CN103180463B - 亲硫性固相以及包含硫代羰基核苷酸的寡核苷酸的缀合物 - Google Patents

亲硫性固相以及包含硫代羰基核苷酸的寡核苷酸的缀合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为亲硫性的，其中所述寡核苷酸包含至少一个式I的硫代羰基核碱基，其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2，其中---表示共价键，且其中所述寡核苷酸经所述硫代羰基核苷酸的硫原子与所述固相结合。本发明还公开了用于产生所述缀合物的方法以及所述寡核苷酸金属缀合物的各种用途。

Description

亲硫性固相以及包含硫代羰基核苷酸的寡核苷酸的缀合物
技术领域
本发明涉及寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为亲硫性(thiophilic)的，其中所述寡核苷酸包含至少一个式I的硫代羰基核碱基(thiooxonucleobase)，
其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2，其中---表示共价键，且其中所述寡核苷酸经所述硫代羰基核苷酸的硫原子与所述固相结合。本发明还公开了用于产生所述缀合物的方法以及所述寡核苷酸金属缀合物的各种用途。
背景技术
生物分子与固体表面的缀合(conjugation)在例如许多诊断应用如免疫测定或者核酸序列(其均需要生物分子与固相结合)中是一个决定性步骤。明显不同的固相材料可用于各种不同应用如聚苯乙烯、胶乳表面或者颗粒以及金属涂覆表面、金属颗粒和量子点中，这仅仅提及了所述应用中的一部分。
在所述可得到的金属纳米颗粒中，量子点和金纳米颗粒(AuNPs)得到了特别的关注，这是因为它们的化学惰性以及便于表面修饰(Mitchell,G.P.等人,J.Am.Chem.Soc.121(1999)8122-8123；Mahtab,R.等人,J.Am.Chem.Soc.117(1995)9099-9100；Mahtab,R.等人,J.Am.Chem.Soc.122(2000)14-17；Reynolds III,R.A.等人,Pure Appl.Chem.72(2000)229-235；Thanh,N.T.等人,Anal.Chem.74(2002)1624-1628；Csáki,A.等人,Exp.Rev.Mol.Diagn.2(2002)187-193；Thaxton,C.S.,and Mirkin,C.A.in:Nanobiotechnology,Niemeyer,C.M.,and Mirkin,C.A.(eds.),Wiley-VCH,Weinheim(2004)pp.288-307)。
例如可使DNA与金纳米颗粒偶联。所述DNA金纳米颗粒缀合物系统(DNA-AuNPs)将胶体金的有利性质与DNA的有利性质组合起来。所述DNA分子具有(i)独特的分子识别性质，(ii)其通过自动化DNA合成或者酶聚合作用而容易地获取，(iii)单链寡核苷酸具有形成多链聚集物的能力，这允许纳米级别装置的构建(Seeman,N.C.,Nature421(2003)427-431；Niemeyer,C.M.,Curr.Opin.Chem.Biol.4(2000)609-618；Gothelf,K.V.等人,Org.Biom.Chem.3(2005)4023-4037；Seela,F.and Budow,S.,Helv.Chim.Acta89(2006)1978-1985；Seela,F.等人,Org.Biomol.Chem.5(2007)1858-1872；Seela,F.等人,Chem.Biodiv.2(2005)84-91)。
使用寡核苷酸官能化的金纳米颗粒或者金表面对于不同应用例如用于体外诊断、体内成像的生物传感器、作为药物载体以及建成确定的纳米结构而言是核心元素。就寡核苷酸金缀合物的应用而言，存在大量文献，其部分综述于：Letsinger,R.L.等人,Chemistry of Oligonucleotide-Gold NanoparticleConjugates,In:Phosphorus,Sulfur and Silicon and the Related Elements,Vol.144-146(1999)pp.359-362；Ingenious nanoprobes in bioassays,Chan,CangelPui-yee,Bioanalysis1(2009)115-133；以及Biosensors based on goldnanoparticle labeling,Moeller,R.,Annual Review of Nano Research1(2006)429-466。
所讨论的寡核苷酸的容易生成以及所述寡核苷酸与例如金颗粒的稳定缀合化学性质为支持寡核苷酸-涂覆的金颗粒的广泛应用的基础。
将寡核苷酸连接至金纳米颗粒(AuNP)表面的常规方案用于在寡核苷酸的5’-或者3’-末端经巯基进行修饰(Mirkin,C.A.等人,Nature382(1996)607)。单链寡核苷酸分别在其5’-或者3’-末端使用带有巯基的非环状衔接物(linker)进行官能化。然后所述巯基官能化用于与AuNPs的共价固定化。然而，在寡核苷酸合成之后的该修饰需要额外的偶联/处理步骤。
用于将寡核苷酸缀合至金纳米颗粒(AuNP)表面的一些其它方法是基于巯基修饰的寡核苷酸的使用。在这些方法中，在寡核苷酸合成过程中通过使用可商购得到的“巯基修饰剂”亚磷酰胺(phosphoramidites)来引入巯基。所述巯基使用需要特定脱保护条件(使用硝酸银)的三苯甲基进行保护，或者作为通过用DTT还原而裂解的二硫化物进行保护。在这两种情况下，标准脱保护条件是不适当的且在寡核苷酸连接至金表面之前需要彻底除去过量的这些特定脱保护试剂。
可代替寡核苷酸的化学合成的是，酶合成也是可能的。所述巯基修饰剂亚磷酰胺均不适于向寡核苷酸的酶结合。
对于金反应基团的酶结合，使用化合物4-硫基-三磷酸胸苷(4-thioTTP)(Incorporation of DNA networks into microelectrode structures;Erler,C.andMertig,M.,Journal of Vacuum Science&Technology,B:Microelectronics andNanometer Structures--Processing,Measurement,and Phenomena27(2009)939-943)。
相应的4-硫基T亚磷酰胺为可商购得到的且可用于含有寡核苷酸的预期的thio-dT的化学合成。然而，S-烷基4-ThioT非常容易反应成为亲核物质。因此，使用4-ThioT合成的寡核苷酸需要在氨水的存在下用NaSH裂解。如上所提及，任何残留的脱保护试剂需要被彻底除去。
然而，如将在实施例部分所显示，结合有4-硫基-胸苷(4-thioT)的寡核苷酸对于在标准脱保护条件下的水解而言不是特别稳定且一般来说可经历亲核攻击。因此这将导致基于结合所述硫基核苷酸的缀合物的不稳定性。
由以上现有技术的讨论而变得明显的是，存在对于合成包含寡核苷酸的硫基核苷酸和/或者将所述寡核苷酸连接至亲硫性金属如金或者量子点的有效且简单的方法的需求。针对简单性而言的一个先决条件是例如允许寡核苷酸连接至表面的基团可在寡核苷酸的化学合成过程中直接引入至寡核苷酸而不需要脱离已确定的标准寡核苷酸合成方案。
已经令人惊奇地发现包含一个或者多个巯基的寡核苷酸可容易地通过使用式I的硫代羰基核碱基、将所述硫代羰基核碱基结合至所述寡核苷酸来合成。
发明内容
本发明涉及寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为亲硫性的，其中所述寡核苷酸包含至少一个式I的硫代羰基核碱基，
其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2，其中---表示共价键，且其中所述寡核苷酸经所述硫代羰基核苷酸的硫原子与所述固相结合。
本发明还披露了产生寡核苷酸-固相缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供选自亲硫性金属、包含亲硫性金属(例如在基于Cd的量子点中的金属)的无机氧化物、硫化物、硒化物或者碲化物的亲硫性固相，以及b)使含有如上给出且定义的至少一个式I的硫代羰基核碱基的寡核苷酸与所述亲硫性固相结合。
本发明还披露且描述了各种用途，如在基于核酸杂交的检测方法中使用本发明的寡核苷酸-固相缀合物或者寡核苷酸纳米颗粒缀合物作为标记物的用途。
具体实施方式
除非另作说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组体技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些在本领域技术人员的掌握范围内。所述技术将在文献中完全解释，诸如"Molecular Cloning:ALaboratory Manual",second edition(Sambrook等人,1989)；"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait,ed.,1984)；"Animal Cell Culture"(R.1.Freshney,ed.,1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols inMolecular Biology"(F.M.Ausubel等人,eds.,1987,and periodic updates)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis等人,eds.,1994)。
除非另作定义，本申请使用的技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.,1994)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms andStructure,4th ed.,John Wiley&Sons(New York,N.Y.,1992)；Lewin,B.,GenesV,published by Oxford University Press(1994),ISBN0-19-8542879)；Kendrew,J.等人(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by BlackwellScience Ltd.(1994),ISBN0-632-02182-9)；以及Meyers,R.A.(ed.),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published byVCH Publishers,Inc.(1995),ISBN1-56081-5698),Mueller,S.(ed.)NucleicAcids from A to Z,A Concise Encyclopedia,Wiley VCH2008,ISBN-10:3-527-31211-0)对本领域技术人员提供了在本申请中使用的许多术语的一般指导。
将本申请引用的所用参考文献包括专利申请和出版物的全部内容通过引用的方式并入本申请。
定义
如在本申请使用，以下各术语具有与其在该部分相关的含义。
本申请使用的冠词"一个"和"一种"是指一个或者多于一个(即至少一个)的合乎语法的物品对象(grammatical object of the article)。作为实例，"抗体"是指一个抗体或者多于一个抗体。术语“至少”用于表明可存在任选一个或者多个另外的对象。作为实例，包含至少两个分开的区域的阵列可任选包含两个或者多个分开的测试区域。
表述“一个或者多个”是指1至50，优选1至20，也优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或者15。
如本领域技术人员所已知的，亲硫性金属可为包含亲硫性金属的合金、半导体或者混合金属半导体，或者其可基本上由亲硫性金属构成，即其可为纯金属。
在所述亲硫性金属为选自铜、金和银的贵金属的情况下，所述亲硫性金属固相优选由所述金属构成。在亲硫性半导体材料用作固相的情况下，所述亲硫性金属包含在所述材料中但不需要以其纯金属形式存在。在所述半导体材料中，所述亲硫性金属优选存在为至少35%w/w。还优选的是，所述半导体材料包含至少40%、45%或者50%的亲硫性半导体金属。
如本领域技术人员将在某些实施方案中所理解的，颗粒例如金颗粒或者量子点可为优选的选择，而对于其它实施方案而言，涂覆至固体载体材料上的亲硫性金属层或者亲硫性半导体材料层可为优选的替代选择。本发明中使用的术语“固相”意在涵盖这两种替代选择，即a)由亲硫性金属构成的固相，以及b)其中所述亲硫性金属存在于固体载体材料表面上的固相。
使用亲硫性金属涂覆以形成固相的固体载体材料不受到任何具体限制且可选自例如金属(例如铝)表面、气相沉积SiO2的金属表面、金属/半金属氧化物(例如Al2O3或者SiO2)表面、玻璃表面、聚合物表面例如薄膜形式的聚合物表面、尼龙膜或者硝基纤维素膜。然而，对于本领域技术人员清楚的是基本上“半固体”或者凝胶状固相载体也是适当的。
玻璃作为固相载体的用途代表一个优选的实施方案。玻璃不具有多孔表面且允许使用亲硫性金属或者亲硫性无机氧化物或者硫化物的半导体层进行均匀涂覆。玻璃也是机械性稳定的、耐热的且对于严格洗涤条件而言是不敏感的，且具有低的内荧光(intrinsic fluorescence)。玻璃的所有类型和类别是适当的，例如石英玻璃。
所述聚合物固相载体可由例如聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)(丙烯酸玻璃或者树脂玻璃)或者环烯共聚物(COCs)构成。例如适当的COC可由Ticona获得，其商标名为“Topaz”。
本申请使用的术语“缀合物”涉及这样的事实：包含硫代羰基核苷酸的寡核苷酸与包含在所述固相中的亲硫性金属经包含在所述寡核苷酸中的硫基结合。亲硫性金属和巯基的缀合物的确切化学性质仍然在研究中。不需要束缚于目前理论，如下汇总且给出了对于巯基-金键的现有知识。
金-硫键为金和硫化合物(通常为有机硫化合物)中的金和硫原子之间的独特的键。金和硫之间的水稳定性金盐通常赋予金其+1氧化状态(一价金)的特征，其用软配体诸如硫醚和硫醇盐形成。然而，有机硫化合物甚至是中性硫醚和硫醇盐也可相当强烈地结合至元素金表面，诸如胶体金纳米颗粒的表面以及松散金(bulk gold)的表面。
巯基-Au(0)表面键(surface bond)的电子性质不是确切清楚的，但其倾向于接近共价的，这是因为金的高电负性(按照Pauling标准为2.4且是相当强的(126-146kJ/mol))，这对于中性配体和中性零价贵金属之间的大多数表面键而言是罕见的。
针对已经困惑了化学家达几百年的该键的性质已经提出了众多假设，但难于进行实验性工作，这是因为实验性工作仅是假设之间的相互排除。所述键可能具有与格相互作用(dative interactions)的特征且可具有反馈键合(backbonding)特征。金-硫相互作用的键能随着表面被含硫化合物(诸如在自身组装的单层中)饱和时而降低。
并未完全理解的是当巯基与金表面结合时，所述巯基上的巯基氢发生了什么。竞争假设表明其可作为质子、氢化物或者氢(H-点)基而离去，可能被金稳定，或者最终为氢的形式。一个使用质子NMR的小组表明氢通常可未完全离去。然而当使用过量巯基(即覆盖大于50%的金表面)时，氢损失为"快速且不可逆的"。
术语“亲硫性金属”是基于HSAB-概念且描述了软硫化物与相应的软金属结合的事实。所述HSAB-概念与硬和软路易斯酸和碱同义。根据HSAB概念，软金属离子优选作为抗衡离子的软硫化物，且因此也称为亲硫性金属离子(与硬亲氧性金属离子相反)。
如上已经针对亲硫性贵金属金所示例说明的，硫代羰基(例如包含在寡核苷酸中的硫代羰基)的硫原子与金之间的键的确切性质是未知的。但这不是关键的，只要可选择适当的亲硫性金属且达到预期的结合。
本发明的亲硫性金属或者金属离子优选地选自第11族:(Cu,Ag,Au)；第12族(Cd,Hg)；第13族(Ga,In,Tl)以及第14族(Sn,Pb)金属。
在本发明的实施方案中，所述亲硫性金属选自亲硫性贵金属和亲硫性半导体材料。
在一个实施方案中，所述亲硫性金属为选自铜、银和金的贵金属。在一个实施方案中，所述亲硫性金属将选自银或者金。在一个实施方案中，金用作亲硫性固相材料。在一个实施方案中，银用作亲硫性固相材料。
如本领域技术人员所认识到的，亲硫性半导体材料可包含选自镉、镓和铟的一种或者多种金属，该金属作为氧化物、硫化物或者硒化物存在。在优选的实施方案中，所述亲硫性半导体材料是基于镉或者镓。在优选的实施方案中，所述半导体材料是基于镉。
在一个实施方案中，所述亲硫性半导体材料以纳米晶体或者量子点的形式存在。术语"量子点"意在广泛地解读为通常涵盖所述结构。量子点描述于专利和技术文献，参见例如美国专利6,322,901、5,990,749和6,274,323以及Murphy,C.J.,Analytical Chemistry74(2002)520A-526A。这些文件的公开通过引用的方式包括于此。量子点为半导体颗粒，其具有限定于1-至10-nm-长度标准的所有三维空间。无机半导体包括第14族(旧第IV族)元素硅和锗；化合物诸如GaN、GaP、GaAs、InP和InAs(统称为III–V材料)；以及ZnO、ZnS、ZnSe、CdS、CdSe和CdTe(II–VI材料)。
量子点为例如可由Invitrogen Corp.,Evident Technologies以及其它获得。
本发明所包括的重要元素之一为包含至少一个式I的硫代羰基核碱基的寡核苷酸，
其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2且其中---表示共价键。
所述式I的硫代羰基核碱基经N9共价键连接至本发明寡核苷酸-固相缀合物的寡核苷酸部分。N9原子所连接的寡核苷酸主链的C原子与天然存在的嘌呤核碱基(即腺苷或者鸟苷)通过连接至寡核苷酸主链所连接的C原子相同。换句话说，式I的核碱基代替了天然嘌呤核碱基，而与主链连接的性质和定位仍然与天然存在的嘌呤核碱基相同。
基于式I的核碱基的硫代羰基核苷酸可存在于寡核苷酸的5’和/或者3’-末端或者其可为所讨论的序列的一部分。在后一种情况下，换句话说，式I的硫代羰基核碱基代替了一个或者多个还存在于所讨论的寡核苷酸序列中的核碱基。
如本领域技术人员所认识到的，包含在本发明的缀合物中的寡核苷酸的关键特征为包含于其中的式I的核碱基。该核碱基例如介导所述寡核苷酸与亲硫性固相的结合。
所述核碱基经N9原子通过共价键所连接的主链类型可以许多不同方式而变化。作为本发明络合物的一部分或者用于在本发明方法中涂覆亲硫性金属的寡核苷酸可具有标准磷酸核糖主链，其中核糖基糖部分选自2’-脱氧D-核糖、2’3’-二脱氧D-核糖和D-核糖，或者可具有任何适当的非标准主链。
具有非标准主链的寡核苷酸优选包含选自2’-脱氧L-核糖、2’O-甲基、2’氟RNA的核糖基类似物或者具有选自锁定的核酸(LNA)、己糖醇核酸(HNA)、环己烯基核酸(CeNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和吗啉代寡核苷酸的主链。
本发明使用的术语核苷(或者硫代羰基核苷)不限于具有作为糖单元的标准2’-脱氧D-核糖、2’3’-二脱氧D-核糖和D-核糖的核苷，但也包括标准核碱基(或者式I的杂环核碱基)与例如锁定的核酸(LNA)、己糖醇核酸(HNA)、环己烯基核酸(CeNA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和吗啉代寡核苷酸中使用的糖单元的核糖基类似物或者结构类似物的任何组合。
如果式I的核碱基存在于寡核苷酸中，则寡核苷酸可与亲硫性固体载体连接。这对于基于标准核糖基糖主链部分的核苷酸、基于如上所述的非标准主链结构的寡核苷酸以及寡核苷酸与不同类型的主链在一个寡核苷酸内的嵌合体而言是真实的。
对于经固相合成将具有式I的核碱基的核苷酸结合至寡核苷酸而言，相应的单体(例如亚磷酰胺)可通过使用对于标准DNA和RNA寡核苷酸的合成或者对于主链修饰的寡核苷酸的单体合成而言所熟知的方法来合成。
出于经济原因以及便于合成，优选的是，具有式I的保护的核碱基且具有2’脱氧核糖作为糖单元的核苷的β氰基乙基亚磷酰胺。还优选对于3’->5’合成的3’亚磷酰胺。
对于经酶方法(使用聚合酶或者末端转移酶)将具有式I的核碱基的核苷酸结合至寡核苷酸而言，需要合成相应的三磷酸盐。并入修饰的三磷酸核苷是已知的，但只限于所选的结构(例如HNA和ANA可通过除了标准三磷酸核糖基糖之外的聚合酶来组装)。对于酶合成优选的是具有D-核糖2’脱氧D-核糖和2’3’二脱氧核糖作为三磷酸核苷的糖单元的三磷酸盐。
表述“基于核苷的核苷酸”用于清楚地表明对于结合至寡核苷酸，式I的核苷需要被活化例如磷酸化，且一旦结合至寡核苷酸则表示形成核苷酸。然后认为所述核苷酸衍生自或者基于具有式I的核碱基的核苷。
本申请使用的术语"寡核苷酸"通常是指短的、通常单链的多核苷酸，其包含至少8个核苷酸且至多约1000个核苷酸。在优选的实施方案中，寡核苷酸将具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或者30个核苷酸的长度。在优选的实施方案中，寡核苷酸将具有不多于1000、500、300、200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或者30个核苷酸的长度。如下给出的对于多核苷酸的描述等同且完全适用于寡核苷酸。
术语寡核苷酸是非常宽泛的且是指任何长度的核苷酸的聚合物，且包括DNA和RNA及其类似物和修饰。
如果在固相寡核苷酸过程中结合本发明的硫基核苷酸，则仅使用单体构成嵌段和修饰条件(例如使用WO2007/059816中所述的不同的氧化剂)，其可在一种合成化学范围内与单体硫基核苷构成嵌段组合。
术语寡核苷酸包括具有生物碱的寡核苷酸，其在核碱基被例如甲基、炔丙基或者卤素取代，或者侧基(pendant moiety)或者官能团与核碱基在此处连接。如果需要，可在聚合物组装之前或者之后进行核苷酸结构的修饰。寡核苷酸可在聚合之后进一步修饰，诸如通过与标记组分结合。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。非核苷酸组分为间隔物和衔接物，其为非官能化的或者使用反应基团如-NH2、-N3、-OH、-COOH、-C=C、ONH2或者与侧基的连接基进行官能化。侧基为蛋白(例如核酸酶、毒素、抗体、肽、聚左旋赖氨酸等)、插入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、小沟粘合剂(例如偏端霉素)、螯合剂(例如金属，包括放射性金属和硼)、荧光或者非荧光染料(例如香豆素、荧光素、罗丹明、噁嗪、4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-对称-二环戊二烯并苯(s-indacene)染料(Bodipy)、偶氮染料、聚偶氮染料、青色素、部花青、芪类、二奈嵌苯、嵌二萘、酞菁)和半抗原(如生物素、洋地黄毒苷)。
术语寡核苷酸包括具有标准碱和/或者碱类似物(显示与生物碱相同的氢键合方式的类似物)如C核苷(间型霉素、假尿核甙)、7脱氮嘌呤、7脱氮8氮杂嘌呤以及6氮杂嘧啶的寡核苷酸。所述碱类似物也可进一步被取代，例如类似的7Br7脱氮dG。
非标准碱例如通用碱如硝基吲哚、硝基吡咯和非氢键合碱代替物(例如二氟苯基)以及能够形成第三碱基对(如异dG或者异dC)的非生物碱也为符合本发明的固定方法的修饰物。
术语寡核苷酸包括具有主链修饰的寡核苷酸，例如以下的寡核苷酸，其具有取代的脱氧核糖(例如2’氟或者甲氧基)、糖类似物如二环糖(已知为LNA)或者6环糖类似物例如己糖醇(已知为HNA)以及具有修饰的核苷酸间衔接物如甲基膦酸酯、亚磷酰胺和磷硫酰的主链。聚核苷酸中的所有衔接物并非需要均相同。
术语寡核苷酸也包括支链寡核苷酸，其中至少三个寡核苷酸经支链单元彼此连接。对于合成支链寡核苷酸(例如1-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基)戊基酰氨基]-3-[5-芴基甲氧基羰基氧基戊基酰氨基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)的不同单体可商购得到。
在一个实施方案中，寡核苷酸中的其它基团作为也能够与亲硫性表面(例如磷硫酰或者非核苷酸间隔物上的巯基)反应的修饰物存在，，所述修饰物位于与本发明的硫代核苷非常邻近的位置以使得不具有可与亲硫性表面反应的不同反应位点。如果在使用聚合酶的酶合成过程中将本发明的硫代核苷酸作为三磷酸盐结合，则放大的核苷酸修饰物的数目和类别被针对那些修饰的三磷酸核苷酸所接受的聚合酶所限制。很好结合的是5取代的(d)CTP和(d)UTP、7取代的7脱氮-(d)GTP和7脱氮-(d)ATP，其中所述取代基为非庞大的取代基(例如类似5Br dUTP、5乙炔基dUTP、5-氨基烯丙基dUTP)或者小的侧基(例如标记物或者半抗原)或者官能团，其中优选地经6至30原子间隔物将-NH2、-N3和-C=C部分连接至5或者7位。
如果需要，这些官能团可例如通过将蛋白结合至其中来进一步修饰以获得具有大的侧基的修饰物。
本申请使用的术语"阵列"或者"微阵列"是指杂交阵列元素优选聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)在底物上的有序排列。所述底物可为固体底物诸如载玻片，或者半固体底物诸如硝基纤维素膜。所述核苷酸序列可为DNA、RNA或者其任何排列。
本申请使用的"靶标序列"、"靶标核酸"或者"靶标蛋白"为所讨论的聚核苷酸或者蛋白，其检测是预期的。一般而言，本申请使用的"模板"为含有所述靶标核苷酸序列的聚核苷酸。在一些实例中，术语"靶标序列"、"模板DNA"、"模板聚核苷酸"、"靶标核酸"、"靶标聚核苷酸"及其变化形式可交替使用。
本申请使用的"放大"通常是指产生期望序列的多个副本的过程"。多个副本"是指至少2个副本。"副本"并非必要地表示完美的序列互补性或者与模板序列相同。例如，副本可包括核苷酸类似物诸如脱氧肌苷、有目的的序列变更(诸如通过引物(包括杂交而非互补的序列)引入至模板的序列变更)和/或者在放大过程中发生的序列错误。
如果基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第一样品中的表达水平/量高于所述基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第二样品中的表达水平/量，则所述基因、蛋白或者生物标记在第一样品中的表达/量相比于在第二样品中的表达/量而言是高的或者增加的。在一个实施方案中，所述基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第一样品中的表达水平/量的增加为所述基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第二样品中的表达水平/量的至少约1.5X、1.75X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、25X、50X、75X或者100X。
如果基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第一样品中的表达水平/量低于所述基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第二样品中的表达水平/量，则所述基因、蛋白或者生物标记在第一样品中的表达/量相比于在第二样品中的表达/量而言是低的或者降低的。在一个实施方案中，所述基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第一样品中的表达水平/量的降低为低于所述基因、基因产物例如蛋白或者生物标记在第二样品中的表达水平/量的至少约1.5X、1.75X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、25X、50X、75X或者100X。
表达水平/量可基于本领域已知的任何适当标准来确定，包括但不限于mRNA、cDNA、蛋白、蛋白片段和/或者基因副本。表达水平/量可定性和/或者定量地来确定。在一个实施方案中，针对测定的RNA或者蛋白的量的差异以及使用的RNA或者蛋白样品的性质的可变性对所述样品进行标准化。所述标准化可通过测量和结合某些标准化基因包括熟知的持家基因诸如GAPDH的表达来完成。可选择地，标准化可以基于所有测定的基因或者其大的亚组(整体标准化方法)的平均信号或者中位值信号。以基因-基因作为基础，将患者肿瘤mRNA或者蛋白的测量标准化量与在参照组中的实测量进行比较。对于每个患者的每个测试肿瘤的每个mRNA或者蛋白的标准化表达水平可表示为测量的表达水平在参照组中的百分数。在待分析的具体患者样品中测量的表达水平将落入至该范围内的某种百分位数，其可通过本领域熟知的方法来确定。
"检测"包括任何方式的检测，包括直接和间接检测。
本申请使用的术语"样品"或者"测试样品"是指由所讨论的受试者获得或者衍生的组合物，其含有待例如基于物理、生物化学、化学和/或者生理特征进行表征和/或者鉴定的细胞和/或者其它分子实体。在一个实施方案中，所述定义涵盖生物来源和组织样品诸如活检标本或者组织培养或者由此衍生的细胞的血液和其它液体样品。所述组织样品的来源可为固体组织，如来自新鲜、冷冻和/或者保存的器官或者组织样品或者活组织检查或者抽吸的样品；血液或者任何血液组成；体液；和在受试者妊娠或者发育过程中的任何时间的细胞或者血浆。样品可在开始治疗(例如癌症治疗)之前或者开始治疗(例如癌症治疗)之后由受试者获得。样品可在开始治疗(例如癌症治疗)之后的7、10、14、28、42或者56天的24小时之内获得。术语"样品"或者"测试样品"包括生物样品，其在获得之后已经以任何方式进行处理，诸如使用试剂处理、增溶或者某些组分诸如蛋白或者聚核苷酸的富集、或者针对切片目的的在半固体或者固体基质中的包埋。对于该目的，组织样品的"切片"是指组织样品的单一部分或者片段，例如来自组织样品的组织或者细胞片段的薄片。
样品包括但不限于原始或者培养的细胞或者细胞系、细胞上清液、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳汁、全血、血液来源细胞、尿、脑脊液、唾液、痰、眼泪、汗液、粘液、肿瘤裂解物以及组织培养液、组织提取物诸如均匀加工处理的组织、肿瘤组织、细胞提取物以及它们的组合。在一个实施方案中，所述样品为临床样品。在另外的实施方案中，所述样品用于诊断测定。在一些实施方案中，所述样品由原始或者转移性肿瘤获得。活组织检查通常用于获得肿瘤组织的代表性片段。可选择地，肿瘤细胞可间接地以已知的或者认为汗液所讨论的肿瘤细胞的组织或者液体的形式获得。例如，肺癌损伤样品可通过切除术、支气管镜检查法、细针抽吸、支气管刷检获得或者由痰、胸膜液或者血液获得。
"引物"通常为短的单链聚核苷酸，其通常具有游离的3'-OH基团，其通过与靶标序列杂交而结合至可能存在于所讨论的样品中的靶标，且此后促进与靶标互补的聚核苷酸的聚合。外部和内部引物或者探针的精确序列由本领域技术人员根据实际分析问题进行选择。例如其可包含与对于待检测或者鉴别的微生物而言特异的DNA序列杂交的序列。例如生物体特异性序列可通过序列数据库比较以及如果需要“调准”来确定。基本上对于通常作为探针的DNA或者核酸没有限制。由于它们已知的优势，也可使用DNA-PNA(肽-核酸)杂交物或者嵌合体。也可使用修饰的核酸(例如dI、dI-生物素、dU、dU-生物素)。
"关联(correlate或者correlating)"是指以任何方式将第一分析或者方案的执行和/或者结果与第二分析或者方案的执行和/或者结果进行比较。例如，可在进行第二方案的过程中使用第一分析或者方案的结果和/或者可使用第一分析或者方案的结果以确定是否应该进行第二分析或者方案。关于基因表达分析或者方案的实施方案，可使用基因表达分析或者方案的结果以确定是否应该进行特定治疗方案。
本申请使用的词语"标记物"是指当直接或者间接与试剂诸如核酸探针或者抗体稠合时的本发明的缀合物，由此便于与其结合或者稠合的试剂的检测。当例如本发明的寡核苷酸-金缀合物与抗体融合时，所述抗体可经所述标记物即包含在寡核苷酸-金缀合物中的金来检测。
本发明的缀合物及其用途：
在一个实施方案中，本发明涉及寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相包含亲硫性金属，其中所述寡核苷酸包含至少一个式I的硫代羰基核碱基，
其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2，其中---表示共价键，且其中所述寡核苷酸经所述硫代羰基核苷酸的硫原子与所述固相结合。
已经发现基于式I的硫代羰基核碱基的硫代羰基核苷酸在合成寡核苷酸中的用途与常规合成操作相容。基于式I的核苷的硫代羰基核苷酸可例如用于寡核苷酸的化学合成中且保护基团可根据标准方案进行断裂。此外，包含一个或者多个式I的核苷酸的寡核苷酸可稳固地结合至亲硫性固相。
其中所述硫代羰基核苷酸为6-脱氮-硫代羰基核苷酸的寡核苷酸具有另外的优势，其相比于6-氮杂核苷酸而言对于任何亲核攻击甚至更稳定。因此在优选的实施方案中，式I中的X为CH。
本发明的亲硫性金属或者金属离子优选选自第11族:(Cu,Ag,Au)；第12族(Cd,Hg)；第13族(Ga,In,Tl)以及第14族(Sn,Pb)金属。
在本发明的一个实施方案中，所述亲硫性金属选自亲硫性贵金属和亲硫性半导体材料。在一个实施方案中，所述寡核苷酸-固相缀合物包含含有一个或者多个式I的硫代羰基核碱基的寡核苷酸以及选自亲硫性贵金属或者包含亲硫性金属的半导体材料的亲硫性固相。
在一个实施方案中，包含在本发明寡核苷酸-固相缀合物中的亲硫性金属为选自铜、银和金的贵金属。在一个实施方案中，所述亲硫性金属选自银和金。在一个实施方案中，金用作亲硫性固相材料。在一个实施方案中，银用作亲硫性固相材料。
如本领域技术人员所认识到的，亲硫性半导体材料可包含选自镉、镓和铟的一种或者多种金属，该金属作为氧化物、硫化物、碲化物或者硒化物存在。在优选的实施方案中，所述亲硫性半导体材料是基于镉或者镓。在优选的实施方案中，所述半导体材料是基于镉。
在一个实施方案中，包含在本发明寡核苷酸-固相缀合物中的亲硫性半导体材料以纳米晶体或者量子点的形式存在。
由于基于式I的核碱基的核苷酸可在合成过程中容易地结合至寡核苷酸，所以目前可以在任何期望位置插入所述核苷酸，且在结合两个或者多个基于式I的核碱基的核苷酸的情况下，其可在由一个所述核苷酸至相邻核苷酸的任何期望距离完成。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸-固相缀合物在亲硫性固体和包含至少两个式I的核碱基的寡核苷酸之间形成。还优选的是，这两个具有式I的核碱基的核苷酸通过至少一个其它核苷酸进行隔开且存在于所述寡核苷酸中的预定位置。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸-固相缀合物在亲硫性固体和包含至少一个式I的核碱基的寡核苷酸之间形成，其中所述寡核苷酸在长度上为至少8个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸-固相缀合物在亲硫性固相和含至少一个具有式I的核碱基的核苷酸的寡核苷酸之间形成，其中所述寡核苷酸在长度上至多为1000个核苷酸。
在一些实施方案中，包含在本发明缀合物中的寡核苷酸分别具有至少9、10、11、12、15、18、21、24、27或者30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，包含在本发明缀合物中的寡核苷酸分别具有不大于1000、500、300、200、150、100、90、80、70、60、50、45、40、35或者30个核苷酸的长度。
本发明的方法：
在一个实施方案中，本发明涉及生成寡核苷酸-固相缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含亲硫性金属的固相，以及(b)使得含有至少一个包含式I的核碱基的硫代羰基核苷酸的寡核苷酸与所述亲硫性固相结合，
其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2且其中--表示共价键。
在一个优选的实施方案中，本发明产生寡核苷酸-固相缀合物的方法使用包含基于式I的核苷的核苷酸的寡核苷酸来进行，其中式I中的X为CH。
本申请披露的产生寡核苷酸-固相缀合物的方法示意性地描述于图1中。
本发明的亲硫性金属或者金属离子优选选自第11族:(Cu,Ag,Au)；第12族(Cd,Hg)；第13族(Ga,In,Tl)以及第14族(Sn,Pb)金属。
在一个实施方案中，本发明披露的方法使用选自亲硫性贵金属和亲硫性半导体材料的亲硫性金属来进行。
在一个实施方案中，在本发明方法中使用的亲硫性金属为选自铜、银和金的贵金属。在一个实施方案中，所述亲硫性金属选自银和金。在一个实施方案中，金用作亲硫性固相材料。在一个实施方案中，银用作亲硫性固相材料。
在优选的实施方案中，在本发明方法中使用的用于产生寡核苷酸-固相缀合物的亲硫性半导体材料选自镉或者镓。在优选的实施方案中，在本发明方法中使用的用于产生寡核苷酸-固相缀合物的半导体材料为镉。
在一个实施方案中，在本发明方法中使用的用于产生寡核苷酸-固相缀合物的亲硫性半导体材料以纳米晶体或者量子点的形式存在。
在一个实施方案中，本申请用于产生寡核苷酸-固相缀合物的方法使用包含至少一个具有式I的核碱基的核苷酸的寡核苷酸来进行，其中所述寡核苷酸在长度上为至少8个核苷酸。
在一个实施方案中，本申请用于产生寡核苷酸-固相缀合物的方法使用包含至少一个具有式I的核碱基的核苷酸的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在长度上为至多1000个核苷酸。
本发明缀合物的用途：
本发明所述的寡核苷酸-固相缀合物可用于许多非常重要的目的。
对于本领域技术人员直接明显的是，在一个实施方案中，本发明所述的寡核苷酸-固相缀合物用于基于核酸杂交的检测方法中。所述用途对于生物传感器中的多重应用而言是最重要的。
在一个实施方案中，本发明所述的寡核苷酸-固相缀合物中的所述固相为选自金纳米颗粒和作为纳米晶体存在的亲硫性半导体材料的纳米颗粒且用作标记物。所述用途类似于例如针对杂交的电化学检测所述的用途(Kafka,J.等人,Electrochimica Acta53(2008)7467-7474)或者针对使用表面等离子体共振的检测所述的用途(Milkani,E.等人,Biosensors&Bioelectronics25(2010)1217-1220)。
其中式I的硫代羰基核碱基为6-脱氮-硫代羰基核苷酸的寡核苷酸可容易地合成，且对于任何亲核进攻是稳定的。
提供下述实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，且其真实的保护范围阐述于随附的权利要求书中。应该理解的是可在阐述的操作中进行修改而不偏离本发明的主旨。
附图说明
图1：图示给出了用于在作为锚分子的包含具有式I的核碱基的硫代羰基核苷的所选实例的寡核苷酸与AuNP之间形成寡核苷酸金缀合物的反应途径。
图2：图示描述了针对基于7脱氮6硫代鸟苷的寡核苷酸的化学合成的构成嵌段的合成步骤。
图3：在图(a)的左侧部分显示了酶消化后获得的寡核苷酸7的酶水解产物的HPLC洗脱分布，且在图(b)的右侧部分显示了包含寡核苷酸7的理论预期的水解产物以及硫代核苷1的合成混合物的HPLC洗脱分布。
图4：显示了(a)未修饰的AuNP溶液(顶部线，由左侧末端开始)、采用硫代核苷1的DNA-AuNP缀合物Au8(中间线)以及含有巯基己基衔接物的DNA-AuNP缀合物Au24(底部线)的UV-VIS光谱；(b)分别在不同时间间隔(0分钟、4小时和12小时)后测量的带有互补的寡核苷酸的DNA-AuNP缀合物Au8·Au9的UV-VIS光谱。
图5：在部分(a)中，给出了在260nm观察到的游离寡核苷酸双链体8·9的解链分布以及分别在520nm记录的组装体Au8·Au9和Au24·Au25的解链分布。在部分(b)中，给出了分别在520nm记录的组装体Au8·Au9、Au15·Au16和Au17·Au18的解链分布。
图6：关于4-硫代-2’-脱氧胸苷(化合物26；在该图中指作1)的水解稳定性的反相HPLC色谱图。(a)4-硫代-2’-脱氧胸苷(1)的HPLC分布。(b)在使用25%氨水在60°C处理1达16小时后获得的HPLC分布。所述化合物通过反相HPLC在260nm在RP-18柱(250x4mm)上进行分析。梯度：0–15分钟0–30%B在A中的溶液，30–40分钟30–40%B在A中的溶液，40–45分钟40–0%B在A中的溶液，流速0.7cm3min-1。该图中的5为5-甲基-2’-脱氧胞苷酸；经共同注射HPLC试验来验证。
图7:关于2-硫代-2’-脱氧胸苷(化合物27；在该图中指作2)的水解稳定性的反相HPLC色谱图。(a)2-硫代-2’-脱氧胸苷(2)的HPLC分布。(b)在使用25%氨水在60°C处理2达16小时后获得的HPLC分布。所述化合物通过反相HPLC在260nm在RP-18柱(250x4mm)上进行分析。梯度：0–15分钟0–30%B在A中的溶液，0–40分钟30–40%B在A中的溶液，40–45分钟40–0%B在A中的溶液，流速0.7cm3min-1。
图8:关于6-硫代-2’-脱氧鸟苷(化合物28；在该图中指作3)的水解稳定性的反相HPLC色谱图。(a)6-硫代-2’-脱氧鸟苷(3)的HPLC分布。(b)在使用25%氨水在60°C处理3达16小时后获得的HPLC分布。所述化合物通过反相HPLC在260nm在RP-18柱(250x4mm)上进行分析。梯度：0–15分钟0–30%B在A中的溶液，30–40分钟30–40%B在A中的溶液，40–45分钟40–0%B在A中的溶液，流速0.7cm3min-1。在该图中的6为2,6-二氨基嘌呤2’-脱氧核糖核苷；经共同注射HPLC试验来验证。
图9:7-脱氮-6-硫代-2’-脱氧鸟苷(化合物1；在该图中指作4)的水解稳定性的反相HPLC色谱图。(a)7-脱氮-6-硫代-2’-脱氧鸟苷(4)的HPLC分布。(b)在使用25%氨水在60°C处理4达16小时后获得的HPLC分布。所述化合物通过反相HPLC在260nm在RP-18柱(250x4mm)上进行分析。梯度：0–15分钟0–30%B在A中的溶液，30–40分钟30–40%B在A中的溶液，40–45分钟40–0%B在A中的溶液，流速0.7cm3min-1。在该图中的7为2,6-二氨基-7-脱氮嘌呤2’-脱氧核糖核苷；经共同注射HPLC试验来验证。
图10:在该图中，显示了对于在寡核苷酸合成中采用的若干不同的硫代羰基核苷酸的不同亚磷酰胺构成嵌段。
图11：在该图中，汇总了关键化合物、使用的序列以及使用所讨论的序列涂覆的各种金颗粒以便于观察和校对。
实施例
方法和试剂的一般信息
所有化学品购自Acros,Fluka或者Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich ChemieGmbH,Deisenhofen,Germany)。5’-巯基改性剂6-(三苯基甲基)-S-(CH2)6O-2-氰基乙基二异丙基亚磷酰胺由Glen Research(Virginia,USA)获得。溶剂为实验室级别。薄层色谱法(TLC)在用硅胶60F254涂覆的铝板,0.2mm层(0.2mm;Merck,Darmstadt,Germany)上进行。柱快速色谱法(FC)在0.4巴在硅胶60H(VWR,Darmstadt,Germany)上进行。UV-Vis光谱：U3200分光光度计(Hitachi,Japan)；λmax以nm计，ε以dm3mol-1计。反相HPLC在具有与可变波长检测器(模型655A)连接的Merck-Hitachi HPLC泵(模型L-6250)的250x4mmPR-18柱(Merck)上进行。NMR光谱：Avance-DPX-300分光计(Bruker,Rheinstetten,Germany)；化学位移(δ)以相对于内部SiMe4(1H,13C)的ppm计。MALDI-TOF质谱使用具有3-羟基脯氨酸(3-HPA)作为基质的AppliedBiosystems Voyager DE PRO分光计记录。微量分析通过MikroanalytischesLabor Beller(,Germany)进行。解链温度曲线使用配备有Cary热电控制器的Cary-100Bio UV-VIS分光光度计(Varian,Australia)测量。来自MembraPure水系(Astacus)的纳米纯水(电导率<0.055μS/cm)用于所有试验。
实施例1:
具有硫基取代基的寡核苷酸
1.1构成嵌段合成
构成嵌段合成也在如下图2和方案2中图示给出。
方案2.试剂和条件：(i)Me3SiCl,苯氧基乙酰氯,吡啶,NH3水,4h,室温；(ii)3-溴丙腈,无水K2CO3,DMF,过夜,室温；(iii)DMTr-Cl,吡啶,3h,室温；(iv)(2-氰基乙基)二异丙基次磷酰氯,N,N-二异丙基乙基胺,无水CH2Cl2,20min,室温。
7-(2-脱氧-β-D-红-戊呋喃糖基)-2-苯氧基乙酰氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-硫酮(2).
将化合物1(1.6g,5.50mmol)与无水吡啶(3×8.0ml)共蒸发，然后混悬于吡啶(15ml)中。经干燥注射器加入三甲基甲硅烷基氯(3.6ml,28.17mmol)并将反应混合物搅拌1小时。经无水注射器加入苯氧基乙酰氯(1.1ml,7.96mmol)并将反应混合物在室温搅拌4小时。将反应容器在冰浴中冷却并在搅拌的同时加入水(5ml)。15分钟后，加入浓氨水(5ml)并将淤浆搅拌另外的15分钟。蒸发溶剂，并将残留物施用于FC(硅胶，柱8×15cm,CH2Cl2/MeOH,50:1→25:1)上。将主要区域产物蒸发，得到2，其为无色泡沫状物(1.9g,80.9%)；mp205℃；Rf=0.53(CH2Cl2/MeOH,9:1)。UV(MeOH):λmax(ε)=333nm(47600)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ=2.15-2.22(m,1H,Hα-2’),2.38-2.47(m,1H,Hβ-2’),3.52(m,2H,H-5’),3.82(m,1H,H-4’),4.35(m,1H,H-3’),4.88(s,2H,Pac-CH2),4.95(t,3J(H,H)=5.3Hz,1H,5’-OH),5.30(d,3J(H,H)=3.6Hz,1H,3’-OH),6.41(m,1H,H-1’),6.64(d,3J(H,H)=3.7Hz,1H,H-5),6.96-7.00(m,3H,苯氧基),7.28-7.34(m,2H,苯氧基),7.49(d,3J(H,H)=3.7Hz,1H,H-6),11.99(s,br,1H,N-H),12.88(s,br,1H,CO-NH)。C19H20N4O5S的分析计算值(416.45)：C,54.80；H,4.84；N,13.45。实测值：C,54.74；H,4.90；N,13.40。
4-[(2-氰基乙基)硫基]-7-(2-脱氧-β-D-红-戊呋喃糖基)-2-苯氧基乙酰氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(3).
将3-溴丙腈(4.0ml,48.07mmol)和无水K2CO3(3.0g,21.71mmol)加至25ml无水二甲基甲酰胺(DMF)并将混合物剧烈搅拌。将化合物2(1.9g,4.45mmol)溶于5ml无水DMF中并在30分钟内逐滴加至搅拌的溶液中。将混合物保持搅拌过夜。将DMF通过与二甲苯共蒸发除去并将残留物应用于FC(硅胶，柱8×15cm,CH2Cl2/MeOH,500:1→100:1)上。蒸发后，主要区域得到3，其为无色固体(1.2g,54.7%)；Rf=0.22(CH2Cl2/MeOH,95:5)。UV(MeOH):λmax(ε)=301nm(26700)；244nm(73300)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ=2.22(m,1H,Hα-2’),2.50(m,1H,Hβ-2’),3.16(t,2H,CH2-CN),3.51-3.56(m,4H,H-5’,H-5’’,CH2-S),3.84(m,1H,H-4’),4.37(m,1H,H-3’),4.94(t,3J(H,H)=5.4Hz,1H,5’-OH),5.00(s,2H,Pac-CH2),5.32(d,3J(H,H)=5.3Hz,1H,3’-OH),6.55(m,2H,H-5,H-1’),6.95(m,3H,苯氧基),7.31(m,2H,苯氧基),7.65(d,3J(H,H)=3.9Hz,1H,H-6),10.69(s,1H,CO-NH)。C22H23N5O5S的分析计算值(469.51)：C,56.28；H,4.94；N,14.92。实测值：C,56.18；H,4.98；N,14.89。
4-[(2-氰基乙基)硫基]-7-[2-脱氧-5-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-红-戊呋喃糖基]-2-苯氧基乙酰氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(4).
将化合物6(469.5mg,1.00mmol)与无水吡啶(3×5.0ml)共蒸发，然后溶于吡啶(5.0ml)中。向该溶液中加入4,4’-二甲氧基三苯基甲基氯(DMT-Cl)(440.5mg,1.30mmol)并将混合物在室温搅拌3小时。通过加入MeOH将反应混合物淬灭并将混合物蒸干。将混合物溶于CH2Cl2(3.0ml)中并应用于FC(柱4×10cm,用CH2Cl2/丙酮洗脱,20:1)上得到4，其为无色泡沫状物(555.8mg,72%)；Rf=0.61(CH2Cl2/MeOH,95:5)。UV(MeOH):λmax(ε)=302nm(14400)；240nm(53500)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ=2.29(m,1H,Hα-2’),2.59(m,1H,Hβ-2’),3.16(m,4H,CH2-CN,H-5’,H-5”),3.54(m,2H,CH2-S),3.71(s,6H,OCH3),3.95(m,1H,H-4’),4.37(m,1H,H-3’),5.00(s,2H,Pac-CH2),5.37(d,3J(H,H)=4.2Hz,1H,3’-OH),6.52-6.56(m,2H,H-5,H-1’),6.78-7.35(m,18H,苯氧基),7.46(d,3J(H,H)=3.6Hz,1H,H-6),10.69(s,1H,CO-NH)。C43H41N5O7S的分析计算值(771.27)：C,66.91；H,5.35；N,9.07。实测值：C,67.05,H,5.20；N,9.17。
4-[(2-氰基乙基)硫基]-7-[2-脱氧-5-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-β-D-红-戊呋喃糖基]-2-苯氧基乙酰氨基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶3’-[(2-氰基乙基)-N,N-二异丙基亚磷酰胺](5).
在氩气下将化合物4(555.8mg,0.72mmol)溶于无水CH2Cl2(3.0ml)中并与(2-氰基乙基)二异丙基次磷酰氯(225μl,0.95mmol)在iPr2EtN(220μl,1.27mmol)的存在下在室温反应。20分钟后，将反应混合物用CH2Cl2稀释并将溶液用5%NaHCO3水溶液、盐水洗涤。将有机溶液经无水Na2SO4干燥，滤过并浓缩。将残留物应用于FC(柱4×10cm,CH2Cl2/丙酮,25:1)上得到5，其为无色泡沫状物(429.1mg,61.3%)；Rf=0.64(CH2Cl2/丙酮,95:5)。31P NMR(300MHz,CDCl3-d6):δ=148.6；148.7。
所有化合物通过UV-光谱、1H-和13C-NMR光谱以及元素分析(表1和实验部分)表征。糖部分和保护基团的13C NMR化学位移的归属根据门控去偶光谱与已经确定的数据(Christopherson,M.S.and Broom,A.D.,Nucleic AcidsRes.19(1991)5719-5724)组合来得到。
表1.6-硫基-7-脱氮-2'-脱氧鸟苷衍生物的13C-NMR化学位移(δ)a
a在DMSO-d6中在298K测量。b系统编号。c嘌呤编号。d与DMSO信号重叠。
1.2寡核苷酸合成、寡核苷酸的纯化和表征
1.2.1寡核苷酸的合成
寡核苷酸在自动DNA合成器,模型392-08(ABI392,AppliedBiosystems,Weiterstadt,Germany)中以1μmol等级采用标准亚磷酰胺以及亚磷酰胺5根据所述的寡核苷酸固相合成的标准操作(Seela,F.,Budow,S.,Helv.Chim.Acta89(2006)1978-1985)来合成。在与固体载体断裂后，将所述寡核苷酸在25%氨水溶液中在60°C脱保护达12-16小时。
1.2.2寡核苷酸的纯化
含有硫基核苷1的寡核苷酸的纯化首先在DMT-on模式的反相HPLC(Merck-Hitachi-HPLC；RP-18柱；梯度系统[A:0.1M(Et3NH)OAc(pH7.0)/MeCN95:5；B:MeCN]:3分钟,20%B在A中的溶液,12分钟,20-50%B在A中的溶液，以及25分钟,20%B在A中的溶液，流速为1.0ml/min)上进行。将溶液干燥并在0°C用2.5%CHCl2COOH–CH2Cl2(400μl)处理5分钟，除去4,4’-二甲氧基三苯甲基残留物。将去三苯甲基化的寡聚体再次经反相HPLC[梯度：0-20分钟0-20%B在A中的溶液；流速1ml/min]纯化。将所述寡聚体在短柱(RP-18,硅胶)上进行脱盐并在Speed-Vac蒸发器上低压冻干，得到无色固体，将其在-24°C冷冻。HPLC(梯度：0-25分钟0-20%A在B中的溶液；流速1.0ml/min)。
1.2.3通过质谱进行寡核苷酸的表征
MALDI-TOF质谱使用具有3-羟基吡啶-2-甲酸(3-HPA)作为基质的Applied Biosystems Voyager DE PRO分光计来记录。
在完全脱保护以及HPLC纯化、随后脱盐之后将寡核苷酸进行表征。在所有情况下，计算值与测量值良好符合(表2)。
表2.在该研究中使用的寡核苷酸以及经MALDI-TOF质谱确定的分子量
间隔物T10=TTT TTT TTT T.
1.2.4通过酶消化进行寡核苷酸的表征
寡核苷酸的酶水解如Seela和Becher(Seela,F.,Becher,G.,Nucleic AcidsRes.29(2001)2069-2078)所述使用蛇毒磷酸二酯酶(EC3.1.15.1,东部钻纹响尾蛇(Crotallus adamanteus))和碱性磷酸酶(EC3.1.3.1,来自RocheDiagnostics GmbH,Germany的大肠杆菌)在0.1M Tris-HCl缓冲剂(pH8.5)在37°C进行且在反相HPLC上进行。(a)在酶消化后获得的寡核苷酸7的酶水解产物以及(b)寡核苷酸7和硫基核苷1的理论预测的水解产物的人工混合物的HPLC洗脱分布显示于图3中。柱和洗脱条件为：RP-18(200x10mm)；洗脱[A:0.1M(Et3NH)OAc(pH7.0)/MeCN95:5；B:MeCN]:对于(a)和(b)而言25分钟A，40分钟0-65%B在A中的溶液；对于(c)和(d)而言100%A；流速：0.7ml/min。
分别由图3(a)和图3(b)的比较而明显的是，蛇毒磷酸二酯酶并未由硫基核苷酸1断裂。
实施例2:
修饰的金纳米颗粒的合成及其表征
2.1金纳米颗粒溶液的制备
15nm金纳米颗粒溶液由HAuCl4溶液通过枸橼酸盐还原来制备，如最初在Turkevich,J.等人,Discuss.Faraday Soc.11(1951)55中所报道的且如之后Letsinger和Mirkin(Storhoff,J.J.等人,J.Am.Chem.Soc.120(1998)1959-1964,and Jin,R.等人,J.Am.Chem.Soc.125(2003)1643)所述。所有玻璃器皿在王水(3份HCl,1份HNO3)中清洁，用纳米纯水淋洗，然后在使用前烘箱干燥。在搅拌下使得含水HAuCl4(1mM,250ml)回流。然后，快速加入38.8mM枸橼酸钠(25ml)。溶液颜色由黄色变为红色，且继续回流15分钟。冷却至室温后，将红色溶液经Micron Separations Inc.1微米滤器滤过。
2.2使用具有核苷1的寡核苷酸制备修饰的金纳米颗粒溶液
将金纳米颗粒(～6nM)使用各种含有核苷1的寡核苷酸在其序列范围内的不同位置进行官能化。DNA-AuNPs缀合物通过使得1ml所述金纳米颗粒溶液与纯化的寡核苷酸溶液(最终寡核苷酸浓度为3μM)混合来制备。偶联反应在略微高温(40°C)进行。静置20小时后，在持续搅拌下加入5μl2M NaCl、0.2mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，使得胶体溶液含有0.01M的NaCl，静置6-8小时。随后将胶体成盐为0.02M且老化另外的6-8小时，然后成盐为0.05M，静置6-8小时，且最终成盐为0.1M NaCl。随后，将DNA金纳米颗粒溶液离心并取出澄清上清液，除去未结合的寡核苷酸。将沉淀物重新分散于1ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中。孵育(24小时,40°C)后，将缀合物溶液再次用相同缓冲剂洗涤，最终得到1ml的DNA-AuNPs缀合物。
实施例3:
使用硫基核苷1作为衔接物对DNA-金纳米颗粒缀合物进行杂交
在典型试验中，使得含有DNA-AuNP缀合物的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐,pH7缓冲溶液与含有具有互补寡核苷酸的DNA-AuNP缀合物的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐,pH7缓冲溶液混合在一起(相同浓度)。将含有两种DNA-AuNP缀合物的溶液孵育过夜。在该过程中，互补寡核苷酸AuNP缀合物的缓慢杂交的发生由伴有红色至紫色颜色变化的细胞质基因组共振条带的缓慢红移和增宽所证实。最终，观察到DNA金纳米颗粒网状结构的沉淀，生成澄清的上清液和深色沉淀物。强烈振摇DNA-AuNP溶液后，深色沉淀物可重新分散，生成UV/VIS最大值为约564nm的紫色溶液。
实施例4:
金表面上的寡核苷酸的固定
4.1寡核苷酸杂交
溶液中具有硫基核苷1的寡核苷酸双链体的杂交性质
原则上，当7-脱氮-6-硫基-2’-脱氧鸟苷(1)用作寡核苷酸与金纳米颗粒结合的锚基时，可选择寡核苷酸序列范围内的任何位置。因此已经选择了用于结合的若干不同的修饰位点。熟知的是，硫原子的松散性(bulkiness)可干扰杂交。为了澄清，使用结合化合物1的游离寡核苷酸进行杂交研究。
相比于母体未修饰的双链体5’-d(TAG GTC AAT ACT)(10)·3’-d(ATCCAG TTA TGA)(11)而言，在12-mer双链体的中心或者外周中的核苷1的单一替代降低了双链体的稳定性(表3)。当1结合至寡核苷酸双链体的中心(10·7:ΔTm=-7°C)时，与其结合至寡核苷酸双链体的外周(10·12:ΔTm=-3°C)相比，效果是更显著的。多重修饰导致显著的进一步脱稳定化(对于13·14，ΔTm=-30°C)(表3)。一致的是，相比于母体未修饰的双链体(19·20)而言，在24-mer双链体的中心或者外周(21·22,23·6)范围内的两个硫基核苷(1)的结合导致了双链体稳定性的强烈降低。相反地，在含有一个或者多个硫基核苷1作为悬垂末端的结合物双链体8·9、15·16和17·18中，未观察到双链体的脱稳定化(destabilization)。
表3.含有与规则核苷相反的或者作为悬垂末端的核苷1的寡核苷酸双链体的Tm值和热力学数据a
a在260nm在具有5μM单链浓度的0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中测量。bΔTm如Tm 碱错位-Tm 碱匹配计算。间隔物T10=TTT TTT TTT T。
4.2寡核苷酸金纳米颗粒缀合物的制备
15nm金纳米颗粒溶液由HAuCl4溶液通过枸橼酸盐还原根据Turkevich所报道的方案以及随后Letsinger和Mirkin(Elghanian,R.,等人,Science277(1997)1078-1081；Mirkin,C.A.等人,Nature283(1996)607-609；Turkevich,J.等人,Discuss.Faraday Soc.11(1951)55)所述的方案来制备。使用ε520=4.2x108M-1cm-1(UV/VISmax:520nm)将纳米颗粒浓度确定为约6.0nM(Demers,L.M.等人,Anal.Chem.72(2000)5535-5541)。未修饰的金纳米颗粒溶液的UV/VIS光谱显示于图4a中。未修饰的AuNPs使用表4中显示的寡核苷酸进行官能化。
表4.用于与AuNPs结合的单链寡核苷酸
间隔物T10=TTT TTT TTT T.
DNA-AuNP缀合物Au8和Au18以及Au21和Au6(分别在表3和4中)分别通过使1ml金纳米颗粒溶液与纯化的寡核苷酸水溶液(1-5μl)混合来制备，得到3μM的最终寡核苷酸浓度。偶联反应在略微高温(40°C)进行。静置24小时后，在持续搅拌下加入5μl2M NaCl、0.2mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)，使得DNA-AuNP溶液具有0.01M的NaCl浓度。使用磷酸盐缓冲剂(2M NaCl,0.2mM磷酸盐缓冲剂,pH7.0)将DNA-AuNP溶液的NaCl浓度逐步增加为0.1M的最终NaCl浓度。将DNA-AuNP缀合物用0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)洗涤两次，除去未结合的寡核苷酸。最终，将DNA-AuNP缀合物分散于1ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中。在整个操作过程中，DNA金纳米颗粒溶液保持在深红色。此外，所得的DNA-AuNP缀合物Au8、Au18和Au21、Au6分别显示了约525nm的预期细胞质基因组共振，这表明其为非聚集状态(表5,图4a)。对于比较，采用先前由他处报道的常规方案(Hurst,S.J.等人,Anal.Chem.78(2006)8313-8318；Seela,F.等人,Chem.Biodiv.2(2005)84-91)使得结合5’-己基巯基衔接物的寡核苷酸24和25与AuNPs结合(→分别为Au24,Au25,表5)。采用1作为锚分子的DNA-AuNP缀合物Au8的UV/VIS光谱显示细胞质基因组共振(526nm)，其非常接近于针对使用可商购得到的己基巯基衔接物作为锚基团的缀合物Au24(523nm)所观察的细胞质基因组共振(图4)。
有趣的且需要指出的是，分别针对DNA-AuNP缀合物Au21和Au6(其中所述寡核苷酸经硫基核苷1的内部位置与AuNPs结合)所报道的UV/VIS光谱在性质上与分别针对其中锚分子位于末端位置的DNA-AuNP缀合物Au8和Au18以及Au24和Au25所观察的光谱相同(表5)。
发现所有DNA-AuNP缀合物在0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂溶液(pH7.0)中是稳定的；未观察到伴有UV/VIS最大值的位移的颗粒的聚集。这是重要的性质，这是因为非官能化的金纳米颗粒溶液经历不可逆的聚集，随后在几分钟内在含有NaCl的缓冲溶液中沉淀(Mirkin,C.A.等人,Nature283(1996)607-609)。
两个结果，即(i)约523-526nm的UV/VIS最大值以及(ii)0.1M NaCl磷酸盐缓冲剂溶液的稳定性可认为是寡核苷酸经7-脱氮-6-硫基-2’-脱氧鸟苷(1)的共价连接的有力证据。由此的化合物1的任何位置(在寡核苷酸的5’-或者3’-末端或者在内部位置)允许稳定的DNA-AuNP缀合物的构建。
表5.包含各种类型的寡核苷酸的金纳米颗粒缀合物以及UV/VIS吸收的最大值
间隔物T10=TTT TTT TTT T.
4.3组装的DNA金纳米颗粒缀合物的杂交试验
在该系列试验中，研究了结合硫基核苷1的DNA-AuNP缀合物的杂交性质并将其与由带有5’-己基巯基衔接物的DNA-AuNP缀合物获得的性质相比较。在典型的试验中，使带有具有互补序列的寡核苷酸的两个DNA-AuNP缀合物探针混合在一起(0.1M NaCl、10mM磷酸盐,pH7.0中浓度相同)，例如DNA-AuNP缀合物Au8和Au9。将混合物进行孵育。在该过程中，与金纳米颗粒连接的互补的寡核苷酸出现缓慢杂交；其通过伴有红色至紫色颜色变化的细胞质基因组共振条带的VIS最大值的红移(Au8·Au9:526nm→546nm)以及增宽来证实(图4b)。最终，观察到DNA金纳米颗粒网状结构的沉淀，这得到澄清的上清液以及深红色沉淀物。杂交样品是相当稳定的，其可重新分散但其甚至在剧烈振摇后仍保持紫色。因此，甚至在DNA-AuNP沉淀物的剧烈振摇之后，仍然得到UV/VIS最大值为564nm的紫色溶液(Au8·Au9)。
4.4杂交的DNA-AuNP缀合物的解链(melting)试验
解链试验使用由带有互补的寡核苷酸的DNA-AuNP缀合物形成的组装物来进行。对于此，将该组装的DNA-AuNP缀合物溶液加热(15°C→75°C)并且在搅拌DNA-AuNP溶液的过程中观察到在520nm的VIS吸收变化。通过获取解链转变的第一衍生物的最大值来确定Tm值且将其列于表6中。
Au8·Au9的典型的陡的解链分布显示于图5a中，其表明对于由双链体8·9组装的Au纳米颗粒的三维交联网状结构的Tm值为54°C。为了比较，将由具有互补的寡核苷酸以及巯基己基衔接物的缀合物Au24和Au25形成的网状结构的离解(dissociation)在与针对Au8·Au9组装物所述完全相同的条件下进行研究。针对Au24·Au25，Tm值确定为53°C(表6)。
对于具有巯基己基衔接物(Au24·Au25)或者硫基核苷1(Au8·Au9)的两个组装物，如图5a所示检测到了具有非常狭窄的解链转变(约4°C的范围)的解链分布，而对于游离寡核苷酸双链体8·9，在非常宽的温度范围(约20°C)内发生解链(图5a)。该发现与其它报道先前观察到的一致，所述其它报道为与金纳米颗粒共价结合的寡核苷酸显示了网状双链体的高度配合解链性质，其由变陡的解链转变所反映(Jin,R.等人,J.Am.Chem.Soc.125(2003)1643-1654；Taton,T.A.等人,Science289(2000)1757-1760)。
表6.DNA-AuNP组装物的Tm值a,b,c.
a在520nm在0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中测量，对于每种DNA-AuNP缀合物溶液的A520=2.1。直径的金纳米颗粒。c间隔物T10=TTTTTT TTT T。n.m.未观察到解链。
此外，使得用多个5’-悬垂的硫基核苷1官能化的AuNPs与带有互补的寡核苷酸的DNA-AuNP缀合物(→Au15·Au16,Au17·Au18)杂交。如在表6中显示，这些缀合物组装物显示了非常相似的Tm值(Au15·Au16:Tm=50°C；Au17·Au18:Tm=51°C)。相比于其中每个寡核苷酸链仅带有一个硫基核苷(1)的组装物Au8·Au9所实测的Tm值，这些数值低了3-4°C但仍然在相同范围内。Au8·Au9、Au15·Au16和Au17·Au18的解链分布显示于图5b中，其显示了狭窄的解链转变范围(约4°C)。
还研究了带有在序列范围内的不同内部位置使用硫基核苷1作为锚分子的24-mer寡核苷酸的DNA-AuNP组装物的解链行为(Au21·Au22,Au23·Au6)。这些寡核苷酸包括双倍重复识别序列，其允许形成24个碱基对或者部分杂交(12个碱基对)。对于具有位于24-mer寡核苷酸序列外周的硫基核苷1的组装物Au21·Au22的Tm值检测为53°C。该Tm值指向为DNA-AuNP组装物内的寡核苷酸的部分杂交，如在表6条目5所显示，诸如(i)具有碎片(fraying)末端且仅在双链体的中心进行碱基配对的完全匹配的双链体或者(ii)双链体的部分杂交，留下未配对的核苷作为识别位点和金纳米颗粒之间的间隔物。
相反地，同样采用互补的寡核苷酸但其中化合物1位于每个寡核苷酸中心的紧密相关的DNA-AuNP缀合物Au23和Au6不能形成DNA-AuNP交联网状结构。甚至孵育过夜也不能导致组合的缀合物溶液的颜色变化且未观察到VIS最大值的移位。因此，未发生聚集。该结果证实了识别位点和金纳米颗粒之间的距离对于组装物形成是必须的。
实施例5:
各种硫代羰基核苷在脱保护条件下的稳定性
若干核苷(1,26-28)的硫代羰基的稳定性在碱性溶液中进行测试(标准寡核苷酸脱保护条件：25%氨水,14-16h,60°C)。
硫代羰基核苷1、26–28在标准脱保护条件(25%氨水,14-16h,60°C)下的水解稳定性通过反相HPLC(RP-18,250x4mm)监测。将核苷1、26-28(各约1mg)在密封容器中溶于1ml25%氨水溶液中并在60°C孵育。16小时孵育后，蒸发除去氨水并将残留物重新溶于1ml HPLC缓冲剂A中。将各50μl样品注射至HPLC装置中并在260nm记录光谱。使用下述溶剂梯度系统：[A:0.1M(Et3NH)OAc(pH7.0)/MeCN95:5；B:MeCN；梯度：0–15分钟0–30%B在A中的溶液，30–40分钟30–40%B在A中的溶液，40–45分钟40–0%B在A中的溶液，流速0.7cm3min-1]。根据峰面积对组分进行定量，将所述峰面积除以核苷在HPLC缓冲剂A中的消光系数(ε260)。
使用下述核苷的消光系数(ε260)：26(1500)、27(6300)、28(7300)和1(10100)。
由表7以及相应的图6-9明显的是，核苷27、28和1显示了适当的稳定性，而发现核苷26相对不稳定。
表7.在氨水中在60°C孵育16小时之后硫代羰基核苷1、26-28的转化
实施例6:
结合不同硫代羰基核苷的各种寡核苷酸与金纳米颗粒的缀合
6.1寡核苷酸的合成、纯化和表征
将含有核苷1、26-28的一系列寡核苷酸(8-9,32-37)(参见表8)在固相上以1μm规模使用常规亚磷酰胺以及亚磷酰胺5、38-40(参见图10)按照3’-(2-氰基乙基)-亚磷酰胺化学方案进行合成。在与固体载体断裂后，将含有27或者1的寡核苷酸在25%氨水溶液中在60°C(标准脱保护条件)进行脱保护达14-16小时。将结合26或者28的寡核苷酸在含有50mM NaSH的25%氨水溶液中在室温(厂商推荐的条件)进行脱保护。将含有DMT的寡核苷酸在反相HPLC上以DMT-on方式进行纯化(Merck-Hitachi-HPLC；RP-18柱)，采用以下梯度系统：[A:0.1M(Et3NH)OAc(pH7.0)/MeCN95:5；B:MeCN]:3分钟20%B在A中的溶液，12分钟20-50%B在A中的溶液，以及25分钟20%B在A中的溶液，流速1.0ml/min。蒸发溶剂并将寡核苷酸用2.5%Cl2CHCOOH/CH2Cl2(400μl)在0°C处理5分钟，除去4,4’-二甲氧基三苯甲基残基。将去三苯甲基化的寡聚体再次经反相HPLC纯化[梯度：0-20分钟0-20%B在A中的溶液；流速1ml/min]。将寡聚体在短柱(RP-18,硅胶)上使用对于盐洗脱的H2O进行脱盐，同时将寡聚体用MeOH/H2O(3:2)洗脱。将寡核苷酸在Speed-Vac蒸发器上低压冻干，得到无色固体，将其在-24°C冷冻。
通过MALDI-TOF质谱法以线性阴性模式确定寡核苷酸8-9、32-37的分子量。检测质量与计算值相同(表8)。
表8.用于与AuNPs结合的单链寡核苷酸
间隔物T10=5’-d(TTT TTT TTT T).
6.2采用硫代羰基核苷作为锚分子的寡核苷酸金纳米颗粒缀合物的一般制备方法
15nm金纳米颗粒溶液由HAuCl4溶液根据Turkevich所报道的以及之后如Letsinger和Mirkin(Mirkin,C.A.等人,Nature283(1996)607-609；Elghanian,R.,等人,Science277(1997)1078-1081；Turkevich,J.等人,Faraday Soc.11(1951)55-75)所述的方案通过枸橼酸盐还原来制备。将金纳米颗粒(～3nM)用在其5’-末端含有硫代羰基核苷1、26-28中的一个的寡核苷酸8-9、32-37进行官能化(表2)。DNA-AuNPs缀合物通过使得1ml金纳米颗粒溶液与纯化的寡核苷酸溶液(最终寡核苷酸浓度为3μM)混合来制备。偶联反应在略微高温(40°C)进行。静置20小时后，在持续搅拌下加入5μl2M NaCl、0.2mM磷酸盐缓冲剂溶液(pH7.0)，使得纳米颗粒溶液的NaCl浓度增加至0.01M。将溶液在40°C孵育6-8小时。重复进行该操作三次，使得纳米颗粒缀合物溶液的NaCl浓度由0.02M逐步增加至0.05M以及最终的0.1M NaCl。在此之间，通常使溶液在40°C老化6-8小时。随后，将DNA金纳米颗粒溶液离心(8000rpm)并取出澄清的上清液，除去未结合的寡核苷酸。将沉淀物重新分散于1ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂溶液(pH7.0)中。孵育(24h,40°C)后，将纳米颗粒溶液再次使用相同缓冲剂(0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂,pH7.0)洗涤，最终得到1ml DNA-AuNPs缀合物Au8-Au9、Au32-Au37。
表9.用于金纳米颗粒缀合物形成的硫代羰基核苷1、26-28的适用性
a稳定的寡核苷酸金纳米颗粒缀合物在0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂,pH7.0中获得。b稳定的寡核苷酸金纳米颗粒缀合物在0.2M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂,pH7.0中获得。c杂交试验在0.1M NaCl、10mM磷酸盐缓冲剂,pH7.0中进行，孵育时间为过夜。*DNA金纳米颗粒网状结构的形成极缓慢地发生且需要若干天。间隔物T10=5’-d(TTT TTT TTT T).
直径的金纳米颗粒.
6.2.14-硫基-2’-脱氧胸苷的试验细节
含有4-硫基-2’-脱氧胸苷(26)的寡核苷酸32和33的UV-VIS光谱显示了由于核苷26的硫代羰基导致的在337nm的特征UV吸收(针对26所报道的文献值：335nm；Fox,J.J.等人,J.Am.Chem.Soc.81(1959)178-187)(图9a)。具有寡核苷酸32或者33的DNA-AuNPs如上所述制备。所得的DNA-AuNP缀合物Au32和Au33显示了在524nm的细胞质基因组共振，这表明了非聚集状态。DNA-AuNP缀合物Au32和Au33的稳定性进一步在0.2M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液中进行测试。在0.2M NaCl的存在下在玻璃容器中孵育过夜后，两种缀合物均显示了在524.5nm的细胞质基因组共振。然而，发现了显著量的DNA-AuNP缀合物粘附在容器的玻璃表面。由于这个原因，DNA-AuNP缀合物溶液的吸光度高度由原始值减少了约36%。基于该结果，使用4-硫基-2’-脱氧胸苷(26)作为锚分子的DNA-AuNP缀合物在0.2M NaCl的存在下被归类为不稳定的(参见表9,条目1)。
接下来，研究了结合硫基核苷26的寡核苷酸AuNP缀合物的杂交性质。在典型的试验中，使得含有DNA-AuNP缀合物Au32的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液以及含有DNA-AuNP缀合物Au33的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液混合在一起(相同浓度)。将含有DNA-AuNP缀合物Au32和Au33的溶液孵育过夜。在该过程中，发生了互补的寡核苷酸AuNP缀合物Au32和Au33的缓慢杂交，其通过伴有红色至紫色颜色变化的细胞质基因组共振条带的缓慢红移(524nm→548nm)和增宽来证实。最终，观察到DNA金纳米颗粒网状结构的沉淀，其导致了澄清的上清液以及深色沉淀物。在剧烈振摇DNA-AuNP溶液之后，所述沉淀物可重新分散，这得到UV/VIS最大值为548nm的紫色溶液。
6.2.22-硫基-2’-脱氧胸苷的试验细节
寡核苷酸34和35的UV光谱显示了在264nm仅有一个吸收最大值(针对27所报道的文献值：264nm；Vorbrueggen,H.等人,Chem.Ber.106(1973)3039-3061)。具有寡核苷酸34或者35的DNA-AuNPs如上所述制备。所得的DNA-AuNP缀合物Au-16和Au-17显示了在524nm的细胞质基因组共振，这表明了在0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液中为非聚集状态。然而，在0.2M NaCl(10mM磷酸盐pH7缓冲剂)的存在下，立即发生聚集(溶液变为黑色)以及随后的沉淀。基于该结果，使用2-硫基-2’-脱氧胸苷(27)作为锚分子的DNA-AuNP缀合物在0.2M NaCl的存在下被归类为不稳定的(参见表9,条目2)。
接下来，测试了结合硫基核苷27的寡核苷酸AuNP缀合物的杂交。在典型的试验中，使得含有DNA-AuNP缀合物Au34的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液以及含有DNA-AuNP缀合物Au35的0.5ml0.1MNaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液混合在一起(相同浓度)。使得含有DNA-AuNP缀合物Au34和Au35的溶液孵育过夜。未观察到DNA-AuNP缀合物溶液的颜色变化。含有互补的缀合物Au34和Au35的DNA-AuNP溶液的UV/VIS光谱显示了在524nm的细胞质基因组共振，这表明了非聚集状态。
6.2.36-硫基-2’-脱氧鸟苷的试验细节
含有6-硫基-2’-脱氧鸟苷(28)的寡核苷酸36和37的UV-VIS光谱显示了由于核苷28的硫代羰基导致的在343nm的特征UV吸收(针对28所报道的文献值：341nm；Iwamoto,R.H.等人,J.Med.Chem.6(1963)684-688)。具有寡核苷酸36或者37的DNA-AuNPs如上所述制备。然而，发现具有36或者37的DNA-AuNP缀合物的制备遇到了困难。寡核苷酸36和37与AuNP的结合失败了若干次(50%失败率)。同样，离心速度需要显著地由8000rpm(标准速度)降低至5800rpm，另外不能重新分散沉淀物。
所获得的DNA-AuNP缀合物Au36和Au37显示了在524nm的细胞质基因组共振，这表明了非聚集状态。DNA-AuNP缀合物Au36和Au37的稳定性进一步在0.2M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液中进行测试(图13)。在0.2M NaCl的存在下在玻璃容器中孵育过夜后，两种缀合物均显示了在525nm的细胞质基因组共振。仅少量的DNA-AuNP缀合物粘附在容器的玻璃表面。DNA-AuNP缀合物溶液的吸光度高度由原始值降低了10-14%(图13)。基于该结果，使用6-硫基-2’-脱氧鸟苷(28)作为锚分子的DNA-AuNP缀合物在0.2M NaCl的存在下被归类为稳定的(参见表9,条目3)。
接下来，研究了结合硫基核苷28的寡核苷酸AuNP缀合物的杂交性质。在典型的试验中，使得含有DNA-AuNP缀合物Au36的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液以及含有DNA-AuNP缀合物Au37的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液混合在一起(相同浓度)。使得含有DNA-AuNP缀合物Au36和Au37的溶液孵育过夜。仅观察到DNA-AuNP缀合物溶液的轻微的颜色变化。含有互补的缀合物Au36和Au37的DNA-AuNP溶液的UV/VIS光谱显示了细胞质基因组共振条带的红移(524nm→538nm)，吸光度降低以及细胞质基因组共振条带的略微增宽。但并未观察到如4-硫基-2’-脱氧胸苷(26)或者7-脱氮-6-硫基-2’-脱氧鸟苷(1)所述的在孵育过夜之后的DNA-AuNPs的沉淀(参见部分6.2.1和6.2.4)。仅在若干天后(约1周)，观察到DNA金纳米颗粒网状结构的沉淀，这导致了澄清的上清液以及深色的沉淀物。在剧烈振摇DNA-AuNP溶液之后，沉淀物可重新分散，这得到了UV/VIS最大值为549.5nm的紫色溶液。
6.2.47-脱氮-6-硫基-2’-脱氧鸟苷的试验细节
含有7-脱氮-6-硫基-2’-脱氧鸟苷(1)的寡核苷酸8和9的UV-VIS光谱显示了由于核苷1的硫代羰基所导致的在345nm的特征UV吸收(针对1所报道的文献值：345nm；Seela,F.等人,Liebigs Ann.Chem.1(1987)15)。具有寡核苷酸8或者9的DNA-AuNPs如上所述制备。所得的DNA-AuNP缀合物Au8和Au9显示了在524nm的细胞质基因组共振，这表明了非聚集状态。DNA-AuNP缀合物Au8和Au9也重新分散于0.2M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液中。
在0.2M NaCl的存在下在玻璃容器中孵育过夜后，两种缀合物均显示了在524.5nm的细胞质基因组共振。仅少量的DNA-AuNP缀合物粘附在容器的玻璃表面。DNA-AuNP缀合物溶液的吸光度高度由原始值降低了10-14%。基于该结果，使用7-脱氮-6-硫基-2’-脱氧鸟苷(1)作为锚分子的DNA-AuNP缀合物在0.2M NaCl的存在下被归类为稳定的(参见表9,条目4)。
接下来，研究了结合硫基核苷1的寡核苷酸AuNP缀合物的杂交性质。在典型的试验中，使得含有DNA-AuNP缀合物Au8的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液以及含有DNA-AuNP缀合物Au9的0.5ml0.1M NaCl、10mM磷酸盐pH7缓冲溶液混合在一起(相同浓度)。使得含有DNA-AuNP缀合物Au8和Au9的溶液孵育过夜。在该过程中，发生了互补的寡核苷酸AuNP缀合物Au8和Au9的缓慢杂交，其通过伴有红色至紫色颜色变化的细胞质基因组共振条带的缓慢红移(524nm→567nm)和增宽来证实。最终，观察到DNA金纳米颗粒网状结构的沉淀，这导致了澄清的上清液以及深色沉淀物。在剧烈搅拌DNA-AuNP溶液之后，沉淀物可重新分散，这得到了UV/VIS最大值为567nm的紫色溶液。
由以上汇总的试验(特别参见表9)将认识到，寡核苷酸-金缀合物(其中寡核苷酸包含基于式I的核苷(例如表9的物质1和28)的硫代羰基核苷酸)至少在某些技术方面优于寡核苷酸-金缀合物(其中寡核苷酸包含现有技术已知的硫代羰基核苷酸(例如表9的物质26和27))。

Claims (32)

1.寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相包含亲硫性金属，其中所述寡核苷酸包含至少一个式I的硫代羰基核碱基，
其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2，其中---表示共价键，且其中所述寡核苷酸经所述硫代羰基核苷酸的硫原子与所述固相结合。
2.权利要求1的寡核苷酸-固相缀合物，其中式I中的X为CH。
3.权利要求1的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述包含亲硫性金属的固相选自亲硫性贵金属或者包含亲硫性金属的半导体纳米晶体。
4.权利要求2的寡核苷酸-固相缀合物，其中是所述包含亲硫性金属的固相选自亲硫性贵金属或者包含亲硫性金属的半导体纳米晶体。
5.权利要求1的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述包含亲硫性金属的固相为选自金和银的贵金属。
6.权利要求2的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述包含亲硫性金属的固相为选自金和银的贵金属。
7.权利要求3的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述包含亲硫性金属的固相为选自金和银的贵金属。
8.权利要求4的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述包含亲硫性金属的固相为选自金和银的贵金属。
9.权利要求5的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为金。
10.权利要求6的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为金。
11.权利要求7的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为金。
12.权利要求8的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为金。
13.权利要求1的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
14.权利要求2的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
15.权利要求3的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
16.权利要求4的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
17.权利要求5的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
18.权利要求6的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
19.权利要求7的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
20.权利要求8的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述固相为金纳米颗粒。
21.权利要求5的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为作为固体载体上的层而存在的金。
22.权利要求6的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为作为固体载体上的层而存在的金。
23.权利要求7的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为作为固体载体上的层而存在的金。
24.权利要求8的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述金属为作为固体载体上的层而存在的金。
25.权利要求1的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述包含亲硫性金属的固相为亲硫性半导体材料。
26.权利要求25的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述亲硫性半导体材料作为纳米晶体而存在。
27.权利要求1-26中任一项的寡核苷酸-固相缀合物，其中所述寡核苷酸在长度上为至少8个核苷酸。
28.产生寡核苷酸-固相缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含亲硫性金属的固相，以及
b)使含有至少一个式I的硫代羰基核碱基的寡核苷酸与所述亲硫性金属结合，所述式I的硫代羰基核碱基为
其中X为CH或者N，其中R1为H或者NH2且其中---表示共价键。
29.权利要求28的方法，其中在所述寡核苷酸中，基于核苷的所述式I的硫代羰基核苷酸为7-脱氮核苷酸，即其中X为CH。
30.权利要求28或者29的方法，其中所述寡核苷酸在长度上为至少8个核苷酸。
31.权利要求1-27中任一项的寡核苷酸-固相缀合物在基于核酸杂交的检测方法中的用途。
32.权利要求13-20之一或者26的寡核苷酸-固相缀合物作为标记物的用途。
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