CN107250379A - 结合蛋白质组信息和基因组信息的高通量单细胞分析 - Google Patents

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Abstract

在此披露了用于单细胞测序的方法。在一些实例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品；分离该富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息。获得序列信息可以包括生成来自该一种或多种分离的细胞的分子索引的多核苷酸文库。富集该样品可以包括使用声聚焦聚集该样品中感兴趣的细胞。

Description

结合蛋白质组信息和基因组信息的高通量单细胞分析
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年2月19日提交的美国临时申请号62/118412的优先权。此相关申请的内容明确地通过引用以其整体结合在此。
背景技术
技术领域
本披露总体上涉及分子生物学的领域，并且更具体地涉及高通量单细胞分析。
相关技术的说明
用于流式细胞术的方法和技术适用于细胞分析，具体地是解密细胞表面蛋白质的表达谱以确定细胞的状态。用于mRNA测序的方法和技术适用于细胞分析，具体地是解密基因表达谱，以使用例如下一代测序(“NGS”)确定细胞的状态。当对感兴趣的细胞和不感兴趣的细胞两者的样品进行时，这些方法和技术确定这些细胞在这些样品中的平均状态。然而，细胞至细胞的变化可能存在于不同细胞中，因此这些方法和技术对于感兴趣的细胞具有差的信噪比。而且，细胞的基因表达谱可能不是细胞的蛋白质表达谱的准确代理。因此，需要改进的分离和测序单细胞(包括感兴趣的细胞)的低成本方法以及能够高效且有效地结合基因组信息和蛋白质组信息以进行细胞分析的方法。
概述
本披露提供了用于单细胞测序的方法。在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品；分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息，其中获得序列信息包括生成来自该一种或多种分离的细胞的分子索引的多核苷酸文库。在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品，其中富集该样品包括使用声聚焦来聚集样品中感兴趣的细胞；分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息。
在一些实施例中，富集该样品包括以下各项中的一种或多种：聚集样品中感兴趣的细胞和消除样品中不感兴趣的细胞。聚集感兴趣的细胞可以包括使用例如声聚焦将样品中感兴趣的细胞聚集到细胞核心流中。聚集样品中感兴趣的细胞可以包括基于细胞大小聚集样品中感兴趣的细胞。例如，聚集感兴趣的细胞包括聚集各自具有预定范围内的大小的细胞。在一些实施例中，消除样品中不感兴趣的细胞包括消除具有不属于预定范围内的大小的细胞。声聚焦可以包括：将样品中的多个细胞悬浮在细长流体填充通道中；并且将所述通道暴露于平行于流动方向的轴向声驻波场，其中所述轴向声驻波场将多个细胞沿着所述通道的中心轴驱动到潜在力最小值的位置，以产生均匀间隔的细胞。在一些实施例中，聚集感兴趣的细胞包括流体动力学聚焦、磁场聚焦、电场聚焦、重力场聚焦、光学场聚焦或其组合。在一些实施例中，该方法可以包括消除样品中的干扰细胞和碎片中的一种或多种。
在一些实施例中，从富集的细胞样品中分离一种或多种感兴趣的细胞包括使用流式细胞仪分选富集的细胞样品中的细胞。流式细胞仪可以利用荧光激活细胞分选。分离样品中的一种或多种感兴趣的细胞可以包括将样品中的一种或多种感兴趣的细胞沉积到一个或多个微量滴定板中。一个或多个微量滴定板中的每一个可以具有例如至少96个孔。
在一些实施例中，该一种或多种多核苷酸包括RNA，诸如mRNA，并且可以从外来体中获得。序列信息可以例如包括至少10种基因的转录物计数，例如CD4、FOX01、CD45RO、MYC、IL1R2、PRF1、GZMK、LGALS1、IL17F、IL23R、LYNX1、PRDM1、SELL、SMAD4、ICOS、IKZF5、RORC、AHRR、CTLA4、ITGB7、ENTPD1、CCR8、TSHR、TGFB2、IL12A、IL7R、HLA-DMA、CCR5、TIAF1、BCL6、BHLHE40、CXCR4、CD307c、CD3D、GSTP1、TCF7、CD3E、RNB6、RB1、MYB、CD3G、KRT8、CDH1、ERBB3、ERBB2、TCTN1、ESR1、CDKN1A、TFF3、ABCB1、ABCG2、ADAM23、AKTl、APC、AR、ATM、BAD、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、C4A、CA12、CCNA1、CCND1、CCND2、CCNE1、CDH1、CDH13、CDK2、CD326、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CSF1、CST6、CTNNBl、CTSD、EGF、EGFR、EMAP-2、ERBB2、ERBB3、ESR1、ESR2、FOXA1、GATA3、GLI1、GPI、GRB7、GSTP1、HIC1、HPRTl、ID1、IGF1、IGF1R、IGFBP3、IL6、JUN、KRT18、KRT19、KRT5、KRT8、LAMPl、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MGMT、MKI67、MLH1、MMP2、MMP9、MUC1、MYB、MYC、NME1、NOTCH1、NR3C1、PGR、PLAU、PRDM2、PSMB2、PSMB4、PTEN、PTGS2、PYCARD、RAB7A、RARA、RARB、RASSF1、RB1、REEP5、RNB6、SERPINE1、SFN、SFRP1、SLC39A6、SLIT2、SNAI2、SRC、TBC1D9、TCTN1、TFF3、TGFB1、THBS1、TP73、TWIST1、VEGFA、XBP1、CD3E、CD3G、CD3G、TCF7、ALCAM、CD25、ITGA6、THY1、PROM1以及CXCR4。在一些实施例中，不超过500个细胞可以从富集的细胞样品中分离。
在一些实施例中，获得序列信息包括对分子索引的多核苷酸文库进行测序并且可能对由文库测序获得的测序结果进行去卷积。在一些实施例中，对测序结果进行去卷积包括使用软件即服务平台。
在一些实施例中，样品可以包括或者可以是生物样品、临床样品、环境样品或其组合。在一些实施例中，该样品可以包括来自患者的生物流体、组织和细胞中的一种或多种。在一些实施例中，该样品可以包括血液、尿液、脑脊液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髓、活检样品或其组合。
在一些实施例中，样品中感兴趣的细胞包括干细胞、癌细胞、血细胞、外周血单核细胞、循环肿瘤细胞、乳腺癌细胞、处于预期细胞周期阶段的细胞或其组合。在一些实施例中，这些方法包括以下各项中的一种或多种：基于所获得的序列信息确定患者的基因型；基于所获得的序列信息确定患者的表型；基于所获得的序列信息确定患者的一种或多种遗传突变；并且预测患者对一种或多种疾病的易感性。一种或多种疾病中的至少一种可以是例如癌症或遗传性疾病。在一些实施例中，样品中细胞总数目的小于10％、1％、0.1％或0.01％是感兴趣的细胞。
附图简要说明
图1A-图1B是示出细胞分析的非限制性示例性工作流程的流程图，这些工作流程包括例如细胞富集和分选、分子索引、文库制备、测序以及数据分析。
图2是示出用于生成来自一种或多种细胞的分子索引的多核苷酸文库的非限制性示例性方法的非限制性示意图。
图3是通过与支持物结合探针的阵列杂交进行的随机标记和计数的非限制性实施例的示意图。
图4A-图4B是标记靶标分子并检测标记的靶标的非限制性示意图。图4A示出使用标记库标记靶标分子的示意图。图4B示出在具有标记特异性和靶标特异性的特征的阵列上检测标记的靶标的示意图。
图5是声聚焦的非限制性示意图。
图6A-图6C是声聚焦的非限制性示意图。
图7是声聚焦的非限制性示意图。
图8是结合声聚焦和流体动力学聚焦的非限制性示意图。
图9是细胞分选仪系统的非限制性示意图。
图10是示出数据分析的非限制性示例性步骤的流程图。
图11A-图11F示出用于下一代测序的单细胞的门控。
图12A-图12B是示出从单细胞获得的读取和转录物数目的柱状图。
图13是示出分子索引测定校正了PCR偏移的计数读取相对于分子的图。
图14A-图14B是调节T细胞(Treg)相对于非调节T细胞和原初调节T细胞相对于效应调节T细胞的主要组分分析(“PCA”)图，这些图显示表面标记物表型与分子谱相关。
图15A-图15C是CD45RA-CD15S+、CD161-非抑制性调节T细胞和CD45RA+CD15S-效应调节T细胞穿过时间点的PCA单细胞图。
图16A-图16C是示出单细胞的细胞周期分析的图。
图17A-图17B是示出单细胞和少量细胞的准确递送的图。
图18A-图18B是示出通过细胞分选仪进行的单细胞分离的图。
图19A-图19C示出Jurkat细胞和T47D细胞的PCA群集和基因表达谱。图19A是示出Jurkat细胞和T47D细胞到两个簇中的群集的PCA图。图19B-图19C是示出Jurkat细胞簇1和T47D细胞簇2的基因表达谱的柱形图。
图20A-图20B是示出CD44和Her2/Neu的相对蛋白质表达的图。
图21A-图21D是示出由Jurkat、Hela、T47D以及SKBR3中的Her2/Neu蛋白质表达限定的三个群体的图。
图22是示出使用分子索引分析的乳腺癌基因的表格
图23是示出所表达的靶基因的分析的热图，该热图证明了四种不同细胞类型之间的明显不同。
图24A-图24B是示出由具有支持热图结果的随机Her2/Neu表达的细胞类型进行的群集的PCA图。
图25A-图25G是示出ERBB2、BRCA1、CDK2、MUC1、CDH1、CTSD以及CTSD的逐步增加的表达图。
详细说明
在以下详细说明中参考了形成本说明的一部分的附图。在图中，相似的符号典型地标识相似的部件，除非上下文另外规定。在详细说明、附图以及权利要求书中所描述的说明性实施例并不意在进行限制。在不脱离在此呈现的主题精神或范围的情况下，可以采用其他实施例，并且可以做出其他改动。易于理解的是，如在此总体所述的和在附图中示出的本披露的方面可以各种的不同构造方式进行布置、取代、组合、分隔和设计，所有这些明显是涵盖的并且组成在此的披露内容的一部分。
定义
除非另有定义，否则在此所使用的技术和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。参见例如辛格尔顿(Singleton)等人，微生物学和分子生物学字典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)第2版，约翰·威利父子公司(J.Wiley&Sons)(纽约州纽约市(New York,NY)1994)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，冷泉港出版社(ColdSprings Harbor Press)(纽约冷泉港(Cold Springs Harbor,NY)1989)。出于本披露的目的，以下术语定义如下。
如在此所用，术语“衔接子”可以意指有利于相缔合的核酸的扩增或测序的序列。相缔合的核酸可以包括靶核酸。相缔合的核酸可以包括样品标记和分子标记中的一种或多种。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一个或多个衔接子可以位于核酸的5’或3’端上。当衔接子包含在5’和3’端上的已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’和/或3’端上的衔接子可以能够与固定在表面上的一种或多种寡核苷酸杂交。衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两个或更多个核酸分子共有的核苷酸序列区域。两个或更多个核酸分子还可以具有序列不同的区域。因此，例如，5’衔接子可以包含相同或通用核酸序列并且3’衔接子可以包含相同或通用序列。可以存在于多个核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单一通用引物复制或扩增多种不同的序列。类似地，可以存在于一批核酸分子的不同成员中的两种(例如一对)或更多种通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一种、两种(例如一对)或更多种单一通用引物复制或扩增多种不同的序列。因此，通用引物包含可与这种通用序列杂交的序列。携带靶核酸序列的分子可以被修饰成将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)连接到不同的靶核酸序列的一端或两端，这些衔接子提供用于通用引物杂交的位点。在衔接子-靶标-衔接子的5’端和3’端处的衔接子可以是相同或不同的。
如在此所用，术语“相缔合的”或“与...相缔合的”可以意指两种或更多种物质在某一时间点可识别为共定位。缔合可以意指两种或更多种物质在或曾经在类似容器内。缔合可以是信息学关联，其中例如关于两种或更多种物质的数字信息被存储并且可以用于确定一种或多种物质在某一时间点共定位。缔合还可以是物理缔合。在一些实施例中，两种或更多种相缔合的物质彼此“系接”、“连接”或“固定”，或“系接”、“连接”或“固定”至共同的固体或半固体表面。缔合可以是指用于将标记连接至固体或半固体支持物诸如珠的共价或非共价方式。缔合可以是靶标与标记之间的共价键。
如在此所使用，术语“互补”可以是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸的指定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键结合，则认为两个核酸在那一位置是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在总体互补性时该结合可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则可以称为第一核苷酸序列是第二序列的“补体”。如果第一核苷酸序列与反向(即核苷酸的顺序是相反的)于第二序列的序列互补，则可以称为第一核苷酸序列是第二序列的“反向补体”。如在此所用，术语“补体”、“互补性”和“反向补体”可以互换使用。从本披露中理解的是，如果分子可以与另一分子杂交，则该分子可以是杂交分子的补体。
如在此所用，术语“数字计数”可以是指用于估计样品中靶分子的数目的方法。数字计数可以包括确定已与样品中的靶标相缔合的独特标记数目的步骤。这种随机方法将计数分子的问题从定位并识别相同分子的一个问题转变成关于检测一组预定义的标记的一系列是/否数字问题。
如在此所用，术语“一个标记”或“多个标记”可以是指与样品内的靶标缔合的核酸编码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是整体或部分可扩增的标记。标记可以是整体或部分可测序的标记。标记可以是天然核酸中可识别为不同的一部分。标记可以是已知序列。标记可包括核酸序列的接点，例如天然序列和非天然序列的接点。如在此所用，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在不同的实施例中，标记可用于确定样品身份、样品来源、细胞身份和/或靶标。
如在此所用，术语“mRNA”或有时提及的“mRNA转录物”包括但不限于一种或多种前-mRNA转录物、转录物加工中间体、准备用于翻译的一种或多种成熟mRNA和这种或这些基因的转录物或者衍生自一种或多种mRNA转录物的核酸。转录物加工可以包括剪接、编辑和降解。如在此所用，衍生自mRNA转录物的核酸是指最后以mRNA转录物或其子序列充当模板来合成的核酸。因此，由mRNA逆转录的cDNA、由cDNA转录的RNA、由cDNA扩增的DNA、由扩增的DNA转录的RNA等等全部是衍生自mRNA转录物并且此类衍生的产物的检测指示初始转录物在样品中的存在和/或丰度。因此，mRNA衍生的样品包括但不限于这种或这些基因的mRNA转录物、由mRNA逆转录的cDNA、由cDNA转录的cRNA、由这些基因扩增的DNA、由扩增的DNA转录的RNA等等。
如在此所用，术语“下一代测序”是指与传统基于桑格(Sanger)电泳和毛细管电泳的方法相比具有增加的通量的测序技术，例如具有一次生成数百上千或数百万的相对短的序列读取的能力。下一代测序技术的实例包括但不限于通过合成进行的测序、通过连接进行的测序和通过杂交进行的测序。下一代测序方法的实例包括但不限于焦磷酸测序，如通过GS Junior和GS FLX系统(454生命科学公司(Life Sciences)，康乃狄克州布兰福德(Bradford,CT))使用的；通过合成进行的测序，如通过Miseq和Solexa系统(依诺米那有限公司(Illumina,Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))使用的；SOLiDTM(通过寡核苷酸连接和检测进行测序)系统和离子半导体测序(Ion Torrent Sequencing)系统诸如个人染色体检测仪或质子测序仪(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))，以及纳米孔测序系统(牛津纳米孔技术公司(OxfordNanopore Technologies)，英国牛津(Oxford,united Kingdom))。
如在此所用，术语“非消耗贮存池(non-depleting reservoirs)”可以是指由许多不同的标记组成的随机条形码库。非消耗贮存池可以包含大量的不同随机条形码，使得当非消耗贮存池与靶标库缔合时，每个靶标很可能与独特的随机条形码缔合。每个标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计学确定，并且取决于与标记的多样性相比集合体中相同靶分子的拷贝数。所得到的标记的靶分子组的大小可以通过条形编码过程的随机性质和检测到的随机条形码的数目分析确定，然后允许计算原始集合体或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数与独特的随机条形码的数目之比较低时，标记的靶分子是高度独特的(即一个给定的标记将对一个以上的靶分子加标记的概率非常低)。
如在此所用，“核酸”可以通常是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对细胞可以是外源性或内源性的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或多种类似物(例如改变的骨架、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、xeno核酸、吗啉化合物、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、蛹虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，连接至糖的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷以及怀俄苷。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。
核酸可以包含一个或多个修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)以提供具有新的或增强的特征(例如，改善的稳定性)的核酸。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基可以杂环碱基。此类杂环碱基的两种最常见的种类是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包含共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包含戊呋喃糖的那些核苷，磷酸酯基团可以连接至糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸时，磷酸酯基团可以共价连接彼此相邻的核苷以形成线性聚合化合物。进而，该线性聚合化合物的对应末端可以进一步连接以形成环状化合物；然而，线性化合物通常是适合的。此外，线性化合物可以具有内部的核苷酸碱基互补性并且因此可以便于产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸内，磷酸酯基团可以通常涉及形成核酸的核苷间骨架。键联或骨架可以是3’至5’磷酸二酯键。
核酸可以包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间键联。修饰的骨架可以包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。其中含有磷原子的适合的修饰的核酸骨架可以包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(诸如3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基膦酸三酯、硒代磷酸酯以及具有正常3'-5'键联、2'-5’键联类似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中一个或多个核苷酸间键联是3’至3'、5’至5'或2'至2’键联的反向极性的那些。
核酸可以包含这样的多核苷酸骨架，这些多核苷酸骨架通过短链烷基或环烷基核苷间键联、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键联、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键联形成。这些骨架可以包括具有以下各项的那些：吗啉代键联(部分地从核苷的糖部分中形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；核乙酰基(riboacetyl)骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组分。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以旨在包括这样的多核苷酸，其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键联两者被非呋喃糖基团置换，仅呋喃糖环的置换也可以称之为糖替代物。杂环碱基部分和修饰的杂环碱基部分可以被保持以用于与适当的靶核酸的杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架被含酰胺骨架，具体地氨基乙基甘氨酸骨架置换。核苷酸可以被保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。PNA化合物中的骨架可以包含给予PNA含酰胺骨架的两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元。杂环碱基部分可以直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。
核酸可以包含吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包含6元吗啉代环以取代核糖环。在这些实施例中的一些中，二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷酸间键联可以置换磷酸二酯键。
核酸可以具有连接的吗啉代单元(即吗啉代核酸)，这些吗啉代单元具有连接至吗啉代环的杂环碱基。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物可以与细胞蛋白质具有不太希望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代种类内的多种化合物可以使用不同的连接基团连接。另一种类的多核苷酸模拟物可以称之为环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中正常地存在的呋喃糖环可以被环己烯基环置换。可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并且将其用于使用亚磷酰胺化学的寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入到核酸链可以增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可以与核酸补体形成复合体，这些复合体具有与天然复合体类似的稳定性。另一修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团连接至4’糖环的碳原子，从而形成2’-C、4’-C-氧基亚甲基键，从而形成二环糖部分。键可以是桥接2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以表现出与互补核酸相当高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、3’核酸外切降解稳定性和良好的溶解特性。
核酸还可以包含核碱基(经常简称为“碱基”)修饰或取代。如在此所用，“非修饰”或“天然”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))，以及嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U))。修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基具体地5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、酚噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G夹环(G-clamp)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、酚噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G夹环诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如在此所使用，术语“固体支持物”可以是指多种分子标记或随机条形码可以连接到其上的离散固体或半固体表面。固体支持物可以涵盖由核酸可固定(例如共价地或非共价地)在其上的塑料、陶瓷、金属或聚合物材料(例如水凝胶)组成的任何类型的固体、多孔或中空球体、球、轴承、圆柱或其他类似的构造。固体支持物可以包括离散颗粒，该离散颗粒可以是球形(例如微球)或具有非球形或不规则形状诸如立方体、长方体、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等等。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。
如在此所用，术语“随机条形码”可以是指包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机标记的多核苷酸序列。随机条形码可以用于定量样品内的靶标。与靶标相缔合的随机条形码可以称为随机条形码-靶标或随机条形码-标签-靶标。
如在此所用，术语“随机条形编码”可以是指核酸的随机标记(例如条形编码)。随机条形编码可以利用递归泊松策略来相关联和定量与靶标缔合的标记。
如在此所用，术语“靶标”可以是指可以与随机条形码或分子鉴定物标记相缔合的成分。适合用于由本披露方法、装置和系统进行的分析的示例性靶标包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微小RNA、tRNA等等。靶标可以是单链或双链的。在一些实施例中，靶标可以是蛋白质。在一些实施例中，靶标是脂质。
术语“逆转录酶”可以是指具有逆转录酶活性(即催化由RNA模板对DNA的合成)的一组酶。一般来讲，此类酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II组内含子衍生的逆转录酶以及其突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶以及II组内含子逆转录酶。II组内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococc s lactis)Ll.LtrB内含子逆转录酶、嗜热细长聚球藻(Thermosynechococcus elongates)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他种类的逆转录酶可以包括许多种类的非逆转录病毒逆转录酶(即转录子、II组内含子以及多样性产生的逆转录因子等等)。
在本披露中，披露了用于成本有效的、高通量的细胞分析(诸如单细胞分析)的方法。这些方法适用于高分辨率基因组研究，包括NGS、qPCR和微阵列分析。在一些实施例中，在此披露的方法将细胞分选与分子索引相结合。在一些实施例中，这些方法也可以包括细胞分选之前的富集步骤并且进行分子索引。在一些实施例中，这些方法包括使用流式细胞术诸如荧光激活细胞分选(“FACS”)来分离感兴趣的细胞。能够分离单细胞的流式细胞仪包括但不限于BD(新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes,NJ))FACSJazzTM细胞分选仪和BDFACSSeqTM细胞分选仪。分子索引技术包括例如来自细胞研究有限公司(CellularResearch,Inc.)(加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto,CA))的PreciseTMMolecularIndexingTM技术。如在此所披露的蛋白质组分析和基因组分析的结合允许对细胞进行综合研究。例如，分子索引技术可以用于研究在转录水平下的细胞活性，例如定量感兴趣的细胞中的mRNA转录物，并且细胞分选方法可以用于研究在翻译水平下的细胞活性，例如测定由细胞进行的蛋白质表达。在多个水平下的细胞活性的知识可以提供细胞生物学的不同方面并且检测细胞中的异常，例如在转录与翻译之间的相关性的缺乏。
在此披露的一些实施例提供了多核苷酸测序(诸如单细胞多核苷酸测序)的方法。在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品；从富集的细胞样品中分离一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息。在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品；从富集的细胞样品中分离一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息，其中获得序列信息包括生成来自该一种或多种分离的细胞的分子索引的多核苷酸文库。在一些实施例中，富集样品可以包括例如聚集样品中感兴趣的细胞。感兴趣的细胞可以使用例如声聚焦来聚集到细胞核心流中。
图1A是示出非限制性示例性方法100A的流程图，该方法结合细胞富集、细胞分选的步骤并且获得关于样品分析的序列信息。该方法在104A处开始。在110A处，该方法可以通过例如磁力地去除不感兴趣的细胞、干扰细胞以及碎片并且声聚集样品中感兴趣的细胞来富集样品中感兴趣的细胞。在116A处，感兴趣的细胞从富集的细胞样品中分离。分离可以通过例如细胞分选(包括单细胞分选)来进行。分离的细胞的序列信息可以在120A处通过例如分子索引和测序诸如NGS来获得。从步骤120A中获得的序列信息可以任选地在124A处进行分析，之后该方法在128A处完成。在该方法中，富集步骤110A和细胞分选步骤116A中的一个或多个可以利用聚焦技术。聚焦技术的非限制性实例包括但不限于声聚焦、流体动力学聚焦、磁场聚焦、电场聚焦、重力场聚焦、光学场聚焦或其任何组合。在一些实施例中，富集步骤110A可以利用磁力地消除干扰细胞和碎片的技术。
图1B是示出非限制性示例性方法100B的流程图，该方法是从细胞富集和分选、分子索引、文库制备、测序以及数据分析。该方法在104B处开始。一种或多种在线富集系统可以包括例如在108B处从样品中磁力地去除不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片。在线富集系统可以利用结合不感兴趣的细胞的BD ImagTM磁力分离珠。细胞可以在112B处声聚集以增加感兴趣的细胞的浓度，之后在116B处进行细胞分选。样品中感兴趣的细胞可以被染色，以在116B处使用细胞分选仪进行分选。细胞分选仪的实例包括但不限于BD FACSJazzTM细胞分选仪、BD FACSseqTM细胞分选仪、伯乐实验室有限公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)(加利福尼亚州赫拉克勒斯(Hercules,CA))S3eTM细胞分选仪、索尼生物技术有限公司(SonyBiotechnology Inc.)(加利福尼亚州圣何塞(San Jose,CA))SH800细胞分选仪、贝克曼库尔特有限公司(Beckman Coulter Inc.)(加利福尼亚州布雷亚(Brea,CA))MoFloTMXDP细胞分选仪。在116B处分选细胞之后，可以将细胞裂解以在120B处进行分子索引和文库制备并在122B处进行测序。从步骤122B中获得的序列信息可以任选地在124B处进行分析，之后该方法在128B处完成。
在一些实施例中，可以有利的是，于在此所披露的方法中具有一个富集步骤，因为该步骤可以允许更迅速地进行细胞分选而较少受到不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片的干扰。在一些实施例中，在细胞分选之前利用声聚焦使得能够有效且快速地富集感兴趣的细胞。这可以提供分选时间的减少，例如从数小时至数分钟和数秒。如本领域技术人员将了解的，快速分选方法可以防止细胞死亡的恶化、生理条件和细胞状态的变化和/或由于长加工时间而导致的细胞死亡。在一些实施例中，活细胞群可以在其生命周期的同一点处或者在其正常生理条件和状态下进行分析。
分子索引和文库生成
在此披露的单细胞测序方法可以包括通过对来自样品中的一种或多种分离的细胞的靶标进行分子索引来获得序列信息。靶标可以例如是多核苷酸。多核苷酸可以是例如DNA或RNA(例如，mRNA)。分子索引(有时称为分子条形编码或分子加标签)可以用于例如高选择性单分子计数。例如，来自一种或多种分离的细胞的相同的多核苷酸分子集合体可以连接至一组不同的标记，以用于分子索引。这些标记各自可以包含例如分子标记(也称为分子索引)。在一些实施例中，这些方法包括对来自1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、600、800、1000、2000、5000、10000个细胞或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的细胞的多核苷酸进行分子索引。
分子索引可以例如用于鉴定所索引的多核苷酸的起源(例如，指示所索引的多核苷酸是来自组织、细胞和/或容器)和/或告知所索引的多核苷酸的身份。该容器可以是板、孔、微滴、分隔件、管或类似容器。所索引的多核苷酸可以包括例如有待索引的多核苷酸(例如，mRNA、基因组DNA或cDNA)和含有一个或多个标记的标记区。在一些实施例中，所索引的多核苷酸可以进一步包含通用PCR区和衔接子区中的一种或多种。作为实例，所索引的多核苷酸可以位于容器(例如，微量滴定板)中，并且所索引的多核苷酸可以进一步包括用于鉴定索引多核苷酸所位于的板的独特标记(例如，样品条形码)。用于鉴定该板的区域的实例是板索引。在一些实施例中，标记区可以包含两个或更多个标记。例如，标记区可以包含分子标记(也称为分子索引)和样品标记(也称为样品条形码)。标记的长度可以发生改变。例如，标记(例如，分子标记或样品标记)的长度可以是或者是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20个核苷酸或更长的。在一些实施例中，分子标记的长度是或者是约5个核苷酸，并且样品标记的长度是或者是约5个核苷酸。在一些实施例中，分子标记的长度是或者是约10个核苷酸，并且样品标记的长度是或者是约10个核苷酸。
在一些实施例中，对多核苷酸进行分子索引包括生成来自一种或多种分离的细胞的分子索引的多核苷酸文库。生成分子索引的多核苷酸文库包括生成来自一种或多种分离的细胞的多个索引的多核苷酸。例如，对于包含第一索引的多核苷酸和第二索引的多核苷酸的分子索引的多核苷酸文库，第一索引的多核苷酸的标记区与第二索引的多核苷酸的标记区的不同之处可以是至少一个、两个、三个、四个或五个核苷酸。在一些实施例中，生成分子索引的多核苷酸文库包括将多个mRNA分子与多种寡核苷酸(包括聚(T)区和标记区)接触；并且使用逆转录酶进行第一链合成，以产生单链标记的cDNA分子，每个cDNA分子包含cDNA区和标记区，其中该多个mRNA分子包括具有不同序列的至少两个mRNA分子并且该多种寡核苷酸包括具有不同序列的至少两种寡核苷酸。生成分子索引的多核苷酸文库可以进一步包括扩增单链标记的cDNA分子，以产生双链标记的cDNA分子；并且对双链标记的cDNA分子进行嵌套式PCR，以产生标记的扩增子。在一些实施例中，该方法可以包括生成衔接子标记的扩增子。
分子索引使用核酸条形码或标签来标记个别DNA或RNA分子。在一些实施例中，当cDNA分子由mRNA生成时，分子索引涉及将DNA条形码或标签添加到cDNA分子中。嵌套式PCR可以被进行来使PCR扩增偏移最小化。衔接子可以被添加来使用例如NGS进行测序。
图2是示出生成来自一种或多种细胞的分子索引的多核苷酸文库的非限制性示例性方法的示意图。如步骤1所示，逆转录过程可以编码具有具有独特分子标记、样品标记和通用PCR位点的每个mRNA分子。分子标记也称为分子条形码和分子索引。样品标记也称为样品条形码和样品索引。标记使得例如96孔形式的一个或多个多层滴定板中的所有样品合并在一起以用于随后的步骤。具体地，通过将一组分子鉴定物标记210与RNA分子202的聚(A)尾部区208随机杂交，RNA分子202可以被逆转录来产生标记的cDNA分子204(包括cDNA区206)。每个分子鉴定物标记210可以包含聚(dT)区212、标记区214和通用PCR区216。在一些实施例中，标记区214可以包含分子标记218和样品标记220。分子标记218的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的核苷酸。样品标记220的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的核苷酸。在一些实施例中，标记区214可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或这些值中的任何值之间的数值或范围的不同标记，诸如分子标记218和样品标记220。每个标记的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的核苷酸。一组分子鉴定物标记210可以含有10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020个或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的分子鉴定物标记210。并且该组分子鉴定物标记210可以例如各自含有独特标记区214。标记的cDNA分子204可以被纯化来去除过量的分子鉴定物标记210。纯化可以包括Ampure珠纯化。
如步骤2所示，来自步骤1的逆转录过程的产物可以合并到管1中并且使用第1PCR引物库和第1通用PCR引物进行PCR扩增。由于独特的标记区214，合并是可能的。具体地，标记的cDNA分子204可以被扩增来产生嵌套式PCR标记的扩增子222。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括在单一反应体积中使用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施例中，多重PCR扩增可以在单一反应体积中利用10、20、40、50、70、80、90、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1020个或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的多重引物。扩增可以包括靶向特定基因的定制引物226A-226C的第1PCR引物库224和通用引物228。定制引物226可以与标记的cDNA分子204的cDNA部分206’内的区域杂交。通用引物228可以与标记的cDNA分子204的通用PCR区216杂交。
如步骤3所示，来自步骤2的PCR扩增的产物可以使用嵌套式PCR引物库和第2通用PCR引物进行扩增。嵌套式PCR可以使PCR扩增偏移最小化。具体地，嵌套式PCR标记的扩增子222可以通过嵌套式PCR进一步扩增。嵌套式PCR可以包括在单一反应体积中使用嵌套式PCR引物232A-C的嵌套式PCR引物库230和第2通用PCR引物228’进行多重PCR。嵌套式PCR引物库228可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000种或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的不同嵌套式PCR引物230。嵌套式PCR引物232可以含有衔接子234并且与标记的扩增子222的cDNA部分206”内的区域杂交。通用引物228’可以含有衔接子236并且与标记的扩增子222的通用PCR区216杂交。因此，步骤3产生衔接子标记的扩增子238。在一些实施例中，嵌套式PCR引物232和第2通用PCR引物228’不能含有衔接子234和236。衔接子234和236反而可以连接至嵌套式PCR的产物，以产生衔接子标记的扩增子238。
如步骤4所示，来自步骤3的PCR产物可以使用文库扩增引物进行PCR扩增以用于测序。具体地，衔接子234和236可以用于对衔接子标记的扩增子238进行一种或多种另外的测定。衔接子234和236可以与引物240和242杂交。一个或多个引物240和242可以是PCR扩增引物。一个或多个引物240和242可以是测序引物。一个或多个衔接子234和236可以用于进一步扩增衔接子标记的扩增子238。一个或多个衔接子234和236可以用于对衔接子标记的扩增子238进行测序。引物242可以含有板索引244，这样使得使用同一组分子鉴定物标记208生成的扩增子可以在一个测序反应中使用NGS进行测序。
于在此披露的方法中，随机条形编码可以用于分子索引。用于随机条形编码的方法和技术已描述于例如美国专利公开号20150299784、美国专利号8,835,358和付(Fu)等人，美国国家科学院院刊(PNAS),2001108(22):9026-9031中，这些文献的内容通过引用以其整体结合在此。在图3和图4A-图4B中示出了用于通过随机标记相同分子集合体来进行单分子数字计数的非限制性示例性方法。
在图3中示意性地示出了随机条形编码的一些实施例。不同标记-标签序列301的文库与包含未知数目的感兴趣的靶标303的样品组合。示出了三种不同种类的靶标303a、303b和303c，它们分别以4、6和3个拷贝存在。来自文库301的个别标记-标签寡核苷酸共价连接至不同的靶标，以形成靶标-标记-标签分子305。每个靶标具有不同标记-标签分子305a、305b和305c的集合体，并且在每个靶标特异性集合体内各成员在连接的标记-标签寡聚物方面是不同的。在阵列307上，每个靶标与所有可能的标记-标签组合相结合来拼接，这些标记-标签组合以存在于阵列上的不同已知或可确定位置处的每个不同组合表示。在图中，靶标和标记-标签的每个不同的组合出于说明目的由单一探针表示，但是在阵列上每个不同的探针优选地以具有同一探针序列的多个拷贝的特征存在。出于说明目的，阵列被分成子阵列307a、307b和307c。探针的上部部分309在根据不同标记-标签的每个特征处变化。下部部分313对于每个子阵列的所有特征而言是相同的并且与靶标互补。在杂交之后，阵列的个别特征通过将互补的靶标-标记-标签分子与特征杂交来标记。附图显示可检测标记311可以用于检测其中杂交靶标-标记-标签的特征。
标记或计数物301与测定靶标303组合，这样使得每个靶标与一个标记组合以形成标记-靶标305。将个别靶标与个别标记分子组合的过程是随机过程。与每个靶标类型组合的标记的数目与该靶标类型的个别靶标的数目或靶标的拷贝数目直接成比例。标记的数目通过与其中个别标记-靶标在不同特征处检测的阵列杂交来计数。
分子(来自相同靶标分子303的集合体)的每个拷贝通过选自不同标记301的大的非消除贮存池来随机捕获标记。每个标记的分子的独特性通过随机选择的统计学控制，并且取决于与标记的多样性相比集合体中相同分子的拷贝数目。一旦分子被标记，每个分子给出独特的身份并且现在可以单独地进行检测。在一些实施例中，优选的是首先扩增标记的靶标，之后进行检测，这样使得可以使用简单存在/不存在阈值检测方法。对标记的数目进行计数，以确定溶液中分子的初始数目。在一些实施例中，有待计数的分子各自是共享一些共同特征的类别的成员，例如它们各自是特定基因序列或核酸序列的单一拷贝。计数可以例如应用于mRNA靶标、拼接产物(可替代地是拼接的产物)、结构性RNA、tRNA、miRNA、siRNA、微RNA等等。类似地，计数可以应用于DNA，例如基因拷贝数目、染色体数目、线粒体DNA、细菌基因组、病原体核酸、病毒核酸等等。计数可以应用于人类或其他哺乳动物或农业生物体例如牛、鸡、小麦、稻米、鱼等的疾病研究中。计数也可以应用于微生物的计数方面，诸如环境测量，例如水品质测试。在小数目的条目有待计数并且准确计数而非相对估值是希望的时，这些方法可以是特别有用的。
靶标与标记-标签序列集合体混合，每个标记-标签是不同的序列并且该集合体具有优选为有待计数的最丰富靶标的拷贝数目的10倍的数目。在一些实施例中，标记-标签是已知序列的集合体，诸如所有可能的6聚体(N6)的集合体。标记-标签序列各自以多个拷贝存在于混合物，但是所有序列均以大约相等的量存在。标记-标签序列连接至靶标。连接是随机的，这样使得任何给定的标记-标签具有大约相同的连接至任一个靶标出现物的概率。因此如果存在1000个不同的靶标，则每个靶标可以连接至不同的标记-标签序列，并且任何两个靶标出现物将具有相同标记-标签连接的概率较低。因为连接是一个随机过程，因此有一个已知的概率，如果给定靶标的C拷贝和N不同标记-标签，靶标T的任何两个拷贝将具有相同的标记。
T1、T2、...TN，C1、C2、...CX，L1、L2、...LY，其中T是不同靶标并且存在N个不同靶标，C是靶标的不同拷贝并且该靶标存在X个拷贝，并且L是不同标记的标记-标签并且存在Y个标记标签。对于每个靶标X可变并且确定X是本发明的目标之一。在X与Y之间的关系决定了两个C将具有相同L的概率。在一些实施例中，对于有待计数的每个靶标，Y大于X。这降低了由于双重标记而导致不足计数的概率。如果T1的C1和C2二者均用L3标记，则两个拷贝将被计数为单次出现，从而导致不足计数。不足计数也可以通过评估可能多次标记的拷贝数目并且向上调节最终计数以将它们考虑在内来进行调节。例如，如果有可能1000个拷贝中的5个将被同一标记标签标记，那么最终数目应向上调节0.5％。
在一些实施例中，检测是通过与探针阵列杂交来进行的。该阵列具有每个靶标的特征集合体，该靶标包含每个标记标签的不同特征。例如，如果存在X标记标签，则对于每个靶标存在X个特征，T1L1、T1L2、...T1LX，并且对于靶标2同样如此，T2L1、T2L2、...T2LX，直到TNL1、TNL2、...TNLX。阵列的特征的数目是大约X乘以N。每个探针具有靶标互补序列和标记标签互补序列。在给定靶标的一组探针内，探针的靶标区段将保持恒定并且标记标签部分在特征至特征之间变化，这样使得每个标记标签序列由每个靶标的至少一个特征表示。
在一些实施例中，这些方法可以用于计数样品中多种靶标各自的拷贝数目。与标记标签混合的含有靶标的样品的量可以被稀释来使得有待计数的每个靶标的拷贝数目小于标记标签的数目。例如，如果有待计数的靶标以约1000个拷贝/细胞存在并且存在10000个标记标签，则需要使得混合物中样品的量大约是一个细胞的RNA价值的等同量。可以将它与每种标记-标签的多个拷贝混合，但是需要将靶标的拷贝的绝对数目保持低于标记标签序列的类型的数目。可以使用样品的稀释和相对少量的起始材料的使用。如果靶序列以低拷贝数目/细胞存在，则可以使用来自更大数目的细胞的核酸。例如，为了测量染色体区域相对于其他染色体区域的DNA拷贝数目，预期的拷贝数目是较低的(例如，对于正常情况是2)，因此如果存在10000个不同的标记标签，则可以添加到样品中以连接标记标签的基因组数目可以是较高的，例如500至1000个。
在一些实施例中，这些方法用于鉴定基因组扩增和染色体异常的区域。例如，这些方法可以用于检测三体性。大部分染色体区域将以2个拷贝/细胞存在并且三体性区域将以3个拷贝/细胞存在。预期在计数中观察到3:2比率。例如，如果具有500个基因组，则将具有1000个大部分区域的拷贝和1500个三体性区域的拷贝。在计数中由不足计数引起的小误差将对计数几乎不具有或不具有影响。在一些实施例中，已知拷贝数目的对照可以添加到样品中，以确定准确性。
t1,N(靶标1的拷贝1、2...N的必需相同分子的集合体)乘以L1,m(当m远大于N时有效地是多样性的无限贮存池)的随机标记。这允许通过赋予t1,N集合体的成员单独的身份来完全或近乎完全地分辨t1,N的成员(条件是在标记中m足够小于N)。这提供了t1,N到L1,m上的随机或无规投射。在一些实施例中，L1,m是文库并且文库中与t1,N相缔合的成员可以被计数来确定靶标的拷贝的数目。在一些实施例中，这些方法可以被描述为索引靶标的成员。这提供了一种追踪个别分子的方法，这些分子是不能以其他方式彼此区分的分子类型的成员。
因为随机标记可以赋予其他不可鉴定分子可鉴定性，它可以赋予任何两个可能非常类似但是不同的分子可鉴定性。可以高度类型但是可以使用所披露的方法单独计数的靶标的实例包括例如基因的替代性剪接形式以及具有一种或多种变化的序列，该一种或多种变化包括单个碱基的变化(例如SNP或插入缺失(短区域的插入或缺失，例如1-5个碱基))。在一些实施例中，这些方法可以赋予克隆标记，这允许单拷贝单独地检测并且从溶液中单独地分离。
一些核酸测序反应使用将靶标随机连接至固体支持物接着扩增所连接靶标并进行分析的方法。靶标连接至未知的位置中并且该位置可以通过对特定位置处的扩增的靶标进行测序来确定。相比之下，所披露的方法提供了已知靶标在已知位置中的克隆扩增。靶标-标记-标签分子的形式的随机性质提供了用于分离所选靶标的单次出现物的机制，这些单次出现物随后可以进行扩增和分析。在一些实施例中，标记可以用作用于分离靶标的克隆群体的柄状物。标记步骤生成具有多种应用的索引的文库。例如，索引的文库可以用于测序应用。该方法增加了任一组分子的可区分性，甚至是因为它们可以共享共同区域或者甚至是相同的而通过其他机制不可区分的分子也如此。所索引的文库可以保存并且使用多次，以生成用于分析的样品。一些应用包括例如对多态性进行基因型分型、研究RNA加工以及选择克隆代表物进行测序。
这些方法可以用于将阵列上的杂交信号强度的模拟读出转化成可以对阵列进行数字评分的可测量方法。该方法利用一种随机过程，其中对测定的分子加标签是通过随机行为控制的。在一个随机过程中，给定的靶标的拷贝越多，被多个标记加标签的概率越大。每个靶标结合的标记的数目计数可以接近于给定的感兴趣的靶标的丰度水平。对微阵列上的标记进行计数的能力相对于其他存在的技术将是明显的成本优点。
如在此所述的随机计数测定也可以是大得多的生物分析系统内的子系统。该生物分析系统可以包括以下所有方面：在例如光学检测之前的样品制备、在光学检测阶段中收集的数据的后加工和最终基于这些结果做出的决策。样品制备可以包括诸如以下步骤：从测试的受试者(人类、动物、植物环境等)中提取样品；分离样品的不同部分以在研究下获得更高浓度和纯度的分子；样品扩增(例如，通过PCR)；将荧光标签或标志物连接至样品的不同部分；并且将样品或样品的一部分转移到反应容器或基质上的位点中。所收集数据的后处理可以包括：归一化；背景和噪声降低；以及统计分析，诸如对重复测试取平均值或不同测试之间的相关性。决策可以包括：针对一组预定义的规则进行测试并且与外部数据库中保存的信息进行比较。
在此所述的随机标记和计数方法和系统的应用和使用可以产生适用于诊断个体例如患者的疾病状态的一种或多种结果。在一些实施例中，诊断疾病的方法包括检查或分析与靶标在样品中的存在和/或浓度水平相关的数据。可以为患者、健康护理提供者或健康护理管理者提供基于数据的检查或分析的结论。在一些实施例中，该结论是基于关于疾病诊断的数据的检查或分析。可以设想的是，在另一个实施例中为患者、健康护理提供者或健康护理管理者提供结论包括通过网络传输数据。
所披露的方法的应用包括诊断癌性病状或者诊断病毒、细菌和其他致病性或非致病性感染。所披露的方法和系统的另外的应用包括病原体检测和分类；化学战/生物战实时检测；化学品浓度控制；危险物质(例如气体、液体)检测和报警；在糖尿病患者中的糖和胰岛素水平检测；妊娠测试；病毒和细菌感染疾病(例如，AIDS、禽流感、SARS、西尼罗河病毒)的检测；环境污染监测(例如，水、空气)；以及食品加工中的质量控制。
可以使用用于检测标记的任何可用的机制。虽然以上所讨论的许多实施例使用阵列读出形式，但是对于本领域技术人员而言将明显的是可以使用其他用于读出的方法。例如，在一些实施例中，测序可以用于检测标记。
在一些实施例中，读出是在阵列上。该阵列可以是在有序排列中具有连接至表面上的固定的核酸探针的固体支持物。探针可以是例如在支持物的已知位置中使用光刻法原位合成的，或者探针可以按阵列形式点到支持物上。如上所讨论的，在一些实施例中，阵列包含每个可能的标记-靶标组合的探针特征。特征优选地包含单一探针序列的许多拷贝。该特征也可以具有一些探针，这些探针不是全长的，由合成的截短物产生。光激活过程可能不是100％有效的，这样使得一些探针在每个步骤中被封端而没有添加的子序列碱基。这些截短的探针具有全长探针的一部分的序列。
测序读出。在标记以随机方式连接至靶标之后，靶标可以根据在此披露的任何方法进行扩增并且扩增产物可以经历任何可用的测序方法。
已开发了许多替代性测序技术并且许多技术是商业上可获得的。这些技术包括使用遗传物质的微阵列，这些微阵列可以被操纵来允许平行检测核苷酸在遗传物质的许多片段中的顺序。这些阵列典型地包括在基底上形成或布置的许多位点。引入另外的物质，典型地是单一核苷酸或核苷酸链(寡核苷酸)，并且允许或促进这些物质结合至有待测序的遗传物质的模板，从而以序列依赖性方式选择性地标记模板。序列信息然后可以通过对位点成像来集中。在某些当前技术中，例如，每个核苷酸类型用荧光标签或染料加标签，这允许分析连接在特定位点处的核苷酸，该特定位点有待通过分析图像数据来确定。
在一些实施例中，质谱分析可以用于检测标记并计数靶标。标记可以是基于可以检测的大小或其他特性可区分的。在此提供的许多实例基于独特核酸序列来鉴定标记，但是可以使用任何可区分标记，例如标记库可以是基于在独特波长处的荧光发射可不同地鉴定的标记。
图4A示出了来自库301的不同标记与同一靶标“t”的4个不同拷贝中的每一个的连接。标记20连接至t1，标记107连接至t2，标记477连接至t3，并且标记9连接至t4。标记的靶标然后被扩增，以生成四种独特的群体，每个群体代表该靶标在起始样品中的单次出现物。
图4B示出用于比较两种样品(样品1和样品2)的方法。靶标401基因A以2个拷贝存在于样品1中并且以9个拷贝存在于样品2中。两种样品具有非靶标分子403。标记405与这些样品组合并且靶标分子以随机方式连接至个别标记-标签分子。具有连接的标记-标签的靶标与具有许多特征的阵列411杂交，每个可能的靶标-标记-标签组合存在一个特征。一些特征被标记，例如409，并且其他特征未被标记，例如407。标记的特征指示特异性靶标-标记-标签组合的存在并且这些特征各自对应于一个计数。如对于样品1中的基因A所示的，存在两个标记的特征，因此计数是2。对于样品2中的基因A而言，存在9个标记的特征，因此计数是9。
在一些实施例中，在此披露的方法可以将不可区分的分子群体随机地扩张至独特可鉴定且可计数的分子群体。证实了单分子的高敏感性阈值检测，并且该过程可以用于对样品中分子的绝对数目和相对数目进行计数。该方法应十分适于测定指定容器中多个靶分子的绝对数目，例如在高敏感性临床测定中，或者适于测定单细胞中转录物的数目。该方法也应与其他分子测定系统相容。例如，抗体可以用DNA片段随机地标记并且收获结合抗原的那些抗体。在扩增之后，所检测的标记的数目将反映溶液中抗原的初始数目。于在此所示的实例中，DNA由于可用序列的多样性较大而被使用，并且因为它是容易可检测的。原则上，可以使用任何分子标记，例如荧光基团或质谱标签，只要它们容易检测并且它们具有用于所需应用的足够多样性。尽管许多实例是指群体
在此披露了用于采用随机标记的用途进行单分子计数的方法和组合物。在一些实施例中，一组不同的标记被随机地连接到相同分子的群体，从而转化为适用于阈值检测的不同分子的群体。如在此所用的随机连接是指一个过程，通过该过程任何标记可以相同的概率连接到给定的分子。为了验证随机标记方法，在随机标记基因组诸如人类基因组的约1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000、200000、300000、400000、500000、600000以及750000个不同片段和超过1000000个片段之后，以实验方式测定所选基因的绝对数目和相对数目。该方法不要求物理分离分子并且可以利用高度平行的方法诸如微阵列和测序技术，以同时计数多个靶标的绝对数目。在一些实施例中，随机标记可以用于测定RNA或DNA分子在单细胞内的绝对数目。
在此所披露的方法可以用于通过将信息转化到用于检测不同标记的存在的数字过程中来对溶液中相同分子的拷贝进行定量测量。已测量该方法的随机特性，并且证实了核酸分子的相对数字计数和绝对数字计数。该方法是极端灵敏的、定量的，并且可以被复用至高水平。在一些实施例中，使用基于微阵列的检测，但是该方法可以扩展到许多其他检测形式。
在一些实施例中，这些方法是基于概率理论，其中在一组标记分子与一组靶标分子之间发生的化学反应的结果被建模并测试。当固定体积的均匀混合物中的所有分子随机碰撞和反应时，化学事件遵循部分由每种种类的分子浓度控制的随机过程。
用于分析基因组信息的方法常常利用与一个位置相缔合的物质的量的测量值之间的相关性。该位置可以是例如含有已知的或者可以测定的特异序列的阵列的特征或者任何类型的固体支持物诸如珠、颗粒、膜等。这些方法的常见方面往往是有待测量的靶标与连接至固体支持物的互补探针的杂交。该探针可以是例如已知或可测定序列的寡核苷酸，但是也可以是BAC、PAC或PCR扩增子。
由于使用合成方法诸如光刻法可以获得的不同特征的密度，微阵列可以应用于高密度应用。例如，在1平方微米的特征大小下，阵列可以具有约108个特征/cm2。在特征内，根据用于合成的化学，探针典型地以约10nm间隔来间隔开，从而产生每微米2约104个分子。在大约完全饱和下，这些探针的约10％与靶标杂交。然后在特征之间具有1微米2的阵列中存在约640个功能性分子(～800nm2功能性区域)。在特征中的此相对小数目的功能性分子限制了用于由杂交信号强度评估相对浓度的动态范围。
例如，在1平方微米的特征大小下，阵列可以每cm2具有约10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018和1019个特征以及超过1020个特征。在一个特征内，根据用于合成的化学，探针以约0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、75nm间隔以及超过100nm间隔来间隔开。可以在一微米2中存在约10、102、103、104、105、106、107、108和109个分子以及超过1010个分子。
在此披露了克服在阵列表面上的小特征大小和少数分子的情况下观察到的动态范围限制的方法，这些方法是通过使用计数或数字读出作为由阵列杂交引起的典型模拟信号的替代物。
使用信号强度评估靶标的相对浓度的方法典型地用可检测标记标记靶标，这通常在扩增步骤之后，并且通过标记的靶标与探针杂交，探针和因此的特征也被标记。标记的量被检测并且与样品中靶标的量的测量值相关联。给定靶标在样品中的量的评估值典型地是相对于样品中的其他靶标或者先前获得的测量值并且可以是基于与样品中存在的已知或预期水平的靶标或样品内的对照的比较。这种类型的分析可以并且已成功用于例如评估基因组拷贝数目，以检测个体或细胞群中的拷贝数目变化。
使杂交信号的强度或信号强度与靶标分子的浓度相关联具有限制并且可以典型地仅提供靶标的绝对量的评估值，并且可能不是存在的靶标的实际量的准确计数。评估值可以是低估或高估的，特别是当比较不同靶标或不同样品时。这是许多不同因素的结果，这些因素包括但不限于探针之间的差异、特征特异性作用、样品特异性作用、特征大小(当它降低时，准确相关联的能力也降低)以及实验变化。许多这种变化可以通过数据分析方法来解决，但是这些方法并不提供个别分子或事件的计数并且因此经历评估误差。
在一些实施例中，披露了用于将不同标记-标签序列连接至特定靶序列的每个分子或更优选地连接至感兴趣的靶序列的集合体的方法。例如，将具有1型靶标的100个分子的样品与过量的例如1000个不同标记-标签序列混合，从而在连接条件下形成标记-标签序列的文库。添加标记-标签序列的文库的多个拷贝，因此每个标记-标签优选地存在许多拷贝。将来自该文库的不同标记-标签序列附加到100个靶标分子中的每个分子中，这样使得第一靶序列的100个分子各自具有附加至其上的独特标记-标签序列。这产生100个不同的靶标-标记-标签组合。靶标-标记-标签分子然后可以被扩增，以相对于其他非靶标富集靶标-标记-标签产物。在标记之后扩增改变了靶标的绝对量，但是因为在初始样品中的每个出现物已被独特地标记，所以这将不会改变计数。扩增的靶标-标记-标签产物无论是否扩增，然后可以用可检测标记加标记，并且与探针的阵列杂交。具有与其杂交的靶标-标记-标签的阵列的特征可以例如通过用荧光标记对杂交复合物加标记并且检测信号在特征处的存在来检测。在此实例中，因为存在1000种可能的不同的标记和正在分析的单个靶标，所以存在1000种可以生成的不同的可能的标记-靶标序列，因此可以使用对于100种不同的可能性各自具有不同特征的阵列。确保每个靶标均被标记并且没有标记使用两次，1000种不同的特征中的100种应是可检测的，这表明已使用相应标记。
一旦靶标分子通过计数器标记，则它们可以自由地扩增而不会影响计数，因为读出是指示检测的是(yes)或指示未检测的否(no)。在一些实施例中，构造对于每个靶序列具有m个元件的单探测器。该检测器可以是阵列。例如，具有108个特征或元件的阵列可以使用103个不同标记测定105个不同靶标。其他检测方法对于每个计数器不需要个别元件，例如测序。
在一些实施例中，“计数器文库”或“标记-标签文库”在文库中具有大约相同数目的每个标记-标签的拷贝。标记-标签序列不是靶标特异性的，而是像已用于其他加标签应用的标签例如昂飞公司(Affymetrix)GENFLEX标签阵列一样。在一组标记-标签中所有可能的标记-标签将具有类似的杂交特征，这样使得该组的标记-标签可以在类似条件下进行检测。
对于每个靶标，在阵列上存在一系列特征，优选地每个标记-标签的一个特征。在这些特征的每个特征中，该探针与靶标(或靶标补体)杂交的部分是相同的，但是标记-标签部分在每个特征中是不同的。例如，为了检测第一靶RNA“RNA1”，将存在一系列特征，每个特征具有不同的探针(RNA1-标签1、RNA1-标签2、...RNA1-标签N)。对于每个有待检测的靶标，存在类似的一组特征，例如RNA2-标签1、RNA2-标签2、...RNA2-标签N。该组标记-标签是N个标签并且它是标记-标签与靶序列的独特组合，该组合形成有待例如通过杂交进行检测的新型序列。
与个别靶标的标记-标签连接是一个随机过程，通过该过程任何给定标记-标签连接至任何靶标的概率是随机的。标记-标签存在随机选择，这是通过将标记-标签以序列独立性方式连接至已知靶序列端来进行的。标记-标签被连接，而不需要它与靶标的任何部分杂交，因此不存在或存在最少关于标记-标签序列所连接的偏移。出于连接标记-标签的目的，个别分子全部看起来相同。
标记-标签可以通过任何可用的方法连接至靶标。在一些实施例中，标记-标签通过将标记-标签连接至靶标的一端来连接。在一些实施例中，阵列的探针是与在靶标与标记之间预测的接点互补的，因此优选的是这些标记在同一位置连接至靶标的所有出现物。如果所选靶标的每个出现物的末端是相同的并且已知的，则有助于这种情况。在一些实施例中，靶标出现物被限制性内切酶切割成片段，这样使得已知序列的限定端得以形成。
在一些实施例中，在标记-标签连接之后，扩增靶标-标记-标签区段。将通用引物连接至任一端接着进行PCR扩增是一种用于扩增的方法。通用引物可以与标记一起添加或者在随后的连接步骤处添加。
对于RNA靶标，可以使用RNA连接酶，诸如T4RNA连接酶。T4RNA连接酶1催化了5’膦酰基末端的核酸供体与3’羟基末端的核酸受体的连接。底物包括单链RNA和DNA。RNA靶标也可以是环化的并且用作用于使用具有逆转录酶活性的酶进行滚环扩增的模板。T4RNA连接酶1可以用于通过将分子的各端连接在一起来对RNA进行环化。T4RNA连接酶1也可以用于将RNA连接至DNA。
全长mRNA可以通过用小牛肠磷酸酶(CIP)处理总体或聚(A)RNA来进行选择，以从含有游离5’磷酸酯的所有分子中去除5’磷酸酯(例如，核糖体RNA、片段化mRNA、tRNA以及基因组DNA)。全长mRNA不受影响。该RNA然后可以用烟草酸焦磷酸酶(TAP)进行处理，以从全长mRNA中去除帽子结构，从而留下5’-单磷酸酯。合成的RNA衔接子可以连接至RNA群体。仅含有5’-磷酸酯的分子(即未封端的全长mRNA)将连接至衔接子。优选地，衔接子具有可变标记序列，并且也可以具有用于引发的恒定序列。优选地，恒定序列是可变序列的5’。在一些实施例中，衔接子连接的mRNA然后可以被拷贝，以通过例如随机引发或使用寡聚dT引发来形成第一链cDNA。cDNA可以随后通过例如PCR进行扩增。T4 RNA连接酶也可以用于将DNA寡聚物连接至单链DNA。
在一些实施例中，连接的靶标-标记-标签分子在样品中可以相对于其他核酸或其他分子富集。此富集可以是例如通过优选地使用例如DNA或RNA聚合酶的扩增靶标-标记-标签方法或者通过优选地降解非靶标-标记-标签分子来进行的。
在一些实施例中，靶标-标记-标签分子可以是核酸酶耐受的，而未连接的靶标和未连接的标记分子可以是核酸酶敏感的。核酸酶可以在连接之后添加到样品中，这样使得连接的靶标-标记-标签分子未被消化，但是未连接的分子被消化。例如，靶标可以是抵抗5’外切核酸酶(而不抵抗3’外切核酸酶)的，而标记是抵抗3’外切核酸酶而不抵抗5’外切核酸酶的。将靶标连接至标记生成了抵抗5’外切核酸酶活性和3’外切核酸酶活性的分子。在连接之后，样品可以用5’外切核酸酶活性、3’外切核酸酶活性或5’外切核酸酶活性和3’外切核酸酶活性处理。例如，Exo VII从5’端和3’端降解单链DNA，因此该样品在连接之后可以用Exo VII处理，以降解非连接产物的分子。
在一些实施例中，扩增可以包括滚环扩增(RCA)步骤。靶标可以是连接的，这样使得它们具有标记和连接至靶标的5’端的通用引物(UP)序列。UP-标记-靶标然后被连接，以形成环状物。与UP互补的引物然后与这些环状物杂交并且使用链置换聚合物酶来延长。所得扩增产物含有环状物UP-靶标-L的补体的多个拷贝。
在一些实施例中，靶标可以在拷贝步骤中标记。例如，具有3’靶标特异性区和5’可变标记区的引物可以与靶标RNA或DNA杂交，并且延长来形成靶标的单一互补拷贝。每个延长产物将具有不同的标记并且该标记与靶标特异性区之间的接点是已知的。延长可以在核酸酶抗性核苷酸存在下进行，这样使得延长产物抵抗核酸酶，而未延长引物则不会。在延长之后，用3’-5’外切核酸酶活性处理反应物，以消化未延长的引物。例如，外切核酸酶I在3’至5’方向上从单链DNA中去除核苷酸，并且Exo III从双螺旋DNA的3’末端去除核苷酸。外切核酸酶T(或RNA酶T)是单链RNA或DNA特异性核酸酶，它需要游离的3’末端并且在3’至5’方向上去除核苷酸。延长产物然后可以通过与和引物互补的探针杂交来检测并且包含独特标记部分和恒定靶标特异性部分。如果靶标是RNA，则在延长置换，它可以用RNA酶H消化。延长产物也可以在杂交之前扩增。
在一些实施例中，任何两种靶标被同一标记加标记的概率可以通过使用两个或更多个标记步骤来增加。例如，其中每个靶标具有选自一组标记的标记的第一标记步骤接着使用同一组标记进行的第二标记组。第一标记事件将独立于第二标记事件，因此第一标记事件和第二标记事件在两个独立靶标中将是相同的概率是两个靶标在任一步骤中具有相同标记的概率的乘积。如果存在N个可能的标记，并且第一靶标首先被标记N1标记并且然后被标记N4标记，则第二靶标也将被N1标记并且然后被N4标记的概率是1/N2。因此如果存在100个标记，则两个靶标将在第一轮中被同一标记加标记并且在第二轮中被同一标记加标记的概括是1/10000。
在一些实施例中，第一轮标记可以使用16种探针(例如，全部可能的2碱基组合)来进行，并且然后第二轮标记使用相同的16种探针进行。任一种探针在第一轮中连接至给定靶标出现物的机会是16分之一，同一探针将连接至第二靶标的机会是1/16并且相同的两个探针将连接的机会是1/16×1/16或1/256。
在一些实施例中，可逆性终止子用于将序列添加到正在计数的每个靶标的末端。例如，可以添加6碱基序列并且两者相同的机会是46之一或4096之一。
在此披露的方法可以用于测量同基因细胞群内的基因表达中的随机细胞至细胞的变化。此类变化可以导致个别细胞的可替代状态之间的转换。例如，comK在枯草芽孢杆菌中的表达中的细胞至细胞的变化已显示选择细胞转换成补体状态，在该细胞中编码DNA摄取蛋白的基因被表达。
聚焦方法
在一些实施例中，在此披露的方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品，其中富集该样品包括聚集样品中感兴趣的细胞；使用流式细胞仪分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息。可以使用不同的聚焦方法和技术，例如流体动力学聚焦、磁场聚焦、电场聚焦、重力场聚焦、光学场聚焦及其任何组合。
在一些实施例中，富集样品包括将样品中感兴趣的细胞聚集到例如细胞核心流中。在一些实施例中，聚集感兴趣的细胞包括声聚焦。声聚焦在分析过程中使用声波控制颗粒(例如，细胞)的移动，例如使用超声辐射压力(例如，>2MHz)来将颗粒运输到样品流的中心。在一些实施例中，有利的是将声聚焦与流体动力学聚焦结合，以使核心流变窄并使激光照明均匀。在一些实施例中，声聚焦包括：将样品中的多种细胞悬浮在细长流体填充通道中；并且将所述通道暴露于平行于流动方向的轴向声驻波场，其中所述轴向声驻波场将多个细胞沿着所述通道的中心轴驱动到力最小值的位置，以产生均匀间隔的细胞。
声辐射压力可以操纵细胞。施加声波场生成了聚集细胞(例如，感兴趣的细胞)的准一维力场。单独的或者与流体动力学聚焦结合的声聚焦可以将细胞聚集到细胞核心流中，例如沿着细长流体填充通道的中心轴在力潜在最小值的位置处。声聚焦因此增加核心流内的细胞浓度。在丢弃一些或所有不在核心流内的流体之后，细胞的浓度增加。因此，声聚焦通过增加感兴趣的细胞的浓度来增加具有低浓度的感兴趣的细胞的稀样品的样品通量。
图5和图6A-图6C示出了本披露的非限制性实施例，这些实施例将样品中的颗粒诸如感兴趣的细胞聚集到核心流中，之后分离一种或多种感兴趣的细胞。可以用于聚集颗粒的方法包括声聚焦。如图5和图6A所示的，通过向通道508的第一部分506中感兴趣的细胞504施加由声学力生成器诸如超声波换能器502A-B生成的声学力500A-B，将感兴趣的细胞504聚集到核心流510中。通道508可以是细长的且流体填充的。
感兴趣的细胞504可以聚集到核心流510中，沿着通道的中心轴在力潜在最小值位置处，以形成均匀间隔的细胞。声学力可以包括与通道508内的流动510方向平行的轴向声驻波场。超声波换能器502A-B在通道508中形成驻波场。超声辐射压力将感兴趣的细胞504压迫到核心流512中。在将感兴趣的细胞504聚集到核心流512中之后，可以通过出口514A-B丢弃一些或所有不在核心流512内的流体。因此通道508的第二部分516中的细胞浓度高于通道508的第一部分506中的细胞浓度。在本披露的一些实施例中，有利的是将这些细胞聚集到核心流512中。在本披露的其他实施例中，有利的是将细胞聚集到核心流510中沿着通道的中心轴的力潜在最小值的位置，以产生均匀间隔的细胞。
图7示出了本披露的实施例中，这些实施例将样品中各自具有预定范围内的大小的颗粒(诸如样品中各自具有预定范围内的大小的感兴趣的细胞)聚集到核心流中，之后分离一种或多种感兴趣的细胞。可以用于聚集具有预定范围内的大小的颗粒的方法包括声聚焦。如结合图5和图6A所描述的，通过向通道508的第一部分506中各自具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞施加由声学力生成器诸如超声波换能器502A-B生成的声学力500A-B，将各自具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞聚集到核心流510中。通过调整声学力500A-B的参数，例如声学力500A-B的频率、幅度和波形，仅将各自具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞聚集到核心流512中。各自具有不在预定范围705内的大小的不感兴趣的细胞并不聚集到核心流512中。通道508可以是细长的且流体填充的。
各自具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞可以聚集到核心流510中，沿着通道的中心轴在力潜在最小值位置处，以形成均匀间隔的细胞。声学力可以包括与通道508内的流动510方向平行的轴向声驻波场。超声波换能器502A-B在通道508中形成驻波场。超声辐射压力将各自具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞压迫到核心流512中。在将具有一定大小704的感兴趣的细胞聚集到核心流512中之后，可以通过出口514A-B丢弃一些或所有不在核心流512内的流体和具有不在预定范围705内的大小的不感兴趣的细胞。因此在通道508的第二部分516中具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞的浓度高于在通道508的第一部分506中具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞的浓度。在本披露的一些实施例中，有利的是将具有预定范围704内的大小的感兴趣的细胞聚集到核心流512中。在本披露的其他实施例中，有利的是将具有预定范围内的大小的感兴趣的细胞聚集到核心流510中沿着通道的中心轴的力潜在最小值的位置，以产生均匀间隔的细胞。
存在许多不同的排列，其中声聚焦可以是有利的。参考图5和图7，声场可以用于通道508中，该通道可以是圆形、正方形或任何其他几何结构。在图6B中示出了一种示例性换能器。在图6B中，声学力500通过通道508的壁反射，示出为声学力500’。在图5、图6A和图7中示出了彼此相对的两个换能器。在图6C中示出了彼此正交的两个换能器。声学力500A通过通道508的壁反射，示出为声学力500A’。声学力500B通过通道508的壁反射，示出为声学力500B’。可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的换能器500。使用彼此相对的两个换能器可以提供反馈，以监控细长流体填充通道506内的声场。另外的换能器可以在正交方向上连接，以形成力场，例如轴向声驻波场，该力场被优化用于聚集具有不同类型、大小和形状的细胞。在一些实施例中，在一个或多个通道508中的系列声聚焦将感兴趣的细胞504聚集到更窄的核心流512中。
在图5和图7中示出的出口数目是两个，包括出口514A和514B。可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或者在这些值中的任何值之间的数值或范围的出口。在图5和图7中示出的第二部分516比第一部分506窄。在一些实施例中，第二部分516可以比第一部分506宽，或者两个部分可以具有相同的大小。两个部分506和516可以具有相同的形状或者具有不同的形状。两个部分506和516可以由相同的材料或者不同的材料制成。
图8示出了本披露的实施例，这些实施例能够将声聚焦与流体动力学聚焦结合以根据本发明的一个实施例浓缩细胞。细胞504的样品流过可以是细长的且流场的通道508。鞘液800最初将细胞504流体动力学地聚集到核心流512中。换能器500A和500B利用声聚焦来进一步聚集中心核心流512内的细胞504。在通过流体动力学聚焦和声聚焦将细胞504聚集到核心流512中之后，可以通过出口514A-B丢弃一些或所有不在核心流512内的流体。因此，通道508的第二部分516中的细胞浓度高于通道508的第一部分506中的细胞浓度。
在一些实施例中，感兴趣的细胞在112B处单独的或者与流体动力学聚焦结合的声聚焦将感兴趣的细胞的浓度增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、1010％、1011％、1012％、1013％、1015％、1020％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。感兴趣的细胞在112B处单独的或者与流体动力学聚焦结合的声聚焦将在116B处的分选速度增加了至少10-倍、20-倍、30-倍、40-倍、50-倍、60-倍、70-倍、80-倍、90-倍、102-倍、103-倍、104-倍、105-倍、106-倍、107-倍、108-倍、109-倍、1010-倍、1011-倍、1012-倍、1013-倍、1015-倍、1020-倍或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。
不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片的消除
在一些实施例中，富集样品可以包括消除样品中不感兴趣的细胞。在一些实施例中，富集样品可以包括声聚焦和消除样品中不感兴趣的细胞。在一些实施例中，可以例如使用磁力消除来消除样品中不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片中的一种或多种。根据一些实施例，消除不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片(例如，使用图1B的108B处的磁力消除)可以去除至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％、99.9％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的样品中最初存在的不感兴趣的细胞、干扰细胞和/或碎片。在一些实施例中，在消除之后，样品中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％、99.999％或者在这些值中的任何两个值之间的数值或范围的固体物质是感兴趣的细胞。在一些实施例中，在消除之后，样品中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％、99.999％或者在这些值中的任何两个值之间的数值或范围的固体物质是感兴趣的细胞。在一些实施例中，在消除之后，样品中感兴趣的细胞的浓度增加了至少约2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、50-倍、100-倍、250-倍、500-倍、750-倍、1000-倍、5000-倍、10000-倍、50000-倍、100000-倍、500000-倍、1000000-倍或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。在一些实施例中，在消除之后，样品中感兴趣的细胞的浓度增加了或增加约2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍、10-倍、50-倍、100-倍、250-倍、500-倍、750-倍、1000-倍、5000-倍、10000-倍、50000-倍、100000-倍、500000-倍、1000000-倍或者在任何这些两个值之间的数值或范围。
感兴趣的细胞可以在消除样品中不感兴趣的细胞之前或之后进行声聚集。在一些实施例中，消除通过磁力消除来进行。磁力消除可以例如利用具有抗体例如单克隆抗体和多克隆抗体的磁珠，这些抗体缀合至磁珠的表面。抗体靶标可检测标志物例如细胞表面标志物是在不感兴趣的细胞和干扰细胞上。此类磁珠的实例包括BD IMagTM颗粒。当将含有用这些磁珠标记的细胞的样品放置于由磁力例如BD IMagnetTM形成的磁场中时，磁场吸引磁铁标记的不感兴趣的细胞，从而允许未标记的感兴趣的细胞穿过。磁力消除允许对感兴趣的细胞进行快速且有效的阴性选择。已标记的不感兴趣的细胞朝向磁铁形成的磁场迁移，从而允许悬浮液中未标记的感兴趣的细胞穿过。磁力消除可以重复多次，以增加感兴趣的细胞的纯度和浓度。磁力消除可以利用靶向不同可检测标志物的不同类型的磁珠，以去除不同类型的不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片。
为了去除白细胞，可以使用具有缀合至磁珠表面的单克隆抗体的磁珠。这些磁珠被优化用于消除携带CD4的白细胞。CD4(L3T4)分化抗原可以在大部分胸腺细胞、成熟T淋巴细胞子群(即，MHC II类限制性T细胞，包括大部分辅助T细胞)和成熟杀伤性T(NK-T)细胞亚型上表达。另外，CD4可以在多能造血干细胞、骨髓的髓细胞和B-淋巴细胞前体、胸腺内淋巴样前体以及脾树突细胞亚型上表达。
流式细胞术
在一些实施例中，可以使用流式细胞仪分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞。在一些实施例中，流式细胞仪利用荧光激活细胞分选法。
流式细胞术是一种用于分析和分离细胞的有价值方法。这样，它具有广泛范围的诊断和治疗应用。流式细胞术利用一个流体流来线性分离细胞，这样使得它们可以成一列纵队穿过检测设备。个别细胞可以根据其在流体流中的位置和可检测标志物的存在来区分。细胞流过聚集的查询点(interrogation point)，其中至少一个激光将激光束引导到通道内的聚集点。通过使鞘液以非常高的容积流率环绕样品流流动，含有细胞的样品流体流体动力学聚集到非常小的核心直径。小核心直径可以小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200微米或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。鞘液的容积流率可以是样品的容积流率的大约至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。这对于聚集的细胞产生大约米/秒的非常快的线速度。因此每个细胞在激发点处花费了非常有限的时间，例如少于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100微秒或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。一旦这些细胞穿过查询点，这些细胞就不能再次重定向至查询点，因为线性流速不能逆转。
流式细胞仪是使得能够基于光学参数诸如光散射和荧光表征细胞的分析工具。在流式细胞仪中，流体悬浮液中的细胞通过检测区域，其中这些细胞暴露于激发光，典型地来自一个或多个激光，并且测量这些细胞的光散射和荧光特性。细胞或其组分典型地被荧光染料标记，以有助于检测。多种不同细胞或组分可以通过使用光谱上不同的荧光染料标记这些不同的细胞或组分来同时检测。在一些实现方式中，在分析器中包括多种光电检测器，一种用于每个有待测量的散射参数并且抑制用于每个有待检测的不同染料。所获得的数据包括对于每个光散射参数和荧光发射所测量的信号。
生物细胞的分离已通过向流式细胞仪添加分选或收集能力来实现。通过机械移除或电移除来将分离流中被检测为具有一个或多个期望特征的细胞与样品流分离。这种流分选方法已用于分选不同类型的细胞，分开携带X染色体和Y染色体的用于生殖的精子，分选用于遗传分析的染色体，并且从复杂生物群体中分离特定生物体。
常见的流式分选技术利用液滴分选，在液滴分选中，将含有线性分离的细胞的液流分解成液滴，并且使含有感兴趣的细胞的液滴带电并通过穿过电场的通道将其偏转到收集管中。液滴分选系统能够在流体流中以约100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、750000、1000000滴/秒或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的速率形成液滴，该流体流穿过具有小于1000、750、600、500、400、300、200、100、75、60、50、40、30、20、10、5、2、1微米或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的直径的喷嘴。液滴分选需要液滴以距离喷嘴尖固定的距离从该流中脱离。该距离通常是约距离喷嘴尖几毫米并且可以通过以预定义的频率震荡喷嘴尖来为未扰动的流体流维持该距离。
该流中线性分离的细胞可以被表征为它们穿过恰好位于喷嘴尖下方的观察点。一旦细胞被鉴定为满足约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、75、100、200、300、400、500、600、750种标准或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围或者超过1000种标准，可以预测它将到达液滴脱离点和在液滴中从流中离开的时间。可能的是，就在含有所选细胞的液滴从流中脱离之前向流体流施加简短的电荷并且在液滴破裂之后立即研磨。在有待分选的液滴从液体流中分离时该液滴维持电荷，并且所有其他液滴均不带电荷。带电液滴通过电场向侧面偏离其他液滴的向下轨道并且被收集在样品管中。不带电荷液滴直接落入到排水器。
细胞仪可以进一步包括用于记录所测量的数据并分析该数据的装置。例如，数据存储和分析可以使用连接至检测电子产品的计算机来进行。例如，数据可以列表形式储存，在该列表中每一行对应于一个细胞的数据，并且列对应于每个测量的参数。使用标准文件诸如“FCS”文件格式来储存来自流式细胞仪的数据促使能使用单独的程序和/或机器来分析数据。使用目前的分析方法，数据典型地呈现在2维(“2D”)图中以便于可视化，但是其他方法也可以用于可视化多维数据。
使用流式细胞仪测量的参数典型地包括由细胞沿着主要的正向方向散射(称为前向散射(“FSC”))的激发光、由细胞在主要的侧向方向上散射的激发光(称为侧向散射(“SSC”))以及由荧光分子在光谱的一个或多个通道(频率的范围)中发射的光(称为FL1、FL2等)或者由主要在该通道中检测的荧光染料发射的光。不同的细胞类型可以通过经由用染料标记的抗体标记不同细胞蛋白质产生的散射参数和荧光发射来鉴定。
荧光激活细胞分选术或者是流式细胞术的特化类型。它提供了用于基于每个细胞的特异性光散射和荧光特征将细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器或微量滴定板的孔中的方法，一次一个细胞。它记录了来自个别细胞的荧光信号，并且物理地分离特别感兴趣的细胞。首字母缩略字FACS是由贝迪医疗公司(Becton Dickinson)注册商标并拥有的。
细胞悬浮液被放置在窄的快速流动的液体流的中心附近。该流被排列来使得平均而言(泊松分布)在细胞之间存在相对于其直径的大间隔。震动的机构使得细胞流分裂成单个液滴。该系统被调节来使得超过一个细胞处于液滴中的概率较低。就在该流分裂成液滴之前，该流穿过一个或多个激光相交处，在该相交处测量每个细胞感兴趣的荧光性状。如果收集细胞，在一个或多个液滴形成并从流中脱离的时间段过程中向流动细胞施加电荷。这些带电荷液滴然后下落通过静电偏转系统，该系统基于施加于液滴的电荷将液滴转移到目标容器中。
图9示出了适于用于例如在图1B的116B处进行细胞分选的分选装置(例如流式细胞仪)的一个实例的功能性框图。在图9中示出的分选装置可以被称为空气中流(stream-in-air)分选系统。示出了样品流902中的细胞。样品流902穿过喷嘴906的孔口904。样品流902在排出喷嘴906时形成喷射流908。激光束910由激光911生成，以照射喷射流908中可以包含的细胞。光通过检测站912进行检测，以生成多个信号，这些信号被处理来生成多参数事件数据点。所生成的事件数据可以被提供给样品行为分析器。该提供可以经由通信媒介(例如，网络/云)、经由存储器或者经由混合配置来引导。
基于多个信号的值，在液滴离开喷射流908之前，它们是带正电荷的、带负电荷的或者中性的。一些液滴将包含样品的细胞，如液滴930所示的，而其他液滴将不包含样品的细胞，如由液滴940所示的。液滴穿过偏转场914。偏转场914包括两个带相反电荷的偏转板916a和916b。偏转板916a和916b被配置来将喷射流908中的带电荷液滴引导到期相应收集容器918a、918b或918c。正如所示，容器918b收集带负电荷液滴，因为正偏转板916a将吸引带负电荷液滴。类似地，容器918c将收集带正电荷液滴，因为带负电荷偏转板916b将吸引带正电荷液滴。每个收集容器可以是微量滴定板或微量滴定板的孔。
在一个收集方案中，流动系统在它们经过检测站912时基于其信号的值来鉴定所有感兴趣的细胞，并且然后使得喷射流908在感兴趣的细胞作为液滴离开喷射流908的瞬间带电荷或处于中性。以这种方式，使得感兴趣的细胞具有相同的电荷。这允许细胞收集在同一收集容器中，该容器包括多层滴定板的相同或不同的孔。
在图9中所示的适于用于例如在图1B的116B处进行细胞分选的分选装置的非限制性实例包括但不限于BD FACSJazzTM细胞分选仪、BD FACSseqTM细胞分选仪或任何其他细胞分选仪，包括伯乐实验室有限公司(加利福尼亚州赫拉克勒斯)S3eTM细胞分选仪、索尼生物技术有限公司(加利福尼亚州圣何塞)SH800细胞分选仪、贝克曼库尔特有限公司(加利福尼亚州布雷亚)MoFloTMXDP细胞分选仪。
分选速度
在一些实施例中，感兴趣的细胞可以在小于约15分钟内分选到一个或多个微量滴定板(即，从细胞样品中分离)(例如，在图1B的116B处)，从而允许收集时间进程数据。样品中感兴趣的细胞也可以在小于0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400、500、600、750、1000分钟或者在任何这些两个值之间的数值或范围的时间内分选。
在此披露的低成本、高通量、单细胞基因组测序方法是快速的并且具有高成功率。例如，该方法可以分选细胞，以在小于0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、50、55、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、250、300、400、500、600、750、1000分钟或者在任何这些两个值之间的数值或范围的时间内获得96、324、946或更多个感兴趣的细胞。在一些实施例中，每秒可以分选103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020个细胞或者在任何这些两个值之间的数值或范围的细胞。
细胞表面标志物
在一些实施例中，这些方法利用细胞表面标志物的加标签和染色进行细胞分选。在一些实施例中，这些细胞利用对细胞表面标志物的加标签来磁力消除不感兴趣的细胞、干扰细胞和碎片。在一些实施例中，这些方法包括以下各项中的一种或多种：基于所获得的序列信息确定患者的基因型；基于所获得的序列信息确定患者的表型；基于序列信息确定患者的一种或多种遗传突变；并且预测患者对一种或多种疾病的易感性。一种或多种疾病中的至少一种是癌症或遗传性疾病。
FACS可以基于使用靶向可检测细胞标志物的抗体对细胞表面标志物进行的加标签和染色来分选细胞。这些抗体包括偶联至荧光团的单克隆抗体和多克隆抗体。可检测细胞标志物包括感兴趣的细胞上的细胞表面标志物。在一些实施例中，磁力消除可以是基于使用具有抗体的磁珠对细胞表面标志物进行的加标签，这些抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，它们缀合至靶向不感兴趣的细胞、干扰细胞和/或碎片的表面。细胞表面标志物的非限制性示例包括CD表面标志物、生长因子/细胞因子、趋化因子受体、核受体以及其他受体。细胞表面标志物的实例包括但不限于ALCAM；CD166；ASGR1；BCAM；BSG；CD147；CD14；CD19；CD2；CD200；CD127BV421；CD25BB515；CD161PE；CD45RA PerCP-CyTM5.5；CD15S AF647；CD4APC-H；CD4；CD25；CD127；CD45RA；CD15S；CD161；CD3；EpCAM；CD44；以及Her2/Neu。生长因子/细胞因子、趋化因子受体的实例包括ACVR 1B；ALK4；ACVR2A；ACVR2B；BMPR1A；BMPR2；CSF1R；MCSFR；CSF2RB；EGFR；EPHA2；EPHA4；EPHB2；EPHB4；以及ERBB2。核受体的实例包括雄激素受体；CAR；ERα；ERβ；ESRRA；ESRRB；ESRRG；FXR；糖皮质激素受体；LXR-a；LXR-b；PPARA；PPARD；PPARG；PXR；SXR；雌激素受体β；黄体酮受体；RARA；RARB；RARG；RORA；RXRA；RXRB；THRA；THRB；以及维生素D3受体。其他受体的实例包括AGER；APP；CLEC12A；MICL；CTLA4；FOLR1；FZD1；FRIZZLED-1；KLRB1A；LRPAP1；NCR3；NKP30；OLR1；PROCR；PTPN1；SOX9；SCARB2；TACSTD2；TREM1；TREM2；TREML1；以及VDR。
微量滴定板
在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品，其中富集该样品包括聚集样品中感兴趣的细胞；使用流式细胞仪分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞并且将该一种或多种感兴趣的细胞沉积到一个或多个微量滴定板中；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息。在一些实施例中，微量滴定板可以具有至少96个孔。
在一些实施例中，从富集的细胞样品中分析感兴趣的细胞(例如，在图1B的116B处)包括将一种或多种感兴趣的细胞沉积到一个或多个微量滴定板中。当细胞处于一个或多个微量滴定板中时，可以收集时间进程数据。微量滴定板的大小可以发生改变。例如，微量滴定板可以具有至少96个细胞。在一些实施例中，微量滴定板具有或者具有约96个孔、384个孔、1536个孔、3456个细胞、9600个孔或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。在一些实施例中，感兴趣的细胞可以分选到384-孔微量滴定板和1536-孔微量滴定板以及具有更高孔密度的微量滴定板中，该孔密度例如是每个微量滴定板约2000、2500、3000、3500、4000、5000、6000、7500、10000、12500、15000、20000、30000、40000、50000、60000、75000、100000个孔。
细胞裂解
该一个或多个微量滴定板的每个孔可以含有细胞裂解缓冲液，例如基于洗涤剂的单细胞裂解缓冲液。每个孔也可以含有RNA稳定剂、分子标记、细胞特异性标记或其组合。具有分选的细胞的板可以在-80℃下保持冷冻，之后进一步处理。
在某些实施例中，优选的裂解导致至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的感兴趣的细胞(例如，红细胞或胎儿有核红细胞)裂解，以及少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的不感兴趣的细胞(例如，母体白细胞或母体有核红细胞)裂解。
每个细胞都可以裂解，并且在逆转录步骤过程中对mRNA内容物使用独特样品和分子索引进行索引。细胞组合物的鉴定可以利用10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000个或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的基因。可以生成一个测序文库并且该文库在测序仪器上运行。在一些实施例中，在生成测序文库之前，产物可以从约2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、75、100、200、300、400、500、600、760、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000个或者在这些值中的任何两个值之间的数值或范围的微量滴定板或者这些值中的任何两个值之间的数值的微量滴定板中合并。可以生成超过一种测序文库。例如，可以生成约2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、76、100、200、300、400、500、600、760、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7500、10000个或者在这些值中的任何两个值之间的数值或范围的测序文库。可以生成在这些值中的任何两个值之间的任何数值的测序文库。
多核苷酸靶标
在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品，其中富集该样品包括聚集样品中感兴趣的细胞；分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息，其中该一种或多种多核苷酸包括RNA或mRNA。在一些实施例中，序列信息包括至少10个基因的转录物计数。RNA可以获自外来体。
多核苷酸靶标(例如，基因靶标和mRNA靶标)的非限制性实例包括CD4、FOX01、CD45RO、MYC、IL1R2、PRF1、GZMK、LGALS1、IL17F、IL23R、LYNX1、PRDM1、SELL、SMAD4、ICOS、IKZF5、RORC、AHRR、CTLA4、ITGB7、ENTPD1、CCR8、TSHR、TGFB2、IL12A、IL7R、HLA-DMA、CCR5、TIAF1、BCL6、BHLHE40、CXCR4以及CD307c。多核苷酸靶标的其他非限制性实例包括CD3D、GSTP1、TCF7、CD3E、RNB6、RB1、MYB、CD3G、KRT8、CDH1、ERBB3、ERBB2、TCTN1、ESR1、CDKN1A以及TFF3。多核苷酸靶标的其他非限制性实例包括ABCB1、ABCG2、ADAM23、AKTl、APC、AR、ATM、BAD、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、C4A、CA12、CCNA1、CCND1、CCND2、CCNE1、CDH1、CDH13、CDK2、CD326、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CSF1、CST6、CTNNBl、CTSD、EGF、EGFR、EMAP-2、ERBB2、ERBB3、ESR1、ESR2、FOXA1、GATA3、GLI1、GPI、GRB7、GSTP1、HIC1、HPRTl、ID1、IGF1、IGF1R、IGFBP3、IL6、JUN、KRT18、KRT19、KRT5、KRT8、LAMPl、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MGMT、MKI67、MLH1、MMP2、MMP9、MUC1、MYB、MYC、NME1、NOTCH1、NR3C1、PGR、PLAU、PRDM2、PSMB2、PSMB4、PTEN、PTGS2、PYCARD、RAB7A、RARA、RARB、RASSF1、RB1、REEP5、RNB6、SERPINE1、SFN、SFRP1、SLC39A6、SLIT2、SNAI2、SRC、TBC1D9、TCTN1、TFF3、TGFB1、THBS1、TP73、TWIST1、VEGFA、XBP1、CD3E、CD3G、CD3G、TCF7、ALCAM、CD25、ITGA6、THY1、PROM1以及CXCR4。多核苷酸靶标的其他非限制性实例包括BRCA1、BRCA2、TP53、PTEN、MSH2、MLH1、MSH6、PMS2、EPCAM、APC、RB1、MEN1、RET以及VHL。
多核苷酸靶标可能与以下各项相关：血液和淋巴疾病；癌症；消化系统；耳、鼻和喉；眼睛疾病；雌性特殊病；雄性特殊病；腺体和激素类；心脏和血管；免疫系统疾病；雄性特殊病；肌肉和骨骼；新生儿疾病；神经系统；营养和代谢病；呼吸性疾病；和/或皮肤和结缔组织。
样品和感兴趣的细胞
在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品，其中富集该样品包括聚集样品中感兴趣的细胞；分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞；并且获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息。样品的类型不受限制。例如，样品可以是或者可以包括临床样品、生物样品、环境样品或其组合。例如，该样品可以包括来自患者的生物流体、组织和细胞中的一种或多种。在一些实施例中，该样品可以包括血液、尿液、脑脊液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髓、活检样品或其组合。在一些实施例中，感兴趣的细胞包括干细胞、癌细胞、血细胞、外周血单核细胞、循环肿瘤细胞(CTC)、乳腺癌细胞、处于预期细胞周期阶段的细胞或其组合。在一些实施例中，样品中感兴趣的细胞是或者是约样品中细胞总数目的0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、10％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。在一些实施例中，少于1000、500、250、100、50、25、10、5或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的感兴趣的细胞可以从富集的细胞样品中分离。
如在此所用，术语“感兴趣的细胞”是指正在研究的细胞。因为感兴趣的细胞可以是稀少的并且样品中感兴趣的细胞的浓度可能是低的，所以为了加速使用例如细胞分选对感兴趣的细胞进行的分离，富集感兴趣的细胞可以是有利的。感兴趣的细胞可以使用聚焦诸如声聚焦并磁力消除不感兴趣的细胞以及干扰细胞和碎片来富集。样品中感兴趣的细胞的非限制性实例包括表达恶性肿瘤表型的细胞；肿瘤细胞，诸如已从肿瘤中流出到血液或其他体液或骨髓中的肿瘤细胞；良性肿瘤细胞；癌细胞；外周血液中的癌细胞；甲状腺癌细胞；乳腺癌细胞；循环肿瘤细胞(“CTC”)；白血病细胞；癌干细胞；来自不同细胞周期阶段(G0/G1、S、G2)的单细胞；携带X染色体和Y染色体的精子；干细胞；胎儿或成人干细胞；多能干细胞；地中海贫血患者中的有核红细胞(“NRBC”)；胎儿细胞，诸如母体外周血液中的胎儿细胞；母体循环中的胎儿有核红细胞(“FNRBC”)；以及由CD71、CD8、CD34或CD133表征的细胞。样品可以包含来自混合癌细胞样品的细胞。
感兴趣的细胞的其他实例包括但不限于以下细胞：循环的内皮细胞；感染有病毒的细胞，诸如被HIV感染的细胞、用感兴趣的基因转染的细胞；以及存在于罹患自身免疫或自身反应病症的受试者的外周血液中的T-细胞或B-细胞的异常亚型；激活淋巴细胞；抗原递呈细胞，诸如单核细胞和树突细胞；致病性或寄生性生物体、含有细胞内寄生物的细胞；以及稀流体如尿液中的细胞或微生物。
细胞系的非限制性实例包括：Jurkat细胞，它是T-白血病细胞系；SKBR3，它是已知过度表达Her2/neu的腺癌衍生的乳腺癌细胞系；T47D，它是证明低至中等Her2/neu表达的导管癌衍生的乳腺癌细胞系；以及HeLa。
在此披露的方法可以适用于具有低浓度感兴趣的细胞的样品，例如具有感兴趣的细胞的样品。感兴趣的细胞可能是稀少的。在一些实施例中，样品中感兴趣的细胞是占样品中细胞总数目的小于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的细胞。在一些实施例中，样品是每毫升样品具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500、1000个或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的感兴趣的细胞的流体样品。流体样品可以包括或者可以是血液(例如，全血、血清或血浆)、尿液、唾液、脑脊液、胸膜液、羊水、精液或其任何组合。在一些实施例中，感兴趣的细胞是或者是约样品中或每毫升流体样品中10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1015、1020个或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的总细胞中的1个。感兴趣的细胞的大小可以发生改变。例如，感兴趣的细胞的直径可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100微米或者在这些值中的任何两个值之间的数值或范围。
根据一些实施例，去除不感兴趣的细胞(例如，在图1B的108B处)去除了至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围的样品中最初存在的不感兴趣的细胞和/或碎片。在一些实施例中，聚集感兴趣的细胞(例如，在图1B的112B处的声聚焦)将样品中感兴趣的细胞的浓度增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、1010％、1011％、1012％、1013％、1015％、1020％或者在这些值的任何两个值之间的数值或范围。例如，聚集感兴趣的细胞(例如，经由在图1B的112B处的声聚焦)可以将细胞分选速度(例如，在图1B的112B处)增加了至少10-倍、20-倍、30-倍、40-倍、50-倍、60-倍、70-倍、80-倍、90-倍、102-倍、103-倍、104-倍、105-倍、106-倍、107-倍、108-倍、109-倍、1010-倍、1011-倍、1012-倍、1013-倍、1015-倍、1020-倍或者在这些值的任何两个值之间的范围或数值。
测序仪
许多方法、装置和系统可用于对多核苷酸进行测序，并且可以用于获得来自在此所披露的方法中分离的细胞的多核苷酸的序列信息。例如，测序仪器的非限制性实例包括GS FLX钛、GS Junior和GS FLX+系统(454生命科学公司，康乃狄克州布兰福德)；Solexa系统、基因组分析器(Genome Analyzer)IIx、MiSeq、HiSeq和HiScanSQ(依诺米那有限公司，加利福尼亚州圣地亚哥)；SOLiDTM(通过寡核苷酸连接和检测进行测序)系统和基于桑格的DNA测序仪诸如3500遗传分析仪(Genetic Analyzer)；以及离子半导体测序系统诸如个人染色体检测仪或质子测序仪(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)；以及以及纳米孔测序系统(牛津纳米孔技术公司，英国牛津)。
数据分析
在一些实施例中，这些方法包括将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品，其中富集该样品包括聚集样品中感兴趣的细胞；分离富集的细胞样品中的一种或多种感兴趣的细胞；并且通过对分子索引的多核苷酸文库进行测序，获得来自该一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息。在一些实施例中，对分子索引的多核苷酸文库进行测序包括可能使用软件即服务平台对由文库测序获得的测序结果进行去卷积。
图10是示出以供例如在图1B的124B处使用的数据分析1000的非限制性示例性步骤的流程图。数据分析可以被提供在安全的在线云环境中。在一些实施例中，数据分析可以使用软件即服务平台来进行。安全的在线云环境的非限制性实例包括七桥基因组(SevenBridges Genomics)平台。七桥基因组平台是软件即服务平台的非限制性实例。
如图10所示，数据分析1000在1004处开始。在1008处，从例如图1B的122B接收测序结果。从图1B的122B接收的测序结果的格式的非限制性实例包括EMBL、FASTA和FASTQ格式。测序结果可以包括分子索引的多核苷酸文库的序列读取。分子索引的多核苷酸文库可以包括多种单细胞的序列信息。多种单细胞的序列信息可以通过以下步骤进行去卷积。在1012处，确定用于在122B处进行测序的衔接子的序列，对其进行分析并且将其丢弃以进行随后的分析。一种或多种衔接子可以包括图2中的衔接子234和236。
在1016处，对分子索引的多核苷酸文库的测序结果进行多路解析。多路解析可以包括将序列读取分类为属于多种单细胞之一。将序列读取分类为属于多种单细胞之一可以是基于标记区214，例如样品标记220。属于一种mRNA的序列读取可以与属于另一种mRNA的序列读取区分，这是基于标记区214，例如分子标记218。在1020处，序列读取可以使用比对器来与mRNA序列比对。在1020处使用的比对器的非限制性实例包括Bowtie比对器、ClustalW、BLAST、ExPASy以及T-COFFEE。在1024处，每个细胞的数字基因表达谱通过对每个mRNA序列计数与细胞的mRNA序列相缔合的不同分子标记218的数目来重构。因此，实现mRNA在单细胞中的数字计数。数据分析1000的输出可以包括读取比对总结和每个细胞中每个基因的分子标记计数的电子表格。数据分析1000在1028处结束。
实例
上文所讨论的实施例的一些方面在以下实例中进一步详细地披露，这些实例不以任何方式旨在限制本披露的范围。
实例1
结合蛋白质组信息和基因组信息的综合性高通量
单细胞分析：流动分选、细胞和mRNA索引以及测序分析
此实例证明了结合蛋白质组信息和基因组信息的综合性高通量单细胞分析。
将外周血细胞用细胞表面标志物染色，以鉴定少见的调节T细胞亚群，包括原初调节T细胞、效应调节T细胞和非抑制性调节T细胞。在使用BD ImagTM磁力分离进行样品富集之后，使用BD FACSJazzTM细胞分选仪将在不同时间点取样的细胞单独分选到96-孔PreciseTM编码板中，从而增加分选速度和品质。将每个细胞裂解，并且在逆转录步骤过程中对mRNA内容物使用独特样品和分子索引进行分子索引。查询针对鉴定细胞组成所小心选择的大约100个基因。在合并来自八个96-孔PreciseTM编码板的产物之后，生成三个测序文库并且在MiSeq仪器上运行。形成层流计算管线，并且在Seven BridgesTM基因组平台上进行自动化数据分析。这些结果证明了使用高通量单细胞基因组测序方法与BD FACS分析仪器装备的强力单细胞分选能力相结合对细胞亚型进行的简单且明确的去卷积。
图11A-图11F是示出用于下一代测序的单细胞的门控的图。通过CPT管(目录号362761)收集外周血单核细胞(“PBMC”)。将PBMC用含有以下白血病白细胞表面标志物的抗体混合物连同BD ImagTMCD4T淋巴细胞富集试剂盒(目录号557939)染色：CD127BV421、CD25BB515、CD161PE、CD45RA PerCP-CyTM5.5、CD15S AF647、CD4APC-H(BD)。通过CD4+CD25+CD127-染色鉴定调节T细胞。将调节T细胞细胞通过两种细胞表面标志物CD45RA和CD15S进一步细分为原初调节T细胞(nTreg CD45RA+CD15S-)、效应调节T细胞(eTreg CD45-CD15S+)和非抑制性调节T细胞(CD45RA-CD15S-)。将非抑制性调节T细胞进一步分为CD161+和CD161-亚群。将非-调节T细胞细胞也收集到CD45RA+和CD45RA-亚群中。
图12A-图12B是示出从单细胞获得的读取和转录物数目的柱状图。图12A是示出从分选到PreciseTM板中的个别细胞开始的高测序成功的图。灰色条指示基于显著更低的总读取计数的可能的失败。如果需要的话，板索引允许多个板(高达4,000个细胞)合并到单次MiSeq运行中。图12B是示出在对读取去卷积之后来自与图A所示相同的板的96个单细胞的平均转录物计数的图。数据显示在大测量范围的单细胞内的绝对mRNA定量。分选的单细胞测序的成功大于95％。在对样品染色之后，在一个范围的时间内对单细胞进行分选。示出1小时数据点。
图13是显示PreciseTM测定校正了PCR偏移的计数读取相对于分子的图。PreciseTM测定校正了PCR扩增偏移并且允许对转录物进行绝对计数。对分子的数目进行计数显著降低了与计数读取相关联的噪声水平。
图14A-图14B是调节T细胞相对于非调节T细胞和初生调节T细胞相对于效应调节T细胞的主要组分分析(“PCA”)图，这些图显示表面标记物表型与分子谱相关。使用主要组分分析，使用在基因的组上表达的细胞的分子计数，使个别细胞成群集。通过在BD FACSJazz上进行的索引分选记录每个细胞的身份，这由每个着色的点表示。
图15A-图15C是CD45RA-CD15S+、CD161-非抑制性调节T细胞和CD45RA+CD15S-效应调节T细胞穿过时间点的PCA单细胞图。
在流式细胞术细胞分选之前利用声聚焦装置能够聚集感兴趣的细胞(小于样品中起始细胞群的1％)。这提供分选时间从数小时至数分钟的减少。这有利地提高了可以在其生命周期的同一点进行分析的活细胞群和更大的活细胞群。
此实例证明了使用BD FACSJazzTM细胞分选仪器与细胞研究公司PreciseTM工作流程相结合进行的低成本、高通量、单细胞基因组测序。该测定具有高成功率，对于单细胞分选和测序而言大于95％。它是迅速的，单细胞的一个96孔板可以在15分钟内分选同时富集，这使得在样品制备之后不希望的基因表达改变最小化。
总之，这些数据表明流动单细胞分选与单细胞条形编码的结合提供了用于将细胞表型与分子转录物分布相关联的强力工具。
实例2
用于高通量、高精确性、定量的、单细胞基因表达谱绘制的新型BD FACSseqTM细胞分选 仪
此实例证明了细胞分选仪用于高通量、高精确性、定量的单细胞基因表达谱绘制的用途。具体地，此实例显示了使用高通量单细胞基因组测序方法例如细胞研究公司PreciseTM测定与单细胞分选仪例如BD FACSseqTM细胞分选仪结合对细胞类型进行的简单且明确的去卷积。
在此实例中，披露了用于细胞周期分析和细胞表面标志物染色应用的单细胞分选的完整工作流程。具体地，此实例证明：1)通过碘化丙锭(PI)染色从集合体中去除死细胞；2)使用赫斯特(Hoechst)染料染色分离来自不同细胞周期阶段(G0/G1、S、G2)的单细胞；3)通过将每孔不同数目的细胞(1个细胞、5个细胞、10个细胞、20个细胞以及50个细胞)沉积在96-孔板中来分选细胞的准确性；以及4)基于其特异性细胞表面标志物染色从混合的癌细胞样品中分离单细胞。使用PreciseTM测定分析分选的细胞并使用下一代测序生成这些细胞的基因表达谱。
图16A-图16C是示出单细胞的细胞周期分析的图。将Jurkat细胞(T-白血病细胞系)培养至对数期并且用赫斯特34580染料(5mg/mL)染色半小时，并且在室温下用PI(目录号556463，5mg/mL)染色10分钟。使用BD FACSseqTM分选仪分析培养的Jurkat细胞。图16A是示出单细胞基于其复合散射而鉴定的触发脉冲宽度相对于散射高度的图。碘化丙啶(PI)染料是可以由紫色激光激发的膜渗透性DNA结合染料。图16B是PI中等荧光强度(“MFI”)相对于散射高度的图，其示出用PI阳性染色的细胞是死的或垂死的并且可以从集合体中排除。排除死细胞确保了仅活的、健康的代表性细胞进入基因组工作流程以进行分析。图16C是计数相对于赫斯特34580MFI的直方图，其示出活细胞的赫斯特染色信号。图16C示出基于其不同赫斯特染料荧光染色强度的G0/G1、S和G2/M细胞周期阶段的分布。
图17A-图17B是示出单细胞和少量细胞的准确递送的图。BD FACSseqTM分选仪可以准确地递送单细胞或者少量感兴趣的细胞。并且通过BD FACSseqTM分选仪的索引分选特性记录分选的细胞的表型信息。将单个或者少量(5、10、20以及50)的用4',6-二脒-2-苯基吲哚(“DAPI”)染色的固定的Jurkat细胞重复地分选到96-孔板中。图17A是如在荧光显微镜上可视化的代表性孔的图像，并且图17B是示出由索引分选记录的分选的细胞的表型信息的DAPI MFI相对于散射高度的图。
图18A-图18B是示出通过BD FACSseqTM细胞分选仪进行的单细胞分离的图。使用EpCAM BV421和CD3Bv650对具有以80％:20％比率混合的Jurkat细胞和T47D细胞(乳腺癌细胞系)的癌细胞样品进行染色并且在BD FACSseq分选仪上运行。图18A是示出单细胞被复合散射门控的触发脉冲宽度相对于散射高度的图。图18B是示出通过其特异性表面标志物染色对两种类型的细胞进行的分离的CD3BV650相对于EpCAM BV421的图。Jurkat细胞仅被CD3阳性染色，而T47D仅被EpCAM染色。将混合的细胞随机分选到96-孔细胞研究公司PreciseTM编码板的每个孔中，其中每个孔中一个单细胞。
图19A-图19C示出通过BD FACSseqTM细胞分选仪分离的图18A-图18B所示的Jurkat细胞和T47D细胞的PCA群集和基因表达谱。图19A是示出Jurkat细胞和T47D细胞到两个簇的群集的PCA图。图19B-图19C是示出Jurkat细胞簇1和T47D细胞簇2中的基因表达谱的柱状图。图19B-图19C示出这些基因在具有Jurkat细胞(簇1)和T47D细胞(簇2)的两个簇对应的孔中高度表达。
总之，这些数据证明了使用新的、容易使用的分选仪选择并分离单细胞以用于高分辨率基因组研究(包括下一代测序、qPCR和微阵列分析)的简单、快速的方法。分选仪提供了用于研究在个别细胞水平下的复杂样品的强力工具。
实例3
使用分子索引技术对Her2/neu-表达癌细胞获得的单细胞基因表达谱
此实例证明使用分子索引技术确定Her2/neu-表达癌细胞的单细胞基因表达谱。
乳腺癌中Her2/neu(Cerb-B2)的表达水平是诊断过程中的基本分类。此癌基因的过度表达与存活的减少相关联并且可以是治疗的驱动决定簇。然而，与Her2/neu过度表达相关联的侵入性乳腺癌中的作用机制尚不清楚。利用大块组织的常规基因谱研究可能受到差的信噪比的阻碍，从而使得难以了解基因表达中的变化。单细胞分析方法可以克服这些问题并且揭示更全面的数据集。此实例的目标是鉴定在过度表达Her2/neu的个别细胞中上调或下调的基因。
使用BD FACSseqTM细胞分选仪，将来自已知表达不同水平的Her2/neu的多种细胞系的单细胞分选到96-孔板中。所使用的细胞系包括SKBR3，它是已知过度表达Her2/neu的腺癌衍生的乳腺癌细胞系；以及T47D，它是证明低至中等Her2/neu表达的导管癌衍生的乳腺癌细胞系。在筛选中也包括阴性对照细胞系(HeLa和Jurkat)。对于乳腺癌特定基因，使用分子索引技术处理这些分选的单细胞。此基因表达图包括与乳腺癌相关联的100个基因。然后将所得基因谱与单个细胞上的Her2/neu表达水平相关联。
细胞培养.使用极限必需培养基(“MEM”)培养HeLa细胞(皮下腺癌细胞系)。使用洛斯维公园纪念所(Roswell Park Memorial Institute)培养基(“RPMI”)1640培养基培养Jurkat细胞(T-白细胞的细胞系)。使用杜氏(Dulbecco's)极限必需培养基(“DMEM”)培养SKBR3细胞(转移性乳腺腺癌细胞系)和T47D细胞(导管乳腺癌细胞系)二者。用10％热灭活胎牛血清(“FBS”)和1％青霉素/链霉素溶液补充所有的培养基。另外，在染色之前使用吉毕科公司(Gibco)收获所有细胞系。
流式细胞术.将HeLa、Jurkat、SKBR3以及T47D人类癌细胞系培养至对数期，收获并计数。将每种细胞系的1×106个细胞用BD HORIZONTM BV421Her-2/Neu(BD定制抗体)和BDHORIZONTM BV786CD44(BD生物科学公司(BD Biosciences)，目录号564942)染色30分钟，将其洗涤，接着用细胞活性染料碘化丙啶(BD生物科学公司，目录号51-66211E)在室温下染色10分钟。然后分析样品并且使用BD FACSseq细胞分选仪进行分选。基于Her2/Neu蛋白质表达，将活的单细胞直接分选到预先填充的细胞研究公司PreciseTM乳腺癌96-孔测定板中。
测序文库生成和数据分析.用基于洗涤剂的细胞裂解缓冲液连同RNA稳定剂、分子索引和样品特异性条形码预先装载细胞研究公司PreciseTM板。在将细胞分选到板中之后，将裂解的细胞保持冷冻在-80℃下，之后进一步处理。然后根据细胞研究公司PreciseTM测定方案处理这些样品，以将样品合并，扩增靶基因并生成测序文库。然后在MiSeq仪器上对文库进行测序。形成层流计算管线，并且在七桥基因组平台上进行自动化数据分析。然后使用Qlucore软件包分析来自七桥的数据输出。
图20A-图20B和图21A-图21D示出CD44和Her2/Neu的相对表达。图20A-图20B是CD44BV786相对于Her2/Neu BV421和计数相对于Her2/Neu BV421的图，这些图示出每个细胞类型Jurkat、T47D、HeLa以及SKBR3由CD44和Her2/Neu的相对表达明确限定。
图21A-图21D是示出图21A中的Jurkat细胞、图21B中的HeLa细胞、图21C中的T47D细胞以及图21D中的SKBR3细胞基于Her2/Neu表达来分选的图。收集每种细胞类型内的三个群体：低Her2/Neu、中等Her2/Neu和高Her2/Neu。将单细胞直接分选到BD PreciseTM乳腺癌96-孔测定板的每个孔中。每个象限示出用于确保分选的细胞是具有所希望的Her2/Neu表达谱的活单细胞的门控策略。
图22是示出使用细胞研究公司PreciseTM测定分析的乳腺癌基因的表格。使用作为基础的细胞研究公司PreciseTM基因文库(99个基因)加上11个另外的基因，此实例查询了110个靶基因。浅灰色阴影的基因指示最终数据分析中包括的靶标。无阴影的基因未检测超过阈值并且因此从最终数据分析中排除。将来自四个96-孔BD Precise测定板(4×96个样品)的产物合并，并且生成一个测序文库。
图23、图24A-图24B和图25A-图25G示出使用七桥基因组平台进行自动化数据分析。在110个靶基因中，57个靶基因的表达水平是可检测的。图23是示出所表达的靶基因的分析的热图，该热图证明了四种不同细胞类型之间的明显不同。在每种细胞类型内，由Her2/Neu蛋白质表达水平限定的亚群并未显示基因表达模式的显著差异。
图24A-图24B是示出由具有支持热图结果的随机Her2/Neu表达的细胞类型进行的群集的PCA图。图24A是示出由细胞类型进行的群集分析的PCA图。群集分析显示四种细胞类型清楚地分离成四个不同的簇。图24B是示出Her2/Neu表达在每种细胞类型簇内不具有可辨别模式的PCA图。
图25A-图25G是示出ERBB2、BRCA1、CDK2、MUC1、CDH1、CTSD以及CTSD的逐步增加的表达图。图25A示出ERBB2(Her2/Neu的mRNA前体)在SKBR3中具有极度的过度表达，在T47D中具有相对低的表达，并且在HeLa和Jurkat细胞中几乎不具有或不具有表达。T47D中的ERBB2表达的进一步检查显示通过流式细胞术获得的与Her2/Neu蛋白质表达很好地相关联的逐步增加。在图25B所示的肿瘤抑制因子BRCA1、图25C所示的激酶CDK2、图25D所示的粘蛋白MUC1、图25E所示的钙粘素CDH1、图25F所示的蛋白酶CTSD以及图25G所示的转录因子XBP1中检测到似乎与Her2/Neu表达相关联的其他基因产物中类似的逐步增加。
这些数据显示在不同癌细胞系内Her2/Neu的不同表达可以在蛋白质水平和mRNA水平下检测到。T47D细胞显示ERBB2的mRNA水平的增加，这表明与在低Her2/Neu、中等Her2/Neu和高Her2/Neu表达细胞的分选群体之间Her2/Neu的蛋白质水平的同时增加的适度相关性。BRCA1、CDK2、MUC1、CDH1、CTSD以及XBP1的mRNA水平类似的同时增加也显示了与Her2/Neu蛋白质表达水平的适度相关性。与细胞研究公司PreciseTM测定耦合的BD FACSseqTM细胞分选仪提供了从单细胞选择和分离到下游定量mRNA分析的耐用且成本有效的工作流程。此工作流程是结合用于研究单细胞水平下的复杂生物样品的表型表达谱和基因表达谱的强力工具。
鉴定与单细胞水平的Her2/neu过度表达相关联的基因阐明了在这些侵入性癌症中起作用的机制，这些侵入性癌症已知包括全部乳腺癌中的多达30％。总之，通过结合单细胞分选和分子分选所生成的这些数据阐明了在这些侵入性癌症中起作用的机制，这些侵入性癌症已知包括全部乳腺癌中的多达30％。
在至少一些先前描述的实施例中，在一个实施例中使用的一个或多个元件可以在另一个实施例中互换地使用，除非这种置换是技术上不可行的。本领域技术人员将了解的是，可以在不背离所要求保护的主题的范围的情况下对以上所述的方法和结构做出各种其他省略、添加和修改。所有这样的修改和改变预期属于如所附权利要求书所限定的主题的范围之内。
关于在此使用基本上任何复数和/或单数术语，那些本领域技术人员可以根据上下文和/或应用的需要将复数翻译成单数和/或将单数翻译成复数。为了清晰起见，可以在此清晰地列出各种单数/复数的转换。
本领域技术人员将理解的是，一般而言，在此所使用的术语，尤其是在所附权利要求书中的术语(例如，所附权利要求书的主体)通常意指“开放性的”术语(例如，术语“包含(including)”应当被解释为“包含但不局限于”，术语“具有”应当被解释为“具有至少”，术语“包括(includes)”应当被解释为“包括但不限于”等等)。本领域的普通技术人员将进一步理解的是，如果意指特定数目的所介绍的权利要求陈述，那么将在该权利要求中明确陈述这种意图，并且在缺乏这类陈述的情况下，不呈现这种意图。例如，为了有助于理解，以下所附权利要求书可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用，以用来介绍权利要求陈述。然而，此类短语的使用不应当解释为意指经由不定冠词“一个”或“一种”介绍权利要求陈述将任何含有此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制于仅含有一个这种陈述的实施例，即使在相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”以及不定冠词例如“一个”或“一种”(例如，“一个”和/或“一种”，也应当解释为表示“至少一个”或“一个或多个”)的时候也是如此；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。另外，即使明确地陈述一个介绍的权利要求陈述的特定数目，本领域技术人员将会意识到此陈述物也应当解释为意味着至少该陈述的数目(例如，仅陈述“两个陈述”而无其他修饰语意指至少两个陈述，或两个或者多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B以及C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的句法结构意指在一定意义上本领域技术人员将理解该惯例(例如，“具有A、B以及C中的至少一个的系统”将包括但不局限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C、和/或同时具有A、B以及C等的系统)。在使用类似于“A、B以及C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常这样的句法结构意指在一定意义上本领域技术人员将理解该惯例(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不局限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、同时具有A和B、同时具有A和C、同时具有B和C、和/或同时具有A、B以及C等的系统)。本领域普通技术人员将进一步理解地是，无论是在说明、权利要求书还是在附图中，实际上呈现两个或更多个选择性术语的任何转折性词语和/或短语都应当理解为考虑到了包含这些术语之一、这些术语中的任一者或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将理解为包含“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当以马库什(Markush)组的方式描述本披露的多个特征或方面时，在本领域内的技术人员将会认识到还以该马库什组中任一个单独的成员或多个成员的子组的方式来对本披露进行描述。
如本领域技术人员将理解，出于诸如就提供书面说明而言的任何和所有目的，在此披露的所有范围也包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易被认为已经充分描述并使得同一范围分成至少相等的二等分、三等分、四等分、五等分、十等分等。作为一个非限制性实例，在此讨论的每个范围可以容易分为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的是，所有诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等语言包括所提数值，并且是指可以接着分成如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解，一个范围包括每个独立成员。因此例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
虽然在此已披露了各个方面和实施例，其他方法和实施例对于本领域技术人员而言将是清楚的。在此所披露的各个方面和实施例是出于数目的目的并且不预期是限制性的，其中真实的范围和精神是由以下权利要求书所指示的。

Claims (37)

1.一种单细胞多核苷酸测序的方法，所述方法包括：
将包含感兴趣的细胞的多个细胞的样品富集以产生富集的细胞样品；
从所述富集的细胞样品中分离一种或多种感兴趣的细胞；并且
获得来自所述一种或多种分离的细胞中每一种的一种或多种多核苷酸的序列信息，其中获得序列信息包括生成来自所述一种或多种分离的细胞的分子索引的多核苷酸文库。
2.如权利要求1所述的方法，其中富集所述样品包括聚集所述样品中的所述感兴趣的细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其中富集所述样品进一步包括消除所述样品中不感兴趣的细胞。
4.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其中聚集所述样品中的所述感兴趣的细胞包括将所述样品中的所述感兴趣的细胞聚集到细胞核心流中。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，其中聚集所述样品中的所述感兴趣的细胞包括基于细胞大小聚集所述样品中的所述感兴趣的细胞。
6.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中聚集所述样品中的所述感兴趣的细胞包括声聚焦。
7.如权利要求6所述的方法，其中声聚焦包括：
将所述样品中的所述多个细胞悬浮在细长流体填充通道中；并且
将所述通道暴露于平行于流动方向的轴向声驻波场，其中所述轴向声驻波场将所述多个细胞沿着所述通道的中心轴驱动到潜在力最小值的位置，以产生均匀间隔的细胞。
8.如权利要求2-5中任一项所述的方法，其中聚集所述样品中的所述感兴趣的细胞包括流体动力学聚焦、磁场聚焦、电场聚焦、重力场聚焦、光学场聚焦或其组合。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中从所述富集的细胞样品中分离所述一种或多种感兴趣的细胞包括使用流式细胞仪分选所述富集的细胞样品中的细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述流式细胞仪利用荧光激活细胞分选。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中分离所述样品中的所述一种或多种感兴趣的细胞包括将所述样品中的所述一种或多种感兴趣的细胞沉积到一个或多个微量滴定板中。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述一个或多个微量滴定板中的每一个具有至少96个孔。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述一种或多种多核苷酸包括核糖核酸(RNA)。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述RNA是信使RNA(mRNA)。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述序列信息包括至少10个基因的转录物计数。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述序列信息包括以下一种或多种的转录物计数：CD4、FOX01、CD45RO、MYC、IL1R2、PRF1、GZMK、LGALS1、IL17F、IL23R、LYNX1、PRDM1、SELL、SMAD4、ICOS、IKZF5、RORC、AHRR、CTLA4、ITGB7、ENTPD1、CCR8、TSHR、TGFB2、IL12A、IL7R、HLA-DMA、CCR5、TIAF1、BCL6、BHLHE40、CXCR4以及CD307c。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述序列信息包括以下一种或多种的转录物计数：CD3D、GSTP1、TCF7、CD3E、RNB6、RB1、MYB、CD3G、KRT8、CDH1、ERBB3、ERBB2、TCTN1、ESR1、CDKN1A以及TFF3。
18.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述序列信息包括以下一种或多种的转录物计数：ABCB1、ABCG2、ADAM23、AKTl、APC、AR、ATM、BAD、BCL2、BIRC5、BRCA1、BRCA2、C4A、CA12、CCNA1、CCND1、CCND2、CCNE1、CDH1、CDH13、CDK2、CD326、CDKN1A、CDKN1C、CDKN2A、CSF1、CST6、CTNNBl、CTSD、EGF、EGFR、EMAP-2、ERBB2、ERBB3、ESR1、ESR2、FOXA1、GATA3、GLI1、GPI、GRB7、GSTP1、HIC1、HPRTl、ID1、IGF1、IGF1R、IGFBP3、IL6、JUN、KRT18、KRT19、KRT5、KRT8、LAMPl、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MGMT、MKI67、MLH1、MMP2、MMP9、MUC1、MYB、MYC、NME1、NOTCH1、NR3C1、PGR、PLAU、PRDM2、PSMB2、PSMB4、PTEN、PTGS2、PYCARD、RAB7A、RARA、RARB、RASSF1、RB1、REEP5、RNB6、SERPINE1、SFN、SFRP1、SLC39A6、SLIT2、SNAI2、SRC、TBC1D9、TCTN1、TFF3、TGFB1、THBS1、TP73、TWIST1、VEGFA、XBP1、CD3E、CD3G、CD3G、TCF7、ALCAM、CD25、ITGA6、THY1、PROM1以及CXCR4。
19.如权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述RNA是从外来体中获得的。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中不超过500个细胞是从所述富集的细胞样品中分离的。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中获得序列信息进一步包括对所述分子索引的多核苷酸文库进行测序。
22.如权利要求21所述的方法，其中对所述分子索引的多核苷酸文库进行测序包括对由所述文库测序获得的测序结果进行去卷积。
23.如权利要求22所述的方法，其中对所述测序结果进行去卷积包括使用软件即服务平台。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述样品包括生物样品、临床样品、环境样品或其组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述样品包括来自患者的生物流体、组织和细胞中的一种或多种。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述样品包括血液、尿液、脑脊液、胸膜液、羊水、精液、唾液、骨髓、活检样品或其组合。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述感兴趣的细胞包括干细胞、癌细胞、血细胞、外周血单核细胞、循环肿瘤细胞、乳腺癌细胞、处于预期细胞周期阶段的细胞或其组合。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述获得的序列信息确定所述患者的基因型。
29.如权利要求25-27中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述获得的序列信息确定所述患者的表型。
30.如权利要求25-27中任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述获得的序列信息确定所述患者的一种或多种遗传突变。
31.如权利要求25-27中任一项所述的方法，所述方法进一步包括预测所述患者对一种或多种疾病的易感性。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种疾病中的至少一种是癌症或遗传性疾病。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述样品中细胞总数目的小于10％是所述样品中的所述感兴趣的细胞。
34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述样品中细胞总数目的小于0.1％是所述样品中的所述感兴趣的细胞。
35.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述样品中细胞总数目的小于0.01％是所述样品中的所述感兴趣的细胞。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，所述方法进一步包括消除所述样品中的干扰细胞。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，所述方法进一步包括消除所述样品中的碎片。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108676890A (zh) * 2018-07-12 2018-10-19 吉林大学 一种女性乳腺恶性肿瘤易感性预测试剂盒及系统
CN111088369A (zh) * 2020-01-17 2020-05-01 天津奥群牧业有限公司 一种绵羊rora基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用
CN112119151A (zh) * 2018-03-02 2020-12-22 量子细胞公司 从组织中分离和表达分析感兴趣的区域的方法、组成和装置
CN112867801A (zh) * 2018-11-30 2021-05-28 Illumina公司 使用单一测定分析多种分析物
WO2022188054A1 (en) * 2021-03-10 2022-09-15 Nanjing University Methods and reagents for sample multiplexing for high throughput single-cell rna sequencing
CN116453602A (zh) * 2023-02-17 2023-07-18 祥符实验室 一种基于ddPCR与荧光液滴分选富集的DNA数据库随机读取方法

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP2820158B1 (en) 2012-02-27 2018-01-10 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
CN107208158B (zh) 2015-02-27 2022-01-28 贝克顿迪金森公司 空间上可寻址的分子条形编码
JP7508191B2 (ja) 2015-03-30 2024-07-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー コンビナトリアルバーコーディングのための方法および組成物
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
EP3347465B1 (en) 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
WO2017205691A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Cellular Research, Inc. Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
CA3034924A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Cellular Research, Inc. Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
EP3539035B1 (en) 2016-11-08 2024-04-17 Becton, Dickinson and Company Methods for expression profile classification
WO2018089377A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Cellular Research, Inc. Methods for cell label classification
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018144240A1 (en) 2017-02-01 2018-08-09 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
JP7187474B2 (ja) 2017-03-31 2022-12-12 ライフ テクノロジーズ コーポレーション フローサイトメトリーを撮像するための装置、システム、および方法
US10676779B2 (en) 2017-06-05 2020-06-09 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
EP3415608B1 (en) * 2017-06-14 2022-05-11 Ricoh Company, Ltd. Method for producing cell containing base
CN109680343B (zh) * 2017-10-18 2022-02-18 深圳华大生命科学研究院 一种外泌体微量dna的建库方法
CN111492068A (zh) 2017-12-19 2020-08-04 贝克顿迪金森公司 与寡核苷酸相关联的颗粒
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11365409B2 (en) 2018-05-03 2022-06-21 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
EP3861134B1 (en) 2018-10-01 2024-09-04 Becton, Dickinson and Company Determining 5' transcript sequences
US11932849B2 (en) 2018-11-08 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
EP3894552A1 (en) 2018-12-13 2021-10-20 Becton, Dickinson and Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
US11661631B2 (en) 2019-01-23 2023-05-30 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides associated with antibodies
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
CN113454234A (zh) 2019-02-14 2021-09-28 贝克顿迪金森公司 杂合体靶向和全转录物组扩增
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
WO2021016239A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
WO2021113065A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Becton, Dickinson And Company Magnetic capture bead mediated molecular barcoding of nucleic acid targets in single particles and compositions for use in the same
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
CN115735111A (zh) * 2020-04-28 2023-03-03 贝克顿·迪金森公司 用于对独特表型进行索引分选的方法及用于其的系统
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
IL300826A (en) * 2020-08-25 2023-04-01 Seer Inc Compositions and methods for testing proteins and nucleic acids
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008122051A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Acoustic Cytometry Systems, Inc. Methods and devices for enhanced analysis of field focused cells and particles
US20140178438A1 (en) * 2011-05-24 2014-06-26 Ugur Sahin Individualized vaccines for cancer
CN104032377A (zh) * 2014-06-30 2014-09-10 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用

Family Cites Families (275)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4510244A (en) 1980-04-17 1985-04-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Cell labeling with antigen-coupled microspheres
US4725536A (en) 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US6150517A (en) 1986-11-24 2000-11-21 Gen-Probe Methods for making oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms
IE72468B1 (en) 1987-07-31 1997-04-09 Univ Leland Stanford Junior Selective amplification of target polynucleotide sequences
US5149625A (en) 1987-08-11 1992-09-22 President And Fellows Of Harvard College Multiplex analysis of DNA
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
WO1990001065A1 (en) 1988-07-26 1990-02-08 Genelabs Incorporated Rna and dna amplification techniques
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5871928A (en) 1989-06-07 1999-02-16 Fodor; Stephen P. A. Methods for nucleic acid analysis
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5925525A (en) 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US5200314A (en) 1990-03-23 1993-04-06 Chiron Corporation Polynucleotide capture assay employing in vitro amplification
AU1248292A (en) 1990-12-06 1992-07-08 Affymax Technologies N.V. Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides
US5981179A (en) 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5981176A (en) 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
AU7212494A (en) 1993-06-25 1995-01-17 Affymax Technologies N.V. Hybridization and sequencing of nucleic acids
US5500356A (en) 1993-08-10 1996-03-19 Life Technologies, Inc. Method of nucleic acid sequence selection
US6309823B1 (en) 1993-10-26 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes for analyzing biotransformation genes and methods of using the same
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
US5714330A (en) 1994-04-04 1998-02-03 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5695934A (en) 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US6600996B2 (en) 1994-10-21 2003-07-29 Affymetrix, Inc. Computer-aided techniques for analyzing biological sequences
ES2271944T3 (es) 1994-10-28 2007-04-16 Gen-Probe Incorporated Composiciones y metodos para la deteccion y cuantificacion simultaneas de multiples secuencias especificas de acidos nucleicos.
ATE254965T1 (de) 1995-04-25 2003-12-15 Discovery Partners Internation Fernprogrammierbare matrizen mit speichern und verwendungen davon
US5648245A (en) 1995-05-09 1997-07-15 Carnegie Institution Of Washington Method for constructing an oligonucleotide concatamer library by rolling circle replication
US5968740A (en) 1995-07-24 1999-10-19 Affymetrix, Inc. Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid
US5763175A (en) 1995-11-17 1998-06-09 Lynx Therapeutics, Inc. Simultaneous sequencing of tagged polynucleotides
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US6613544B1 (en) 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US5962271A (en) 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
AU730633B2 (en) 1996-05-29 2001-03-08 Phillip Belgrader Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
JPH1021373A (ja) 1996-07-05 1998-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd 画像解析装置
US5935793A (en) 1996-09-27 1999-08-10 The Chinese University Of Hong Kong Parallel polynucleotide sequencing method using tagged primers
US6124092A (en) 1996-10-04 2000-09-26 The Perkin-Elmer Corporation Multiplex polynucleotide capture methods and compositions
US6117631A (en) 1996-10-29 2000-09-12 Polyprobe, Inc. Detection of antigens via oligonucleotide antibody conjugates
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
EP0985142A4 (en) 1997-05-23 2006-09-13 Lynx Therapeutics Inc SYSTEM AND APPARATUS FOR THE SEQUENTIAL TREATMENT OF ANALYTES
US6399334B1 (en) 1997-09-24 2002-06-04 Invitrogen Corporation Normalized nucleic acid libraries and methods of production thereof
AU1603199A (en) 1997-12-03 1999-06-16 Curagen Corporation Methods and devices for measuring differential gene expression
US6265163B1 (en) 1998-01-09 2001-07-24 Lynx Therapeutics, Inc. Solid phase selection of differentially expressed genes
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
WO2000014282A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Lynx Therapeutics, Inc. Method of screening for genetic polymorphism
US6480791B1 (en) 1998-10-28 2002-11-12 Michael P. Strathmann Parallel methods for genomic analysis
US6197554B1 (en) 1998-11-20 2001-03-06 Shi-Lung Lin Method for generating full-length cDNA library from single cells
US6629040B1 (en) 1999-03-19 2003-09-30 University Of Washington Isotope distribution encoded tags for protein identification
CA2366459A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Affymetrix, Inc. Universal arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
DE60045059D1 (de) 1999-04-20 2010-11-18 Nat Inst Of Advanced Ind Scien Verfahren und Sonden zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäure-Molekülen und Verfahren zur Analyse der gewonnenen Daten
US6372813B1 (en) 1999-06-25 2002-04-16 Motorola Methods and compositions for attachment of biomolecules to solid supports, hydrogels, and hydrogel arrays
US6326148B1 (en) 1999-07-12 2001-12-04 The Regents Of The University Of California Detection of copy number changes in colon cancer
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
SE9903988D0 (sv) 1999-11-03 1999-11-03 Amersham Pharm Biotech Ab Method of analysis
US6489114B2 (en) 1999-12-17 2002-12-03 Bio Merieux Process for labeling a ribonucleic acid, and labeled RNA fragments which are obtained thereby
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
WO2001057269A2 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US20020072058A1 (en) 2000-03-24 2002-06-13 Voelker Leroy L. Method for amplifying quinolone-resistance-determining-regions and identifying polymorphic variants thereof
EP2206791B1 (en) 2000-04-10 2016-07-13 Taxon Biosciences, Inc. Methods for the survey and genetic analysis of populations
US20030207300A1 (en) 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7630063B2 (en) * 2000-08-02 2009-12-08 Honeywell International Inc. Miniaturized cytometer for detecting multiple species in a sample
JP2004513619A (ja) 2000-07-07 2004-05-13 ヴィジゲン　バイオテクノロジーズ　インコーポレイテッド リアルタイム配列決定
CA2426824A1 (en) 2000-10-24 2002-07-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic dna
US20020142345A1 (en) 2000-12-22 2002-10-03 Nelsen Anita J. Methods for encoding and decoding complex mixtures in arrayed assays
US20030049616A1 (en) 2001-01-08 2003-03-13 Sydney Brenner Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags
WO2002070684A2 (en) 2001-01-11 2002-09-12 Lion Bioscience Ag Gene library for screening methods
WO2002059355A2 (en) 2001-01-25 2002-08-01 Tm Bioscience Corporation Polynucleotides for use as tags and tag complements, manufacture and use thereof
JP2005233974A (ja) 2001-03-21 2005-09-02 Olympus Corp 生化学的検査方法
US7027932B2 (en) 2001-03-21 2006-04-11 Olympus Optical Co., Ltd. Biochemical examination method
AUPR480901A0 (en) 2001-05-04 2001-05-31 Genomics Research Partners Pty Ltd Diagnostic method for assessing a condition of a performance animal
US6849404B2 (en) 2001-05-07 2005-02-01 Bioneer Corporation Polymerase chain reaction of DNA of which base sequence is completely unidentified
US6905827B2 (en) 2001-06-08 2005-06-14 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases
JP4244534B2 (ja) 2001-06-12 2009-03-25 横河電機株式会社 バイオチップ
US6830931B2 (en) 2001-07-12 2004-12-14 Automated Cell, Inc. Method and apparatus for monitoring of proteins and cells
WO2006071776A2 (en) 2004-12-23 2006-07-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Ligation-based rna amplification
EP1476569A2 (en) 2002-01-29 2004-11-17 Global Genomics AB Methods and means for manipulating nucleic acid
US20030186251A1 (en) 2002-04-01 2003-10-02 Brookhaven Science Associates, Llc Genome sequence tags
US20070178478A1 (en) 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
US20050019776A1 (en) 2002-06-28 2005-01-27 Callow Matthew James Universal selective genome amplification and universal genotyping system
WO2004003219A2 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Igen International, Inc. Improved assay systems and components
AU2003276852A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Clinical Microarrays, Inc. Reading of fluorescent arrays
US7361821B2 (en) 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
AU2002329063A1 (en) 2002-09-30 2004-04-23 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene
WO2004040001A2 (en) 2002-10-02 2004-05-13 California Institute Of Technology Microfluidic nucleic acid analysis
WO2004044225A2 (en) 2002-11-11 2004-05-27 Affymetrix, Inc. Methods for identifying dna copy number changes
US7822555B2 (en) 2002-11-11 2010-10-26 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US7269518B2 (en) 2003-04-30 2007-09-11 Agilent Technologies, Inc. Chemical array reading
US20040259118A1 (en) 2003-06-23 2004-12-23 Macevicz Stephen C. Methods and compositions for nucleic acid sequence analysis
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
GB0319332D0 (en) 2003-08-16 2003-09-17 Astrazeneca Ab Amplification
US20050048498A1 (en) 2003-08-29 2005-03-03 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for assembling probes
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
ATE461292T1 (de) 2003-09-10 2010-04-15 Althea Technologies Inc Erstellung von expressionsprofilen unter verwendung von mikroarrays
EP1694869A2 (en) 2003-11-10 2006-08-30 Investigen, Inc. Methods of preparing nucleic acid for detection
EP1709203A2 (en) 2004-01-23 2006-10-11 Lingvitae AS Improving polynucleotide ligation reactions
AU2005214329A1 (en) 2004-02-12 2005-09-01 Population Genetics Technologies Ltd Genetic analysis by sequence-specific sorting
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US20050250147A1 (en) 2004-05-10 2005-11-10 Macevicz Stephen C Digital profiling of polynucleotide populations
AU2005252242A1 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Irm Llc Dispensing systems, software, and related methods
US20060035258A1 (en) 2004-08-06 2006-02-16 Affymetrix, Inc. Methods for identifying DNA copy number changes
US20060041385A1 (en) 2004-08-18 2006-02-23 Bauer Kenneth D Method of quantitating proteins and genes in cells using a combination of immunohistochemistry and in situ hybridization
EP1647600A3 (en) 2004-09-17 2006-06-28 Affymetrix, Inc. (A US Entity) Methods for identifying biological samples by addition of nucleic acid bar-code tags
EP1871527B1 (en) 2004-12-23 2017-09-27 Abbott Point of Care Inc. Molecular diagnostics system
EP1845160A4 (en) 2005-02-10 2009-07-01 Riken NUCLEOTIDE-amplification
US7393665B2 (en) 2005-02-10 2008-07-01 Population Genetics Technologies Ltd Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides
US20060211030A1 (en) 2005-03-16 2006-09-21 Sydney Brenner Methods and compositions for assay readouts on multiple analytical platforms
EP1861512A4 (en) 2005-03-18 2009-12-09 Fluidigm Corp THERMAL REACTION DEVICE AND USE METHOD THEREFOR
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
US7695886B2 (en) 2005-05-19 2010-04-13 Fuji Xerox Co., Ltd. Process for producing resin particle liquid dispersion for electrostatic image developing toner, electrostatic image developing toner and production process thereof
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
US7796815B2 (en) 2005-06-10 2010-09-14 The Cleveland Clinic Foundation Image analysis of biological objects
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
CA2620081A1 (en) 2005-09-16 2007-03-29 454 Life Sciences Corporation Cdna library preparation
US8313711B2 (en) 2005-11-01 2012-11-20 Freeslate, Inc. Liquid dispensing for high-throughput experimentation
US7375211B2 (en) 2005-11-18 2008-05-20 Kou Zhong C Method for detection and quantification of T-cell receptor Vβ repertoire
US20080070303A1 (en) 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US7636465B2 (en) 2005-12-09 2009-12-22 Cytyc Corporation Cross-frame object reconstruction for image-based cytology applications
EP1987162A4 (en) 2006-01-23 2009-11-25 Population Genetics Technologi NUCLEIC ACID ANALYSIS ABOUT SEQUENCE TOKENS
WO2007087312A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 Population Genetics Technologies Ltd. Molecular counting
US20080038727A1 (en) 2006-03-10 2008-02-14 Applera Corporation MicroRNA and Messenger RNA Detection on Arrays
EP2002246A1 (en) 2006-04-04 2008-12-17 Sidec Technologies AB Extended electron tomography
US20080194414A1 (en) 2006-04-24 2008-08-14 Albert Thomas J Enrichment and sequence analysis of genomic regions
WO2007136874A2 (en) 2006-05-18 2007-11-29 President And Fellows Of Harvard College Genomic library construction
EP4108780A1 (en) 2006-06-14 2022-12-28 Verinata Health, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
WO2008147428A1 (en) 2006-10-05 2008-12-04 Nanopoint, Inc. Systems and methods for active microfluidic cell handling
CA2669728C (en) 2006-11-15 2017-04-11 Biospherex Llc Multitag sequencing and ecogenomics analysis
US8050476B2 (en) 2006-11-22 2011-11-01 General Electric Company Heart rate demodulation of periodic movement in ultrasound data for object identification
EP4134667A1 (en) 2006-12-14 2023-02-15 Life Technologies Corporation Apparatus for measuring analytes using fet arrays
EP2096429A4 (en) 2007-01-16 2009-12-16 Olympus Corp FLUORESCENT SIGNAL ANALYSIS APPARATUS AND FLUORESCENT SIGNAL ANALYSIS METHOD
WO2008109207A2 (en) 2007-01-30 2008-09-12 The Regents Of The University Of California Methods and devices for biomolecular arrays
US20080269068A1 (en) 2007-02-06 2008-10-30 President And Fellows Of Harvard College Multiplex decoding of sequence tags in barcodes
WO2008096318A2 (en) 2007-02-09 2008-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Identification system
KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2009-02-06 성균관대학교산학협력단 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도
JP2008256428A (ja) 2007-04-03 2008-10-23 Intec Systems Institute Inc マイクロアレイ画像のブロック位置検出方法
US20080274458A1 (en) 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US20090061513A1 (en) 2007-05-15 2009-03-05 Picovitro Ab Cell sorting and cell cultivation methods
CN101720359A (zh) 2007-06-01 2010-06-02 454生命科学公司 从多重混合物中识别个别样本的系统和方法
WO2009031054A2 (en) 2007-06-29 2009-03-12 Population Genetics Technologies Ltd. Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants
CA2720747A1 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Gentel Biosciences, Inc. Substrates for multiplexed assays and uses thereof
US8687189B2 (en) 2008-03-03 2014-04-01 Ajjer, Llc Analysis of arrays by laser induced breakdown spectroscopy
DE102008025656B4 (de) 2008-05-28 2016-07-28 Genxpro Gmbh Verfahren zur quantitativen Analyse von Nukleinsäuren, Marker dafür und deren Verwendung
US20090298709A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Affymetrix, Inc. Assays for determining telomere length and repeated sequence copy number
US20100120097A1 (en) 2008-05-30 2010-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for nucleic acid sequencing
WO2010021936A1 (en) 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US20100159533A1 (en) 2008-11-24 2010-06-24 Helicos Biosciences Corporation Simplified sample preparation for rna analysis
US8492096B2 (en) * 2008-12-24 2013-07-23 Boris Pasche TGFBR1 expression modifies risk for colorectal cancer
JP2012515533A (ja) 2009-01-20 2012-07-12 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 診断、予後診断、および創薬ターゲットの同定のための単細胞遺伝子発現の方法
US20100323348A1 (en) 2009-01-31 2010-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process
MX2011009244A (es) 2009-03-05 2011-09-26 Daiichi Sankyo Co Ltd Derivado de piridina.
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
DK2414548T3 (en) 2009-03-30 2015-12-21 Illumina Inc Gene expression in single cells
KR101829182B1 (ko) 2009-04-02 2018-03-29 플루이다임 코포레이션 표적 핵산의 바코딩을 위한 멀티 프라이머 증폭 방법
US9085798B2 (en) 2009-04-30 2015-07-21 Prognosys Biosciences, Inc. Nucleic acid constructs and methods of use
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
GB0909923D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Oxford Gene Tech Ip Ltd Picowell capture devices for analysing single cells or other particles
US8330957B2 (en) 2009-06-29 2012-12-11 Hager Enviromental and Atmospheric Technologies, LLC Device and method for quantification of gases in plumes by remote sensing
CA2766351C (en) 2009-06-29 2018-02-27 Luminex Corporation Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
US9364831B2 (en) * 2009-08-08 2016-06-14 The Regents Of The University Of California Pulsed laser triggered high speed microfluidic switch and applications in fluorescent activated cell sorting
CN102482668A (zh) 2009-08-20 2012-05-30 群体遗传学科技有限公司 分子内核酸重排的组合物和方法
US9493822B2 (en) 2009-09-01 2016-11-15 Koninklijke Philips Electronics N.V. Devices and methods for microarray selection
US8936762B2 (en) 2009-09-01 2015-01-20 Trustees Of Boston University High throughput multichannel reader and uses thereof
US9625454B2 (en) 2009-09-04 2017-04-18 The Research Foundation For The State University Of New York Rapid and continuous analyte processing in droplet microfluidic devices
WO2011041308A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Quest Diagnostics Investments Incorporated Bcr-abl truncation mutations
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
EP2366031B1 (en) 2010-01-19 2015-01-21 Verinata Health, Inc Sequencing methods in prenatal diagnoses
US10662474B2 (en) 2010-01-19 2020-05-26 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic DNA by whole genome sequencing
WO2011100604A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
SG185544A1 (en) 2010-05-14 2012-12-28 Fluidigm Corp Nucleic acid isolation methods
US8828688B2 (en) 2010-05-27 2014-09-09 Affymetrix, Inc. Multiplex amplification methods
EP2580351B1 (en) 2010-06-09 2018-08-29 Keygene N.V. Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening
EP2407242A1 (en) 2010-07-13 2012-01-18 Dublin City University Direct clone analysis and selection technology
US20120040843A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Dublin City University Centrifugal capture system
EP3115468B1 (en) 2010-09-21 2018-07-25 Agilent Technologies, Inc. Increasing confidence of allele calls with molecular counting
WO2012042374A2 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Anssi Jussi Nikolai Taipale Method of determining number or concentration of molecules
CA2814049C (en) 2010-10-08 2021-07-13 President And Fellows Of Harvard College High-throughput single cell barcoding
US20120088691A1 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Gao Chen Highly multiplexed real-time pcr using encoded microbeads
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
AU2011336707A1 (en) 2010-11-29 2013-07-04 Dako Denmark A/S Methods and systems for analyzing images of specimens processed by a programmable quantitative assay
EP2649447A4 (en) 2010-12-09 2018-06-06 Akonni Biosystems Sample analysis system
EP2652155B1 (en) 2010-12-16 2016-11-16 Gigagen, Inc. Methods for massively parallel analysis of nucleic acids in single cells
WO2012092515A2 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Life Technologies Corporation Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing
US20120190020A1 (en) 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US9365897B2 (en) 2011-02-08 2016-06-14 Illumina, Inc. Selective enrichment of nucleic acids
US9150852B2 (en) 2011-02-18 2015-10-06 Raindance Technologies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
KR20120110431A (ko) 2011-03-29 2012-10-10 에스케이하이닉스 주식회사 반도체 메모리 장치
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
AU2012242847B2 (en) 2011-04-15 2017-01-19 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
AU2012249759A1 (en) 2011-04-25 2013-11-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
CN103890245B (zh) 2011-05-20 2020-11-17 富鲁达公司 核酸编码反应
US9518292B2 (en) 2011-05-26 2016-12-13 Brandeis University Methods for suppression PCR
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9752176B2 (en) 2011-06-15 2017-09-05 Ginkgo Bioworks, Inc. Methods for preparative in vitro cloning
WO2013003498A2 (en) * 2011-06-27 2013-01-03 Life Technologies Corporation Acoustic cytometry methods and protocols
US9340826B2 (en) 2011-08-01 2016-05-17 Celemics, Inc. Method of preparing nucleic acid molecules
JP5816486B2 (ja) 2011-08-18 2015-11-18 オリンパス株式会社 蛍光観察装置および蛍光観察システム並びに蛍光観察装置の蛍光画像処理方法
KR101337094B1 (ko) 2011-11-30 2013-12-05 삼성에스디에스 주식회사 염기 서열 정렬 장치 및 그 방법
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
WO2013120089A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Raindance Technologies, Inc. Molecular diagnostic screening assay
EP3309262B1 (en) 2012-02-24 2019-09-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
EP2820158B1 (en) 2012-02-27 2018-01-10 Cellular Research, Inc. Compositions and kits for molecular counting
EP2820174B1 (en) 2012-02-27 2019-12-25 The University of North Carolina at Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
US9803239B2 (en) 2012-03-29 2017-10-31 Complete Genomics, Inc. Flow cells for high density array chips
PT2850211T (pt) 2012-05-14 2021-11-29 Irepertoire Inc Método para aumentar a precisão na deteção quantitativa de polinucleótidos
US9840732B2 (en) 2012-05-21 2017-12-12 Fluidigm Corporation Single-particle analysis of particle populations
CN108587867B (zh) 2012-05-25 2021-12-17 北卡罗来纳-查佩尔山大学 微流体装置、用于试剂的固体支持体和相关方法
WO2013188831A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Uniquely tagged rearranged adaptive immune receptor genes in a complex gene set
CN104619862B (zh) 2012-06-15 2017-10-31 得克萨斯系统大学董事会 单细胞的多转录物的高通量测序
CN104619894B (zh) 2012-06-18 2017-06-06 纽亘技术公司 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法
EP2875173B1 (en) 2012-07-17 2017-06-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
US9695416B2 (en) 2012-07-18 2017-07-04 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Method of normalizing biological samples
WO2014018460A1 (en) 2012-07-24 2014-01-30 Sequenta, Inc. Single cell analysis using sequence tags
US20150005200A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378349A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
JP6367196B2 (ja) 2012-08-14 2018-08-01 テンエックス・ジェノミクス・インコーポレイテッド マイクロカプセル組成物および方法
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140378322A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20150005199A1 (en) 2012-08-14 2015-01-01 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
AU2013337280B2 (en) 2012-11-05 2018-11-08 Takara Bio Usa, Inc. Barcoding nucleic acids
EP3567116A1 (en) 2012-12-14 2019-11-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014108850A2 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. High throughput transcriptome analysis
US9562269B2 (en) 2013-01-22 2017-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Haplotying of HLA loci with ultra-deep shotgun sequencing
CN104955576A (zh) 2013-01-24 2015-09-30 沙特基础全球技术有限公司 由聚酯-聚碳酸酯制成的微孔板
EP2951557B1 (en) 2013-02-01 2022-10-05 Becton Dickinson and Company Methods and systems for assessing sample behavior in a flow cytometer
US9644204B2 (en) 2013-02-08 2017-05-09 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
WO2014126937A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Suspension arrays and multiplexed assays based thereon
US20140274811A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Lyle J. Arnold Methods for Amplifying a Complete Genome or Transcriptome
US9816088B2 (en) 2013-03-15 2017-11-14 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
WO2014165762A1 (en) 2013-04-05 2014-10-09 Raindance Technologies, Inc. Rare cell analysis after negative selection
EP2805769A1 (en) 2013-05-24 2014-11-26 European Molecular Biology Laboratory Methods for nano-scale single cell analysis
US20160122753A1 (en) * 2013-06-12 2016-05-05 Tarjei Mikkelsen High-throughput rna-seq
EP4357493A3 (en) 2013-06-27 2024-07-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
GB2546833B (en) 2013-08-28 2018-04-18 Cellular Res Inc Microwell for single cell analysis comprising single cell and single bead oligonucleotide capture labels
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
CA2922926A1 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Fluidigm Corporation Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell
GB201317301D0 (en) 2013-09-30 2013-11-13 Linnarsson Sten Method for capturing and encoding nucleic acid from a plurality of single cells
EP3052658B1 (en) 2013-09-30 2021-03-31 Vesicode AB Methods to profile molecular complexes by using proximity dependant bar-coding
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
CN114717291A (zh) 2013-12-30 2022-07-08 阿特雷卡公司 使用核酸条形码分析与单细胞缔合的核酸
CA2941612A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US20150298091A1 (en) 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids
KR20170026383A (ko) 2014-06-26 2017-03-08 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 서열의 분석
KR102531677B1 (ko) 2014-06-26 2023-05-10 10엑스 제노믹스, 인크. 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
ES2784361T3 (es) 2015-01-22 2020-09-24 Becton Dickinson Co Dispositivos y sistemas para la creación de códigos de barras moleculares de dianas de ácido nucleico en células individuales
CN107208158B (zh) 2015-02-27 2022-01-28 贝克顿迪金森公司 空间上可寻址的分子条形编码
US20160257993A1 (en) 2015-02-27 2016-09-08 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for labeling targets
JP7508191B2 (ja) 2015-03-30 2024-07-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー コンビナトリアルバーコーディングのための方法および組成物
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
US9618871B2 (en) 2015-04-28 2017-04-11 Kyocera Document Solutions Inc. Image forming apparatus
EP3347465B1 (en) 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
US10822643B2 (en) 2016-05-02 2020-11-03 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
WO2017205691A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Cellular Research, Inc. Molecular label counting adjustment methods
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US20180037942A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 Cellular Research, Inc. Enzyme-independent molecular indexing

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008122051A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Acoustic Cytometry Systems, Inc. Methods and devices for enhanced analysis of field focused cells and particles
US20140178438A1 (en) * 2011-05-24 2014-06-26 Ugur Sahin Individualized vaccines for cancer
CN104032377A (zh) * 2014-06-30 2014-09-10 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISLAM SAIFUL等: "Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers", 《NATURE METHODS》 *
PICELLI SIMONE等: "Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects", 《GENOME RESEARCH》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112119151A (zh) * 2018-03-02 2020-12-22 量子细胞公司 从组织中分离和表达分析感兴趣的区域的方法、组成和装置
CN108676890A (zh) * 2018-07-12 2018-10-19 吉林大学 一种女性乳腺恶性肿瘤易感性预测试剂盒及系统
CN112867801A (zh) * 2018-11-30 2021-05-28 Illumina公司 使用单一测定分析多种分析物
US12104281B2 (en) 2018-11-30 2024-10-01 Illumina, Inc. Analysis of multiple analytes using a single assay
CN111088369A (zh) * 2020-01-17 2020-05-01 天津奥群牧业有限公司 一种绵羊rora基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用
CN111088369B (zh) * 2020-01-17 2022-11-15 天津奥群牧业有限公司 一种绵羊rora基因插入/缺失多态性的检测方法、引物对和应用
WO2022188054A1 (en) * 2021-03-10 2022-09-15 Nanjing University Methods and reagents for sample multiplexing for high throughput single-cell rna sequencing
CN116453602A (zh) * 2023-02-17 2023-07-18 祥符实验室 一种基于ddPCR与荧光液滴分选富集的DNA数据库随机读取方法
CN116453602B (zh) * 2023-02-17 2024-04-19 祥符实验室 一种基于ddPCR与荧光液滴分选富集的DNA数据库随机读取方法

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