KR101718867B1

KR101718867B1 - 생체적합성 형광 나노입자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101718867B1
Application number: KR1020140067102A
Authority: KR
Inventors: 김세훈; 권익찬; 이상엽
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2014-06-02
Filing date: 2014-06-02
Publication date: 2017-03-22
Also published as: KR20150138726A

Abstract

본 발명은 신규한 쌍극성 아릴비닐 화합물, 이를 포함하는 나노프로브 입자, 그리고 이를 이용한 조영제 조성물 및 이미징 방법에 관한 것이다. 본 발명의 쌍극성 아릴비닐 화합물은 생리학적 조건에서 고체-상 나노응집체들을 형성하여 증가된 SSF 및 AEF를 나타낼 뿐 아니라 공여체-수용체 조합에 따라 SSF 색의 조정이 가능하고, 수용성 환경에서 약 65 nm 미만의 유체역학적 크기를 나타낸다. 본 발명의 나노프로브 입자는 약 25 nm 미만의 유체역학적 크기를 가지고, 650 nm 이상의 근적외선(near-infrared, NIR) 영역에서 증가된 SSF를 나타내며, 특정 조직(예컨대, 감시림프절, 종양 또는 뇌)에 세포 또는 인 비보 레벨에서 축적됨에 따라 상기 조직을 특이적으로 검출하는 데 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 나노프로브 입자를 포함하는 조영제 조성물 및 이미징 방법은 림프절, 종양 또는 뇌 조직을 특이적으로 조영할 수 있다는 점에서 암/종양 또는 뇌 질환의 진단에 효율적으로 적용될 수 있다.

Description

생체적합성 형광 나노입자 및 이의 용도{Biocompatible Fluorescence Nanoparticles and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 쌍극성 아릴비닐 화합물, 이를 포함하는 나노프로브 입자, 그리고 이를 이용한 조영제 조성물 및 이미징 방법에 관한 것이다.

분자 형광은 높은 민감도, 용이한 접근성, 다중-변수(multi-parametric) 검출능 및 다양한 천연 및 합성 형광 분자들의 유용성으로 인해 생물학적 및 생의학적 연구에서 큰 도약을 이끌었다¹ ^{, 2}. 최근에, 고체상 형광(solid-state fluorescence, SSF) 또는 응집-증대된 형광(aggregation-enhanced fluorescence, AEF)을 발산하는 분자적 응집체들로 구성된 유기 나노입자들이 분자-통합된 형광성 나노프로브들 중 새로이 떠오르는 클래스로 큰 관심을 받고 있는데, 이는 이들이 강력한 방출 시그널(emission signal)을 요구하는 바이오이미징 적용에 있어서 강력한 가능성을 가지기 때문이다³ ^-12. SSF는 일반적인 유기 염료들(organic dyes)의 전형적인 형광 퀀칭(quenching)을 극복하기 위해 농축된 또는 응집된 상태에서 형광능을 유지할 수 있는 독특한 현상이다. SSF는 입자 내부에 고밀도의 염료 탑재를 가능하게 하여 발광 강도가 탑재 밀도에 비례하여 증가되는 염료-응집 분자 나노프로브들을 제공해 준다. 더욱이, 나노입자들 내로의 염료 응집은 수용성에 대한 화학적 변형의 필요 없이 생의학적 용도를 위한 염료의 수분산 제형(formulation)을 생산하는 것을 용이하게 해 준다. 나노입자 제형은 증가된 세포 투과성, enhanced permeability and retention(EPR) 효과에 따른 수동적 인 비보 종양 타겟팅, 그리고 다중 바이오컨쥬게이션(bioconjugation)에 의한 능동적 타겟팅용 표면공학을 포함하는 추가적인 이점들을 제공할 수 있다¹³ ^{, 14}.

일반적으로, SSF는 AEF를 보이는 특별한 클래스의 분자들에서 일어난다. 대부분의 경우에서, 상기 분자들은 분리된 용액 상태에서 형광 퀀칭을 야기하는 자유로운 비틀림(tortional freedom)을 가진 비평면 구조를 갖는 반면에, 고형화(solidification)에 의해 비틀림 운동을 차단시킬 시에 이들의 발광이 크게 증가한다¹⁵ ^-20. 폭넓은 스펙트럼의 발광 범위를 가지는 다양한 종류의 AEF-활성 염료들이 바이오이미징 및 센싱 응용분야들에서 성공적으로 적용되어 왔다. 하지만, 이들 중 대부분이 650 nm 미만의 가시광 영역(visible window)에서 발광을 나타낸다; 근적외선(near-infrared, NIR)에서의 SSF는 현재까지 거의 보고되지 않았다⁸ ^-12. 낮은 광학적 간섭(흡수, 산란 및 자가형광) 및 높은 시그널-대-노이즈(signal-to-noise) 비를 가지는 NIR 영역이 생물학적 조직으로 가장 깊은 빛 투과성을 가지기 때문에 생의학적 인 비보 이미징을 위해 NIR로의 스펙트럼 튜닝이 요구된다²¹. 따라서, NIR, 특히 650 nm 이상에서 SSF를 방출하는 염료들이 인 비보 용도를 위한 진보된 분자적 나노프로브들을 제공하기 위해 추가적으로 개발될 필요가 있다. 또한, 기능성 형광 염료들의 개발에 있어서, 조합 화학이 타겟팅된 목표에 도달하기 위해 강력한 방법론이라는 것이 밝혀지만²² ^-25, 이러한 접근방법은 생체 내 적용을 위한 SSF 염료 라이브러리를 개발하는 데 거의 이용되지 않았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 우수한 SSF(solid-state fluorescence)를 나타내는 기능성 형광 염료 및 이를 이용한 바이오이미징 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 생물학적 조직으로 높은 빛 투과성을 가지는 NIR 영역(특히, 650 nm 상의 파장 영역)에서 증가된 SSF 또는 AEF를 방출하는 쌍극성 아릴비닐 스캐폴드 화합물을 합성/동정하였고, 상기 화합물과 생체적합성 폴리머 계면활성제 간의 자기조립(self-assembly)된 20 nm 미만 크기의 나노프로브 입자들을 제형화시켰으며, 상기 나노프로브 입자들을 포함하는 조성물 또는 이를 이용하는 방법이 세포 또는 인 비보에서 타겟(예컨대, 감시림프절, 뇌 또는 종양)을 효과적으로 이미징할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 쌍극성 아릴비닐 화합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 형광성 나노프로브 입자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 조영제(contrast agent) 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 타겟 조직의 이미징 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 화학식 Ⅰ 또는 화학식 II로 표시되는 쌍극성 아릴비닐(dipolar arylvinyl) 화합물을 제공한다:

[화학식 I]

[화학식 II]

상기 화학식 I 또는 화학식 II에서, R₁은 시아노기(cyano group)이고; A는 카르바졸(carbazole), 아닐린(aniline) 또는 이의 유도체(derivatives)이고, B는 시아노기, 카르보닐기, 카르복실기, C₂-C₁₀ 에스테르, 아릴, 또는 C₂-C₁₂ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이며; C는 1,3-인단디온(indandione) 또는 하나 이상의 시아노기로 치환된 1,3-인단디온 유도체로부터 선택된 화합물인 것인 아릴비닐 화합물.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 쌍극성 아릴비닐 화합물; 및 (b) 폴리머 계면활성제를 포함하는 형광성 나노프로브 입자(nanoprobe particles, NPs)로, 상기 쌍극성 아릴비닐 화합물은 상기 계면활성제 내부에 함입되어 있는 것인 나노프로브 입자를 제공한다.

본 발명자들은 우수한 SSF를 나타내는 기능성 형광 염료 및 이를 이용한 바이오이미징 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 생물학적 조직에 대한 높은 빛 투과성을 가지는 NIR 영역(특히, 650 nm 이상의 파장 영역)에서 증가된 SSF 또는 AEF를 방출하는 쌍극성 아릴비닐 스캐폴드 화합물을 합성/동정하였고, 상기 화합물과 생체적합성 폴리머 계면활성제 간의 자가-어셈블리된 20 nm 미만 크기의 나노프로브 입자들을 제형화시켰으며, 상기 나노프로브 입자들을 포함하는 조성물 또는 이를 이용하는 방법이 세포 또는 인 비보에서 타겟(예컨대, 감시림프절, 뇌 또는 종양)을 효과적으로 이미징할 수 있다는 것을 확인하였다.

화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 본 발명의 화합물은 양 말단에 π-전자 공여체 및 수용체를 가지는 쌍극성 π-컨쥬게이션(conjugation)을 나타내며, 이를 기반으로 폴리머 계면활성제와 함께 신규한 나노프로브 입자를 구성한다.

먼저, 본 발명은 다음의 화학식 I 또는 화학식 II로 표시되는 쌍극성 아릴비닐 화합물을 제공한다:

[화학식 I]

[화학식 II]

상기 화학식 I 또는 화학식 II에서, R₁은 시아노기이고; A는 카르바졸, 아닐린 또는 이의 유도체이고, B는 시아노기, 카르보닐기, 카르복실기, C₂-C₁₀ 에스테르, 아릴, C₂-C₁₂ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이며; C는 1,3-인단디온 또는 하나 이상의 시아노기로 치환된 1,3-인단디온 유도체로부터 선택된다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 카르바졸 또는 이의 유도체는 다음의 화학식 III으로 표시되는 화합물로,

[화학식 III]

상기 화학식 III에서, R₂는 C₁-C₁₂ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C₂-C₁₂ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올, 또는 C₁-C₁₂ 알콕시이고, R₃는 화학식 I 또는 화학식 II에서 비닐기가 결합되는 위치이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 아닐린 또는 이의 유도체는 다음의 화학식 IV으로 표시되는 화합물로,

[화학식 IV]

상기 화학식 IV에서, R₂는 서로 독립적으로 H, C₁-C₆ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬, C₂-C₆ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬알코올, 또는 C₁-C₆ 알콕시이고, R₃는 화학식 I 또는 화학식 II에서 비닐기가 결합되는 위치이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “아릴(aryl)”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미하며, 구체적으로는 모노아릴 또는 비아릴이다. 모노아릴은 탄소수 5-6을 갖는 것이 바람직하며, 비아릴은 탄소수 9-10을 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 상기 아릴은 치환 또는 비치환된 페닐, 벤젠, 바이페닐, 티오펜, 1,3-인단디온 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 모노아릴, 예컨대, 페닐이 치환되는 경우에는, 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있으나, 구체적으로는, 시아노, 브로모, 할로, 히드록시, 니트로, C₁-C₄ 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬, C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알콕시, 알킬 치환 설파닐, 페녹시, C₃-C₆ 사이클로헤테로알킬 또는 치환 또는 비치환 아미노기에 의해 치환될 수 있고, 보다 구체적으로는 시아노 또는 브로모이다. 아릴기는 페닐기, 치환된 페닐기, 나프틸기, 치환된 나프틸기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 상술한 아릴기 치환(aryl group substituent)은 구체적으로는 적은 수의 알킬 또는 할로겐을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “헤테로아릴”은 헤테로사이클릭 방향족기로서, 헤테로원자로서 N, O 또는 S를 포함하는 것이다. 구체적으로는, 헤테로아릴은 헤테로원자로서 S를 포함하는 헤테로비아릴이다. 본 명세서의 사용되는 용어 “아릴기 치환(aryl group substituent)”은 알킬, 사이클로알킬, 사이클로아릴, 아릴, 헤테로아릴을 포함할 수 있으며, 선택적으로 할로, 할로알킬, 알킬, 아릴아킬, 헤테로아릴아킬, 1-2개의 이중 결합을 포함하는 알케닐, 1-2개의 삼중 결합을 포함하는 알키닐, 하이드록시, 폴리할로알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기를 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 아릴기 치환은 C₁-C₅ 알킬, C₁-C₅ 알콕시 또는 할로겐을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “알콕시(alkoxy)”는 -O알킬기로, 예를 들어 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 트리데실, 펜타데실 및 헵타데실 등을 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 알킬은 C₂-C₁₂ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고, 보다 구체적으로는 C₁-C₆ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이며, 보다 더 구체적으로는 C₂-C₄ 직쇄 또는 가지쇄의 알킬이다. 상기 용어 “C₁-C₁₂ 알킬”은 탄소수 1-12의 포화 탄화수소기를 의미하고, 저가 알킬로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 이소부틸, n-부틸, t-부틸 등을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “할로겐”은 F, Cl, Br 및 I를 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 할로겐은 Br이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “에스테르”는 -COOR(R은 알킬 또는 아릴)로 표시되는 작용기를 의미하며, 구체적으로는 탄소수 2-10의 에스테르이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “카르복실기”는 -COOH로 표시되는 작용기를 의미하며, 구체적으로는 탄소수 2-10의 카르복실기이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “알코올”은 히드록실기가 알킬 또는 치환된 알킬기의 탄소원자에 결합된 화합물을 의미한다. 구체적으로는, 탄소수 1-20의 알코올, 보다 구체적으로는 탄소수 1-10의 알코올, 보다 더 구체적으로는 탄소수 1-5의 알코올이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “알킬알코올”은 히드록실기가 알킬 또는 치환된 알케닐기의 탄소원자에 결합된 화합물로, 구체적으로는 탄소수 1-20의 알케놀, 보다 구체적으로는 탄소수 1-10의 알케놀, 보다 더 구체적으로는 탄소수 1-5의 알케놀이다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 아릴은 브로모메틸벤젠, 메틸티오펜 및 메틸바이페닐을 포함한다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 에스테르는 에틸 프로피온산이다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 1,3-인단디온(indandione)은 시아노기로 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있고, 치환되는 경우 하나 내지 네 개의 시아노기로 치환될 수 있으며, 예를 들어 3-디시아노메틸리덴-1-인다논(3-dicyanomethylidene)-1-indanone) 및 1,3-비스(디시아노메틸리덴)인단(1,3-bis(dicyanomethylidene)indane)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 상기 화학식 I 또는 화학식 II에서 A는 π-전자 공여체(electron donor)로 기능하고 B 또는 C는 π-전자 수용체(electron acceptor)로서 기능한다. 본 발명의 화합물은 상기 빌딩 블락들(building blocks; A와 B 또는 C) 간의 축합 반응(예컨대, Knoevenagel condensation reaction)에 의해 합성되었다. α, α-이중치환된 비닐 분절로 구성된 상기 수용체들이 세포내 입체적 장애를 가하여 고체-상 형광(solid-state fluorescence, SSF) 발생에 유리한 심각한 뒤틀림을 야기하기 때문에 상기 빌딩 블락들로 구성된 아릴비닐 화합물들은 고체에서 증가된 형광을 나타낼 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 아릴비닐 화합물은 고체상 형광 또는 응집-증대된 형광(aggregation-enhanced fluorescence, AEF)을 나타내고, 보다 구체적으로는 상기 SSF는 상기 아릴비닐 화합물의 ICT(intramolecular charge transfer) 특성에 기인한 입체적 장애(steric hindrance)에 따른 심각한 뒤틀림을 통해 발생된다.

본 발명의 아릴비닐 화합물은 용액 내 약한 형광 및 응집(체)에서의 증가된 형광 방출을 나타낸다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 SSF 색은 빌딩 블락들인 상기 A와 B 또는 C의 조합을 통해 조정(tunability)될 수 있다(참고: 도 3 및 표 2).

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 아릴비닐 화합물은 근적외선(near-infrared, NIR) 영역을 포함하는 폭넓은 스펙트럼 범위에서 증가된 SSF를 나타내고, 보다 구체적으로는 650 nm 이상의 근적외선(near-infrared, NIR) 영역에서 증가된 SSF를 나타낸다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 화학식 I 또는 화학식 II으로 표시되는 아릴비닐 화합물은 다음의 화학식 1 내지 화학식 20에 의해 표시되는 화합물이다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

[화학식 20]

이에 따라, 본 발명은 (a) 상술한 쌍극성 아릴비닐 화합물; 및 (b) 폴리머 계면활성제를 포함하는 형광성 나노프로브 입자(nanoprobe particles, NPs)를 제공한다. 본 발명의 나노프로브 입자에 있어서, 상기 쌍극성 아릴비닐 화합물은 상기 계면활성제 내부에 함입되어 있다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 폴리머 계면활성제는 생체적합성을 나타내는 물질이라면 어떠한 것도 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체(polyoxyethylene-polyoxypropylene block copolymer), 폴리비닐 알코올 및 젤라틴을 포함할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체(폴록사머)는 화학식 (PEO)_x-(PPO)_y-(PEO)_z로 표시되는 비이온성 고분자 물질이다: 상기 화학식에서, PEO는 에틸렌옥사이드, PPO는 프로필렌옥사이드, x, y 및 z는 각각 독립적으로 1-10,000의 정수이다. 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제는 폴리프로필렌 옥사이드의 소수성 센터 및 폴리에틸렌 옥사이드의 양 끝의 친수성 폴리 택(tag)으로 구성된 양친매성 삼중블럭(tri-block) 구조로, 소수성 오일 물질의 물 용해도를 증가시키거나 서로 다른 성질을 지니는 두 물질의 혼화성(miscibility)를 증가시키는 데 이용될 수 있으며, 상기 x, y 및 z의 구성에 따라 다양한 플루로닉스(pluronics) 상표명(BASF Corporation)으로 구입이 가능하다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제는 플루로닉 127이다.

상기 폴록사머는 공업, 화장품 또는 의학 분야에 응용되며, 특히 약제 운반 시스템(drug delivery system)의 모델 시스템으로 유용하게 이용될 수 있을 뿐 아니라, 세포 완충 효능(cell cushioning effects)으로 인해 세포를 낮은 스트레스 조건에 놓이게 하기 때문에 생의학 분야(예컨대, 세포 배양 배지, 바이오이미징, 등)에도 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명의 나노프로브 입자는 상술한 아릴비닐 화합물(특히, 화학식 9, 화학식 10, 화학식 18, 화학식 19 또는 화학식 20)과 생체적합성 폴리머 계면활성제로 이루어진다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노프로브 입자의 유체역학적 크기는 100 nm 미만이고, 보다 구체적으로는 65 nm 미만이며, 보다 더 구체적으로는 50 nm 미만이고, 가장 구체적으로는 20 nm 미만이다.

생물학적 조직에 대한 형광 나노입자는 높은 민감도 뿐 아니라 용이한 접근성을 가져야 한다. 본 발명의 나노프로브 입자는 물-분산된 제형으로 용이하게 제조될 수 있을 뿐 아니라 650 nm 이상의 근적외선(near-infrared, NIR) 영역에서 증가된 SSF를 나타냈다(참고: 도 10).

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노프로브 입자는 높은 시그널-대-백그라운드 비율(signal-to-background, S/B)의 NIR-SSF 방출을 나타내어 생의학적 적용에 매우 적합하다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노프로브 입자는 수용성 환경에서 콜로이드 형태를 이루며, 체액에서 혈청 반응을 유발하지 않는다(참고: 도 11).

흥미롭게도, 본 발명의 나노프로브 입자는 특정 조직(예컨대, 감시림프절, 종양 또는 뇌)을 세포 또는 인 비보에서 특이적으로 축적되었다(참고: 도 12 내지 도 15). 본 발명의 나노프로브 입자가 증가된 세포 투과성, 증가된 투과성 및 지체(EPR) 효과로 인해 감시림프절 또는 종양 세포에 특이적으로 축적되어 형광을 통해 검출될 수 있다는 것은 질환의 진단에 매우 효과적으로 이용/적용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 나노프로브 입자는 뇌 조직에 특이적으로 축적되었다(참고: 도 15b).

뇌에서 발생하는 질병의 진단 및 치료에서의 어려운 점은 뇌혈관에 존재하는 '혈뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)'이라는 독특한 구조 때문인데, 상기 구조는 아교세포(glia cell)라는 세포들이 매우 조밀하게 혈관을 둘러싸 신경세포가 생존하는데 필요한 물질은 통과시키고 독성물질은 뇌로 들어가지 못하게 걸러주는 역할을 한다. 하지만, 상기 혈뇌장벽은 진단을 위한 다양한 영상제 뿐 아니라, 종양, 알츠하이머, 파킨슨병 등 뇌에 질병이 생겼을 때 약물이 통과하는 것을 막아 뇌 관련 진단 및 치료 기술 개발에 저해가 되고 있다. 이에 따라, OX26(항체), OX26-폴리에틸렌글리콜, 만니톨, 또는 트랜스페린과 같은 약물을 사용하여 일시적으로 화학적 충격을 통해 혈뇌장벽을 붕괴시킨 후에 약물이나 영상제를 투여하는 방법이 사용되고 있다(참고: 미국특허 등록번호 제6,372,250호, 미국특허 출원번호 제10/025,732호). 또는 약물이나 영상제에 상기 약물들을 화학적으로 부착시켜 함께 투여하는 방법이 사용되고 있다(참고: 미국특허 등록번호 제6,117,454호 및 제6,821,594호, 미국특허 출원번호 제2004-0131692호, 유럽특허 등록번호 제1,071,408호). 하지만, 상기 방법들은 일정 시간이 지난 뒤 다시 혈뇌장벽이 회복되어 추가적 전달이 어렵고 또는 약물에 의한 혈뇌장벽의 파괴 시 쇼크를 유발시킬 수 있는 위험 부담이 있다는 점에서 실제 적용이 쉽지 않다.

본 발명의 어떤 구현예에 있어서, 본 발명의 나노프로브 입자는 림프절(특히, 감시림프절), 종양세포 또는 뇌에서 보다 특이적으로 분포되며, 상기 용어 “분포(distribution)”는 나노프로브 입자를 정맥내 주입한 경우 나노프로브 입자가 생체 내 여러 기관에 존재하는(localization) 정도를 의미한다. 따라서, 조영제/영상제로의 적용의 측면에서 본 발명의 나노프로브 입자는 부가적인 약물의 투여 없이 혈뇌장벽을 통과할 수 있다는 장점을 가질 뿐 아니라, 뇌 조직에 특이적으로 축적됨으로써 뇌 질환 관련 진단에 유용하게 적용시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 용어 “진단”은 한 대상자(subject)가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 또는 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것을 포함한다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 나노프로브 입자에 의해 진단/검출될 수 있는 암/종양은 뇌암, 신경 내분비 암, 골수종, 림프종, 백혈병, 림프관 혈관내피세포육종(lymphangioendotheliosarcoma), 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 회돌기세포교종, 수막종, 신경모세포종, EMC(extraskeletal myxoid chondrosarcoma), 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 요관암, 자궁경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피 암종, 신경교종, 대장선암, 전립선암종, 대장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피세포암, 기저세포암, 선암종, 신세포암종, 간세포암, 담도암, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피세포육종, 림프관 육종, 윤활막종, 중피종, 유윙 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 횡문근종, 땀샘암종, 피지샘 암종, 유두상암종, 유두상 선암, 낭선암종, 연수갑상선암종, 기관지암종, 융모상피암, 고환종, 배아성암종, 윌름 종양, 카포시육종 또는 망막모세포종을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상술한 본 발명의 나노프로브 입자의 뇌 국소화(localization) 특징은 종래의 혈뇌장벽 통과 입자들과 비교하여 매우 흥미로운 특징으로, 종래의 혈뇌장벽 통과 입자들의 경우에는 뇌에 존재하는 특정 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는 타겟팅 리간드와 결합되어 뇌 국소화를 유도하지만, 본 발명의 나노프로브 입자는 나노입자 자체만으로도 생체 내에 주입하면 뇌에서 보다 높은 분포도를 나타낸다(참고: 도 15b). 따라서, 본 발명의 나노프로브 입자는 통상적인 보조제(예컨대, 만니톨)의 사용 없이도 혈뇌장벽을 효율적으로 통과할 수 있을 뿐 아니라 뇌로 특정 물질(예컨대, 치료제)을 운반하는 운반체로도 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 나노프로브 입자를 포함하는 조영제(contrast agent) 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 나노프로브 입자를 대상자(subject)에 투여하는 단계; 및 (b) 상기 대상자의 목적 조직(tissue of interest)에서 형광을 측정하는 단계를 포함하는 목적 조직의 이미징 방법을 제공한다.

본 발명의 조영제 조성물 및 이미징 방법은 상술한 본 발명의 나노프로브 입자를 유효성분으로 포함하기 때문, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 혈뇌장벽 통과용 나노입자는 매우 우수한 효율로 혈뇌장벽을 통과하여 뇌에 위치하기 때문에 뇌의 조영에 매우 유용하다.

본 발명의 조영제 조성물은 다양한 조영 기술에 적용될 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 나노프로브 입자는 방출 형광에 따라 광학 이미징 및 분광(Optical Imaging and Spectroscopy) 또는 BL(bioluminescence) 이미징에 사용될 수 있다. BL 이미징의 일반적인 내용은 미국 특허 제5,650,135호에 개시되어 있다.

또한, 본 발명의 쌍극성 아릴비닐 화합물의 합성에서 방사선 동위 원소 또는 양전자방출동위원소가 결합되어 쌍극성 아릴비닐 화합물이 합성되는 경우, 이로부터 얻어진 나노프로브 입자는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에도 사용될 수 있다. 본 발명의 조영제 조성물을 이용하여 PET 또는 SPECT 이미지를 얻는 경우, 양전자방출동위원소의 예는 ¹⁰C, ¹¹C, ¹³O, ¹⁴O, ¹⁵O, ¹²N, ¹³N, ¹⁵F, ¹⁷F, ¹⁸F, ³²Cl, ³³Cl, ³⁴Cl, ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ⁵¹Mn, ⁵²Mn, ⁵²Fe, ⁵³Fe, ⁵⁵Co, ⁵⁶Co, ⁵⁸Co, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶²Zn, ⁶³Zn, ⁶⁴Cu,⁶⁵Zn, ⁶⁶Ga, ⁶⁶Ge, ⁶⁷Ge, ⁶⁸Ga, ⁶⁹Ge, ⁶⁹As, ⁷⁰As, ⁷⁰Se, ⁷¹Se, ⁷¹As, ⁷²As ⁷³Se, ⁷⁴Kr, ⁷⁴Br, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁷⁷Kr, ⁷⁸Br, ⁷⁸Rb, ⁷⁹Rb, ⁷⁹Kr ,⁸¹Rb, ⁸²Rb, ⁸⁴Rb, ⁸⁴Zr, ⁸⁵Y, ⁸⁶Y, ⁸⁷Y, ⁸⁷Zr, ⁸⁸Y, ⁸⁹Zr, ⁹²Tc, ⁹³Tc, ⁹⁴Tc, ⁹⁵Tc, ⁹⁵Ru, ⁹⁵Rh, ⁹⁶Rh, ⁹⁷Rh, ⁹⁸Rh, ⁹⁹Rh, ¹⁰⁰Rh, ¹⁰¹Ag, ¹⁰²Ag, ¹⁰²Rh, ¹⁰³Ag, ¹⁰⁴Ag, ¹⁰⁵Ag, ¹⁰⁶Ag, ¹⁰⁸In, ¹⁰⁹In, ¹¹⁰In, ¹¹⁵Sb, ¹¹⁶Sb, ¹¹⁷Sb, ¹¹⁵Te, ¹¹⁶Te, ¹¹⁷Te, ¹¹⁷I, ¹¹⁸I, ¹¹⁸Xe, ¹¹⁹Xe, ¹¹⁹I, ¹¹⁹Te, ¹²⁰I, ¹²⁰Xe, ¹²¹Xe, ¹²¹I, ¹²²I, ¹²³Xe, ¹²⁴I, ¹²⁶I, ¹²⁸I, ¹²⁹La, ¹³⁰La, ¹³¹La, ¹³²La, ¹³³La, ¹³⁵La, ¹³⁶La, ¹⁴⁰Sm, ¹⁴¹Sm, ¹⁴²Sm, ¹⁴⁴Gd, ¹⁴⁵Gd, ¹⁴⁵Eu, ¹⁴⁶Gd, ¹⁴⁶Eu, ¹⁴⁷Eu, ¹⁴⁷Gd, ¹⁴⁸Eu, ¹⁵⁰Eu, ¹⁹⁰Au, ¹⁹¹Au, ¹⁹²Au, ¹⁹³Au, ¹⁹³Tl, ¹⁹⁴Tl, ¹⁹⁴Au, ¹⁹⁵Tl, ¹⁹⁶Tl, ¹⁹⁷Tl, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁰Bi, ²⁰²Bi, ²⁰³Bi, ²⁰⁵Bi, ²⁰⁶Bi 또는 그의 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. PET 이미징 방법 및 장치는, 미국특허 등록번호 제6,151,377호, 제6,072,177호 제5,900,636호, 제5,608,221호, 제5,532,489호 제5,272,343호 및 제5,103,098호에 기재되어 있으며, 상기 특허 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. SPECT 이미징 방법 및 장치는, 미국특허 제6,115,446호, 제6,072,177호, 제5,608,221호, 제5,600,145호, 제5,210,421호 및 제5,103,098호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 조영제 조성물은 인체의 특정 부위, 특히 뇌의 혈관에 대한 이미징에 매우 유용하다. 이미징 과정은 인간에게 조영제의 진단학적 유효량을 투여한 다음 뇌의 가시적 이미지를 얻기 위하여 이미징을 실시하여 인체를 스캐닝함으로써 이루어진다.

본 발명의 조영제는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조영제는 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 두개강내(intracranial) 주입, 피내 주입, 병변내 (intralesional) 주입, 근육내 주입, 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “진단학적 유효량”은 인체의 이미지를 얻는데 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.0001-100 mg/kg이다.

본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 포유동물, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 신규한 쌍극성 아릴비닐 화합물, 이를 포함하는 나노프로브 입자, 그리고 이를 이용한 조영제 조성물 및 이미징 방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 쌍극성 아릴비닐 화합물은 생리학적 조건에서 고체-상 나노응집체들을 형성하여 증가된 SSF 및 AEF를 나타낼 뿐 아니라 공여체-수용체 조합에 따라 SSF 색의 조정이 가능하고, 수용성 환경에서 약 65 nm 미만의 유체역학적 크기를 나타낸다.

(c) 본 발명의 나노프로브 입자는 약 25 nm 미만의 유체역학적 크기를 가지고, 650 nm 이상의 근적외선(near-infrared, NIR) 영역에서 증가된 SSF를 나타내며, 특정 조직(예컨대, 감시림프절, 종양 또는 뇌)에 세포 또는 인 비보 레벨에서 축적됨에 따라 상기 조직을 특이적으로 검출하는 데 이용할 수 있다.

(d) 따라서, 본 발명의 나노프로브 입자를 포함하는 조영제 조성물 및 이미징 방법은 림프절, 종양 또는 뇌 조직을 특이적으로 조영할 수 있다는 점에서 암/종양 또는 뇌 질환의 진단에 효율적으로 적용될 수 있다.

도 1은 고체-상 형광성 쌍극성 아릴비닐(ArV)의 구조 및 합성 경로를 보여주는 도면이다.
도 2는 HOMO 및 LUMO 윤곽 다이어그램(HF/PM3)으로 덮어씌워진 ArV의 최적화된 기하학 결과이다.
도 3은 365 nm 조사에 따른 ArV 파우더의 형광을 보여주는 결과로, CbV9-10 및 AnV9-10의 NIR 형광 이미지들은 Cy5.5를 위한 여기/방출의 필터 세트를 가지는 코닥 이미징 시스템으로 얻어졌다.
도 4a는 DLS에 의해 측정된 THF(tetrahydrofuran)/H₂O(= 부피로 1/9) 내 CbV 및 AnV의 자가-응집된 나노입자들의 유체역학적 크기를 보여주는 결과이다. 레이블: 크기(size), d.nm(직경, nm); 및 숫자(number), %.
도 4b는 대표적인 ArV 염료들의 정규화된 UV 및 PL 스펙트럼을 나타내는 결과이다: (a) THF 용액, (b) 자가-응집체들 및 (c) FArV NP들에서의 흡수성; (d) THF 용액, (e) 자가-응집체들 및 (f) FArV NP들에서의 방출. (1) CbV5, (2) AnV1, (3) CbV7, (4) AnV7, (5) CbV8, (6) AnV8, (7) CbV9 및 (8) CbV10. 레이블: absorbance, 흡광도; PL intensity (a.u.), 광발광 강도 (a.u.); 및 wavelength, 파장(nm).
도 5는 용액(THF, 점선) 및 자가-응집된 나노입자들의 분산(THF/탈이온수 = 1/9 v/v, 실선)에서 5 μM ArV[(a) CbV5, (b) AnV1, (c) CbV7, (d) AnV7, (e) AnV8, (f) CbV9]의 대표적인 광발광(photoluminescence, PL) 스펙트럼을 보여주는 결과이다. (삽입 그림) 365 nm 조사에 따른 형광 방출. (f)의 CbV9의 NIR 형광 이미지는 Cy5.5를 위한 여기/방출의 필터 세트를 가지는 코닥 이미징 시스템으로 얻어졌다.
도 6a는 FArV NP들의 TEM 이미지들을 제시하는 결과이다: (a) CbV8(6.3 ± 1.6 nm), (b) AnV8(7.6 ± 2.2 nm), (c) CbV9(7.2 ± 1.4 nm) 및 (d) CbV10(6.1 ± 1.5 nm). 축척 막대: 40 nm.
도 6b는 DLS에 의해 측정된 FArV NP들의 유체역학적 크기들을 보여주는 결과이다. 레이블: 크기(size), d.nm(직경, nm); 및 숫자(number), %.
도 7은 365 nm 조사 하의 대표적인 FArV NP들의 형광 방출을 보여주는 결과이다: (a) CbV5, (b) AnV1, (c) CbV7, (d) AnV7, (e) CbV8, (f) AnV8, (g) CbV10 및 (h) CbV9. 상응하는 ArV의 화학 구조들이 아래에 보여진다. CbV9(h)의 NIR 형광 이미지는 Cy5.5를 위한 여기/방출의 필터 세트를 가지는 코닥 이미징 시스템으로 얻어졌다.
도 8은 FArV NP들로 처리된 HeLa 세포에서의 광학 이미지, 형광 이미지 및 병합된 이미지들을 보여주는 결과이다: (a) CbV5, (b) AnV1, (c) CbV7, (d) AnV7, (e) AnV8, 및 (f) CbV9. DAPI로 염색된 핵들이 파란색으로 보여진다. (삽입 그림) 세포질 부위의 국소적 형광 스펙트럼. 레이블: PL intensity (a.u.), 광발광 강도 (a.u.); 및 wavelength, 파장(nm).
도 9는 HeLa 세포에 대한 (a) 40 mg/mL 및 (b) 20 mg/mL의 농도에서의 FArV NP들의 세포독성을 보여주는 인 비트로 MTT 어세이 결과이다. (1) CbV5, (2) AnV1, (3) CbV7, (4) AnV7, (5) CbV8, (6) AnV8, (7) CbV10, (8) CbV9 및 (9) 처리되지 않은 대조군.
도 10은 FArV NP들의 형광 시그널(S) 및 조직 자가형광 백그라운드(B)의 정량과 이의 S/B 비율을 제시한 결과이다. 광발광은 생물학적 조직(3.5 mm 두께의 돼지 햄, n = 3)으로부터 여기되어 이미지들 내에 주어진 파장을 가지는 여기(Ex.) 및 방출(Em.) 필터들을 이용하여 이미지화되었다. 시그널링(S) 영역이 하얀색 원으로 지시된다.
도 11은 형광 및 투과도(산란) 변화로 모니터링된 생물학적 조건(90% FBS, 37℃)에서의 FCbV10 NP들의 안정성 테스트를 나타내는 결과이다. 레이블: PL intensity (% of initia), 광발광 강도(개시값에 대한 %); Transmittance(% of initia), 투과도(개시값에 대한 %); 및 시간(H).
도 12a는 FCbV10 NP들이 좌측 앞발에 피내 주입된 마우스(n = 5)의 NIRF 이미지들을 보여주는 결과이다. 주입 후 이미징 시간들이 보여진다. 노란색 화살표 및 빨간색 화살표는 각각 주입 위치 및 감시림프절(sentinel lymph node)을 지시한다. 레이블: S, 시그널; 및 B, 백그라운드.
도 12b는 가짜-색(pseudo-color) 엑스 비보 이미지를 보여주는 결과이다. 주입된 부위(좌측) 및 다른 쪽 부위(우측)로부터 절제된 림프절들(각각, 빨간색 및 녹색으로 보여짐)은 동일한 색깔로 제시되는 이들의 스펙트럼 프로파일들(오른쪽 그래프)에 따라 스펙트럼적으로 혼합되지 않았다.
도 12c는 도 12a 및 도 12b에서 지시된 시그널(S) 및 백그라운드(B)의 영역에서 FCbV10 NP들의 인 비보 및 엑스 비보 강도들을 나타내는 결과이다.
도 13a는 FCbV10 NP들이 꼬리 정맥으로 주입된 마우스(n = 5)의 NIRF 이미지들을 보여주는 결과이다. 주입 후 이미징 시간들이 보여진다. 초기 성장 단계(접종 1주 후)에서 볼 수 없는 피하 SCC7 종양이 빨간색 화살표로 지시된다. 레이블: S, 시그널; 및 B, 백그라운드.
도 13b는 접종 12시간 후에 찍어진 가짜-색 인 비보 이미지(왼쪽 패널)를 보여준다. 조직 자가형광(녹색) 및 FCbV10 NP들의 시그널(빨간색)이 동일한 색깔로 제시되는 이들의 스펙트럼 프로파일들에 따라 스펙트럼적으로 혼합되지 않았다(오른쪽 패널). 레이블: Tissue, 조직; 및 Tumor, 종양.
도 13c는 도 13a에서 지시된 시그널(S) 및 백그라운드(B)의 영역에서 FCbV10 NP들의 인 비보 강도를 보여주는 결과이다.
도 14는 SCC7 종양이 접종된 마우스로부터 절제된 종양 및 다른 주요 기관들의 가짜-색 엑스 비보 이미지를 보여주는 결과이다(종양 세포 주입 2주 후에 관찰됨). 이미지는 FCbV10 NP들의 꼬리 정맥 주입 후 5시간 째에 얻어졌다. 종양(빨간색)으로부터의 FCbV10 NP 시그널 및 다른 기관들(녹색)로부터의 조직 자가형광(a)은 동일한 색깔로 제시되는 이들의 스펙트럼 프로파일들(b)에 따라 스펙트럼적으로 혼합되지 않았다. (a) 내 삽입 그림은 종양 및 백그라운드(BG) 내 FCbV10 NP들의 엑스 비보 강도를 나타낸다. 레이블: Liver, 간; Heart, 심장; Kidney, 신장; Spleen, 비장; 및 Tumor, 종양.
도 15a 및 도 15b는 각각 대조군(Cy.5) 및 본 발명의 폴리머성 NP들을 이용하여 실시된 뇌 이미징 결과이다. 레이블: Liver, 간; Heart, 심장; Kidney, 신장; Spleen, 비장; Brain, 뇌; 및 Ctr1, 대조군.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험재료 및 기계들. 모든 화학 시약들은 Aldrich 및 TCI로부터 구매되어 얻어진 상태로 이용되었다. 화학 구조들은 FT-IR(Thermo Mattsonmodel Infinity Gold FT-IR), ¹H NMR(Varian unity plus 300) 및 CHNS 분석기(EA 1180, FISONS Instruments)에서 실시된 원소 분석에 의해 동정되었다. 탈이온수 내 나노입자 분산의 입자 크기 분포는 zeta-sizer(Nano-ZS, Malvern)를 이용하여 25℃에서 결정되었다. 투과전자현미경(Transmission electron microscopic, TEM) 이미지들은 200 kV에서 작동된 CM30 전자현미경(FEI/Philips)으로 얻어졌다. TEM 시료 준비를 위해, 입자 분산액 한 방울이 탄소로 코팅된 300-메쉬 구리 그리드 위에서 건조되어 2wt% 우라닐 아세테이트 용액으로 음성적으로 염색되었다. TEM 이미지들로부터, 60개의 입자들이 각 시료의 크기 분석을 위해 카운팅되었다. 흡수 및 방출 스펙트럼들이 각각 UV-가시광선 분광광도계(Agilent 8453) 및 형광 분광광도계(Hitachi F-7000, 여기 및 방출에 대해 교정된 파장)을 이용하여 얻어졌다. 상대적인 형광 양자 수율(Φf)은 레퍼런스로서 로다민 B를 포함하는 에탄올 용액을 이용하여 결정되었다.

ArV 합성을 위한 일반적인 과정. 모든 ArV 화합물들은 도 1에 예시된 크노에베나겔(Knoevenagel) 축합에 의해 합성되었다. 전형적으로, 100% EtOH(10 mL)에 녹여진 방향족의 알데하이드 공여체(Ar-CHO, 1.0 mmol) 및 활성 메틸렌 수용체(AM, 1.0 mmol) 용액에 피페리딘이 조금씩 나누어(portion wise) 처리된 후 2-3시간 동안 60℃에서 교반되었다. 0℃까지 냉각시킨 후, 상기 침전물을 여과하고 냉장 EtOH로 세척하였다. 상기 건조된 조 산물을 용리제로서 클로로포름을 이용하는 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 고체를 얻었다. 모든 화합물들에 대한 특성 데이터들은 다음과 같이 제공된다:

2-(4-브로모페닐)-3-(9-에틸-9H-카르바졸-3-일)아크릴로니트릴(CbV1);

옅은-황색 고체. 수율: 71%. FT-IR cm^-1(KBr), 1622 (방향족성 C=C), 2208 (CN), 2968 (지방족의 C-H) 및 3046 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.46(3H, t, -CH3, J = 7.2), 4.4 (2H, q, -CH2, J = 7.2), 7.30 (1H, t, CbPhH, J = 7.2), 7.42-7.56 (8H, m, CbPhH & COPhH), 7.68 (1H, s, CH), 8.15 (1H, d, CbPhH, J = 7.5), 8.63 (1H, s, CbPhH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 143.92, 141.37, 140.66, 134.39, 132.20, 127.28, 127.13, 126.66, 124.63, 123.49, 122.96, 122.86, 122.58, 120.91, 120.03, 118.89, 109.10, 108.99, 106.22, 37.95, 13.99 ppm. C₂₃H₁₇BrN₂(C, 68.84; H, 4.27; N, 6.98)로 측정된 원소 분석: 측정치(found), C, 68.63; H, 4.16; N, 6.96%. C₂₃H₁₇BrN₂(m/z=402.06)로 대해 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=402.05.

3-(9-에틸-9H-카르바졸-3-일)-2-(티오펜-2-일)아크릴로니트릴(CbV2);

황색 고체. 수율: 75%. FT-IR cm^-1(KBr), 1628 (방향족의 C=C), 2212 (CN), 2977 (지방족의 C-H) 및 3096 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.47 (3H, t, J = 7.2 Hz), 4.40 (2H, q, J =7.2 Hz), 7.08 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.27-7. 32 (2H, m), 7.37 (1H, d, J = 6.9 Hz), 7.43-7. 54 (3H, m), 7.58 (1H, s), 8.09 (1H, d, J = 8.7 Hz), 8.15 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.61(1H, s). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 141.33, 141.21, 140.64, 140.28, 128.13, 126.98, 126.59, 126.10, 125.26, 124.55, 123.48, 122.97, 122.58, 120.92, 119.97, 118.05, 109.06, 109.01, 102.21, 37.93, 13.99 ppm. C₂₁H₁₆N₂S(C, 76.80; H, 4.91; N, 8.53; S, 9.76)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 76.44; H, 4.89; N, 8.39; S, 9.60%. C₂₁H₁₆N₂S(m/z=328.10)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=328.11.

2-(비페닐-4-일)-3-(9-에틸-9H-카르바졸-3-일)아크릴로니트릴(CbV3);

옅은-황색 고체. 수율: 62%. FT-IR cm^-1(KBr), 1612 (방향족의 C=C), 2213 (CN), 2908 (지방족의 C-H) 및 3038 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.48 (3H, t, -CH3, J = 7.2), 4.41 (2H, q, -CH2, J = 7.2), 7.30 (1H, t, CbPhH, J = 7.5), 7.38 (1H, t, BiPhH, J = 7.2), 7.44-7.55 (6H, m, BiPhH & CbPhH), 7.63-7.68 (3H, m, CbPhH), 7.71 (1H, s, CH), 7.79 (2H, d, CbPhH, J = 8.4), 8.17 (2H, d, BiPhH, J = 8.4), 8.67 (1H, s, CbPhH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 143.29, 141.31, 141.25, 140.65, 140.27, 134.32, 129.04, 127.81, 127.70, 127.31, 127.13, 126.58, 126.20, 124.97, 123.48, 123.02, 122.75, 120.94, 119.97, 119.25, 109.07, 108.96, 107.04, 37.93, 14.0. C₂₉H₂₂N₂(C, 87.41; H, 5.56; N, 7.03)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 86.27; H, 5.51; N, 6.94%. C₂₉H₂₂N₂(m/z=398.18)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=398.17.

2-시아노-3-(9-에틸카르바졸-3-일)아크릴산(CbV4);

황록색 고체, 57% 수율; FT-IR cm^-1(KBr), 1624 (방향족의 C=C), 1694 (카르복실기의 C=O), 2224 (CN), 2980 (방향족의 C-H), 3440 (O-H, 카르복실산). ¹H NMR (300 MHz, DMSO, TMS, ppm): δ 1.35 (3H, t, CH3, J = 6.9), 4.51 (2H, q, CH2, J = 6.9), 7.32 (1H, t, J = 7.2), 7.55 (1H, t, J = 7.5), 7.72 (1H, d, J = 8.4), 7.83 (1H, d, J = 8.7), 8.15 (1H, d, J = 7.5) 8.29 (1H, d, J = 8.4), 8.46 (1H, s), 8.86 (1H, s), 13.64 (1H, s, -OH). ¹³C NMR (150 MHz, DMSO) δ 164.78, 155.79, 142.73, 140.78, 128.33, 127.42, 126.07, 123.13, 122.85, 122.62, 121.09, 120.86, 117.88, 110.51, 98.34, 62.74, 38.03, 14.0. C₁₈H₁₄N₂O₂(C, 74.47; H, 4.86; N, 9.65; O, 11.02)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 74.39 %; H, 4.76%; N, 9.52%. C₁₈H₁₄N₂O₂(m/z= 290.11)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=290.26.

에틸 2-시아노-3-(9-에틸-9H-카르바졸-3-일)아크릴레이트(CbV5);

옅은-황색 고체, 수율: 58%. FT-IR cm^-1(KBr), 1628 (방향족의 C=C), 1722 (C=O, 에스테르), 2218 (CN), 2974 (지방족의 C-H) 및 3068 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.39-1.50 (6H, m, -CH3), 4.36-4.44 (4H, m, -CH2), 7.32 (1H, t, Cb-PhH, J = 7.2), 7.46 (1H, t, Cb-PhH, J = 6.9), 7.52-7.57 (2H, m, Cb-PhH), 8.16 (1H, d, Cb-PhH, J = 8.4), 8.22 (1H, d, Cb-PhH, J = 8.7), 8.42 (1H, s, CH), 8.75 (1H, s, Cb-PhH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 163.76, 156.01, 142.89, 140.72, 129.16, 127.05, 125.48, 123.67, 122.72, 121.06, 120.66, 117.08, 109.33, 109.19, 103.3, 97.76, 62.39, 38.05, 14.56, 14.2 ppm. C₂₀H₁₈N₂O₂(C, 75.45; H, 5.70; N, 8.80)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 74.94%; H, 5.61%; N, 8.66%. C₂₀H₁₈N₂O₂(m/z=318.14)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=318.50.

2-((9-에틸-9H-카르바졸-3-일)메틸렌)말로노니트릴(CbV6);

황색 고체. 수율 60%. FT-IR cm^-1(KBr), 1626 (방향족의 C=C), 2228 (CN), 2980 (지방족의 C-H) 및 3056 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.48 (3H, t, CH₃, J = 7.2 Hz,), 4.41 (2H, q, CH₂, J = 8.0 Hz), 7.36 (1 H, t, PhH, J = 7.2 Hz), 7.47 (2H, d, PhH, J = 9.3 Hz), 7.57 (1H, t, PhH, J = 7.2 Hz), 7.86 (1H, s, CH), 8.07-8.15 (2 H, m, PhH), 8.62 (1H, s, PhH) ppm. ¹³C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 160.0, 143.30, 140.65, 128.52, 127.33, 124.98, 123.69, 122.56, 122.26, 120.93, 115.02, 114.08, 109.40, 109.30, 76.36, 38.02, 13.77 ppm. C₁₈H₁₃N₃(C, 79.68; H, 4.83; N, 15.49%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 79.62%; H, 4.72%; N, 15.41%. C₁₈H₁₃N₃(m/z= 271.11)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=271.12.

2- 벤조일 -3-(9-에틸-9H- 카르바졸 -3-일) 아크릴로니트릴 ( CbV7 );

황록색 고체, 수율: 68%. FT-IR cm^-1(KBr), 1628 (방향족의 C=C), 1665 (C=O), 2210 (CN), 2978 (지방족의 C-H) 및 3055 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.48 (3H, t, -CH3, J = 7.2), 4.41 (2H, q, -CH2, J = 7.2), 7.33 (1H, t, CbPhH, J = 7.2), 7.45-7.57 (6H, m, COPhH & CbPhH), 7.63 (1H, t, COPhH, J = 7.2), 7.91 (2H, d, COPhH, J = 7.8), 8.15 (1H, d, CbPhH, J = 7.5), 8.30 (1H, s, CH), 8.78 (1H, s, CbPhH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 189.34, 157.17, 143.14, 140.79, 136.91, 132.93, 129.41, 129.28, 128.66, 127.15, 125.87, 123.86, 123.07, 122.97, 121.12, 120.79, 118.56, 109.41, 109.35, 105.38, 38.15, 14.0 ppm. C₂₄H₁₈N_2O(C, 82.26; H, 5.18; N, 7.99; O, 4.57%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 81.96%; H, 5.06%; N, 7.98%. C₂₄H₁₈N_2O(m/z=350.14)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=350.13.

2-((9-에틸-9H- 카르바졸 -3-일)메틸렌)-1H- 인덴 -1,3 (2H)- 디온 ( CbV8 );

주황색 고체. 수율: 81%. FT-IR cm^-1(KBr), 1625 (방향족의 C=C), 1665 (C=O), 2976 (지방족의 C-H) 및 3050 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.47 (3H, t, -CH3, J = 7.2), 4.39 (2H, q, -CH2, J = 7.2), 7.33 (1H, t, CbPhH, J = 7.5), 7.41-7.54 (3H, m, CbPhH), 7.73-7.80 (2H, m, InPhH), 7.95-8.03 (2H, m, InPhH), 8.07 (1H, s, CbPhH), 8.24 (1H, d, CbPhH, J = 8.4), 8.66 (1H, d, CbPhH, J = 8.7), 9.44 (1H, s, CH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 191.29, 143.32, 142.50, 140.71, 140.02, 134.92, 134.66, 133.48, 128.88, 126.79, 125.02, 123.79, 123.41, 122.96, 121.19, 120.69, 109.25, 108.78, 38.06, 14.0 ppm. C₂₄H₁₇NO₂(C, 82.03; H, 4.88; N, 3.99%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 81.97 %; H, 4.79 %; N, 3.99 %. C₂₄H₁₇NO₂(m/z=351.13)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=351.12.

2-(2-((9-에틸-9H- 카르바졸 -3-일)메틸렌)-3-옥소-2,3- 디하이드로 -1H- 인덴 -1- 일리덴 ) 말로노니트릴 ( CbV9 )

암적색 고체. 수율: 67%. FT-IR cm^-1(KBr), 1628 (방향족의 C=C), 1704 (C=O), 2220 (CN), 2974 (지방족의 C-H) 및 3050 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.50 (3H, t, -CH3, J = 7.2), 4.42 (2H, q, -CH2, J = 7.2), 7.36 (1H, t, CbPhH, J = 7.8), 7.46-7.57 (3H, m, CbPhH), 7.75-7.81 (2H, m, onmalPhH), 7.95 (1H, d, CbPhH, J = 7.5), 8.23 (1H, d, onmalPhH, J = 7.8), 8.50 (1H, d, onmalPhH, J = 8.7), 8.71 (1H, d, CbPhH, J= 7.8), 8.84 (1H, s, CbPhH), 9.25 (1H, s, CH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 188.32, 163.17, 149.76, 143.83, 140.56, 137.54, 135.09, 134.58, 134.07, 129.6, 127.08, 125.18, 124.53, 123.84, 123.58, 123.4, 123.3, 121.30, 121.11, 119.50, 115.29, 114.82, 109.46, 108.80, 69.88, 38.21, 14.01 ppm. C₂₇H₁₇N_3O(C, 81.19; H, 4.29; N, 10.52%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 81.08%; H, 4.37%; N, 10.68%. C₂₇H₁₇N_3O(m/z=399.14)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=399.13.

2,2’-(2-((9-에틸-9H- 카르바졸 -3-일)메틸렌)-1H- 인덴 -1,3(2H)- 디일리덴 ) 디말로노니트릴 ( CbV10 );

암청색 고체. 수율: 85%. FT-IR cm^-1(KBr), 1630 (방향족의 C=C), 2208 (CN), 2956 (지방족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 1.51 (3H, t, -CH3, J = 7.2), 4.43 (2H, q, -CH2, J = 7.2), 7.38 (1H, t, CbPhH, J = 7.5), 7.48-7.58 (3H, m, CbPhH), 7.74-7.82 (2H, m), 7.92 (1H, d, J = 7.5), 7.96-8.1 (2H, m), 8.72 (1H, d, J = 7.8), 8.85 (1H, s), 9.3 (1H, s, CH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 190.1, 158.74, 148.54, 143.64, 140.54, 138.42, 135.02, 130.69, 129.2, 127.06, 125.2, 124.33, 123.54, 122.14, 118.51, 118.42, 109.26, 108.60, 103.3, 50.95, 39.6, 14.05 ppm. C₃₀H₁₇N₅(C, 80.52; H, 3.83; N, 15.65%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 80.26; H, 3.57; N, 15.37%. C₃₀H₁₇N₅(m/z=447.15)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=447.28.

2-(4- 브로모페닐 )-3-(4-(디메틸아미노) 페닐 ) 아크릴로니트릴 ( AnV1 );

황색 고체, 수율: 86%. FT-IR cm^-1(KBr), 1612 (방향족의 C=C), 2206 (CN), 2908 (지방족의 C-H) 및 3037 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 3.1 (6H, s, (NCH₃)₂), 6.70 (2H, d, ArH, J = 9 Hz), 7.37 (s, 1H, CH), 7.46-7.53 (m, 4H, PhBr), 7.84 (2H, d, ArH, J = 9 Hz). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 151.95, 142.95, 134.74, 132.08, 131.56, 127.02, 121.94, 121.38, 119.24, 111.71, 103.25, 40.14. C₁₇H₁₅BrN₂(C, 62.40; H, 4.62; Br, 24.42; N, 8.56%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 62.56%; H, 4. 61%; N, 8.65%. C₁₇H₁₅BrN₂(m/z= 326.04)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=326.04.

2-(4-(디메틸아미노) 페닐 )-3-(티오펜-2-일) 아크릴로니트릴 ( AnV2 );

녹색 고체. 수율: 80%. FT-IR cm^-1(KBr), 1612 (방향족의 C=C), 2208 (CN), 2908 (지방족의 C-H) 및 3012 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 3.61 (6H, s, N(CH₃)₂), 6.71 (2H, d, ArH, J = 9 Hz), 7.02-7.05 (1H, m, TpH), 7.20 (1H, d, TpH, J = 6 Hz), 7.25 (1H, s, CH), 7.27 (1H, d, TpH, J = 6 Hz), 7.80 (2H, d, ArH, J = 9 Hz). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 151.75, 140.64, 131.21, 128.03, 128.01, 125.25, 124.59, 121.30, 118.38, 111.77, 99.48, 40.16. C₁₅H₁₄N₂S(C, 70.83; H, 5.55; N, 11.01; S, 12.61%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 70.67%; H, 5.54%; N, 10.85; S, 12.43%. C₁₅H₁₄N₂S(m/z=254.09)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=254.08.

2-(비페닐-4-일)-3-(4-(디메틸아미노) 페닐 ) 아크릴로니트릴 ( AnV3 );

황색 고체. 수율: 85%. FT-IR cm^-1(KBr), 1612 (방향족의 C=C), 2210 (CN), 2908 (지방족의 C-H) 및 3038 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 3.07 (6H, s, N(CH₃)₂), 6.74 (2H, d, ArH, J = 9 Hz), 7.46 (1H, s, CH), 7.40-7.51(5H, m, PhH), 7.68-7.61(4H, m, PhH), 7.88 (2H, d, ArH, J = 9 Hz). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 151.82, 142.36, 141.24, 140.34, 134.66, 131.47, 128.95, 127.96, 127.20, 125.93, 121.76, 119.56, 111.76, 104.20, 40.18, 23.45. C₂₃H₂0N₂(C, 85.15; H, 6.21; N, 8.63%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 85.55%; H, 6.12%; N, 8.48%. C₂₃H₂0N₂(m/z=324.16)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=324.16.

2- 시아노 -3-(4-(디메틸아미노) 페닐 )아크릴산( AnV4 );

황색 고체. 수율 63%. FT-IR cm^-1(KBr), 1615 (방향족의 C=C), 1668 (카르복실기의 C=O), 2219 (CN), 2972 (방향족의 C-H), 3436 (O-H, 카르복실산). ¹H NMR (300 MHz, DMSO, TMS, ppm): δ 3.07 (6H, s, NCH₃), 6.82 (2H, d, ArH, J = 9), 7.93 (2H, d, ArH, J = 9), 8.07 (1H, s, CH), 13.25 (1H, s, OH). ¹³C NMR (150 MHz, DMSO) δ 165.40, 154.36, 154.02, 134.06, 118.97, 118.49, 112.17, 94.02, 39.64 ppm. C₁₂H₁₂N₂O₂(C, 66.65; H, 5.59; N, 12.96%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 66.69; H, 5.66; N, 12.97%. C₁₂H₁₂N₂O₂(m/z=216.09)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=216.10.

에틸 2- 시아노 -3-(4-(디메틸아미노) 페닐 ) 아크릴레이트 ( AnV5 );

주황색 고체. 수율: 72%. FT-IR cm^-1(KBr), 1612 (방향족의 C=C), 1706 (C=O, 에스테르), 2214 (CN), 2935 (지방족의 C-H) 및 2990 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 8.06 (1H, s, CH), 7.93 (2H, d, J = 9.3 Hz, ArH), 6.69 (2H, d, J = 9 Hz, ArH), 4.33 (2H, q, J = 7.1 Hz, CH2), 3.10 (s, 6H, NCH3), 1.37 (3H, t, J = 7.2 Hz, CH3). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 164.39, 154.63, 153.68, 134.15, 119.46, 117.70, 111.59, 86.16, 61.8, 40.26, 14.26 ppm. C₁₄H₁₆N₂O₂(C, 68.83; H, 6.60; N, 11.47%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 68.61%; H, 6.66%; N, 11.40%. C₁₄H₁₆N₂O₂(m/z=244.12)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=244.12.

2-(4-(디메틸아미노) 벤질리덴 ) 말로노니트릴 ( AnV6 );

황색 고체. 수율: 67%. FT-IR cm^-1(KBr), 1618 (방향족의 C=C), 2216 (CN), 2925 (지방족의 C-H) 및 3060 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 7.81 (2H, d, ArH, J = 9.0 Hz), 7.45 (1 H, s, CH), 6.69 (2 H, d, ArH, J = 9.0 Hz), 3.14 (6 H, s, (NCH₃)₂). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 158.20, 154.37, 133.92, 119.40, 116.13, 115.05, 111.73, 39.76. C₁₂H₁₁N₃(C, 73.07; H, 5.62; N, 21.30%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 72.89; H, 5.58; N, 20.99%. C₁₂H₁₁N₃(m/z=197.10)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=197.09.

2- 벤조일 -3-(4-(디메틸아미노) 페닐 ) 아크릴로니트릴 ( AnV7 );

주황색 고체. 수율: 69%. FT-IR cm^-1(KBr), 1618 (방향족의 C=C), 1654 (C=O), 2204 (CN), 2948 (지방족의 C-H) 및 3054 (지방족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 3.13 (6Н, s, N (CH₃)₂); 6.72 (2Н, d, ArH, J = 9 Hz); 7.46-7.55 (2Н, m, COPh, J = 7.2); 7.57 (1Н, t, COPh, J = 4.8 Hz); 7.84 (2Н, d, COPh, J = 7.2); 7.89 (1H, s, CH), 8.0 (2Н, d, ArH, J = 9 Hz). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 188.74, 155.87, 153.98, 137.46, 134.65, 132.46, 129.05, 128.49, 119.84, 119.33, 111.73, 101.75, 40.26 ppm. C₁₈H₁₆N₂O(C, 78.24; H, 5.84; N, 10.14%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 77.94; H, 5.80; N, 10.03%. C₁₈H₁₆N₂O(m/z=276.13)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=276.12.

2-(4-(디메틸아미노) 벤질리덴 )-1H- 인덴 -1,3(2H)- 디온 ( AnV8 );

빨간색 고체. 수율: 80%. FT-IR cm^-1(KBr): 1608 (방향족의 vC=C), 1662 & 1708 (vC=O), 2948 (지방족의 vC-H) 및 3000 (방향족의 vC-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 3.15 (6H, s, N (CH₃)₂), 6.75 (2H, d, ArH, J = 9 Hz), 7.71-7.75 (2H, m, COPh), 7.83 (1H, s, CH), 7.91-7.95 (2H, m, COPh), 8.55 (2H, d, ArH, J = 9 Hz) ppm. ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 190.1, 154.06, 147.62, 142.35, 139.99, 138.09, 134.49, 134.21, 122.59, 111.51, 40.18 ppm. C₁₈H₁₅NO₂(C, 77.96; H, 5.45; N, 5.05%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 77.38; H, 5.45; N, 5.03%. C₁₈H₁₅NO₂(m/z=277.11)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=277.10.

2-(2-(4-(디메틸아미노) 벤질리덴 )-3-옥소-2,3- 디하이드로 -1H- 인덴 -1- 일리덴 ) 말로노니트릴 ( AnV9 );

암적색 고체. 수율 60%. FT-IR cm^-1(KBr), 1608 (방향족의 C=C), 1674 (C=O), 2214 (CN), 2948 (지방족의 C-H) 및 2994 (방향족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 3.07 (6H, s, N(CH₃)₂), 6.68 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.20-7.36 (2H, m), 7.70 (1H, t, J = 8.1 Hz), 7.85 (1H, t, J = 8.4 Hz), 8.37 (2H, d, ArH, J = 9.3 Hz), 8.50 (1H, s, CH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 198.93, 189.55, 159.17, 149.81, 139.87, 135.86, 134.08, 131.65, 129.51, 127.41, 125.74, 123.54, 120.70, 115.39, 111.64, 61.08, 40.33 ppm. C₂₁H₁₅N₃O(C, 77.52; H, 4.65; N, 12.91%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 76.98; H, 4.80; N, 13.39%. C₂₁H₁₅N₃O(m/z=325.12)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=325.74.

2,2’-(2-(4-(디메틸아미노) 벤질리덴 )-1H- 인덴 -1,3(2H)- 디일리덴 ) 디말로노니트릴 ( AnV10 );

암청색 고체. 수율 77%. FT-IR cm^-1(KBr), 1632 (방향족의 C=C), 2200 (CN), 2950 (지방족의 C-H). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, TMS, ppm): δ 3.08 (6H, s, N(CH₃)₂), 5.66 (1H, s, CH), 6.59 (2H, d, ArH, J = 9.3 Hz), 7.21-7.26 (2H, m, PhH), 7.48 (2H, d, ArH, J = 9.3 Hz), 7.92-7.96 (2H, m, PhH). ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 190.39, 164.78, 158.72, 138.42, 136.49, 132.1, 122.13, 118.51, 118.41, 111.61, 103.32, 59.84, 39.96 ppm. C₂₄H₁₅N₅(C, 77.20; H, 4.05; N, 18.76%)로 측정된 원소 분석: 측정치, C, 77.29; H, 4.37; N, 18.27%. C₂₄H₁₅N₅(m/z=373.13)로 측정된 MS (MALDI): 측정치, m/z=373.56.

ArV 자가-응집체( Self - Aggregates )의 제조. ArV 나노응집체들의 수용성 분산액이 AEF 행동에 대한 연구를 위해 계면활성제 없이 제조되었다. 간략하게는, 각 ArV 화합물(50 μM, 1 mL)의 THF 스톡 용액이 초음파 하에서 9 mL의 탈이온수에 한 번에 첨가되어 최종 농도 5 μM의 ArV 용액을 얻었다. 비교 연구를 위해, 동일한 농도의 THF 용액이 THF 스톡 용액을 9 mL의 THF와 혼합시켜 제조되었다.

FArV NP 들의 제조. 모든 ArV 화합물들에 있어서, 염료 응집체들의 폴리머-포집된 나노입자들이 인 비트로 및 인 비보 이미징을 위해 플루로닉 F-127 계면활성제와 함께 제조되었다. 전형적으로, F-127(20 mg) 및 ArV(0.3 mg)의 혼합물이 1 mL의 THF에 녹여졌다. 공기를 불어 넣어 용매를 증발시킨 후, 건조된 혼합물을 2 mL의 탈이온수와 혼합시켜 수초의 초음파 처리 하에서 교반시킴으로써 150 μg/mL의 ArV 농도를 가지는 소수성 염료 응집체들의 투명한 수용성 분산액을 얻는다. 다만, 인 비보 뇌 이미징에 있어서는 상기 F-127(20 mg) 및 ArV(0.5 mg)의 혼합물이 200 μL의 MC(methyl cellulose)에 녹여져 상기와 같은 과정으로 수용성 분산액을 얻었으며, 200 μL의 상기 분산액이 정맥내 주입되었다.

인 비트로 세포 표지 및 이미징. HeLa 세포는 습도-유지된 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 10% FBS, 5 mM L-글루타민, 및 5 μg/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)에서 유지되었다. 세포들은 35 mm 커버 글래스 아래 디쉬에 분주되어 70%의 컨플루언스에 도달할 때까지 배양되었다. 실험 전에, 세포들은 PBS(pH 7.4)로 두 번에 걸쳐서 세척되어 잔여 성장 배지를 제거시킨 후, FArV NP들(200 μL)을 포함하는 혈청-부재 배지(1.8 mL)에서 30분 동안 배양되었다. 광발광 이미징을 위해, 상기 표지된 세포들이 PBS(pH 7.4)로 두 번에 걸쳐서 세척된 후 뉘앙스 FX 다중스펙트럼 이미징 시스템이 장착된 LEICA DMI3000B(CRI, USA)를 이용하여 직접적으로 이미징되었다.

인 비보 감시림프절 및 종양 이미징. 동물 연구들은 KIST의 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었으며, 마우스의 처리는 상기 위원회의 규정에 따라 실시되었다. 종양 모델의 제조를 위해, SCC7 세포주가 BALB/c 마우스(5-주령된 수컷; Orient Bio Inc., Korea)에 주입되었다. 상기 마우스들은 실험 전에 0.5% 펜토바르비탈나트륨(0.01 mL/g)의 복강 내 주입을 통해 마취되었다. 감시림프절 이미징을 위해, 20 μL의 FCbV10 NP들이 정상 마우스의 앞 발바닥으로 주입되었으며, 종양 이미징을 위해, 200 μL의 FCbV10 NP들이 종양-보유 마우스들의 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주입되었다. 인 비보 이미징은 IVIS 스펙트럼 이미징 시스템(Caliper, USA)으로 실시되었다.

실험결과 및 추가논의사항

ArV의 구조 및 합성 경로가 도 1에 보여진다. 쌍극성 아크릴비닐 스캐폴드는 조합 포맷의 모듈러 합성을 통해 용이하게 제조될 수 있고²⁵ 일부 파생물들이 효과적인 SSF를 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에²⁶ ^-28, 상기 스캐폴드가 화합물 라이브러리를 구축하기 위해 선택되었다. ArV 구조는 양쪽 말단에 π-전자 공여체(donor) 및 수용체(acceptor)를 가지는 쌍극성 π-컨쥬게이션에 의해 특징화된다. 상기 화합물들은 방향족의 알데하이드 공여체(Ar-CHO) 및 활성 메틸렌(AM) 수용체 빌딩 블락들(building blocks) 간의 단일-단계 크노에베나겔 축합(Knoevenagel condensation)에 의해 합성되었다. 아닐린(An-CHO) 및 카르바졸(Cb-CHO)의 알데하이드들이 다른 π-전자 공여 강도(electron donating strengths)를 가지는 공여체 빌딩 블락들로서 선택되었다. 열개의 수용체 빌딩 블락들이 하나 또는 둘의 전자-수용 시아노 또는 카르보닐 치환체들을 포함하는 활성 메틸렌 화합물들 중에서 선택되었다. 상기 축합 반응은 피페리딘(piperidine)의 존재 하에서 에탄올에서 실시되었으며, 상기 침전된 산물들은 컬럼 크로마토그래피로 정제되었다. 상기 소수성 산물들은 일반적인 유기 용매에 용해 가능하지만, 알코올 및 물에는 녹지 않았는데, 이는 생리학적 조건에서 고체-상 나노응집체들의 형성을 용이하게 해 준다.

반경험적 분자궤도(Semiempirical molecular orbital, MO) 산출은 상기 모든 쌍극성 ArV 화합물들이 가장 높게 점유된 분자궤도(HOMO)와 가장 낮게 점유되지 않은 분자궤도(LUMO) 다이어그램에서 명확하게 보여지는 ICT(intramolecular charge transfer) 특성을 가진다는 것을 증명하였다: π-전자들은 HOMO에서 공여체 주위에 분포되지만(전자적 기저 상태를 반영함), LUMO에서 수용체를 향하여 재분포된다(첫 번째 여기된 상태를 반영함; 도 2). 최적화된 기하학은 α,α-이중치환된 비닐 분절로 구성된 상기 벌크 수용체들이 세포내 입체적 장애(steric hindrance)를 가하여 SSF의 발생에 알맞은 심각한 뒤틀림을 야기하는 것으로 나타났다. 실제로, 상기 얻어진 모든 ArV 화합물들은 고체에서 형광을 나타냈는데, 이는 SSF를 얻기 위한 본 발명자들의 분자적 디자인 전략이 유효함을 의미한다(도 3).

분자 상태에 따른 ArV의 시각적 특성들은 적합한 용매(THF) 및 수용성의 안 좋은 용매(THF/H₂O = 부피 상으로 1/9)에서 비교하여 연구되었다. 후자의 수용성 환경에서, 소수성 ArV 분자들은 약 50 nm의 유체역학적 크기를 가지는 자가-응집된 나노입자들로 침전되었다(표 1 및 도 4a). 상술한 결과들은 하기 표 2에 요약되어 있다(일부는 대표적인 스펙트럼에 대한 것임; 도 4b).

DLS에 의해 결정된 유체역학적 크기(nm).

ArV	자가-응집체	FArV	ArV	자가-응집체	FArV
CbV1	56.37	15.02	AnV1	40.37	14.03
CbV2	32.65	13.83	AnV2	33.29	11.53
CbV3	49.34	16.53	AnV3	62.08	14.62
CbV4	29.56	12.58	AnV4	29.74	15.44
CbV5	43.44	14.93	AnV5	52.18	14.96
CbV6	34.96	17.97	AnV6	50.71	17.34
CbV7	43.76	12.92	AnV7	34.16	16.50
CbV8	47.34	13.95	AnV8	60.01	15.65
CbV9	30.48	12.89	AnV9	59.47	22.42
CbV10	28.62	8.78	AnV10	31.75	11.35

도 5에 대표적으로 보여진 바와 같이, 대부분의 ArV 화합물들이 AEF 행동, 즉 용액 내 약한 형광 및 나노응집(nanoaggregation)에서의 증가된 방출을 나타냈다. 산출 결과들에 의해 제시된 바(도 2)와 같이, 상기 AvrV의 뒤틀린 π-컨쥬게이션은 분리된 용액 상태에서 자유로운 뒤틀림 황동을 야기할 수 있고, 이는 빠른 비발광 소멸(nonradiative decay) 및 낮은 형광 양자 수율로 이어진다⁷. 따라서, 응집에 의한 상기 제한된 퀀칭 활동은 상기 AEF 행동에 대한 타당한 이유일 수 있다. 응집 하에서 형광 스펙트럼에서의 심색성 변형(bathochromic alterations)이 관찰되었는데, 이는 상기 뒤틀린 기하학의 응집-유도된 평면화(planarization)가 효과적인 π-컨쥬게이션 길이를 연장시켜 시각적 밴드갭(bandgap)을 좁게 만든다는 것을 의미한다. 이것은 각 ArV의 다른 분자적 스태킹 모드(stacking mode)가 형성된 나노응집체의 결과적인 SSF 색에 영향을 미칠 수 있다는 것을 제시한다.

다양한 공여체-수용체 조합을 가진 쌍극성 ArV 라이브러리는 하기 표 2에 요약된 바와 같이 SSF 색의 용이한 조정(tunability)이 가능하였다.

용액, 자가-응집체 및 폴리머-포집된 나노입자(FArV NPs)^a의 형태에서 ArV의 스펙트럼 특성들.

A rV	용액( THF )			자가-응집체			FArV NPs
A rV	Abs ( nm )	Em ( nm )	QY (%)	Abs ( nm )	Em ( nm )	QY (%)	Abs ( nm )	Em ( nm )	QY (%)
CbV1	369	452	0.23	387	500	2.23	380	460	3.5
CbV2	370	447 548	0.26	397	530	2.94	383	465	3.6
CbV3	386	465	0.41	394	519	6.5	383	470	6.3
CbV4	388	458	0.49	370	506	2.2	372	482	2.6
CbV5	394	460	0.37	432	510	22.9	398	470	12.3
CbV6	405	472	0.29	421	513	12.1	466	536	40.3
CbV7	406	486	0.32	437	546	8.7	424	548	7.5
CbV8	448	510	0.23	460	630	15.2	440	624	14.7
CbV9	513	574	0.61	562	740	19.8	550	732	18.2
CbV10	580 630	654 705	12.6	584 624	661 709	15.8	582 633	658 708	18.7
AnV1	392	485	0.003	442	503	7.6	398	503	27.1
AnV2	386	455 546	0.18	416	534	5.5	397	524	10.6
AnV3	386	476	0.16	419	550	7.9	399	564	15
AnV4	396	462	0.30	410	486	3.2	402	487	2.9
AnV5	414	467	0.21	437	572	4.7	432	566	5.4
AnV6	426	476	0.71	440	564	44	438	569	20
AnV7	432	512	0.03	465	601	36	462	606	15.3
AnV8	474	534	0.04	502	670	9.3	494	720	5.2
AnV9	547	638	1.2	566	715	12.3	552	656	8.5
AnV10	582 630	643 704	5.4	586 632	657 715	6.2	584 634	658 710	10.2

^aAbs, 흡수; Em, 방출; QY, 양자 수율; QY용 표준, 에탄올에 녹여진 로다민 B. 모든 시료들에 대해 ArV 농도는 5 μM이다. 자가-응집체 및 FArV NP들은 THF/탈이온수 혼합물(THF/H₂O = 1/9 v/v) 및 순수한 탈이온수에 각각 분산되었다.

중요하게도, 상기 방출 색은 NIR 영역까지의 폭넓은 스펙트럼 범위를 포함한다(도 5). 동일한 수용체 단위들에 있어서, 아닐린 유도체들(AnV)은 상응하는 카르바졸 카운터파트(CbV)에 대해 상대적인 적색-이동된(red-shifted; 장파장 이동) 흡수 및 방출을 보였는데, 이는 아닐린이 카르바졸보다 더 강력한 π-전하 공여체라는 사실을 확인시켜 준다. 아닐린 내 질소의 대여 쌍(loan pair) 전자들과 비교하여, 카르바졸의 대여 쌍 전자들은 추가적인 방향족의 안정화로 인해 카르바졸 고리 내에 우선적으로 비편재화(delocalization)되는 데, 이것은 카르바졸 질소로부터 수용체를 향한 전하 이동을 방해하여 시각적 밴드갭을 넓히는 ICT의 정도를 낮춘다²⁹. 유사하게도, 다른 수용 세기를 가지는 다른 수의 수용체들(시아노>케톤>에스테르)를 가지는 수용체 구조에서의 변이들은 상기 나노응집체들의 SSF 색 상에 유의한 효과를 나타냈다. 비닐 말단에 부착된 하나의 시아노기 및 같은 자리의(geminal) 방향족 고리를 가지는 CbV1-3 및 AnV1-3은 청색-대-녹색 SSF를 방출하는 큰 밴드갭을 보였다. 같은 자리의 비닐 말단에 2개의 수용체들의 존재(CbV4-7 및 AnV4-7)는 SSF 색을 녹색-대-주황색 윈도우로 조정하였다. 상기 SSF 색은 추가적인 페닐 고리와 함께 2개의 같은 자리 수용체들, 즉 1,3-인단디온-기반된 수용체들(CbV8-10 및 AnV8-10)의 고리형 브릿징(bridging)에 의해 추가적으로 적색-이동될 수 있었다. 상기 페닐 브릿지는 상기 2개의 수용체들을 평면내(in-plane) 기하학내로 랏킹(locking)하고 추가적인 방향성과 함께 효과적인 π-컨쥬게이션을 연장시킴으로써 스펙트럼의 적색-이동(red-shift)에서 핵심 역할을 하였던 것으로 추측된다³⁰. 이러한 추론은 고리형 수용체들의 평면 형태 및 ICT에 의해 페닐 브릿지 말단까지의 HOMO-대-LUMO π-전자 재분포를 증명하였던 CbV8-10 및 AnV8-10에 대한 산출 결과들에 의해 지지된다(도 2). 1,3-인단디온 단위의 디시아노메틸리덴 치환 수의 증가와 함께, 결과적인 SSF 색은 정확한 NIR(700 nm 초과)에 접근하였는데, 이는 SSF를 NIR로 조정하고자 하는 본 발명자들의 조합적 접근방법을 유효함을 의미한다. 전체적으로, 본 발명자들의 ArV 라이브러리는 폭넓은 범위(array)의 생물학적 적용들에 유용한 청색-대-NIR 영역에서 SSF 색들을 제공한다.

상기 얻어진 SSF 방출을 바이오이미징에 적용시키기 위해, ArV 화합물들을 생체적합성 폴리머 계면활성제인 플루로닉(Pluronic) F-127과 함께 포집시켜 염료-응집된 분자적 나노프로브(FArV NPs)를 제조하였다. FArV NP들은 ArV를 용액 상에서 플루로닉 F-127과 혼합시키고 건조된 혼합물에 물을 첨가함으로써 제조되었다. 후자의 단계 동안, 분산액 내에서 관찰되는 명확한 침전물 없이 균일하게 분산된 콜로이드가 물에서 자발적으로 형성되었다. 더욱이, FArV NP들(20 nm 미만)의 유체역학적 크기는 ArV 자가-응집체들의 크기보다 훨씬 더 작게 측정되었는데(표 1), 이는 상기 물-불용성 ArV 염료들이 F-127의 상기 자가-어셈블리된 나노구조의 소수성 내부에 완전히 임베드되었다(embedded)는 것을 의미한다.

대표적인 NIR-방출 FArV NP들의 투과전자현미경(TEM) 이미지들은 상기 얻어진 콜로이드가 10 nm 미만의 평균 직경을 가지는 구형 나노입자들이라는 것을 명료하게 보여주었다(도 6a, 모든 화합물들의 DLS 크기; 도 6b). 상기 얻어진 콜로이드의 크기는 혈류 내 순환이 용이할 정도로 작아서 나노물질의 인 비보 적용에 적합하다¹³ ^{, 14}. 도 3 및 도 4b는 상기 결과적인 ArV-기반된 분자적 나노프로브의 청색-대-NIR 형광 조정을 확인시켜 준다. 중요하게도, FArV NP들은 상응하는 용액들과 비교하여 적색-이동되고 증가된 형광을 방출하였다(표 2). 자가-응집체들에서 관찰된 바와 같이, 이것은 상기 ArV 염료들이 상기 플루로닉 나노입자들 내에서 상-분리되고 응집되어 SSF 방출을 나타낸다는 것을 의미한다.

생의학적 용도로서 FArV NP들의 유용성은 세포 및 인 비보에서 형광 이미징 실험들을 실시하여 증명되었다. 살아있는 암 세포 이미징을 위해, HeLa(human cervical epitheloid carcinoma) 세포가 FArV NP들과 반응되었다. 염색 30분 후에, 상기 세포질 부위는 세포 내 환경에서 잘 유지된 각 나노프로브의 방출 스펙트럼과 함께 청색-대-NIR 윈도우에서 명확한 다중-색 형광을 나타냈다(도 8). FArV NP들의 효율적인 세포내 흡수(uptake)는 여러 가지 비파괴적 엔도사이토시스(endocytosis) 경로들을 촉진하는 것으로 알려진 플루로닉 나노입자들의 표면 특징에 기인한다³¹ ^{, 32}. 더욱이, 상기 표면에 플루로닉을 가진(Pluronic-surfaced) 나노입자들은 이미징 조건 하에서 최소한의 세포독성을 나타냈는데, 이는 생체적합성 표면 특성과 작은 콜로이드 크기 때문일 것이다(도 9).

인 비보 이미징을 실시하기 전에, NIR-SSF 나노입자들을 이용하는 장점이 인 비보-미미킹(mimicking) 조건들에서 평가되었다. FAnV10 NP 및 FCbV10 NP들로부터의 밝은 NIR-SSF 방출(720-740 nm)은 640 nm의 근적외선(far-red, NIR) 여기(excitation)에 의해 얻어질 수 있고, 상기 방출이 더 우수한 조직 투과성을 위한 최적 상태 뿐 아니라 생물학적 조직들로부터 유래되는 자가형광 백그라운드를 최소화시킬 수 있음을 나타낸다. NIR-여기성 NIR-SSF의 이러한 유리한 점이 많은 양의 자가형광을 가지는 두꺼운 생물학적 표본(3.5 mm 두께의 돼지고기 햄)에서의 시그널-대-백그라운드(signal-to-background, S/B) 비율을 측정함으로써 확인되었다. 비교를 위해, 다른 여기/방출 파장을 가지는 FArV NP들이 이용되었으며, 다른 여기/방출 필터들로 이미징되었다: FCbV8(430/620 nm; 가시광선/가시광선), FAnV8(430/700 nm; 가시광선/NIR) 및 FCbV10 (640/720 nm; NIR/NIR). 도 10에서 확인된 바와 같이, 다른 것들과 비교하여 FCbV10에서의 NIR/NIR 조합이 여기 및 방출 광 모두에서 더 높은 조직 투과성을 가지기 때문에 가장 높은 S/B 비율을 나타냈다. 이러한 관찰은 양자-제한된 그리고 백그라운드-풍부 인 비보 배지(media)에 유용한 밝은 NIRF 프로브로서 SSF-방출 나노입자들의 포텐셜(potential)을 증명한다. 더욱이, 상기 콜로이드 분산액과 FCbV10 NP들의 시각적 특징들은 37℃에서 90% 혈청 내에서 시간에 따라 잘 유지되는 것으로 보여졌다. 형광 강도 및 산란에서 어떠한 유의적 변화들이 12시간 동안의 혈청 반응 동안 관찰되지 않았는데, 이는 체액에서의 화학적 안정성 및 콜로이드 안정성을 의미한다(도 11).

인 비보 이미징 성능(performance)을 검증하기 위해, FCbV10 NP들이 마우스의 앞발의 발바닥으로 피내 주입되어 암 단계 및 수술에서 임상적으로 중요한 감시림프절(sentinel lymph node, SLN) 맵핑에 적용되었다³³. 일부의 투여된 나노프로브들이 주입 후 5분 째에 이미 림프절에 축적되었음이 명확하게 이미징되었다(도 12a). 엑스 비보 이미지에서, FAnV10 NP들의 전형적인 NIR 스펙트럼 특징은 주입 면으로부터 절제된 2개의 절(겨드랑이 및 팔)에서만 관찰되었는데(도 12b), 이는 상기 림프와 관련되어 유출된 나노프로브들이 SLN에 효율적으로 트랩된다(trapped)는 것을 의미한다. 상기 나노프로브들에 의한 신속한 SLN 맵핑은 효율적인 림프성 유출 및 이동이 가능할 정도로 충분히 작은 콜로이드 크기(<20 nm)에 기인한다³⁴. 중요하게도, FAnV10 NP들은 자가형광-부재 엑스 비보 값(S/B 비율 = 16.5)에 비해 절반 정도의 감소만을 나타낼 정도로 매우 우수한 인 비보 이미지 대조능(S/B 비율 = 8.2)을 보였는데(도 12c), 이는 상기 밝은 NIR-SSF 나노프로브들이 높은 정확도로 조직 분포를 묘사할 수 있다는 것을 의미한다.

질환 이미징에 대한 밝은 NIR-SSF 방출의 가능한 유용성은 전신성 투여에 의해 시각적으로 검출할 수 없는 피하내 작은 종양을 가지는 마우스들의 비침습성(noninvasive) 몸-전체 시각화로 설명되었다. FCbV10 NP들이 SCC7 세포 접종 1주일 후에 BALB/c 누드 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입되어 NIR 여기/검출 세팅 하에서 모니터링되었다. 도 13a에서 볼 수 있듯이, 강한 NIRF 시그널들이 혈액-순환 나노프로브들의 일시적인 조직 분포를 성공적으로 나타낸다. 중요하게도, 명확한 이미지 대조가 종양 접종 위치에서 10분 내에 나타나 주입 후 8시간까지 증가되어 시각적으로 검출가능하지 않은 종양을 손쉽게 위치시켰다. 상기 스펙트럼 특징들은 강한 종양 시그널이 FCbV10 NP들로부터 유래된 형광이라는 것을 확실하게 증거하였는데, 이는 종양에서의 이들의 축적을 의미한다(도 13b). 이러한 행동은 FCbV10 NP들의 현저한 종양 축적이 상기 플루로닉 나노입자들의 작은 콜로이드 크기(<20 nm) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)-풍부 표면 특성 덕분이라는 것을 나타낸다. 상술한 특성은 세망-내피계(reticulo-endothelial system, RES)에 의한 나노물질들의 제거를 감소시켜 혈류에서의 순환을 연장시킴으로써 크기-기인된 EPR 효과를 통한 수동적 종양 타겟팅을 촉진시킬 수 있다¹³ ^{, 14}. 절제된 기관들의 엑스 비보 이미지는 상기 나노프로브가 다른 기관들에서의 형광보다 더 강한 형광 시그널을 가지는 종양에서 주로 축적된다는 것을 보여준다(도 14). 인 비보 이미지 대조능은 SLN 이미징의 경우에서처럼, 매우 높은 것(S/B 비율 = 7.9)으로 확인되었다(도 13c).

또한, MC에 녹여진 CbV10-F127 NP들이 BALB/c 누드 마우스의 꼬리 정맥 내로 주입되어 NIR 여기/검출 세팅 하에서 뇌 이미징의 효능에 대해 모니터링되었다. 도 15a에서 볼 수 있듯이, 강한 NIRF 시그널들이 접종 후 30분부터 나타나기 시작해 주입 후 2시간째에 뇌에서 강한 시그널을 보이고, 이는 5시간째까지 지속되었다(도 15a 내 왼쪽 패널). 흥미롭게도, 상기 마우스로부터 조직을 절제하여 각 조직 별로 나노입자들의 축적을 관찰한 결과, 뇌에 특이적으로 축적된다는 것을 확인할 수 있었다(도 15a 내 오른쪽 패널). 대조군으로서 Cy.5-F127 NP들에 대한 이미징도 동일한 방식으로 진행되었으며, 그 결과가 도 15b에 예시되어 있다. 상기 Cy.5-F127 NP들의 경우는 마우스 몸 전체에 걸쳐 고르게 분포되는 경향을 나타냈으며, 특히 간과 신장에 고농도로 축적되었을 뿐 뇌 조직에서는 전혀 형광 시그널을 검출할 수 없었다.

전체적으로, 상술한 이미징 결과들은 조직-투명성 NIR 영역에서의 강력한 형광 시그널에 의한 효과적인 종양 타겟팅 능력 뿐 아니라 높은 이미지 대조능으로 인해 종양 발생의 매우 초기 단계에서 종양을 검출 및 진단하기 위한 NIR-SSF 나노프로브들의 포텐셜을 증명하고, 뇌에 특이적으로 축적한다는 점에서 뇌 영상 이미징에 특히 효율적이라는 것을 확인시켜 준다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

(a) 하기 화학식 Ⅰ 또는 화학식 II로 표시되는 쌍극성 아릴비닐(dipolar arylvinyl) 화합물; 및 (b) 폴리머 계면활성제를 포함하는 형광성 나노프로브 입자(nanoprobe particles, NPs)로, 상기 쌍극성 아릴비닐 화합물은 상기 계면활성제 내부에 함입되어 있는 것인 나노프로브 입자:
[화학식 I]

[화학식 II]

상기 화학식 I 및 화학식 II에서, R₁은 시아노기(cyano group)이고; A는 카르바졸(carbazole) 또는 아닐린(aniline)이며; B는 시아노기, 카르보닐기, 카르복실기, C₂-C₅ 에스테르 또는 C₄-C₁₂ 아릴이고; C는 1,3-인단디온(indandione) 또는 하나 이상의 시아노기로 치환된 1,3-인단디온 유도체부터 선택된 화합물인 것이고,
상기 아릴비닐 화합물은 고체-상 형광(solid-state fluorescence, SSF) 또는 응집-증대된 형광(aggregation-enhanced fluorescence, AEF)을 나타내는 것이고,
상기 아릴비닐 화합물은 근적외선(near-infrared, NIR) 영역을 포함하는 스펙트럼 범위에서 증가된 SSF를 나타내는 것이다.
제1항에 있어서,
상기 아릴비닐 화합물의 상기 A는 전자 공여체(electron donor)로 기능하는 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서,
상기 아릴비닐 화합물의 상기 카르바졸은 다음의 화학식 III으로 표시되는 화합물로,
[화학식 III]

상기 화학식 III에서, R₂는 C₁-C₆직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고, R₃는 상기 화학식 I 또는 화학식 II에서 비닐기가 결합되는 위치인 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서,
상기 아릴비닐 화합물의 상기 아닐린은 다음의 화학식 IV로 표시되는 화합물로,
[화학식 IV]

상기 화학식 IV에서, R₂는 서로 독립적으로 H 또는 C₁-C₆직쇄 또는 가지쇄의 알킬이고, R₃는 상기 화학식 I 또는 화학식 II에서 비닐기가 결합되는 위치인 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서,
상기 아릴비닐 화합물의 상기 아릴은 브로모메틸벤젠, 메틸티오펜, 또는 메틸바이페닐인 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서,
상기 아릴비닐 화합물의 상기 에스테르는 에틸 프로피온산인 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서,
상기 아릴비닐 화합물의 상기 1,3-인단디온 유도체는 하나 내지 네 개의 시아노기로 치환된 화합물인 것인 나노프로브 입자.
제7항에 있어서, 상기 1,3-인단디온 유도체는 3-디시아노메틸리덴-1-인다논 또는 1,3-비스(디시아노메틸리덴)인단인 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 아릴비닐 화합물은 하기 화학식 1 내지 화학식 20인 것인 나노프로브 입자.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

[화학식 20]
제1항에 있어서, 상기 근적외선 영역은 650 nm 이상인 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 아릴비닐 화합물의 상기 SSF는 상기 아릴비닐 화합물의 ICT(intramolecular charge transfer) 특성에 기인한 입체적 장애(steric hindrance)에 따른 심각한 뒤틀림을 통해 발생하는 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 아릴비닐 화합물의 상기 SSF 색은 상기 A와 B의 조합을 통해 조정(tunability)되는 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 폴리머 계면활성제는 생체적합성 폴리머 계면활성제인 것인 나노프로브 입자.
제13항에 있어서, 상기 생체적합성 폴리머 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체, 폴리비닐 알코올 또는 젤라틴인 것인 나노프로브 입자.
제14항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블락 공중합체는 플루로닉 127인 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 나노프로브 입자는 65 nm 미만의 크기를 가지는 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 나노프로브 입자는 수용성 환경에서 콜로이드 형태를 이루는 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 나노프로브 입자는 높은 시그널-대-백그라운드 비율(signal-to-background, S/B)의 NIR-SSF 방출을 나타내는 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 나노프로브 입자는 체액에서 혈청 반응을 유발하지 않는 것인 나노프로브 입자.
제1항에 있어서, 상기 나노프로브 입자는 감시림프절(sentinel lymph node, SLN), 뇌 또는 종양 세포를 타겟팅하는 것인 나노프로브 입자.
제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항의 나노프로브 입자를 포함하는 조영제(contrast agent) 조성물.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 대상자(subject)에게 비경구로 투여되는 것인 조영제 조성물.
제21항에 있어서, 상기 조성물은 목적 조직(tissue of interest)에 10분 이내에 축적되어 18시간까지 지속적으로 형광을 나타내는 것인 조영제 조성물.
제23항에 있어서, 상기 목적 조직은 감시림프절, 뇌 또는 종양 세포인 것인 조영제 조성물.
제23항에 있어서, 상기 형광은 650 nm 이상의 근적외선 영역에서 관찰되는 것인 조영제 조성물.
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