 mg于EP管中剪碎，按照天根基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA的提取。用Nano 2000测定DNA浓度和OD值；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度；提取的DNA﹣20℃保存，用于后续试验。

(2)耳样组织DNA提取：

耳样组织DNA提取过程为：①用眼科剪剪取0.2g耳组织，去除其表面毛发及酒精，装 入1.5mLEppendorf管中，并尽可能将耳组织剪碎；②DNA的提取采用北京全式金生物科技 有限公司的组织DNA提取试剂盒提取；③将得到的DNA调终浓度至100ng/μL，放在2-8摄 氏度保存；④DNA纯度检测：取1μLDNA在SMA1000上测定OD260/OD280的比值，当 OD260/OD280比值在1.8-2.0之间说明所提DNA纯度较高；⑤质量检测：将所提DNA用1.5％ 琼脂糖凝胶电泳检测，观察提取产物的质量以便进行后续实验。

(3)PCR扩增GPR54基因目的片段（6个外显子）：

以提取的猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系25 μL：2×Taq Master Mix12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O补至25 μL。PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸4min。将PCR扩增产物送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行纯化并测序。测序峰图及序列使用BioEdit以及DNA star等软件进行分析。

(4)群体遗传学特性分析：

采用群体分析软件Genepop（http://genepop.curtin.edu.au）计算GPR54基因各位点的基因型频率、基因频率、多态信息含量（PIC）、群体杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），并对各位点进行χ² Hardy-Weinberg平衡检验。根据固定效应模型，通过SPSS软件中一般线性模型（General Linear Model，GLM）进行基因与繁殖性状的关联分析，并通过最小二乘法分析嘉兴黑猪的繁殖性能在各基因型之间的差异：

Y _i ＝μ＋G _i ＋e _i

式中，Y_i为繁殖性状的记录值；μ为群体均值；Gi为基因效应；e_i为随机残差。

本实施例以嘉兴黑猪为研究对象，测定结果如下：

1、嘉兴黑猪GPR54基因结果

猪耳组织基因组DNA的检测结果：

提取后的DNA经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1，由图1可知，本试验提取的DNA样品质量较好，能够满足本试验的要求，可以进行后续试验。

GPR54基因分型结果：

如图2所示，GPR54基因的PCR产物经纯化并测序后得到的峰图通过BioEdit以及DNAstar等软件进行比对分析，结果发现共检测到3个SNPs位点，如图2所示：分别为T3739C、C3878T和T6789C。其中，GPR54基因在外显子2区域的3739bp处和3878bp处发生T→C突变及C→T突变，在外显子6区域的6789bp处发生T→C突变，且每个SNP位点都存在AB、BB 2种基因型（以GPR54基因3739位点为例，参考基因该位点的碱基为T，但在我们的实验中该位点只发现了CC基因型和TC基因型，未发现野生型即TT基因型。通常我们将野生型视为AA，杂合突变型视为AB，纯合突变型视为BB）。

GPR54基因的基因型频率、基因频率及群体遗传特性结果：

由表1所示，在嘉兴黑猪群体中，GPR54基因的T3739C、C3878T和T6789C位点的优势等位基因均为B等位基因，基因频率分别为0.94、0.98和0.98。经χ2检验，3个SNPs位点均处于平衡状态。根据Botstein等(1980)提出的衡量多态信息的标准，多态信息含量PIC>0.5为高度多态，0.25<PIC<0.5为中度多态，PIC<0.25为低度多态。GPR54基因中所有突变位点均属于低度多态。

2、GPR54基因多态性及其与嘉兴黑猪繁殖性能的关联分析

嘉兴黑猪繁殖性能分析结果：

由表2可知，嘉兴黑猪总群体中的总产仔数、产活仔数、死胎数和初生窝重平均值分别为12.94头、12.29头、1.44头和14.02kg。初产母猪的总产仔数、产活仔数、死胎数和初生窝重平均值分别为12.33头、11.64头、0.88头和13.69kg；经产母猪的总产仔数、产活仔数、死胎数和初生窝重平均值分别为13.29头、12.67头、1.76头和14.17kg。经产母猪总产仔数、产活仔数和死胎数都极显著高于初产母猪（P＜0.01）。

GPR54基因多态性与母猪繁殖性能的关联分析结果：

由表3可知，嘉兴黑猪总群体、初产母猪和经产母猪中，GPR54-T3739C位点的各基因型的总产仔数、产活仔数和初生窝重均表现为BB＞AB，死胎数表现为AB＞BB。除经产母猪外，BB型的总产仔数和产活仔数极显著高于AB型（P＜0.01），且初产母猪中BB型的出生窝重显著高于AB型（P＜0.05）。

由表4可知，除嘉兴黑猪经产母猪中，GPR54-C3878T位点的各基因型的死胎数表现为AB＞BB，差异不显著外（P＞0.05），所有群体中该位点的各基因型的总产仔数、产活仔数、死胎数和初生窝重均表现为BB＞AB，且无显著差异(P＞0.05)。

由表5可知，在嘉兴黑猪总群体中，GPR54-T6789C位点的各基因型的总产仔数和死胎数表现为AB＞BB，产仔活数和初生窝重表现为BB＞AB。在初产母猪中，该位点的各基因型的总产仔数、产活仔数和初生窝重表现为AB＞BB，死胎数表现为BB＞AB。在经产母猪中，该位点各基因型的总产仔数、产活仔数和初生窝重均表现为BB＞AB，死胎数表现为AB＞BB。差异均不显著(P＞0.05)。

综上所述，检测到GPR54基因存在3个SNPs，分别在外显子2区域的3739bp处和3878bp处发生T→C突变及C→T突变，在外显子6区域的6789bp处发生T→C突变，且每个SNP位点都存在AB、BB 2种基因型，处于Hardy-Weinberg平衡状态。在T3739C位点和C3878T位点处，嘉兴黑猪总群体、初产母猪和经产母猪群体中的各基因型的总产仔数、产活仔数和初生窝重均表现为BB＞AB。在T6789C位点，嘉兴黑猪总群体和经产母猪群体中产活仔数和初生窝重均表现为BB＞AB。

Claims (2)

1.影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的GPR54基因分子标记，其特征在于，具有一种或者多种突变；所述突变包括：

外显子2区域的3739bp处具有T→C突变，BB基因型初产母猪的总产仔数、产活仔数和死胎数都显著高于AB型初产母猪；整个群体而言，BB基因型母猪的总产仔数和产活仔数都要高于AB型；

外显子2区域的3878bp处具有C→T突变，AB基因型和BB基因型的母猪的繁殖性状差异并不显著；

外显子6区域的6789bp处具有T→C突变，AB基因型和BB基因型的母猪的繁殖性状差异并不显著。

2.根据权利要求1 所述的GPR54基因分子标记的应用，其特征在于，用于提高嘉兴黑猪繁殖性状的选育。