JP4220397B2

JP4220397B2 - バイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブ

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Publication number: JP4220397B2
Application number: JP2003578887A
Authority: JP
Inventors: ガリメラ、ビスワナダム; ジェイ．ストーホフ、ジェームス
Original assignee: Nanosphere LLC
Current assignee: Nanosphere LLC
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-11-08
Publication date: 2009-02-04
Anticipated expiration: 2022-11-08
Also published as: EP1466015B1; ATE403751T1; AU2002367817B2; CA2466656C; EP1466015A2; JP2005519627A; US7186814B2; EP1466015A4; WO2003081202A3; WO2003081202A2; AU2002367817A1; CA2466656A1; DE60228128D1; US20030143598A1

Description

本発明は、核酸その他の標的検体を検出するのに有用な、安定したバイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブに関する。本発明はまた、バイオコンジュゲート‐ナノ粒子の製造方法、前記プローブを使用して標的検体を検出する方法、および前記プローブを含むキットに関する。

核酸を検出し配列決定する方法の開発は、遺伝性疾患、バクテリア性疾患およびウイルス性疾患の診断に極めて重要である。非特許文献１を参照のこと。特定のＤＮＡの存在を示すためにオリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子プローブを使用するＤＮＡ検出方法が、特許文献１（その全体が本願明細書に援用される）に記載されている。典型的には、検出しようとする核酸に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる。ナノ粒子が核酸にハイブリダイズすると、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが溶液中の核酸標的にハイブリダイズする結果として検出可能な変化がもたらされる。

ナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合させるため、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子またはその両者に官能基を導入する。これらの方法は当技術分野において知られており、例えば、オリゴヌクレオチドについてはその３’末端または５’末端にアルカンチオール類を用いて官能基を導入する。このような官能基を導入したヌクレオチドは、容易に金ナノ粒子に結合する。

アルカンチオール‐オリゴヌクレオチドで誘導体化したナノ粒子に伴う問題は、系をある温度を超えて加熱すると、オリゴヌクレオチドがナノ粒子表面から簡単に外れてしまうという点である。加熱はナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・プローブを不安定化し不活性化する。また、ＤＴＴなど他のチオールを含む化合物の存在下でオリゴヌクレオチドがナノ粒子表面から脱離してしまうこともある。
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号マンスフィールド、イー．エス．ら（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔａｌ．）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，１９９５年、第９巻、ｐ．１４５−１５６

オリゴヌクレオチドがナノ粒子に対してより良好な定着性を示し、したがってより安定かつ堅牢なオリゴヌクレオチド‐ナノ粒子プローブ、一般的にはバイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブが必要とされている。また、このような複合体の製造方法も必要とされている。

本発明は、ナノ粒子に連結したバイオコンジュゲートを含んでなるナノ粒子プローブを調製する方法であって、
（ｉ）以下の式(III)の構造を有するチオール修飾試薬（式中、ｎは１〜１０）を

下記式（ａ’）（ｂ’）（ｃ’）（ｄ’）または（ｅ’）の構造

と反応させて、下記式（ａ”）（ｂ”）（ｃ”）（ｄ”）または（ｅ”）

を有するジスルフィドを生成する工程と、
（ｉｉ）前記（ｉ）のジスルフィド（ａ”）（ｂ”）（ｃ”）（ｄ”）または（ｅ”）を還元して以下の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）のバイオコンジュゲートを生成する工程と、

（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のバイオコンジュゲートをナノ粒子に接触させて、ナノ粒子プローブを形成する工程と、
からなり、
前記バイオコンジュゲートが硫黄基を介してナノ粒子と連結され、
式中、
ｎは２〜１００であり、
ｍは０〜１００であり、
Ｘはヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであり、
Ｚはヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドまたはポリアニオンであり、
Ｑは認識基であり、
Ｒは直鎖または分岐鎖のＣ _１〜Ｃ _８アルキル基であり、
Ｗはステロイドであり、
各Ｌは、ＣＯＯＨ、ＮＨ _２、ＣＨＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、アリル、ビニルおよびＣＨ _３ＣＯ _２ ⁻ からなる群から選択される２つの部分の連結によって形成されるリンカーであるか、または、Ｌは‐Ｃ（＝ＮＨ _２Ｃｌ）ＣＨ _２） _３ ⁻ である、
方法を提供する。

本願で使用する場合、「（１つの）種類のオリゴヌクレオチド」は同じ配列を有する複数のオリゴヌクレオチド分子を指す。オリゴヌクレオチドが結合した「（１つの）種類の」ナノ粒子、粒子、ラテックス・ミクロスフェアなどは、同じ種類のオリゴヌクレオチドが結合した複数のナノ粒子を指す。「バイオコンジュゲートが結合したナノ粒子」は、「ナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブ」、「ナノ粒子プローブ」、「ナノプローブ」、または、単に「プローブ」とも呼ばれる。

式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）および（Ｇ）のバイオコンジュゲートは、ナノ粒子プローブを加熱するか、またはチオール含有化合物と接触させる際に生じる該プローブの不安定性の問題に解決策を提供する。特に、本発明は、バイオコンジュゲート上に存在する２つ以上の硫黄基（ｓｕｌｆｕｒｇｒｏｕｐ）がナノ粒子表面に結合し得るようにするもので、これにより、ナノ粒子‐バイオコンジュゲート結合の安定性を強化する。生じるバイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブは、熱に対し安定であり、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）のようなチオール含有化合物による脱離に対する抵抗性を増す。

本発明のナノ粒子プローブを形成するためにナノ粒子に連結されるバイオコンジュゲートは、以下の式のものである：

（式中、ｎ、ｍ、Ｘ、Ｚ、Ｌ、Ｒ、ＷおよびＱは上に定義した通りである）。
上に示すように、Ｑは認識基を表わす。「認識基」とは、核酸など標的検体への結合親和性を備えた少なくとも１つの結合性部分を意味する。したがって、結合性部分は、例えば互いに結合親和性を有する２つ以上の物質から構成される認識カップルのメンバーでもよい。したがって、バイオコンジュゲートがナノ粒子に結合すると、バイオコンジュゲートはナノ粒子に検体についての有用なバイオ認識性（ｂｉｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｙ）を付与する。例えば、標的が核酸である場合、認識基は核酸とのハイブリダイゼーションによってその核酸に結合し得る。次いで、核酸に結合したナノ粒子を検出することが可能である。

認識基の例には、限定はされないが、レセプター、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、２本鎖ＤＮＡ、タンパク質、抗体、ペプチド、炭水化物、糖、ハプテン、核酸、アミノ酸、ペプチド核酸、連結した核酸、ヌクレオシド三リン酸、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片または細胞全体が含まれる。認識基‐標的検体カップルの例には以下のものが含まれる：抗原と抗体；抗原と相補的抗原結合ドメインを有する抗体誘導体；糖とレクチン；レセプターとリガンド；ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；ヌクレオチド配列とその結合タンパク質または合成結合剤；ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン；セルロースまたはキチンとセルロース結合ドメイン。好ましい認識基はオリゴヌクレオチドである。抗体も好ましい。

また、認識基は、第２の認識基（例えば、オリゴヌクレオチド配列またはタンパク質）が結合した第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドとすることが可能である。この場合、第２の認識基を、標的検体（例えば、抗原）との特異的結合に使用することが可能である。

認識基はまた、認識カップルのメンバーである第２の認識基（例えば、ストレプトアビジン）に結合し得る第１の認識基（例えば、ビオチン）とすることが可能である。この場合、第２の認識基を、標的検体に結合し得る第３の認識基（例えば、レセプター）に直接または間接的に（例えば、リンカーを介して）結合させることが可能である。

Ｚは、存在する場合には、ヌクレオチド・スペーサー、修飾オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、またはポリエチレングリコールのようなオリゴヌクレオチド合成で利用し得る他のタイプのスペーサーである。ナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブの核酸とのハイブリダイゼーション効率は、バイオコンジュゲート上の認識基とナノ粒子との間のスペーサー部分の使用によって増大させ得ることがわかった。スペーサー部分の使用によって、認識基はナノ粒子の表面から遠ざけられ、その標的とのハイブリダイゼーションがより容易になる。認識部分をナノ粒子から適度に遠ざけるスペーサー部分の長さおよび配列は実験に基づいて決定することが可能である。少なくとも約１０個のヌクレオチド、好ましくは１０〜５０個のヌクレオチドからなるスペーサー部分が好結果を与えることがわかった。スペーサー部分は、認識基が標的検体またはサンドイッチ・ハイブリダイゼーション・アッセイの場合は表面上の捕捉部分と結合する能力を妨害しないのであれば任意の配列を有し得る。例えば、スペーサー部分は、スペーサー部分相互に、認識基の配列に、または標的検体の配列に相補的な配列を有してはならない。上に挙げた問題のうちのいずれかを引き起こすことがなければ、スペーサー部分のヌクレオチドの塩基はすべてアデニン、すべてチミン、すべてのシチジンまたはすべてグアニンであることが好ましい。より好ましくは、塩基はすべてアデニンまたはすべてチミンである。最も好ましくは、塩基はすべてチミンである。スペーサーＺと認識基Ｑとを様々な技法によって共に結合させることが可能である。例えば、共有結合によって直接に、または非共有結合によって間接的にそれらを結合させることが可能である。

リンカーとして、Ｌは任意の所望の化学基であり得る。例えば、Ｌは、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリメチレン、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸）、‐ＣＯＯ‐、‐ＣＨ_２（ＣＨ_２）_ｖＣＯＯ‐、‐ＯＣＯ‐、Ｒ^１Ｎ（ＣＨ_２）_ｖ‐ＮＲ^１‐、‐ＯＣ（ＣＨ_２）_ｖ‐、‐（ＣＨ_２）_ｖ‐、‐Ｏ‐（ＣＨ_２）_ｖ‐Ｏ‐、‐Ｒ^１Ｎ−（ＣＨ_２）_ｖ−、

（ここで、ｖは０〜３０であり、Ｒ^１はＨまたはＧ（ＣＨ_２）_ｖであり、Ｇは‐ＣＨ_３、‐ＣＨＣＨ_３、‐ＣＯＯＨ、‐ＣＯ_２（ＣＨ_２）_ｖＣＨ_３、‐ＯＨ、またはＣＨ_２ＯＨである）でありうる。

また、Ｌは、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＣＨＯ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、アリルおよびＣＨ_３ＣＯ_２ ⁻からなる群から選択される、分子に結合した２つの部分を連結することによって形成されるリンカーであるか、または、Ｌは‐Ｃ（＝ＮＨ_２Ｃｌ）（ＣＨ_２）_３ ⁻である。

Ｗは硫黄部分が容易に結合し得る脂肪族または芳香族の基である。例えば、Ｗはステロイドとし得る。実施例９に記載するように、Ｗはエピアンドロステロン誘導体であることが好ましい。

Ｘは、（示すように）チオール基を官能基として導入したヌクレオチドを表わす。好ましくは、Ｘ基はすべてアデニン、すべてチミン、すべてシチジンまたはすべてグアニンであり、より好ましくはすべてアデニンまたはすべてチミンであり、最も好ましくはすべてチミンである。（Ｘ）_ｎにおいて、ｎは２〜１００である。ｎは２〜５０であることが好ましく、より好ましくは２〜２０、さらに好ましくは２〜１０である。チオール基による連結Ｘへの官能基導入は様々な技法によって実行し得る。

本発明の１つの実施形態では、少なくとも２つの反応性基Ｒ_２を含む複合体（Ｉ）または複合体（ＩＩ）を、オリゴヌクレオチドの合成の間にＲ_２基を含むヌクレオチド構成ブロックを組み込むことにより合成する。Ｒ_２はＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＣＨＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、アリルまたはＣＨ_３ＣＯ_２ ⁻とし得る。複合体（Ｉ）または（ＩＩ）の中のＲ_２がＮＨ_２である場合、ＮＨ_２基を含むヌクレオチド誘導体を調製してオリゴヌクレオチドへの組み込む。本発明のこの態様で使用される適当なアミン修飾ヌクレオチド試薬には、以下のものが含まれる（しかし、これらに限定はされない）：Ｃ_６‐ｄＴホスホロアミダイト（５’‐ジメトシキトリチル‐５‐［Ｎ（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）‐３‐アクリルイミド］‐２’デオキシウリジン、３’‐［（２‐シアノエチル）‐（Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル）］‐ホスホロアミダイト）、アミノ修飾剤Ｃ_６‐ｄＣ（５’‐ジメトシキトリチル‐Ｎ‐ジメチルホルムアミジン‐５‐［Ｎ‐（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）‐３‐アクリルイミド］‐２’‐デオキシ‐シチジン、３’‐［（２−シアノエチル）‐（Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル）］‐ホスホロアミダイト）、およびアミノ修飾剤Ｃ_２‐ｄＴ（５’ジメトシキトリチル‐５‐［Ｎ‐（トリフルオロアセチルアミノエチル）‐３‐アクリルイミド］‐２’‐デオキシ‐ウリジン、３’‐［（２‐シアノエチル）‐（Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル）］‐ホスホロアミダイト）。これらお
よび他のアミノ修飾剤は、例えば、ヴァージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）所在のグレンリサーチ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）から市販されている。好ましいアミノ修飾剤は、Ｃ_６‐ｄＴである。

複合体（Ｉ）または（ＩＩ）をチオール化試薬と反応させるが、この試薬には複合体上のＲ_２基と反応して含硫黄官能基の導入されたバイオコンジュゲートを形成し得る基が官能化として導入されている。適当なチオール化試薬としては、一般に、複合体上のＲ_２基と反応し得る１個または複数の官能基を有するチオール化合物が含まれる。そのような試薬としては、シスタミン、および式ＳＨ（ＣＨ_２）_ｎＹの化合物（ここでｎは１〜２０であり、ＹはＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＣＨＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、アリルまたはＣＨ_３ＣＯ_２ ⁻である）が含まれるが、これらに限定されない。他の適当なチオール化試薬は２‐イミノチオラン塩酸塩（トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ‘ｓＲｅａｇｅｎｔ））であり、複合体（Ｉ）または（ＩＩ）の中のＲ_２がアミンである場合、本試薬が好ましい。この実施形態の好ましい態様では、フッ素化されたヌクレオチドがオリゴヌクレオチド配列に組み入れられ、シスタミンで処理されて配列上にジスルフィド単位を与えられる（参照文献として（１）Ｌ．Ｖ．ネチェフ（Ｌ．Ｖ．Ｎｅｃｈｅｖ）、Ｉ．コゼコフ（Ｉ．Ｋｏｚｅｋｏｖ）、Ｃ．Ｍ．ハリス（Ｃ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ）およびＴ．Ｍ．ハリス（Ｔ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ）、ＣｈｅｍＲｅｓＴｏｘｉｃｏｌ、２００１年、第１４巻、ｐ．１５０６−１５１２。（２）Ａ．Ｒ．ディアス（Ａ．Ｒ．Ｄｉａｚ）、Ｒ．エリチア（Ｒ．Ｅｒｉｔｊａ）およびＲ．Ｇ．ガルシア（Ｒ．Ｇ．Ｇａｒｃｉａ）、ＮｕｃｌｅｏｓＮｕｃｌｅｏｔ、１９９７年、第１６巻、ｐ．２０３５−２０５１。（３）Ｄ．Ａ．エルランソン（Ｄ．Ａ．Ｅｒｌａｎｓｏｎ），Ｊ．Ｎ．Ｍ．グローバー（Ｊ．Ｎ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）およびＧ．Ｌ．バーディン（Ｇ．Ｌ．Ｖｅｒｄｉｎｅ）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７年、第１１９巻、ｐ．６９２７−６９２８）。この好適な態様については、後述の実施例７〜９に詳細に記載する。

複合体（Ｉ）または（ＩＩ）をチオール化する別の方法は、試薬の組み合わせであるチオール化試薬を使用する方法である。例えば、複合体（Ｉ）または（ＩＩ）の中のＲ_２がＮＨ_２である場合は、複合体をＣＨＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨＯなどのアミン反応性２官能性架橋剤、およびＳＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２またはＳＨ（Ｃ_６Ｈ_４）ＮＨ_２などのアルキルまたはアリールチオールアミンで処理することが可能である。アミン反応性２官能性架橋剤およびアルキルチオールアミンのいずれの場合も、ｎは独立に１〜３０である。好ましくは、アミン反応性２官能性架橋剤はグルタルアルデヒドである（つまり、ｎが３である）。また、好ましくは、アルキルチオールアミンはメルカプトエチルアミンである（つまり、ｎが２である）。他の好ましい架橋剤には１，４‐フェニレンジイソチオシアネート、１，６‐ジヘキサン酸または１，６‐ヘキサンジイソシアネートが含まれる。

チオール官能基が導入されたバイオコンジュゲートを調製するためのより直接的な別の手法では、アルキルチオールまたは他のチオール系基を含むホスホロアミダイトを合成して、式（Ａ）のバイオコンジュゲートを調製するために使用する。アルキルチオール基を含むホスホロアミダイトの例は後述の実施例４に記載され、グリックら（Ｇｌｉｃｋｅｔａｌ．）、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、１９９３年、第３４巻、ｐ．
５５４９−５５５２（本願明細書に援用される）の方法によって調製される。

上に示すように、本発明は標的検体を検出するのに有用なバイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブを提供する。該プローブを形成するために、バイオコンジュゲート（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）または（Ｇ）を、バイオコンジュゲート上の硫黄結合によってナノ粒子の表面に結合させる。この結合は、バイオコンジュゲート分子当たり少なくとも２個のチオール基によって行うことが好ましい。ナノ粒子にバイオコンジュゲートを結合させるためには、様々な方法を使用することが可能である。実際、ナノ粒子にバイオコンジュゲートを結合させる任意の適当な方法を使用し得る。ナノ粒子にバイオコンジュゲートを結合させる好ましい方法は、米国特許出願番号第０９／３４４，６６７号（出願日：１９９９年６月２５日）；同第０９／６０３，８３０号（出願日：２０００年６月２６日；同第０９／７６０，５００号（出願日：２００１年１月１２日）；同第０９／８２０，２７９号（出願日：２００１年３月２８日）；同第０９／９２７，７７７号（出願日：２００１年８月１０日）；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（出願日：１９９７年７月２１日）；同第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号（出願日：２０００年６月２６日）；同第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号（出願日：２００１年１月１２日）；同第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号（出願日：２００１年３月２８日）に記載されたエージング・プロセスに基づく（これらの開示の全体を本願明細書に援用する）。

エージング・プロセスによりナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブの安定性および選択性が増強される。この方法は、上述のように調製した、共有結合したチオール官能基を有するバイオコンジュゲートを提供することを含む。官能基が導入されたバイオコンジュゲートを、官能基によって少なくともバイオコンジュゲートのうちの一部がナノ粒子に結合するのに十分な時間、水中でナノ粒子と接触させる。このような時間は実験的に決定することが可能である。例えば、約１２〜２４時間で好結果が得られることがわかった。バイオコンジュゲートの結合のための他の適当な条件も実験的に決定し得る。例えば、約１０〜２０ｎＭのナノ粒子濃度および室温でのインキュベーションで好結果が得られる。

次いで、少なくとも１種類の塩を水に加えて塩溶液を形成する。塩は任意の適当な水溶性塩とすることが可能である。例えば、塩は塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化セシウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸リチウム、硝酸セシウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム、酢酸セシウム、酢酸アンモニウム、これらの塩類の２種以上の組み合わせ、またはこれらの塩類のうちの１つをリン酸緩衝剤に含めたものでよい。好ましくは、塩は濃溶液として加えられるが、固体として加えることも可能である。塩は水に対し全量を一時に加えることも可能であるし、時間をかけて徐々に加えることも可能である。「時間をかけて徐々に」とは、塩を少なくとも二分して時間的な間隔を置いて断続的に加えることを意味する。適当な時間間隔は実験的に決定することが可能である。

塩溶液のイオン強度は、バイオコンジュゲートの相互の静電反発力、ならびに負帯電バイオコンジュゲートの正帯電ナノ粒子への静電引力または負帯電バイオコンジュゲートの正帯電ナノ粒子への静電反発力のいずれかを、少なくとも部分的に克服するのに十分でなければならない。塩を時間をかけて徐々に加えることにより徐々に静電引力および静電反発力を低減させると、ナノ粒子上においてバイオコンジュゲートが最も高い表面密度となることがわかった。適当なイオン強度は、各塩または塩類の組み合わせについて実験的に決定することが可能である。塩化ナトリウムの最終濃度をリン酸緩衝液中で約０．１Ｍ〜約３．０Ｍとし、好ましくは塩化ナトリウム濃度を時間をかけて徐々に増加させると良好な結果が得られることがわかった。

塩を加えた後、バイオコンジュゲートおよびナノ粒子を、さらに十分な時間をかけて塩溶液中でインキュベートして十分な追加のバイオコンジュゲートをナノ粒子に結合させて安定なナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブを生産する。ナノ粒子上のバイオコンジュゲートの表面密度が増加すると、プローブが安定することが分かった。このインキュベーションの時間は実験的に決定することが可能である。合計で約２４〜４８時間、好ましくは４０時間のインキュベーションが、好結果を与えることが分かった（これはインキュベーションの合計時間である。上記のようにこの時間内で塩濃度を徐々に増加させることも可能である）。塩溶液中でのこの第２のインキュベーション期間をここでは「エージング」ステップと呼ぶ。この「エージング」ステップの他の適当な条件も実験的に決定することが可能である。例えば、室温およびｐＨ７．０のインキュベーションは好結果を与える。次いで、溶液を遠心分離し、必要に応じてナノ粒子プローブを処理する。例えば、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機５４１４において溶液を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することが可能であり、これにより、コロイド金７〜１０％（５２０ｎｍでの吸光度によって示される）と共に大半のオリゴヌクレオチド（２６０ｎｍに吸光度によって示される）を含む非常に薄いピンク色の上清と、密で暗色のゼラチン状の管底残留物が得られる。上清を除き、残留物を所望の緩衝液中に再懸濁させる。

「エージング」ステップの使用によって生産されたプローブは、「エージング」ステップを経ずに生産したものより、大幅に安定性が高いことが分かった。上記のように、この安定性の増大は、ナノ粒子表面上のバイオコンジュゲート密度の増大が「エージング」ステップにより達成されることによる。「エージング」ステップによって達成される表面の密度は、ナノ粒子のサイズおよび種類、ならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存する。安定したナノ粒子とするための適当な表面密度、およびナノ粒子とオリゴヌクレオチドの所望の組み合わせのための表面密度を得るのに必要な条件は実験的に決定することが可能である。

上記のような多数のチオール部分を含むオリゴヌクレオチドまたはその他の認識要素は、チオール基への親和性を有する様々なナノ粒子に結合し得る。本発明の実施において有用なナノ粒子は、金属（例えば、金、銀、プラチナ、コバルト）、半導体（例えば、Ｓｉ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳで被覆されたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）、コア‐シェル型粒子（例えば、金被覆銀粒子）、合金粒子（例えば、銀と金の合金）、磁性体（例えば、コバルト）、および非金属コロイド材料（例えば、シリコン）を含む。コア‐シェル型粒子は、各々本願明細書に援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６３８２号、ならびに本願と同時係属している米国特許出願番号第１０／１５３，４８３号および第１０／０３４，４５１号に記載されている。チオール基への親和性を有する物質から構成された他のナノ粒子も使用し得る。また、チオール基への親和性を有する組成を備えたナノワイヤーまたはナノロッドも使用し得る。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、より好ましくは約５〜約５０ｎｍ、最も好ましくは約１０〜約３０ｎｍである。

金属、半導体および磁気ナノ粒子を作る方法は、当技術分野ではよく知られている。例えば、シュミット，Ｇ（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．）編、「ＣｌｕｓｔｅｒｓａｎｄＣｏｌｌｏｉｄｓ」（ヴァインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）所在のＶＣＨ，１９９４）；ハイアット，Ｍ．Ａ．（Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．）編、「ＣｏｌｌｏｉｄａｌＧｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（サンディエゴ所在のＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９９１）；マッサート，Ｒ．（Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．）、ＩＥＥＥＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓＯｎＭａｇｎｅｔｉｃｓ，第１７巻、ｐ．１２４７（１９８１）；アーマディ，Ｔ．Ｓ．ら（Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．ｅｔａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７２巻、ｐ．１９２４（１９９６）；ヘングライン，Ａ．ら（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．ｅｔａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９
９巻、ｐ．１４１２９（１９９５）；カーティス，Ａ．Ｃら（Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．，ｅｔａｌ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第２７巻、ｐ．１５３０（１９８８）参照。ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ_２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ_２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ_２Ｓ_３、Ｉｎ_２Ｓｅ_３、Ｃｄ_３Ｐ_２、Ｃｄ_３Ａｓ_２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓのナノ粒子を製造する方法も当技術分野において知られている。例えば、ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第３２巻、ｐ．４１（１９９３）；ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，第１４３巻、ｐ．１１３（１９８８）；ヘングライン（Ｈｅｎｇｌｅｉｎ）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，第８９巻、ｐ．１８６１（１９８９）；ブルス（Ｂｒｕｓ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．，第５３巻、ｐ．４６５（１９９１）；バーンクマン（Ｂａｈｎｃｍａｎｎ）、「ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎａｎｄＳｔｏｒａｇｅｏｆＳｏｌａｒＥｎｅｒｇｙ」（ペリゼッティ（Ｐｅｌｉｚｅｔｔｉ）およびシアヴェルロ（Ｓｃｈｉａｖｅｌｌｏ）編）（１９９１）、ｐ．２５１；ワン（Ｗａｎｇ）およびヘロン（Ｈｅｒｒｏｎ）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９５巻、ｐ．５２５（１９９１）；オルシャフスキら（Ｏｌｓｈａｖｓｋｙｅｔａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１２巻、ｐ．９４３８（１９９０）；ウシダら（Ｕｓｈｉｄａｅｔａｌ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９５巻、ｐ．５３８２（１９９２）参照。

適当なナノ粒子は、例えば、テッド・ペラ社（ＴｅｄＰｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）（金）、アマシャム・コーポレイション（ＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（金）、ナノプローブズ社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（金）から市販もされている。現時点で好ましいナノ粒子は金のナノ粒子である。

本発明のバイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブは、核酸などの標的検体を検出するために使用することが可能である。本発明のナノ粒子プローブで検出することができる核酸の例には、遺伝子（例えば、特定の疾病に関連した遺伝子）、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、バクテリアのＤＮＡ、真菌のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、１本鎖核酸、２本鎖核酸、天然の核酸および合成核酸などが含まれる。したがって、本発明によって調製されたナノ粒子プローブは、例えば、ウイルス性疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、疱疹ウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタインバーウイルス）、バクテリア性疾患（例えば、結核、ライム病、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、大腸菌感染症、レジオネラ感染症、マイコプラズマ感染症、サルモネラ菌感染症）、性感染症（例えば、淋病）、遺伝性障害（例えば、嚢胞性繊維症およびデュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｅ）筋ジストロフィー症、フェニルケトン尿症、鎌形赤血球貧血症）ならびに癌（例えば、癌の発生に関連する遺伝子）の診断および／またはモニタリングのために；法医学において；ＤＮＡ配列決定において；親子鑑別のために；細胞株の認証のために；遺伝子治療のモニターのために；ならびに他の多くの目的のために使用することが可能である。

本発明に従って分析を実行するためには、標的検体を含む疑いのある試料を、標的検体の少なくとも一部に結合し得る認識基が結合しているバイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブに接触させる。検出すべき標的を既知の方法によって分離してもよいし、あるいは、当技術分野において知られているようにして、細胞、組織試料、体液（例えば、唾液、尿、血液、血清）、ＰＣＲ成分を含む溶液、大過剰のオリゴヌクレオチドまたは高分子量ＤＮＡを含む溶液、その他の試料中で直接検出してもよい。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．）、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（第２版、１９８９）およびＢ．Ｄ．ヘイムズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）およびＳ．Ｊ．ヒギンズ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、「Ｇｅｎｅ
Ｐｒｏｂｅｓ１」（ニューヨーク所在のアイアールエル出版（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）、１９９５）参照。プローブをハイブリダイズさせて検出するための核酸調製方法は、当技術分野においてよく知られている。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．）、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（第２版、１９８９）およびＢ．Ｄ．ヘイムズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）およびＳ．Ｊ．ヒギンズ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、「ＧｅｎｅＰｒｏｂｅｓ１」（ニューヨーク所在のアイアールエル出版（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）、１９９５）参照。

核酸の存在量が少量である場合、当技術分野において既知の方法によって増幅してもよい。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．）、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（第２版、１９８９）およびＢ．Ｄ．ヘイムズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）およびＳ．Ｊ．ヒギンズ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、「ＧｅｎｅＰｒｏｂｅｓ１」（ニューヨーク所在のアイアールエル出版（ＩＲＬＰｒｅｓｓ）、１９９５）参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅が好ましい。

本発明によって核酸を検出するための１つの方法は、１または複数の種類のナノ粒子プローブに核酸を接触させることを含む。検出される核酸は少なくとも２つの部分を持っている。これらの部分の長さおよび（存在する場合はその間の）距離は、ナノ粒子上のバイオコンジュゲートが核酸にハイブリダイズしたときに、検出可能な変化が生じるように選択される。これらの長さおよび距離は実験的に決定することができ、使用する粒子の種類およびそのサイズ、ならびにアッセイで用いる溶液中に存在するであろう電解質の種類（当技術分野で知られているようにある種の電解質は核酸のコンフォメーションに影響を及ぼす）に依存するであろう。

また、核酸を他の核酸の存在下で検出すべき場合は、ナノ粒子上のバイオコンジュゲートに結合させるべき核酸部分を、核酸の検出が特異的になるために十分な固有配列を含むように選択しなければならない。そうするためのガイドラインは当技術分野においてよく知られている。

１種類のバイオコンジュゲート‐ナノ粒子のみを使用すればよいように、核酸が互いに十分に近接した繰り返し配列を含むようにしてもよいが、これはまれな場合であろう。一般には、選択される核酸部分は様々な配列を有し、好ましくは異なるナノ粒子に結合した２以上の異なるバイオコンジュゲートを担持するナノ粒子と接触させることになろう。ＤＮＡの追加部分を対応するナノ粒子の標的とすることも可能であろう。核酸のいくつかの部分を標的とするとすることにより、検出可能な変化の大きさが増大する。

ナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブと核酸との接触は、ナノ粒子上のバイオコンジュゲートと核酸の標的配列とのハイブリダイゼーションに有効な条件下で行う。これらのハイブリダイゼーション条件は当技術分野においてよく知られており、使用される特定のシステムのために容易に最適化することが可能である。例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．）、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（第２版、１９８９）参照。好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いる。

検出すべき核酸とナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブとを含む溶液を凍結・解凍することにより、より迅速なハイブリダイゼーションが可能である。溶液は、溶液を凍結させるのに十分な時間（一般に、溶液１００マイクロリットル当たり約１分間）ドライアイス・アルコール浴に入れるなど、任意の便利な方法で凍結させることが可能である。この溶液は、熱変性温度（これは好都合なことに、ナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プ
ローブと核酸のほとんどの組み合わせについて室温であり得る）未満の温度で解凍しなければならない。ハイブリダイゼーションを完了し、溶液を解凍した後に検出可能な変化を観察すればよい。

検出すべき核酸とナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブとを含む溶液を、ナノ粒子上のバイオコンジュゲートと標的核酸との間で形成された複合体の解離温度（Ｔｍ）未満の温度に加温することにより、ハイブリダイゼーション速度を増大させることも可能である。あるいは、解離温度（Ｔｍ）よりも高温に加熱し溶液を冷却させることにより迅速なハイブリダイゼーションを達成することが可能である。

ハイブリダイゼーション速度を、塩濃度を増す（例えば、０．１Ｍ〜１ＭＮａＣｌ）ことにより増大させることも可能である。
ナノ粒子上のバイオコンジュゲートが核酸にハイブリダイズする際に生じる検出可能な変化は、光学的な変化（例えば、色の変化）でもよいし、ナノ粒子の凝集体の形成または凝集したナノ粒子の沈殿でもよい。光学的な変化は肉眼で、または分光分析によって観察することが可能である。ナノ粒子の凝集体の形成は、電子顕微鏡または比濁分析によって観察することが可能である。凝集したナノ粒子の沈殿は肉眼または顕微鏡で観察することが可能である。肉眼で観察し得る色の変化が好ましい。

色の変化の肉眼による観察は、背景を対照色とすればより容易に行うことが可能である。例えば、金ナノ粒子を使用する場合、色変化の観察は、ハイブリダイゼーション溶液の試料を、固体の白い表面（シリカまたはアルミナのＴＬＣプレート、濾紙、硝酸セルロース薄膜およびナイロン薄膜など。好ましくは、ナイロン薄膜）上にスポット滴下し、これを乾燥させることにより容易に行える。最初、スポットは、ハイブリダイゼーション溶液の色のままである（ハイブリダイゼーションがない状態のピンク／赤から、ハイブリダイゼーションが生じた場合の赤紫／紫の範囲に及ぶ）。室温または８０℃（温度は重要ではない）で乾燥させると、スポット滴下の前にハイブリダイゼーションによってナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブが標的核酸と結合している場合は青いスポットが現れる。ハイブリダイゼーションが起こっていない場合（例えば、標的核酸が存在しない場合）、スポットはピンクである。青およびピンクのスポットは安定で、引き続き冷却または加熱しても、または時間が経っても変化しない。それらは、試験を永久的に記録するうえで好都合である。色変化の観察には、他のステップ（ハイブリダイズしたナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブとハイブリダイズしなかったナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブの分離など）は必要ない。色変化の量は、平床式スキャナーまたはＣＣＤカメラなどの光学走査装置によりプレート像を記録し、各個別スポットの色の量およびタイプを分析することにより定量可能である。あるいは、特定の色を除くためにカラー・フィルター（例えば、赤色フィルター）を使用し、その結果得られる各スポットのシグナル強度を記録し分析してもよい。

アッセイ結果を簡単に視覚化する別の方法は、ガラス繊維フィルター（例えば、粒径１３ｎｍの金ナノ粒子について使用するにはホウケイ酸塩マイクロファイバー・フィルター、孔径０．７μｍ（ｍｉｃｒｏｎ）、ＦＧ７５グレード）上に、標的核酸にハイブリダイズしたナノ粒子プローブを、このフィルターを通して液体を吸引しながらスポットすることである。次いで、水ですすぐことによってハイブリダイズしていない過剰のプローブをフィルターから洗い流し、ナノ粒子プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによって生成した凝集体を含む観察可能なスポットを残す（これらの凝集体はフィルターの孔より大きいので、保持される）。この技法では過剰量のナノ粒子プローブを使用可能なので、より高い感度が得られる。

核酸を検出する方法のいくつかの実施形態では基材を利用する。基材を使用することに
より、検出可能な変化（シグナル）を増幅し、アッセイ感度を増大させることが可能である。

検出可能な変化を観察し得るどのような基材も使用可能である。適当な基材には、透明な固体表面（例えば、ガラス、石英、プラスチックその他のポリマー）、不透明な固体表面（例えば、ＴＬＣシリカ・プレート、濾紙、ガラス繊維フィルター、硝酸セルロース薄膜、ナイロン薄膜などの白色固体表面）および導電性固体表面（例えば、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ））が挙げられる。基材は、任意の形状または厚さであり得るが、一般に平坦で薄いものである。ガラス（例えば、スライドグラス）またはプラスチック（例えば、マイクロタイター・プレートのウェル）などの透明な基材が好ましい。

１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドを基材に結合させる。オリゴヌクレオチドは、例えば、クリシーら（Ｃｈｒｉｓｅｙｅｔａｌ．）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，第２４巻、ｐ．３０３１−３０３９（１９９６）；クリシーら（Ｃｈｒｉｓｅｙｅｔａｌ．）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，第２４巻、ｐ．３０４０−３０４７（１９９６）；ムシックら（Ｍｕｃｉｃｅｔａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第５５５巻（１９９６）；ツィンマーマンおよびコックス（ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎａｎｄＣｏｘ）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，第２２巻、ｐ．４９２（１９９４）；ボトムリーら（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙｅｔａｌ．）、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ，第１０巻、ｐ．５９１（１９９２）；ならびにヘグナーら（Ｈｅｇｎｅｒｅｔａｌ．）、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，第３３６巻、ｐ．４５２（１９９３）に記載されているような基材に結合させることが可能である。

基材に結合させたオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の配列の第１の部分に相補的な配列を有する。基材上のオリゴヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で核酸を基材に接触させる。このようにして、核酸が基材に結合することとなる。ナノ粒子‐バイオコンジュゲート・プローブを加える前に未結合の核酸をすべて基材から洗い流すのが好ましい。

次に、基材に結合した核酸を、オリゴヌクレオチドなどのバイオコンジュゲートが結合した第１の種類のナノ粒子に接触させる。オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２の部分に相補的な配列を有しており、接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするのに有効な条件下で行う。このようにして、第１の種類のナノ粒子が基材に結合することとなる。ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを基材に結合させた後、基材を洗浄して未結合のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートおよび核酸をすべて除去する。

第１の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドはすべて同じ配列を有していてもよいし、あるいは、検出すべき核酸の異なる部分にハイブリダイズする様々な異なる配列を有していてもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する場合、各ナノ粒子に異なるオリゴヌクレオチドがすべて結合していてもよいし、または、好ましくは、異なるオリゴヌクレオチドを別々のナノ粒子に結合させてもよい。代替例として、第１の種類の各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが複数の異なる配列を有してもよいが、少なくともそのうちの１つは検出すべき核酸の一部とハイブリダイズしなければならない。

基材に結合した第１の種類のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを、場合によっては、オリゴヌクレオチドが結合した第２の種類のナノ粒子と接触させる。第２の種類のナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、第１の種類のナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に相補的な配列を有し、接触は、第１の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを第２の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブ
リダイズさせるのに有効な条件下で行う。ナノ粒子が結合した後、好ましくは基材を洗浄して未結合のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートをすべて除去する。

このハイブリダイゼーションの組み合わせにより検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は、第２の種類のコンジュゲートを用いる場合は多重ハイブリダイゼーションによって検出可能な変化の増幅が起こること以外は、前記と同様である。特に、第１の種類の各ナノ粒子には複数のオリゴヌクレオチド（同一または異なる配列を有する）が結合しているので、第１の種類の各ナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートは、複数の第２の種類のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートにハイブリダイズし得る。同様に、第１の種類のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを、検出すべき核酸の複数の部分にハイブリダイズさせてもよい。多重ハイブリダイゼーションによってもたらされる増幅は、それにより変化が初めて検出可能にするものでもよいし、または検出可能な変化の規模を増大させるものでもよい。このような増幅はアッセイの感度を高め、少量の核酸の検出を可能にする。

所望であれば、第１および第２の種類のナノ粒子‐オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを連続的に追加することにより、追加のナノ粒子層を構築することができる。このように、標的核酸の分子１個当たりに固定化されるナノ粒子の数を、対応するシグナル強度の増大を伴ってさらに増加させることが可能である。

非核酸検体の検出のための１つの実施形態（例えば、米国特許出願第０９／８２０，２７９号（出願日：２００１年３月２８日）、および国際特許出願第ＰＣＴ／０１／１００７１号（出願日：２００１年３月２８日）参照。各々、本願明細書に援用される）では、検体を、共有結合または非共有結合による相互作用によって、直接または間接に基材に結合させることが可能である。基材は上記と同様な種類の基材である。間接的結合では、リンカー（例えば、オリゴヌクレオチドその他のスペーサー分子）を介して検体を基材に結合することが可能である。あるいは、基材に結合した捕捉オリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに検体を結合することにより検体を修飾してもよい。次いで、検体に対する認識基を有するナノ粒子‐プローブを、基材に結合した検体へのナノ粒子‐プローブの特異的結合を可能にするのに有効な条件下で基材に接触させ、基材上でのスポット形成、または金上での銀染色（ｓｉｌｖｅｒｏｎｇｏｌｄｓｔａｉｎ）など染色材料の使用のいずれかにより、検体の存在を視覚的に検出することが可能である。この検出方法の例については図１を参照されたい。

検体を検出する別の方法では、プローブの認識部分としてナノ粒子‐プローブに検体を結合させることにより標的検体を修飾することが可能である。その後、修飾ナノ粒子‐プローブを、認識カップルの第２のメンバーが結合した基材に接触させる。基材上でのスポット形成、または金上での銀染色など染色材料の使用のいずれかにより、検体の存在を視覚的に検出することが可能である。

検体を検出するさらに別の方法では、ナノ粒子‐プローブに結合したオリゴヌクレオチド（認識基）の配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに結合させることによって標的検体を修飾する。その後、標的に結合したオリゴヌクレオチドとナノ粒子‐プローブに結合したオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションに有効な条件下で修飾標的とナノ粒子‐プローブとを接触させることにより、修飾標的をナノ粒子‐プローブに連結させる。次いで、ハイブリダイズにより生じた複合体を、検体に対する認識基が結合した基材に接触させる。基材上でのスポット形成、または金上での銀染色など染色材料の使用のいずれかにより、検体の存在を視覚的に検出することが可能である。この検出方法の例については図２を参照されたい。

基材を使用する場合、染色により検出可能な変化を生じるか増強することが可能である。基材（上記のものを含む）上で行う任意のアッセイにおいて検出可能な変化を生じるか増強するために染色材料（例えば、金、銀など）が使用可能である。例えば、銀の還元を触媒する任意の種類のナノ粒子とともに銀染色を用いることが可能である。貴金属（例えば、金や銀）で作製されたナノ粒子が好ましい。バッセルら（Ｂａｓｓｅｌｌ，ｅｔａｌ．）、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，第１２６巻、ｐ．８６３−８７６（１９９４）；ブラウン−ホウランドら（Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１３巻、ｐ．９２８〜９３１（１９９２）参照。検体の検出のために用いるナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合、標的検体に銀イオンを錯形成させて還元を触媒させることが可能である。ブラウンら（Ｂｒａｕｎｅｔａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ，第３９１巻、ｐ．７７５（１９９８）参照。また、核酸上のリン酸基と反応しうる銀染色も知られている。

ポリチオール・ナノ粒子プローブを利用する別の方法は、核酸、タンパク質または炭水化物などの様々な生体分子を検出するマイクロアレイに用いることである。具体的な１例は、米国特許出願第６３６１９４４号に記載のように、ポリチオール修飾オリゴヌクレオチドで標識された金ナノ粒子プローブをサンドイッチ・アッセイ形式の核酸検出に用いることである。この方法では、金ナノ粒子の標識が銀の堆積プロセスによって検出される。別例として、米国特許第６４１７３４０号に記載のように金ナノ粒子現像操作を使用して、光学的に検出することが可能である。注目すべきは、ここに記載されたポリチオール・ナノ粒子プローブがｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション標識などにおいて検出プローブとして用いることも可能であり、あるいは他のＤＮＡ／ＲＮＡ検出技術にも拡張し得ることである。

本発明はさらに、検体を検出または定量するアッセイを行うためのキットを提供する。キットは、認識基が結合したナノ粒子プローブの入った容器を含む。キットはまた、アッセイを行うために有用な他の試薬や物品を含んでもよい。試薬は、対照物、標準品、ＰＣＲ試薬、ハイブリダイゼーション試薬、バッファーなどを含んでもよい。キットの一部として提供される他の物品としては、反応装置（例えば、試験管、マイクロタイター・プレート、固体表面（捕捉用分子が結合していてもよい）、シリンジ、ピペット、キュベット、容器などが挙げられる。

以下の実施例は、本発明を例示するが、その範囲の限定に資するものではない。
（合成実施例）
（実施例１アミノ基の導入）
本実施例において、アミノ修飾剤であるＣ_６‐ＤＴ基は、アミノ修飾剤ホスホロアミダイト（ヴァージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）所在のグレン研究所（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能）を使用して、オリゴヌクレオチドへ導入される（図３）。

（プロトコル）アミノ修飾剤Ｃ_６‐ＤＴは、通常のホスホロアミダイト（つまり、標準的な自動オリゴヌクレオチド合成）と同じ反応様式を有する。第１級アミン上のトリフルオロアセチル（ＴＦＡ）保護基は、標準的な水酸化アンモニウムによる脱保護の際に除去される。しかし、アンモニアによる脱保護の際の些少な副反応により、２〜５％のアミンの不可逆的キャッピングが起こり得る。この反応を防ぐために、合成はアセチル保護されたｄＣを使用して行い、脱保護は３０％アンモニア／４０％メチルアミン１：１（ＡＭＡ）中で６５℃で１５分間実施する。

（実施例２チオール基の導入）
本実施例では、実施例１において調製したアミン含有オリゴヌクレオチドを、２‐イミノチオラン・ＨＣｌ（トラウト（Ｔｒａｕｔ）試薬、イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）所在のピアス・ケミカル社（ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）から入手可能）と反応させ、チオール基を導入する（図４）。

（プロトコル）実施例１で調製したアミン含有オリゴヌクレオチドを最初に逆相ＨＰＬＣによって精製し、次いで、ｐＨ８の５０ｍＭトリエタノールアミン‐ＨＣｌバッファー（または、１０ｍＭリン酸の０．１６Ｍホウ酸などの他のｐＨ８のバッファー）に溶解する。２〜１０倍モル過剰の２‐イミノチオラン‐ＨＣｌを加える。溶液を０〜２５℃で２０〜６０分間インキュベートする。次いで、チオール化したアミン・オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（０．０３ＭＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７）、１％／分の勾配で９５：５アセトニトリル／０．０３ＭＴＥＡＡ（ｐＨ７））を使用して、アミン・オリゴヌクレオチドから分離する。

あるいは、以下のプロトコルを使用することが可能である。最初にアミン含有オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣによって精製する。精製後に、１０〜１００倍過剰の水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ、例えば、エチルジメチルアミノプロピル‐カルボジイミド）および１０〜１００倍過剰の３‐メルカプトプロピオン酸を含むリン酸またはホウ酸バッファー（ｐＨ７．２〜８．５）中にオリゴヌクレオチドを再溶解し、室温で２〜４時間放置する。次いで、過剰の試薬を除去するためにＮＡＰ‐１０カラムを通してオリゴヌクレオチドを精製し、水で溶出させてから逆相ＨＰＬＣ精製を行う。

（実施例３チオール基の導入のための代替プロトコル）
本実施例は、オリゴヌクレオチドへのチオール基導入の代替法を示す。アミン反応性の２官能性架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）、およびアルキルチオールアミンなどのヘテロ２官能性基を、実施例２において調製したアミン官能性オリゴヌクレオチドと反応させ、チオール基を形成する（図５）。

（プロトコル）最初にアミン含有オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣによって精製する。精製後に、オリゴヌクレオチドを、１０％のグルタルアルデヒドを含むリン酸またはホウ酸バッファー（ｐＨ６〜９）中に再溶解して１〜２時間放置する。次いで、過剰のグルタルアルデヒドを除去するためにＮＡＰ‐１０カラムを通してオリゴヌクレオチドを精製し、ｐＨ６〜９のリン酸またはホウ酸バッファーで溶出させた。次いで、１０〜１００倍過剰のメルカプトエチルアミンをオリゴヌクレオチドと室温で２〜４時間反応させてから、シアノホウ水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）を添加して１０％溶液とし５分間シッフ塩基を還元する。続いてオリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣによって精製する。

（実施例４チオール官能基を導入したホスホロアミダイトを使用するチオール基導入のための代替プロトコル）
本実施例では、アルキルチオールまたはその他のチオールに基づく官能性を有する式ＩＩＩのホスホロアミダイト（図６）をグリックらの方法（Ｇｌｉｃｋｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，１９９３年、第３４巻、ｐ．５５４９−５５５２、その全体を本願明細書に援用する）によって合成する。次いで、該ホスホロアミダイトを使用して、標準的なホスホロアミダイトの方法論を用いてオリゴヌクレオチドにチオール基を組み入れる。

（実施例５チオール基の導入のための代替プロトコル）
チオール基をオリゴヌクレオチドに導入するための代替プロトコルは、以下の通りである。カルボキシ‐ｄＴ（ヴァージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎ
ｉａ）所在のグレン研究所（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能）を実施例１と同様の方法でオリゴヌクレオチドに導入する。脱保護は穏やかな脱保護法（０．４Ｍメタノール性水酸化ナトリウム（メタノール：水＝４：１）、室温で１７時間）を使用して実行する。担体をピペットで取り除き２ＭＴＥＡＡで溶液を中和する。逆相ＨＰＬＣによってＤＮＡを精製する。このＤＮＡを１００ｍＭＭＥＳバッファー（ｐＨ６）中に再懸濁し、水溶性のカップリング試薬（エチルジメチルアミノプロピル‐カルボジイミド（ＥＤＣ）および‐Ｎ‐ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ））を、最終濃度が２ｍＭＥＤＣおよび５ｍＭスルホＮＨＳとなるように添加し、混合物を室温で１５分間インキュベートする。次に、チオールカップリング試薬（例えばＳＨ（ＣＨ_２）_ｘＮＨ_２）を１０倍過剰量加え、混合物を室温で３時間インキュベートする。オリゴヌクレオチドをＮＡＰ‐１０カラムにより精製して過剰の試薬を除去し、その後ＨＰＬＣ精製を行う。

（実施例６官能基を導入したヌクレオチドのナノ粒子への結合）
本実施例では、本願明細書に示した方法のうちのいずれかによって調製したチオール官能基導入オリゴヌクレオチドを、少なくとも２個のチオール基を介して金ナノ粒子に結合させる。

（プロトコル）ポリチオールで修飾したオリゴヌクレオチドの４μＭ溶液をおよそ１５ｎＭの金粒子分散液とともにインキュベートし、次いで、遠心分離によって粒子を分離する。

（実施例７エピアンドロステロン・ジスルフィド誘導体（ＥＰＩ）修飾オリゴヌクレオチドの合成）
追加の結合要素としてエピアンドロステロンを使用することが可能である。その利点としては、容易に入手可能であること、簡単にケトアルコールに誘導されること、および大きな疎水性表面を備えた置換基として金表面への水溶性分子の接近の遮断を助けることが挙げられる（レッツィンガーら（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１５巻、ｐ．７５３５−７５３６、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．第９巻、ｐ．８２６−８３０）。オリゴヌクレオチドへのｅｐｉジスルフィドの組み込みは、ホスホロアミダイト化学によって下記のように実施する。

ｅｐｉジスルフィド誘導体は以下の構造を有する：

（ａ）ｅｐｉジスルフィドの合成（図７）エピアンドロステロン（０．５ｇ）、１，２‐ジチアン‐４，５‐ジオール（０．２８ｇ）およびｐ‐トルエンスルホン酸（１５ｍｇ）をトルエン（３０ｍＬ）に溶解した溶液を、水分除去条件下で７時間還流し（ディーン・スターク（ＤｅａｎＳｔａｒｋ）装置）、次いで減圧下にトルエンを除去し、残渣
を酢酸エチルに溶解した。この溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮してシロップ状の残留物とした。これをペンタン／エーテル中で一夜置くと白い固体（４００ｍｇ）として合成ｅｐｉジスルフィド１ａが得られ、Ｒｆ（ＴＬＣ、シリカ・プレート（溶離剤としてエーテル））は０．５である（比較のためにあげれば、同じ条件の下で得られたエピアンドロステロンおよび１，２‐ジチアン‐４，５‐ジオールに対するＲｆ値は、それぞれ０．４および０．３である）。ペンタン／エーテルからの再結晶で白色粉末を得た（融点１１０〜１１２℃；^１ＨＮＭＲ、δ３．６（１Ｈ、Ｃ^３ＯＨ）、３．５４−３．３９（２Ｈ、ジチアン環のｍ２ＯＣＨ）、３．２−３．０（４Ｈ、ｍ２ＣＨ_２Ｓ）、２．１−０．７（２９Ｈ、ｍステロイドＨ）；マススペクトル（ＥＳ^＋）：Ｃ_２３Ｈ_３６Ｏ_３Ｓ_２（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４２５．２１７９、実測値４２５．２１５１；分析（Ｃ_２３Ｈ_３７Ｏ_３Ｓ_２）Ｓに対する計算値１５．１２；実測値１５．２６。

（ｂ）ステロイド‐ジスルフィド・ケタール・ホスホロアミダイト誘導体の調製（図７）
ｅｐｉジスルフィド１ａ（１００ｍｇ）をＴＨＥ（３ｍＬ）に溶解し、ドライアイス・アルコール浴中で冷却した。Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（８０μＬ）とβ‐シアノエチル・クロロジイソプロピルホスホロアミダイト（８０μＬ）を連続的に加え、次いで、混合物を室温まで加温し、２時間撹拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）と混合し、５％ＮａＨＣＯ_３水溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、さらに濃縮乾固した。残留物を最少量のジクロロメタンに溶解し、−７０℃でヘキサンを加えて沈殿させ真空下に乾燥させた。収量１００ｍｇ；^３１ＰＮＭＲ１４６．０２。

（実施例８５’‐修飾オリゴヌクレオチドの調製）（図８）
化合物１ｂを最終的なホスファイト化ステップで用いること以外は従来のホスホロアミダイト化学を使用して、５’‐修飾オリゴヌクレオチドをＣＰＧ担体上に構築する。生成物を、５５℃で１６時間の濃ＮＨ_４ＯＨ処理によって担体から開裂させる。オリゴヌクレオチド１ｃを、ヒューレット・パッカード（ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ）ＯＤＳＨｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）カラム（４．６×２００ｎｍ、粒子サイズ５μｍ）を備えたダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＤＸ５００システムで、１ｍＬ／分の流速でＴＥＡＡバッファー（ｐＨ７．０）および９５％ＣＨ_３ＣＮ／５％０．０３ＴＥＡＡの１％／分の勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製する。

（実施例９フッ素化ヌクレオチドの導入とチオール結合ヌクレオチドへの転換による１ｃのさらなるチオール官能基導入）
本実施例においては、フッ素で修飾したイノシン・ヌクレオチド（２‐Ｆ‐ｄＩ；ヴァージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）所在のグレン研究所（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能）をオリゴヌクレオチド１ｃに導入し、合成を終えた後にシスタミンで処理する。Ｌ．Ｖ．ネチェフ（Ｌ．Ｖ．Ｎｅｃｈｅｖ）、Ｉ．コゼコフ（Ｉ．Ｋｏｚｅｋｏｖ）、Ｃ．Ｍ．ハリス（Ｃ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ）およびＴ．Ｍ．ハリス（Ｔ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ）、ＣｈｅｍＲｅｓＴｏｘｉｃｏｌ，２００１年、第１４巻、ｐ．１５０６−１５１２；Ａ．Ｒ．ディアス（Ａ．Ｒ．Ｄｉａｚ）、Ｒ．エリチア（Ｒ．Ｅｒｉｔｊａ）およびＲ．Ｇ．ガルシア（Ｒ．Ｇ．Ｇａｒｃｉａ）、ＮｕｃｌｅｏｓＮｕｃｌｅｏｔ，１９９７年、第１６巻、ｐ．２０３５−２０５１、Ｄ．Ａ．エルランソン（Ｄ．Ａ．Ｅｒｌａｎｓｏｎ），Ｊ．Ｎ．Ｍ．グローバー（Ｊ．Ｎ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ）およびＧ．Ｌ．バーディン（Ｇ．Ｌ．Ｖｅｒｄｉｎｅ）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９７年、第１１９巻、ｐ．６９２７−６９２８を参照。

（プロトコル）１．２‐Ｆ‐ｄｌ‐ＣＥホスホロアミダイト（グレン研究所（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）より市販）を用いて、標準の合成条件を使用して所望の位置に２‐Ｆ‐ｄＩを組み込む。２．ヌクレオシド転換：オリゴヌクレオチド合成の完了時に、アセトニトリルで合成カラムをすすぎ、アルゴンを用いて担体を大まかに乾燥する。所望の第１級アミンを１〜２ｍＬのＤＭＳＯに溶解し（アミンの溶解度によっては他の有機溶媒に置き換えることも可能である）０．５Ｍの濃度とする。２本の１ｍＬ容使い捨てシリンジを使用して、カラム内の担体をアミン溶液で処理する。転換を達成するために室温で１８〜２４時間インキュベートする。別の手法は、ザルシュテット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）チューブに担体を移し、アミン溶液を加えて、上記のようにインキュベートすることである。３．予備的なＯ６の脱保護：担体をＤＭＳＯで２回、次いでアセトニトリルで３回洗い、アルゴンを用いて担体を大まかに乾燥する。上記のように２本の使い捨てシリンジを使用して、アセトニトリルに溶解した１ＭＤＢＵ各１ｍｌで各１時間、担体を２回処理する。担体を各１ｍｌのメタノールで２回、およびアセトニトリルで３回すすぐ。アルゴンを用いて担体を大まかに乾燥し、通常通り、水酸化アンモニウムを使用して担体からオリゴ１ｄを脱保護する。

（安定性の実施例）
本発明のナノ粒子プローブの安定性を、固体の白い表面（Ｃ‐１８シリカＴＬＣプレートまたは逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣプレートなど）上に対象とする混合物をスポットし、乾燥後にスポットの色を観察することにより評価した。赤色は、開始時のナノ粒子がＤＮＡ鎖とともに溶液中に分散していることを示し、紫色は、金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの部分的な脱離による粒子の凝集を示し、青色は、オリゴヌクレオチドのより広範囲な脱離による、さらに大規模な粒子の凝集を示す。

（実施例１０ＥＰＩ＋２Ｓプローブ）
配列５’‐Ｅｐｉ‐ＳＨ‐ＳＨ‐ａｌ８‐ｇｃｇｇａａｇａａｔｇｔｇｔｃ‐３’［配列番号：１］を有するオリゴヌクレオチドを実施例７〜９に記載するようにして調製した。これらのオリゴヌクレオチドは図７におけるオリゴヌクレオチド１ｄに類似の構造を有している。すなわち、それらはｅｐｉジスルフィド部分とさらに２つのチオール基を骨格上に有する。オリゴヌクレオチドを後述のように金ナノ粒子上に装着させる。該プローブは本発明のプローブの代表であり、「ＥＰＩ＋２Ｓプローブ」と表示する。

ＥＰＩ＋２Ｓプローブは２種の塩溶液中で調製（装着）される。すなわち、同じオリゴ
ヌクレオチドを０．８５Ｍ塩化ナトリウムまたは２．２Ｍ塩化ナトリウム中で装着させる。ＥＰＩ−２Ｓプローブの長さは全体で３５ｍｅｒであり、充填物を含んでいない。

（オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への結合）
クエン酸還元法（グラバーら（Ｇｒａｂａｒｅｔａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５年、第６７巻、ｐ．７３５）によって調製したクエン酸安定化金ナノ粒子のコロイド溶液（約１０ｎＭ）を、硫黄修飾したａ_２０−プローブ・オリゴヌクレオチド（４μＭ）と混合し、蓋をした１ｍｌエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）バイアル中、室温で２４時間放置した。次いで、ステップ１：０．１Ｍリン酸水素ナトリウムバッファー１００μＬ、ｐＨ７．０と１．０ＭＮａＣｌ１００μＬを予め混合して先の溶液に加え、さらに１２時間放置した。ステップ２：次いで、塩濃度を０．３ＭＮａＣｌに増加し、室温でさらに１２時間維持した。ステップ３：この時点で塩濃度を０．８５に増加し、室温でさらに１６時間を維持した。塩エージングのプロセスには合計で４０時間を要した。塩濃度２．２Ｍの場合には、ステップ３の塩の段階で徐々に２．２ＭＮａＣｌに増加させ、室温に維持した。

次に、この溶液をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離機５４１４で、１４，０００ｒｐｍで約１５分間遠心分離して、７〜１０％のコロイド金（５２０ｎｍの吸光度によって示される）と共に大半のオリゴヌクレオチド（２６０ｎｍの吸光度によって示される）を含む非常に淡いピンク色の上清、および小さく固まった暗色のゼラチン状の管底残留物を得た。上清を除去し、残留物を所望のバッファー中に再懸濁させた。

（実施例１１ＥＰＩプローブ）
オリゴヌクレオチド１ｃに類似の構造を有する、すなわちｅｐｉジスルフィドが連結しているが他の硫黄基を持たないオリゴヌクレオチドを、実施例７〜８に記載するようにして調製した。プローブの長さは１８ｍｅｒ＋Ａ２０リンカーおよび合計３８ｍｅｒである。プローブ配列は５’‐Ｅｐｉ‐ａ２０‐ｃｃｔｃａａａｇａａａａｇ‐３’［配列番号：２］およびＡ２０‐Ｅｐｉ充填物である。プローブを０．８５ＭのＮａＣｌ溶液中で装着させる。これらのプローブは、オリゴヌクレオチド骨格の追加的なチオール官能基を含んでいないという点で従来技術プローブを代表するものである。該プローブを「ＥＰＩプローブ」と呼ぶ。

（金ナノ粒子へのオリゴヌクレオチドの結合）
クエン酸還元法（グラバーら（Ｇｒａｂａｒｅｔａｌ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５年、第６７巻、ｐ．７３５）によって調製したクエン酸安定化金ナノ粒子のコロイド溶液（約１０ｎＭ）を、パートＢに記載のようにして調製した硫黄修飾したａ_２０‐プローブ・オリゴヌクレオチドおよび対応する硫黄修飾したｄａ_２０‐充填物オリゴヌクレオチド（各々１．７μＭの濃度）と混合し、蓋をした１ｍｌエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）バイアル中、室温で２４時間放置した。次いで、ステップ１：０．１Ｍリン酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０を１００μＬと１．０ＭＮａＣｌの１００μＬを予め混合して先の溶液に加え、さらに１２時間放置した。ステップ２：次いで、塩濃度を０．３ＭＮａＣｌに増加し、室温でさらに１２時間維持した。ステップ３：この時点で塩濃度を０．８５に増加し、室温でさらに１６時間維持した。塩エージングのプロセスには合計で４０時間を要した。

（実施例１２ＥＰＩ＋２Ｓの標的への結合）
本実施例は、ＥＰＩ＋２Ｓプローブが、ＥＰＩプローブのように標的に結合することを確認するものである。

１００μｌのコロイド混合物（ＥＰＩ＋２Ｓプローブ５０μｌおよびＥＰＩプローブ５０μｌ）に、標的（ＭＴＨＦＲ８７ｍｅｒの合成標的）の１０μＭ溶液１μｌを添加し、試料を−７０℃で１分間凍結し、次いで室温で解凍した。試料が室温まで戻った後、３μｌアリコートをＲＰ‐ＨＰＬＣプレート上にスポットし、溶媒を蒸発させた。同時に、標的を含まないこと以外は同様にして調製した対照溶液を、ＨＰＬＣプレート上にスポットした。溶媒の蒸発後に、スポットを含む標的は完全に青くなり、標的へのハイブリダイゼーションを示した。対照スポットは赤くなり、ハイブリダイゼーションが起こっていないことを示した。図１０を参照のこと。図１０は標的へのオリゴヌクレオチドの結合を示す。図中、Ｒは赤を示し、Ｂは青を示し、Ｐは紫を示す。この実施例における標的は８７ｍｅｒの標的配列：５’−ｇｇｔｇｔｃｔｇｃｇｇｇａｇｃｃｇａｔｔｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃｇｃａｇｃｔｔｔｔｃｔｔｔｇａｇｇｃｔｇａｃａｃａｔｔｃｔｔｃｃｇｃｔｔｔｇｔｇａａｇｇｃａｔｇｃａｃｃｇａ− ３’［配列番号：３］を有している。

（実施例１３ＤＴＴ存在下での安定性）
本実施例は、ＤＴＴ溶液中におけるＥＰＩ＋２Ｓプローブの安定性がＥＰＩプローブと比較して高いことを示す。本実施例はまた、２．２ＭＮａＣｌ溶液中で調製したＥＰＩ＋２Ｓプローブ（「２．２ＭＥＰＩ＋２Ｓプローブ」）が、０．８５ＭＮａＣＩ溶液中で調製したＥＰＩ＋２Ｓプローブ（「０．８５ＭＥＰＩ＋２Ｓプローブ」）より安定性が高いことを示す。

０．１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）中のプローブ・コロイド５０μｌに、０．１ＭＤＴＴ溶液５μｌを加え、混合物をＣ‐１８ＲＰシリカ・プレートにスポットした。ＥＰＩプローブのスポットは４４時間（４４ｈ）で青くなった。０．８５Ｍで装着したＥＰＩ＋２Ｓプローブのスポットは７２時間（７２ｈ）以内に青くなり、ＥＰＩプローブよりも高い安定性を示した。期待された通り、２．２Ｍで装着したＥＰＩ＋２Ｓプローブのスポットは、０．１ＭＮａＣｌの条件下で８３時間（８３ｈ）後でさえ青くならず、さらに高い安定を示した。図１１〜１３を参照のこと。図１１〜１３は、ナノ粒子からのオリゴヌクレオチドの脱離を示す（青色のスポットによって示す）。

（実施例１４高温におけるＤＴＴ存在下での安定性）
本実施例は、高温でのＤＴＴ存在下におけるＥＰＩ＋２Ｓプローブの安定性が、ＥＰＩプローブと比較して高いことを明らかにする。

コロイド５０μｌに、０．１ＭＤＴＴ溶液５μｌを加えて６０℃でインキュベートし、Ｃ‐１８ＲＰシリカ・プレート上にスポットした。ＥＰＩプローブは７０分で青くなったが、０．８５ＭＥＰＩ−２Ｓプローブは１２０分で青くなり始めた。図１４を参照のこと。図１４は、ナノ粒子からのオリゴヌクレオチドの脱離を示す（青色のスポットによって示す）。

（実施例１５高温におけるＤＴＴおよびＭｇＣｌ_２存在下での安定性）
本実施例は、高温でのＤＴＴおよびＭｇＣｌ_２存在下におけるＥＰＩ＋２Ｓプローブの安定性が、ＥＰＩプローブと比較して高いことを示す。

コロイド５０μｌに、０．１ＭＤＴＴ溶液５μｌおよび１０ｍＭＭｇＣｌ_２［最終
濃度］を加え、該試料を６０℃でインキュベートした。試料をＣ‐１８ＲＰシリカ・プレート上にスポットした。ＥＰＩプローブ・スポットは２５分で青くなったが、０．８５ＭＥＰＩ−２Ｓプローブ・スポットは２５分で青くなり始めた。２．２ＭＥＰＩ−２Ｓプローブ・スポットも２５分で青くなり始めた。図１５を参照のこと。図１５は、ナノ粒子からのオリゴヌクレオチドの脱離を示す（青色のスポットによって示す）。

基材を使用した検体の検出を表す図。基材を使用した検体の検出を表す図。オリゴヌクレオチドにアミン基を導入するための手順を示す図。オリゴヌクレオチドにチオール基を導入するための手順を示す図。オリゴヌクレオチドにチオール基を導入するための代替的手順を示す図。オリゴヌクレオチドにチオール基を導入するために使用可能なホスホロアミダイトを表す図。エピアンドロステロン・ジスルフィドで誘導体化されたホスホロアミダイトの調製方法を示す図。オリゴヌクレオチドへのエピアンドロステロン・ジスルフィドの組み込みを示す図。エピアンドロステロン・ジスルフィド部分を有するオリゴヌクレオチド中への追加的チオール基の組み込みを示す図。本発明のナノ粒子プローブの標的への結合を示すスポット試験を表す図。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液中における様々なナノ粒子プローブの相対的な安定性を示すスポット試験を表す図。ＤＴＴ溶液中における様々なナノ粒子プローブの相対的な安定性を示すスポット試験を表す図。ＤＴＴ溶液中における様々なナノ粒子プローブの相対的な安定性を示すスポット試験を表す図。高温のＤＴＴ溶液中における様々なナノ粒子プローブの相対的な安定性を示すスポット試験を表す図。高温のＤＴＴおよび塩化マグネシウム含有溶液中における様々なナノ粒子プローブの相対的な安定性を示すスポット試験を表す図。

Claims

ナノ粒子に連結したバイオコンジュゲートを含んでなるナノ粒子プローブを調製する方法であって、
（ｉ）以下の式 (III) の構造を有するチオール修飾試薬（式中、ｎは１〜１０）を

下記式（ａ’）（ｂ’）（ｃ’）（ｄ’）または（ｅ’）の構造

と反応させて、下記式（ａ”）（ｂ”）（ｃ”）（ｄ”）または（ｅ”）

を有するジスルフィドを生成する工程と、
（ｉｉ）前記（ｉ）のジスルフィド（ａ”）（ｂ”）（ｃ”）（ｄ”）または（ｅ”）を還元して以下の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）または（Ｆ）のバイオコンジュゲートを生成する工程と、

（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）のバイオコンジュゲートをナノ粒子に接触させて、ナノ粒子プローブを形成する工程と、
からなり、
前記バイオコンジュゲートが硫黄基を介してナノ粒子と連結され、
式中、
ｎは２〜１００であり、
ｍは０〜１００であり、
Ｘはヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドであり、
Ｚはヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドまたはポリアニオンであり、
Ｑは認識基であり、
Ｒは直鎖または分岐鎖のＣ _１〜Ｃ _８アルキル基であり、
Ｗはステロイドであり、
各Ｌは、ＣＯＯＨ、ＮＨ _２、ＣＨＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、アリル、ビニルおよびＣＨ _３ＣＯ _２ ⁻ からなる群から選択される２つの部分の連結によって形成されるリンカーであるか、または、Ｌは‐Ｃ（＝ＮＨ _２Ｃｌ）ＣＨ _２） _３ ⁻ である、
方法。
前記バイオコンジュゲートがバイオコンジュゲート（Ｂ）であり、
工程（ｉｉ）が
水中で前記バイオコンジュゲート（Ｂ）を前記ナノ粒子に接触させる工程と
前記水に塩を加えて塩溶液を形成する工程と
前記バイオコンジュゲートとナノ粒子を前記塩溶液中でインキュベートしてバイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブを形成する工程と
前記塩溶液から前記バイオコンジュゲート‐ナノ粒子プローブを単離する工程と
からなる請求項１に記載の方法。
前記塩のすべてを水に一回の添加で加える請求項２に記載の方法。
塩を時間をかけて徐々に加える請求項２に記載の方法。
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩類の２種以上の組み合わせ、これらの塩類のうちの１つをリン酸緩衝剤に含めたもの、およびこれらの塩類のうちの２種以上の組み合わせをリン酸緩衝剤に含めたものからなる群から選択される請求項２に記載の方法。
塩がリン酸緩衝剤に含めた塩化ナトリウムである請求項５に記載の方法。
前記ナノ粒子が、金属、半導体、磁性材料、コロイド材料、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ_２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ_２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ_２Ｓ_３、Ｉｎ_２Ｓｅ_３、Ｃｄ_３Ｐ_２、Ｃｄ_３Ａｓ_２、ＩｎＡｓ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＢａＴｉＯ_３、Ｃｏ、Ｆｅ_２Ｏ_３、コア‐シェル粒子および合金粒子からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
前記ナノ粒子が金である請求項７に記載の方法。
前記バイオコンジュゲートがバイオコンジュゲート（Ａ）である請求項１に記載の方法。
前記バイオコンジュゲート中のＱが、有機分子、有機または無機ポリマー、レセプター、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体、ペプチド、炭水化物、糖、ハプテン、核酸、アミノ酸、ペプチド核酸、連結された核酸、ヌクレオシド三リン酸、脂質、脂質結合タンパク質、アプタマー、ウイルス、細胞断片または細胞全体からなる請求項１に記載の方法。
前記認識基が第１および第２の認識基からなり、第１の認識基は該第２の認識基に結合し、第２の認識基は標的検体に特異的に結合する認識カップルのメンバーである請求項１に記載の方法。
前記第１および第２の認識基が特異的結合対からなる請求項１１に記載の方法。
前記結合対が抗体−抗原またはレセプタ‐リガンドである請求項１２に記載の方法。
前記第１および第２の認識基が、その配列の少なくとも一部が互いに相補的なオリゴヌクレオチドである請求項１１に記載の方法。
ＸとＺが独立して、アデニン、グアニン、シストシン、チミン、ウラシル、ホスホロアミダイト（５’‐ジメトシキトリチル‐５‐［Ｎ（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）‐３‐アクリルイミド］‐２’デオキシウリジン、３’‐［（２‐シアノエチル）‐（Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル）］‐ホスホロアミダイト）、（５’‐ジメトシキトリチル‐Ｎ‐ジメチルホルムアミジン‐５‐［Ｎ‐（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）‐３‐アクリルイミド］‐２’‐デオキシ‐シチジン、３’‐［（２−シアノエチル）‐（Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル）］‐ホスホロアミダイト）、および（５’ジメトシキトリチル‐５‐［Ｎ‐（トリフルオロアセチルアミノエチル）‐３‐アクリルイミド］‐２’‐デオキシ‐ウリジン、３’‐［（２‐シアノエチル）‐（Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル）］‐ホスホロアミダイト）で修飾されたヌクレオチドを備えるヌクレオチド誘導体、ＣＯＯＨ、ＮＨ _２、ＣＨＯ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、アリル、またはＣＨ _３ＣＯ _２ ⁻ である請求項７に記載の方法。
Ｘがチミンである請求項１５に記載の方法。
Ｌが‐ＮＨ‐Ｃ（＝Ｏ）‐である請求項１に記載の方法。
バイオコンジュゲートＤのｎが２である請求項１に記載の方法。
Ｑがオリゴヌクレオチドである請求項１０に記載の方法。
ＱがｃＤＮＡである請求項１０に記載の方法。
Ｑがポリヌクレオチドである請求項１０に記載の方法。
前記ナノ粒子が、チオール基への親和性を有するナノ粒子から選択される請求項１に記載の方法。
前記ナノ粒子が、金、銀、プラチナ、コバルト、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、またはＳｉを含む金属、半導体、磁性材料からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
前記ナノ粒子が金である請求項２３に記載の方法。
前記工程（ｉｉｉ）の前に、前記工程（ｉｉ）のバイオコンジュゲート（Ａ）または（Ｄ）を以下の式

と反応させ、以下の式（Ｃ）または（Ｇ）のバイオコンジュゲートを生成することをさらに含む請求項１に記載の方法。