CN106460058B - 经修饰的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了经修饰的胞嘧啶碱基，该经修饰的胞嘧啶碱基在多核苷酸杂交复合物中提供对鸟嘌呤碱基的增强的碱基配对亲合性。还公开了包含此类经修饰的胞嘧啶碱基的多核苷酸寡聚物、多核苷酸杂交复合物。还公开了各种使用方法。例如，在一些实施方式中，本文公开的经修饰的多核苷酸寡聚物可用作用于核酸扩增和/或检测的引物和探针。

Description

经修饰的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年3月30日提交的、题目为“经修饰的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法”、系列号61/972,391的临时专利申请以及于2015年3月30日提交的、题目为“经修饰的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法”、系列号14/673,494的非临时专利申请的权益，其公开内容通过援引整体上并入以用于所有目的。
技术领域
本文的技术涉及核酸。
背景技术
多核苷酸用于各种应用，例如靶标检测、诊断应用、治疗应用、核酸测序、法医分析和靶标扩增。通常而言，此类应用需要与互补多核苷酸链以高特异性和敏感性杂交的多核苷酸，特别是当靶核酸以有限量可获得时。
已经开发了具有经修饰的碱基的核苷酸类似物以包含在多核苷酸中，从而改变核酸杂交、扩增和/或检测的强度、敏感性和/或特异性。然而，需要新的化学结构和方法来扩展对于操作和分析核酸可获得的工具组。
发明内容
本发明特别地提供一种能够提供增强的与鸟嘌呤碱基的碱基配对的新型的非天然存在的胞嘧啶样经修饰的碱基(本文也称为“经修饰的胞嘧啶碱基”或者简称为“经修饰的碱基”)、包含此类经修饰的碱基的多核苷酸寡聚物及其应用。
已经发现当引入多核苷酸寡聚物时本发明的经修饰的碱基令人惊奇地增加包含其的这些寡聚物(与不含有此类经修饰的碱基的寡聚物相比)对于与互补性序列杂交的结合亲合性和特异性。该令人惊奇的发现允许使用较短的寡聚物或者在寡聚物和其互补靶序列之间的互补性的较短区。本发明的经修饰的胞嘧啶碱基的进一步优点在于它们能够增强含有其的寡聚物的水溶性。这对于增加聚核酸(PNA)寡聚物的水溶性是尤其有用的，与DNA和RNA的溶解度相比，公知所述聚核酸(PNA)寡聚物是相对水不溶性的。增加的水溶性(除了杂交期间胞嘧啶对诸如鸟嘌呤的互补性碱基的碱基配对亲合性的强度增加之外)对于抵消芳香族荧光团和猝灭剂部分的疏水性特征也能是有用的，所述芳香族荧光团和猝灭剂部分的疏水性特征能够促进经标记的多核苷酸寡聚物在水性条件下不想要的沉淀或凝集。此外，根据用户的特定需要，本发明的一个或多个经修饰的碱基可位于寡聚物碱基序列中的任意位置。
本发明的多核苷酸寡聚物可以包含任意数量的经修饰的碱基。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一个经修饰的碱基，其中，所述经修饰的碱基由下式表示：
其中，Z是CH2或O。在本发明的特定实施方式中，Z是O。上式中所示的经修饰的碱基，本文称为“经修饰的胞嘧啶碱基”或简称为“经修饰的碱基”。
本发明的多核苷酸寡聚物可以包含任意数量的脱氧核苷酸部分(moiety)。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一个脱氧核糖核苷酸部分。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基与所述多核苷酸寡聚物中的脱氧核糖核苷酸部分共价连接。
本发明的多核苷酸寡聚物还可以包含任意数量的肽核酸(PNA)部分。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一个肽核酸(PNA)部分。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基与所述多核苷酸寡聚物中的肽核酸部分共价连接。
在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物是PNA/DNA嵌合体，其中，本发明的经修饰的胞嘧啶碱基包括在所述嵌合体的PNA链段(segment)中或者DNA链段中，或者包括在所述嵌合体的PNA链段和DNA链段二者中，各链段包含此类经修饰的碱基。
本发明的多核苷酸可以包含任意数量的经修饰的碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含多个经修饰的碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少2个经修饰的碱基。当多核苷酸寡聚物包含多个经修饰的胞嘧啶碱基时，经修饰的胞嘧啶碱基可以相同或不同。
对于可以将经修饰的胞嘧啶碱基引入多核苷酸寡聚物内的何处没有限制。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸寡聚物在多核苷酸寡聚物的3’端处包含经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物在距离多核苷酸寡聚物的3’端一个碱基处包含经修饰的胞嘧啶碱基。
本发明的多核苷酸寡聚物可以包含一种或多种另外的化合物。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含小沟结合剂。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含嵌入剂。
本发明的优选多核苷酸寡聚物是其中，主链包含2’-脱氧核糖或核糖的多核苷酸寡聚物。但是，本发明的多核苷酸寡聚物可以包含一种或多种修饰。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含糖修饰。各种糖修饰是有用的。一些非限制性糖修饰包括阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖和双环糖(bicyclic sugar)。
本发明的多核苷酸寡聚物可以包含一种或多种主链修饰。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含主链修饰。在一些实施方式中，主链修饰选自由下述组成的组：经修饰的糖磷酸酯主链、锁核酸主链、肽主链、磷酸三酯主链(phosphotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)主链、硅氧烷主链、羧甲基酯主链、乙酰胺酯主链、氨基甲酸酯主链、硫醚主链、桥接亚甲基膦酸酯主链、硫代膦酸酯主链、甲基膦酸酯主链、烷基膦酸酯主链、磷酸酯主链、烷基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、碳酸酯主链、磷酸酯三酯主链(phosphate triester backbone)、羧甲基酯主链、甲基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、具有对乙氧基键的主链以及前述任何两种以上的组合。在本发明的特定实施方式中，主链修饰是经修饰的糖磷酸酯主链。
在本发明的一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含通过DNA或RNA依赖性聚合酶能够延伸的3’末端核苷酸。
本发明的多核苷酸寡聚物可以包含任意有用数量的核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含小于30个核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含约9～约25个核苷酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
本发明的多核苷酸寡聚物可以包含一个或多个可检测标记。在本发明的一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一个可检测标记。可检测标记不受限制。在一些实施方式中，可检测标记是荧光团或荧光猝灭剂。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含荧光团和荧光猝灭剂。
本发明还提供在杂交方法中使用本发明的经修饰的胞嘧啶碱基的方法。在杂交方法中可以使用本文所述的任何经修饰的胞嘧啶碱基。在本发明的一些实施方式中，提供使本发明的多核苷酸寡聚物与怀疑在反应混合物中存在的核酸靶序列杂交的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使包含多核苷酸寡聚物并且怀疑包含靶核酸序列的反应混合物在有利于所述多核苷酸寡聚物与在所述反应混合物中如果存在的靶核酸序列杂交的条件下温育的步骤。该方法中使用的多核苷酸寡聚物与怀疑在反应混合物中存在的核酸靶序列内的序列互补，并且包含至少一个由下式表示的经修饰的碱基：
其中，Z是CH2或O。在本发明的特定实施方式中，Z是O。
将反应混合物温育，由此在多核苷酸寡聚物与在反应混合物中如果存在的靶核酸序列之间形成双链体。在一些实施方式中，所述方法包括检测在反应混合物中所述靶核酸序列的存在或者确认其不存在。作为形成此类双链体的结果，检测到在反应混合物中存在所述靶核酸序列。作为不形成此类双链体的结果，确认在反应混合物中不存在所述靶核酸序列。在所述方法的一些实施方式中，多核苷酸寡聚物包含选自由可检测标记、荧光团和荧光猝灭剂组成的组的部分。可检测标记、荧光团和/或荧光猝灭剂有助于双链体的检测和/或靶核酸序列的检测。
本发明还提供包含任意数量的多核苷酸寡聚物的双链体，所述多核苷酸寡聚物包含本发明的经修饰的胞嘧啶碱基。在本发明的一些实施方式中，双链体包含至少一个多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列。所述至少一个多核苷酸寡聚物包含经修饰的胞嘧啶碱基，以及互补多核苷酸序列的至少4个相邻碱基互补和杂交的4个以上相邻碱基。此类双链体可以用本发明的任何多核苷酸寡聚物形成。在一些实施方式中，具有双链体的多核苷酸寡聚物包含至少一个由下式表示的经修饰的碱基
其中，Z是CH2或O。在本发明的特定实施方式中，Z是O。
在一些实施方式中，双链体内的多核苷酸寡聚物包含选自由可检测标记、荧光团和荧光猝灭剂组成的组的部分。可检测标记、荧光团和/或荧光猝灭剂有助于双链体的检测和/或双链体内的多核苷酸序列的检测。
在本发明的一些实施方式中，提供经修饰的核苷亚磷酰胺。在本发明的一些实施方式中，经修饰的核苷亚磷酰胺由下式表示：
其中，Z是CH2或O；其中，X1和X2分别是相同或不同的保护基，或者X1和X2合起来看是二齿保护基；其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；和其中，Q是羟基保护基。在本发明的特定实施方式中，Z是O。
在本发明的一些实施方式中，提供经修饰的肽核酸。在本发明的一些实施方式中，经修饰的肽核酸由下式表示：
其中，Z是CH2或O；其中，X1和X2分别是相同或不同的保护基，或者X1和X2合起来看是二齿保护基；其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；其中，Q1和Q2独立地是H或氮保护基，或者Q1和Q2一起是氮保护基；和其中，Q3是H或羧基保护基。
在本发明的一些实施方式中，提供经修饰的胞嘧啶核苷。在本发明的一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶核苷由下式表示：
在本发明的特定实施方式中，经修饰的胞嘧啶核苷由下式表示：
在本发明的一些实施方式中，提供经修饰的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯。在本发明的一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯由下式表示：
在本发明的特定实施方式中，经修饰的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯由下式表示：
本发明的一些实施方式以正下方的权利要求形式提出。
权利要求1.一种多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸寡聚物包含至少一个经修饰的碱基，其中，所述至少一个经修饰的碱基由下式表示：
其中，Z是CH2或O，并且优选的是，Z是O。
权利要求2.如权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含多个脱氧核糖核苷酸部分，优选的是，至少一个脱氧核糖核苷酸部分。
权利要求3.如权利要求2所述的多核苷酸寡聚物，其中，经修饰的碱基与所述至少一个脱氧核糖核苷酸部分共价连接。
权利要求4.如权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含多个肽核酸部分，优选的是，至少一个肽核酸部分。
权利要求5.如权利要求4所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述经修饰的碱基与所述至少一个肽核酸部分共价连接。
权利要求6.如权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物是PNA/DNA嵌合体。
权利要求7.如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含至少两个经修饰的碱基，并且其中在所述至少两个经修饰的碱基中的Z相同或不同。
权利要求8.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物在其3’端处或者在距离其3’端一个碱基处包含所述经修饰的碱基。
权利要求9.如权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物还包含小沟结合剂或嵌入剂。
权利要求10.如权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物还包含糖修饰；优选的是，所述糖修饰选自由阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖和双环糖组成的组。
权利要求11.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物还包含主链修饰，优选的是，所述主链修饰选自由下述组成的组：经修饰的糖磷酸酯主链、锁核酸主链、肽主链、磷酸三酯主链、氨基磷酸酯主链、硅氧烷主链、羧甲基酯主链、乙酰胺酯主链、氨基甲酸酯主链、硫醚主链、桥接亚甲基膦酸酯主链、硫代膦酸酯主链、甲基膦酸酯主链、烷基膦酸酯主链、磷酸酯主链、烷基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、碳酸酯主链、磷酸酯三酯主链、羧甲基酯主链、甲基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、具有对乙氧基键的主链以及前述任何两种以上的组合；优选的是，所述主链修饰是经修饰的糖磷酸酯主链。
权利要求12.如权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物还包含通过DNA或RNA依赖性聚合酶能够延伸的3’末端核苷酸。
权利要求13.如权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含小于30个核苷酸，优选的是，所述寡核苷酸寡聚物包含约9～约25个核苷酸。
权利要求14.如权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物还包含选自由可检测标记、荧光团和荧光猝灭剂组成的组的部分。
权利要求15.一种使权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸寡聚物与怀疑在反应混合物中存在的核酸靶序列杂交的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸寡聚物并且怀疑包含靶核酸序列的反应混合物在有利于所述多核苷酸寡聚物与在反应混合物中如果存在的靶核酸序列杂交的条件下温育；和
(b)检测在反应混合物中所述靶核酸序列的存在或者确认其不存在；
其中，所述多核苷酸寡聚物与在所述核酸靶序列内的序列互补，
其中，所述多核苷酸寡聚物包含至少一个经修饰的碱基，和
其中，所述至少一个经修饰的碱基由下式表示：
其中，Z是CH2或O，并且优选的是，Z是O。
权利要求16.如权利要求15所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物还包含选自由可检测标记、荧光团和荧光猝灭剂组成的组的部分。
权利要求17.一种双链体，其包含：
(i)至少一个权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸寡聚物；和
(ii)多核苷酸序列；
其中，所述至少一个权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸寡聚物包含与所述多核苷酸序列的至少4个相邻碱基互补和杂交的4个以上相邻碱基。
权利要求18.一种由下式表示的经修饰的核苷亚磷酰胺：
其中，Z是CH2或O，并且优选的是，Z是O；
其中，X1和X2分别是相同或不同的保护基，或者X1和X2合起来看是二齿保护基；
其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；和其中，Q是羟基保护基。
权利要求19.一种由下式表示的经修饰的肽核酸单体：
其中，Z是CH2或O，并且优选的是，Z是O；
其中，X1和X2分别是相同或不同的保护基，或者X1和X2合起来看是二齿保护基；
其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；
其中，Q1和Q2独立地是H或氮保护基，或者Q1和Q2一起是氮保护基；和
其中，Q3是H或羧基保护基。
权利要求20.一种由下式表示的经修饰的胸腺嘧啶核苷：
并且优选的是，所述经修饰的胞嘧啶核苷由下式表示：
权利要求21.一种由下式表示的经修饰的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯：
并且优选的是，所述经修饰的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯由下式表示：
在以下描述中提出本发明的另外特征和优点。公开内容的这些和其它特征会从以下描述变得更完全地显而易见，或者能够通过本文提出的原理的实施而了解。
附图说明
图1示意性地描述由一系列相同序列的多核苷酸寡聚物获得的解链曲线(作为270nm的吸光度(A270)相对于温度(℃)的一阶导数而绘制)，所述多核苷酸寡聚物为：在多核苷酸寡聚物内的不同位置处包含本发明的1个经修饰的碱基(C1或C2)或2个经修饰的碱基(C3)的多核苷酸寡聚物18-聚物(“CBP”)，或者包含正常的C碱基(称为“天然的”)、与互补性DNA多核苷酸12-聚物杂交的多核苷酸寡聚物18-聚物。该图显示，本发明的经修饰的胞嘧啶寡聚物与天然的相同序列的DNA寡聚物相比，具有显著更强的对互补性序列的杂交亲合性，并且包含两个CBP部分(C2)的寡聚物具有最高亲合性。另外的细节提供于实施例5和表4中。
图2A和2B示意性地描述从5’核酸酶PCR反应获得的作为循环数(Cn)的函数的荧光(516nm,FAM(Em))的图，所述PCR反应使用包含1～5个CBP部分的荧光探针，以及仅包含常规胞嘧啶碱基的正向引物和反向引物。使用以下探针：Pf1-C-1(1个经修饰的胞嘧啶碱基)、Pf1-C-2(1个经修饰的胞嘧啶碱基)、Pf1-C-3(1个经修饰的胞嘧啶碱基)、Pf1-C-4(2个经修饰的胞嘧啶碱基)、Pf1-C-5(2个经修饰的胞嘧啶碱基；“Pf1-5”)、Pf1-C-6(3个经修饰的胞嘧啶碱基；“Pf1-6”)、Pf1-C-7(3个经修饰的胞嘧啶碱基；“Pf1-7”)和Pf1-C-8(5个经修饰的胞嘧啶碱基；“Pf1-8”)。引物Pf1与经修饰的胞嘧啶探针具有相同的核苷酸序列，然而，仅具有天然碱基，即无经修饰的胞嘧啶碱基。另外的细节提供于实施例6和表4中。
图3示意性地描述来自5’核酸酶PCR反应的作为循环数(Cn)的函数的荧光(516nm,FAM(Em))的图，所述PCR反应利用各自包含1个CBP部分的正向引物和反向引物使用各种引物延伸温度(60℃、“60C”；63℃、“63C”；66℃、“66C”；和69℃、“69C”)进行。另外的细节提供于实施例7和表4中。
图4A和4B示意性地描述来自5’核酸酶PCR反应的作为循环数(Cn)的函数的荧光的图，所述PCR反应利用未修饰引物(图4A)或各自包含1个CBP部分的经修饰的胞嘧啶引物(图4B)和各种退火时间(图4A：13、16、20、30和45秒；图4B：8、10、13、16、20、30和45秒)。另外的细节提供于实施例7和表4中。
具体实施方式
I.定义
在整个本说明书和所附权利要求中，词语“包含”和“包括”及其各种变体如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”被包含性地解释。即，这些词语意指可能包含上下文允许但没有具体描述的其它要素或整体。说明书中任何语言均不应解释为将任何未要求权利保护的要素作为实施本文所述发明的必要特征。正如此文所用的，短语“由……组成”意指包括并且对跟随在“由……组成”后面的内容的限制。因此短语“由……组成”是指需要所列出的要素或者其是强制性的，并且无其它要素可以存在。术语“基本上由……组成”是指所述组合物、方法或结构可以包含另外的成分、步骤和/或部分，但是只有另外的成分、步骤和/或部分不实质上改变所要求保护组合物、方法或结构的基本的新颖特征。
除非在本文另有说明或上下文明显矛盾，描述本发明的上下文中(特别是在以下的权利要求书的上下文中)使用的术语“一个”(“a”，“an”)和“所述”(“the”)和类似的指代被解释为包括单数和复数。
除非在此另外指出，否则在此对数值范围的叙述仅仅用作一种速记方法，分别涉及落入范围内的各单独数值，各单独数值包含在说明书内，如同在此个别列举一样。范围在此可以通过从“约”(或“大约”)一个特定值和/或至“约”(或“大约”)另一个特定值来表达。当表达此类范围时，另一实施方式包括从某一特定值和/或到另一特定值。类似的，当值通过使用在前的“约”或“大约”被表示为近似值时，应该理解，该特定值形成另一实施方式。还应当理解每个范围的端点相对于另一个端点以及独立于另一个端点都是有意义的。还应理解的是，本文公开了多个数值，每一个数值除其本身数值外在本文也公开了“约”该特定值。例如，如果公开了数值“10”,那么还公开了“约10”。还应该理解，当数值被公开为“小于或等于该数值时”，“大于或等于该数值”以及这些数值之间的可能范围也被公开，正如有经验的技术人员所恰当地理解的那样。例如，如果公开了数值“10”，那么还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。
本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另有说明或者上下文明显矛盾。此外，本文描述并且具有大于1个步骤的所有方法可以通过大于1个人或实体进行。因此，一个人或一个实体可以进行方法的步骤(a)，另一人或另一实体可以进行方法的步骤(b)，再一人或再一实体可以进行方法的步骤(c)。任何和所有实例或者此处提供的示例性语言(例如，“如”)的使用都仅仅是为了更好地说明本发明，除非另外声明，否则不对本发明的范围构成限制。
单位、前缀和符号均按照国际单位系统(SI)的接受的形式表示。除非另外说明，否则核酸序列从左向右以5'至3'方向书写；氨基酸序列从左向右以从氨基至羧基的方向书写。
本文公开的备选要素或实施方式的分组不应解释为限制。各组成员可被单独提到或要求保护，或与本文发现的组的其它成员或其它要素任意组合而被提到或要求保护。可以预料到，出于方便和/或专利性的原因，一组的一个或多个成员可以被包括进一组中或从该组删除。当任何此类包括或删除发生时，说明书在本文中被认为含有经过改动的组，因此满足对所附权利要求书中所用的全部马库什组的书面描述。
在此使用的标题仅用于组织目的，并不打算用来限制说明书或权利要求书的范围，其可以通过整体参考说明书而被包含在内。因此，通过参考整个说明书,下面马上要定义的术语将得到更加充分的定义。
图解说明是出于描述本发明优选实施方式的目的，而并非意欲将本发明限制于此。
除非另外定义，否则这里使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的熟练技术人员通常理解的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本发明所用的许多术语的一般定义：Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nded.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非特别指出，以下术语具有对其所赋予的含义。
本文所用术语“约”是指规定值的±10％的范围。例如，短语“约200包括”±200的10％，或从180至220，除非上下文明显矛盾。
本文所用的术语“扩增”是指通过其生产至少一个靶核酸或其序列互补物的至少部分序列的任何手段，通常以模板依赖性方式，包括但不限于，用于扩增核酸序列的各种技术，无论是线性的还是指数性的。扩增方法的非限制性实例包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、连接酶检测反应(LDR)、多重连接-依赖性探针扩增(MLPA)、连接后Q复制酶扩增、引物延伸、链置换扩增(SDA)、超支化链置换扩增、多重置换扩增(MDA)、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增和数字扩增等。除了其它来源之外，此类技术的描述可发现于：Ausubel等；PCR Primer:ALaboratory Manual,Diffenbach,Ed.,Cold Spring Harbor Press(1995)；TheElectronic Protocol Book,Chang Bioscience(2002)；The Nucleic Acid ProtocolsHandbook,R.Rapley,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.(2002)；and Innis et al,PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press(1990)。
本文所用术语“扩增条件”或“延伸条件”，在本文可相互替换地使用，是指聚合酶可以向多核苷酸的3'端添加一个或多个核苷酸的条件。此类扩增或延伸条件是本领域公知的，并且例如描述于Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Edition,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ausubel,et al,Current Protocols in Molecular Biology,1987-2007,John Wiley&Sons。
本文使用的术语“阵列”或“微阵列”通常是指诸如多核苷酸探针等可杂交阵列元件在基底上的有序排列。“阵列”通常是例如寡核苷酸序列或核苷酸序列(如RNA等)或者由寡核苷酸序列编码的蛋白质的空间上或逻辑上有组织的集合。阵列元件可以是寡核苷酸、DNA片段或多核苷酸等。阵列元件可以包括固定在固体支持物上的任何元件，所述支持物能够与靶序列特异性地结合，从而可以定性或定量地确定基因表达。高密度寡核苷酸阵列对确定样品中大量RNA的基因表达谱图特别有用。阵列元件可以通过合成或生物合成制备。阵列元件可以彼此相同或不同。阵列可以呈现为各种形式，例如，可溶性分子的文库；连接在树脂珠、二氧化硅芯片或其它固体支持物的化合物的文库。根据阵列上样品斑点的尺寸，阵列可以是巨阵列或微阵列。巨阵列通常含有约300微米以上的样品斑点尺寸，并且可以通过凝胶印迹扫描仪而容易地成像。微阵列通常含有小于300微米的斑点尺寸。多孔阵列是包含多个用于容纳样品斑点的腔室的支持物。优选的阵列元件是本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物。阵列上的优选分子是本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物。在一些实施方式中，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物连接至阵列。
本文使用的术语“连接至”或“被连接至”或其语法等效物是指系在(fasten on)、系在一起(fasten together)、附着至(affix to)、固定至(mount to)、固定在(mount on)、连接至(connect to)或接合(join)。“连接”是指连接的动作或被连接的条件。连接可以是直接或间接的。例如部件A可以直接连接至部件B。作为选择，部件A可以通过首先使部件A连接至部件C然后使部件C连接至部件B而间接连接至部件B。可以使用多于一个中间部件来将部件A连接至部件B。连接可是是永久的、暂时的或持续一段时间。例如，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物可以暂时地连接至固体支持物或阵列，持续本发明方法或本发明方法的步骤所需的时间。作为选择，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物可以连接至固体支持物或阵列一段延长的时间，例如还在不执行本发明方法或本发明方法的步骤时。另外，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物可以永久性地连接至固体支持物或阵列。
本文使用的术语“碱基”是指能够与互补核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物(例如嘌呤、7-脱氮嘌呤或嘧啶)形成沃森-克里克型氢键的含氮杂环部分。典型碱基是天然存在的碱基腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和脲嘧啶。碱基还包括天然存在的碱基的类似物，例如脱氮腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、肌苷、水粉蕈素、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基-嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤等。
本文使用的术语“珠”是指具有“一些圆形外貌或表面的小团块”，例如球形、圆柱形、椭圆形、卵圆形或圆顶形团块。
本文使用的术语“生物流体”是指来自宿主的流体，并且包括全血、血清、血浆、尿、眼泪、粘液性腹水、口腔流体、精液、粪便、痰、脑脊液和胎液。生物流体可以包括细胞或缺乏细胞。
本文使用的术语“生物样品”是指含有核酸或多肽的生物组织或生物流体的样品。此类样品通常来自人，但是包括分离自非人灵长类或啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的组织。生物样品还可以包括诸如外科活组织检查、细针抽吸活组织检查的组织切片和尸体解剖样本、为组织学目的而获取的冷冻切片、血液、血浆、血清、痰、粪便、眼泪、粘液、头发、皮肤等等。生物样品还包括外植体和源自患者组织的原代细胞和/或转化细胞培养物。“生物样品”还指来自动物的细胞或细胞群或一定量的组织或流体。最常见的是，生物样品已经从动物移除，但是术语“生物样品”还可以指体内分析的细胞或组织，即未从动物移除。通常而言，生物样品”包含来自动物的细胞，但是术语“生物样品”还可以指非细胞生物材料，例如血液的非细胞成分、唾液或尿，它们可用于测定多核苷酸或多肽的表达水平。在本发明中可以使用许多类型的生物样品，包括但不限于组织的活组织检查或血液样品。本文使用的术语“组织的活组织检查”是指从动物，优选哺乳动物，更优选灵长类，最优选人移除的一定量的组织。“生物样品”涵盖获得其后已经以任何方式操作的样品，例如通过用试剂处理、洗涤、处理以产生核酸样品(包含适合于进一步操作的核酸的样品)，或者富含特定细胞群，例如CD4+T淋巴细胞、神经胶质细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞和外周血单个核细胞(PBMC)，等等。术语“生物样品”涵盖临床样品，并且还包括培养中的细胞、细胞上清液、组织样品、器官和骨髓等。本文使用的术语“提供组织样品”是指获得用于本发明中所述方法的生物样品。最常见的是，这会通过从受试对象移除细胞样品而完成，但是还可以通过使用之前分离的细胞(例如通过另一人、在另一时间和/或出于另一目的而分离)，或者通过在体内执行本发明的方法而实现。具有治疗或结果史(outcome history)的存档组织会尤其有用。生物样品还可以源自存有从患者、另一动物或癌细胞系植入的异种移植物肿瘤的动物。
本文使用的术语“互补”是指寡聚物序列彼此杂交并且形成碱基对的能力。碱基对通常通过在反向平行的多核苷酸(寡聚物)链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸寡聚物链可以以沃森-克里克方式(例如A与T、A与U、C与G)，或者以允许形成双链体的任何其它方式进行碱基配对。探针序列与靶序列的“互补性”百分比是指探针序列与靶序列或者与靶序列的互补物的百分比“同一性”。在确定探针和靶序列之间的“互补性”程度时，“互补性”的程度表达为在探针序列与靶序列的序列或靶序列的序列互补物的之间的百分比同一性，所述靶序列的序列互补物与所述靶序列的序列为最佳比对。示例性的探针是如本文所述的寡核苷酸寡聚物。
本文使用的术语“不同”是指不相同，不具有相同的同一性。
本文使用的“双链体”是指通过使互补(或部分互补)的单链多核苷酸寡聚物(例如DNA、RNA或PNA)退火(杂交)而形成的双链杂交复合体。
关于“特异性杂交”，本文使用术语“杂交(hybridize或hybridization)”，其是使核酸分子(在一些实施方式中，在严谨条件下)优先与特定核苷酸序列结合、双链化或退火。术语“严谨条件”是指探针会优先与其靶序列杂交，而与其它序列杂交程度较低或根本不杂交的条件。核酸杂交的上下文中的“严谨杂交”和“严谨杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。核酸杂交的广泛指南发现于例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes part I,Ch.2,"Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays,"Elsevier,NY。通常而言，用于过滤器杂交的高严谨杂交和洗涤条件选择成在规定离子强度和pH下比特定序列的热熔点(也称为“热解链温度”或“Tm”)低约5℃。杂交严谨性对缓冲液组合物、温度和探针长度的依赖性是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rd ed.)Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Press,NY)。寡聚物(或多核苷酸寡聚物)与靶序列的杂交程度(也称为杂交强度)，通过本领域公知的方法确定。优选方法是确定给定杂交双链体的Tm。这可以通过使在溶液中所形成的双链体逐渐升温，并且监视双链体的变性(例如借助紫外线的吸光度，其随着伴随变性的碱基对的解堆叠(unstack)而增加)而实现。Tm通常定义为一半DNA链为单链(ssDNA)状态下的温度。Tm取决于各种参数，例如杂交互补链序列的长度、其特异性核苷酸序列、碱基组成和互补链的浓度。
本文使用的术语“标记”或“可检测标记”是指当连接至生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸寡聚物时通过合适的检测手段使此类生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸寡聚物可检测的部分。示例性标记包括荧光团、发色团、放射性同位素、自旋标记、酶标记、化学发光标记、电致化学发光化合物、磁性标签、微球、胶体金属、免疫标记、配体和酶等。在一些实施方式中，标记是荧光染料，例如荧光素型或罗丹明型染料。在一些实施方式中，标记选自由下述组成的组：放射性标记、诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶、链亲和素、生物素、由抗体识别的表位和其等效物。
当例如在扩增反应中目的序列与靶序列杂交时关于在目的核酸中不与相应序列中的相应核苷酸互补的核苷酸，本文使用“错配核苷酸”。C的互补物是G，A的互补物是T。换言之，认为目的序列中的“C”与靶序列中的“T”、“C”或“A”错配。
本文使用的术语“经修饰的核苷酸碱基”或“经修饰的碱基”是指不具有天然存在的碱基的结构因而是非天然存在的碱基。本文公开的优选经修饰的碱基例如是经修饰的胞嘧啶碱基。
本文使用的术语“经修饰的多核苷酸寡聚物”、“经修饰的寡核苷酸寡聚物”和“经修饰的寡聚物”是指包含至少一个经修饰的碱基的本发明的多核苷酸寡聚物。本文公开的优选经修饰的碱基例如是经修饰的胞嘧啶碱基。术语“经修饰的多核苷酸寡聚物”、“经修饰的寡核苷酸寡聚物”和“经修饰的寡聚物”，被认为在本文可相互替换地使用，还指多核苷酸寡聚物、寡核苷酸寡聚物或寡聚物的非天然存在的修饰形式的线性聚合物，包括例如，双链或单链脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其α-端基异构形式等。本发明的优选经修饰的多核苷酸寡聚物是包含经修饰的胞嘧啶碱基的多核苷酸寡聚物。经修饰的多核苷酸寡聚物可以完全由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其类似物组成，或可以包含两种以上不同单体类型的嵌段或混合物。这些术语也涵盖包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物(也称为“寡核苷酸类似物”或“核酸类似物”)的序列。各种参考文献公开了此类核酸类似物，例如包括：氨基磷酸酯(Beaucage等,Tetrahedron 49(10):1925(1993)和其中的参考文献；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970)；Sprinzl等,Eur.J.Biochem.81:579(1977)；Letsinger等,Nucl.Acids Res.14:3487(1986)；Sawai等,Chem.Lett.805(1984),Letsinger等,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；and Pauwels等,Chemica Scripta 26:141 91986))，硫代膦酸酯(Mag等,核酸s Res.19:1437(1991)；and U.S.Patent No.5,644,048)，二硫代膦酸酯(phosphorodithioate)(Briu等,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989),O甲基亚磷酰胺(methylphophoroamidite)键(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,Oxford University Press)，以及肽核酸主链和键(参见Egholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier等,Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992)；Nielsen,Nature 365:566(1993)；Carlsson等,Nature 380:207(1996)，全部都通过援引并入)。其它类似物核酸包括具有下述主链的类似物核酸：正电主链(positive backbone)(Denpcy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995)；非离子主链(美国专利号5,386,023,5,637,684,5,602,240,5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等,Angew.Chem.Intl.Ed.English30:423(1991)；Letsinger等,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger等,Nucleoside&Nucleotide 13:1597(1994)；第2和3章,ASC Symposium Series 580,“CarbohydrateModifications in Antisense Research”,Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook；Mesmaeker等,Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等,J.Biomolecular NMR 34:17(1994)；Tetrahedron Lett.37:743(1996))以及非核糖主链，包括描述于下述那些：美国专利号5,235,033和5,034,506,第6和7章,ASC Symposium Series 580,“CarbohydrateModifications in Antisense Research”,Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook.含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的一个定义内(参见Jenkins等,Chem.Soc.Rev.pp 169176(1995))。数种核酸类似物描述于Rawls,C&E News June 2,1997，第35页。所有这些参考文献在此明确地通过援引并入。
在核酸分子的语境下本文使用的术语“天然存在”是指具有天然存在的核苷酸序列并且即包含天然存在的成分(例如碱基、核苷和核苷酸)的RNA或DNA分子(单链或双链)。
本文使用的术语“核苷”是指由经由β-糖苷键结合至核糖或脱氧核糖的本文所述类型的含氮碱基组成的分子。核苷的实例包括腺苷、胞苷、胸苷、鸟苷、尿苷和肌苷。通常而言，当碱基是A或G时，核糖连接至碱基的N9-位置。当碱基是C、T或U时，核糖连接至碱基的N1-位置(Kornberg and Baker,DNA Replication,2nd Ed.,Freeman,San Francisco,Calif.,(1992))。
本文使用的术语“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，作为独立的单体或者作为多核苷酸内的亚单元(subunit)。核苷酸单体例如包括核苷酸5’-单磷酸酯、5’-二磷酸酯、5’-三磷酸酯和3’-单磷酸酯。核苷酸三磷酸酯有时标示为"NTP"、"dNTP"(2'-脱氧戊糖)或"ddNTP"(2',3'-二脱氧戊糖)，以特别指出核糖的结构特征。“核苷酸5’-三磷酸酯”是指在5'位置具有三磷酸酯基团的核苷酸。三磷酸酯基团可以包括对一个或多个磷酸酯氧原子的硫取代，例如α-硫代核苷酸5'-三磷酸酯。核苷酸单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯可以充当核酸加工酶的底物，所述核酸加工酶催化核酸或核酸中间体的修饰。
本文使用的术语“核苷酸加工酶”是指对核苷酸、寡核苷酸或核酸进行修饰或加工的酶，并且包括但不限于，引物延伸酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、限制性酶、切口酶、修复酶和连接酶。
本文使用的术语“多个”是指多于1个。例如，多个经修饰的多核苷酸寡聚物是指至少两个经修饰的多核苷酸寡聚物、至少三个经修饰的多核苷酸寡聚物或者至少四个经修饰的多核苷酸寡聚物等。如果本发明的实施方式包含多于1个经修饰的多核苷酸寡聚物，它们也可以称为第一经修饰的多核苷酸寡聚物、第二经修饰的多核苷酸寡聚物、第三经修饰的多核苷酸寡聚物，等等。
本文使用的术语“多核苷酸寡聚物”、“寡核苷酸寡聚物”和“寡聚物”在本文被认为可相互替换地使用，是指与本发明的“经修饰的多核苷酸寡聚物”、“经修饰的寡核苷酸寡聚物”和“经修饰的寡聚物”不同的天然存在的核苷酸单体线性聚合物。通常而言，“多核苷酸寡聚物”的核苷单体通过磷酸二酯键连接。但是，也可以设想含有非磷酸二酯键的经修饰的多核苷酸寡聚物。“经修饰的多核苷酸寡聚物”还涵盖含有一个或多个非天然存在的单体和/或亚单元间键的聚合物，例如肽核酸(PNA)，例如含有经由非-酰胺主链氮而附接有核碱基的酰胺-连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸亚单元的主链的聚合物。参见Nielsen等,Science 254:1497-1500(1991))。多核苷酸寡聚物和经修饰的多核苷酸寡聚物的通常尺寸从数个单体单元(例如8-40)至数千个单体单元。只要多核苷酸寡聚物或经修饰的多核苷酸寡聚物由字母序列如“ATGCCTG”表示，除非另外指出，其会被理解为核苷酸从左向右为5'→3'顺序，并且“A”表示腺嘌呤，“C”表示胞苷，“G”表示鸟苷，“T”表示胸苷，“U”表示尿苷。对于不具有常规5’和/或3’端的主链(例如PNA)，碱基序列就像5’→3’顺序一样提供，从而使所述序列会以反向平行的方式与具有3’→5’取向的互补序列杂交，就如同在普通双链DNA的反向平行互补链的情况一样。
当单独使用时，“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指主要或全部由常规DNA或RNA单体单元(即由A、C、G、T或U碱基取代的脱氧核糖或核糖环)组成、并且通过常规磷酸酯主链部分连接的多核苷酸寡聚物。
本文使用的术语“引物”是指作为起点来合成与靶核酸链互补的多核苷酸链有效的寡聚物或经修饰的寡聚物。例如，用于PCR的引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物含有与靶核酸链的区域互补的序列并且引导互补链的合成。反向引物含有与相反链互补的序列，并且沿着靶核酸链的相反链引导合成。
本文使用的术语“探针”是指经标记的寡核苷酸或经标记的经修饰的寡核苷酸，其含有与靶核酸序列的区域互补的序列，允许探针与靶序列形成双链体，并且生成表明靶序列的区域的存在的可检测信号。可检测信号在杂交期间或之后直接或间接生成。在一些应用中，例如在5’-核酸酶PCR的引物延伸期间，探针缺乏可延伸的3’羟基，从而防止探针的聚合酶介导的延伸。
“引物”或“探针”通常是包含与靶核酸分子的至少6个相邻核苷酸的序列互补的区域的寡聚物或经修饰的寡聚物，虽然引物和探针可以包含小于6个相邻核苷酸。在一些实施方式中，提供经修饰的寡聚物，其包含与靶核酸分子的6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上、12个以上、13个以上、14个以上、15个以上、16个以上、17个以上、18个以上、19个以上、20个以上、21个以上、22个以上、23个以上、24个以上、25个以上、约50个以上、或至多约100个相邻核苷酸相同或互补的序列。当引物或探针包含与靶核酸分子的至少X个相邻核苷酸“互补”的区域时，引物或探针与靶核酸分子的至少X个相邻核苷酸至少95％互补。在一些实施方式中，引物或探针与靶核酸分子至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。优选的“引物”或“探针”是包含经修饰的碱基、优选经修饰的胞嘧啶碱基的“引物”或“探针”。
本文使用的术语“保护基”、“保护性基团”或“保护形式”是指官能团(例如磷酸酯基团(phosphate group)或膦酸酯基团(phosphonate group))的不稳定化学修饰，以意图在随后的化学反应中保留其官能团性和/或获得化学选择性。通过去保护处理(利用用浓氨水处理)而从最终产物除去保护基。在一些实施方式中，磷酸酯和膦酸酯保护基X1和X2独立地选自用于在自动化亚磷酰胺寡核苷酸合成中保护亚磷酸化试剂(phosphitylatingreagents)的保护基，和/或与自动化亚磷酰胺寡核苷酸合成的条件相容。在特定实施方式中，X1和X2基团独立地可选地取代苯基，可选地取代烷基(例如氰乙基)，并且可选地取代杂烷基。示例性氨基保护基包括但不限于甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄基-氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(SES)、三苯甲基和经取代的三苯甲基、烯丙基氧羰基、9-芴基-甲基氧羰基(FMOC)和硝基-藜芦基氧羰基(NVOC)。示例性的羟基保护基包括其中羟基被乙酰化或烷基化的那些，例如苄基醚和三苯甲基醚以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚和烯丙基醚。还参见第1章：Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis by Etienne Sonveaux in Methodsin Molecular Biology,第26卷,Protocols for Oligonucleotide Conjugates,S.Agrawal(Ed.),Humana Press Inc.,Totowa,NJ(1994)；Greene's Protective Groupsin Organic Synthesis,P.Wutz and T.Greene(Eds.),Wiley-Interscience,第4版，(2006)；Thomson,S.A.,等,“Fmoc Mediated Synthesis of Peptide Nucleic Acids”,Tetrahedron 51:6179-6194(1995)；和“Solid-Phase Synthesis of Peptide NucleicAcids”,J.Peptide Science 3:175-183(1995)；对于此类公开内容在此通过援引将其并入。
本文使用的术语“盐”是指化合物的盐，例如本文所述的经修饰的部分，其用相对无毒的酸或碱制备，这取决于在本文所述的化合物上发现的具体取代基。当本发明的化合物含有相对酸性的官能性时，碱加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所期望碱(无溶剂(neat)或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、氨、有机氨或镁盐，或者相似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能性时，酸加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所期望酸(无溶剂或在合适的惰性溶剂中)接触而获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括衍生自无机酸(盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等)的盐，以及衍生自相对无毒的有机酸(如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等)的盐。还包括的是氨基酸的盐(例如精氨酸盐等)和有机酸(如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐(参见例如Berge等,1977,“Pharmaceutical Salts”,Journal of PharmaceuticalScience,66:1-19)。本发明的一些特定化合物同时包含碱性和酸性官能性，其允许化合物转化成碱或酸加成盐。化合物的中性形式可以通过使所述盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物而再生。化合物的母体形式与各种盐形式的不同之处在于一些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度，但是在其它方面，对本发明的目的而言所述盐与所述化合物的母体形式是等效的。
本文使用的术语“固体支持物”是指任何不溶性材料，包括颗粒(例如珠)、纤维、块材(monoliths)、膜、过滤器、塑料带和阵列等。
本文使用的术语“基本上互补”是指在所讨论序列中不超过20％(例如，不超过15％、10％或5％)的核苷酸与靶序列错配的序列。在一些实施方式中，杂交复合体的互补链具有1、2、3、4、5个以上核苷酸错配。
本文使用的术语“靶核酸”或“靶核酸分子”是指在一些实施方式中作为用于杂交、扩增等(即，出于检测目的)的靶标的核酸或多核苷酸寡聚物。在一些实施方式中，靶核酸包含与本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物部分或完全互补的RNA或DNA。
本文使用的术语“靶核酸”、“靶核酸分子”或“靶核苷酸序列”是指靶核酸内的序列。靶序列通常可以使用DNA的4种碱基(A、T、G和C)或者RNA的4种碱基(A、U、G和C)描述。
II.组合物
公开内容提供包含一个或多个经修饰的碱基的多核苷酸寡聚物(“经修饰的多核苷酸寡聚物”)，其展现提高的杂交性质，用于杂交反应并且作为聚合酶的底物。公开内容还涉及此类经修饰的多核苷酸寡聚物作为探针和/或引物并且例如在核苷酸阵列中的用途。
还提供包含此类经修饰的多核苷酸寡聚物的组合物、方法和试剂盒(即，套件)。经修饰的多核苷酸寡聚物与缺乏此类经修饰的碱基的寡聚物相比，提供在经修饰的多核苷酸寡聚物和互补多核苷酸序列之间的碱基配对方面的优异稳定性。
在一些实施方式中，本文描述的经修饰的多核苷酸寡聚物包括DNA、RNA、PNA和DNA/PNA嵌合寡聚物。本发明的经修饰的碱基和经修饰的多核苷酸寡聚物提供对互补序列的较大双链体稳定性，并且当在杂交复合体中存在一个或多个碱基错配时提高错配识别。
还提供的是含有本发明的经修饰的碱基的核苷和核苷酸。此类核苷可以用作用于合成相应的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的前体或者作为酶底物。本发明的核苷酸可以通过聚合酶介导的引物延伸而引入多核苷酸寡聚物。
以下详细地讨论公开内容的各种实施方式。虽然讨论的具体的实施，应该理解的是这样做仅出于说明目的。可以使用其它成分和构造而无需背离公开内容的精神和范围。
A.经修饰的胞嘧啶碱基
公开内容提供包含一个或多个经修饰的碱基的多核苷酸寡聚物，其展现提高的杂交性质，用于杂交反应并且作为聚合酶的底物。本发明的经修饰的碱基是非天然存在的。
本文公开的经修饰的碱基包含通过连接体(linker)部分连接至嘧啶环结构的5-位置的磷酸酯或膦酸酯基团。本发明的经修饰的碱基可以认为是常规碱基胞嘧啶的类似物。胞嘧啶的5-氢原子被连接体-磷酸酯或连接体-膦酸酯部分替换，如下进一步所示。在本公开内容中，经修饰的碱基有时表示为经修饰的胞嘧啶碱基(例如CBP或CPP)。
本发明的经修饰的碱基可以通常通过下式表示：
其中，Z是CH2或O；Y1和Y2独立地是H或保护基；X1和X2独立地是H或保护基，或者一起是保护基，并且波形线表示经修饰的碱基与寡聚物主链连接的点，或者与单体主链部分(例如脱氧核糖核苷的核糖环、脱氧核糖核苷酸的核糖环或者PNA氨基酸单体的主链)连接的点。当X1和X2都是保护基时，X1和X2分别可以相同或不同，并且X1和X2合起来看可以是二齿保护基，例如α,α-二甲基-o-亚苯甲基：
在本发明的特定实施方式中，根据式I的本发明的经修饰的碱基是经修饰的碱基，其中，Z是O，并且X1和X2合起来看是α,α-二甲基-o-亚苯甲基：
磷酸酯和膦酸酯保护基及其引入方法的进一步说明可发现于Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis,P.Wutz and T.Greene(Eds.),Wiley-Interscience,第4版,2006，对于该公开内容在此通过援引将其并入。
通常而言，当期望在寡聚物合成期间保护磷酸酯或膦酸酯部分免受损坏或修饰时，如在通过亚磷酰胺法合成多核苷酸寡聚物或者通过肽合成合成PNA寡聚物的情况下，X1和X2是保护基。在含有本发明的经修饰的碱基的多核苷酸寡聚物中，保护基通常在寡聚物用于与互补多核苷酸寡聚物杂交之前除去，以提供增加的碱基配对亲合性和水溶性。优选的是，只要X1和/或X2以及/或者Y1和/或Y2是保护基时，可以通过氨处理除去保护基。
在Z是O的一些实施方式中，经修饰的碱基包含磷酸酯(phosphate)部分。
在Z是CH2的一些实施方式中，经修饰的碱基包含膦酸酯(phosphonate)部分。
如下文进一步所述，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物、亚磷酰胺、经修饰的PNA单体、经修饰的核苷和经修饰的核苷酸包含一个或多个上述经修饰的碱基(式I)。
B.经修饰的多核苷酸寡聚物
公开内容提供包含一个或多个经修饰的碱基的多核苷酸寡聚物，其展现提高的杂交性质，用于杂交反应并且作为聚合酶的底物。本文将其称为“经修饰的多核苷酸寡聚物”并且是非天然存在的。公开内容还涉及此类经修饰的多核苷酸寡聚物作为探针和/或引物并且例如在核苷酸阵列中的用途。
在一些实施方式中，本文所述的经修饰的多核苷酸寡聚物包含根据以上式(参见式I)的1、2、3、4、5、6个以上经修饰的碱基。经修饰的多核苷酸寡聚物内的经修饰的碱基的数量取决于寡聚物序列中C碱基的数量和期望的结合亲合性的增加量，如本文所述其可以通过对不同寡聚物构建体进行解链研究或其它试验而确定，以确定对于特定应用的需要而言什么是最优的。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物由下式表示：
其中，各Y5独立地是H、C1-C8烷基，或可选地与Y3组合以形成5～7元环；
其中，各Y4独立地是O、S或NH；
其中，各Y3独立地是H、F或ORa；
其中，各Ra独立地是H、C1-C8烷基或羟基保护基；
其中，各Z独立地是P(O)OH、P(S)OH或P(O)CH3；
其中，n是1-98；
其中，Q1和Q2各自独立地是H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、荧光报道染料或猝灭剂；
其中，各B独立地是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、二氨基嘌呤，条件是至少一个B是由下式表示的经修饰的胞嘧啶碱基：
其中，Z是CH2或O；
其中，X1和X2相同或不同，并且分别是H或保护基，或者X1和X2一起是二齿保护基，例如α,α-二甲基-o-亚甲苯基：
和
其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；
在一些实施方式中，Y1和Y2是H，X1和X2是H。在一些实施方式中，Z是O。在一些实施方式中，Z是CH2。优选的是，只要X1和/或X2以及/或者Y3和/或Y4是保护基时，可以通过氨处理除去保护基。
在特定实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物由下式表示：
其中，各Y1是H；
其中，各Y2是O；
其中，各Y3是H；
其中，各Ra是H；
其中，各Z是P(O)OH；
其中，n是1-98；
其中，Q1和Q2各自独立地是H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、荧光报道染料或猝灭剂，优选荧光猝灭剂；
其中，各B独立地是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、二氨基嘌呤，条件是至少一个B是由下式表示的经修饰的碱基：
其中，Z是O，并且其中X1和X2合起来看是α,α-二甲基-o-亚苯甲基
本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物通常包含具有小于100个核苷酸的单链多核苷酸或者由其组成，尽管还设想数百或数千以上各碱基的更长序列。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含小于30个核苷酸，优选的是，寡核苷酸寡聚物包含约9至约25个核苷酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含2～约100、2～约50、2～约25、2～约15、5～约50、5～约25、5～约15、约10～约50、约10～约25、约10～约20、约10～约15、约12～约50、约12～约25或约12～约20个核苷酸，或者由其组成。寡聚物可以由其长度称呼。例如，将15个核苷酸的寡聚物称为“15聚物”。
如本领域技术人员会意识到的，经修饰的多核苷酸寡聚物、探针、引物或PNA内经修饰的胞嘧啶碱基可以引入的位置不受限制。本文公开的是其中，在各种位置引入经修饰的胞嘧啶碱基的多核苷酸寡聚物、探针、引物和PNA。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的1位(例如，参见Pf1-C-1、Pf1-C-4、Pf1-C-6、Pf1-C-8；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的2位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的3位(例如，参见Pf1-C-2；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的4位(例如，参见Pf1-C-3、Pf1-C-4、Pf1-C-5、Pf1-C-6；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的5位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的6位(例如，参见C-PNA；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的7位(例如，参见C1、C3；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的8位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的9位(例如，参见Pf1-C-5、Pf1-C-6；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的10位(例如，参见C2、C3、Pf1-C-7、Pf1-C-8；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的11位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的12位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的13位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的14位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的15位(例如，参见Pf1-C-7、Pf1-C-8；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的16位(例如，参见R1、P1R；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的17位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的18位。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的19位(例如，参见F1、P1F；表4)。在一些实施方式中，经修饰的胞嘧啶碱基位于多核苷酸当以5’→3’方向书写时的20位(例如，参见Pf1-C-7、Pf1-C-8；表4)。
如本领域技术人员会意识到的，多核苷酸寡聚物、探针或引物内经修饰的胞嘧啶碱基的数量不受限制。本文公开的是包含各种数量的经修饰的胞嘧啶碱基的多核苷酸寡聚物、探针、引物和PNA。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、探针、引物或PNA包含1个经修饰的胞嘧啶碱基(例如，参见C1、C2、F1、R1、Pf1-C-1、Pf1-C-2、Pf1-C-3、P1F、P1R、C-PNA；表4)。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含2个经修饰的胞嘧啶碱基(例如，参见C3、Pf1-C-4、Pf1-C-5；表4)。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含3个经修饰的胞嘧啶碱基(例如，参见Pf1-C-6、Pf1-C-7；表4)。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含4个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含5个经修饰的胞嘧啶碱基(例如，参见Pf1-C-8；表4)。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、探针、引物或PNA包含至少1个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少2个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少3个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少4个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少5个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少6个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少7个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少10个经修饰的胞嘧啶碱基。在一些实施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探针或PNA包含至少20个经修饰的胞嘧啶碱基。
在一些实施方式中，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物连接至固体支持物。在一些实施方式中，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物连接至珠。在一些实施方式中，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物连接至阵列。在一些实施方式中，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物连接至微阵列。
1.包含另外的修饰的经修饰的多核苷酸寡聚物
在一些实施方式中，包含本发明的一个或多个经修饰的碱基的经修饰的多核苷酸寡聚物会进一步包含其它类型的修饰，例如包含经修饰的碱基或碱基类似物和/或可检测标记、荧光和/或化学发光猝灭剂和/或小沟结合剂和/或一个或多个碱基修饰、糖修饰和/或主链修饰。
虽然在以下段落，为清楚起见单独地描述经修饰的多核苷酸寡聚物的另外的修饰，本领域技术人员会意识到，各个单独描述的修饰可以与另一个相互组合。例如，经进一步修饰的多核苷酸寡聚物包含糖修饰和主链修饰。在另一非限制性实例中，经进一步修饰的多核苷酸寡聚物包含糖修饰和标记。在另一实例中，经进一步修饰的多核苷酸寡聚物包含主链修饰和标记。在又一非限制性实例中，经进一步修饰的多核苷酸寡聚物包含标记和碱基修饰。
(a)包含糖修饰的经修饰的多核苷酸寡聚物
一些实施方式中，本文所述的经修饰的多核苷酸寡聚物包含一个或多个经修饰的糖部分。可以使用各种糖部分来修饰本发明的经修饰的多核苷酸。如本领域技术人员会意识到的，糖修饰在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受本文公开内容限制。在一些实施方式中，用于修饰本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的糖部分包括但不限于，阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖。在一些实施方式中，用于修饰本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的糖部分选自由阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖组成的组。
在一些实施方式中，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物包括一个或多个连接有经修饰的糖部分的核苷酸。可以使用各种糖部分来连接至会被引入本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物中的核苷酸。在一些实施方式中，连接至核苷酸的糖部分包括2'-取代的糖，例如2'-O-烷基-核糖、2'-氨基-脱氧核糖、2'-氟-脱氧核糖、2'-氟-阿拉伯糖或2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'MOE)。在一些实施方式中，连接至核苷酸的糖部分选自由2'-取代的糖例如2'-O-烷基-核糖、2'-氨基-脱氧核糖、2'-氟-脱氧核糖、2'-氟-阿拉伯糖和2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'MOE)组成的组。在本发明的特定实施方式中，连接至核苷酸的糖部分是2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'MOE)。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含锁核酸(“LNA”)糖。LNA糖是双环糖，即含有在C-4'和C-2'处的氧原子之间的亚甲基桥。在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含一个或多个具有LNA糖的核苷酸。在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物含有一个或多个由具有LNA糖部分的核苷酸组成的区域。在一些实施方式中，经修饰的寡核苷酸寡聚物含有具有LNA糖部分的核苷酸，所述LNA糖部分散布有脱氧核糖核苷酸。参见例如Frieden,M.等(2008)Curr.Pharm.Des.14(11):1138-1142。
(b)包含主链修饰的经修饰的多核苷酸寡聚物
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含主链修饰。可以将各种主链修饰引入经修饰的寡核苷酸中。如本领域技术人员会意识到的，主链修饰在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受本文公开内容限制。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含一个或多个磷酸二酯键。在一些实施方式中，核苷酸类似物包含主链修饰，例如利用肽核酸(PNA)。在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含经修饰的键，例如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、硫代膦酸酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、二硫代膦酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、羧甲基酯、甲基硫代膦酸酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基键和它们的组合。在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含经修饰的键，所述经修饰的键选自由磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥接氨基磷酸酯、桥接亚甲基膦酸酯、硫代膦酸酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、二硫代膦酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、羧甲基酯、甲基硫代膦酸酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基键和它们的组合组成的组。
例如，可以将PNA容易地合成为含有常规DNA碱基(A、C、T和G)或非常规碱基，但是PNA单体单元通过聚酰胺主链而不是糖-磷酸酯主链连接。
(c)包含碱基修饰的经修饰的多核苷酸寡聚物
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含一个或多个非标准碱基(即，除了腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和脲嘧啶之外)。可以将各种非标准碱基引入经修饰的寡核苷酸中。如本领域技术人员会意识到的，碱基修饰在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受本文公开内容限制。此类非标准碱基可以服务许多目的，例如使杂交稳定或不稳定；促进或抑制探针降解；或作为用于可检测部分或猝灭剂部分的连接点。经修饰的碱基(除了本发明的经修饰的碱基之外)和碱基类似物的许多实例如上所述，是本领域公知的，并且可用于进一步修饰经修饰的多核苷酸寡聚物。
在一些实施方式中，经修饰的寡聚物包含作为经胺修饰的核苷酸(即，已经经过修饰以含有反应性胺基团的核苷酸)的经修饰的碱基。
本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物可以包含正常碱基或经修饰的碱基的任意组合，例如未经取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶碱基(例如PPG和PPA)、3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶、经修饰的嘌呤、经修饰的嘧啶、5-取代嘧啶或通用碱基。
(d)包含标记的经修饰的寡核苷酸寡聚物
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含标记，优选可检测标记。例如，如本文所述，包含可检测标记的经修饰的多核苷酸寡聚物用作探针或用作引物。可以将各种标记引入经修饰的寡核苷酸中。如本领域技术人员会意识到的，标记在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受本文公开内容限制。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含在其序列的一端上的荧光团和/或在其序列另一端上的荧光猝灭剂，从而荧光猝灭剂经由能量转移机制(如荧光共振能量转移("FRET"))抑制完整探针(即用作探针的经修饰的多核苷酸寡聚物)中的荧光团的荧光信号。当聚合酶沿着也与探针杂交的模板将引物延伸时，聚合酶的5'-核酸酶活性切割探针(即，经修饰的多核苷酸寡聚物)，由此允许荧光团从荧光猝灭剂扩散开，从而检测到荧光信号。该信号随着各PCR循环成比例地增加至切割的探针的量，因此成比例地增加至扩增产物(扩增子，靶序列)的量。这允许靶DNA序列的直接检测和定量。在一些实施方式中，荧光团连接至距离经修饰的多核苷酸寡聚物的序列的一端至少一个核苷酸位置的碱基，和/或荧光猝灭剂连接至距离经修饰的多核苷酸寡聚物另一端至少一个核苷酸位置的碱基。在一些实施方式中，荧光团和/或荧光猝灭剂内部地位于经修饰的多核苷酸寡聚物中。如本领域技术人员会意识到的，荧光团和/或荧光猝灭剂在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受限制。
在一些实施方式中，荧光团和荧光猝灭剂不位于FRET探针的端部。在一些实施方式中，荧光团的发射光谱与荧光猝灭剂的吸收光谱显著重叠。但是，当猝灭涉及碰撞机制时此类光谱重叠较不重要或不需要，或者所述重叠因例如反应条件或探针结构而增加。
在一些实施方式中，在FRET探针上(即在用作FRET探针的经修饰的多核苷酸寡聚物上)使用的标记包括比色和染料或荧光团如Alexa Fluor染料，BODIPY染料如BODIPY FL；Cascade蓝；Cascade黄；香豆素和其衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素、氨基香豆素和羟基香豆素；花青染料，例如Cy3和Cy5；曙红和赤藓红；荧光素和其衍生物，例如荧光素异硫氰酸酯；镧系离子的大环螯合物，例如量子染料(TM)；Marina蓝；奥勒冈绿(Oregon Green)；罗丹明染料，例如罗丹明红，四甲基罗丹明和罗丹明6G；德克萨斯红；荧光能量转移染料，例如噻唑橙-溴化乙锭异二聚体；和TOTAB。
可用于修饰本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的有用染料的具体实例包括但不限于以上和以下鉴定的那些：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500.Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750；胺反应性BODIPY染料，例如BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR和BODIPY-TR；Cy3、Cy5、6-FAM、荧光素异硫氰酸酯、HEX、6-JOE、奥勒冈绿488、奥勒冈绿500、奥勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、REG、罗丹明绿、罗丹明红、Renographin、ROX、SYPRO、TAMRA、2‘,4’,5’,7‘四溴砜-荧光素、TET和得克萨斯红。
可用于修饰本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的荧光团/荧光猝灭剂对(即供体/受体对)的实例包括但不限于荧光素/四甲基罗丹明；IAEDANS/荧光素；EDANS/dabcyl；荧光素/荧光素；BODIPY FL/BODIPY FL；荧光素/QSY 7或荧光素/QSY 9。当供体和受体相同时，在一些实施方式中，可以通过荧光去极化而检测FRET。荧光团/荧光猝灭剂对(即供体/受体对)的一些特定实例包括但不限于Alexa Fluor 350/Alexa Fluor 488；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 555；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor568；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 647；AlexaFluor 546/Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 555/Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 555/Alexa Fluor647；Alexa Fluor 568/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 594/Alexa Fluor 647；AlexaFluor 350/QSY35；Alexa Fluor 350/dabcyl；Alexa Fluor 488/QSY 35；Alexa Fluor488/dabcyl；Alexa Fluor 488/QSY 7或QSY 9；Alexa Fluor 555/QSY 7或QSY9；AlexaFluor 568/QSY 7或QSY 9；Alexa Fluor 568/QSY 21；Alexa Fluor 594/QSY 21；和AlexaFluor 647/QSY 21。在一些实施方式中，对于多个荧光团可以使用相同的猝灭剂，例如，宽光谱猝灭剂，例如Iowa Black(R)猝灭剂(Integrated DNA Technologies,Coralville,IA)或Black Hole猝灭剂(TM)或(BHQ(TM)；Biosearch Technologies,Petaluma,CA)因此在本发明的一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含选自由下述组成的组中的荧光团/荧光猝灭剂对：荧光素/四甲基罗丹明；IAEDANS/荧光素；EDANS/dabcyl；荧光素/荧光素；BODIPY FL/BODIPY FL；荧光素/QSY 7荧光素/QSY 9,Alexa Fluor 350/Alexa Fluor 488；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 555；Alexa Fluor488/Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 488/Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 488/AlexaFluor 647；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 546/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 555/Alexa Fluor 594；Alexa Fluor555/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 568/Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 594/AlexaFluor 647；Alexa Fluor 350/QSY35；Alexa Fluor 350/dabcyl；Alexa Fluor 488/QSY35；Alexa Fluor 488/dabcyl；Alexa Fluor 488/QSY 7或QSY 9；Alexa Fluor 555/QSY 7或QSY9；Alexa Fluor 568/QSY 7或QSY 9；Alexa Fluor 568/QSY 21；Alexa Fluor 594/QSY 21；和Alexa Fluor 647/QSY 21。
在一些实施方式中，例如在同时检测两个以上部分的多重反应中，各经修饰的多核苷酸寡聚物探针可以包含可检测上不同的荧光团，从而当在同一反应中同时检测时可以区分所述荧光团。本领域技术人员可以从以上公开的选择荧光团/荧光猝灭剂和本领域已知的其它荧光团/荧光猝灭剂选择一组可检测上不同的荧光团，以用于多重反应。如本领域技术人员会意识到的，荧光团和/或荧光猝灭剂的选择以及荧光团和/或荧光猝灭剂在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受本文公开内容限制。
(e)包含其它修饰的经修饰的寡核苷酸寡聚物
在一些实施方式中，本文所述的经修饰的多核苷酸寡聚物还包含一个或多个悬垂基团(pendant group)。各种悬垂基团可用于修饰本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物。如本领域技术人员会意识到的，悬垂基团的选择和悬垂基团在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受本文公开内容限制。悬垂基团可以是连接至一个或多个内部碱基、连接至3'-末端，连接至5'-末端，连接至两端，或者内部地位于经修饰的多核苷酸寡聚物的一个末端或两个末端的部分，例如亲脂性基团、小沟结合剂、嵌入剂、螯合剂或交联剂。因此，在一些实施方式中连接至经修饰的多核苷酸寡聚物的悬垂基团是选自由亲脂性基团、小沟结合剂、嵌入剂、螯合剂和交联剂组成的组的部分。适于连接此类悬垂基团的方法通常是本领域技术人员已知的。
在一些实施方式中，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物包含低分子量的“尾部分”。各种“尾部分”可用于进一步修饰本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物。如本领域技术人员会意识到的，“尾部分”的选择和“尾部分”在本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物内的位置可以改变，并且不受本文公开内容限制。在一些实施方式中，尾部分连接至经修饰的多核苷酸寡聚物的3'端或5'端，或者在两端。尾部分子可以是磷酸根(phosphate)、磷酸酯(phosphate ester)、烷基、氨基烷基或亲脂性基团。因此，在一些实施方式中，连接至经修饰的多核苷酸寡聚物的尾部分选自由磷酸根、磷酸酯、烷基、氨基烷基和亲脂性基团组成的组。在一些实施方式中，尾部分将嵌入剂、亲脂性基团、小沟结合剂(MGB)、报告基团、螯合剂或交联官能性连接至经修饰的多核苷酸寡聚物。例如，MGB可以连接至经修饰的寡核苷酸寡聚物的任一端或两端。除此之外或者作为选择，可以将一个或多个MGB连接在经修饰的寡核苷酸寡聚物中的内部位置。如本领域技术人员会意识到的，此类选择可以取决于经修饰的寡核苷酸寡聚物的长度。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含非天然比例的原子同位素。在一些实施方式中，对经修饰的多核苷酸寡聚物进行放射性标记。合适的放射性标记包括但不限于氚(3H)、碘125(125I)、磷(32P)或碳14(14C)。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物以盐形式提供。经修饰的多核苷酸寡聚物可以以各种盐形式提供。如本领域技术人员会意识到的，本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的盐形式可以改变，并且不受本文公开内容限制。本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的盐形式包括但不限于碱加成盐，例如钠、钾、钙、氨、有机氨或镁盐，或者相似的盐。
在一些实施方式中，本文所述的经修饰的多核苷酸寡聚物包含碱性和/或酸性官能性。任何可离子化基团的电荷状态会取决于环境pH。例如，经修饰的多核苷酸寡聚物内的磷酸酯基团的非桥接氧原子在酸性pH条件下比在碱性pH条件下会倾向于更多质子化。因此，虽然以特定的质子化状态示出结构(例如完全质子化的磷酸酯二酸部分)，在经修饰的多核苷酸寡聚物内的可离子化基团的真实质子化状态会取决于诸如溶剂的pH、水含量和盐浓度等因素。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物拥有不对称碳原子或双键，例如作为外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单独异构体提供，并且它们都旨在包括在本发明的范围内。例如，虽然常规DNA和RNA包含核苷酸亚单元的D-立体异构体，但是本公开内容也涵盖DNA和RNA的L-立体异构体。
C.经修饰的核苷亚磷酰胺
本发明还提供由下式表示的经修饰的核苷亚磷酰胺：
其中，Z是CH2或O；
其中，X1和X2分别是相同或不同的保护基，或者其中，X1和X2合起来看是二齿保护基；
其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；和
其中，Q是羟基保护基。
在一些实施方式中，Z是O。在一些实施方式中，Z是CH2。在本发明的特定实施方式中，Z是O。
在一些实施方式中，Q是三苯甲基、甲氧基三苯甲基(MMT)或二甲氧基三苯甲基(DMT)。优选的是，在酸性条件下Q能够除去。
优选的是，只要X1和/或X2以及/或者Y1和/或Y2是保护基时，可以通过氨处理除去保护基。在一些实施方式中，X1和X2合起来看是二齿保护基，例如o-亚苯甲基(o-benzylene)、α-甲基-o-亚苯甲基或α,α-二甲基-o-亚苯甲基。在一些实施方式中，Y1和Y2一起是氮保护基。在一些实施方式中，经修饰的核苷亚磷酰胺可以包含任何前述示例性特征的组合。
在经修饰的核苷亚磷酰胺的一些实施方式中，当保护基X1和X2分别来看时，各自可以具有由下式表示的结构：
其中，R1和R2独立地是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基或苯基；n和m独立地是0、1、2、3或4；X是O或NR4；
Y是O或S；Z是键、O或NR4；各个R3相同或不同并且独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、氰基、硝基、卤素、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、NR5a R5b或苯基；R4、R5a和R5b各自独立地是C3-C6环烷基或苯基。(参见例如WO 2000/055179 A1)。
在经修饰的核苷亚磷酰胺的一些实施方式中，X1和X2独立地具有以下结构：
其中，L是键、C1-C8亚烷基、C2-C8杂亚烷基、C2-C8亚烯基；并且W是H、氰基、C(O)NRaRb、NO2、N+RaRbRc、C6H4NO2、C6H4Cl、C6H3(NO2)2、C6H2(NO2)3、SO2Rc或S(O)2ORc；Ra和Rb独立地是H、CF3、C1-C8烷基或C6-C10芳基；和Rc是C1-C8烷基或C6-C10芳基。此类基团是有利的，因为它们能够通过常规氨或氢氧化铵处理而除去。在本发明的特定实施方式中，根据上式的经修饰的核苷亚磷酰胺是经修饰的核苷亚磷酰胺，其中，X1和X2独立地具有以下结构：
其中，L是键，并且W是H。
在一些实施方式中，X1和X2各自分别是新戊酰基氧苄基基团。
本发明的经修饰的核苷氨基磷酸酯(nucleoside phosphoramidate)是非天然存在的。如本领域技术人员会意识到的，所述经修饰的核苷亚磷酰胺(nucleosidephosphoramidite)用于合成本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物。
D.经修饰的PNA单体
本发明还提供由下式表示的经保护的经修饰的PNA单体：
其中，Z是CH2或O；
其中，X1和X2分是相同或不同的保护基，或者其中，X1和X2合起来看是二齿保护基；
其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；
其中，Q1和Q2独立地是H或氮保护基，或者其中Q1和Q2一起是氮保护基；和
其中，Q3是H或羧基保护基。
在经修饰的PNA单体的一些实施方式中，Z是O。在一些实施方式中，Z是CH2。在本发明的特定实施方式中，根据上式的经保护的经修饰的PNA单体是经保护的经修饰的PNA单体，其中，Z是O。
在一些实施方式中，Q1是H，Q2是Fmoc，并且Q3是H。优选的是，只要X1和/或X2以及/或者Y1和/或Y2是保护基时，可以通过氨处理除去保护基。
本发明的经修饰的PNA单体是非天然存在的。
E.经修饰的核苷和经修饰的核苷酸
本发明还提供由下式表示的经修饰的核苷：
在本发明的特定实施方式中，经修饰的核苷由下式表示：
本发明的经修饰的核苷是非天然存在的。它们例如作为任何反应中的底物是有用的，无论是化学还是酶促反应，对于所述反应而言相应的常规DNA和RNA核苷胞嘧啶是底物。例如，核苷可以通过合适的激酶转化成一磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯。用于制造此类经修饰的胞嘧啶核苷的通用步骤提供于例如实施例11中。
本公开内容还提供由以下实施例12中所示的式NT1和NT2表示的核苷酸。本发明还提供由下式表示的经修饰的核苷酸：
在本发明的特定实施方式中，经修饰的胞嘧啶核苷由下式表示：
用于制造此类经修饰的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯的通用步骤提供于例如实施例12中。本发明的经修饰的核苷酸还能够以与常规核苷酸相同的方式使用核苷酸转移酶来被引入多核苷酸寡聚物中从而生产经修饰的多核苷酸寡聚物。
本发明的经修饰的胞嘧啶核苷酸是非天然存在的。在期望使用本发明的经修饰的碱基的任何酶促或合成反应中可以使用此类核苷酸代替相应的常规胞苷磷酸酯。例如，包含本发明的经修饰的胞嘧啶碱基的核苷酸5’-三磷酸酯可以通过DNA聚合酶而引入经修饰的多核苷酸寡聚物中。可以这样做以例如增强所得到引物延伸产物的杂交亲合性。在非限制性实例中，如下进行其：(a)提供混合物，所述混合物包含模板依赖性DNA聚合酶、本发明的核苷酸5’-三磷酸酯和可选的一种或多种脱氧核苷酸三磷酸酯(例如dATP、dCTP、dGTP和/或常规TTP)以及其它缓冲液成分(例如Mg2+和/或Mn2+离子)；和(b)将引物退火至模板DNA或RNA链中的互补序列，从而使聚合酶能够将经修饰的碱基(即经修饰的核苷酸)和其它NTP(如果存在)引入延伸引物中，由此形成包含本发明的经修饰的碱基的多核苷酸寡聚物。对于引物延伸的合适反应条件，也参见Kutyavin,I.,Biochemistry 47:13666–13673(2008),“Use of Base-Modified Duplex-Stabilizing Deoxynuleoside 5′-Triphosphates toEnhance the Hybridization Properties of Primers and Probes in DetectionPolymerase Chain Reaction”。
F.双链体
在一些实施方式中，本发明提供包含经修饰的多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列的双链体。在一些实施方式中，本发明提供包含多个经修饰的多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列的双链体。在一些实施方式中，本发明提供包含至少一个经修饰的多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列的双链体。虽然此类双链体内的经修饰的多核苷酸寡聚物是非天然存在的寡聚物，在一些实施方式中，该双链体内的多核苷酸序列是天然存在的多核苷酸序列。在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸和多核苷酸序列都是非天然存在的。在本发明的双链体的一些实施方式中，所述至少一个经修饰的多核苷酸寡聚物包含与所述多核苷酸序列的至少4个相邻碱基互补和杂交的4个以上相邻碱基。
如本领域技术人员会意识到的，本文所述的任何经修饰的多核苷酸寡聚物和如本文所述包含任何另外的修饰的任何经修饰的多核苷酸可用于与多核苷酸序列形成双链体。另外，多核苷酸序列不受限制。可以使用具有与经修饰的多核苷酸具有互补性的至少4个以上相邻核苷酸的任何多核苷酸。
在一些实施方式中，多核苷酸序列包含原核生物核苷酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸序列包含真核生物核苷酸序列。在一些实施方式中，多核苷酸序列包含病毒核苷酸序列。
在双链体的一些实施方式中，多核苷酸序列比经修饰的多核苷酸寡聚物长，即多核苷酸序列比经修饰的多核苷酸寡聚物包含更多的核苷酸。
在一些实施方式中，双链体连接至固体支持物。在一些实施方式中，本发明的双链体连接至珠。在一些实施方式中，本发明的双链体连接至阵列。在一些实施方式中，本发明的双链体连接至微阵列。
III.方法
A.包含经修饰的胞嘧啶碱基的合成经修饰的多核苷酸、经修饰的核苷、经修饰的核苷酸和其它部分
含有本发明的经修饰的胞嘧啶碱基的寡聚物、核苷、核苷酸和其它部分可以通过任何合适的方法合成，并且通常化学和/或酶促地合成。本文描述了优选方法，例如参见实施例1-4、8、9、11和12。
例如，经修饰的多核苷酸寡聚物可以在实验室中通过使用亚磷酰胺方法和源自被合适地保护的2'-脱氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)或经化学修饰的核苷(例如LNA、BNA)等的亚磷酰胺构建嵌段通过固相合成来合成。多核苷酸链组装通常以从3'-至5'-末端的方向进行，然后是被称为“合成循环”的例行步骤。单个合成循环的完成导致向生长链添加一个核苷酸残基。HPLC和本领域已知的其它方法用于分离具有所需序列的经修饰的多核苷酸寡聚物。
合成多核苷酸和其类似物的方法已经描述于许多出版物中，是公知的，并且除了实施例1-4、8、9、11和12所述方法之外，可使用其来合成本发明的经修饰的部分。参见例如Gait,Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(1990)，和S.Agrawal,Protocols forOligonucleotides and Analogs,Methods in Molecular Biology Vol.20,HumanaPress,Totowa,N.J.(1993)。对于经修饰的PNA寡聚物的合成，可以使用本领域公知的常规肽合成方法(参见例如Nielsen等,Science 254:1497-1500(1991))。还可以使用酶促方法，例如由DNA聚合酶介导的引物延伸，或使用合适的激酶将在5’位置的核苷磷酸化。
本发明的说明性多核苷酸寡聚物的各种性质在本文的实施例1～12中进一步说明。
本文的实施例8～11描述根据本发明的数个示例性PNA寡聚物的合成和表征。
B.包含经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的多核苷酸、经修饰的核苷、经修饰的核苷酸和其它部分的示例性用途
当阅读本公开内容时如本领域技术人员所意识到的，经修饰的碱基、经修饰的多核苷酸寡聚物、经修饰的核苷、经修饰的核苷酸和含有其并且在本文描述的其它经修饰的部分在核酸加工和操作领域中发现各种用途。例如，它们用于增强双链体稳定性，例如在杂交复合体(如多核苷酸双链体和三链体)中的稳定性。在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物用作例如在下述中的分子探针：DNA测序、文库构建、阵列、Southern印迹、ASO分析、荧光原位杂交(FISH)、人工基因合成、作为聚合酶链反应(PCR)等的引物、连接测定(例如，用于已知单核苷酸多态性的检测)等。以上所列方法是本领域已知的。本领域技术人员用本文所述的非天然存在的经修饰的胞嘧啶碱基、用本文所述的非天然存在的经修饰的核苷、用本文所述的非天然存在的经修饰的核苷酸或者用本文所述的非天然存在的经修饰的多核苷酸寡聚物取代例如任何这些方法中使用的天然存在的碱基、天然存在的核苷、天然存在的核苷酸或者天然存在的多核苷酸寡聚物没有困难。
在一些实施方式中，包含一个或多个本发明的经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的多核苷酸寡聚物提高引物延伸反应的效率。由本发明的经修饰的胞嘧啶碱基提供的附加的双链体稳定性允许本领域技术人员在比用缺乏此类经修饰的胞嘧啶碱基的天然存在的多核苷酸寡聚物更高的温度下执行引物延伸。由此，可以减少引物延伸时间和/或变性温度和退火温度之间的斜升时间(transition ramp times)。更高的反应温度对于使靶分子中的潜在有问题的二次结构最小化而言也是有利的，并且可以减少引物二聚体的形成。此外，不受理论限制，据认为使用更高的反应温度也减少噪音。
以下描述本文所述的非天然存在的经修饰的胞嘧啶碱基、非天然存在的经修饰的核苷、非天然存在的经修饰的核苷酸和非天然存在的经修饰的多核苷酸寡聚物的一些非限制性用途。
1.经修饰的多核苷酸寡聚物在阵列应用中的用途
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物用于包含阵列的应用中。本领域技术人员了解涉及阵列的许多应用。如本领域技术人员会意识到的，涉及连接有本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的阵列的应用的选择可以改变，并且不受本文公开内容限制。在一些实施方式中，阵列应用例如用于基因表达的杂交或基于阵列的分析。示例性非限制性阵列包括芯片或平台阵列、珠阵列、液相阵列和“邮政-编码(zip-code)”阵列等。经修饰的多核苷酸寡聚物在与靶核苷酸序列的碱基配对中的优异稳定性导致相关序列的识别提高，特别是在单核苷酸水平上，这在杂交或基于阵列的分析中是有利的。诸如硝酸纤维素、玻璃、硅晶片、光学纤维等适于构建阵列的材料是本领域技术人员已知的。
因此，在本发明的一些实施方式中，提供连接有经修饰的多核苷酸寡聚物的阵列。在本发明的一些实施方式中，提供连接有多个经修饰的多核苷酸寡聚物的阵列。在本发明的一些实施方式中，提供连接有多个不同经修饰的多核苷酸寡聚物的阵列。所述多个不同经修饰的多核苷酸寡聚物可以包含对具有不同序列的经修饰的多核苷酸寡聚物或经修饰的多核苷酸寡聚物的不同进一步修饰。
2.经修饰的多核苷酸寡聚物作为探针的用途
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物是探针。在一些实施方式中，所述探针包含可检测标记或部分。本文使用的可检测标记同时包括诸如荧光染料(荧光团)等直接可检测部分和诸如结合对的成员等间接可检测部分。当可检测部分是结合对的成员时，在一些实施方式中，探针可以通过将探针与结合至结合对的第二成员的可检测标记一起温育而可检测。在一些实施方式中，探针未经标记，例如当探针是例如在微阵列或珠上的捕获探针时。在一些实施方式中，探针不能例如通过聚合酶而可延伸。在一些实施方式中，探针是可延伸的。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物是FRET探针。FRET探针可以用荧光染料在5'端或者用荧光猝灭剂在3'端进行标记，荧光猝灭剂是当化学基团紧密接近(即连接至相同探针)时吸收(即抑制)来自染料的荧光发射的化学基团。
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物是5’核酸酶PCR探针、MolecularBeaconTM或ScorpionTM探针。
3.经修饰的多核苷酸寡聚物在杂交方法中的用途
如本领域技术人员会理解的，寡核苷酸和核酸与互补经修饰的多核苷酸寡聚物的杂交在各种应用中是有用的。例如，包含本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的杂交双链体的形成可以作为双链体的可检测信号或特征方面的变化的结果而直接检测，例如在原位杂交(FISH)技术中那样。因此本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物可以作为未经标记或经标记探针而提供，以促进此类检测。双链体还可以进行固相或电泳分离，例如以区分真实信号与背景。在一些实施方式中，作为与互补靶序列杂交的结果，杂交的经修饰的多核苷酸寡聚物以某种方式化学改变。例如，在引物延伸过程(例如PCR)中，经修饰的多核苷酸寡聚物可以称为“经修饰的引物”。此类经修饰的引物可以延伸而形成引物延伸产物，其可以充当下一PCR循环的模板。在5’-核酸酶反应中，经修饰的多核苷酸寡聚物可以称为“经修饰的寡聚物探针”。此类经修饰的寡聚物探针可以通过DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)的外切核酸酶活性而被切割，从而产生能够通过荧光或其它手段检测的切割片段。在此类应用中，引物的延伸或探针的切割是本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物通过与互补核酸序列杂交而形成双链体的证据。此外，可以将反应条件调整为确定最合适条件，该最合适条件将用于特定应用的杂交最大化。具体而言，反应温度通常选择成接近、稍微低于或有时稍微高于用于其靶标的寡聚物的Tm。如果反应温度过高，寡聚物会不与其靶序列杂交，并且引物延伸或探针切割的效率会降低。
本发明还提供在杂交方法中使用包含本发明的经修饰的胞嘧啶碱基的多核苷酸寡聚物(本文有时也称为“经修饰的多核苷酸寡聚物”)的方法。在杂交方法中可以使用本文所述的任何经修饰的胞嘧啶碱基。在本发明的一些实施方式中，提供使包含经修饰的胞嘧啶碱基的多核苷酸寡聚物与怀疑在反应混合物中存在的核酸靶序列杂交的方法。在一些实施方式中，所述方法包括使包含经修饰的多核苷酸寡聚物并且怀疑包含靶核酸序列的反应混合物在有利于经修饰的多核苷酸寡聚物与在反应混合物中如果存在的靶核酸序列杂交的条件下温育的步骤。该方法中使用的经修饰的多核苷酸寡聚物与怀疑在反应混合物中存在的核酸靶序列内的序列互补，并且包含至少一个由下式表示的经修饰的碱基：
其中，Z是CH2或O。
在本发明的特定实施方式中，该方法中使用的经修饰的多核苷酸寡聚物与怀疑在反应混合物中存在的核酸靶序列内的序列互补，并且包含至少一个由下式表示的经修饰的碱基：
其中，Z是O。
将反应混合物温育，由此在经修饰的多核苷酸寡聚物与在反应混合物中如果存在的靶核酸序列之间形成双链体。在一些实施方式中，所述方法包括检测在反应混合物中所述靶核酸序列的存在或者确认其不存在。作为形成此类双链体的结果，检测到在反应混合物中存在所述靶核酸序列。作为不形成此类双链体的结果，确认在反应混合物中不存在所述靶核酸序列。在所述方法的一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物包含选自由可检测标记、荧光团和荧光猝灭剂组成的组的部分。可检测标记、荧光团和/或荧光猝灭剂有助于双链体的检测和/或靶核酸序列的检测。
在一些实施方式中，反应混合物包含生物样品。在一些实施方式中，反应混合物包含由生物样品制备的核酸样品。由生物样品制备核酸样品是本领域公知的。
本发明提供检测生物样品中的靶核酸的方法。在一些实施方式中，该方法包括下述步骤：(a)使生物样品的靶核酸与包含经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的多核苷酸寡聚物接触，其中，所述靶核酸与所述经修饰的多核苷酸寡聚物特异性杂交，和(b)检测在所述靶核酸与所述经修饰的多核苷酸寡聚物之间的双链体形成。
在一些实施方式中，本发明提供一种方法，其包括下述步骤：(a)提供怀疑含有靶核酸的核酸样品；(b)提供包含经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的多核苷酸寡聚物和与所述靶核酸互补的核苷酸序列；和(c)将所述核酸样品与所述经修饰的多核苷酸寡聚物在允许于所述靶核酸与所述经修饰的多核苷酸寡聚物之间形成双链体的杂交条件下组合。
在一些实施方式中，本发明提供一种方法，其包括下述步骤：(a)将(i)怀疑含有靶核酸的核酸样品以及(ii)包含经修饰的胞嘧啶碱基和与所述靶核酸互补的核苷酸序列的经修饰的多核苷酸寡聚物在允许于所述靶核酸与所述经修饰的多核苷酸寡聚物之间形成双链体的杂交条件下组合；和(b)检测在所述靶核酸与所述经修饰的多核苷酸寡聚物之间的双链体形成。
在一些实施方式中，本发明提供一种方法，其包括下述步骤：(a)将(i)怀疑含有靶核酸的核酸样品以及(ii)包含经修饰的胞嘧啶碱基和与所述靶核酸互补的核苷酸序列的经修饰的多核苷酸寡聚物在允许于所述靶核酸与所述经修饰的多核苷酸寡聚物之间形成双链体的杂交条件下组合；和(b)确认在所述核酸样品中不存在所述靶核酸。
如本领域技术人员会意识到的，杂交和检测样品中靶核酸的存在或者确认其不存在的方法可以使用任何靶核酸进行，只要可以获得所述靶标的一些信息从而可以制备具有与所述靶核酸互补的至少4个相邻互补核苷酸的经修饰的多核苷酸寡聚物。
4.经修饰的多核苷酸寡聚物作为引物的用途
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物是引物。本文使用的引物有时被称为经修饰的引物，是能够与靶序列特异性杂交并且能够在一端(通常是3’端)通过模板依赖性DNA或RNA聚合酶延伸的经修饰的多核苷酸寡聚物。在模板、聚合酶和合适的缓冲液和试剂的存在下，经修饰的引物可以延伸以形成与靶序列互补的经修饰的引物延伸产物(也称为延伸引物)。在一些实施方式中，经修饰的引物包含标记，或者一个或多个聚合用前体(例如核苷三磷酸酯)可以包含标记。经修饰的引物延伸产物可以通过本领域技术人员已知的许多技术中的任一种检测。在一些实施方式中，经修饰的引物未经标记。在一些实施方式中，使用经修饰的多核苷酸寡聚物作为扩增用引物。
5.经修饰的多核苷酸寡聚物对于扩增的应用
在一些实施方式中，在扩增反应中使用经修饰的多核苷酸寡聚物。如本领域技术人员会意识到的，其中，可以使用本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的扩增反应不受限制。扩增的示例性非限制性实例包括聚合酶链反应(“PCR”)、逆转录酶PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、滚环扩增(RCA)或链置换扩增(SDA)。因此，在一些实施方式中提供用于扩增的方法。在一些实施方式中该方法包括下述步骤：(a)将经修饰的多核苷酸引物退火至靶序列；和(b)将所述经修饰的多核苷酸寡聚物延伸以形成经修饰的多核苷酸寡聚物延伸产物。
在用于扩增的方法的一些实施方式中，所述经修饰的多核苷酸寡聚物连接至固体支持物。在用于扩增的方法的一些实施方式中，所述经修饰的多核苷酸寡聚物连接至珠。在用于扩增的方法的一些实施方式中，所述经修饰的多核苷酸寡聚物连接至阵列。在用于扩增的方法的一些实施方式中，所述经修饰的多核苷酸寡聚物连接至微阵列。
许多扩增反应，例如PCR，利用反复引物(reiterative primer)依赖性聚合。在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物是下述引物，其能够与靶核酸序列杂交，并且一旦杂交，能够利用靶核酸序列作为模板，通过聚合酶(在核苷酸底物，例如核苷酸三磷酸酯的存在下)延伸。聚合酶包括但不限于DNA和RNA聚合酶、逆转录酶等。对利用不同聚合酶的聚合有利的条件是本领域技术人员公知的。
扩增反应优选在自动热循环仪中进行以便于在期望温度下进行一定的温育时间。在一些实施方式中，扩增包括以下顺次步骤的至少一个循环：将至少一个引物(即经修饰的多核苷酸寡聚物)与至少一个靶核酸中的互补或基本上互补序列一起退火；使用聚合酶以模板依赖性方式合成核苷酸的至少一条链；和将新形成的核酸双链体变性以分开所述链。所述循环可以重复或者可以不重复。扩增可以包含热循环，或可以等温地进行。
在一些实施方式中，扩增包括在约90℃～约100℃下开始变性约1～约10分钟，然后循环，所述循环包括在约55℃～约75℃下退火约1秒～约30秒，在约55℃～约75℃下延伸约5秒～约60秒，并且在90℃～约100℃下变性约1秒～约30秒。还可以使用其它次数和过程。例如，引物退火和延伸可以在一个温度下在同一步骤中执行。
在一些实施方式中，循环执行至少5次、至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次、至少35次、至少40次或至少45次。
特定循环次数和温度会取决于正在扩增的特定核酸序列，并且可以容易地由本领域技术人员确定。
6.经修饰的多核苷酸寡聚物在治疗应用中的用途
在一些实施方式中，经修饰的多核苷酸寡聚物在治疗应用中发现用途。如本领域技术人员会意识到的，其中，可以使用本发明的经修饰的多核苷酸寡聚物的治疗应用不受限制。治疗应用的示例性非限制性实例包括使用经修饰的多核苷酸作为与RNA结合的反义寡聚物或siRNA，使用经修饰的多核苷酸作为与DNA结合的反义寡核苷酸，使用经修饰的多核苷酸作为适体，使用经修饰的多核苷酸作为诱饵，或者使用经修饰的多核苷酸作为与蛋白质结合的CpG寡聚物。经修饰的多核苷酸寡聚物已经可用于调节基因表达和用于反义基因疗法。
IV.试剂盒
为了用于诊断、研究和以上提出的治疗应用，本发明还提供试剂盒。在诊断和研究应用中，此类试剂盒可以包括任何以下物质或其全部：一种或多种经修饰的胞嘧啶碱基、一种或多种包含经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的多核苷酸寡聚物、一种或多种包含经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的核苷、一种或多种包含经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的核苷酸、一种或多种包含经修饰的胞嘧啶碱基的改性PNA；一种或多种包含经修饰的胞嘧啶碱基的经修饰的部分、一种或多种检验试剂、一种或多种缓冲液，等等。治疗产品可以包括无菌盐水或另一药学上可接受的乳液或悬浮基质。可选地是，所述试剂盒包括描述制造和/或使用本文所述的经修饰的部分的说明书手册。通常而言，除了说明书手册之外的这些成分在一个或多个容器中提供。
在一些实施方式中，本发明提供包含本文所述的经修饰的部分的试剂盒。在一些实施方式中，本发明提供包含本文所述的经修饰的多核苷酸寡聚物的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒还包含至少一种聚合酶，例如热稳定的聚合酶。在一些实施方式中，试剂盒还包含dNTP。在一些实施方式中，试剂盒还包含引物和/或探针。
在一些实施方式中，本发明提供包含用于实施本发明方法的组合物的试剂盒，所述本发明方法包括但不限于，处理核酸样品，执行酶促反应，执行杂交，形成双链体等，如本文所述。
说明书材料可以含有用于实施本发明方法的指导(即方法)。所述说明书可以以各种形成存在于题述试剂盒中，在所述试剂盒中可以存在一种或多种形式的说明书。虽然说明书材料通常包含书面材料或打印材料，但是它们不限于此。本发明设想能够储存此类说明书并且使其与终端用户通讯的任何介质。此类材料包括但不限于电子储存介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)和光学介质(例如，CD ROM)等等。此类介质可以包括提供此类说明书材料的网址地址。
如本领域技术人员会意识到的，可以根据本发明制备各种试剂盒和成分，这取决于试剂盒的有意用户和用户的特定需要。本发明的另外的试剂盒实施方式包括可选的功能组分，其允许本领域技术人员执行本文所述的任一方法变体。
在此描述了本发明的优选实施方式，包括发明人所知道的实施本发明的最佳模式。当然，在阅读前述说明书时，对这些优选实施方式的等效的改变、变化、改动和替换对于本领域普通技术人员来说将是明显的。本发明人希望本领域技术人员适当使用等效的这些改变、变化、改动和替换，并且本发明人期望本发明以不同于此处具体描述的那样的方式来实行。本领域技术人员容易认识到，可以改变、改动或调整各种非关键参数以便产生相似的结果。因此，至少可适用的法律允许，本发明包括附加的权利要求书中所述的主题的所有改动和等效物。此外，除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，本发明包括上述要素以其所有可能变化的任何组合。
虽然本发明的各个要素在本文被描述为含有多个实施方式，应该理解的是，除非另有说明，本发明给定要素的各个实施方式能够与本发明的其它要素的各个实施方式能够一起使用，并且各个此类使用旨在形成本发明的不同实施方式。
本文引用的所引用专利、专利申请和科技文献在此通过整体援引而并入,其程度与每个出版物、专利或专利申请通过援引具体而单独指明地并入相同。本文引入的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何矛盾应以有利于后者的方式得到解决。类似地，如果本领域理解的对词语或短语的定义与本说明书的具体教导的词语或短语的定义存在任何冲突，应以有利于后者的方式得到解决。
如从以上公开内容而意识到的，本发明具有各种应用。本发明通过下述的实施例进一步描述，但这些实施例仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本发明的定义和范围。
V.实施例
通用方法和推荐
提供以下实施例来说明本文所述的发明，但不对其造成限制。
在氩气(Ar)下进行所有空气和水分敏感性反应。除非另外指出，从商业来源获得无水溶剂和试剂。快速色谱在230-400目硅胶(VWR)上执行。
1H NMR光谱于20℃在Bruker 400光谱仪上运行，并且相对于对于1H的标准物Me4Si和对于31P的标准物H3PO4以ppm报道。
熔点使用Mel-Temp熔点设备在开放毛细管中确定，并且未经校正。
紫外-可见光吸收光谱在Cary Varian分光光度计上在200-400-nm范围中记录。
薄层色谱在硅胶60F-254铝背衬的TLC板(EM Reagents)上执行。
HPLC分析在配备有四元泵(quaternary pump)、自动取样器和二极管阵列检测器的Agilent 1100仪器上进行，并且除非另外指出，监视270nm处的吸光度。
寡核苷酸合成在MerMade 12DNA合成仪(BioAutomation)上执行。使用标准亚磷酰胺合成循环，对于经修饰的亚磷酰胺，耦合时间增加至360秒。对于所有解链试验，各寡核苷酸的浓度为1uM，缓冲液浓度为3mM MgCl2、15mM KCl、25mM HEPES，pH 8。在室温下在浓氨水中进行从固体支持物的切割和去保护24小时。
除非本文另外指出，本发明的实施会利用为本领域技能内的细胞生物学、分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA等等的常规技术。此类技术在文献中充分解释。参见例如Sambrook,Fritsch,and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,SecondEdition(1989),Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait Ed.,1984),Animal CellCulture(R.I.Freshney,Ed.,1987),the series Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.M.Miller andM.P.Calos eds.1987),Current Protocols Ii Molecular Biology(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,and K.Struhl,eds.,1987)。
在以下具体实施例中，相关反应方案按照实施例。
实施例1.DMT-CBP亚磷酰胺(M6)的合成
实施例1描述用于制备经修饰的胞嘧啶3’-亚磷酰胺单体M6的受保护形式的合成步骤，所述经修饰的胞嘧啶3’-亚磷酰胺单体M6的受保护形式包含与嘧啶5-位碳通过1-丁炔基连接体连接的经保护磷酸酯部分(本文将该经修饰的碱基有时称为“CBP”)。M6的5’-羟基受DMT基团保护，磷酸酯部分的两个羟基受新戊酰基氧苄基基团保护。
4-新戊酰基氧苄基醇(化合物M1)。
在室温下在氩气气氛下向在含有三乙胺(10.43mL,75mmol)的无水THF(50mL)中的4-羟基苯甲醇(6.21g,50mmol)的搅拌溶液逐滴添加特戊酰氯(6.79mL,55mmol)。搅拌60分钟后，将反应混合物用水(0.2mL)猝灭并静置过夜。然后用EtOAc(～400mL)稀释并用饱和NaHCO3(3x 100mL)和盐水(100mL)洗涤。然后在Na2SO4上干燥、过滤和浓缩。在用乙酸乙酯/己烷(4:6)洗脱的硅胶柱(4x 20cm)上使用快速色谱分离出产物(TLC:Rf～0.4，在乙酸乙酯/己烷(4:6)中)。汇集纯级分，将其浓缩和真空干燥，以提供7.75g(74％)的无色油。1HNMR(DMSO-d6):δ7.35(d,2H,J＝8.6Hz),7.04(d,2H,J＝8.6Hz),5.22(t,1H),4.50(d,2H),1.31(s,9H)。
化合物M2.
在氩气下将化合物M1(参见下文：7.79g,37.4mmol)溶解在含有N,N-二异丙基乙基胺(8.14mL,46.8mmol)的无水THF(50mL)中，将所获得溶液在冰水浴中冷却至0℃。在搅拌和冷却的情况下利用注射器用5分钟时间逐滴添加二氯二异丙基亚磷酰胺(3.46mL,18.8mmol)。使反应混合物升温至室温，并搅拌过夜。通过过滤除去沉淀的盐，在真空中浓缩滤出液。将残留物溶解在乙酸乙酯(～150mL)中，用5％NaHCO3(3x 50mL)洗涤然后用盐水(50mL)洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。在硅胶柱(4x 20cm)上使用快速色谱分离出产物(TLC:Rf～0.6，在乙酸乙酯/己烷/三乙胺(20:80:2)中)，所述硅胶柱(4x20cm)从己烷/三乙胺(100:2)加载，并且用乙酸酯/己烷/三乙胺(20:80:2)洗脱。汇集纯级分，将其浓缩以提供8.1g(79％)的无色油。1H NMR(DMSO-d6):δ7.37(d,4H,J＝8.6Hz),7.07(d,4H,J＝8.6Hz),4.76–4.63(m,4H),3.70–3.61(m,2H),1.30(s,18H),1.16(d,12H,J＝6.8Hz).31P NMR(DMSO-d6):δ147.30。
化合物M3.
在氩气气氛下将3-丁炔-1-醇(1.18mL,15.0mmol)和化合物M2(参见下文；8.1g,14.8mmol)溶解在无水THF中。立即添加5-(乙硫基)-1H-四唑(66mL,0.25M，在乙腈中)的溶液，并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加叔丁基氢过氧化物溶液(4.0mL，5-6M，在癸烷中)，并且将所述混合物搅拌另外2小时。然后在真空下除去溶剂，并将残留物溶解在乙酸乙酯(200mL)中，用饱和NaHCO3(3x 50mL)洗涤，并用盐水(50mL)洗涤。将有机相在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩。使用在己烷中阶梯性梯度为20–50％的乙酸乙酯在硅胶上通过快速色谱分离出产物(TLC:Rf～0.35，在乙酸乙酯/己烷(1:1)中)。获得非晶态固体5.3g(67％)。1HNMR(DMSO-d6):δ7.42(d,4H,J＝8.6Hz),7.11(d,4H,J＝8.6Hz),5.07(d,4H,J＝8.2Hz),4.07–4.01(m,2H),2.93(t,1H,J＝2.6Hz),2.56–2.52(m,2H),1.31(s,18H).31P NMR(DMSO-d6):δ-1.2。
5’-DMT-N4-DIBF-5-I-dC(化合物M4).
通过与无水吡啶(3x 20mL)共蒸发而使5-碘-2’-脱氧胞苷(1.06g,3mmol)无水，并将其悬浮在无水MeOH(10mL)中。在氩气气氛下添加N,N-二异丁基甲酰胺二甲基缩醛(810mg,3.9mmol)，并且在室温下搅拌反应混合物。在约1小时内使悬浮液转变为澄清溶液。此时HPLC分析揭示起始核苷的完全消失。将反应混合物用水(0.1mL)猝灭，并且将溶剂在真空中蒸发。将残留物与无水吡啶(3x 20mL)共蒸发，溶解在无水吡啶(20mL)中并用DMT-Cl处理成固体。将混合物在室温下搅拌过夜。蒸发掉溶剂，将残留物用TEA:MeOH(10mL,(1:10))处理并再次蒸发。将残留物溶解在乙酸乙酯(150mL)中，用10％柠檬酸、5％NaHCO3和盐水依次洗涤。
分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，并且过滤。使用在乙酸乙酯中阶梯性梯度为0–20％的丙酮洗脱的快速色谱分离出产物(TLC:Rf～0.3，在乙酸乙酯/丙酮(8:2)中)。获得白色泡沫(1.81g,76％)。1H NMR(DMSO-d6):δ8.63(s,1H),8.14(s,1H),7.42–7.20(m,9H),6.92–6.89(m,4H),6.11(t,1H),5.29(d,1H),4.23–4.18(m,1H),3.96–3.93(m,1H),3.74(s,6H),3.45–3.41(m,2H),3.33–3.29(m,2H),3.22–3.19(m,2H),2.32–1.93(m,4H),0.93–0.85(m,12H)。
化合物M5.
将794mg(1.0mmol)的化合物M4(参见上文)和化合物M3(上文；637mg,1.2mmol)与Pd(PPh3)4(116mg,0.1mmol)、碘化亚铜(I)(38mg,0.2mmol)在配备有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中合并。将烧瓶排空并用氩气填充，用隔板(septum)和氩气气球密封。使用注射器通过隔板添加N,N-二甲基甲酰胺(10mL)和三乙胺(697μL,5mmol)，并且将混合物在Ar气氛下在环境温度下搅拌。反应的进展使用C18RP HPLC或TLC控制，监视起始核苷的消失。12～72小时后，将反应混合物用乙酸乙酯(150mL)稀释，并用0.1M Na2EDTA(2x 50mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x 50mL)和盐水(50mL)洗涤。
分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，并且浓缩成油。在硅胶柱(3x 20cm)上通过快速色谱分离出反应产物(TLC:Rf～0.35，在乙酸乙酯/丙酮(8:2)中)，所述硅胶柱(3x 20cm)从乙酸乙酯加载并且用在乙酸乙酯中阶梯性梯度为0–20％的丙酮洗脱。获得浅黄色玻璃状固体(834mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6):δ8.61(s,1H),8.04(s,1H),7.42–7.18(m,13H),7.08–7.04(m,4H),6.91–6.86(m,4H),6.12(t,1H),5.33(d,1H),5.03(d,4H),4.31–4.26(m,1H),3.99–3.89(m,3H),3.71(s,6H),3.33–3.22(m,5H),3.13–3.09(m,1H),2.57–2.52(m,2H),2.33–2.07(m,3H),1.96–1.86(m,1H),1.29(s,18H),0.84(d,12H)。31P NMR(DMSO-d6):δ-1.3。
化合物M6.
在氩气下向保持在0℃的在含有N,N-二异丙基乙基胺(348μL,2.0mmol)的无水CH2Cl2(10mL)中的化合物M5(上文；814mg)的搅拌溶液逐滴添加2-氰基乙基N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(159μL,0.71mmol)。使反应混合物升温至室温，并在30分钟后添加甲醇(0.1mL)。然后将反应混合物用乙酸乙酯(150mL)稀释并用5％NaHCO3水溶液(3x 50mL)和盐水(50mL)洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，并且浓缩成油。将产物在硅胶柱(3x 15cm)上使用快速色谱纯化，所述硅胶柱(3x15cm)从乙酸乙酯/己烷/三乙胺(50:50:2)加载，并且用在己烷/三乙胺(100:2)中阶梯性梯度为50–100％的乙酸乙酯洗脱。获得奶油状泡沫(803mg,85％)。31P NMR(DMSO-d6):δ147.47,147.23,-1.29。
实施例2.DMT-CBP亚磷酰胺(M11)的合成
实施例2描述用于制备经修饰的胞嘧啶3’-亚磷酰胺单体M11的受保护形式的合成步骤，所述经修饰的胞嘧啶3’-亚磷酰胺单体M11的受保护形式包含与嘧啶5-位碳通过1-丁炔基连接体连接的经保护的磷酸酯部分(本文将该经修饰的碱基有时称为“CBP”)。M11的5’-羟基受DMT基团保护，磷酸酯部分的两个羟基受α,α-二甲基-o-亚苯甲基保护基而不是实施例1中使用的新戊酰基氧苄基保护基保护。
2-(羟基-1-甲基-乙基)-苯酚(化合物M7).
该化合物按照以下文献中所述的方法合成：Johnsson,R.,Mani,K.,Cheng,F.,Ellervik,U.(2006)J.Org.Chem.,第71卷，第3444-3451页.
化合物M8.
在氩气下将化合物M7(上文；3.42g,22.5mmol)溶解在无水THF(50mL)中，在丙酮-干冰浴中将所获得溶液冷却至-20℃。在搅拌和冷却下逐滴添加二氯二异丙基亚磷酰胺(5.0g,24.7mmol)，然后添加N,N-二异丙基乙基胺(9.80mL,56.3mmol)。使反应混合物升温至室温，并搅拌1小时。然后将其用乙酸乙酯(～150mL)稀释并用5％NaHCO3水溶液(3x50mL)洗涤，然后用盐水(50mL)洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。在用己烷/三乙胺(100:2)洗脱的硅胶柱(4x 20cm)上使用快速色谱分离出产物(TLC:Rf～0.85，在己烷/三乙胺(100:2)中)。汇集纯级分，将其浓缩以提供5.58g(88％)的无色油，其在-20℃储存时固化。1H NMR(DMSO-d6):δ7.23–7.13(m,2H),6.97–6.82(m,2H),3.67–3.54(m,2H),1.69(s,3H),1.56(s,3H),1.19–1.14(m,12H).31P NMR(DMSO-d6):δ130.75。
化合物M9.
在氩气气氛下将3-丁炔-1-醇(1.50mL,18.9mmol)和化合物M8(5.58g,19.8mmol)溶解在无水乙腈(50mL)中。立即添加5-(乙硫基)-1H-四唑(87mL,0.25M，在乙腈中)的溶液，并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加叔丁基氢过氧化物溶液(5.0mL,5-6M，在癸烷中)，并且将所述混合物搅拌另外2小时。然后在真空下除去溶剂，并将残留物溶解在乙酸乙酯(200mL)中，用饱和NaHCO3(3x 50mL)洗涤，并用盐水(50mL)洗涤。将有机相在Na2SO4上干燥，过滤并浓缩。使用在己烷中阶梯性梯度为30–50％的乙酸乙酯在硅胶上通过快速色谱分离出产物(TLC:Rf～0.33，在乙酸乙酯/己烷(1:1)中)。获得无色油4.79g(91％)。1H NMR(DMSO-d6):δ7.45–7.35(m,2H),7.25–7.13(m,2H),4.13–4.05(m,2H),2.85(t,1H,J＝2.7Hz),2.55–2.49(m,2H),1.79(s,3H),1.73(s,3H).31P NMR(DMSO-d6):δ-12.45。
化合物M10.
用2.38g(3.0mmol)的化合物M4和化合物M9(1.04g,3.9mmol)开始，按照对于化合物M5所述的步骤，合成该化合物。在硅胶柱(4x 20cm)上通过快速色谱分离出反应产物(TLC:Rf～0.3，在乙酸乙酯/丙酮(8:2)中)，所述硅胶柱(4x 20cm)从乙酸乙酯加载并且用在乙酸乙酯中阶梯性梯度为0–20％的丙酮洗脱。获得浅褐色泡沫(2.27g,81％)。1H NMR(DMSO-d6):δ8.62(s,1H),8.00(s,1H),7.42–7.03(m,13H),6.91–6.86(m,4H),6.12(t,1H),5.34(d,1H),4.30–4.25(m,1H),3.99–3.90(m,3H),3.71(s,6H),3.34–3.22(m,5H),3.14–3.09(m,1H),2.56–2.50(m,4H),2.33–2.08(m,3H),1.97–1.90(m,1H),1.72(s,3H),1.69(s,3H),0.89–0.81(m,12H).31P NMR(DMSO-d6):δ-12.57。
化合物M11.
用2.24g(2.4mmol)化合物M10开始，按照对于化合物M6所述的步骤，合成亚磷酰胺化合物M11。将产物在硅胶柱(4x 20cm)上使用快速色谱纯化，所述硅胶柱(4x 20cm)从乙酸乙酯/己烷/三乙胺(60:40:2)加载，并且用在己烷/三乙胺(100:2)中阶梯性梯度为60–100％的乙酸乙酯洗脱。获得奶油状泡沫(2.38g,87％)。31P NMR(DMSO-d6):δ147.44,147.15,-12.58。
实施例3.CBP-PNA(M18)的合成
实施例3描述用于制备经修饰的胞嘧啶PNA单体M18的受保护形式的合成步骤，所述经修饰的胞嘧啶PNA单体M18的受保护形式包含与PNA单体主链连接的CBP部分。单体包含受α,α-二甲基-o-亚苯甲基保护基保护的磷酸酯部分、Fmoc-保护的氨基和游离羧基，以用于通过PNA肽偶联法引入多核苷酸寡聚物中。
化合物M12.
化合物M12根据文献方法(J.Org.Chem.,2008,73,p.3807-3816)制备。
化合物M13.
在氩气下将5-碘胞嘧啶(5.10g,21.5mmol)溶解在125mL的无水DMF中，并且将溶液冷却至0℃，然后添加NaH(95％,0.544g,21.5mmol)。在环境温度下搅拌1小时后，溶液变澄清，并且4小时后形成沉淀。用2分钟逐滴添加溴代乙酸乙酯(2.38mL,21.5mmol)，使反应混合物继续在环境温度下过夜。在高度真空下通过旋转蒸发除去溶剂，并且向残留油添加100mL水。通过过滤、干燥和从乙醇重结晶收集固化残留物，从而产生5.19g(75％)的产物。1H NMR(DMSO-d6):δ1.18(t,3H),4.12(q,2H),4.44(s,2H),6.65(s,1H),7.83(s,1H),8.09(s,1H)。
化合物M14.
将化合物M13(上文；5.11g,15.8mmol)悬浮在250mL的无水THF中，并且向溶液添加DMAP(193mg,1.6mmol)、三乙胺(4.40mL,31.6mmol)、Boc2O(7.59g,34.8mmol)。在环境温度下搅拌6小时后，添加另外的1.5g Boc2O，将反应混合物加热2小时至60℃，然后使其在环境温度下搅拌过夜。通过在真空下蒸发除去溶剂，在用在己烷中阶梯性梯度为30–50％的乙酸乙酯洗脱的硅胶柱(5x 18cm)上通过快速色谱分离出反应产物，从而产生5.49g(66％)。1HNMR(DMSO-d6):δ1.21(t,3H),1.42(s,18H),4.18(q,2H),4.72(s,2H),8.69(s,1H)。
化合物M15.
将化合物M14(上文；5.46g,10.4mmol)溶解在90mL的THF中，并冷却至0℃。用20分钟向搅拌中的THF溶液经由加料漏斗逐滴添加30mL的2.5M NaOH溶液。45分钟后，将反应混合物倒入含有150mL的1M NaHSO4和150mL的乙酸乙酯的分液漏斗中。将混合物摇晃，并且分离出有机层。用乙酸乙酯(2X100mL)提取水性层，将合并的有机层在Na2SO4上干燥。在真空下除去溶剂，将残留物(5.54g)用于下一步骤，而无需进一步纯化或表征。
化合物M16.
在氩气下在配备有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中将来自之前步骤的化合物M15(10.4mmol)和化合物M9(上文；2.77g,10.4mmol)溶解在100mL无水DMSO中，并且添加Pd(PPh3)4(1.12g,1.04mmol)、碘化亚铜(I)(199mg,1.04mmol)和三乙胺(7.5mL,52mmol)。将溶液加热至65℃，并且在65℃下搅拌4小时。将反应混合物用二氯甲烷(300mL)稀释，在空气中在环境温度下搅拌30分钟，然后将混合物用水(300mL)、0.1M Na2EDTA(2x 250mL)、水(250mL)和盐水(250mL)洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，过滤，并且浓缩成油。在用在乙腈中阶梯性梯度为1–4％的水洗脱的硅胶柱(7x18cm)上通过快速色谱分离出反应产物，从而产生3.97g,(60％，对于2个步骤)。1H NMR(DMSO-d6):δ1.37(s,9H),1.42(s,9H),1.73(s,3H),1.79(s,3H),4.05-4.12(m,4H),4.63(d,2H),7.12-7.44(m,5H)。
化合物M17.
在氩气下将化合物M16(上文；1.91g,3.0mmol)和化合物M12(上文；1.05g,2.7mmol)溶解在40mL无水DMF中，并且将所获得溶液冷却至0℃。添加DIEA(1.60mL,9mmol)，然后添加HATU(1.43g,3.8mmol)，在0℃下搅拌10分钟后，使混合物升温至环境温度，并且在环境温度下搅拌1.75小时。将反应混合物用二氯甲烷(200mL)稀释，并且用1M HCl(200mL)、水(2X150mL)和盐水(150mL)洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，过滤，并且浓缩成油。在用在二氯甲烷中阶梯性梯度为1–4％的甲醇洗脱的硅胶柱(5x 18cm)上通过快速色谱分离出反应产物，从而产生1.32g,(48％)。1H NMR(DMSO-d6):δ1.39(s,18H),1.72(s,3H),1.77(s,3H),2.72(t,2H),3.18-3.49(m,4H),4.09-4.42(m,5H),4.59-4.97(m,5H),5.19-5.33(m,2H),5.8-6.1(m,1H),7.12-7.20(m.2H),7.31-7.43(m,7H),7.64-7.74(m,3H),7.88-7.90(m,2H)。
化合物M18.
将化合物M17(上文；1.25g,1.25mmol)溶解在25ml氯仿中，并且在氩气下添加乙酸(1.5mL)、4-甲基吗啉(0.75mL)和Pd(PPh3)4(145mg,0.13mmol)。将反应混合物在环境温度下搅拌5小时。将反应混合物用二氯甲烷(150mL)稀释，并且用1M NaHSO4和盐水洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，过滤，并且浓缩成油。在用在二氯甲烷中阶梯性梯度为2–10％的甲醇洗脱的硅胶柱(3x 15cm)上通过快速色谱分离出反应产物，从而产生0.788g(65％)。1HNMR(DMSO-d6):δ1.39(s,18H),1.72(s,3H),1.77(s,3H),2.52(m,2H),3.18-3.49(m,4H),4.09-4.42(m,4H),4.59-4.97(m,4H),5.19-5.33(m,2H),5.8-6.1(m,1H),7.12-7.20(m.2H),7.31-7.43(m,7H),7.64-7.74(m,3H),7.88-7.90(m,2H).
实施例4.DMT-CPP-1亚磷酰胺(M24)的合成
实施例4描述用于制备经修饰的胞嘧啶3’-亚磷酰胺单体M24的受保护形式的合成步骤，所述经修饰的胞嘧啶3’-亚磷酰胺单体M24的受保护形式包含其磷原子与嘧啶5-位碳通过1-戊炔基连接体连接的经保护的膦酸酯(即，Z是CH2)(本文将该经修饰的碱基有时称为“CPP”)。该实施例说明制造包含膦酸酯部分的经保护的核苷亚磷酰胺的方法。
2-(羟基-1-甲基-乙基-苯酚(化合物M20＝以上M7).
该化合物按照以下所述的方法合成：Johnsson,R.,Mani,K.,Cheng,F.,Ellervik,U.(2006)J.Org.Chem.,v.71,pp.3444-3451。
化合物M21.
将配有空气冷凝器的100-mL圆底烧瓶填充以5-氯-1-戊炔(15.0mL,0.14mol)和亚磷酸三乙酯(25.7mL,0.15mol)。将烧瓶的内容物加热回流(120℃矿物油浴)。回流间歇性地继续2周，该段时间期间沸腾温度逐渐升高至180℃。此时通过31P NMR在反应混合物中仅可检测出痕量的亚磷酸三乙酯。中断加热，并且将混合物冷却至环境温度，并且在～1mm,Hg真空蒸馏。收集在91–92℃/～1mm下沸腾的级分，提供14.0g(48％)无色液体。1H NMR(DMSO-d6):δ4.04–3.93(m,4H,),2.82(t,1H),2.26(dt,2H),1.85–1.74(m,2H),1.69–1.58(m,2H),1.23(t,6H).31P NMR(DMSO-d6):δ31.20)。
化合物M22.
在Ar气氛下在室温下将化合物M20(上文；2.04g,10.0mmol)溶解在溴代三甲基硅烷(3.96mL,30.0mmol)中，并且在50-mL圆底烧瓶中保持密封过夜。在减压下除去挥发物，并且在高度真空中将残留物干燥半小时。将烧瓶的内容物溶解在含有N,N-二甲基甲酰胺(0.1mL)的无水二氯甲烷(10mL)中，并在氩气下冷却至-20℃。在搅拌下将溶液用草酰氯(3.43mL,40.0mmol)逐滴处理。使反应混合物升温至室温，并搅拌2小时。然后将其在减压下蒸发，并且将残留物在高度真空中干燥1小时。将残留的浅黄色固体溶解在无水二氯甲烷(5.0mL)中，并且将所获得溶液冷却至-20℃。在搅拌下逐滴添加在含有N,N-二异丙基乙基胺(6.96mL,40.0mmol)的二氯甲烷(5mL)中的化合物M6(上文；1.52g,10.0mmol)的溶液。使反应混合物升温至环境温度，搅拌过夜，然后用乙酸乙酯(150mL)稀释。将所获得溶液用5％NaHCO3(3x 50mL)和盐水(50mL)洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，过滤和浓缩。使用在己烷中阶梯性梯度为20–80％的乙酸乙酯在硅胶上通过快速色谱分离出产物(TLC:Rf～0.2，在乙酸乙酯/己烷(1:1)中，或者Rf～0.6，在乙酸乙酯中)。产率：2.05g(78％；略带色的油)。1H NMR(DMSO-d6):δ7.43–7.35(m,2H),7.23–7.13(m,2H),2.79(t,1H),2.24(bt,2H),1.99–1.89(m,2H),1.73(ds,6H),1.68–1.57(m,2H).31P NMR(DMSO-d6):δ22.34。
化合物M23.
将化合物M4(上文)与Pd(PPh3)4、碘化亚铜(I)在配备有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中合并。将所述烧瓶排空并用氩气填充，用隔板和氩气气球密封。使用注射器通过隔板添加化合物M22(上文)和三乙胺的溶液，并且将混合物在Ar气氛下在环境温度下搅拌。15小时后，将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并用0.1M Na2EDTA、饱和NaHCO3水溶液(3X50mL)和盐水(50mL)洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，并且浓缩成油。在硅胶上通过快速色谱分离出反应产物。
化合物M24.
向保持在0℃下的在含有N,N-二异丙基乙基胺的无水CH2Cl2中的化合物M23(上文)的搅拌溶液，在氩气下逐滴添加2-氰基乙基N,N-。使反应混合物升温至室温，并在30分钟后添加甲醇。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并且用5％NaHCO3水溶液和盐水洗涤。分离有机层，将其在Na2SO4上干燥，并且浓缩成油。在硅胶柱上使用快速色谱对产物M24纯化。
实施例5.CBP取代的寡聚物杂交
实施例5描述下述试验，所述试验中，当各自与互补12聚物DNA寡聚物(“短互补物”)或互补18聚物DNA寡聚物(“长互补物”)杂交时，将包含1个或2个CBP部分的18聚物DNA寡聚物(具有去保护的磷酸酯基团)的亲合性与仅包含常规A、C、G和T核苷酸的相应18聚物DNA寡聚物的杂交亲合性比较。如图1(经修饰的寡聚物和未经修饰的寡聚物与短互补物的杂交)中的解链曲线数据所示，并且如表1和2中所总结的，观察到包含2个CBP部分的经修饰的寡聚物具有的Tm，实质上大于对于未经修饰的18-聚物和包含单个CBP部分的18聚物的杂交所观察到的Tm值。包含单个CBP部分的寡聚物的Tm值，实质上高于用未取代寡聚物观察到的Tm值，当与互补12聚物杂交时传达稳定化为2.2℃和2.8℃，当与互补18聚物杂交时稳定化为1.9℃和2.0℃(参见表1和2)。对于经双修饰的C3寡聚物分别与互补12聚物和18聚物杂交观察到的Tm值为4.6℃和3.6℃，表明各经修饰的碱基取代的单独稳定化效果在该实施例中几乎是累加的。
表征包含CBP取代的寡聚物的杂交，并且将其与仅包含常规胞嘧啶碱基的未经修饰的寡聚物的杂交性质比较。寡聚物C1和C2包含1个CBP部分，寡聚物C3包含2个CBP部分。寡聚物序列如下所示：
C1 5’-TTT AGA(CBP)TT CTT GGA TTT-3’ (SEQ ID NO:1)
C2 5’-TTT AGA CTT(CBP)TT GGA TTT-3’ (SEQ ID NO:2)
C3 5’-TTT AGA(CBP)TT(CBP)TT GGA TTT-3’ (SEQ ID NO:3)
短互补物和长互补物的序列如下所示：
短互补物 5’-TCC AAG AAG TCT-3’ (SEQ ID NO:4)
长互补物 5’-AAA TCC AAG AAG TCT AAA-3” (SEQ ID NO:5)
沿着其3’→5’方向，短互补物和长互补物的序列分别读作3’-TCTGAAGAACCT-5’和3’-AAATCTGAAGAACCTAAA-5’(显示胜过(better)与C1、C2和C3互补的互补区)。
Tm数据使用标准解链条件(1uM的各寡核苷酸、3mM MgCl2、15mM KCl、25mM HEPES，pH 8)获得，并且记录相对于温度(℃)的270nm下吸光度。
图1显示对于与上述短互补物序列杂交的寡聚物C1、C2和C3观察到的解链曲线(绘制成270nm下吸光度相对于温度(℃)的一阶导数)。从图1中的数据计算出的Tm值在表1中列表如下：
表1
与短互补物序列杂交
ΔTm是Tm(经修饰的寡聚物)-Tm(未经取代寡聚物)
NA＝不适用。
以与以上解释相同的方式，对于寡聚物与长互补物的杂交也记录解链曲线，并且所获得的Tm值在表2中列表如下：
表2
与长互补物序列杂交
寡聚物 T<sub>m</sub>(℃) ΔT<sub>m</sub>(℃)
未经取代 54.2 NA
C1 56.1 1.9
C2 56.2 2.0
C3 57.8 3.6
ΔTm是Tm(经修饰的寡聚物)-Tm(未经取代寡聚物)
NA＝不适用。
实施例6.经修饰的探针在5’-核酸酶PCR中的性能
在实施例6中，使用包含本发明的0、1、2、3或5个经修饰的(CBP)碱基的可切割猝灭荧光探针进行5’-核酸酶PCR反应。图2A和2B中显示的PCR曲线说明，所有包含CBP部分的寡聚物都有效地充当检测探针。此外，包含CBP部分的寡聚物与未经修饰的寡聚物相比，具有更大的对互补寡聚物序列的亲合性，允许较高的PCR延伸温度和较短PCR循环次数。
评价包含1～5个CBP取代的5’-核酸酶PCR探针。使用人基因组DNAβ-球蛋白管家基因作为靶标。在Stratagene Mx3005P仪器上进行PCR，每个反应测试三次。使用以下PCR方法：
扩增子长度-96bp，10,000个拷贝/反应；
引物浓度–200nM；
探针浓度–200nM；
第一次变性为在95℃下60秒
循环：退火–在68℃下延伸30秒；在95℃下变性8秒
正向引物和反向引物具有以下序列：
F1 5’-AATTCCTGAAGCTGACAG(CBP)A-3’ (SEQ ID NO:6)
R1 5’-AAATAGCCTCCAGGC(CBP)A-3’ (SEQ ID NO:7)
寡聚物探针具有以下序列：表3
在图2A和2B中示出作为循环数量的函数的PCR荧光曲线。可以看出，在整个寡聚物的一个或多个位置的CBP取代，即使接近5’端，不影响所述探针被聚合酶的5’-核酸酶活性进行5’切割的效率(3’端处的修饰未显示，这是因为其对5’-核酸酶切割无效果)。此外，包含本发明的经修饰的碱基而不是常规胞嘧啶碱基的探针与不包含经修饰的碱基的探针相比，通常具有更高的对互补靶序列的结合亲合性。
实施例7. 5’核酸酶PCR探针的性能
实施例7描述以下研究，在所述研究中，使用不含有CBP部分的一对正向引物和反向引物(引物P2F和P2R)或者含有1个CBP部分的一对正向引物和反向引物(P1F和P1R)进行5’核酸酶PCR反应。图3显示利用一系列不同延伸温度的使用经修饰的引物P1F和P1R获得的PCR曲线。可以看出，在60℃和63℃的延伸温度时所述引物表现良好，但是在66℃时PCR效率降低，并且在69℃时不可检测。这些结果证明本发明的经修饰的寡聚物是如何能够表征以确定最佳PCR条件，以及是否应该对引物、探针或者需要时的反应条件进行进一步修改。
也对实施例7中的经修饰的寡聚物在不同退火时间相对于未经修饰的引物的性能进行评价。图4A和4B中显示所获得的PCR曲线。可以看出，经修饰的引物有效地表现为PCR中的聚合酶底物。
还将包含CBP部分的寡聚物评价为5’-核酸酶PCR引物。在该研究中，正向引物和反向引物在接近3’端包含单个CBP取代，序列如下：
P1F 5’-AATTCCTGAAGCTGACAG(CBP)A-3’ (SEQ ID NO:16)
P1R 5’-AAATAGCCTCCAGGC(CBP)A-3’ (SEQ ID NO:17)
在一个研究中，在以下条件下使用4种不同的延伸温度进行5’-核酸酶PCR反应：
靶标：10,000个拷贝/反应；
引物浓度–200nM；
探针浓度–200nM；
第一次变性为在95℃下60秒
循环：退火–在60、63、66或69℃下延伸30秒；在95℃下变性8秒。
在图3中示出作为循环数量的函数的PCR荧光曲线。可以看出，在60℃和63℃的延伸温度时所述引物表现良好，但是在66℃时PCR效率降低，并且在69℃时不存在。这些结果证明本发明的经修饰的寡聚物是如何能够表征以确定最佳PCR条件，以及需要时是否应该进行进一步修改。
在第二研究中，使以上经修饰的引物以各种不同的退火时间进行5’-核酸酶PCR，并且将结果与使用相应的未经修饰的引物获得的结果比较，所述未经修饰的引物的序列如下所示：
P2F 5’-AATTCCTGAAGCTGACAGCA-3’ (SEQ ID NO:18)
P2R 5’-AAATAGCCTCCAGGCCA-3’ (SEQ ID NO:19)
具体而言，未经修饰的正向引物和反向引物以5种不同的退火时间(13、16、20、30和45秒–参见图4A)进行评价，并且以上所示出的经CBP修饰的引物P1F和P1R以7种不同的退火时间(8、10、13、16、20、30和45秒–参见图4B)进行评价。结果证明，除了增加杂交亲合性之外，所述引物对于DNA聚合酶的引物延伸活性而言是良好的底物。这些结果证明，对于所述经修饰的引物而言，在较短的退火时间时不存在检测到的“降低(slow-down)”的效果。对于经修饰的和未经修饰的引物而言，在适当低的退火温度下，扩增曲线阈值循环(Ct)和EPR对于天然引物是相同的。
实施例8.包含CBP部分的PNA寡聚物的合成
实施例8提供使用Fmoc-PAL-PEG-PS树脂制备包含经修饰的和/或未经经修饰的碱基的PNA寡聚物的合成方法。
PNA合成使用来自Applied Biosystems的Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(0.16mmol/g)手动进行。经Fmoc-保护的单体和HATU获自PolyOrg,Inc。溶剂获自EMD。哌啶、TFA、DIEA和间甲酚来自Aldrich。使用之前将树脂在DCM中膨胀至少2小时，然后用DCM(5x)和DMF(5x)洗涤。
合成方法：
去保护：在DMF中的20％哌啶，2x 5分钟
洗涤：DMF(5x),DMF/DCM(1:1)(5x)
预活化：HATU(4当量),DIEA(4.5eq),PNA-单体(1当量),DMF,3分钟
偶联：30分钟
洗涤：DMF/DCM(1:1)(5x)
加帽：5％Ac2O/5％DIEA,10分钟
洗涤：DMF(5x)
在室温下用TFA/间甲酚(9:1)进行90分钟从固体支持物的切割，然后在Et2O中沉淀。通过离心收集固体，并且重复Et2O洗涤/离心2次。通过反相HPLC进行纯化后，通过ESI(+)质谱将PNA表征。
实施例9.PNA-DNA嵌合体的合成
实施例9提供可以制造PNA-DNA嵌合寡聚物的通用方法，其中，将包含本发明的经修饰的碱基的PNA单体借助于核苷亚磷酰胺或者经修饰的PNA单体引入。
如之前所报道的(Petraccone等,J.Am.Chem.Soc.,2005,16125-16223)，使用经Fmoc保护的PNA单体和核苷亚磷酰胺，经由固相策略合成PNA寡聚物和DNA-PNA嵌合体。使用N-Fmoc甘氨酸官能化的Tentagel-OH树脂与第一PNA单元反应，然后与5’-O-DMT-3’-O-(2-氰基乙基)亚磷酰胺鸟苷、胸苷、腺苷和胞苷单元反应，从而获得嵌合体。使嵌合体从固体支持物脱离，并且在55℃用浓氨水去保护12-16小时。将溶液蒸发以除去氨，并且经由制备型反相HPLC分离出产物。
实施例10.经CBP修饰的PNA与DNA的杂交
实施例10描述以下试验，在所述试验中，对于已经通过实施例8的方法制造并且包含CBP部分的PNA寡聚物确定解链温度。C-PNA与靶DNA的双链体具有47℃的Tm，与之相对，对照双链体具有38.4℃的Tm。这些结果显示，与对照DNA寡聚物观察到的Tm值相比，含有CBP的PNA寡聚物具有较高的Tm值，因此具有较高的结合亲合性。
制备具有CBP取代的PNA寡聚物，并将其对互补靶DNA序列的杂交亲合性(Tm)与相应的未经修饰的对照DNA寡聚物的杂交亲合性(Tm)进行比较。使用标准解链条件(1uM的各寡聚物、3mM MgCl2、15mM KCl、25mM HEPES，pH 8)获得Tm数据。使用以下序列：
C-PNA 5’-CGATACBPTGC-3’ (SEQ ID NO:20)
对照DNA 5’-CGATACTGC-3’ (SEQ ID NO:21)
靶DNA 5’-TTTGCAGTATCGTTT-3’ (SEQ ID NO:22)
C-PNA与靶DNA的双链体具有47℃的Tm，与之相对，对照双链体具有38.4℃的Tm。因此，经修饰的PNA显示，对于与互补DNA链杂交而言，相对于与相应的DNA寡聚物(缺乏任何碱基修饰)与相同互补DNA链杂交观察到的Tm，Tm提高约8.6℃。
实施例11：核苷合成的通用方法
化合物NS1说明包含经修饰的碱基的经修饰的核苷，所述经修饰的碱基含有膦酸酯部分。经由Pd(PPh3)4和碘化亚铜(I)催化的偶联，然后用25％氨水除去保护基，化合物NS1与化合物M23类似地制备。
化合物NS2说明包含经修饰的碱基的经修饰的核苷，所述经修饰的碱基含有磷酸酯部分。经由Pd(PPh3)4和碘化亚铜(I)催化的偶联，然后用25％氨水除去保护基，化合物NS2与化合物M23类似地制备。
实施例12:合成核苷酸5’-三磷酸酯的通用方法
NT1和NT2三磷酸酯从相应的5’-DMTr衍生物M23和M5通过下述过程合成：将3’-羟基乙酰化，然后除去5’-DMTr基团，并使用Hollenstein所述的方法(Hollenstein M.,Synthesis of Deoxynuleoside Triphosphates that Include Proline,Urea,orSulfonamide Groups and Their Polymerase Incorporation into DNA,Chem.Eur.J.2012,18,13320–13330)转化成相应的三磷酸酯。化合物NT1说明包含经修饰的碱基的经修饰的核苷酸5’-三磷酸酯，所述经修饰的碱基含有磷酸酯部分。化合物NT2说明包含经修饰的碱基的经修饰的核苷酸5’-三磷酸酯，所述经修饰的碱基含有膦酸酯部分。
实施例13:序列的合并表
以下表4提供如上所述本文制备和使用的序列的合并表。
表4
序列的合并表
虽然以上提供各种实施例和其它信息来解释权利要求范围内的各方面，但是基于此类实施例的特定特征和排列不应该暗指对权利要求的限制，因为本领域技术人员能够使用这些实施例来推导各种实施方案。此外，尽管已经可以用对结构特征、条件或用途的实例特定的语言描述一些主题，但是应该理解的是，权利要求中限定的主题不必限于其。
序列表
<110> 赛沛
<120> 经修饰的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法
<130> R2097-00376
<150> 61/972,391
<151> 2014-03-30
<160> 22
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: C1 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> CBP 部分
<400> 1
tttagacttc ttggattt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: C2 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> CBP 部分
<400> 2
tttagacttc ttggattt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: C3 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (7)..(7)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> CBP 部分
<400> 3
tttagacttc ttggattt 18
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: 短互补物序列
<400> 4
tccaagaagt ct 12
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: 长互补物序列
<400> 5
aaatccaaga agtctaaa 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: F1 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> CBP 部分
<400> 6
aattcctgaa gctgacagca 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: R1 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> CBP 部分
<400> 7
aaatagcctc caggcca 17
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-1 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 8
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-2 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (3)..(3)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 9
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-3 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 10
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-4 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 11
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-5 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (9)..(9)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 12
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-6 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (9)..(9)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 13
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-7 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (15)..(15)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 14
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: Pf1-C-8 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> FAM 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (1)..(1)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (4)..(4)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (10)..(10)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (15)..(15)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> CBP 部分
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> BHQ1 部分
<400> 15
ctccgtggcc ttagctgtgc tc 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: P1F 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> CBP 部分
<400> 16
aattcctgaa gctgacagca 20
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: P1R 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (16)..(16)
<223> CBP 部分
<400> 17
aaatagcctc caggcca 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: P2F 序列
<400> 18
aattcctgaa gctgacagca 20
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: P2R 序列
<400> 19
aaatagcctc caggcca 17
<210> 20
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: C-PNA 序列
<220>
<221> 经修饰的_碱基
<222> (6)..(6)
<223> CBP 部分
<400> 20
cgatactgc 9
<210> 21
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: 对照 DNA 序列
<400> 21
cgatactgc 9
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列的描述: 靶 DNA 序列
<400> 22
tttgcagtat cgttt 15

Claims (131)

1.一种多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸寡聚物包含至少一个经修饰的碱基，其中，所述至少一个经修饰的碱基由下式表示：
并且
其中，Z是CH2或O。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个脱氧核糖核苷酸部分。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述经修饰的碱基与所述脱氧核糖核苷酸部分共价连接。
4.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个肽核酸部分。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述经修饰的碱基与所述多核苷酸寡聚物中的所述至少一个肽核酸部分共价连接。
6.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物是PNA/DNA嵌合体。
7.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少两个经修饰的碱基，并且其中在所述至少两个经修饰的碱基中的Z相同或不同。
8.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物在其3’端处或者在距离其3’端一个碱基处进一步包含所述经修饰的碱基。
9.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含小沟结合剂或嵌入剂。
10.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含糖修饰。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述糖修饰选自由阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖和双环糖组成的组。
12.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含主链修饰。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述主链修饰选自由下述组成的组：经修饰的糖磷酸酯主链、锁核酸主链、肽主链、磷酸三酯主链、氨基磷酸酯主链、硅氧烷主链、羧甲基酯主链、乙酰胺酯主链、氨基甲酸酯主链、硫醚主链、桥接亚甲基膦酸酯主链、硫代膦酸酯主链、甲基膦酸酯主链、烷基膦酸酯主链、磷酸酯主链、烷基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、碳酸酯主链、磷酸酯三酯主链、羧甲基酯主链、甲基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、具有对乙氧基键的主链以及前述任何两种以上的组合。
14.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含通过DNA或RNA依赖性聚合酶能够延伸的3’末端核苷酸。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含小于30个核苷酸。
16.根据权利要求15所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述寡核苷酸寡聚物进一步包含9～25个核苷酸。
17.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个可检测标记。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述可检测标记是荧光团。
19.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含荧光猝灭剂。
20.一种使包含经修饰的碱基的多核苷酸寡聚物与怀疑在反应混合物中存在的核酸靶序列杂交的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含多核苷酸寡聚物并且怀疑包含靶核酸序列的反应混合物在有利于所述多核苷酸寡聚物与在所述反应混合物中如果存在的所述靶核酸序列杂交的条件下温育；和
(b)检测在所述反应混合物中所述靶核酸序列的存在或者确认其不存在；
其中，所述多核苷酸寡聚物与在所述核酸靶序列内的序列互补，
其中，所述多核苷酸寡聚物包含至少一个经修饰的碱基，
其中，所述至少一个经修饰的碱基由下式表示：
并且
其中，Z是CH2或O。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由可检测标记和荧光猝灭剂组成的组的部分。
22.一种双链体，所述双链体包含：
(i)至少一个多核苷酸寡聚物；和
(ii)多核苷酸序列
其中，所述至少一个多核苷酸寡聚物包含与所述多核苷酸序列的至少4个相邻碱基互补和杂交的4个以上相邻碱基，
其中，所述至少一个多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个经修饰的碱基，
其中，所述至少一个经修饰的碱基由下式表示
并且
其中，Z是CH2或O。
23.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由可检测标记荧光猝灭剂组成的组的部分。
24.一种由下式表示的经修饰的核苷亚磷酰胺：
其中，Z是CH2或O；
其中，X1和X2分别是相同或不同的保护基，或者X1和X2合起来看是二齿保护基；
其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；和
其中，Q是羟基保护基。
25.一种由下式表示的经修饰的肽核酸单体：
其中，Z是CH2或O；
其中，X1和X2分别是相同或不同的保护基，或者X1和X2合起来看是二齿保护基；
其中，Y1和Y2独立地是H或氮保护基，或者Y1和Y2一起是氮保护基；
其中，Q1和Q2独立地是H或氮保护基，或者Q1和Q2一起是氮保护基；和
其中，Q3是H或羧基保护基。
26.一种由下式表示的经修饰的胞嘧啶核苷：
27.一种由下式表示的经修饰的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯：
28.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由发色团、放射性同位素、自旋标记、酶标记、化学发光标记、电致化学发光化合物、磁性标记、微球、胶体金属、免疫标记、配体和荧光染料组成的组的标记。
29.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，当以5’→3’方向书写时至少一个经修饰的碱基位于选自由多核苷酸寡聚物的1位、多核苷酸寡聚物的2位、多核苷酸寡聚物的3位、多核苷酸寡聚物的4位、多核苷酸寡聚物的5位、多核苷酸寡聚物的6位、多核苷酸寡聚物的7位、多核苷酸寡聚物的8位、多核苷酸寡聚物的9位、多核苷酸寡聚物的10位、多核苷酸寡聚物的11位、多核苷酸寡聚物的12位、多核苷酸寡聚物的13位、多核苷酸寡聚物的14位、多核苷酸寡聚物的15位、多核苷酸寡聚物的16位、多核苷酸寡聚物的17位、多核苷酸寡聚物的18位、多核苷酸寡聚物的19位和多核苷酸寡聚物的20位组成的组的位置。
30.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物连接至固体支持物。
31.根据权利要求30所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述固体支持物选自由珠、阵列和微阵列组成的组。
32.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个连接有经修饰的糖部分的核苷酸。
33.根据权利要求32所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述经修饰的糖部分选自由2'-取代的糖和锁核酸糖组成的组。
34.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个非标准碱基。
35.根据权利要求34所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述一个或多个非标准碱基选自由经修饰的嘌呤和经修饰的嘧啶组成的组。
36.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个悬垂基团。
37.根据权利要求36所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述一个或多个悬垂基团选自由亲脂性基团、小沟结合剂、嵌入剂、螯合剂和交联剂组成的组。
38.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含连接在多核苷酸寡聚物的任意3'端、5'端或两端的尾部分。
39.根据权利要求38所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述尾部分选自由磷酸根、磷酸酯、烷基、氨基烷基和亲脂性基团组成的组。
40.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个脱氧核糖核苷酸部分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述经修饰的碱基与所述脱氧核糖核苷酸部分共价连接。
42.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个肽核酸部分。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述经修饰的碱基与至少一个所述多核苷酸寡聚物中的肽核酸部分共价连接。
44.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物是PNA/DNA嵌合体。
45.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少2个经修饰的碱基，并且其中至少2个经修饰的碱基中的Z是相同或不同。
46.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物在其3’端处或在距离其3’端一个碱基处进一步包含所述经修饰的碱基。
47.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含小沟结合剂或嵌入剂。
48.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含糖修饰。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述糖修饰选自由阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖和双环糖组成的组。
50.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含主链修饰。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述主链修饰选自由下述组成的组：经修饰的糖磷酸酯主链、锁核酸主链、肽主链、磷酸三酯主链、氨基磷酸酯主链、硅氧烷主链、羧甲基酯主链、乙酰胺酯主链、氨基甲酸酯主链、硫醚主链、桥接亚甲基膦酸酯主链、硫代膦酸酯主链、甲基膦酸酯主链、烷基膦酸酯主链、磷酸酯主链、烷基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、碳酸酯主链、磷酸酯三酯主链、羧甲基酯主链、甲基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、具有对乙氧基键的主链以及前述任何两种以上的组合。
52.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含通过DNA或RNA依赖性聚合酶能够延伸的3’末端核苷酸。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含小于30个核苷酸。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含9～25个核苷酸。
55.根据权利要求20所述的方法，其中检测的步骤包括检测连接至所述多核苷酸寡聚物的可检测标记。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述可检测标记是荧光团。
57.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含荧光猝灭剂。
58.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由发色团、放射性同位素、自旋标记、酶标记、化学发光标记、电致化学发光化合物、磁性标记、微球、胶体金属、免疫标记、配体和荧光染料组成的组的标记。
59.根据权利要求20所述的方法，其中，当以5’→3’方向书写时至少一个经修饰的碱基位于选自由多核苷酸寡聚物的1位、多核苷酸寡聚物的2位、多核苷酸寡聚物的3位、多核苷酸寡聚物的4位、多核苷酸寡聚物的5位、多核苷酸寡聚物的6位、多核苷酸寡聚物的7位、多核苷酸寡聚物的8位、多核苷酸寡聚物的9位、多核苷酸寡聚物的10位、多核苷酸寡聚物的11位、多核苷酸寡聚物的12位、多核苷酸寡聚物的13位、多核苷酸寡聚物的14位、多核苷酸寡聚物的15位、多核苷酸寡聚物的16位、多核苷酸寡聚物的17位、多核苷酸寡聚物的18位、多核苷酸寡聚物的19位和多核苷酸寡聚物的20位组成的组的位置。
60.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物连接至固体支持物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中，所述固体支持物选自由珠、阵列和微阵列组成的组。
62.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个连接有经修饰的糖部分的核苷酸。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述经修饰的糖部分选自由2'-取代的糖和锁核酸糖组成的组。
64.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个非标准碱基。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述一个或多个非标准碱基选自由经修饰的嘌呤和经修饰的嘧啶组成的组。
66.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个悬垂基团。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述一个或多个悬垂基团选自由亲脂性基团、小沟结合剂、嵌入剂、螯合剂和交联剂组成的组。
68.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含连接在多核苷酸寡聚物的任意3'端、5'端或两端的尾部分。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述尾部分选自由磷酸根、磷酸酯、烷基、氨基烷基和亲脂性基团组成的组。
70.根据权利要求20所述的方法，进一步包括步骤：
(c)执行扩增反应。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述扩增反应选自由聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR、实时PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增、连接酶链反应、滚环扩增和链置换扩增组成的组。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述扩增反应在自动热循环仪中进行。
73.根据权利要求20所述的方法，进一步包括步骤：
(c)执行DNA测序反应。
74.根据权利要求20所述的方法，进一步包括步骤：
(c)执行引物延伸反应。
75.根据权利要求20所述的方法，进一步包括步骤：
(c)将多核苷酸寡聚物连接至阵列。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述阵列选自由芯片阵列、平台阵列、珠阵列、液相阵列和邮政-编码阵列组成的组。
77.根据权利要求75所述的方法，其中所述阵列包含硝酸纤维素、玻璃、硅晶片或光学纤维。
78.根据权利要求20所述的方法，进一步包括步骤：
(c)执行5’-核酸酶反应。
79.根据权利要求20所述的方法，其中检测步骤包括检测连接至所述多核苷酸寡聚物的可检测标记或荧光猝灭剂。
80.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个脱氧核糖核苷酸部分。
81.根据权利要求80所述的双链体，其中所述经修饰的碱基与所述脱氧核糖核苷酸部分共价连接。
82.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个肽核酸部分。
83.根据权利要求82所述的双链体，其中所述经修饰的碱基与至少一个所述多核苷酸寡聚物中的肽核酸部分共价连接。
84.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物是PNA/DNA嵌合体。
85.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物包含至少2个经修饰的碱基，并且其中所述至少2个经修饰的碱基中的Z是相同或不同。
86.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物在其3’端处或在距离其3’端一个碱基处包含所述经修饰的碱基。
87.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含小沟结合剂或嵌入剂。
88.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含糖修饰。
89.根据权利要求88所述的双链体，其中所述糖修饰选自由阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖和双环糖组成的组。
90.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含主链修饰。
91.根据权利要求90所述的双链体，其中所述主链修饰选自由下述组成的组：经修饰的糖磷酸酯主链、锁核酸主链、肽主链、磷酸三酯主链、氨基磷酸酯主链、硅氧烷主链、羧甲基酯主链、乙酰胺酯主链、氨基甲酸酯主链、硫醚主链、桥接亚甲基膦酸酯主链、硫代膦酸酯主链、甲基膦酸酯主链、烷基膦酸酯主链、磷酸酯主链、烷基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、碳酸酯主链、磷酸酯三酯主链、羧甲基酯主链、甲基硫代膦酸酯主链、二硫代膦酸酯主链、具有对乙氧基键的主链以及前述任何两种以上的组合。
92.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含通过DNA或RNA依赖性聚合酶能够延伸的3’末端核苷酸。
93.根据权利要求92所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物包含小于30个核苷酸。
94.根据权利要求93所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物包含9～25个核苷酸。
95.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含至少一个可检测标记。
96.根据权利要求95所述的双链体，其中所述可检测标记是荧光团。
97.根据权利要求20所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含荧光猝灭剂。
98.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由发色团、放射性同位素、自旋标记、酶标记、化学发光标记、电致化学发光化合物、磁性标记、微球、胶体金属、免疫标记、配体和荧光染料组成的组的标记。
99.根据权利要求22所述的双链体，其中，当以5’→3’方向书写时至少一个经修饰的碱基位于选自由多核苷酸寡聚物的1位、多核苷酸寡聚物的2位、多核苷酸寡聚物的3位、多核苷酸寡聚物的4位、多核苷酸寡聚物的5位、多核苷酸寡聚物的6位、多核苷酸寡聚物的7位、多核苷酸寡聚物的8位、多核苷酸寡聚物的9位、多核苷酸寡聚物的10位、多核苷酸寡聚物的11位、多核苷酸寡聚物的12位、多核苷酸寡聚物的13位、多核苷酸寡聚物的14位、多核苷酸寡聚物的15位、多核苷酸寡聚物的16位、多核苷酸寡聚物的17位、多核苷酸寡聚物的18位、多核苷酸寡聚物的19位和多核苷酸寡聚物的20位组成的组的位置。
100.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述多核苷酸寡聚物连接至固体支持物。
101.根据权利要求100所述的双链体，其中，所述固体支持物选自由珠、阵列和微阵列组成的组。
102.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包括一个或多个连接有经修饰的糖部分的核苷酸。
103.根据权利要求102所述的双链体，其中，所述经修饰的糖部分选自由2'-取代的糖和锁核酸糖组成的组。
104.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个非标准碱基。
105.根据权利要求104所述的双链体，其中，所述一个或多个非标准碱基选自由经修饰的嘌呤和经修饰的嘧啶组成的组。
106.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含一个或多个悬垂基团。
107.根据权利要求106所述的双链体，其中，所述一个或多个悬垂基团选自由亲脂性基团、小沟结合剂、嵌入剂、螯合剂和交联剂组成的组。
108.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含连接在多核苷酸寡聚物的任意3'端、5'端或两端的尾部分。
109.根据权利要求108所述的双链体，其中，所述尾部分选自由磷酸根、磷酸酯、烷基、氨基烷基和亲脂性基团组成的组。
110.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述双链体连接至固体支持物。
111.根据权利要求110所述的双链体，其中，所述固体支持物选自由珠、阵列和微阵列组成的组。
112.根据权利要求24所述的经修饰的核苷亚磷酰胺，其中Z是O。
113.根据权利要求24所述的经修饰的核苷亚磷酰胺，其中Q是三苯甲基、甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。
114.根据权利要求24所述的经修饰的核苷亚磷酰胺，其中所述二齿保护基是o-亚苯甲基、α-甲基-o-亚苯甲基或α,α-二甲基-o-亚苯甲基。
115.根据权利要求24所述的经修饰的核苷亚磷酰胺，其中X1和X2独立地具有由下式表示的结构：
其中，R1和R2独立地是氢、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基或苯基；
n和m独立地是0、1、2、3或4；X是O或NR4；
Y是O或S；
Z是键、O或NR4；并且
各个R3相同或不同并且独立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6环烷基、氰基、硝基、卤素、C1-C6烷氧基、C3-C6环烷氧基、NR5a R5b或苯基；其中R4、R5a和R5b各自独立地是C3-C6环烷基或苯基。
116.根据权利要求24所述的经修饰的核苷亚磷酰胺，其中X1和X2独立地具有以下结构
其中，L是键、C1-C8亚烷基或C2-C8杂亚烷基、C2-C8亚烯基；并且
W是H、氰基、C(O)NRaRb、NO2、N+RaRbRc、C6H4NO2、C6H4Cl、C6H3(NO2)2、C6H2(NO2)3、SO2Rc或S(O)2ORc；Ra和Rb独立地是H、CF3、C1-C8烷基或C6-C10芳基；并且Rc是C1-C8烷基或C6-C10芳基。
117.根据权利要求116所述的经修饰的核苷亚磷酰胺，其中L是键，并且W是H。
118.根据权利要求24所述的经修饰的核苷亚磷酰胺，其中X1和X2各自分别是新戊酰基氧苄基基团。
119.根据权利要求25所述的经修饰的肽核酸单体，其中Q1是H，Q2是Fmoc，并且Q3是H。
120.根据权利要求20所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含为荧光团的部分。
121.根据权利要求22所述的双链体，其中，所述多核苷酸寡聚物进一步包含为荧光团的部分。
122.根据权利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、链亲和素、生物素、由抗体识别的表位、香豆素、香豆素衍生物、花青染料、曙红、赤藓红、镧系离子的大环螯合物、罗丹明染料和荧光能量转移染料组成的组的标记。
123.根据权利要求32所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述经修饰的糖部分选自由2'-O-烷基-核糖、2'-氨基-脱氧核糖、2'-氟-脱氧核糖、2'-氟-阿拉伯糖和2'-O-甲氧基乙基-核糖组成的组。
124.根据权利要求34所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述一个或多个非标准碱基选自由未经取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶碱基、3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶和5-取代的嘧啶组成的组。
125.根据权利要求20所述的方法，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、链亲和素、生物素、由抗体识别的表位、香豆素、香豆素衍生物、花青染料、曙红、赤藓红、镧系离子的大环螯合物、罗丹明染料和荧光能量转移染料组成的组的标记。
126.根据权利要求62所述的方法，其中，所述经修饰的糖部分选自由2'-O-烷基-核糖、2'-氨基-脱氧核糖、2'-氟-脱氧核糖、2'-氟-阿拉伯糖和2'-O-甲氧基乙基-核糖组成的组。
127.根据权利要求64所述的方法，其中，所述一个或多个非标准碱基选自由未经取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶碱基、3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶和5-取代的嘧啶组成的组。
128.根据权利要求20所述的方法，其中检测步骤包括检测连接至所述多核苷酸寡聚物的荧光团。
129.根据权利要求22所述的双链体，其中所述多核苷酸寡聚物进一步包含选自由辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、链亲和素、生物素、由抗体识别的表位、香豆素、香豆素衍生物、花青染料、曙红、赤藓红、镧系离子的大环螯合物、罗丹明染料和荧光能量转移染料组成的组的标记。
130.根据权利要求102所述的双链体，其中，所述经修饰的糖部分选自由2'-O-烷基-核糖、2'-氨基-脱氧核糖、2'-氟-脱氧核糖、2'-氟-阿拉伯糖和2'-O-甲氧基乙基-核糖组成的组。
131.根据权利要求104所述的双链体，其中，所述一个或多个非标准碱基选自由未经取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶碱基、3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶和5-取代的嘧啶组成的组。
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