CN108103070A - Kiss1基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种Kiss1基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用，属于基因工程和细胞工程技术领域。本发明以Kiss1基因为研究对象，采用了分子与细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中表达调控。并通过基因工程技术找出其核心启动子区；再预测该基因核心启动子区潜在结合的转录因子，研究转录因子在卵巢颗粒细胞中对该基因核心启动子区活性的影响，来达到该基因在卵巢颗粒细胞中的表达调控研究。本发明首次证实长大二元杂母猪初情期调控基因Kiss1基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达调控，还通过在猪卵巢颗粒细胞中转录因子Stat4对Kiss1基因的表达调控和在卵巢颗粒细胞中的功能进行研究。本研究实验内容较多，结果齐全、准确。

Description

Kiss1基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用

技术领域

本发明属于基因工程和细胞工程技术领域，具体涉及母猪初情期启动相关基因Kiss1在促进卵巢颗粒细胞中E2(雌二酮)生成的应用。

背景技术

母猪初情期是指青年母猪首次发情并排卵的时期，和母猪的性成熟和繁殖性能有关。研究发现，Kiss1基因与GPR54基因相互作用组成Kiss1/GPR54系统，参与下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)启动初情期，促进动物机体的发育，使母猪具有生育繁殖能力。

动物初情期启动是由复杂的生理神经网络系统调控的，其中最主要的调控系统是HPG系统。HPG在胚胎期既已经存在，出生后逐渐成熟，在胎儿期，HPG系统已经出现分化并且发生作用，但是此后，一直处于抑制状态，直到动物机体达到体成熟，HPG系统在中枢神经的刺激下被激活，从而促进性腺发育和生殖机能成熟。目前已鉴定出参与下丘脑GnRH调控动物初情期启动相关的重要调控基因系统包括Kiss1/GPR54系统、NPY系统、Leptin系统、LIN28系统和NKB系统等。研究表明在小鼠上敲除Kiss1和GPR54基因或者在体内注射kisspeptin都能使GnRH分泌异常，从而影响哺乳动物的繁殖性能。

Kiss1基因是在1996年由Lee发现并命名，最初被认为它可以抑制乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞的转移，位于人类1号染色体1q32～41区。猪的Kiss1基因位于9号染色体上，基因结构包括2个外显子，cDNA长度约为456bp，CDs区长度约为417bp，编码138个氨基酸(臧猛等，2008)，编码的多肽类激素是kisspeptin，经剪切后可以生成含有54个氨基酸的多肽，kisspeptin-54，kisspeptin-54在体内可被分解为kisspeptin-10，kisspeptin-13，kisspeptin-14，它们可以特异性结合G蛋白偶联受体(GPR54)，组成Kiss1/GPR54系统，直接作用于下丘脑，激活GnRH细胞释放GnRH，促进GnRH的释放，进而影响动物机体内的生殖内分泌功能。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种母猪初情期启动相关基因Kiss1在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。

通过基因工程技术构建该基因启动子区的缺失片段，分析各启动子区缺失片段的活性，找出其核心启动子区；通过生物信息学软件预测该基因核心启动子区潜在结合的转录因子，研究转录因子在卵巢颗粒细胞中对该基因核心启动子区活性的影响，来达到该基因在卵巢颗粒细胞中的表达调控研究。

本发明的另一目的在于提供抑制Kiss1基因的RNA小干扰片段(siRNA)。

本发明的另一目的在于提供所述的Kiss1基因核心启动子区潜在结合的转录因子。

本发明的另一目的在于提供所述的转录因子在抑制Kiss1基因表达中的应用。

本发明的另一目的在于提供所述的转录因子在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。

本发明的另一目的在于提供抑制转录因子的RNA小干扰片段(siRNA)。

本发明的再一目的在于提供所述的转录因子在卵巢颗粒细胞中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种母猪初情期启动相关基因Kiss1在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。过表达Kiss1基因后能促进E2的生成，干扰Kiss1基因后抑制E2的生成。

本发明提供一种抑制Kiss1基因的siRNA，序列如下：

Kiss1-siRNA-3：5′-GCCACUUCCUUCAAGGAGA-3′；

本发明提供一种转录因子Stat4作为Kiss1基因核心启动子区的转录因子的应用。

本发明提供所述的转录因子Stat4在抑制Kiss1基因表达中的应用。过表达转录因子Stat4后可抑制Kiss1基因表达，干扰转录因子Stat4后促进Kiss1基因表达。

本发明提供所述的转录因子Stat4在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。过表达转录因子Stat4后会抑制E2的生成，干扰Kiss1基因后能促进E2的生成。

本发明提供抑制转录因子Stat4的siRNA，序列如下：

Stat4-siRNA-1：5′-CCCAAAUGGGAAUGUUGUG-3′；

Stat4-siRNA-2：5′-ACCAUUCGCUGACAUUCUU-3′；

Stat4-siRNA-3：5′-GCUUGGGCAUCCAUCAUUU-3′；

本发明所述的转录因子Stat4在卵巢颗粒细胞中的应用。过表达转录因子Stat4后可以促进卵巢颗粒细胞的凋亡，干扰转录因子Stat4后可以抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。

本发明的验证结果如下：

1、构建含有Kiss1基因CDs区的真核表达载体pcDNA3.1-Kiss1，超表达Kiss1基因找出最适转染的浓度，为200ng。

2、合成3对Kiss1基因干扰小片段/对照(Kiss1-siRNA/Scrambled-siRNA)，筛选并检测其干扰效率。

3、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰Kiss1基因，用FITC Annexin VApoptosis Detection Kit with PI检测细胞凋亡。

4、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰Kiss1基因，用ELISA检测卵巢颗粒细胞上清中E2的含量。

5、构建含有Kiss1基因启动子区缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体，瞬时转染进猪的卵巢颗粒细胞，双荧光素酶报告系统分析Kiss1基因启动子区缺失片段的活性，并确定其核心启动子区，结果显示Kiss1基因启动子区-850bp/-289bp为Kiss1基因的核心启动子区，且存在负向调控元件的结合位点。

6、生物信息学软件预测猪Kiss1基因核心启动子区存在转录因子Stat4(Gene ID：397261)的结合位点，阅读文献查阅转录因子Stat4在卵巢卵泡发育过程中的作用，初步确定转录因子Stat4为猪Kiss1基因核心启动子区的转录因子。

7、ChIP验证Kiss1基因核心启动子区与潜在的转录因子结合情况，结果显示，转录因子Stat4能够结合在Kiss1基因的核心启动子区。

8、构建含有转录因子Stat4CDs区的真核表达载体pcDNA3.1-Stat4，超表达转录因子找出最适转染转录因子的浓度，为200ng。

9、通过双荧光素酶报告分析，得出超表达转录因子Stat4后，Kiss1基因的核心启动子活性降低，采用qRT-PCR和Western blotting在转录水平和翻译水平验证得出：超表达转录因子Stat4后，Kiss1基因的mRNA和蛋白水平表达显著降低。

10、合成3对转录因子Stat4干扰小片段/对照(siRNA-Stat4/Scrambled-siRNA)，筛选并检测其干扰效率。转染基因干扰小片段到卵巢颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的siRNA-Stat4小片段进行后续实验。

11、转录因子Stat4干扰小片段(siRNA-Stat4)转染颗粒细胞，研究干扰转录因子Stat4在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因的表达调控。

12、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰转录因子Stat4，用FITC Annexin VApoptosis Detection Kit with PI检测细胞凋亡。

13、在猪的卵巢颗粒细胞中超表达或者干扰Kiss1基因，用ELISA检测卵巢颗粒细胞上清中E2的含量。

本发明以Kiss1基因(Gene ID：100145896)为研究对象，采用了分子与细胞生物学方法研究其在猪卵巢颗粒细胞中表达调控。关键点在于：(1)超表达或者干扰母猪Kiss1基因，对母猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响以及E2水平的变化；(2)构建含有Kiss1基因启动子区缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体并进行启动子活性分析找出核心启动子区；(3)ChIP验证Kiss1基因核心启动子区与潜在的转录因子结合情况；(4)qRT-PCR和Westernblotting在转录水平和翻译水平验证转录因子Stat4在猪卵巢颗粒细胞中对Kiss1基因的表达调控；(5)超表达或者干扰母猪转录因子Stat4，对母猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响以及E2水平的变化；

研究发现，Kiss1基因与GPR54基因相互作用组成Kiss1/GPR54系统，参与下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)启动初情期，促进动物机体的发育，使母猪具有生育繁殖能力。本发明第一次证实长大二元杂母猪初情期调控基因Kiss1基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达调控，以及在猪卵巢颗粒细胞中转录因子Stat4对Kiss1基因的表达调控和在卵巢颗粒细胞中的功能。

本发明的机理是：

本发明主要通过qRT-PCR检测长大二元杂母猪Kiss1基因的超表达和干扰情况，通过流式细胞仪检测超表达或者干扰Kiss1基因对母猪卵巢颗粒细胞的影响，并使用ELISA试剂盒检测超表达或者干扰Kiss1基因后母猪卵巢颗粒细胞上清中E2的浓度变化，随后使用PCR技术获得母猪Kiss1基因启动子区序列，构建含有Kiss1基因启动子区缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体，瞬时转染进猪的卵巢颗粒细胞，双荧光素酶报告系统分析Kiss1基因启动子区缺失片段的活性，并确定其核心启动子区。生物信息学网站预测Kiss1基因核心启动子区潜在的转录因子结合位点，ChIP验证Kiss1基因核心启动子区与潜在的转录因子结合情况，构建含有转录因子CDs区序列的重组载体和si-RNA，瞬时转染进猪的卵巢颗粒细胞，双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、Western Blot技术分析转录因子对Kiss1基因核心启动子区的活性、mRNA水平和蛋白水平的影响。并通过流式细胞仪检测超表达或者干扰转录因子对母猪卵巢颗粒细胞的影响，此外还使用ELISA试剂盒检测超表达或者干扰转录因子母猪卵巢颗粒细胞上清中E2的浓度变化。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明第一次证实长大二元杂母猪初情期调控基因Kiss1基因在猪卵巢颗粒细胞中的表达调控，本发明除了研究其自身功能以外还通过在猪卵巢颗粒细胞中转录因子Stat4对Kiss1基因的表达调控和在卵巢颗粒细胞中的功能进行研究。本研究实验内容较多，结果齐全、准确。

附图说明

图1是qRT-PCR检测Kiss1基因在卵巢颗粒细胞中的最适转染浓度图。

图2是qRT-PCR检测Kiss1基因3对干扰小片段的干扰效率图。

图3是流式细胞仪检测超表达或者干扰Kiss1基因后卵巢颗粒细胞上清中E2(雌二酮)的水平变化图。

图4是Kiss1基因启动子缺失片段的活性分析图。

图5是ChIP验证Kiss1基因核心启动子区与潜在的转录因子结合情况图；其中，图5A是生物信息学软件预测猪Kiss1基因核心启动子区潜在的转录因子结合位点；图5B是ChIP验证Kiss1基因核心启动子区与潜在转录因子Stat4的结合情况。

图6是超表达转录因子找出转录因子Stat4最适转染浓度的结果图。

图7是验证超表达转录因子Stat4对Kiss1基因的表达调控图；其中，图7A、图7B、图7C分别表示双荧光报告基因验证、qRT-PCR和Western blotting验证。

图8是qRT-PCR检测3对转录因子Stat4干扰小片段的干扰效率图。

图9是验证干扰转录因子Stat4对Kiss1基因的表达调控图；其中，图9A、图9B分别表示qRT-PCR和Western blotting验证结果。

图10是流式细胞仪检测超表达或者干扰转录因子Stat4后卵巢颗粒细胞上清中E2的水平变化图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1卵巢颗粒细胞的培养

(1)在屠宰场采集卵巢，用PBS或者生理盐水(含1％双抗)置于37℃保温瓶迅速运回实验室；

(2)将收集的卵巢在无菌培养室用预热过的PBS(含1％双抗)清洗3遍后，迅速转入超净工作台；用1mL无菌一次性注射器浅插入卵巢有腔卵泡中吸取卵泡液；

(3)吸取的卵泡液置于含有适量DMEM的15mL离心管中，1000rpm室温离心6min；

(4)弃去上清，再用DMEM重悬、离心，重复清洗细胞2次；配制DMEM完全培养基：89％DMEM+10％FBS+1％双抗；

(5)吸取细胞重悬液和完全培养基接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养。

所述的双抗为青霉素和链霉素。

实施例2卵巢颗粒细胞的接种和转染

(1)颗粒细胞长至90％左右，倒掉培养基，用预热的含1％双抗(所述的双抗为青霉素和链霉素)的PBS洗3遍；

(2)加入胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液终止消化；

(3)DMEM清洗2遍，期间1000rpm离心5min；

(4)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；

(5)24h左右，观察颗粒细胞状态，待细胞汇合度达80％左右时准备转染；

(6)转染方法按Invitrogen公司的3000试剂盒说明书进行；每组设置3个重复；

(7)转染后的孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(8)转染后1～3天，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。

实施例3 qRT-PCR

本发明中基因的qRT-PCR检测分别采用美国Thermo公司的SYBR SYBR Green qPCRMix试剂盒。实验采用比较Ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：

基因相对表达量＝2^{-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}}

其中对基因检测用GAPDH做内参，本发明所用到的qRT-PCR引物为：

qRT-PCR-Kiss1 Forward：5′-AACCAGCATCTTCTCACCAGG-3′；

Reverse：5′-CTTTCTCTCCGCACAACGC-3′；

qRT-PCR-GAPDH Forward：5′-TCCCGCCAACATCAAAT-3′；

Reverse：5′-CACGCCCATCACAAACAT-3′；

qRT-PCR-Stat4 Forward：5′-TTGTCTGCTCTACCATTCGCTG-3′；

Reverse：5′-TAACCTTTGTCTCCCCTTTCTG-3′；

细胞的总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体提取步骤如下：

(1)颗粒细胞直接加入TRIzol；

(2)室温下放置10min以充分裂解细胞，12000g离心5min，弃沉淀吸上清于新RNase-free管中；

(3)加入0.2mL氯仿(每1mL TRIzol)剧烈震荡15～30s，室温下放置5min后4℃12000g离心15min；

(4)吸取上层水相置于新RNase-free EP管中；

(5)加入0.5mL异丙醇(每1mL TRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在室温放置10min，4℃12000g离心10min；

(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL 75％乙醇-DEPC(每1mL TRIzol)以洗涤RNA，4℃12000g离心5min后尽量弃上清；

(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；

(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。

mRNA的反转录PCR采用Thermo公司的Thermo Scientific RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit。

实施例4 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI检测

(1)1000转离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

(2)加入1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞浓度为1.0*10⁶个/mL。

(3)吸取100μL上述细胞悬液到另一离心管中，依次加入5μL FITC-AnnexinV，加入5μL PI，轻混匀后，室温(25℃)避光反应15min。

(4)每管加入400μL 1×Binding Buffer，上机进行流式分析。选择合适的通道(FL1通道检测FITC，FL3或者FL2通道检测PI)。

实施例5 ELISA方法测定猪卵巢颗粒细胞上清样本中E2含量

ELISA方法测定猪卵巢颗粒细胞上清样本中E2含量检测，参照CUSABIO公司的PigE2ELISA试剂盒，具体操作步骤如下：

(1)24孔板转染48h后，吸取细胞培养液至无菌的1.5mL离心管，-20℃保存待用。

(2)准备样品和试剂；

(3)设置空白对照；

(4)每孔加入50μL样品；

(5)样品组每孔加入50μL的HRP-conjugate，对照组不加，随后每孔加入50μL抗体，混合均匀；

(6)37℃孵育1h；

(7)用200μL的Wash Buffer洗涤三次；

(8)每孔加入50μL的Substrate A和50μL的Substrate B，混合均匀，37℃孵育15min；

(9)每孔加入50μL的Stop Solution，轻轻吹打，混合均匀，10min之内测完全部样品的OD值。

实施例6荧光素酶报告基因活性检测

荧光素酶报告基因活性检测，参照Promega公司的Dual-Luciferase ReporterAssay System试剂盒，具体操作步骤如下：

(1)转染48h后，吸去旧的培养基，用PBS清洗两次，每孔细胞加入100μL的GloLysis Buffer，室温轻微振摇5min，收集细胞裂解液；

(2)将30μL细胞裂解液加入96孔发光板后，在其中加入75μL Luciferase Assay Reagent，混匀后在20～25℃静置15～30min。在BioTek公司Synergy 2多功能酶标仪上检测发光值，对应于萤火虫荧光素酶的表达水平；

(3)再加入75μL Reagent试剂，混匀后在20～25℃静置15～30min。检测发光值，对应于海肾荧光素酶的表达水平；

(4)萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶表达量的比值为萤火虫荧光素酶相对活性，即为对应靶基因活性(三个重复)。

实施例7 ChIP

交联

(1)加275μL 37％甲醛到10mL培养基中(甲醛终浓度1％)，室温摇床处理10min；

(2)加500μL 10×甘氨酸中和未反应的甲醛，室温摇床处理10min；

(3)彻底吸除培养基；

(4)加1mL预冷1×PBS，轻摇洗涤细胞后弃PBS；

(5)细胞刮刮取细胞，富集至离心管，4℃下，1000g离心5min，弃上清；

(6)加1mL预冷1×PBS，轻摇洗涤细胞后，4℃下，1000g离心5min，弃上清；

(7)吸尽PBS，部分超声裂解及-80℃保存。

超声裂解

(1)加200μL细胞裂解液和1μL蛋白酶抑制剂，4℃下摇床处理30min；

(2)加800μL ChIP稀释液使终体积达到1mL；

(3)自动超声波破碎仪，振幅50W，0.5s on+0.5s off处理20min；

(4)破碎后，4℃下10000g离心15min，将上清移至新的离心管中；

(5)取50μL上清作为input，加50μL稀释液和5μL蛋白酶K，65℃孵育4h。其余-80℃保存；

(6)纯化input，最终加50μL EB溶解DNA；

(7)取5μL DNA用2％琼脂糖凝胶跑胶验证。

染色体免疫沉淀

(1)取60μL磁珠加1mL预冷的PBS洗涤；

(2)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；

(3)加1×BSA封闭磁珠，4℃5min；

(4)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；

(5)加1mL TE缓冲液洗涤磁珠，轻柔混匀后移除上清；

(6)加100μL TE缓冲液和3-5μg抗体，4℃孵育2h；

(7)加1mL细胞破碎液到装有磁珠的管子内，4度孵育过夜；

反向交联和DNA纯化

(1)加1mL预冷的洗液I，4℃摇床处理5min；

(2)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；

(3)加1mL预冷的洗液II，4℃摇床处理5min；

(4)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；

(5)加1mL预冷的洗液III，4℃摇床处理5min；

(6)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；

(7)加1mL预冷的TE缓冲液，4℃摇床处理5min；

(8)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；

(9)加200μL EB和10μL蛋白酶K，65℃孵育4h；

(10)将管子置于磁力架上静置2min，移除上清；

(11)纯化交联后的DNA，溶解于60～100μL的EB中，进行后需检测或-80℃保存。

定性PCR

(1)反应体系(20μL)：

组分	加入量(μL)
		ddH2O	7
2×PCR Premix	10
		Forward Prime(10pmol/μL)	0.5
Reverse Primer(10pmol/μL)	0.5
		DNA	2
总体积	20

注：反应液配制在冰上进行

(2)扩增程序

反应条件为：95℃3分钟，然后95℃10秒，60℃30秒，72℃，1分钟，共40循环，72℃5分钟。

(3)定性PCR琼脂糖凝胶电泳

天平称取1.6g琼脂糖至锥形瓶中，倒入80mL TBE(1×)缓冲液，在微波炉加热溶解1min，轻轻晃动后置室温冷却；冷却至约60℃，加入核酸染料(EB替代物)10μL，轻轻晃动混匀；倒入插有梳子的配胶板中，不能有气泡；室温放置约30min至凝胶完全凝固，从配胶板中取出凝胶至电泳槽中，备用。

(4)电泳

在电泳槽中加入电泳缓冲液(1×TBE)至淹没过凝胶；样本准备：取扩增的PCR产物5μL加入6×Loding buffer 1μL，混匀；点样：用枪头吸取样品轻轻注入电泳孔中，留一孔点样为(100bp)Maker 5ul；电泳条件：120V 40分钟。

实施例8 Western Blotting

(1)单层贴壁细胞总蛋白的提取：倒掉细胞培养液，加入适量预冷的PBS洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。6孔板细胞每孔加入100～200μL蛋白裂解液和10μL 100mM的PMSF，裂解细胞30min。收集细胞裂解液移至1.5mL离心管中，4℃14000rpm离心5min。取部分上清加入上样buffer，煮沸10min。缓慢恢复室温后，稍离心，放于-20℃保存；

(2)SDS-PAGE电泳：BCA法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5:1混合，煮沸5min。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部止；

(3)蛋白质转移：PVDF膜甲醇预处理3～5s，放至转印液浸润30min。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除。100V恒压60～120min；

(4)免疫印记：取出杂交膜，TBST漂洗5min，重复三次。5％脱脂奶粉溶液室温封闭90min，TBST漂洗5min，重复三次。加入PIK3R2和TSC1一抗(PIK3R2一抗：PIK3R2/p85Beta，购自LSBio公司；TSC1一抗：Hamartin，购自biorbyt公司)(1:2000)4℃孵育过夜，TBST洗膜5min，三次。加入二抗稀释液(二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，购自碧云天公司)(1:10000)室温孵育1h，TBST洗膜5min，三次。蒸馏水漂洗膜2min，三次。擦干PVDF膜上的液体，加入化学发光剂放于一胶片上，放入X射线暗盒置于暗房。在暗房内打开暗盒，放入胶片，5min后打开暗盒，拿出胶片。采用Image Plus软件分析胶片中的蛋白条带。

结果分析：

1、qRT-PCR检测Kiss1基因在猪卵巢颗粒细胞中的超表达和干扰效果。结果如图1和图2所示。本研究所选择的超表达浓度为200ng，干扰效果最好的干扰小片段为Kiss1-siRNA-3。

Kiss1-siRNA-1：5′-CCCAUGGAGAAUCCUAGAU-3′；

Kiss1-siRNA-2：5′-CCUACAACUGGAACUCCUU-3′；

Kiss1-siRNA-3：5′-GCCACUUCCUUCAAGGAGA-3′；

2、流式细胞仪检测超表达和干扰Kiss1基因后，卵巢颗粒细胞凋亡情况，结果如表1。超表达和干扰Kiss1基因后，对母猪卵巢颗粒细胞凋亡没有影响。

表1超表达或干扰Kiss1基因后对卵巢颗粒细胞凋亡的影响

3、使用ELISA试剂盒检测超表达和干扰Kiss1基因后，卵巢颗粒细胞培养液里E2的浓度变化，结果如图3所示，超表达Kiss1基因后，促进E2的生成，干扰Kiss1基因后，抑制E2的生成。

4、培养猪的卵巢颗粒细胞，将猪的Kiss1基因启动子缺失片段报告基因重组质粒瞬时转染进猪的卵巢颗粒细胞，以pRL-TK为内参，pRL-TK可以提供组成型表达的海肾萤光素酶，为实验的萤火虫萤光素酶报告基因正态化提供内对照值，进行双荧光素酶活性检测，结果如图4所示，通过猪Kiss1基因启动子缺失片段荧光活性分析得出：重组质粒P0、P1、P2、P3、P4之间活性无显著差异，但是重组质粒P5的活性显著高于P4，这个差异极显著，即可以说明P4和P5之间可能结合着重要的负向调控元件，抑制了启动子的活性，为后续的实验做准备。

5、生物信息学软件预测猪Kiss1基因核心启动子区潜在的转录因子结合位点，预测结果如图5A；ChIP验证Kiss1基因核心启动子区与潜在转录因子Stat4的结合情况，结果如图5B所示，证明转录因子Stat4可以结合在Kiss1基因核心启动子区。

6、构建含有转录因子Stat4CDs区序列的真核表达载体，qRT-PCR检测转录因子Stat4的超表达效果，结果如图6所示，证明转录因子Stat4的超表达效果显著。

7、通过双荧光素酶报告分析，结果如图7A所示，发现超表达转录因子Stat4后，Kiss1基因的核心启动子活性降低。使用qRT-PCR和Western blotting在转录水平和翻译水平验证转录因子Stat4调控Kiss1基因的表达，发现超表达转录因子Stat4后，Kiss1基因的mRNA和蛋白水平表达显著降低。结果如图7B和图7C所示。

8、合成3对转录因子Stat4干扰小片段(Stat4-siRNA)，筛选并检测其干扰效率。结果如图8所示。转染基因干扰小片段到颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好的Stat4-siRNA小片段进行后续实验。

Stat4-siRNA-1：5′-CCCAAAUGGGAAUGUUGUG-3′；

Stat4-siRNA-2：5′-ACCAUUCGCUGACAUUCUU-3′；

Stat4-siRNA-3：5′-GCUUGGGCAUCCAUCAUUU-3′；

上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照Scrambled-siRNA来自广州市锐博生物科技有限公司。

9、转录因子Stat4干扰小片段(Stat4-siRNA-1)转染颗粒细胞，研究转录因子Stat4干扰小片段(Stat4-siRNA-1)对猪Kiss1基因表达调控的影响。通过qRT-PCR和Western blotting在转录水平和翻译水平验证转录因子Stat4干扰小片段调控Kiss1基因的表达。结果如图9A和图9B所示。

10、流式细胞仪检测超表达和干扰转录因子Stat4后，卵巢颗粒细胞的凋亡情况，结果如表2。超表达转录因子Stat4后，可以促进卵巢颗粒细胞的凋亡，干扰转录因子Stat4后，可以抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。

表2超表达或干扰转录因子Stat4后对卵巢颗粒细胞凋亡的影响

11、使用ELISA试剂盒检测超表达和干扰转录因子Stat4后，卵巢颗粒细胞培养液里E2的浓度变化，结果如图10所示，超表达转录因子Stat4后，抑制E2的生成，干扰转录因子Stat4后，促进E2的生成。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> Kiss1基因在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Kiss1-siRNA-1

<400> 1

cccauggaga auccuagau 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Kiss1-siRNA-2

<400> 2

ccuacaacug gaacuccuu 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Kiss1-siRNA-3

<400> 3

gccacuuccu ucaaggaga 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Stat4-siRNA-1

<400> 4

cccaaauggg aauguugug 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Stat4-siRNA-2

<400> 5

accauucgcu gacauucuu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Stat4-siRNA-3

<400> 6

gcuugggcau ccaucauuu 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Kiss1 Forward

<400> 7

aaccagcatc ttctcaccag g 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Kiss1 Reverse

<400> 8

ctttctctcc gcacaacgc 19

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Forward

<400> 9

tcccgccaac atcaaat 17

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Reverse

<400> 10

cacgcccatc acaaacat 18

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Stat4 Forward

<400> 11

ttgtctgctc taccattcgc tg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-Stat4 Reverse

<400> 12

taacctttgt ctcccctttc tg 22

Claims (9)

1.母猪初情期启动相关基因Kiss1在促进卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。

2.一种抑制Kiss1基因的siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列如下：Kiss1-siRNA-3：5′-GCCACUUCCUUCAAGGAGA-3′。

3.一种转录因子Stat4作为Kiss1基因核心启动子区的转录因子的应用。

4.转录因子Stat4在抑制Kiss1基因表达中的应用。

5.转录因子Stat4在抑制卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。

6.抑制转录因子Stat4的siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列如下：Stat4-siRNA-1：5′-CCCAAAUGGGAAUGUUGUG-3′。

7.抑制转录因子Stat4的siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列如下：Stat4-siRNA-2：5′-ACCAUUCGCUGACAUUCUU-3′。

8.抑制转录因子Stat4的siRNA，其特征在于：所述siRNA的序列如下：Stat4-siRNA-3：5′-GCUUGGGCAUCCAUCAUUU-3′。

9.转录因子Stat4在卵巢颗粒细胞中的应用。