CN108779488A - 采用双探针邻近性连接系统的多重单分子rna可视化 - Google Patents

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Abstract

SNAIL提供了单细胞中的特定核酸的有成本效益的检测，并且可与流式细胞术组合以针对多个核酸同时分析大量细胞，例如，能够以高达约50、100、250、500或更多个细胞/秒的速率同时分析至少一种至高达5种、高达10种、高达15种、高达20种或更多种转录物。所述方法仅需要两种引物用于扩增，且可进一步包括检测引物。

Description

采用双探针邻近性连接系统的多重单分子RNA可视化
发明背景
对基因表达调控机制的研究是理解其失调是如何引起疾病状况所必需的。信使RNA(mRNA)的空间分布在细胞和组织水平下都受到严格调控。对mRNA的丰度和空间分布的分析常常受到可通过常规的显微镜同时检测的荧光团数量或费力、费时且昂贵的方法的限制。在单细胞中的特异性mRNA分子的检测通常涉及cDNA的产生(例如FISSEQ技术)，或在cDNA上的挂锁探针连接，继之以滚环扩增，由此敏感性受到低效率的逆转录酶的限制。
或者，单分子RNA检测可利用多个短的荧光标记核苷酸探针直接与靶mRNA(例如单分子RNA-FISH)的杂交。这些方法具有必须合成多个探针的缺点；且这种探针一般需要靶向开放阅读框。
最近，我们公开了基于邻近性的RNA检测技术PLAYR，其能够实现在CyTOF上的单细胞RNA检测。然而，问题在于PLAYR涉及复杂的四探针系统，该系统需要两步杂交且特征为中间杂交特异性序列，其使探针设计过程变复杂。另外，各基因需要不同的中间杂交序列，且每个新的序列必须被独立地测试以确保连接的效率和不存在串话(cross-talk)，这使得高度多重实验的设计成为一项艰巨任务。
使用微阵列技术或高通量测序的基因表达的高通量测量对于我们关于以下的理解做出了极大的贡献：基因网络是如何在正常细胞和组织中协调地发挥作用及它们是如何在疾病中功能失常的。这种测量使得能够推断基因基于它们的表达模式的功能，以便检测哪些基因在疾病中有改变的表达并且鉴别作为疾病进展前兆的表达特征。然而，大多数转录物组测量仅探知样品中的平均基因表达。因此，在含有具有不同基因表达特征的若干细胞类型的复杂样品中，仅将捕获最丰富，而不一定是最有意义的特征。因此，在大多数生物系统且特别是组织和肿瘤中的单细胞基因表达的可变性导致需要旨在表征所关注的单个细胞中的基因表达程序的技术。
对于单细胞测量的重要性的认识的提高反映在数量巨大的单细胞分析平台中，该分析平台近年来已被成功地商业化，包括质谱流式细胞术(mass cytometry)和基于微流控的方法。尽管流式细胞术提供了一个关于使用抗体检测单细胞中的蛋白质的极佳平台，但对于核酸的检测没有相当的解决方案。用于检测和定量单细胞中的mRNA的微流控技术极其昂贵，且它们的通量与使用流式细胞术对蛋白质可实现的相比低几个数量级。
为了克服大多数分析的限制，已经开发了测量单细胞中的基因表达的许多项技术。在一种这样的方法中，高达20个短寡核苷酸探针对在相邻位置中与靶RNA杂交。随后使用分支DNA技术扩增这些结合事件，其中在后续杂交步骤中的寡核苷酸组的添加产生了分支DNA分子。然后使用荧光探针，通过流式细胞术检测这种分支DNA结构的存在并定量。此技术使得能够检测数百万单细胞中的仅少量RNA拷贝数，但目前限于同时检测小数量的所测量的转录物。此外，该方案是长期和艰巨的，并且所用的缓冲液与流式细胞术中常用的一些荧光团不相容且根本不能在质谱流式细胞术中使用。
另一种方法(Larsson等人(2010)Nature Methods)使用挂锁探针，即线性探针，其可在与靶RNA分子杂交之后通过靶标依赖性连接转化为环状DNA分子。然后可在称为滚环扩增(RCA)的过程中使用酶phi29聚合酶扩增所生成的环化单链DNA探针。此过程产生含有原始DNA环的数百个互补串联重复的单链DNA分子。此RCA产物可通过添加荧光标记的检测探针而变得可见，所述检测探针将与产物中的检测序列杂交。此技术能够实现转录物的多重检测，但需要在挂锁探针的杂交之前使用特异性引物的靶mRNA的逆转录和原始转录物的RNA酶H消化。因此，它将额外的变异性引入测定中，且需要探针和引物的设计与优化。
单细胞mRNA测量的另一种可商购获得的解决方案是基于使用微流控装置对单细胞进行物理分离，继之以文库制备和测序。这是目前唯一的全基因组解决方案，但非常有限的通量(每轮96个细胞)使其不适用于具有多个细胞群的样品(如血液样品或肿瘤)的分析。另外，该技术与其它方法相比较昂贵，且不容许同时检测同一细胞中的蛋白质和mRNA。
需要可提供关于单细胞中的多种转录物的信息的方法，具体来说，其可有效地与蛋白质分析组合。这种方法可有助于分析生物网络是如何在正常和患病的细胞和组织中协调地运行。本发明解决了这个需要。
出版物
Larsson等人In situ detection and genotyping of individual mRNAmolecules.Nat.Methods 7,395–397(2010)。Player等人Single-copy gene detectionusing branched DNA(bDNA)in situ hybridization.J.Histochem.Cytochem.49,603–612(2001)。Porichis,F.等人High-throughput detection of miRNAs and gene-specificmRNA at the single-cell level by flow cytometry.Nature Communications 5,5641(2014)。Bendall,S.C.等人Single-cell mass cytometry of differential immune anddrug responses across a human hematopoietic continuum.Science 332,687–696(2011)。Wolf-Yadlin,A.等人Effects of HER2overexpression on cell signalingnetworks governing proliferation and migration.Mol Syst Biol 2,54(2006)。Angelo,M.等人Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.Nat Med 20,436–442(2014)。Fredriksson,S.等人Protein detection using proximity-dependentDNA ligation assays.Nat Biotechnol 20,473–477(2002)。O.等人Directobservation of individual endogenous protein complexes in situ by proximityligation.Nat.Methods 3,995–1000(2006)。
国际专利申请WO2012/160083；WO2001/061037；WO2013/173774。
发明内容
提供了用于在单细胞水平下分析mRNA种类的组合物和方法。本发明的方法可称为SNAIL-RCA，其代表Splint Nucleotide Assisted Intramolecular Ligation followedby Rolling Circle Amplification(夹板核苷酸辅助的分子内连接和滚环扩增)。在本发明的方法中，所关注的细胞中存在的mRNA用作供组装包含两种寡核苷酸的复合物的骨架，这两种寡核苷酸在本文中称为夹板引物寡核苷酸(SPO)和挂锁寡核苷酸(PO)。在一些实施方案中，扩增反应混合物包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：用于各靶序列的两个探针，且所述方法可在用于给定靶序列的额外探针不存在下进行。
SPO和PO各自包含与靶mRNA上的相邻序列互补的第一互补区(分别为CR1和CR1’)。
SPO和PO各自进一步包含位于邻近CR1或CR1’的第二互补区(CR2和CR2’)。存在于PO上的CR2’是割裂区(split region)，其中PO的5’和3’端以平头至末端的方式与CR2杂交，以便在杂交之后，PO的5'和3'端直接定位成彼此相邻。示意图示于图1中。PO可进一步包含间隔区，所述间隔区在环状分子中位于CR1’与CR2’之间。在线性PO中，5’末端被磷酸化，以使得两端与CR2一旦退火，便可使用任何合适的DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)通过连接使寡核苷酸环化。
在一个替代的实施方案中，PO是闭合环状分子，且省去连接步骤。
一旦环化，便可使用任何链置换聚合酶(例如，噬菌体φ29聚合酶)，借助于滚环扩增来扩增PO序列。扩增需要环状分子，这又要求SPO和PO与同一mRNA分子的直接相邻区杂交并且要求连接酶成功地连接PO的5’和3’端。高水平的特异性是由以下必要条件所致：为了扩增反应的进行，两个探针与相邻位置杂交，产生极佳的特异性、低背景值和高信噪比。
RCA产物可通过各种方法检测，包括但不限于与序列特异性检测寡核苷酸(DO)的杂交，也称为检测探针。在一些实施方案中，DO被缀合至可检测的标记，例如荧光团、镧系元素、生物素、放射性核素等，其中标记可通过光学显微术、SIMS离子束成像等检测。在一些实施方案中，DO未被标记，其中DO的存在可在由DO引发的聚合反应中检测到，且其中聚合反应可包含一个或多个dNTP，所述dNTP包含可检测的标记。这种聚合产物可进一步包括以下步骤：添加用于不同产物的顺序检测的标记，检测所述标记，及移除所述标记。检测引物可对RCA扩增产物的对靶基因有特异性的区域有特异性，例如CR1’序列，或可为通用检测探针，其结合至PO上的非靶特异性区域，例如间隔区。
本发明的方法提供的优势在于：需要少量探针，这降低了分析成本；且容许高度多重性。本发明的方法能够实现单细胞中的特定核酸的有成本效益的检测，并且可与流式细胞术或质谱流式细胞术组合以针对多个核酸同时分析大量细胞，例如，至少一种至高达5种、高达10种、高达15种、高达20种、高达30种、高达40种或更多种转录物可以高达约50、100、250、500、高达750、高达1000或更多个细胞/秒的速率被同时分析。SNAIL的优点包括同时分析单细胞中的多种核酸和蛋白质的能力，因为该方法与针对蛋白质、胞内磷酸化位点及其它细胞抗原的常规抗体染色相容。这使得能同时检测多种核酸分子以及额外的细胞参数。其可与各种不同的平台组合，包括但不限于FACS、质谱流式细胞术、显微术、扫描质谱法(包括但不限于纳米SIMS)等等。
在一些实施方案中，提供了一种测定单细胞中的靶核酸的丰度的方法，所述方法包括使固定和透化过的细胞与至少一对寡核苷酸引物在容许特异性杂交的条件下接触，其中各寡核苷酸对包含如上所述的SPO探针和PO探针；洗涤不含未结合的引物的细胞；进行连接反应，其中连接适合地与夹板(SPO)杂交的PO探针以生成一个环；通过滚环扩增来扩增连接的主链/插入环；洗涤不含聚合酶的细胞；使检测引物与扩增过的环杂交；洗涤不含未结合的检测探针的细胞；以及将结合的检测引物的水平定量以测定靶核酸的丰度。在许多实施方案中，同时分析多个靶核酸。
在本发明的一些实施方案中，SNAIL与细胞计量术设门组合用于特定细胞群上，所述细胞群由其它细胞参数所定义，这些细胞参数是与抗体染色和质谱流式细胞术或FACS同时(例如组合)测量以定义所关注的亚群。在这种实施方案中，可分析复杂的细胞群，例如，活检或血液样品，其潜在地包括免疫细胞、祖细胞或干细胞、癌细胞等。例如，提供了一种用于测定复杂的细胞群内已定义的细胞类型中的一个或多个靶核酸的丰度的方法，其中检测探针的定量与细胞标志物的检测组合，所述细胞标志物包括但不限于蛋白质标志物，其是用来定义所关注的细胞类型。
在其它实施方案中，本发明方法用于多重检测和定量单细胞中的mRNA转录物的特定剪接变体。
在又一实施方案中，本发明方法与邻近性连接测定(PLA)组合用于同时检测和定量核酸分子及蛋白质-蛋白质相互作用。
在内源性细胞DNA(通过热、酶促法或任何其它合适的工序)的事前变性下，为了检测特定的DNA序列(单细胞的基因分型)而修改技术。在此修改下，所述技术能够实现基因拷贝数变化的定量和基因组易位/融合事件的检测。例如，在融合事件的检测中，如果第一基因融合至第二基因，那么可用以下各物对SNAIL方法进行修改：SPO序列，其中引物可靶向基因1；和靶向基因2的PO探针。只有当存在融合转录物时获得信号，因为单个探针不产生扩增产物。多个单个引物可为基因1和基因2的每个而设计，例如2、3、4、5、6或更多个。
在一些实施方案中，部分地基于单个结合探针或成对探针的Tm选择SNAIL寡核苷酸探针，以便使探针将能在溶液中实现“连接”的机会最小。依靠归因于邻近性的“局部浓度”增加，较少数量的在连接点周围成对的探针是可能的。
在一些实施方案中，在检测之后移除检测探针，或者差别地用于可视化在不同的时期的不同滚环产物。
在一些实施方案中，不在相邻区检测探针的结合事件，例如，在RNA分子末端上的区域，因为由于空间3D变化，这些区域连接在一起。
在一些实施方案中，多个SNAIL寡核苷酸探针对被同时平铺在靶序列上。在一些这种实施方案中，对平铺的寡核苷酸进行编码以确定哪个正被读出。
附图简述
图1.a-b：SNAIL-RCA方案的步骤：杂交、连接、滚环扩增、扩增产物检测。
图2.HLADR在NALM-6和Jurkat细胞中的表达的SNAIL-RCA检测。
图3.在OVCAR-4细胞中24个基因的表达的分析，通过检测探针的反复重退火来可视化。
图4.A.在602OVCAR-4细胞上定量的基因的共表达。B：OVCAR细胞的单细胞力导向的布局，其中边缘表示在24个基因的组上计算的相关单细胞表达谱。色码表示通过单个基因的聚簇和表达鉴别的细胞的表型群。
具体实施方式
在进一步描述本发明前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这些实施方案当然可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制，因为本发明的范围将只受所附权利要求书的限制。
当提供一个数值范围时，应该理解的是介于该范围的上下限间的每一个中间值(除非文中另外清楚地指出，否则所述中间值是下限单位的十分之一)和任何其他所说明的或者在所说明的范围中的中间值都被包括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地被包括在该较小的范围中，且在所说明范围内任何明确地排除极限值的条件下也被包括在本发明内。当所述范围包括所述限值中的一个或两个时，排除了那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。
本文所列举的方法可以按列举事件的逻辑上可行的任何次序以及按列举的事件次序实施。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明所述领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述的那些的任何方法和材料还可用于实践或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。
本文所提及的全部出版物以引用的方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。
除非文中另外清楚指出，必须指出如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。还应该注意，权利要求书可能撰写成排除了任何可选要素。因此，此声明旨在用作与权利要求要素的陈述相关联使用此类排除性术语如“单独”、“仅仅”等，或使用“负”限制的前提基础。
本文所讨论的出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权根据在先发明使这种出版日期提前。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地确认。
定义
靶核酸。如本文所用，靶核酸为存在于单细胞中的任何多核苷酸核酸分子(例如，DNA分子；RNA分子、修饰的核酸等)。在一些实施方案中，靶核酸为编码RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，靶核酸为非编码RNA(例如，tRNA、rRNA、微RNA(miRNA)、成熟miRNA、未成熟的miRNA；等等)。在一些实施方案中，靶核酸为细胞环境中的RNA分子的剪接变体(例如，mRNA、前mRNA等)。合适的靶核酸因此可为未剪接的RNA(例如，前mRNA、mRNA)、部分剪接的RNA或完全剪接的RNA等。
所关注的靶核酸可在细胞群内可变地表达，即具有不同丰度，其中本发明方法容许分析和比较单个细胞中的核酸(包括但不限于RNA转录物)的表达水平。
靶核酸也可为DNA分子，例如变性基因组、病毒、质粒等。例如，所述方法可用于检测拷贝数变异，例如在癌细胞群中，其中靶核酸在所述群中的细胞基因组中以不同丰度存在；在受病毒感染的细胞中，以便测定病毒载量和动力学等等。
靶特异性寡核苷酸引物对。在本发明的方法中，使一对或多对靶特异性寡核苷酸引物与包含靶核酸的细胞接触。每个寡核苷酸对包含两种寡核苷酸，在本文中称为夹板引物寡核苷酸(SPO)和挂锁寡核苷酸(PO)。SPO和PO各自包含与靶mRNA上的相邻序列互补的第一互补区(分别为CR1和CR1’)。SPO和PO各自进一步包含位于与CR1或CR1’相邻的第二互补区(CR2和CR2’)。存在于PO上的CR2’是割裂区，其中PO的5’和3’端以平头至末端的方式与CR2杂交，以便在杂交之后，PO的5'和3'端直接定位成彼此相邻。示意图示于图1中。PO可进一步包含间隔区，所述间隔区在环状分子中位于CR1’与CR2’之间。间隔序列可被选出以提供条形码信息等。在线性PO中，5’末端被磷酸化，以使得两端与CR2一旦退火，便可使用任何合适的DNA连接酶(例如T4DNA连接酶)通过连接使寡核苷酸环化。
可在反应中使用多个寡核苷酸对，其中一对或多对特异性地结合至各靶核酸。例如，可将两个引物对用于一个靶核酸，以便提高敏感性并降低变异性。所关注的还有检测细胞中的多个不同的靶核酸，例如，检测高达2、高达3、高达4、高达5、高达6、高达7、高达8、高达9、高达10、高达12、高达15、高达18、高达20、高达25、高达30、高达40或更多个截然不同的靶核酸。引物通常在使用之前变性，通常通过加热至至少约50℃、至少约60℃、至少约70℃、至少约80℃和至多约99℃、至多约95℃、至多约90℃的温度。
靶结合位点结合至靶核酸的区域。在一对中，各靶位点是不同的，且所述对是靶核酸上的互补相邻位点，例如，通常与另一位点相隔不超过10个核苷酸，不超过9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸，且可为连续地位点。靶位点通常以相同的取向存在于靶核酸的同一条链上。还选择靶位点以提供相对于细胞中存在的其它核酸来说独特的结合位点。各靶位点在长度上一般为约18至约25个核苷酸，例如，约18至23、约18-21等。选择寡核苷酸探针对以使得成对的各探针具有用于结合至其同源靶位点的相似解链温度，例如，Tm可为约50℃、约52℃、约55℃和至多约70℃、至多约72℃、至多约70℃、至多约65℃、至多约62℃，且可为约58℃至约62℃。靶位点的GC含量一般被选为不超过约20％、不超过约30％、不超过约40％、不超过约50％、不超过约60％、不超过约70％、
连接酶。如本文所用的术语“连接酶”是指常用于将多核苷酸连接在一起或连接单个多核苷酸的末端的酶。连接酶包括ATP依赖性双链多核苷酸连接酶、NAD+依赖性双链DNA或RNA连接酶和单链多核苷酸连接酶，例如在EC 6.5.1.1(ATP依赖性连接酶)、EC 6.5.1.2(NAD+依赖性连接酶)、EC 6.5.1.3(RNA连接酶)中所述的任一种连接酶。连接酶的具体实例包括细菌连接酶，如大肠杆菌DNA连接酶和Taq DNA连接酶、热稳定的DNA连接酶(Technologies Corp.、的一部分,Madison,Wis.)及噬菌体连接酶，如T3DNA连接酶、T4DNA连接酶和T7DNA连接酶及其突变体。
滚环扩增。单链环状多核苷酸模板通过PO的连接而形成，该环状多核苷酸包含与SPO探针互补的区域。在适当的dNTP前体及其它辅因子存在下添加DNA聚合酶后，通过复制模板的多个拷贝来延长SPO探针。此扩增产物可容易通过结合至检测探针来检测。
用于滚环扩增的技术是本领域中已知的(参见，例如Baner等人,Nucleic AcidsResearch,26:5073-5078,1998；Lizardi等人,Nature Genetics 19:226,1998；Schweitzer等人Proc.Natl Acad.Sci.USA 97:10113-119,2000；Faruqi等人,BMC Genomics 2:4,2000；Nallur等人,Nucl.Acids Res.29:el 18,2001；Dean等人Genome Res.11:1095-1099,2001；Schweitzer等人,Nature Biotech.20:359-365,2002；美国专利号6,054,274、6,291,187、6,323,009、6,344,329和6,368,801)。在一些实施方案中，聚合酶为phi29DNA聚合酶。
检测探针(DO)。扩增的SNAIL挂锁序列在细胞中的存在和定量可通过使细胞与寡核苷酸探针在其中探针结合至扩增产物的条件下接触来确定。探针包含可检测的标记，其可被测量和定量。作为替代方案，可使用WO 2015/200139中阐述的方法，该专利明确地以引用的方式并入本文。
标记的核酸探针为用任何标记部分标记的核酸。在一些实施方案中，核酸检测剂为单一标记分子(即，标记的核酸探针)，其特异性地结合至扩增产物。在一些实施方案中，核酸检测剂包括多个分子，其中一个特异性地结合至扩增产物。在此类实施方案中，当存在标记的核酸探针时，标记的核酸探针不特异性地结合至靶核酸，而是相反，特异性地结合至核酸检测剂的其它分子中的一个上。杂交探针可以是提供特异性结合的任何便利的长度，例如，其长度可为约16至约50个核苷酸，且长度更通常为约18个核苷酸至约30个核苷酸。
用于核酸探针的“标记”或“标记部分”为提供信号检测并且可根据测定的具体性质广泛变化的任何部分。所关注的标记部分包括可直接和间接检测的标记。用于本文所述的方法中的合适的标记包括可通过光谱学、光化学、生化、免疫化学、电学、光学、化学或其它手段间接或直接检测的任何部分。例如，合适的标记包括抗原标记(例如，洋地黄毒苷(DIG)、荧光素、二硝基酚(DNP)等)、供标记的链霉抗生物素缀合物的染色用的生物素、荧光染料(例如，荧光素、Texas红、罗丹明、荧光团标记，如ALEXA标记等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶及其它在ELISA中常用的酶)、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)、螯合金属的合成聚合物、比色标记等等。抗原标记可掺入到核酸中的任何核苷酸(例如，A、U、G、C)上。
荧光标记可使用光检测器(例如，在流式细胞仪中)以检测发射光来检测。酶促标记通常通过向酶提供底物并检测在底物上的酶的作用下产生的反应产物来检测，比色标记可仅通过可视化着色的标记来检测，且抗原标记可通过提供特异性地结合至抗原标记的抗体(或其结合片段)来检测。可直接或间接地检测特异性地结合至抗原标记的抗体。例如，抗体可缀合至提供信号(例如荧光)的标记部分(例如荧光团)；抗体可缀合至酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶等)，所述酶在提供有适当的底物(例如，荧光-酪胺、FastRed等)时产生可检测的产物(例如，荧光产物)；等等。
金属标记(例如Sm152、Tb159、Er170、Nd146、Nd142等)可使用包括以下的任何便利的方法来检测(例如，可测量标记的量)：例如，纳米SIMS、质谱流式细胞术(参见，例如：美国专利号7,479,630；Wang等人(2012)Cytometry A.2012Jul；81(7):567-75；Bandura等人,AnalChem.2009Aug 15；81(16):6813-22；及Ornatsky等人,J Immunol Methods.2010Sep 30；361(1-2):1-20。如上所述，质谱流式细胞术是实时定量分析技术，借此细胞或粒子被单独地引入质谱仪(例如，感应耦合等离子体质谱仪(ICP-MS))中，并且通过质谱法(例如，飞行时间质谱法)分析由单细胞产生的离子云(或多个所生成的离子云)。质谱流式细胞术可使用元素(例如金属)或稳定同位素，作为标记部分连接至检测试剂(例如，抗体和/或核酸检测剂)。
在其它实施方案中，检测可包括序列读取；探针结合和电化学检测；pH的变化；由结合至DNA标签的酶诱导的催化的检测、通过量子纠缠(quantum entanglement)的检测、通过拉曼光谱学的检测、通过太赫波(teraherz wave)技术的检测、通过SEM(扫描电子显微术)的检测。
核酸、类似物和模拟物。在定义本发明方法中使用的组分寡核苷酸引物、探针等时，应理解的是，这样的探针、引物等涵盖天然和合成或修饰的多核苷酸，具体来说，本身不是实施方法期间用于酶促修饰的底物的探针、引物等，例如，靶特异性寡核苷酸引物和检测探针。
修饰的核酸具有一种或多种修饰，例如，碱基修饰、主链修饰等，以提供具有新的或增强的特征(例如，提高的稳定性)的核酸。核苷可为碱基-糖组合，其中的碱基部分为杂环碱基。杂环碱基包括嘌呤和嘧啶。核苷酸为进一步包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸基团可连接至糖的2'、3'或5'羟基部分上。在形成寡核苷酸时，磷酸基团将相邻核苷共价地彼此连接以形成线性聚合物。在一些情况下，此线性聚合物的各个末端可进一步相连以形成环状化合物。另外，线性化合物可具有内部核苷酸碱基互补性且因此可以产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在寡核苷酸内，磷酸基团可涉及形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的键或主链可为3'至5'磷酸二酯键。
含有修饰的合适的核酸的实例包括具有修饰的主链或非天然的核苷间键的核酸。具有修饰的主链的核酸包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。含有磷原子的合适的修饰的寡核苷酸主链包括：例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、膦酸甲酯及其它膦酸烷酯包括3'-烯基膦酸酯、5'-烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、具有正常3'-5'键的硒磷酸酯和硼磷酸酯、这些物质的2'-5'连接的类似物以及具有反向极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3'至3'、5'至5'或2'至2'键。具有反向极性的合适的寡核苷酸包括在多数的3'-核苷酸间键处的单个3'至3'键，即，单个倒转的核苷残基，它可为无碱基的(核酸碱基丢失或在其位置上具有羟基)。还包括各种盐(例如钾或钠)、混合盐和游离酸形式。
在一些实施方案中，主题核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键，特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(也称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯核苷酸间键表示为-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-)。MMI型核苷间键公开于以上引用的美国专利号5,489,677中。合适的酰胺核苷间键公开于美国专利号5,602,240中。
同样合适的是具有吗啉代主链结构的核酸，如例如美国专利号5,034,506中所述。例如，在一些实施方案中，主题核酸包括代替核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，二氨基磷酸酯或其它非磷酸二酯核苷间键替代磷酸二酯键。
其中不包括磷原子的合适的修饰的多核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有以下的那些：吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；核乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚胺基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它各物。
还包括核酸模拟物。术语“模拟物”当应用于多核苷酸时包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键都被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也被称为糖替代。保留杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分以用于与适当的靶核酸的杂交。一种这样的核酸被称为肽核酸(PNA)，即，已显示具有极佳的杂交性质的多核苷酸模拟物。在PNA中，多核苷酸的糖主链被含有酰胺的主链(具体说来氨基乙基甘氨酸主链)替代。保留核苷酸并且直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。
具有极佳杂交性质的一种多核苷酸模拟物为肽核酸(PNA)。PNA化合物中的主链为两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，其产生PNA，即含有酰胺的主链。杂环碱基部分直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。描述PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。
另一类合适的多核苷酸模拟物是基于连接的吗啉代单元(吗啉代核酸)，其具有连接到吗啉代环上的杂环碱基。已报道了可连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元的许多连接基团。已选择了一类连接基团以得到非离子型寡聚化合物。基于吗啉代的非离子型寡聚化合物不太可能具有不希望有的与细胞蛋白质的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸为寡核苷酸的非离子型模拟物，其不太可能形成不希望有的与细胞蛋白质的相互作用(Dwaine
A.Braasch和David R.Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510)。基于吗啉代的多核苷酸公开于美国专利号5,034,506中。已经制备了属于多核苷酸的吗啉代类的多种化合物，其具有连接单体亚单位的多个不同的连接基团。
另一种合适类别的多核苷酸模拟物被称为环己烯基核酸(CeNA)。将通常存在于DNA/RNA分子中的呋喃糖环用环己烯基环替代。已经制备了CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并且用于根据典型的亚磷酰胺化学性质的寡聚化合物合成。完全修饰的CeNA寡聚化合物和具有用CeNA修饰的特定位置的寡核苷酸已被制备和进行了研究(参见Wang等人,J.Am.Chem.Soc.,2000,122,8595-8602)。CeNA单体并入DNA链中提高了DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸与RNA和DNA互补链形成复合物，其具有与天然复合物相似稳定性。CeNA结构向天然核酸结构中的并入通过NMR和圆二色性显示以便继续进行构象调整。
锁核酸(LNA)和/或LNA类似物也适合作为修饰的核酸。在LNA中，2'-羟基连接至糖环的4'碳原子，由此形成2'-C,4'-C-氧亚甲基键，且由此形成二环糖部分。该键可为将2'氧原子与4'碳原子桥连的亚甲基(-CH2-)，其中n为1或2(Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456)。LNA和LNA类似物展现与互补DNA和RNA的极高双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对于3'-核酸外切酶降解的稳定性及良好的溶解性。已经描述了含有LNA的有效和无毒的寡核苷酸(Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638)。
已经描述了LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备、以及它们的低聚反应和核酸识别性质(Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。LNA及其制备还描述于WO98/39352和WO99/14226中，这两者都以引用的方式整体并入本文。示例性LNA类似物描述于美国专利7,399,845和7,569,686中，这两者都以引用的方式整体并入本文。
核酸还可包括一个或多个取代的糖部分。合适的多核苷酸包括选自以下的糖取代基团：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为被取代或未被取代的C.sub.1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。同样适合的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n和m为1至约10。其它合适的多核苷酸包括选自以下的糖取代基：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂及具有相似性质的其它取代基。合适的修饰可包括2'-甲氧乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504)，即烷氧基烷氧基。合适的修饰可包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，如在下文的实施例中所述；和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其它合适的糖取代基包括甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(--O CH2CH2CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基(--O--CH2—CH＝CH2)和氟(F)。2'-糖取代基可在阿拉伯糖(向上)位置或核糖(向下)位置上。合适的2'-阿拉伯糖修饰为2'-F。相似的修饰也可在寡聚化合物的其它位置上进行，特别是在3'末端核苷上的糖的3'位上，或者在2'-5'连接的寡核苷酸内和5'末端核苷酸的5'位上。寡聚化合物还可具有糖模拟物如环丁基部分以代替呋喃戊糖基糖。
核酸还可包括核酸碱基(也称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基：腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；及嘧啶碱基：胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核酸碱基包括其它合成和天然的核酸碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤基尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基(特别是5-溴基)、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核酸碱基还包括三环嘧啶，如吩恶嗪胞啶(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并恶嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹如取代的吩恶嗪胞啶(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并恶嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞啶(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)及吡啶并吲哚胞啶(H-吡啶并(3',2':4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。
杂环碱基部分还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环替代的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它核酸碱基包括美国专利号3,687,808中公开的那些、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.编著John Wiley&Sons,1990中公开的那些、由Englisch等人,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613公开的那些以及由Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.及Lebleu,B.编著,CRC Press,1993公开的那些。这些核酸碱基中的某些适用于提高寡聚化合物的结合亲和力。它们包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代将核酸双链体稳定性提高了0.6-1.2℃。(Sanghvi等人编著,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)并且为合适的碱基取代，例如当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
可检测标记的定量。可利用各种方法来定量可检测标记的存在，在检测探针上的存在抑或在与细胞标志物分析的组合方法中的存在，所述细胞标志物是用于定义被分析的细胞。对于检测探针的量或所存在的其它特异性结合配偶体的测量，便利的方法是用可检测的部分进行标记，所述可检测的部分可为金属、荧光、发光的、放射性的、酶促活性的等。
荧光部分容易用于标记几乎任何的生物分子、结构或细胞类型。免疫荧光部分可涉及不仅结合至特定的蛋白质，而且还结合至特定的构象、切割产物、或位点修饰，像磷酸化。单个肽和蛋白质可被工程化为自发荧光，例如，通过将它们表达为细胞内部的绿色荧光蛋白嵌合体(关于综述请参见Jones等人(1999)Trends Biotechnol.17(12):477-81)。
质谱流式细胞术为流式细胞术的变型，其中探针是用重金属离子标记而非荧光染料来标记。读出是通过飞行时间质谱法完成。这允许单个样品中许多的特征的组合，而无通道之间的显著溢出。例如，参见Bendall等人(2011)Science 332(6030):687-696，其明确地以引用方式并入本文。扫描质谱法(包括但不限于纳米SIMS)是一种检测金属标记的替代方法。
可对同一样品使用多个荧光或金属标记且分别定量地检测，从而允许同时多重分析。已开发了许多定量技术以利用荧光的独特性质，包括：直接荧光测量、荧光共振能量传递(FRET)、荧光偏振或各向异性(FP)、时间分辨荧光(TRF)、荧光寿命测量(FLM)、荧光相关光谱(FCS)和荧光漂白恢复法(FPR)(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals,第7版,Molecular Probes,Eugene Oreg.)。
流式细胞术或质谱流式细胞术可用于定量参数，如细胞表面蛋白或构象或其翻译后修饰的存在；胞内蛋白或分泌蛋白，其中透化容许抗体(或探针)进入；等等。单细胞多参数和多细胞多参数多重测定都在本领域中使用，其中鉴别输入细胞类型并且通过定量成像及荧光和共焦显微术读取参数，参见Confocal Microscopy Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology第122卷)Paddock编著,Humana Press,1998。
细胞。用于本发明测定中的细胞可为生物体、来源于生物体的单细胞类型，或可为细胞类型的混合物。包括天然存在的细胞和细胞群、遗传工程化的细胞系、来源于转基因动物的细胞等。实际上任何细胞类型和大小可适用。合适的细胞包括细菌、真菌、植物和动物细胞。在本发明的一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如，复杂的细胞群，如天然存在的组织，例如血液、肝脏、胰脏、神经组织、骨髓、皮肤等等。一些组织可被破碎成单分散悬液。或者，细胞可为培养的群，例如，来源于复杂群的培养物、来源于单细胞类型的培养物，在所述单细胞类型中细胞已分化成多个谱系，或者细胞针对刺激差异性地反应等等。
可应用于本发明中的细胞类型包括干细胞和祖细胞，例如，胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经嵴细胞等；内皮细胞、肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和骨骼肌细胞、间充质细胞、上皮细胞；造血细胞，如淋巴细胞，包括T细胞，如Th1T细胞、Th2T细胞、Th0T细胞、细胞毒性T细胞；B细胞、前B细胞等；单核细胞；树突细胞；嗜中性白细胞；以及巨噬细胞；天然杀伤细胞；肥大细胞等；脂肪细胞、涉及具体器官如胸腺、内分泌腺、胰腺、脑如神经元、神经胶质、星形胶质细胞、树突细胞等的细胞；及其遗传修饰的细胞。造血细胞可与炎性过程、自身免疫疾病等有关；内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等可与心血管疾病有关；几乎任何类型的细胞都可与瘤形成有关，如肉瘤、癌瘤和淋巴瘤；与肝细胞有关的肝脏疾病；与肾细胞有关的肾脏疾病；等等。
细胞也可为转化细胞或不同类型的赘生性细胞，例如，不同细胞起源的癌瘤、不同细胞类型的淋巴瘤等。美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)已收集并使得可获取来自超过150个不同物种的超过4,000个细胞系，包括700个人癌细胞系的超过950个癌细胞系。国家癌症研究所(The National Cancer Institute)汇集来自一大组人肿瘤细胞系的临床、生化和分子数据，它们可获自ATCC或NCI(Phelps等人(1996)Journal of Cellular Biochemistry增刊24:32-91)。包括自发衍生的或针对来自单个细胞系的所要生长或反应特征而选出的不同细胞系；并且可包括来源于相似肿瘤类型但不同患者或部位的多个细胞系。
细胞可为非粘附细胞，例如，包括单核细胞、T细胞、B细胞的血细胞；肿瘤细胞等，或为粘附细胞，例如，上皮细胞、内皮细胞、神经细胞等。为了对粘附细胞进行分析，可将它们从其所粘附到的底物上分离，并与其它细胞分离，分离方式使得它们能保留识别和结合至探针分子的能力。
这种细胞可使用例如抽吸、灌洗、洗涤、手术解剖等从个体处获取，通过本领域中已知的多种技术由各种组织，例如血液、骨髓、实体组织(例如实体肿瘤)、腹水中获得。细胞可从固定或未固定的、新鲜或冷冻的、完整或解聚的样品中获得。组织的解聚可使用已知技术以机械或酶促方式发生。
存在用于预分离样品的组成部分的各种方法和装置。这些方法包括过滤、离心、色谱及其它众所周知的流体分离方法；使用柱、离心、过滤的粗分离；通过杀伤不需要细胞的分离；用荧光激发的细胞分选器的分离；通过细胞直接或间接地结合至固定在物理支持物上的配体的分离，如淘选技术；通过柱免疫吸附的分离；以及使用磁性免疫珠的分离。
固定和透化。本发明的方面包括“固定”细胞样品。如本文所用的术语“固定(fixing)”或“固定(fixation)”为保存生物材料(例如组织、细胞、细胞器、分子等)免于腐烂和/或降解的过程。固定可使用任何便利的方案完成。固定可包括使细胞样品与固定试剂(即，含有至少一种固定剂的试剂)接触。细胞样品可由固定试剂接触许多次，这可取决于温度、样品的性质和固定剂。举例来说，细胞样品可由固定试剂接触24小时或更短、18小时或更短、12小时或更短、8小时或更短、6小时或更短、4小时或更短、2小时或更短、60分钟或更短、45分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、5分钟或更短、或2分钟或更短。
细胞样品可由固定试剂接触以下范围内的时间：5分钟至24小时(例如，10分钟至20小时、10分钟至18小时、10分钟至12小时、10分钟至8小时、10分钟至6小时、10分钟至4小时、10分钟至2小时、15分钟至20小时、15分钟至18小时、15分钟至12小时、15分钟至8小时、15分钟至6小时、15分钟至4小时、15分钟至2小时、15分钟至1.5小时、15分钟至1小时、10分钟至30分钟、15分钟至30分钟、30分钟至2小时、45分钟至1.5小时、或55分钟至70分钟)。
细胞样品可由固定试剂在各种温度下接触，这取决于所用的方案和试剂。例如，在一些情况下，细胞样品可由固定试剂在-22℃至55℃范围内的温度下接触，其中所关注的特定范围包括但不限于：50至54℃、40至44℃、35至39℃、28至32℃、20至26℃、0至6℃、及-18至-22℃。在一些情况下，细胞样品可由固定试剂在以下温度下接触：-20℃、4℃、室温(22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃。
可使用任何便利的固定试剂。常见的固定试剂包括交联固定剂、沉淀固定剂、氧化固定剂、汞制剂等。可使用交联固定剂及广泛多种交联试剂，交联固定剂通过共价键将两个或更多个分子在化学上相连。合适的交联固定剂的实例包括但不限于醛类(例如，甲醛，通常也称为“多聚甲醛”和“福尔马林”；戊二醛；等)、亚氨酸酯、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯等。合适的沉淀固定剂的实例包括但不限于醇类(例如甲醇、乙醇等)、丙酮、乙酸等。在一些实施方案中，固定剂为甲醛(即多聚甲醛或福尔马林)。甲醛在固定试剂中的合适的最终浓度为0.1至10％、1-8％、1-4％、1-2％、3-5％或3.5-4.5％，包括约1.6％，持续10分钟。在一些实施方案中，将细胞样品固定于最终浓度4％的甲醛(如由更浓的储备溶液所稀释，例如38％、37％、36％、20％、18％、16％、14％、10％、8％、6％等)中。在一些实施方案中，将细胞样品固定于最终浓度10％的甲醛中。在一些实施方案中，将细胞样品固定于最终浓度1％的甲醛中。在一些实施方案中，固定剂为戊二醛。戊二醛在固定试剂中的合适浓度为0.1至1％。
固定试剂可含有一种以上以任何组合形式的固定剂。例如，在一些实施方案中，使细胞样品与含有甲醛和戊二醛的固定试剂接触。
透化。本发明的方面包括“透化”细胞样品。如本文所用的术语“透化(permeabilization)”或“透化(permeabilize)”是指致使细胞样品的细胞(细胞膜等)对实验试剂如核酸探针、抗体、化学底物等可透过的过程。可使用用于透化的任何便利的方法和/或试剂。合适的透化试剂包括清洁剂(例如，皂角苷、Triton X-100、Tween-20等)、有机固定剂(例如丙酮、甲醇、乙醇等)、酶等。可使用在一定浓度范围内的清洁剂。例如，对于透化(例如，0.1％皂角苷、0.2％tween-20、0.1-0.3％triton X-100等)可使用0.001％-1％清洁剂、0.05％-0.5％清洁剂或0.1％-0.3％清洁剂。在一些实施方案中，使用在冰上的甲醇持续至少10分钟来进行透化。
在一些实施方案中，相同溶液可用作固定试剂和透化试剂。例如，在一些实施方案中，固定试剂含有0.1％-10％甲醛和0.001％-1％皂角苷。在一些实施方案中，固定试剂含有1％甲醛和0.3％皂角苷。
细胞样品可由透化试剂接触许多次，这可取决于温度、样品性质及一种或多种透化试剂。举例来说，细胞样品可由透化试剂接触24小时或更久(参见下文所述的储存)、24小时或更短、18小时或更短、12小时或更短、8小时或更短、6小时或更短、4小时或更短、2小时或更短、60分钟或更短、45分钟或更短、30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、5分钟或更短、或2分钟或更短。细胞样品可由透化试剂在各种温度下接触，这取决于所用的方案和试剂。例如，在一些情况下，细胞样品可由透化试剂在-82℃至55℃范围内的温度下接触，其中所关注的特定范围包括但不限于：50至54℃、40至44℃、35至39℃、28至32℃、20至26℃、0至6℃、-18至-22℃、及-78至-82℃。在一些情况下，细胞样品可由透化试剂在以下温度下接触：-80℃、-20℃、4℃、室温(22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃。
在一些实施方案中，使细胞样品与酶促透化试剂接触。酶促透化试剂通过部分地降解细胞外基质或表面蛋白来透过细胞样品，所述细胞外基质或表面蛋白阻止测定试剂对细胞样品的渗透。与酶促透化试剂的接触可在固定之后且在目标检测之前的任一时点进行。在一些情况下，酶促透化试剂为蛋白酶K，即一种可商购获得的酶。在此情况下，使细胞样品在与固定后试剂(如下所述)接触之前与蛋白酶K接触。蛋白酶K处理(即，由蛋白酶K的接触；通常也称为“蛋白酶K消化”)可在一定范围内的温度下，在一定范围内的酶浓度下进行一定范围内的次数，这些范围可凭经验针对研究中的各细胞类型或组织类型确定。例如，细胞样品可由蛋白酶K接触30分钟或更短、25分钟或更短、20分钟或更短、15分钟或更短、10分钟或更短、5分钟或更短、或2分钟或更短。细胞样品可由1ug/ml或更少、2ug/ml或更少、4ug/ml或更少、8ug/ml或更少、10ug/ml或更少、20ug/ml或更少、30ug/ml或更少、50ug/ml或更少、或100ug/ml或更少的蛋白酶K接触。细胞样品可由蛋白酶K在2℃至55℃范围内的温度下接触，其中所关注的特定范围包括但不限于：50至54℃、40至44℃、35至39℃、28至32℃、20至26℃、及0至6℃。在一些情况下，细胞样品可由蛋白酶K在以下温度下接触：4℃、室温(22-25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃。在一些实施方案中，细胞样品不与酶促透化试剂接触。在一些实施方案中，细胞样品不与蛋白酶K接触。
细胞样品与至少一种固定试剂和透化试剂的接触导致固定/透化的细胞样品的产生。
核酸酶抑制。本发明的方面包括使细胞样品与核酸酶抑制剂在杂交步骤期间接触，具体来说，在靶特异性寡核苷酸对与细胞中存在的RNA分子的结合期间。如本文所用，“核酸酶抑制剂”为可用于抑制细胞样品内的核酸酶活性以便保持细胞样品的细胞内的核酸完整性的任何分子。换句话说，细胞样品的细胞内的核酸通过核酸酶活性的降解通过使细胞样品与核酸酶抑制剂接触而被抑制。
在一些实施方案中，核酸酶抑制剂为RNA酶抑制剂(即，抑制RNA酶活性的抑制剂)。合适的可商购获得的核酸酶抑制剂的实例包括：蛋白质和非蛋白质基抑制剂，例如氧钒基核糖核苷复合物、寡聚(乙烯基磺酸)(OVS)、2.5％金精三羧酸(ATA)；焦碳酸二乙酯(DEPC)；来自Life Technologies的RNAsecureTM试剂；等等)和蛋白质基抑制剂(例如，来自EMDMillipore的核糖核酸酶抑制剂；来自Life Technologies的RNaseOUTTM重组核糖核酸酶抑制剂、SUPERaseInTM、ANTI-RNA酶和RNA酶抑制剂；来自Roche的RNA酶抑制剂和ProtectorRNA酶抑制剂；来自Promega的RNAsin等等)。可在由其商业来源推荐的的浓度范围下使用核酸酶抑制剂。
标志物检测试剂。本发明的方面可包括使样品中的细胞与检测试剂接触以便除靶核酸之外同时针对标志物对细胞进行分析。这种方法尤其适用于检测复杂群中的细胞的表型，例如，免疫细胞群、神经细胞群、复杂的活检细胞群等。如本文所用的术语“标志物检测试剂”是指特异性地结合至靶标志物(例如，细胞样品的细胞的靶蛋白质)并促进靶蛋白质的定性和/或定量检测的任何试剂。术语“特异性结合”、“特异性地结合”等指的是相对于溶液或反应混合物中的其它分子或部分与分子的优先结合。在一些实施方案中，检测试剂与其所特异性地结合至的靶蛋白质之间当它们在结合复合物中彼此特异性地结合时的亲和力被表征为Kd(解离常数)，为10-6M或更小，如10-7M或更小，包括10-8M或更小，例如10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-13M或更小、10-14M或更小，包括10-15M或更小。“亲和力”是指结合强度，提高的结合亲和力与较低的Kd有关。
在一些实施方案中，蛋白质检测试剂包括标记或标记的结合成员。“标记”或“标记部分”为提供信号检测并可根据测定的具体性质广泛变化的任何部分，并且包括如上所述适于与寡核苷酸检测探针一起使用的标记中的任一种。
在一些情况下，蛋白质检测试剂为多克隆或单克隆抗体或其结合片段(即，足以结合至所关注的靶标(例如蛋白质靶标)的抗体片段)。抗体片段(即结合片段)可为例如单体Fab片段、单体Fab'片段或二聚F(ab)'2片段。同样在术语“抗体或其结合片段”范围内的是通过抗体工程改造产生的分子，如单链抗体分子(scFv)；或由单克隆抗体产生的人源化或嵌合抗体，通过置换重链和轻链的恒定区以产生嵌合抗体或置换恒定区和可变区的构架部分以产生人源化抗体。
所关注的标志物包括胞质、细胞表面或分泌的生物分子，通常是生物聚合物，例如多肽、多糖、多核苷酸、脂质等。当标志物是蛋白质时，检测可包括如本领域中已知的磷酸化、糖基化等状态。
使用方法
多重测定如此处所证明是省时省力且珍贵的临床材料，并且允许在单细胞水平下分析遗传事件，如拷贝数扩增、RNA表达等。更重要的是，同时评价同一细胞内的多个同时发生的分子事件的能力可提供阐明细胞内的相互作用的复杂网络的全新机遇。多重分析可用于测量和定量基因相互作用之间的平衡以便增进对细胞功能的了解。
本发明的方面包括分析细胞样品中靶核酸(例如脱氧核糖核酸、核糖核酸)在单细胞水平下、通常多个靶核酸在单细胞水平下的存在的方法。所述分析可与定义群内细胞的另外的标志物(例如，蛋白质标志物)组合。
因而，本发明方法为评估细胞样品的细胞中的靶核酸的量(即水平)的方法。在一些实施方案中，本发明方法为评估靶核酸是否存在于样品中的方法，其中靶核酸的检测是定性的。在一些实施方案中，本发明方法为评估靶核酸是否存在于样品中的方法，其中靶核酸的检测是定量的。所述方法可包括确定细胞样品的细胞中的靶核酸的量的定量量度。在一些实施方案中，对靶核酸的表达水平的定量包括比较一种核酸的表达水平与另一种核酸的表达水平以确定相对表达水平。在一些实施方案中，所述方法包括确定靶核酸在细胞样品的细胞中是以高于抑或低于预定阈值存在。因而，当检测的信号大于具体的阈值(也称为“预定阈值”)时，所关注的靶核酸的量在细胞样品的细胞中以高于预定阈值存在。当检测的信号弱于预定阈值时，所关注的靶核酸的量在细胞样品的细胞中以低于预定阈值存在。
如本文所用的术语“细胞样品”意指含有以任何所需浓度的呈悬液形式的一个或多个单个细胞的任何样品。例如，细胞样品可含有1011或更少、1010或更少、109或更少、108或更少、107或更少、106或更少、105或更少、104或更少、103或更少、500或更少、100或更少、10或更少、或1个细胞/毫升。样品可含有已知数量的细胞或未知数量的细胞。合适的细胞包括真核细胞(例如，哺乳动物细胞)和/或原核细胞(例如，细菌细胞或古细菌细胞)。
在实践本发明方法时，细胞样品可由体外来源(例如，来自在培养中生长的实验室细胞的细胞悬液)或体内来源(例如，哺乳动物受试者、人受试者等)获得。在一些实施方案中，细胞样品由体外来源获得。体外来源包括但不限于原核(例如，细菌、古细菌)细胞培养物、含有原核和/或真核(例如，哺乳动物、protest、真菌等)细胞的环境样品、真核细胞培养物(例如，建立的细胞系的培养物、已知或购买的细胞系的培养物、永生化细胞系的培养物、原代细胞的培养物、实验室酵母的培养物等)、组织培养物等等。
在一些实施方案中，样品是由体内来源获得并且可包括从组织(例如，来自组织活检的细胞悬液、来自组织样品的细胞悬液等)和/或体液(例如，全血、分级分离的血液、血浆、血清、唾液、淋巴液、组织液等)中获得的样品。在一些情况下，在评估之前，对来源于受试者的细胞、体液或组织进行培养、储存或处置。体内来源包括活的多细胞生物体并且可得到非诊断性或诊断性细胞样品。
细胞样品可从多种不同类型的受试者处获得。在一些实施方案中，样品来自于哺乳纲内的受试者，包括例如食肉目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)、兔形目(例如兔)及灵长目(例如人、黑猩猩和猴)等等。在某些实施方案中，动物或宿主，即受试者(在本文中也称为患者)为人。
本发明的方面可包括使细胞样品与“刺激剂”(在本文中也称为“刺激物”)接触。刺激剂意指影响至少一种细胞活性或改变细胞稳定状态(即，在丰度或活性方面的诱导或降低)的任何化合物。细胞样品与刺激剂的接触可用于探明细胞对该试剂的反应。刺激剂的“有效量”意味着刺激剂以影响至少一种细胞活性或改变细胞稳定状态(即，在丰度或活性上的诱导或降低)的量存在。刺激剂可以粉末或液体形式提供。因而，刺激剂可包括各种化合物和制剂，如胞内信号诱导剂和免疫调节剂。实例包括小分子药物以及肽、蛋白质、脂质碳水化合物等。尤其关注的是化合物，如肽激素、趋化因子、细胞因子，例如I型干扰素(例如IFN-α、IFN-β)、白介素(例如，白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)、转化生长因子β等等。
靶核酸检测
本发明方法为分析靶核酸的存在的方法。因而，本发明方法为包括以下步骤的方法(当靶核酸存在于细胞样品的细胞中时)：检测靶核酸，产生响应于靶核酸检测的信号及检测所产生的信号。由检测的靶核酸产生的信号可为任何可检测的信号(例如，荧光信号、扩增荧光信号、化学发光信号等)。
本发明的方面包括检测靶核酸的方法(即，靶核酸检测)。在一些实施方案中，使细胞样品与核酸检测剂接触。如本文所用，术语“核酸检测剂”意指可特异性地结合至靶核酸的任何试剂。例如，合适的核酸检测剂可为至少部分与靶核酸序列互补且与靶核酸序列杂交的核酸(或修饰的核酸)。在一些实施方案中，核酸检测剂包括探针或探针的组(即，探针组)，其各自特异性地结合(即杂交)靶核酸的序列(即靶序列)。
在一些实施方案中，提供了一种测定单细胞中的靶核酸的丰度的方法，所述方法包括使固定和透化过的细胞与一对寡核苷酸SNAIL引物在容许特异性杂交的条件下接触；洗涤不含未结合的引物的细胞；进行连接反应，其中连接SNAIL寡核苷酸以生成一个环；通过滚环扩增来扩增所连接的环；使检测引物与扩增过的环杂交；以及定量结合的检测引物的水平以测定靶核酸的丰度。
在本发明的一些实施方案中，SNAIL与细胞计量术设门组合用于特定细胞群上，所述细胞群是由其它细胞参数所定义，这些细胞参数与抗体染色和质谱流式细胞术或FACS同时(例如组合)测量以定义所关注的亚群。在这种实施方案中，可分析复杂的细胞群，例如，活检或血液样品，其潜在地包括免疫细胞、祖细胞或干细胞、癌细胞等。例如，提供了一种用于测定复杂的细胞群内已定义的细胞类型中的一个或多个靶核酸的丰度的方法，其中检测探针的定量与细胞标志物的检测组合，所述细胞标志物包括但不限于蛋白质标志物，其是用来定义所关注的细胞类型。
在其它实施方案中，本发明方法用于多重检测和定量单细胞中的mRNA转录物的特定剪接变体。
在又一实施方案中，本发明方法与邻近性连接测定(PLA)组合用于同时检测和定量核酸分子及蛋白质-蛋白质相互作用。
在内源性细胞DNA(通过热、酶促法或任何其它合适的工序)的事前变性下，针对检测特定的DNA序列(单细胞的基因分型)而修改技术。在此修改下，所述技术能够实现基因拷贝数变化的定量和基因组易位/融合事件的检测。
信号检测和定量可使用任何仪器(例如液体测定装置)进行，这些仪器可以测量来自本发明方法的荧光、发光、光散射或比色信号输出。在一些实施方案中，由靶核酸的检测产生的信号是通过流式细胞仪来检测。在一些实施方案中，用于评估细胞样品中靶核酸的存在的液体测定装置是流式细胞仪，例如，质谱流式细胞仪、FACS、MACS等。因而，在一些情况下，关于靶核酸是否存在于细胞样品的细胞中的评估包括用流式细胞仪分析该细胞样品。在流式细胞术中，将细胞样品的细胞悬浮于流体流中，使至少一个光束(例如，单波长的激光)通过该流体流，每次一个细胞。许多检测器(包括一个或多个荧光检测器)检测散射光以及从细胞样品中发出的光(例如荧光)。以此方式，流式细胞仪获得可用于导出有关穿过光束的各单个细胞的物理和化学结构的信息的数据。如果对靶核酸的检测有特异性的信号通过流式细胞仪在细胞中被检测到，那么靶核酸存在于细胞中。在一些实施方案中，使用流式细胞仪定量检测到的信号。
读数可以是与测量有关的平均数、均值、中值或方差或其它统计或数学推导值。读数信息可进一步通过与相应参考或对照直接比较来改进，例如参照标准多核苷酸样品、管家基因表达等。在相同条件下获得的绝对值可表现生物系统中固有的差异。
在某些实施方案中，将获得的数据与单个参考/对照谱相比较以获得关于被分析的细胞的表型的信息。在另一些实施方案中，将获得的数据与两个或更多个不同的参考/对照谱相比较以获得关于细胞表型的更深入的信息。例如，获得的数据可与阳性和阴性对照相比较以获得关于细胞是否具有所关注的表型的确认的信息。
效用
本发明的方法、装置、组合物和试剂盒能够用于多种不同的用途。本发明方法为评估细胞样品的细胞的方法，在所述细胞中可存在或不存在靶核酸。在一些情况下，未知的是在进行测定之前，细胞样品的细胞是否表达靶核酸。在其它情况下，未知的是在进行测定之前，细胞样品的细胞是否以大于(超过)预定阈值量(或相对量)的量(或相对量，例如相对于另一种核酸或相对于正常细胞中的靶核酸的量)表达靶核酸。在这种情况下，所述方法为评估细胞样品的细胞的方法，在所述细胞中所关注的靶核酸可以大于(超过)或小于预定阈值的量存在或不存在。在一些实施方案中，本发明方法可用于测定细胞样品的单个细胞中核酸的表达水平(或相对表达水平)，通常是细胞中的多个核酸的多重分析。还分析了任选地另外的标志物，如蛋白质。
本发明方法可用于鉴别样品中的特定细胞为异常或非异常的。例如，已知一些mRNA在异常细胞(例如癌细胞)中以高于具体水平或相对水平(即，高于预定阈值)表达。因此，当针对细胞样品的细胞的具体靶核酸(例如mRNA)的信号(如使用本发明方法所检测)水平(或相对水平)表面靶核酸的水平(或相对水平)等于或大于已知与异常细胞有关的水平(或相对水平)时，则确定细胞样品的细胞为异常的。相反，已知一些mRNA(和/或miRNA)在异常细胞(例如癌细胞)中以低于具体水平或相对水平(即，低于预定阈值)表达。因此，当针对细胞样品的细胞的具体靶核酸的信号(如使用本发明方法所检测)水平(或相对水平)表面靶核酸的水平(或相对水平)等于或小于已知与异常细胞有关的水平(或相对水平)时，则确定细胞样品的细胞为异常的。因此，本发明方法可用于检测和计数异常细胞在细胞样品中的数量和/或出现率。可就关于蛋白质或其它标志物的附加信息对任何鉴别的所关注的细胞进行分析。
在一些情况下，未知的是具体的靶核酸在异常细胞中的表达是否变化，且本发明方法可用于确定靶核酸在异常细胞中的表达是否变化。例如，可对已知不含异常细胞的细胞样品进行评估并且可将结果与已知(或怀疑)含有异常细胞的细胞样品的评估结果相比较。
在一些情况下，异常细胞为在异常状态(例如，异常代谢状态；刺激状态；信号传导状态；疾病状态；例如细胞增殖性疾病、癌症；等)下的细胞。在一些情况下，异常细胞为含有原核、真核或病毒病原体的细胞。在一些情况下，含有病原体的异常细胞(即，受感染的细胞)以高于未感染的细胞的水平表达致病mRNA或宿主细胞mRNA。在一些情况下，这种细胞以低于未感染的细胞的水平表达宿主细胞mRNA。
在采用流式细胞仪以便用流式细胞仪分析细胞样品的实施方案中，可快速地完成针对靶核酸的存在对细胞样品的细胞的评估，可分选细胞，并且可评估大量细胞。设门可用于针对靶核酸表达的存在或水平(或相对水平)对细胞样品的细胞的选定子集进行评估(例如，在具体形态范围内的细胞，例如，前向和侧向散射特征；表达表面蛋白的具体组合的细胞；在具体的水平下表达具体的表面蛋白的细胞；等等)。
在一些实施方案中，所述方法为确定异常细胞是否存在于诊断细胞样品中的方法。换句话说，样品已由体内来源获得或源自于体内来源(即，活的多细胞生物体，例如哺乳动物)以确定靶核酸在一个或多个异常细胞中的存在，以便作出诊断(即，诊断疾病或病状)。因此，所述方法为诊断性方法。由于所述方法是“诊断性方法”，所以它们是诊断(即，确定存在或不存在)在活生物体(如哺乳动物，例如人)中的疾病(例如，癌症、循环肿瘤细胞、微小残留病(MRD)、细胞增殖性疾病状态、病毒感染例如HIV等)或病状(例如，病原体的存在)的方法。因而，本公开的某些实施方案是用于确定活受试者是否患有给定疾病或病状(例如，癌症、循环肿瘤细胞、微小残留病(MRD)、细胞增殖性疾病状态、病毒感染、病原体的存在等)的方法。“诊断性方法”还包括基于至少一种靶核酸的表达水平(或相对水平)确定给定疾病或病状的严重程度或状态的方法。
在一些实施方案中，所述方法为确定异常细胞是否存在于非诊断性细胞样品中的方法。非诊断性细胞样品是已由任何体外或体内来源获得或源自于任何体外或体内来源的细胞样品，包括活的多细胞生物体(例如哺乳动物)，而不是为了作出诊断。换句话说，是为了确定靶核酸的存在而获得样品，而不是为了诊断疾病或病状。因此，这类方法为非诊断性方法。
这类分析的结果可与由参考化合物、浓度曲线、对照等获得的结果进行比较。结果的比较是通过使用合适的推导方案、人工证据系统、统计比较等完成。在具体的实施方案中，如上所述的方法可用于多重测定中，其中异质细胞群被多种可区别地标记的结合剂标记。
可汇编分析信息的数据库。这些数据库可包括来自已知细胞类型的结果、来自在具体条件下处理的细胞的分析的参考等。可生成数据矩阵，其中数据矩阵的各点对应于来自细胞的读数，其中每个细胞的数据可包含来自多个标记的读数。读数可以是与测量有关的平均数、中值或方差或其它统计或数学推导值。输出读数信息可进一步通过与相应的参考读数直接比较来改进。在相同条件下获得的各输出的绝对值表现活生物系统中固有的差异并且也反映单个细胞差异以及个体间固有的差异。
试剂盒
本公开还提供了用于实践如上所述的方法的试剂盒。本发明试剂盒含有用于实施如上所述的方法的试剂且在某些实施方案中，可含有多个探针和引物，包括例如至少一对靶特异性寡核苷酸引物；用于挂锁探针的相应插入物和主链；及任选用可检测的部分标记的检测探针。试剂盒还可含有由测试样品获得的结果可与其比较的参考样品。
除上述组分之外，本发明试剂盒还可包括使用试剂盒的组分来实践本文所述的方法的说明书。用于实践本发明方法的说明书一般记录在合适的记录介质上。例如，可以将说明书打印在如纸或塑料等的基质上。同样地，说明书可作为包装说明书存在于试剂盒中、存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装有关)、等等。在其它实施方案中，这些说明书作为存在于合适的计算机可读储存介质例如CD-ROM、磁盘等上的电子储存数据文件出现。在又一些实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，但提供由远程来源获得说明书的方式，例如通过因特网。此实施方案的一个例子是包括网址的试剂盒，其中可以在该网址查看说明书和/或从该网址下载说明书。与说明书一样，用来获得说明书的此方法也记录在合适的基质上。除上述组分之外，本发明试剂盒还可包括执行数据比较的软件。
应当理解，本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、和试剂等，因为这些可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求书的限制。
除非上下文中另外清楚指出，如本文所用的单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指示物。除非另外清楚指出，本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
给出下列实施例，以便为本领域普通技术人员提供有关如何完成和使用本发明的全面内容和说明，并且不会限制视为本发明的范围。已经努力确保所用数值(例如，量、温度、浓度等)的精确性，但是应允许某些实验误差和偏差。除非另外指出，份是重量份，分子量是平均分子量；温度是以摄氏度为单位；且压力为大气压或接近大气压。
实验
本发明现将结合一些实施例更充分地描述，这些实施例不应被看作是对本发明的限制。
实施例1
用简化的双探针邻近性连接系统进行的多重单分子RNA可视化
在单细胞水平下对基因转录活性的定量是研究细胞表型异质性、分化过程和基因调控网络的关键。大多数现代的单细胞表达分析方法需要cDNA产生，这限制了效率并引入了序列偏倚。smRNA-FISH的替代方法限于长转录物。我们创建了一种简单的双探针邻近性连接系统，被称为SNAIL-RCA，其能实现基因的的原位扩增、检测和可视化。经由未标记的检测探针的杂交联同用荧光核苷酸类似物的单核苷酸延伸来检测RCA产物。荧光成像和自动图像分析能够实现表达水平的精确定量。多重性能够通过再杂交实现，再杂交与解析条形码策略组合，该策略能够同时检测成百或上千的基因。显示SNAIL能够实现在细胞培养物和组织样品中的单细胞转录异质性的检测，其对检测低表达的转录物足够敏感。
对HLADR NALM对比Jurkat的系统设计、高信号特异性。设计了一种用于多重检测核酸(主要是RNA)的简化的邻近性连接技术。该方法被称作SNAIL-RCA，其表示夹板核苷酸辅助的分子内连接和滚环扩增(Splint Nucleotide Assisted Intramolecular Ligationfollowed by Rolling Circle Amplification)。如图1A所示，RNA用作组装由两个合成寡核苷酸组成的复合物的骨架。这两个寡核苷酸含有与靶mRNA上的直接辅助区互补的区段。上游‘夹板’寡核苷酸包括3’末端序列，其被设计来充当用于环化下游‘挂锁’寡核苷酸的骨架。同时，‘挂锁’核苷酸包括基因特异性检测序列。‘挂锁’核苷酸的5’和3’末端被设计来以平头至末端的方式与夹板退火，使得能够通过T4DNA连接酶完成环化形式的连接(图1A)。
环化之后，添加链置换φ29聚合酶，其触发‘挂锁’和其含有的基因特异性检测序列的滚环扩增(RCA)。(图1B)‘夹板’与‘挂锁’之间的互补区被设计为短的并且具有低熔点温度以使得复合物形成、连接及后续的RCA可仅在特异性骨架RNA存在下发生。这一系列事件决定了靶RNA检测的特异性。经由特异性引物的杂交(图1C)和用荧光dNTP的单碱基延伸完成检测(图1D)。图1E-F显示在NALM细胞中的HLADRA mRNA检测的高度特异性检测(图1E)，同时Jurkat细胞衍生自T细胞谱系并且对HLADR呈阴性，这证明信号的完全不存在，由此证实SNAIL-RCA系统的特异性。
SNAIL的特征是一项简化设计，其采用在单个杂交步骤中形式的两个寡核苷酸。主要优点是寡聚物设计过程的简化：虽然RNA互补序列和检测序列是根据靶标来修饰，而连接序列一直保持不变，因此可以完全自动化方式来设计针对大的基因库的探针组。
组织制备和切片。从小鼠中采集组织，于O.C.T.化合物(Tissue-Tek)中快速冷冻并在-80C下储存。必要时，将组织以5μm的切片切到包被有聚赖氨酸的盖玻片上并在-80下储存长达一个月。
SNAIL方案。使切片在室温下干燥并平衡1’，然后立即在室温下用PBS中的4％PFA固定10’。接着将组织在冰冷的甲醇中透化并在-80C下培育10’。然后去除甲醇并且在室温下将组织于PBS、0.1％Tween(Sigma-Aldrich)和40U/mL RNasin(PBST-R)中再水合1’。将与SNAIL探针的杂交在基于DEPC处理过的水(Life Technologies)的缓冲液中进行，所述DEPC处理过的水含有1x SSC(Affymetrix)、2.5％v/v聚乙烯基磺酸、20mM核糖核苷氧钒基复合物(New England Biolabs)、40U/mL RNasin、1％Tween和100μg/mL鲑鱼精子DNA(LifeTechnologies)。将SNAIL探针以100μM的浓度再悬浮于中DEPC处理过的水中。将探针加热至90℃并持续5min，然后在冰上冷却并以100nM的最终浓度添加到杂交缓冲液中的组织中。在40℃下将组织在轻微搅拌下培育过夜，且随后用PBST-R洗涤三次。然后在40℃下，在轻柔搅拌下于含有PBS、4x SSC、40U/mL RNasin的缓冲液中培育组织20min。在用PBST-R洗涤两次之后，将组织在37C下用T4DNA连接酶(Thermo)培育2小时，然后在30℃下用phi29DNA聚合酶(Thermo)培育2小时。根据制造商说明书使用两种酶，添加40U/mL RNasin。然后在37℃下将组织于PBS、1x SSC、0.1％Tween、40U/mL RNasin中与浓度为10nM的检测寡核苷酸培育30分钟。
实施例2
细胞和组织中的单一RNA分子的多重可视化通常依赖于smRNA-FISH，smRNA-FISH使用直接与mRNA杂交的多个荧光标记的探针。然而，现有方法通常使用48 20个核苷酸的探针，需要这些探针与各mRNA杂交，这使得该方法局限于大的mRNA。并且，创建代表大部分基因组的大型文库可极为昂贵。bDNA技术可以检测短RNA且甚至是miRNA，但其多重性受到难以找出正交bDNA序列的限制。或者，cDNA可原位产生，然后与挂锁探针杂交，将它们连接并经由RCA扩增，但逆转录的低效率和序列偏倚对此方法构成瓶颈。
我们设想了一种称为SNAIL-RCA(Specific Amplification of Nucleic Acidsvia Intramolecular Ligation and Rolling Circle Amplification)的简化设计，其使用两个探针并且消除对衔接序列的需要-并且这将连接反应从2减至1或无。上游探针用作供环化和连接下游‘挂锁’探针的夹板，其含有检测条形码序列(图1a)。各探针对一旦与靶RNA杂交便形成环状构建体，然后将它们连接并通过链置换聚合酶扩增。(图1b)互补区的解链温度足够低(Tm 27℃)以防止在杂交(40℃)和连接(37℃)步骤期间在靶mRNA不存在下形成双探针二聚体。这在实际上零背景下实现了目标检测的高特异性，如通过在B细胞白血病(NALM-6)和T细胞白血病(Jurkat)细胞系中HLADR和CD3的检测所证明(图2)。
此简化设计容许针对许多不同的mRNA利用相同的互补性/连接序列，仅改变靶杂交序列。通过将荧光检测探针与相同样本反复重退火来执行多重成像。利用此方法已检测了24个基因在OVCAR4细胞中的表达(图3)。可以同样检测高度表达的基因(ACTB，GAPDH)以及低表达的基因(CD24，E-钙粘蛋白)。成像方法使得我们能够表征RNA靶标的亚细胞定位。虽然大多数RNA排外地在胞质中存在，但发现PBOV1的mRNA，即一种来源于不到5百万年前的非编码RNA的人特异性蛋白质编码基因，展现优先的核定位，提示作为编码和非编码RNA的双重功能。为了进行联合基因表达的定量分析，将捕获602个细胞的图像分割并转化为单细胞RNA表达载体。在单细胞中的基因共表达分析揭示了显示高度相关表达的增殖相关基因的主要共表达组(图4A)。
最终，单个细胞成簇并且以力导向布局表示(关于方法请参见Samusik等人(2016)Nature Methods 6:493-496)。簇1富集了表达WFDC2的细胞，簇2对E-钙粘蛋白和MUC16呈阳性，簇3表达PBOV1，簇4和5展现增殖表型、共表达cMyc、CD13和Ki-67。簇4对E-钙粘蛋白呈阳性，而簇5对E-钙粘蛋白呈阴性，但除cMyc之外还表达MycN。此研究结果显示OVCAR4细胞在此细胞系中相当大程度的表型多样性。
因此，SNAIL-RCA能够实现在单细胞中基因表达水平的容易配置、有效管理、定量检测。
方法
细胞培养。将OVCAR4细胞在含有10％FBS(Thermo Fisher Scientific)、100U/mL青霉素/100μg/mL链霉素(Thermo Fisher Scientific)的RPMI-1640培养基(ThermoFisher Scientific)中培养。将细胞通过在室温下于无血清的RPMI-1640培养基中用1.6％甲醛溶液培育30分钟而以60％汇合固定。之后，将细胞转移到冰上并用冰冷的甲醇透化，并且在-80C下储存于甲醇中。
SNAIL方案。使用内部开发的SNAIL-designer软件来设计SNAIL探针序列，为每个基因设计总共4个探针对。在IDT处合成探针，并且以100μM在IDTE缓冲液中的形式运输和保存。用于大多数方案步骤的载体溶液(包括洗涤液)为PBS、0.1％Tween-20(Sigma-Aldrich)和4U/mL RNasin。将带有甲醛固定的和甲醇透化的细胞的盖玻片用PBS、0.1％Tween(Sigma-Aldrich)和4U/mL RNasin和20mM核糖核苷氧钒基复合物(New England BioLabs)洗涤。将与SNAIL探针的杂交在基于DEPC处理过的水(Thermo Fisher Scientific)的缓冲液中进行，所述DEPC处理过的水含有1×盐水-柠檬酸钠(SSC)(Affymetrix)、2.5％体积/体积聚乙烯基磺酸、20mM核糖核苷氧钒基复合物(New England BioLabs)、40U/mL RNasin、1％Tween-20和100μg/mL鲑鱼精子DNA(Thermo Fisher Scientific)。将用于实验的所有靶转录物的SNAIL探针混合并加热至90℃并持续5min。然后将探针以200nM的最终浓度与杂交缓冲液混合并添加到细胞中。将细胞在40℃下培育1h并洗涤三次。然后在40℃下将细胞在含有PBS、4×SSC和40U/mL RNasin的缓冲液中培育20min。在两次洗涤之后，将细胞在37℃下与Quick连接酶(New England Biolabs)培育1小时，然后在30℃下在搅拌下与phi29DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)培育2小时。更久的扩增(长达16h)一般增强信号强度。根据其各自的制造商说明书使用两种酶。
成像。用Hoechst 34580(Thermo Fisher Scientific)对细胞核染色。通过使缀合至荧光染料(ATTO-488、ATTO-595、ATTO-647)的检测寡核苷酸退火来检测RCA产物。使细胞经受使用定制流体学设置进行的退火、成像和剥离的循环，并用Keyence BZ-X710显微镜成像。检测寡核苷酸、退火和剥离缓冲液是由Akoya Biosciences Inc(San Francisco,USA)提供。

Claims (23)

1.一种用于测定单细胞中的靶核酸的丰度的方法，所述方法包括：
使固定和透化过的细胞与至少一对SNAIL寡核苷酸引物在容许特异性杂交的条件下接触，其中所述引物对包含夹板引物寡核苷酸(SPO)和挂锁寡核苷酸(PO)，其中SPO和PO各自包含与所述靶核酸上的相邻序列互补的第一互补区(分别为CR1和CR1’)；且SPO和PO各自进一步包含位于邻近CR1或CR1'的第二互补区(CR2和CR2’)；其中CR2’是割裂区以使得PO的5’和3’端与CR2杂交，以便在杂交之后，PO的5’和3’端直接定位成彼此相邻；
洗涤不含未结合的引物的细胞；
使所述细胞与连接酶接触，其中连接所述PO以生成闭合环；
使用所述PO作为模板和SPO作为聚合酶的引物来进行滚环扩增；
使所述细胞与检测探针在容许特异性杂交的条件下接触；以及
检测结合的检测探针的水平以测定所述靶核酸的丰度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述SNAIL寡核苷酸引物对在接触样品之前通过加热而变性。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞存在于细胞群中。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞群包含多种细胞类型。
5.如权利要求1所述的方法，其中使用对不同的靶核酸具有特异性的多个SNAIL寡核苷酸引物。
6.如权利要求5所述的方法，其中检测到至少5种不同的靶核酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述RNA是mRNA。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。
10.如权利要求1所述的方法，其中针对一种或多种非核酸标志物的表达对所述细胞同时进行分析。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述一种或多种标志物是蛋白质标志物。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述检测探针用荧光团、同位素或质量标签中的一种或多种标记。
13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述检测通过以下手段进行：流式细胞术；测序；探针结合和电化学检测；pH改变；由结合至DNA标签的酶诱导的催化；量子纠缠；拉曼光谱学；太赫波技术；或扫描电子显微术。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述流式细胞术是质谱流式细胞术或荧光激活流式细胞术。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述检测通过显微术、扫描质谱法或其它成像技术进行。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述检测通过纳米SIMS进行。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述SNAIL寡核苷酸中的一个或多个的序列提供关于鉴别供用于多重分析的所述靶核酸的条形码信息。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述PO作为闭合环提供，且省去使所述细胞与连接酶接触的步骤。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中选择反应中的探针的Tm以使溶液中的连接最少。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中在检测之后移除所述检测探针。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述检测探针差异性地检测在不同的时期的不同滚环产物。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中多个同时的SNAIL寡核苷酸引物对平铺于RNA种类中，其中所述引物任选地包含并入的码。
23.一种试剂盒，其用于如权利要求1-22中任一项所述的方法。
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