CN111088369B - 一种绵羊rora基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法，步骤如下：以待测绵羊基因组DNA为模板，以引物对为扩增引物，利用PCR扩增包含绵羊RORA基因内含子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型；其中，所述插入/缺失多态性位点选自绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23‑bp插入/缺失多态性位点。本方法能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

Description

一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和 应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种技术领域，尤其是一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用。

背景技术

绵羊以其产肉、产奶和产绒性能深受消费者的喜爱，随着人们生活水平的提高，社会对羊肉、羊奶、羊绒等产品的需求越来越高。为了实现高产、优质和高效的绵羊育种目标，人们对绵羊的研究已在分子水平上，以DNA的多态性为标记对绵羊进行基因结构和功能的遗传分析和研究，通过筛查与绵羊产羔数性状密切相关的DNA标记位点并进行检测，并根据其基因多态性与产羔数性状的关联，从而可以加快建立优良产羔数性状绵羊种群，这类标记具有存在较为普遍、遗传稳定、准确度高等优点，因而被广泛应用于各个领域。

分子标记辅助选择(MAS)作为分子遗传标记的常用方法，通过对目标基因所连锁的分子标记的基因型分析从而进行育种，使用这种方法可以大幅度的缩短育种年限，针对某一性状专一选择，从而能够有效的提高育种效率。

近年来，随着测序技术的不断升级与测序成本的降低，插入/缺失(indel)突变作为一种重要的分子遗传标记而逐渐受到人们的重视。插入和缺失(InDels)构成自然突变库的重要组成部分，InDels是由于聚合酶滑移、转座子、不均等交叉等导致的在整个基因组中大量分布的结构，有时可能导致生物体功能的获得或丧失。InDels最常见的类别包括单碱基对插入和缺失，单体碱基对扩展和多碱基对扩展，然而在基因组中包含随机序列和转座子插入的InDel相对较少。由于可以简单的使用凝胶对InDels进行基因分型鉴定，使InDels更具价值。在以前的一些研究中，还发现InDels比微卫星标记更具多态性。如今，InDels已在多种应用中使用，包括种群遗传学，分类学诊断标记，遗传图谱构建和不同农作物中的关联图谱，在动物繁殖性状的选育方面的indel标记的研究和应用较少。在羊上已有的部分关于indels的报道显示：在生长方面，有报道在陕北白绒山羊KDM6A基因内含子区域存在一个16bp的indel可以显著的影响山羊的体高，胸深，体长等生长性状(Wang.et al.,2018)；在繁殖方面，有报道山羊CTNNB1存在一26bp的indel与山羊第一胎产羔数极显著相关(Zhang.et al.,2018)；还有chen等对山羊SPEF2三个indel位点进行了关联分析，发现SPEF12对山羊的产羔数有显著影响(chen et al.,2018)。这些研究都表明InDels对动物分子育种具有重要的意义和参考价值。

ROR家族由三名成员组成，RORA(NR1F1)，RORB(NR1F2)和RORC(NR1F3)。绵羊RORA基因，全称为维甲酸相关孤核受体a(retinoid acid receptor related orphan receptor,RORα,NR1F1)，位于7号染色体上，具有13个外显子和12个内含子，长度约为38.5kb，其cDNA可以编码512个氨基酸的完整开放阅读框。RORA是一种属于类固醇激素受体超家族成员的转录调控因子，它能够直接进入细胞核调节靶基因的转录，从而参与多种重要生理过程的调节，在形态发育、细胞增殖分化、机体稳态维持、生物代谢调控、高级神经功能控制以及免疫调节等方面发挥重要作用，该基因在正常的乳腺、前列腺和卵巢上皮细胞中表达。近年来，RORA在小脑发育、淋巴组织发育、胸腺发育、自身免疫疾病和昼夜节律脂类合成代谢等方面的研究已经比较深入，但RORA在繁殖方面的研究还较为缺乏。

通过检索，尚未发现与本专利申请相关的公开专利文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用，该方法能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性检测用引物对，所述引物对能够用于PCR扩增绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点。

而且，所述引物对为：

上游引物：SEQ NO.1 5'-GGATGGGGCTTGGTGGATTA-3'(20nt)；

下游引物：SEQ NO.2 5'-CAGGTGGTGAGCCATCTTGG-3'(20nt)。

如上所述的绵羊RORA基因插入/缺失多态性检测用引物对在绵羊产羔数分子标记辅助选择育种方面中的应用。

一种包含如上所述的引物对的绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测试剂盒。

一种利用如上所述的引物对的绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法，步骤如下：

以待测绵羊基因组DNA为模板，以引物对为扩增引物，利用PCR扩增包含绵羊RORA基因内含子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型；

其中，所述插入/缺失多态性位点选自绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点。

而且，所述PCR扩增采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12～24s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12～24s，25～30个循环；72℃延伸10min。

而且，所述电泳时采用质量浓度为3.0～3.5％的琼脂糖凝胶。

而且，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型II表现为195bp一条带纹，插入/缺失基因型ID表现为195bp和172bp两条带纹，缺失/缺失基因型DD表现为172bp一条带纹。

一种如上所述的绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法在绵羊产羔数分子标记辅助选择育种方面中的应用。

而且，所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型作为提高绵羊第2胎、第3胎产羔数的DNA标记。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法根据绵羊RORA基因内含子区插入/缺失多态性位点(参考序列NC_040258.1:S.10400_10423)设计引物，以绵羊基因组DNA为模板，通过序列扩增、电泳鉴定，能够简单、快速、低成本、精确地检测所述插入/缺失多态性位点的基因型。

2、本发明方法对绵羊(例如，澳洲白绵羊)RORA基因插入/缺失多态性位点(参考序列NC_040258.1:S.10400_10423)进行基因型和基因频率分析，对该插入/缺失多态性位点与绵羊生产性状进行关联分析，结果表明本发明检测的插入/缺失多态性位点能够作为绵羊产羔数的分子标记位点，从而加快建立产羔数性状优良的绵羊种群，提高良种选育速度。

3、本发明方法以待测绵羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增绵羊RORA基因部分片段，再进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点的基因型。该23-bp插入/缺失多态性位点的不同基因型与澳洲白绵羊的产羔数性状存在显著相关关系，存在提高绵羊第2胎和第3胎产羔数性状的DNA标记。本发明提供的检测绵羊RORA基因插入/缺失多态性的方法，可应用于绵羊分子标记辅助选择育种中，加快建立优良绵羊遗传资源群体。

附图说明

图1为本发明中绵羊RORA基因扩增产物(引物对P1)的琼脂糖凝胶电泳结果；M表示Marker；

图2为本发明中绵羊RORA基因PCR扩增产物测序图，其中：黑色方框标出的部分表示23-bp插入序列：NC_040258.1:S.10400_10423

NC-040258.110400-10423insCCTTCTGGCATTCCAAGGGTTTC。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性检测用引物对，所述引物对能够用于PCR扩增绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点。

较优地，所述引物对为：

上游引物：SEQ NO.1 5'-GGATGGGGCTTGGTGGATTA-3'(20nt)；

下游引物：SEQ NO.2 5'-CAGGTGGTGAGCCATCTTGG-3'(20nt)。

如上所述的绵羊RORA基因插入/缺失多态性检测用引物对在绵羊产羔数分子标记辅助选择育种方面中的应用。

一种包含如上所述的引物对的绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测试剂盒。

一种利用如上所述的引物对的绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法，步骤如下：

以待测绵羊基因组DNA为模板，以引物对为扩增引物，利用PCR扩增包含绵羊RORA基因内含子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型；

其中，所述插入/缺失多态性位点选自绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点。

较优地，所述PCR扩增采用的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12～24s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12～24s，25～30个循环；72℃延伸10min。

较优地，所述电泳时采用质量浓度为3.0～3.5％的琼脂糖凝胶。

较优地，根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型II表现为195bp一条带纹，插入/缺失基因型ID表现为195bp和172bp两条带纹，缺失/缺失基因型DD表现为172bp一条带纹。

一种如上所述的绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法在绵羊产羔数分子标记辅助选择育种方面中的应用。

较优地，所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型作为提高绵羊第2胎、第3胎产羔数的DNA标记。

更为具体地，相关制备步骤如下：

本发明利用PCR方法对所发现的绵羊RORA基因S.10400_10423位点(参考序列：NC_040258.1)突变可能产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与绵羊产羔数性状进行关联分析，验证其是否存在可以作为绵羊分子育种中标记辅助选择的分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1 生化试剂与生物学试剂：①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)；③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2 普通试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等，普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品。

1.3 溶液与缓冲液：所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制；高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)、25min。试剂配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》；

1)提取组织样DNA所用溶液

①2mol/LNaCl：11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌；

②组织DNA提取液(100mL)：1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)1mL、0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，及2mol/LNaCl 5mL，定容至100mL。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL；

②上样缓冲液：含0.25％溴酚蓝以及0.25％二甲苯青FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.设计绵羊RORA基因InDel位点扩增引物

在NCBI上检索绵羊RORA基因的序列(NC_040258.1)，并利用Primer 5.0设计能够扩增RORA基因多个候选InDel位点DNA片段的引物，其中能够扩增绵羊RORA基因第1内含子区S.10400_10423InDel位点的PCR引物对为P1(引物设计完成时间2019年10月)。引物对P1序列见表1。

表1.绵羊RORA基因InDel位点扩增引物表

上述引物对P1对绵羊基因组扩增，能够扩增包含绵羊RORA基因第1内含子区的候选InDel位点(NC_040258.1:S.10400_10423)的片段。理论上，当S.10400_10423位之间的序列CCTTCTGGCATTCCAAGGGTTTC插入时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是195bp大小的带纹；当S.10400_10423位之间的序列CCTTCTGGCATTCCAAGGGTTTC缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是172bp大小的带纹；当S.10400_10423位之间的序列CCTTCTGGCATTCCAAGGGTTTC在一个等位基因上出现插入，在另一个等位基因上出现缺失时，利用引物对P1进行PCR扩增所得到的是大小分别为195bp和172bp的带纹。

3.以引物对P1 PCR扩增待测绵羊RORA基因片段

3.1 绵羊耳组织样品的采集

实验所用的动物共计532个样本，具体信息见表2。产羔数性状数据由原种场工作人员测量，采取个体耳组织样品，样品用70％乙醇保存，冰盒低温带回实验室后置于-80℃冻存。

表2.采样信息

3.2 组织样品基因组DNA的提取与分离

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)和以下文献：蓝贤勇.绵羊重要功能基因遗传变异及其与经济性状的关系[D.]西北农林科技大学博士学位论文，2007，陕西杨凌。

3.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.4 DNA的纯化

参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(2002)。

3.5 分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数。

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至20ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6 PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA(浓度为20ng/μL的绵羊基因组DNA)，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系包括2×Taq PCRSuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL；上游引物0.25μL；下游引物0.25μL(上、下游引物浓度为10pmol/μL)；基因组DNA 0.5μL；去离子水5.5μL；共13μL。

3.7 PCR反应的程序

95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸12s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸12s，25个循环；72℃延伸10min。

4.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测分析

琼脂糖凝胶电泳检测分3步：1)制作3.5％的琼脂糖凝胶，使用核酸染料染色，点样4.5μL，点样后120V电压电泳1.0～1.2h；2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时，在BIO-RADGel Doc 2000凝胶成像系统成像；3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析InDel位点多态性；

对于澳洲白绵羊RORA基因S.10400_10423位存在的23-bp插入/缺失多态性位点，其插入/缺失突变(InDel)在不同绵羊个体中的多态性分析结果参见图1，PCR的扩增产物(引物对P1)经琼脂糖凝胶电泳检测之后，所扩增的对应插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为195bp一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为195bp和172bp两条带纹，缺失/缺失基因型(DD)表现为172bp一条带纹。分析结果经测序进行了验证，见图2。

5.绵羊RORA基因InDel位点的频率统计分析

1)基因和基因型频率

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_YY＝N_YY/N，其中P_YY代表某一位点的YY基因型频率；N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_Y＝(2N_YY+N_Ya1+N_Ya2+N_Ya3+N_Ya4+……+N_Yan)/2N

式中，P_Y表示等位基因Y频率，N_YY表示群体中具有YY基因型的个体数量，N_Yai表示群体中具有Yai基因型个体数量，a1～an为等位基因Y的n个互不相同的复等位基因。

2)统计结果

澳洲白绵羊样本RORA基因S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点的基因型频率及等位基因频率如表3所示。

表3.澳洲白绵羊RORA基因InDel位点基因频率分布表

6.绵羊RORA基因InDel位点基因效应的关联分析

基因型数据：PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳识别的基因型；

生产数据：澳洲白绵羊的每胎产羔数据。

关联分析模型：利用SPSS(18.0)软件来分析品种，不同因素与产羔数性状相关性。首先要对所得数据描述性的统计分析，来确定是不是存在离群值。然后根据数据的特性，利用方差分析、多元线性模型或者t分析进而来分析基因型的效应。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析。此外，根据实际条件来进行取舍，完整模型：Y_ijlm＝μ+S_i+HYS_j+G_l+e_ijlm；其中，Y_ijlm：个体表型记录；μ：总体均值；S_i：产仔年限效应；HYS_j：绵羊群体均值；G_l：基因型的固定效应；e_ijlm：随机误差。第二胎次的结果使用方差分析，第三胎中将n＜3的基因型的个体剔除并做t检验，方差分析结果如表4所示。

表4.绵羊RORA基因InDel位点与澳洲白绵羊每胎产羔数性状方差分析

：平均值肩上字母不同表示差异极显著(P<0.01)；---：表示n数量小于3个，故不做分析。

与此同时，将第二胎和第三胎的结果使用独立卡方(χ2)检验结果如表5所示。

表5.绵羊RORA基因InDel位点与澳洲白绵羊每胎产羔数性状卡方检验

由表4和表5可以看出，RORA基因23-bp InDel多态性对澳洲白绵羊第二胎和第三胎产羔数有显著影响(P<0.05)，ID基因型个体性状优于II和DD基因型个体。因此，绵羊RORA基因23-bp插入/缺失多态性位点(NC_040258.1:S.10400_10423)的ID基因型可作为绵羊产羔数的DNA分子标记。

总之，本发明利用PCR扩增方法检测绵羊RORA基因23-bp插入/缺失多态性位点(NC_040258.1:S.10400_10423)的基因型，并将其与澳洲白绵羊的前五胎产羔数进行关联分析，发现了可以作为绵羊产羔数分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育速度。本发明所建立的绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法，为利用InDel实现绵羊产羔数性状的标记辅助选择(MAS)提供了理论和实践依据。

本发明相关序列如下：

1、人工合成SEQ NO.1

Ggatggggct tggtggatta 20

2、人工合成SEQ NO.2

Caggtggtga gccatcttgg 20

3、NC_040258.1:S.10400_10423位插入序列

Ccttctggca ttccaagggt ttc 23

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津奥群牧业有限公司

<120> 一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物(Unknown)

<400> 1

ggatggggct tggtggatta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物(Unknown)

<400> 2

caggtggtga gccatcttgg 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> NC_040258.1:S.110548_110571位插入序列(Unknown)

<400> 3

ccttctggca ttccaagggt ttc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> S.110548_110571位之间的序列(Unknown)

<400> 4

ccttctggca ttccaagggt ttc 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> S.110548_110571位之间的序列(Unknown)

<400> 5

ccttctggca ttccaagggt ttc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> S.10400_10423位之间的序列(Unknown)

<400> 6

ccttctggca ttccaagggt ttc 23

Claims (6)

1.一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性检测用引物对在绵羊产羔数分子标记辅助选择育种方面中的应用，所述绵羊RORA基因插入/缺失多态性检测用引物对能够用于PCR扩增绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点；

所述引物对为：

上游引物：SEQ NO.1；

下游引物：SEQ NO.2。

2.一种绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法在绵羊产羔数分子标记辅助选择育种方面中的应用；所述绵羊RORA基因插入/缺失多态性的检测方法的步骤如下：

以待测绵羊基因组DNA为模板，以引物对为扩增引物，利用PCR扩增包含绵羊RORA基因内含子区插入/缺失多态性位点的片段，对扩增产物进行电泳，根据电泳结果鉴定所述插入/缺失多态性位点的基因型；

其中，所述插入/缺失多态性位点选自绵羊RORA基因 NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点；

所述引物对能够用于PCR扩增绵羊RORA基因NC_040258.1:S.10400_10423位23-bp插入/缺失多态性位点；

所述引物对为：

上游引物：SEQ NO.1；

下游引物：SEQ NO.2。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型作为提高绵羊第2胎、第3胎产羔数的DNA标记。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增采用的反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸12~24 s，18个循环，每循环后退火温度减1 ℃；50 ℃退火30 s，72 ℃延伸12~24 s，25~30个循环；72 ℃延伸10 min。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述电泳时采用质量浓度为3.0~3.5%的琼脂糖凝胶。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：根据电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型 II 表现为195bp一条带纹，插入/缺失基因型 ID 表现为195 bp和172bp两条带纹，缺失/缺失基因型 DD 表现为172bp一条带纹。

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