CN113039287A - 具有结合对的成员的涂覆有链霉亲和素的固相 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以生物素：(链霉)亲和素相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与所述结合对的第二成员结合但不能与生物素或与(链霉)亲和素结合，并且其中所述结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。在具有高含量的生物素或其(链霉)亲和素结合衍生物的样品的免疫测定中，所述固相特别有用。本公开进一步提供用途、试剂盒和方法，特别是用于确定样品中的分析物。

Description

具有结合对的成员的涂覆有链霉亲和素的固相
技术领域
本公开涉及一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与所述结合对的第二成员结合但不能与生物素或与(链霉)亲和素结合，并且其中所述结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。在具有高含量的生物素或其(链霉)亲和素结合衍生物的样品的免疫测定中，所述固相特别有用。本公开进一步提供用途、试剂盒和方法，特别是用于确定样品中的分析物。
背景技术
本报告涉及测定法中技术上有利的替代方案，在一个测定法步骤中，该测定法要求形成两个结合剂的联接对(＝结合对)，并且其中到目前为止，该结合剂对是<生物素：(链霉)亲和素>结合对。因此，特别关注的是生物化学应用，其中结合对的两个成员的特异性相互作用以及它们彼此之间最终的结合在各自应用中起功能性作用。
非常常见并且技术人员众所周知的是，<生物素：(链霉)亲和素>结合对被用于非均相免疫测定中以将经生物素化的分析物特异性捕获剂固定在固相上。免疫测定的另一种常用实施例包括使用<生物素：(链霉)亲和素>结合对将经生物素化的抗原固定在固相上的步骤。技术人员了解大量已经构建的具有经(链霉)亲和素涂覆的表面的固相。
当最初提供在溶液中的经生物素化的化合物(即，生物素缀合物)待与这种与该溶液接触的已构建固相连接时，若同一溶液中、同一区室中或同一时间内存在未缀合的(即，未结合且无阻碍扩散的，＝“游离的”)生物素分子，则会出现问题。在这种情况下，未缀合的生物素与经生物素化的化合物竞争与固相上的(链霉)亲和素结合。取决于游离生物素的浓度和经生物素化的化合物的浓度，一定量的缀合物可能会失去竞争力，从而将不会被(链霉)亲和素结合。考虑到非均相免疫测定，例如，如果待测定样品中实质性升高的量的生物素与经生物素化的分析物特异性捕获抗体竞争与涂覆有(链霉)亲和素的微孔板或涂覆有(链霉)亲和素的磁性颗粒的结合，则可能出现实际问题。因此，所谓的生物素干扰可能造成较少的捕获抗体被锚定在固相上；捕获抗体越少，可捕获的分析物的量越低，并且可能导致测定结果不正确。
上述情形称为生物素干扰。作为免疫测定中技术挑战的生物素干扰在早前已经有所描述，例如，Kwok JS等人(Pathology.44(2012)278-280)。作者报告了关于使用自动非均相免疫测定法确定血浆中TSH(促甲状腺激素)和游离甲状腺激素的免疫测定的生物素干扰。在其他来源中，生物素干扰往往是由于高剂量生物素的摄入，例如，从特定补充剂到正常的人饮食。据信，生物素是角蛋白的关键贡献者，高剂量生物素因此可改善毛发、指甲和皮肤的质量和数量。生物素是水溶性的并且被迅速排泄。然而，如果摄入高剂量生物素补充，则循环中可能存在相当高水平的生物素，并且循环中的生物素也可能存在于用于进行分析物测量的体外分析的样品中，即，样品如血清或血浆中。样品中包含的生物素如果以高水平存在，则可能干扰用于分析物测量的测定法，该测定法采用涂覆有(链霉)亲和素的固相和经生物素化的特异性结合剂。
解决这一技术挑战的一种方式是将<生物素：(链霉)亲和素>结合对替换为不同的结合对。已经提出了可能具有与<生物素：(链霉)亲和素>结合对类似特性的其他结合对，例如，葫芦[n]脲主客体复合物，参见Shetty D.等人(Chem.Soc.Rev.44(2015)8747-8761)，其提及替换结合对的示例性和非限制性实施例。US4752638公开了由地高辛和地高辛特异性单克隆抗体组成的结合对。
但到目前为止，理论上和/或实际上可能的替代方案尚未得到广泛使用，情况似乎恰恰相反。这可能是因为可能的可替代连接基化学作用尚未得以鉴定，而这种可替代连接基化学作用是将可替代结合对成员与靶标分子或固相联接所需要的。这种连接基化学作用需要足够多功能、简单、可再现且牢固。
考虑到免疫测定法和其他类型的测定法，大量且众多不同种类的涂覆有(链霉)亲和素的固相已经得到处理，是技术人员已知的并且可供从业人员使用。(链霉)亲和素的生物化学作用已经提供了大量技术和应用。特别地，考虑到不同的固相，现有技术仍使用长久以来已知的过程用(链霉)亲和素来涂覆多种表面，如例如WO 1989/010979 A1和EP0643305 A2中所公开的。大量具有链霉亲和素涂覆的表面的不同固相已经得以描述并且可商业获得，包括例如微孔板、载玻片、培养皿、小瓶、膜、传感器芯片、珠、磁性颗粒等。考虑到与(链霉)亲和素有关的此类现有材料和方法，将这一结合配偶体替换为结合对的可替代成员需要进行巨大努力以达到可比的阶段和类似的复杂程度；此外，需要开发可替代涂覆技术。
因此，生物化学领域特别需要提供将除(链霉)亲和素以外的结合配偶体与固相连接的手段。对于用于检测测定法(诸如免疫测定法，尤其是关于测定可能含有游离生物素的样品的测定法)中的固相存在特别需求。所希望的不受生物素干扰影响的测定法在测定进程中将不需要依赖于经联接的<生物素：(链霉)亲和素>结合对的形成。
在核酸分析领域中，已经构建了序列捕获技术。在具体实施例中，将经生物素化的单链核酸与涂覆有(链霉)亲和素的磁性颗粒连接。这些颗粒可用来“捕钓”所希望的序列，例如，以进行进一步扩增或进行测序。Mastrangeli R等人(Analytical biochemistry 241(1996)93-102)公开了使用经生物素化的探针和链霉亲和素偶联的磁珠捕获目的cDNA序列，之后对捕获的分子进行PCR扩增。然而，尽管有关于序列捕获的知识和可用性，但在将除(链霉)亲和素以外的结合配偶体与固相连接的可替代涂覆技术方面，尤其是在检测测定法诸如免疫测定法中的常规使用方面，似乎尚无进展。一个原因可能是，已知大量的样品材料含有溶核酶，这不鼓励使用杂交核酸作为备选结合对来替换生物素：(链霉)亲和素。
先前已经提出了用具有互补序列的单链寡核苷酸，即能够通过杂交方式形成双链体的寡核苷酸作为结合对工具，来联接大分子或将分子连接至固相。EP 0488152公开了一种使用固相的非均相免疫测定法，其通过联接抗体和固相的核酸双链体将分析物特异性捕获抗体固定在固相上。示出了一个实施例中，其中一个杂交的寡核苷酸与抗体结合，而互补的寡核苷酸与固相结合，从而形成联接双链体。在文件EP 0698792、WO 1995/024649、WO1998/029736和EP 0905517中提供了类似的公开内容。WO 2013/188756公开流式细胞术的方法和组合物，所述组合物包含抗体、寡球和寡核苷酸探针，所述抗体缀合至第一寡核苷酸，所述寡球缀合至具有与第一寡核苷酸相同序列的第二寡核苷酸，所述寡核苷酸探针具有标记和与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸互补的第三序列。在具体实施例中，寡球是磁性的。本文件报道寡球的具体用途，作为标准化程序中的参考。
修饰的寡核苷酸，诸如肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)已研究用于生物化学和生理学应用。LNA在核糖部分的2′-氧和4′-碳原子之间具有亚甲基连接基，其将糖锁定为C3-内构象，因此LNA称为“锁核酸”。在涉及通过杂交形成双链体的技术应用中，这种化学修饰赋予核酸酶抗性以及对寡核苷酸靶标的更高的亲和力和更高的特异性。WO 1998/39352公开了锁核酸(LNA)结构。WO 2000/056746公开了LNA单体的合成，所述LNA单体包括用于LNA的某些立体异构体的中间产物。通过化学合成，可以合成仅由LNA核苷类似物单体组成的单链(“全LNA”)。
WO 1999/14226建议在亲和对的构建中使用LNA以连接到目的分子和固体支持物上。然而，本领域也已知互补的全LNA单链的杂交具有的技术问题。仅由LNA组成的寡核苷酸类似物的杂交的热力学分析在很大程度上是凭经验进行的，到目前为止，似乎不可能进行没有事先变性步骤(例如，在杂交之前加热)的杂交单体的序列预测。
到目前为止，大多数情况下都分析了混合的LNA/DNA寡核苷酸(也称为“混合体单链”或“混合体”)。迄今为止，仅有特别是由Koshkin A.A.等人(J Am Chem Soc 120(1998)13252-13253)和
Figure BDA0003066285850000041
B.P.等人(Analyst 130(2005)1634-1638)发表的关于仅由LNA单体制成的杂交单链寡核苷酸(即“全LNA”单链寡核苷酸)的表征的较少报道。Eze N.A.等人(Biomacromolecules 18(2017)1086-1096)报道，DNA/LNA混合体和DNA探针的缔合率低于105M-1 s-1。根据这些作者的观点，考虑到三分之一单体可替代，用LNA单体取代一个或多个DNA单体似乎不会影响溶液中的杂交动力学。
关于含有LNA的寡核苷酸的热力学行为的预测是由Tolstrup N.等人(NucleicAcids Research 31(2003)3758-3762)引用的专用计算机程序来辅助的。然而，由于这些寡核苷酸更复杂的特性，而不是缺乏实验数据，所述报告明确提到了LNA寡核苷酸的更高的预测误差。
本报告的重要基本概念是，当可替代结合对的一个成员作为生物素缀合物而被连接时，技术人员可以继续使用构建的(链霉)亲和素涂覆的固相。也就是说，本公开教导将可替代结合对的选定成员连接到所选择的链霉亲和素涂覆的固相上，其中可替代结合对的选定成员是经生物素化的形式。需要提醒的是，选定成员本身必须既不是生物素也不是(链霉)亲和素。因此，本报告公开了使用可替代结合对的选定成员“外涂覆”(链霉)亲和素涂覆的固相。这种外涂覆的固相可用于将化合物非共价地且特异性地与固相连接，其中该化合物作为具有可替代结合对的另一成员的缀合物而提供。连接受可替代结合对的彼此结合的两个成员的影响。
再者，发现并在本文中报告，除<生物素：(链霉)亲和素>结合对以外的结合对的所选成员的生物素化可以容易地实现，主要通过依赖于构建的生物素偶联化学作用，同时阻止成员的与其各自同源结合成员形成联接的功能。
发明内容
外涂覆的概念提供了本公开的第一方面。据此，涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的第一方面涉及一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与结合对的第二成员结合，第二成员是缀合物的一部分，但是其中第一成员不能与生物素或(链霉)亲和素结合，其中能够变为被第一成员结合和/或正在被第一成员结合的第二成员是缀合物的一部分。缀合物包含分析物、分析物类似物和分析物特异性捕获剂中的任一者，并且其中结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。因此，第一方面包括一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与所述结合对的第二成员结合但不能与生物素或与(链霉)亲和素结合，其中当所述第二成员是包含分析物、分析物类似物和分析物特异性捕获剂中任一者的缀合物的一部分时，所述第二成员能够变为被所述第一成员结合，并且其中所述结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。
根据这第一方面的固相可以获得和/或获自制备具有与其连接的结合对成员的固相的方法，该方法是涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的另一方面。因此，公开了一种制备具有与其连接的结合对的成员的固相的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供涂覆有(链霉)亲和素的固相；
(b)选择具有第一成员和第二成员的结合对；
(c)提供在步骤(b)中选择的结合对的第一成员；
(d)将步骤(c)的第一成员生物素化；
(e)通过使获自步骤(d)的经生物素化的第一成员与步骤(a)的经涂覆的固相接触并对其进行孵育，将经生物素化的第一成员与固相连接，从而将经生物素化的第一成员以生物素-(链霉)亲和素相互作用的方式与固相连接；
其中在步骤(b)中，选择该对，使得
-在不经生物素化的情况下，结合对的第一成员和第二成员不能与链霉亲和素结合，
-以经生物素化的形式并且与经涂覆的固相连接，结合对的第一成员能够与第二成员结合，并且
-结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交；
从而获得具有与其连接的结合对的成员的固相。这一通过外涂覆制备固相的方法是本公开的另一方面，其涉及本文所公开的全部其他方面和实施例。因此，这一方面包括一种制备具有与其连接的结合对的成员的固相的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供涂覆有(链霉)亲和素的固相；
(b)选择具有第一成员和第二成员的结合对；
(c)提供在步骤(b)中选择的结合对的第一成员；
(d)将步骤(c)的第一成员生物素化；
(e)通过使获自步骤(d)的经生物素化的第一成员与步骤(a)的经涂覆的固相接触并对其进行孵育，将经生物素化的第一成员与固相连接，从而将经生物素化的第一成员以生物素-(链霉)亲和素相互作用的方式与固相连接；
其中在步骤(b)中，选择该对，使得
-在不经生物素化的情况下，结合对的第一成员和第二成员不能与链霉亲和素结合，
-以经生物素化的形式并且通过生物素：(链霉)亲和素键的方式与经涂覆的固相非共价连接，结合对的第一成员能够与第二成员结合，
-以经缀合的形式并且与分析物特异性捕获剂共价连接，结合对的第二成员能够与连接到固相的经生物素化的第一成员结合，并且
-结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交；
从而获得具有与其连接的结合对的成员的固相。
本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是，本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相(作为产物)在确定样品中的分析物的测定法中的用途。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是用于确定样品中的分析物的试剂盒，该试剂盒包含处于第一容器中的(a)和处于第二容器中的(b)或(c)任一者，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是包含(a)、以及(b)或(c)的复合物，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员，
其中在复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，其中在复合物中，结合对的第一成员与结合对的第二成员结合。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是形成本文所公开的复合物的方法，该方法包括使(a)与(b)或(c)接触的步骤，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员，
之后是分别孵育(a)和(b)或者(a)和(c)的步骤，从而形成复合物，其中在复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，其中在复合物中，结合对的第一成员与结合对的第二成员结合。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是确定样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤
(a)提供具有分析物的样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相；
(c)提供缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)；
(d)使(a)的样品与(c)的缀合物接触、混合并对其进行孵育，从而形成复合物，该复合物包含被缀合物中包含的分析物特异性捕获剂捕获的分析物；
(e)通过使步骤(d)中形成的复合物与步骤(b)的固相接触并对其进行孵育，将复合物固定化，其中结合对的第一成员与第二成员结合；
(f)任选地洗涤获自步骤(e)的经固定化的复合物；
(g)确定获自步骤(e)或步骤(f)的经固定化的复合物中包含的分析物；
从而确定样品中的分析物。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是确定样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤
(a)提供具有分析物的样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相；
(c)提供缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员；
(d)提供经标记的分析物特异性检测剂，其中步骤(c)的缀合物中包含的分析物或分析物类似物和样品中的分析物能够被该检测剂结合；
(e)使步骤(a)的样品与步骤(c)的缀合物和步骤(d)的检测剂接触、混合并对其进行孵育，从而形成包含分析物和检测剂的第一复合物以及包含缀合物和检测剂的第二复合物；
(f)通过使步骤(e)中形成的第二复合物与步骤(b)的固相接触并对其进行孵育，将复合物固定化，其中结合对的第一成员与第二成员结合；
(g)任选地洗涤获自步骤(f)的经固定化的复合物；
(h)确定获自步骤(f)或步骤(g)的经固定化的复合物中包含的标记；
从而确定样品中的分析物。
附图说明
图1示出实例1的合成方案。
图2示出实例2的合成方案。
图3示出实例3的合成方案。
图4示出实例4的合成方案。
图5示出实例5的合成方案。
图6 A和B是实例10的结果的例示。
图7 A和B是实例12的结果的例示。
图8示出实例13的结果的示意图。
具体实施方式
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并非旨在限制本发明。
冠词“一”和“一个”在本文中用来指该冠词的语法对象中的一个或多个(即，至少一个)。举例而言，“一项目”意为一个项目(一个单一项目)或超过一个项目(多个项目)。
应进一步理解，当在本说明书中使用基本术语“包括”和/或“具有”时，其指定了所提及的特征、项目、整数、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但并不排除存在或添加至少一个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或它们的组。以类似的方式，“有”也指定了所阐述特征等的存在。
如本文所用，术语“包含(comprise/comprising)”、“含有(contain/containing)”、“包括(include/including)”、“具有(has/having)”或其任何其他变型旨在覆盖非排他性的包括，即，表示特征的开放性列举。例如，包含一系列特征的过程、方法、物品或设备不一定仅限制为那些特征，而可以包括未明确列出的或此类过程、方法、物品或设备所固有的其他特征。相反，“由...组成(consist of/consisting of)”或其变型指定特征的封闭性列举。注意，给定特征的封闭性列举理解为表示这些特征的开放性列举的一个具体实施例。
如本文中所用并且除非明确阐述为相反，否则“或”是指包含性的或而非排他性的或。例如，条件A或条件B服从以下任一项：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)并且B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。
如本文所用，“基本上”、“相对”、“通常”、“典型”、“约”和“大致上”是相对修饰语，旨在表示所允许的自如此修饰的特征的变动。它们不旨在限制其所修饰的绝对值或特征，而是抵达或接近这种物理或功能性特征。如果未另外阐述，则应理解，术语“约”与数字值n的组合(“约n”)表示处于该值的数字值±5％所给定的间隔内的值x，即，n-0.05*n≤x≤n+0.05*n。在术语“约”与数字值n组合描述本发明的优选实施例的情况下，如果没有另外指明，则n的值是最优选的。
在本具体实施方式中，对“一个实施例”、“一实施例”或“在实施例中”的引用意味着所指的特征包括在与其根据本公开的全部方面相关的技术的至少一个实施例中。此外，除非明确阐述，并且除非对于本领域技术人员是显而易见的，否则对“一个实施例”、“一实施例”或“多个实施例”的独立引用不一定指同一实施例，然而，也不意味着这些实施例相互排斥。因此，根据本公开的其全部方面中的术语可包括本文所述实施例的任何种类的组合和/或整合。
在本文提及的全部方面和实施例中，术语“(链霉)亲和素”和亲和素型蛋白质可互换使用。亲和素型蛋白质通常理解为具有至少一个能够与生物素的杂环状结构特异性结合的结合袋的蛋白质，该杂环状结构以与四氢噻吩环稠合的脲基环表示。由于这一特性，亲和素型蛋白质能够与经生物素化的靶标分子结合，其中生物素经由生物素的戊酸侧链的羧基功能的碳原子与该分子共价结合。亲和素型蛋白质的若干实施例是本领域已知的。更具体地，亲和素型蛋白质可以选自包括以下的组：亲和素、中性亲和素、链霉亲和素、bradavidin、traptavidin、其生物素结合突变体、其混合物、其单体、其二聚体、其三聚体、其四聚体、其多聚体、其缀合形式和与常规生物素化目的分子结合的抗体。众所周知，在其天然存在的形式中，大量亲和素型蛋白质(尤其是那些非抗体的蛋白质)，特别是亲和素和链霉亲和素，是同源四聚体；即，它们由四个相同的亚基组成。在单体性亲和素型蛋白质变体的实施例中，天然存在的形式可以是二-寡聚物、三-寡聚物或四-寡聚物，其中每个单体均具有生物素结合袋。在一个实施例中，亲和素型蛋白质选自单体、同源二聚体、同源三聚体和同源四聚体。而且，亲和素型蛋白质可以是具有能够与生物素的杂环状结构特异性结合的抗原结合袋的抗体，该杂环状结构以与四氢噻吩环稠合的脲基环表示。
链霉亲和素与生物素之间的相互作用构成了异常强的蛋白质：配体结合的实例。链霉亲和素结合动力学已经被很详细地描述，例如，如Srisa-Art M.等人(Anal.Chem.80(2008)7063-7067)和该文献中引用的参考文献中所报道的。据此，链霉亲和素和生物素的缔合速率为约107M-1 s-1，且示例性范围为约2x106M-1 s-1至约5x107M-1 s-1，这取决于进行各测量的特定技术路线。针对未衍生化的链霉亲和素报导的解离速率常数为2.4×10-6s-1，这比使用亲和素观察到的值7.5×10-8s-1是30倍高，参见Piran U&Riordan WJJ(Immunol 1Methods 133(1990)141-143)。
当本公开中称为“(链霉)亲和素”或亲和素型蛋白质时，应理解，这些术语同样并入了其任何变体，前提条件是该变体能够与生物素非共价地结合，具有至少一个能够与生物素的杂环状结构特异性结合的结合袋，该杂环状结构以与四氢噻吩环稠合的脲基环表示。就此而言，变体是“功能上等效的多肽”，因为形成至少一个结合袋的氨基酸具备与所考虑的原始亲和素型蛋白质的氨基酸序列相似的静电和立体化学属性，其中该变体包含一个或多个保守氨基酸取代、类似氨基酸取代和/或氨基酸的缺失和/或添加，这些并不显著影响或改变结合袋的氨基酸的功能。“功能上等效”也包括关于相应参考氨基酸序列的同源氨基酸序列。
出于本公开的目的，应理解，术语“生物素”代表了天然存在的化合物，即，D(+)-生物素。生物素(D(+)-生物素；C10H16N2O3S；MW＝244.31g/mol；IUPAC名称：5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代-1，3，3a，4，6，6a-六氢噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]戊酸)，CAS登记号58-85-5，其包含与四氢噻吩环稠合的脲基环以及与四氢噻吩环的碳原子中的一个共价连接的戊酸取代基。生物素的基本结构早已广为人知并且已有报导，例如，Melville D.B.等人(J.Biol.Chem.146(1942)487-492)。生物素具有三个连续的手性碳原子，并因此有四种可能的非对映体外消旋形式。在非对映体外消旋形式中，仅D(+)-生物素存在于自然界中，而其他异构体均来源于合成。生物活性形式是(3aS，4S，6aR)构型。
根据Marquet A.(Pure&Appl.Chem.49(1977)183-196)，在D(+)-生物素的晶体结构中，脲基环是平面的，而噻吩烷环具有信封构象。戊酸侧链不是完全延展的而是扭曲的，并且在侧链的C6原子和脲基环的N′3原子之间存在相互作用；据报导，这一相互作用对生物素的反应性有影响。也报导了溶液中的噻吩烷环的信封构象，如Glasel J.A.(Biochemistry 5(1966)1851-1855)和Lett R.&Marquet A./Tetrahedron 30(1974)3365-3377)报导的NMR研究所示。
术语“生物素部分”用来指代与分子的生物素相关的部分或源自生物素的部分，例如，获自任何种类的生物素化或化学偶联。生物素经由戊酸侧链的羧基功能的碳原子与目的分子上的适宜化学基团连接成为“生物素化”或“常规生物素化”。据此，“经生物素化的”目的分子的生物素部分具有面向外的环结构(即，与四氢噻吩环稠合的脲基环)，而生物素部分的线性部分面向内而朝向经生物素化的分子的表面。面向外的环结构可以被亲和素型蛋白质结合。在生物素化之后，生物素部分保留了与(链霉)亲和素特异性相互作用的能力；生物素化不影响生物素分子中负责与亲和素型蛋白质的结合袋的特异性相互作用的部分，即，生物素化不影响以与四氢噻吩环稠合的脲基环表示的杂环状结构。
注意，生物素衍生物诸如但不限于生物素醇(biotinol)或生物胞素也具有与(链霉)亲和素结合的能力，结合方式与生物素相似。这是因为，在此类分子中，要么四氢噻吩环被完全保留(如在生物素醇和生物胞素的情况下)，要么杂环状结构被充分保留以仍允许与(链霉)亲和素结合袋进行实质性相互作用。
在本公开的语境中，术语“生物素化”涵盖不同种类的能够将生物素与所选分子偶联的连接基化学作用，前提条件是与四氢噻吩环稠合的脲基环呈现为从经生物素化的分子向外，使得生物素部分可以被(链霉)亲和素结合。技术人员清楚地知道能够将生物素的戊酸部分的碳原子桥接至所选分子中包含的官能团的不同种类的连接基化合物。
本文档通篇中，结合对的第一成员与第二成员之间的标点符号(“：”)用来表示结合对的第一成员与第二成员的特异性联接或形成此特异性联接的能力，因此以“成员1：成员2”或“<成员1：成员2>”表示。典型地，第一成员和第二成员属于不同的种类，即，第一成员和第二成员不是相同化合物。据此，取决于语境，“成员1：成员2”可意为成员1和成员2可以形成结合对，并且成员1能够特异性地识别并结合至成员2；或者，取决于语境，“成员1：成员2”可意为成员1和成员2是经联接的对。还应理解，除非另做不同描述，否则成员不仅包括作为经分离化合物的成员，而且包括与另一实体连接的成员(例如，形成另一实体的部分)。举例而言，“(链霉)亲和素：生物素”(＝“生物素：(链霉)亲和素”)结合对是本领域技术人员完全已知的。一方面的生物素或生物素部分和另一方面的(链霉)亲和素表示这一结合对的两个成员。如别处所述，这一结合对在具有非共价相互作用的已知最高结合亲和力之一方面表现优异。术语“生物素：(链霉)亲和素”中的“生物素”包括游离生物素、在生物素戊酸侧链的羧基功能碳原子处衍生的生物素、和经生物素化的化合物的生物素部分。术语“生物素：(链霉)亲和素”中的“(链霉)亲和素”包括经分离的(链霉)亲和素和与另一实体(例如，固相)共价或非共价连接的(链霉)亲和素。
如抗体的示例性语境中所用，术语“分析物特异性结合”是指抗体与分析物上的其靶标表位的免疫特异性相互作用，即，抗体与分析物上表位的结合。本领域技术人员完全清楚抗体经由分析物上的其表位进行分析物特异性结合的概念。术语“特异性捕获剂”和“特异性检测剂”是更广义术语“特异性结合剂”下的两个实施例。这表明受试剂能够与目的分析物特异性结合或者被目的分析物特异性结合。很多用于免疫测定的不同测定设置是本领域已知的。取决于具体的测定设置，可使用各种特异性结合剂。术语“分析物特异性结合剂”涵盖术语“分析物特异性捕获剂”和“分析物特异性检测剂”；它是指与目的分析物特异性结合的分子。本公开的意义上的分析物特异性结合剂典型包含能够与分析物(其他术语：目的分析物、靶标分子)结合的结合分子或捕获分子。在一个实施例中，分析物特异性结合剂对于其相应靶标分子即分析物具有至少107l/mol的亲和力。在其他实施例中，分析物特异性结合剂对于其靶标分子具有108l/mol或甚至109l/mol的亲和力。如技术人员将会了解的，术语“特异性”用来表示样品中存在的其他生物分子不显著地与特异于分析物的结合剂结合。在一些实施例中，与除靶标分子以外的生物分子的结合水平导致结合亲和力仅为靶标分子亲和力的1O％，更优选仅为5％或更低。在一个实施例中，与除分析物以外的分子的结合亲和力是不可测量的。在一个实施例中，分析物特异性结合剂将满足亲和力和特异性的上述最低标准。
术语“抗体”涵盖各种形式的抗体结构，包括但不限于完整抗体和抗体片段。在一个实施例中，抗体可以来自不同来源，例如，来自山羊、绵羊、小鼠、兔或大鼠；抗体可以是嵌合抗体或进一步经基因工程化改造的抗体，只要根据本公开实施例的特征特性得以保留即可。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或者至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双体抗体、单链抗体分子和自抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体在例如Huston，J.S.，Methods in Enzymol.203(1991)46-88中有所描述。此外，抗体片段包含单链多肽，其具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域组装在一起，或者具有与IGF-1结合的VL结构域的特征，即能够与VH结构域组装在一起成为功能性抗原结合位点，并因此提供符合根据本公开的技术的抗体特性。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；单链抗体分子；scFv、sc(Fv)2；双体抗体；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段都有单个抗原结合位点和残留的“Fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生的F(ab′)2片段具有两个抗原结合位点并且仍能与抗原交联。Fab片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域且亦含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于Fab′片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中关于其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab′的命名。F(ab′)2抗体片段最初是作为在其间具有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段而产生的。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“Fv”是包含完全的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链Fv种类由紧密和非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽连接基共价地链接，使得轻链和重链可缔合为类似于在双链Fv种类(sc(Fv)2)中的“二聚体”结构。以此构型，每个可变结构域的三个HVR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个HVR共同对抗体赋予抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于完整结合位点。
本公开包括单价Fab片段和单链Fv，它们来源于能够与本文所公开的游离生物素特异性结合的单克隆抗体。与天然存在的抗体形式相比，单价种类由于它们较小的分子量而可以在水溶液中更快地扩散。另一方面是，特别在合适的条件下，scFv抗体可以在真核表达系统中重组地产生。
术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，其片段包含联接至与同一多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的连接基，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体抗体可为二价抗体或双特异性抗体。双体抗体更全面地描述于例如：EP 404097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Holliger等人，PNAS USA 90：6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中描述。
本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均相的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能存在的少量突变例如天然存在的突变，该抗体群体包含的单个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆的”表明抗体的特征不是离散抗体的混合物。在某些实施例中，这样的单克隆抗体典型包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列获自包括从多个多肽序列中选择单个靶标结合多肽序列的过程。例如，选择过程可以是从多个克隆，诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特的克隆。应当理解，可以进一步改变选择的靶标结合序列，例如，以提高对靶标的亲和力、使靶标结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产生、降低其在体内的免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是根据本公开的技术的单克隆抗体。与典型包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除其特异性外，单克隆抗体制剂的优势还在于其典型不受其他免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上均相的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括，例如，杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein，Nature，256：495-97(1975)；Hongo等人，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)，Harlow等人，Antibodies：A LaboratoryManual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)；Haemmerling等人，在以下文献中：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier，N.Y.，1981))、重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)、噬菌体展示技术(参见，例如，Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，PNAS USA 101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)和在动物中产生具有编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的部分或全部的人抗体或类人抗体的技术(参见，例如，WO1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovits等人，PNAS USA90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann等人，Year inImmunol.7：33(1993)；美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016；Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild等人，NatureBiotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.14：826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定种类或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来自另一种类或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出所需的生物学活性即可(例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人，PNAS USA 81：6851-6855(1984))。嵌合抗体包括
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抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用目的抗原免疫猕猴而产生的抗体。
术语“肽”意为通过酰胺(肽)键链接两个或更多个氨基酸而形成的任何化合物，通常是α-氨基酸的聚合物，其中每个氨基酸残基(NH2-末端氨基酸除外)的α-氨基基团均与线性链中的下一个残基的α-羧基链接。术语肽、多肽和聚(氨基酸)在本文中同义地使用，是指尺寸不受限制的这一类化合物。这一类的最大成员称为蛋白质。
术语“免疫原”(＝“抗原”)和“免疫原性”是指能够在生物体内产生或生成免疫应答的物质。相比之下，“半抗原”是小分子(例如，杀虫剂、杀真菌剂、药物、激素、毒素、合成肽等)，其不直接诱导免疫应答诸如抗体的形成。已经构建了通过将半抗原与免疫原性载体诸如抗原性大分子缀合来研发抗半抗原抗体的技术。出于本公开的目的，半抗原理解为低分子量分子，尤其是分子量为10,000Da或更小的分子，它们不引起免疫应答，直到并且除非与免疫原性载体诸如蛋白质缀合。一旦引起免疫应答并形成抗体，该抗体就可以与半抗原结合。这样生成的抗体可用于很多领域中，尤其是免疫诊断试剂盒或生物传感器的开发中。因此，术语“半抗原”表示仅在与免疫原性载体(诸如至少30个氨基酸的多肽)连接时才引起免疫应答的10,000Da或更低的小分子。在这个意义上并且在一个实施例中，半抗原是不完整的抗原，它本身不能促成抗体形成但当它与至少30个氨基酸的蛋白质缀合时可以促成抗体形成。示例性的半抗原是苯胺、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、醌、组胺-琥珀酰基-甘胺酸(HSG)、肼苯哒嗪、三氟溴氯乙烷、铟-DTPA、荧光素、地高辛、茶碱、溴脱氧尿苷、甾族化合物和二硝基苯酚。在具体实施例中，半抗原不是生物素并且不含生物素部分。在一个具体实施例中，半抗原是地高辛或茶碱或荧光素或溴脱氧尿苷。
术语“分析物”是指其在样品中的存在或其量待确定的物质或物质的基团，包括但不限于，任何药物或药物衍生物、激素、肽或蛋白质抗原、DNA或RNA寡核苷酸、半抗原或半抗原-载体复合物。
“分析物类似物”(＝“分析物的类似物”)是，就分析物特异性结合剂(例如，抗体)对于分析物的结合亲和力和/或特异性而言，其行为模式与分析物相似或有益于达成所希望的特异性结合和/或测定结果的任何物质或物质的基团，包括但不限于，其衍生物、代谢物和异构体。
术语“样品”表示水性混合物诸如来自宿主的体液，例如，尿液、全血、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊液、泪液、黏液等，但特别是尿液、血浆或血清。若希望则可以对样品进行预处理，并且样品可在不干扰使用分析物特异性结合剂的测定的任何常规介质中制备。优选水性介质。在本公开的意义上，样品通常理解为从源个体物理地分离。
“混合物”是通过将两种或更多种不同材料组合制备的没有发生化学反应的物质。混合物是将化学物质如元素和化合物机械掺混或“混合”的产物。除非另有规定，否则形成混合物并不赋予被混合的材料以共价化学键合或其他化学改变，使得每一成分保持其自身的化学特性和组成。尽管混合物中不存在化学改变，但混合物的物理特性诸如其熔点也可能与其组分不同。
“缀合物”是指通过将两个或更多个化学化合物共价接合而形成的化合物。这一过程也称为“缀合”。典型地但不一定，通过至少双官能连接基将两个或更多个化学化合物接合，其中第一共价键在连接基的第一反应性基团和第一化学化合物之间形成，而第二共价键在连接基的第二反应性基团和第二化学化合物之间形成。术语“共价键”意为两个种类之间的化学键，并且可包括单键或多键。相比之下，术语“非共价键”意为不形成化学键的化学或物理相互作用。因此，非共价结合包括疏水/亲水相互作用、氢键键合、范德华相互作用以及离子性和金属性相互作用。例如，物质被吸附到表面是非共价的，而诸如通过例如碳二酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或所谓“点击”化学偶联将物质偶联至表面是共价的。
术语“结合配偶体”或“结合对”是指互补分子，即第一成员和第二成员，它们的对也可表示为成员1：成员2、[第一成员]：[第二成员]、成员1：[第二成员]或[第一成员]：成员2，其中不同的成员通过由它们的结构所决定的非共价连接而特异性地与彼此相互作用。示例性的结合配偶体包括一对能够与彼此形成双链体的杂交寡核苷酸或多核苷酸或其类似物、生物素：(链霉)亲和素、抗体：半抗原、抗体：抗原、酶：底物、[甘露糖、麦芽糖、直链淀粉]：[对应的糖结合蛋白质]、[寡糖或多糖]：凝集素、细胞因子：[对应的受体]或配体：[对应的配体结合结构域]、[Zn2+、Ni2+、Co2+或Cu2+金属螯合复合物]：[组氨酸-标签]、[铟螯合复合物]：[CHA255抗体]、[葫芦[n]脲主体残基]：[客体残基]、[第一蛋白质二聚化结构域]：[第二蛋白质二聚化结构域]。
“标记”定义为例如在向其添加反应剂时或将反应剂与其加成时直接或间接地生成可检测信号的部分，诸如在与合适的共反应剂/底物加成时生成可检测信号的酶标记，该共反应剂/底物与酶发生作用或酶作用于该反应剂/底物时，得到可检测信号。标记本身可以是可检测的，诸如裸眼可视或使用观察装置(诸如显微镜、分光光度计、色度计等)可视。因此，这种标记物可包括，例如，酶、铁蛋白、荧光或着色微粒/珠或纳米颗粒/珠、胶体金属(包括金和银胶体颗粒)、量子点、磁性颗粒、上转换磷光颗粒、电化学发光分子、含有各种金属(包括但不限于，过渡金属，诸如Sc、Y、Ti、Zr、Hf、V、Nb、Ta、Cr、Mo、W、Mn、Tc、Re、Fe、Ru、Co、Rh、Ir、Ni、Pd、Pt、Cu、Ag、Au、Zn、Cd、Hg和Os；镧系元素，诸如Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu；锕系元素，诸如Th、Pa、U、Np、Pu、Am、Cm、Bk、Cf、Es、Fm、Md、No和Lr；等等)的化合物。
如本文中所用，术语“固相”和“固相支持物”可互换使用，并且是指可与结合对的成员连接的任何固体或半固体材料，例如，结合对的成员可直接或间接地与其非共价连接的材料，或者可将它们掺入(例如，物理性包封、吸附等)其中的材料，或者可被功能化以包括结合对的成员(例如，与结合对的成员缔合)的材料。除了结合对的成员之外，固相支持物可以含有多种材料，其包括例如天然或合成的聚合物、树脂、金属或硅酸盐。重要的是，在本公开的意义上，固相的面向外的表面涂覆有(链霉)亲和素，从而允许结合对的经生物素化的成员以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式连接。
合适的固相支持物是本领域中已知的并且例示地包括琼脂糖(可作为Sepharose在商业上获得)、纤维素(例如，羧甲基纤维素)、葡聚糖(诸如Sephadex)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙二醇、硅酸盐、二乙烯基苯、甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、玻璃、陶瓷、纸、金属、类金属、聚丙烯酰替吗啉、聚酰胺、聚(四氟乙烯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚(对苯二甲酸乙二酯)、人造丝、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、硅酮、聚甲醛、醋酸纤维素、小基纤维素、其他类型的树脂、或任何前述物质的两种或等多种的组合。所要求的一切就是，固相支持物中的材料或材料组合基本上不干扰(例如，在一些情况下仅最小程度地干扰)结合对的成员之间的结合。
固相支持物可具有多种物理格式，这些格式可包括，例如，膜；芯片；载片(例如，载玻片或盖玻片)；柱；中空的、实心的、半固体的、多孔的或含空腔的颗粒诸如珠；凝胶；纤维，其包括光纤材料；基质；和样品接受器。样品接受器的非限制性实例包括样品孔、管、毛细管、小瓶和任何其他能够容纳样品的容器、沟槽或凹陷。样品接受器可包含在多样品平台上，诸如微量板、载片、微流控装置、多孔板或微孔板等。结合对的成员所连接的颗粒可具有多种尺寸，其包括保持悬浮在所需粘度的溶液中的颗粒，以及已经在所需粘度的溶液中沉淀的颗粒。例如，可通过包括用于使用合适的标签结合材料以及用于使用磁场进行的分离或保留方法的磁性、顺磁性或超磁性进行分离的纯化标签，选择颗粒以便易于与样品构成组分分离。
在具体实施例中，本文所述的固相颗粒具有球形的形状。但是，颗粒可以是例如椭圆体的或管状的。在一些实施例中，例如结晶形式的颗粒中，颗粒可具有多面体形状(不规则的或规则的)诸如立方体形状。在一些实施例中，颗粒可以是无定形的。
在一些实施例中，颗粒混合物可以是基本上球形的、基本上椭圆体的、基本上管状的、基本上多面体形的或基本上无定形的。就这一点而言，“基本上”意为颗粒混合物中超过30％(例如，35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高百分比)为给定形状。
在一些实施例中，颗粒的直径(或最长直线维度)可以为介于约1nm至约1000μm或更大之间。在一个实施例中，颗粒可以为至少约1nm至约500μm。在一些实施例中，颗粒的直径(或在其最长直线维度)可以为约50nm至约200μm。
可以以本领域技术人员所知的大量方式以(链霉)亲和素涂覆固相。例如，(链霉)亲和素可直接地或间接地共价地或非共价地与固相支持物结合，诸如通过连接基、结合剂或结合对的成员结合。例如，(链霉)亲和素可直接地与固相支持物共价结合，例如，通过(链霉)亲和素上的官能团和固相表面上的官能团之间的化学键结合。另选地，(链霉)亲和素可间接地与固相表面共价结合，例如，(链霉)亲和素可与连接基、结合剂或“底涂”化合物共价结合，而该连接基、结合剂或“底涂”化合物自身与固相表面共价结合。在后一种情况下，在一个实施例中，固相表面共价地或非共价地涂覆有底涂化合物(诸如但不限于，血清白蛋白)，并且在后续步骤中，通过将(链霉)亲和素共价地或非共价地与底涂化合物结合而将(链霉)亲和素“外涂覆”。
在频繁使用的实施例中，(链霉)亲和素可非共价地与固相结合，诸如通过吸附到或涂覆在固相表面上，或通过与连接基、结合剂或结合对的成员共价或非共价缔合，而该连接基、结合剂或结合对的成员自身与固相非共价地结合或缔合。可用于将(链霉)亲和素与支持物缔合的连接基、结合剂或结合对的成员的例示性实例包括蛋白质、有机聚合物(PEG及其衍生物)和小分子。特别优选的实例包括HSA(人血清白蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)和生物素。
例如，在一个优选实施例中，可将(链霉)亲和素共价地缀合至结合剂诸如HSA或BSA，然后，所得共价缀合物可用来非共价地涂覆固相的表面。在另一实施例中，可将(链霉)亲和素非共价地连接至(例如，涂覆于)固相表面。在其他实施例中，(链霉)亲和素与结合对的一个成员的缀合物可以与结合对的另一个成员非共价地结合，而该另一个成员已经与固相共价地链接。
在一些实施例中，(链霉)亲和素直接地与固相表面非共价地结合，例如，(链霉)亲和素非共价吸附在固相支持物上。在其他实施例中，(链霉)亲和素间接地与固相表面非共价地结合。在一个实施例中，(链霉)亲和素与连接基、结合剂或结合对的成员共价地结合，而连接基、结合剂或结合对的成员与固相表面非共价缔合。在全部情况下，与当(链霉)亲和素不与固相缔合时，与(链霉)亲和素的特异性相比，(链霉)亲和素与固相的结合都应该基本上不影响经生物素化的成员在用于连接成员的所需<生物素：(链霉)亲和素>相互作用方面的特异性。
可用于将(链霉)亲和素与固相表面共价地结合的多种化学反应是本领域技术人员众所周知的。可用于与这种支持物共价连接的官能团的例示性实例包括烷基、Si-OH、羧基、羰基、羟基、酰胺、胺、氨基、醚、酯、过氧化物、氰酸根、异氰酸根、硫氰酸根、巯基、二硫化物、氧化物、叠氮基、碘、磺基或具有化学反应性或潜在化学反应性的类似基团。
连接基或结合剂也可以用来将(链霉)亲和素共价地链接至固相表面。例如，可以将分析物与结合剂诸如HSA或BSA的共价缀合物共价链接至固相表面。
在一些实施例中，可将固相的表面修饰以促进(链霉)亲和素、连接基或结合剂的稳定连接。通常，技术人员可使用常规方法来根据所需应用将固相支持物修饰。
(链霉)亲和素和生物素之间的相互作用已经广泛应用于免疫测定中。EP 0540037例示了非均相免疫测定中<生物素：(链霉)亲和素>结合对的早期证明。报导了一种固相，其涂覆有链霉亲和素并且用来固定化经生物素化的分析物特异性捕获抗体。目前，很多商用自动化免疫测定将经生物素化的抗体与经链霉亲和素涂覆的磁珠并入作为将抗原：抗体复合物固定化在固相上的手段(Diamandis E.P.&Christopoulos T.K.Clin Chem 37(1991)625-636)。但是，这种测定设计容易受到样品中的高生物素浓度的干扰。在这种情况下，过量的游离生物素与经生物素化的抗体竞争，从而造成夹心免疫测定中的假性低结果和竞争性免疫测定中的假性高结果(Henry J.G.等人Ann Clin Biochem 33(1996)162-163)。
Grimsey P.等人(Int.J.Pharmacokinet.2(2017)247-256)报导了对生物素和生物素代谢物在血清中的有效半衰期的评估，并且报道了药代动力学(PK)模型以模拟血清生物素浓度下降到低于一系列阈值所花费的时间。不过，在诊断性免疫测定中，尤其是在生物素以大剂量应用的情况下或者考虑到由于疾病而具有高生物素血清浓度的患者，对于提供<生物素：(链霉)亲和素>结合对的替代方案存在技术需求。后一组患者易受干扰；血液(和血浆)中的高生物素水平是由于罕见的先天性代谢错误，诸如生物素酶缺乏症、全羧化酶合成酶缺乏症和生物素-硫胺素反应性基底神经节疾病，高剂量生物素疗法是已构建的针对其的治疗。而且，高剂量生物素疗法已经用作针对进行性多发性硬化的治疗的一部分(Sedel F.等人Mult Scler Relat Disord 4(2015)159-169)。
因此，随着高剂量生物素的使用增加，越来越需要抵消样品中异常高生物素水平的潜在干扰。特别关注的是，在免疫测定中确定(定性或定量检测)来自样品的分析物，该免疫测定基于<生物素：(链霉)亲和素>结合对的形成。本公开的目的为提供技术上可行、稳健且经济上可实施的测定法来确定样品中的分析物，其中本文提供的测定法对可能存在于待分析样品中的经溶解的生物素造成的干扰不敏感。因此，报导并提供了对于免疫测定工作流程进程期间的生物素干扰不敏感的特异性免疫测定。
本公开的一个关键关注点是，检测复合物借以变为被固定(锚定)在固相上的手段，例如但不限于，在用于确定样品中的分析物的非均相测定进程期间。特别地，本公开关注除<生物素：(链霉)亲和素>以外的结合对的用途，在大量的生物素的存在下，该结合对促进分析物特异性捕获剂、分析物或检测复合物的固定化。
在受控(即，在受控缺乏干扰浓度的游离生物素)的条件下将可替代结合对的成员与经(链霉)亲和素涂覆的固相连接，提供了用于分析物检测测定诸如非均相免疫测定的有利材料。本报告的基础性基本概念是，当希望进行涂覆的可替代结合成员作为生物素缀合物而被连接时，技术人员可以继续使用构建的(链霉)亲和素涂覆的固相，甚至是已经存在的检测测定中的那些。也就是说，本公开提出将可替代结合对的选定成员连接到所选择的(链霉)亲和素涂覆的固相上，其中可替代结合对的选定成员是经生物素化的形式。需要提醒的是，选定成员本身既不是生物素也不是(链霉)亲和素。因此，根据本公开的概念，在固相的制备过程中形成<生物素：(链霉)亲和素>，例如但不限于，在固相制造期间制备。重要的是，制备过程发生在将固相用于分析物检测测定之前，即，与可能含有造成干扰的浓度的生物素的样品接触之前。
因此，本报告公开了使用可替代结合对的选定成员“外涂覆”已知且已构建的(链霉)亲和素涂覆的固相。外涂覆的概念提供了本公开的一方面。据此，第一方面涉及一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与该结合对的第二成员结合但不能与生物素或与(链霉)亲和素结合，并且其中该结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。这一方面包括一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与结合对的第二成员结合但不能与生物素或(链霉)亲和素结合，其中当第二成员是包含分析物、分析物类似物和分析物特异性捕获剂中任一者的缀合物的一部分时，第二成员能够变为被第一成员结合，并且其中结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。
重要的是，应理解，本公开通篇中并且针对本文报导的全部方面和实施例，结合对-即用来替代<生物素：(链霉)亲和素>的结合对-排除了<分析物：分析物特异性捕获剂>和<分析物类似物：分析物特异性捕获剂>中的任一者。
因此，如可被技术人员选择的那样，固相的表面最初直接地或间接地涂覆有(链霉)亲和素。在后续的涂覆步骤中，结合对的经生物素化的第一成员的生物素部分将第一成员锚定在经(链霉)亲和素涂覆的固相表面上，从而促进将第一成员呈递在环绕固相的介质中，例如，作为这种介质的特定实施例的水溶液。
例如，如已经在序列捕获方法中公开的，结合对不包含天然存在的核酸诸如DNA或RNA在技术上具有重要意义，例如，如Mastrangeli R.等人(Analytical Biochemistry 241(1996)93-102)中所述。也就是说，排除了能够与DNA和RNA杂交的核酸的杂交对成员。而且，排除了任何能够与DNA或RNA杂交的结构性类似物。排除此类结合配偶体的第一个重要原因是，样品诸如全血和源自血液的样品如血浆和血清中存在单链核酸。样品中包含的此类核酸是对一对互补DNA或RNA分子或其功能性类似物的杂交成员造成干扰的重要来源。因此，为了避免DNA或RNA分子与第一结合成员和第二结合成员之间的特异性相互作用竞争，必须排除任何能够与天然存在的单链核酸形成双链体的结合对成员。
另一个反对选择由DNA或RNA特异性制备的结合对的理由是，这些结合配偶体对核酸酶敏感。因此，它们通常一定被视为在大多数生物来源样品的存在下是不稳定的，并且因此被排除在根据本文所呈现概念的结合对之外。因此，关于本文所报道的第一方面和全部其他方面，选择该对结合成员，使得结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸(即，DNA或RNA)杂交。
<生物素：(链霉)亲和素>结合对的替代物需要可替代结合对具有具体所需的技术特征。因此，两个结合配偶体的相互作用必须是特异性的。此外，联接形成的动力学，即结合对的两个分离的配偶体相互作用并最终缔合的速度，即彼此连接的速度期望高。另外，两个结合配偶体的联接一旦形成就期望是稳定的，即使该联接受非共价结合的影响。此外，对于结合配偶体在免疫测定中的应用，它们必须适合于与其他分子进行化学缀合，该其他分子为诸如(但不限于)分析物及其类似物以及分析物特异性受体。
涉及本文中公开的全部方面，在一个实施例中，第一成员能够与结合对的第二成员结合。在这一实施例中，与其他成员结合的能力独立于对应的成员，该对应的成员在溶液中游离的或与固相连接、与大分子(诸如但不限于，分析物特异性捕获剂，例如，抗体)缀合或不缀合、经生物素化或未经生物素化、与(链霉)亲和素连接或不与(链霉)亲和素连接(前提是对应的成员是经生物素化的)。重要的是，这些特征还应用于全部实施例中，其包括与结合对的成员接触的水溶液的存在。
还重要的是要认识到，在免疫测定中，分析物特异性捕获剂(＝受体或受体分子)和典型还有待检测的分析物(或其类似物)仅在某些条件下才能保持其构象和功能，而这些条件可能会因具体考虑的特定受体或分析物而有所不同；因此，受体分子或分析物只能耐受这些条件的有限偏差。仅举几例，这样的条件可以包括(但不限于)在约6.5至约8.5的pH范围内的缓冲水溶液、一种或多种溶解盐、一种或多种辅助物质，总量约250mosm/kg至约500mosm/kg范围内的溶质，在1℃至40℃范围内的预选温度。因此，在具体实施例中，在液体水溶液的存在下，结合对的第一成员能够与第二成员结合，该溶液的pH在约pH 3至约pH 11范围内，更具体地在约pH 5至约pH9范围内，更具体地在约pH 6.5至约pH 8.5范围内，甚至更具体地为约pH 7。在另一具体实施例中，在液体水溶液的存在下，结合对的第一成员能够与第二成员结合，该溶液含有总量在约1mosm/kg至约1000mosm/kg范围内，更具体地在约250mosm/kg至约500mosm/kg范围内的溶质。在另一具体实施例中，在液体水溶液的存在下，结合对的第一成员能够与第二成员结合，该溶液具有在-10℃至50℃范围内，更具体地在0℃至约40℃范围内的温度。
对于靶标与固相的连接，除了<生物素：(链霉)亲和素>的结合对是所希望的。与生物素：(链霉)亲和素相似，可替代结合对将会由第一结合配偶体和第二结合配偶体组成，其中至少一个结合配偶体可以经生物素化，以变为与经(链霉)亲和素涂覆的固相表面和需要能够与另一分子(例如，分析物特异性捕获剂)偶联的另一结合配偶体连接。
所希望的结合对的两个成员需要能够与彼此形成特异性联接，即，在也与受体：分析物捕获和/或结合相容的条件下与彼此特异性地结合。结合对的两个成员的特异性联接是非共价的，即，结合是基于非共价相互作用(诸如范德华力、疏水性和静电相互作用、氢键、离子诱导的双极和双极诱导的双极相互作用)的，并且也作为复合物(诸如例示为<蛋白质：配体>、<金属离子：整合物>等)。上述所希望的特征特别意味着，独立的结合配偶体不需要任何变性预处理以便获得结合相应的结合配偶体的能力。反之，在结合剂：分析物结合条件下，需要结合配偶体为功能性结合配偶体。具体地，出于诊断性免疫测定的目的，在样品为全血、血清或血浆的情况下，即在源自全血、血清或血浆的水溶液中，希望结合对的成员在不进行预处理的情况下能够与彼此形成联接。再者，希望所设想的结合配偶体的缔合速率为105M-1 s-1或更高，以便允许在短时间内使用合理量的结合配偶体在环境条件下在独立元件上进行结合配偶体的联接，该独立元件需要与经联接的第一成员和第二成员的对应结合对联接。
此外，要求可替代结合对的分离的成员适合于缀合，具体地是与生物分子的缀合，以及与固相表面的缀合，而又不丧失它们与彼此特异性联接的能力。关于免疫测定中的缀合物，可替代结合对的每个分离的结合配偶体必须在测定条件下起作用。相同的推理适用于与结合配偶体缀合的所有其他所需材料，诸如但不限于用以检测样品中分析物的测定进程期间可能存在的分析物、任何辅助材料、固相和其他物质或化合物。
在与本文所公开的全部方面和实施例相关的实施例中，结合对选自由以下项组成的组：
-第一寡核苷酸镜像体和第二寡核苷酸镜像体，其各自由含有L-核糖的核苷单体或含有L-2′-脱氧核糖的核苷单体组成，该第一寡核苷酸镜像体能够与该第二寡核苷酸镜像体杂交；
-由β-L-LNA核苷单体组成的第一寡聚物和第二寡聚物，该第一寡聚物能够与该第二寡聚物杂交；
-抗原和抗原特异性抗体；
-半抗原和半抗原特异性抗体；
-配体和特异性配体结合结构域；
-寡糖或多糖和凝集素，该凝集素能够与该寡糖或多糖特异性结合；
-组氨酸标签和包含选自Zn2+、Ni2+、Co2+和Cu2+的金属离子的金属螯合复合物，该金属螯合复合物能够与组氨酸标签结合；
-铟螯合复合物和CHA255抗体；
-葫芦[n]脲主体残基和能够与该主体残基结合的客体残基；和
-第一蛋白质二聚化结构域和第二蛋白质二聚化结构域，任选地在二聚化诱导剂或增强剂的存在下。
镜像体作为包含立体中心的给定化合物的镜像立体异构体而为技术人员所知。在示例性实施例中，镜像体是从非天然L-核苷酸构建的合成寡核苷酸。在具体实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是第一寡核苷酸镜像体和第二寡核苷酸镜像体，其各自由含有L-核糖的核苷单体或含有L-2′-脱氧核糖的核苷单体组成，该第一寡核苷酸镜像体能够与该第二寡核苷酸镜像体杂交。重要的是，此类镜像体具有不能够与天然存在的单链核酸(DNA或RNA)杂交的特性。此外，提及的寡核苷酸镜像体并非天然存在的核酸酶的底物，因为此类酶的酶袋与由L-核糖单体或L-2′-脱氧核糖单体组成的寡核苷酸类似物不相容。
在进一步的具体实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是由β-L-LNA核苷单体组成的第一寡聚物和第二寡聚物，该第一寡聚物能够与该第二寡聚物杂交。WO 1999/14226建议在亲和对的构建中使用LNA以连接到目的分子和固体支持物上。然而，本领域也已知互补的全LNA单链的杂交具有的技术问题。全LNA杂交的热力学分析在很大程度上是凭经验进行的，到目前为止，似乎不可能进行没有事先变性步骤(例如，在杂交之前加热)的杂交单体的序列预测。关于含有LNA的寡核苷酸的与天然存在的核酸杂交的热力学行为的预测是由Tolstrup N.等人(Nucleic Acids Research 31(2003)3758-3762)引用的专用计算机程序来辅助的。然而，由于这些寡核苷酸更复杂的特性，而不是缺乏实验数据，所引用的公开内容明确提到了LNA寡核苷酸的更高的预测误差。
事实上，当提供某些完全由LNA单体组成的(＝“全LNA”)互补单链寡核苷酸时，特别是提供由Seq ID NO：1和Seq ID NO：2组成的第一对以及由Seq ID NO：3和Seq ID NO：4组成的第二对时，发现这些当在水溶液中彼此混合并且在不存在变性步骤的情况下仅缓慢或不充分地形成双链体。
5’ctgcctgacg 3’(Seq ID NO：1) ：5’cgtcaggcag 3’(Seq ID NO：2)、
5’gactgcctgacg 3’(Seq ID NO：3) ：5’cgtcaggcagtc 3’(Seq ID NO：4)
但是，仅在加热该对单链全LNA寡核苷酸的混合物之后，才发现互补单链分子能够迅速(而不是缓慢)地形成双链体分子。对这一(相当期待的)发现的可能的解释是，分离的单链分子形成分子内二级结构或分子间二级结构，而为了使得寡核苷酸能够形成Watson-Crick配对的双链体分子，需要打破这种二级结构。在杂交步骤之前的变性步骤的有效性与这一结论是一致的。并且，这一发现总体上确证了先前关于难以预测全LNA分子的杂交特性(尤其是杂交动力学)的结论。
出乎意外的是，已经鉴定出多对互补的β-L-LNA寡核苷酸，它们能够特异性地形成具有Watson-Crick碱基配对的双链体。甚至更令人惊讶的是以下发现：此类β-L-LNA无需预先变性而与彼此杂交。已经被发现合适的由β-L-LNA单体组成的示例性和非限制性结合对是
5’tgctcctg 3’(Seq ID NO：5) ：5’caggagca 3’(Seq ID NO：6)、
5’gcctgacg 3’(Seq ID NO：7) ：5’cgtcaggc 3’(Seq ID NO：8)、
5’tgctcctgt 3’(Seq D NO：9) ：5’acaggagca 3’(Seq ID NO：10)、
5’gtgcgtct 3’(Seq ID NO：11) ：5’agacgcac 3’(Seq ID NO：12)、
5’gttggtgt 3’(Seq ID NO：13) ：5’acaccaac 3’(Seq ID NO：14)
5’gttggtgtgttggtg 3’(Seq ID NO：15) ：5’caccaacacaccaac 3’(Seq ID NO：16)
5’gttggtgtg 3’(Seq ID NO：17) ：5’cacaccggc 3’(Seq ID NO：18)
5’ggaagagaa 3’(Seq ID NO：19) ：5’ttctcttcc 3’(Seq ID NO：20)。
在一个实施例中，本报告因此提供任何上述结合对，其能够在不存在变性条件的情况下，尤其在杂交前不存在变性条件的情况下，通过杂交而与彼此形成非共价联接。具体地，提供任何上述结合对，以用于分析物检测测定中，更具体地，用于免疫测定中以用于检测样品中的分析物。引人注目地并且明显地与公认理论形成对照，此类寡聚物保留了它们在环境条件下和生理缓冲液中或以未修饰的形式或以经生物素化的形式稳定地形成双链体的能力，也可以作为缀合物。特别值得注意的是，这些序列对的双链体形成很快，即，与(链霉)亲和素和生物素的双链体形成是可比的，并且是定量的。
在又进一步的具体实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是抗原和抗原特异性抗体。技术人员清楚地了解大量此类结合对。重要的是，当抗原是蛋白质时，当抗体特异性靶向的抗原决定簇是线性表位时，它是可分离的。由于被分离为呈递亚序列的肽的线性表位，因此可用作这一结合对的成员。此外，若其中抗体已经进行亲和力成熟以增强其对抗原的结合特性，则结合对是尤其优选的。
在又进一步的具体实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是半抗原和半抗原特异性抗体。若其中抗体已经进行亲和力成熟以增强其对半抗原的结合特性，则结合对是尤其优选的。
在又进一步的实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是配体和配体结合结构域。在又进一步的实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是寡糖或多糖和凝集素，该凝集素能够与寡糖或多糖特异性结合。在又进一步的实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是组氨酸标签和包含选自Zn2+、Ni2+、Co2+和Cu2+的金属离子的金属螯合复合物，该金属螯合复合物能够与组氨酸标签结合。在又进一步的实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是铟螯合复合物和CHA255抗体。在又进一步的实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是葫芦[n]脲主体残基和能够与该主体残基结合的客体残基。在又进一步的实施例中，被选择为<生物素：(链霉)亲和素>替代物的结合对是第一蛋白质二聚化结构域和第二蛋白质二聚化结构域，任选地在二聚化诱导剂或增强剂的存在下。
在与本文所公开的全部方面和实施例相关的又进一步的实施例中，固相选自由以下项组成的组：微粒、微孔板、试管、比色皿、膜、石英晶体、片、滤纸、盘和芯片。在更具体的实施例中，固相是直径为0.05μm至200μm的微粒。在与本文所公开的全部方面和实施例相关的又进一步的实施例中，固相是微粒，更具体为单分散的顺磁珠或超磁珠。参见，例如，美国专利号4,628,037、4,965,392、4,695,393、4,698,302和4,554,088。在另一具体实施例中，珠是包埋有铁的基于聚苯乙烯的颗粒。在另一具体实施例中，珠是
Figure BDA0003066285850000311
在更具体的实施例中，珠的直径为约3μm。
在与本文所公开的全部方面和实施例相关的又进一步的实施例中，固相与水性液相(＝液体水溶液)接触。因此，在具体实施例中，本文所公开的固相与液体水溶液接触，该溶液的pH在约pH 3至约pH 11范围内，更具体地在约pH 5至约pH 9范围内，更具体地在约pH6.5至约pH 8.5范围内，甚至更具体地为约pH 7。在另一具体实施例中，本文所公开的固相与液体水溶液接触，该溶液含有总量在约0.1mosm/kg至约1,500mosm/kg范围内，更具体地在约250mosm/kg至约500mosm/kg范围内的溶质。在另一具体实施例中，本文所公开的固相与液体水溶液接触，该溶液具有在-10℃至50℃范围内，更具体地在0℃至约40℃范围内的温度。
在与本文所公开的全部方面和实施例相关的又进一步的实施例中，该水性液相含有缀合物，该缀合物包含结合对的第二成员。在具体实施例中，缀合物溶解在水性液相中。在另一具体实施例中，缀合物通过结合对的手段与固相连接。在又一具体实施例中，所溶解的缀合物和所连接的缀合物同时存在并且都与水性液相接触。
考虑到提供本文所呈现的固相，并且还涉及本文所公开的全部其他方面和实施例，本报告包括一种制备具有与其连接的结合对成员的固相的方法，该方法包括以下步骤
(a)提供涂覆有(链霉)亲和素的固相；
(b)选择具有第一成员和第二成员的结合对；
(c)提供在步骤(b)中选择的结合对的第一成员；
(d)将步骤(c)的第一成员生物素化；
(e)通过使获自步骤(d)的经生物素化的第一成员与步骤(a)的经涂覆的固相接触并对其进行孵育，将经生物素化的第一成员与固相连接，从而将经生物素化的第一成员以生物素-(链霉)亲和素相互作用的方式与固相连接；
其中在步骤(b)中，选择该对，使得
-在不经生物素化的情况下，结合对的第一成员和第二成员不能与链霉亲和素结合，
-以经生物素化的形式并且与经涂覆的固相连接，结合对的第一成员能够与第二成员结合，并且
-结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交；
从而获得具有与其连接的结合对的成员的固相。本文包括一种制备具有与其连接的结合对成员的固相的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供涂覆有(链霉)亲和素的固相；
(b)选择具有第一成员和第二成员的结合对；
(c)提供在步骤(b)中选择的结合对的第一成员；
(d)将步骤(c)的第一成员生物素化；
(e)通过使获自步骤(d)的经生物素化的第一成员与步骤(a)的经涂覆的固相接触并对其进行孵育，将经生物素化的第一成员与固相连接，从而将经生物素化的第一成员以生物素-(链霉)亲和素相互作用的方式与固相连接；
其中在步骤(b)中，选择该对，使得
-在不经生物素化的情况下，结合对的第一成员和第二成员不能与链霉亲和素结合，
-以经生物素化的形式并且通过生物素：(链霉)亲和素键的方式与经涂覆的固相非共价连接，结合对的第一成员能够与第二成员结合，
-以经缀合的形式并且与分析物特异性捕获剂共价连接，结合对的第二成员能够与连接到固相的经生物素化的第一成员结合，并且
-结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交；
从而获得具有与其连接的结合对的成员的固相。
经必要的小修改，上文呈现的固相的实施例应用于制备固相的方法的这一相关方面。
本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相在确定样品中的分析物的测定法中的用途。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是确定样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤
(a)提供具有分析物的样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相；
(c)提供缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)；
(d)使(a)的样品与(c)的缀合物接触、混合并对其进行孵育，从而形成复合物，该复合物包含被缀合物中包含的分析物特异性捕获剂捕获的分析物；
(e)通过使步骤(d)中形成的复合物与步骤(b)的固相接触并对其进行孵育，将复合物固定化，其中结合对的第一成员与第二成员结合；
(f)任选地洗涤获自步骤(e)的经固定化的复合物；
(g)确定经固定化的复合物中包含的分析物；
从而确定样品中的分析物。
在一个实施例中，样品中的分析物被分析物特异性的捕获剂结合。再者，在步骤(d)的实施例中，其他试剂特异性结合剂被连接至分析物。出于这一目的，分析物需要包含两个独立的识别位点，一个针对分析物特异性捕获剂并且一个针对分析物特异性进一步结合剂。因此，形成了夹心复合物，在该复合物中，分析物被夹在捕获剂和进一步结合剂之间。在一个实施例中，分析物特异性进一步结合剂包含标记。经标记的进一步结合剂也称为“检测剂”。位于识别位点上的经标记的结合剂的量可以通过确定标记而得以测量。它将与分析物的浓度成正比，因为如果样品中不存在分析物，那么经标记的结合剂将不会结合。这一类型的检测测定(某些实施例称为免疫测定)称为夹心测定，因为分析物被“夹在”两种试剂之间。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是确定样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤
(a)提供具有分析物的样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相；
(c)提供缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员；
(d)提供经标记的分析物特异性检测剂，其中步骤(c)的缀合物中包含的分析物或分析物类似物和样品中的分析物能够被该检测剂结合；
(e)使步骤(a)的样品与步骤(c)的缀合物和步骤(d)的检测剂接触、混合并对其进行孵育，从而形成包含分析物和检测剂的第一复合物以及包含缀合物和检测剂的第二复合物；
(f)通过使步骤(e)中形成的第二复合物与步骤(b)的固相接触并对其进行孵育，将复合物固定化，其中结合对的第一成员与第二成员结合；
(g)任选地洗涤获自步骤的经固定化的复合物；
(h)确定获自步骤(f)或步骤(g)的经固定化的复合物中包含的标记；
从而确定样品中的分析物。
出于本公开的目的并且根据早前呈现的定义，并且考虑到本文所报道的全部方面和实施例，需要提醒的是，技术人员将缀合物理解为包含多个分子，这些分子通过一个或多个共价键接合在一起，从而形成分子的缀合物。
用来确定样品中分析物的测定可例示为均相测定或非均相测定。术语“非均相”-相对于“均相”-表示测定过程中的两个基本且独立的步骤。在第一步中，形成包含标记的分析物检测复合物并将其固定化在固相上，但是未结合的标记仍围绕经固定化的复合物。在确定标记依赖性信号之前，将未结合的标记从固定化的检测复合物洗掉，洗涤代表第二步。注意，均相测定不需要洗涤步骤，并且以单步骤过程的方式生成分析物依赖性可检测信号。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是用于确定样品中的分析物的试剂盒，该试剂盒包含处于第一容器中的(a)和处于第二容器中的(b)或(c)任一者，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员。
在一个实施例中，试剂盒包含固相和第一缀合物，并且试剂盒进一步包含经标记的分析物特异性检测剂，其中检测剂和第一缀合物处于不同的容器中，并且其中第一缀合物的分析物特异性捕获剂和经标记的分析物特异性检测剂能够与分析物形成夹心复合物。在一个实施例中，试剂盒包含固相和第二缀合物，并且试剂盒进一步包含经标记的分析物特异性检测剂，其中检测剂和第二缀合物处于不同的容器中，并且其中该缀合物中包含的分析物或分析物类似物和样品中的分析物能够被检测剂结合。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是包含(a)、以及(b)或(c)的复合物，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员，
其中在复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，并且其中在复合物中，结合对的第一成员与结合对的第二成员结合。因此，在复合物中，通过第一成员与第二成员连接而形成结合对。
在本文所公开的复合物的基础上，大量技术用途是可能的。其中它们包括以下项：在一个实施例中，结合对将一方面的位于固相表面上的(链霉)亲和素与另一方面的第一缀合物桥接，从而将具有分析物特异性捕获剂的第一缀合物固定化在固相上。可以通过将分析物与经固定化的捕获剂连接而延伸这一复合物，从而将分析物固定化在固相上。如技术人员所知，这种复合物可用于确定经固定化的分析物的测定中，从而定性地或定量地检测分析物。
在另一实施例中，结合对将一方面的位于固相表面上的(链霉)亲和素与另一方面的第二缀合物桥接，从而将分析物或分析物的类似物固定化在固相上。如技术人员已知，这种复合物可用于使用本文别处所述的竞争性测定设置来定量地检测样品中的分析物。此外，可通过将分析物特异性捕获剂(诸如但不限于，抗体)与经固定化的分析物或其类似物连接而延伸该复合物，从而将分析物特异性结合剂固定化在固相上。如技术人员所知，这种复合物可用于确定经固定化的捕获剂的测定中，从而定性地或定量地检测捕获剂。
而且，本公开的涉及本文所公开的全部其他方面和实施例的进一步方面是形成本文所公开的复合物的方法，该方法包括使(a)与(b)或(c)接触的步骤，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中该固相是本文所公开的固相或获自本文所公开的制备固相的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与捕获剂偶联的结合对的第二成员，该捕获剂对于分析物是特异性的(即，该剂是分析物特异性捕获剂)，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员，
之后为分别孵育(a)以及(b)或(c)任一者的步骤，从而形成该复合物，
其中在复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，并且其中结合对的第一成员与结合对的第二成员结合。另一实施例是可作为本文所公开的形成复合物的方法的产物而获得的复合物。
以一种更正式的方式，本公开包括以下项目，其各自表示本公开的一个实施例：
1.一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与该结合对的第二成员结合但不能与生物素或与(链霉)亲和素结合，并且其中该结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。
2.根据项目1所述的固相，其可以通过根据项目10所述的方法获得。
3.根据项目1或项目2所述的固相，其中结合对选自由以下项组成的组：
-第一寡核苷酸镜像体和第二寡核苷酸镜像体，其各自由含有L-核糖的核苷单体或含有L-2′-脱氧核糖的核苷单体组成，该第一寡核苷酸镜像体能够与该第二寡核苷酸镜像体杂交；
-由β-L-LNA核苷单体组成的第一寡聚物和第二寡聚物，该第一寡聚物能够与该第二寡聚物杂交；
-抗原和抗原特异性抗体；
-半抗原和半抗原特异性抗体；
-配体和特异性配体结合结构域；
-寡糖或多糖和凝集素，该凝集素能够与该寡糖或多糖特异性结合；
-组氨酸标签和包含选自Zn2+、Ni2+、Co2+和Cu2+的金属离子的金属螯合复合物，该金属螯合复合物能够与组氨酸标签结合；
-铟螯合复合物和CHA255抗体；
-葫芦[n]脲主体残基和能够与该主体残基结合的客体残基；和
-第一蛋白质二聚化结构域和第二蛋白质二聚化结构域，任选地在二聚化诱导剂或增强剂的存在下。
4.根据项目1至3中任一项所述的固相，其中固相选自由以下项组成的组：微粒、微孔板、试管、比色皿、膜、石英晶体、片、滤纸、盘和芯片。
5.根据项目4所述的固相，其中固相是直径为0.05μm至200μm的微粒。
6.根据项目5所述的固相，其中微粒是单分散的顺磁珠。
7.根据项目6所述的固相，其中珠的直径为约3μm。
8.根据项目1至7中任一项所述的固相，其中固相与水性液相接触。
9.根据项目8所述的固相，其中液相中包含缀合物，该缀合物包含结合对的第二成员。
10.一种制备具有与其连接的结合对的成员的固相的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供涂覆有(链霉)亲和素的固相；
(b)选择具有第一成员和第二成员的结合对；
(c)提供在步骤(b)中选择的结合对的第一成员；
(d)将步骤(c)的第一成员生物素化；
(e)通过使获自步骤(d)的经生物素化的第一成员与步骤(a)的经涂覆的固相接触并对其进行孵育，将经生物素化的第一成员与固相连接，从而将经生物素化的第一成员以生物素-(链霉)亲和素相互作用的方式与固相连接；
其中在步骤(b)中，选择该对，使得
-在不经生物素化的情况下，结合对的第一成员和第二成员不能与链霉亲和素结合，
-以经生物素化的形式并且与经涂覆的固相连接，结合对的第一成员能够与第二成员结合，并且
-结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交；
从而获得具有与其连接的结合对的成员的固相。
11.根据项目1至9中任一项所述的固相或获自根据项目10所述的方法的固相在确定样品中的分析物的测定法中的用途。
12.一种用于确定样品中的分析物的试剂盒，该试剂盒包含处于第一容器中的(a)以及处于第二容器中的(b)或(c)任一者，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中固相是根据项目1至9中任一项所述的固相或获自根据项目10所述的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的结合对的第二成员，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员。
13.根据项目12所述的试剂盒，该试剂盒包含(a)和(b)，该试剂盒进一步包含经标记的分析物特异性检测剂，其中检测剂和(b)处于不同的容器中，并且其中(b)的分析物特异性捕获剂和经标记的分析物特异性检测剂能够与分析物形成夹心复合物。
14.根据项目12所述的试剂盒，该试剂盒包含(a)和(c)，该试剂盒进一步包含经标记的分析物特异性检测剂，其中检测剂和(c)处于不同的容器中，并且其中缀合物中包含的分析物或分析物类似物和样品中的分析物能够被检测剂结合。
15.一种复合物，其包含(a)以及(b)或(c)任一者，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中固相是根据项目1至9中任一项所述的固相或获自根据项目10所述的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的结合对的第二成员，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员，
其中在复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，并且其中在复合物中，结合对的第一成员与结合对的第二成员结合。
16.一种根据项目15所述的复合物，其可以通过根据项目17所述的方法获得。
17.一种形成复合物的方法，该方法包括使(a)与(b)或(c)任一者接触的步骤，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中固相是根据项目1至9中任一项所述的固相或获自根据项目10所述的方法的固相，
(b)是第一缀合物，该缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的结合对的第二成员，
(c)是第二缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员，
之后为分别孵育(a)以及(b)或(c)任一者的步骤，从而形成该复合物，
其中在复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，并且其中结合对的第一成员与结合对的第二成员结合。
18.一种确定样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供具有分析物的样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中固相是根据项目1至9中任一项所述的固相或获自根据项目10所述的方法的固相；
(c)提供缀合物，该缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的结合对的第二成员；
(d)使(a)的样品与(c)的缀合物接触、混合并对其进行孵育，从而形成复合物，该复合物包含被缀合物中包含的分析物特异性捕获剂捕获的分析物；
(e)通过使步骤(d)中形成的复合物与步骤(b)的固相接触并对其进行孵育，将复合物固定化，其中结合对的第一成员与第二成员结合；
(f)任选地洗涤获自步骤(e)的经固定化的复合物；
(g)确定经固定化的复合物中包含的分析物；
从而确定样品中的分析物。
19.根据项目18所述的方法，其中步骤(d)和(e)依次实施或同时实施。
20.根据项目18和19中任一项所述的方法，其中
-步骤(c)另外包括提供经标记的分析物特异性检测剂，
-分析物能够同时被缀合物中包含的捕获剂结合并且被检测剂结合，从而能够形成夹心复合物；
-步骤(d)包括使(a)的样品与(c)的缀合物和另外地经标记的分析物特异性检测剂接触、混合并对其进行孵育，从而形成复合物，该复合物包含夹在捕获剂和检测剂之间的分析物，并且
-步骤(g)通过确定经固定化的复合物中包含的标记而得以实施。
21.根据项目20所述的方法，其中在步骤(g)之前，将未结合的经标记的分析物特异性检测剂从经固定化的复合物中去除。
22.一种确定样品中的分析物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供具有分析物的样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中固相是根据项目1至9中任一项所述的固相或获自根据项目10所述的方法的固相；
(c)提供缀合物，该缀合物包含与分析物或分析物的类似物偶联的结合对的第二成员；
(d)提供经标记的分析物特异性检测剂，其中步骤(c)的缀合物中包含的分析物或分析物类似物和样品中的分析物能够被检测剂结合；
(e)使步骤(a)的样品与步骤(c)的缀合物和步骤(d)的检测剂接触、混合并对其进行孵育，从而形成包含分析物和检测剂的第一复合物以及包含缀合物和检测剂的第二复合物；
(f)通过使步骤(e)中形成的第二复合物与步骤(b)的固相接触并对其进行孵育，将复合物固定化，其中结合对的第一成员与第二成员结合；
(g)任选地洗涤获自步骤的经固定化的复合物；
(h)确定获自步骤(f)或步骤(g)的经固定化的复合物中包含的标记；
从而确定样品中的分析物。
23.根据项目22所述的方法，其中步骤(e)和(f)依次实施或同时实施。
24.根据项目22和23中任一项所述的方法，其中在步骤(h)之前，将未结合的经标记的分析物特异性检测剂从经固定化的复合物中去除。
25.根据项目22至24中任一项所述的方法，其中提供了(c)和/或(d)各自的预定量。
26.根据项目17至25中任一项所述的方法，其中一个或多个步骤在包含选自由以下项组成的组的化合物的水溶液的存在下实施：盐、缓冲盐、离子性洗涤剂、非离子性洗涤剂、表面活性剂、抗氧化剂和防腐剂。
27.根据项目17至Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.中任一项所述的方法，其中水溶液含有总量为0.1mmol/L至1,000mmol/L之间的溶解物质。
28.根据项目Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.所述的方法，其中水溶液含有总量为1mmol/L至500mmol/L之间的溶解物质。
29.根据项目Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.所述的方法，其中水溶液含有总量为10mmol/L至500mmol/L之间的溶解物质。
30.根据项目17至Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.中任一项所述的方法，其中该方法在0℃至40℃的温度实施。
31.根据项目17至Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.中任一项所述的方法，其中该方法在一个或多个步骤为自动化的情况下实施。
32.根据项目18至Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.中任一项所述的方法，其中确定样品中的分析物得到计算机可读的数据。
33.根据项目Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.所述的方法，其中计算机可读的数据存储在电子注册器上。
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
实例1
糖中间体1，2-O-二乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-L-核糖的合成
本实例示出经由若干中间产物的多步骤合成，如下文所述。图1示出了合成方案。
(i)
1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃葡萄糖
根据Qu等人，Research on Chemical Intermediates 2014，40(4)，1557-1564，合成了1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃葡萄糖。
在搅拌下，向无水L-葡萄糖(50g，0.28mol；从Carbosynth获得)在无水丙酮(500mL)中的悬浮液中加入粉末状无水氯化锌(40g)，然后加入1.5mL的85％磷酸。将这一混合物在室温搅拌30小时，通过过滤收集未反应的糖，并且用小体积的丙酮洗涤。将滤液和洗出液冷却，并使用2.5M氢氧化钠造成微碱性。通过过滤去除不溶解的无机材料并且用丙酮洗涤。将几乎无色的滤液和洗出液减压浓缩，残留物用水稀释，用二氯甲烷萃取，以硫酸镁干燥，并且减压浓缩。将残留物从己烷中结晶，给出1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃葡萄糖，为无色针状(51g，70％)。
Rf(乙酸乙酯/己烷 1∶1)＝0.5。
1H NMR(CDCl3)：δ5.94(d，1H)，4.53(d，1H)，4.39-4.29(m，2H)，4.16(dd，1H)，4.06(dd，1H)，3.98(dd，1H)，2.65(d，1H)，1.49(s，3H)，1.44(s，3H)，1.36(s，3H)，1.31(s，3H)。
(ii)
1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-核-呋喃己-3-酮糖
1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖
根据Hassan等人，Bioorganic Chemistry 2016，65，9-16，合成了1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖。
向配备机械搅拌器和顶部与矿物油喷管联接的冷凝器的2L、3颈烧瓶中，加入1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃葡萄糖(100g，0.38mol)在无乙醇的氯仿(500mL)中的溶液、碳酸钾(16.2g，0.12mol)、高碘酸钾(148.5g，0.65mmol)、苄基三乙基氯化铵(0.9g，3.83mmol)和活化的水合氧化钌(IV)(1.75g)。将混合物在0℃搅拌1h，然后在室温搅拌过夜。将混合物在硅藻土垫上过滤，分离有机相并且用水洗涤。水相用氯仿洗涤，合并的有机相经硫酸镁干燥，蒸发并减压干燥，以给出1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-核-呋喃己-3-酮糖(Rf(乙酸乙酯/己烷 3∶1)＝0.85)。残留物不经进一步纯化而用于下一反应步骤中。
将1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-核-呋喃己-3-酮糖溶解在乙醇/水 7∶3(600mL)中，并且在0℃用硼氢化钠(8.73g)分批处理。混合物变为无色，在0℃搅拌3小时，然后在室温搅拌1小时。将溶剂浓缩至约400mL，并且将另外400mL水加入混合物中。然后，将混合物浓缩至体积为大约400mL并且用二氯甲烷萃取。有机相以硫酸镁干燥并减压蒸发，以给出1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖(60g，61％)，为白色固体。
1H NMR(DMSO-d6)：δ5.66(d，1H)，5.05(d，1H)，4.45(t，1H)，4.23(dt，1H)，3.93(dd，1H)，3.83(m，2H)，3.74(dd，1H)，1.45(s，3H)，1.32(s，3H)，1.28(s，3H)，1.27(s，3H)。
(iii)
3-O-苄基-1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖
3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖
根据Hassan等人，Bioorganic Chemistry 2016，65，9-16，合成了3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖。
在0℃，向1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖(60g，0.235mol)在DMF(150mL)中的溶液中逐滴加入苄基溴(29.2mL，0.245mol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。将水(100mL)加入混合物中，并使产物在冰箱中结晶过夜。过滤出晶体，用水洗涤，减压干燥以给出3-O-苄基-1，2：5，6-二-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖。将残留物溶解在70％乙酸(390mL)中，并且在36℃搅拌7小时。将混合物减压蒸发以得到3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖(62.8g，86％)，为澄清粘稠油状物。
Rf(乙酸乙酯/己烷＝1∶1)＝约0.9。
1H NMR(CDCl3)δ7.39-730(m，5H)，5.76(d，1H)，4.77(d，1H)，4.63-4.54(m，2H)，4.13-4.06(dd，1H)，4.01-3.91(m，2H)，3.68(d，2H)，2.88(br s，1H)，2.71(br s，1H)，1.54(s，3H)，1.33(s，3H)。
(iv)
3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-β-L-核-五二呋喃醛糖
3-O-苄基-4-C-羟甲基-1，2-O-异亚丙基-β-L-核糖
向配备磁力搅拌棒的2L锥形瓶内填充硅胶(80.6g，EM Science，目录号9385-9)和二氯甲烷(800mL)。在5分钟内，逐滴加入高碘酸钠(80mL，52mmol，0.65M)的水溶液，并形成白色沉淀。将3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-β-L-呋喃阿洛糖(10.0g，32.3mmol，0.5M)在二氯甲烷(65mL)中的溶液一次性加入该锥形瓶中。将混合物在室温搅拌1.5小时。然后用水(275mL)稀释反应，并将悬浮液转移到2L分液漏斗中。水层和有机层分离，并且用二氯甲烷萃取水层。合并的有机层以无水硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，以得到无色油状物，将其在高真空下干燥12小时，得到3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-β-L-核-五二呋喃醛糖(5.3g，59％)。
在搅拌下，先后将37％福尔马林(10.6mL)水溶液和1M氢氧化钠水溶液(53mL)在0℃加入粗制3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-β-L-核-五二呋喃醛糖(5.3g，19mmol)在水(50mL)中的溶液中。然后，将反应混合物在室温保持4天并减压浓缩。残留物用二氯甲烷萃取，以硫酸镁干燥并浓缩至干。将残留物通过柱色谱(硅胶；甲苯/乙醚)纯化以给出3-O-苄基-4-C-羟甲基-1，2-O-异亚丙基-β-L-核糖(4.3g；72％)。
Rf(乙酸乙酯)＝0.42。
1H NMR(CDCl3)：δ7.41-7.28(m，5H)，5.76(d，1H)，4.80(d，1H)，4.62(dd，1H)，4.52(d，1H)，4.21(d，1H)，3.90(dd，2H)，3.78(dd，1H)，3.55(dd，1H)，2.37(t，1H)，1.89(dd，1H)，1.63(s，3H)，1.33(s，3H)。
(v)
3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-核糖
将3-O-苄基-4-C-羟甲基-1，2-O-异亚丙基-β-L-核糖(10g，32mmol)在无水吡啶(30mL)中的溶液在冰浴中冷却，并加入甲磺酰氯(7.5mL，96.5mmmol)。将混合物在室温搅拌1小时，用乙醚(200mL)稀释，并用水洗涤。有机层以硫酸钠干燥，减压浓缩，与甲苯(2×100mL)共蒸发，并真空干燥以得到3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-核糖，为白色固体(15.0g，95％)。
Rf(己烷/乙酸乙酯 15∶85)＝约0.5。
1H NMR(CDCl3)：δ7.42-7.29(m，5H)，5.79(d，1H)，4.89(d，1H)，4.78(d，1H)，4.65(dd，1H)，4.58(d，1H)，4.42(d，1H)，4.33(d，1H)，4.19(d，1H)，4.14(d，1H)，3.08(s，3H)，2.98(s，3H)，1.69(s，3H)，1.34(s，3H)。
(vi)
1，2-O-二乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-L-核糖
将乙酸酐(22.6mL，240mmol)和浓硫酸(23μL)加入3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-核糖(15.0g，30.2mmol)在乙酸(230mL)中的溶液中，并将混合物在室温搅拌过夜。再加入浓硫酸(4μL)，并继续反应24小时。之后，加入水(150mL)，将混合物搅拌3小时，并且用二氯甲烷洗涤两次。有机层用饱和碳酸氢钠(4×200mL)洗涤，以硫酸钠干燥，并减压浓缩以给出1，2-O-二乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-L-核糖，为无色油状物(14.5g，97％；两种异头物比率约1∶5)。
1H NMR(CDCl3)：δ7.42-7.24(m，5H)，6.17(s，1H)，5.37(d，1H)，4.62(d，1H)，4.52(d，1H)，4.50(d，1H)，4.42(d，1H)，4.38(d，1H)，4.30(d，1H)，4.19(d，1H)，3.02(s，3H)，3.01(s，3H)，2.14(s，3H)，2.10(s，3H)。
实例2
β-L-LNA-T亚磷酰胺化合物
本实例示出经由若干中间产物的多步骤合成，如下文所述。图2示出了合成方案。基本上类似于Koshkin等人，Journal of Organic Chemistry 2001，66(25)，8504-8512实施合成。
(i)
1-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)胸腺嘧啶
将N，O-双(三甲基硅基)乙酰胺(33.7mL，136mmol)加入1，2-O-二乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-L-核糖(25g，49mmol)和胸腺嘧啶(7.7g，61mmol)在无水乙腈(120mL)中的混合物中。将反应混合物回流1小时，之后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(11.5mL，64mmol)，并且再继续回流5小时。将溶液在室温保持过夜，之后用二氯甲烷(100mL)稀释，并且用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩。然后，将残留物通过硅胶柱色谱(乙酸乙酯)纯化以得到1-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(24.0g，85％)，为白色固体。
1H NMR(CDCl3)：δ9.33(s，1H)，7.40-7.28(m，5H)，7.08(d，1H)，5.71(d，1H)，5.58(dd，1H)，4.70(d，1H)，4.60(d，1H)，4.55(d，1H)，4.53(d，1H)，438(d，1H)，4.34(d，1H)，432(d，1H)，3.02(s，3H)，3.00(s，3H)，2.11(s，3H)，1.92(d，3H)。
MS(ESI)：576.6Da，确认。
(ii)
3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-T
向1-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(22g，38.2mmol)在1，4-二氧六环/水 1∶1(100mL)中的溶液中加入2M氢氧化钠(100mL)。将混合物在室温搅拌1小时，用饱和碳酸氢钠溶液(100mL)稀释，并用二氯甲烷萃取。水相通过10％盐酸酸化，之后用二氯甲烷萃取。有机层以硫酸钠干燥，减压浓缩，并且残留物通过硅胶柱色谱(1-3％甲醇在二氯甲烷中)纯化以得到3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-T(16.1g，96％)，为白色固体。
1H NMR(CDCl3)：δ9.24(s，1H)，741-7.22(m，6H)，5.68(s，1H)，4.66(d，1H)，4.61(s，1H)，4.59(d，1H)，4.56(d，1H)，4.52(d，1H)，4.08(d，1H)，3.93(s，1H)，3.87(d，1H)，3.08(s，3H)，1.93(s，3H)。
MS(ESI)：438.5Da，确认。
(iii)
5′-O-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-T
将苯甲酸钠(9.9g，68.7mmol)加入3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-T(15.0g，34.2mmol)在无水N，N-二甲基甲酰胺(400mL)中的溶液中。将混合物在100℃搅拌5小时，冷却至室温并过滤。减压蒸发N，N-二甲基甲酰胺，将残留物悬浮在乙酸乙酯(150mL)中，用饱和氯化钠溶液洗涤，以硫酸钠干燥，并浓缩至干。从乙醇中结晶，得到5′-O-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-T(14.9g，94％)，为白色固体。
Rf(乙酸乙酯)＝0.78。
1H NMR(CDCl3)：d 8.78(s，1H)，7.94(m，2H)，7.61(m，1H)，7.45(m，2H)，7.30-7.20(m，6H)，5.63(s，1H)，4.83(d，1H)，4.73(d，1H)，4.66(s，1H)，4.56(d，1H)，4.52(d，1H)，4.18(d，1H)，3.97(d，1H)，3.91(s，1H)，1.58(s，3H)。
MS(ESI)：464.5Da，确认。
(iv)
3′-O-苄基-β-L-LNA-T
将水(25mL)和2M氢氧化钠(100mL)加入5′-O-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-T(14g，31.8mmol)在1，4-二氧六环(100mL)中的溶液中。将反应混合物回流24小时，冷却至室温，并且用乙酸(12.5mL)中和。加入饱和碳酸氢钠溶液(100mL)，并将混合物用二氯甲烷洗涤。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩。通过硅胶柱色谱(1-3％甲醇在二氯甲烷中)纯化，得到3′-O-苄基-β-L-LNA-T(10.3g，90％)，为白色固体。
Rf(乙酸乙酯)＝0.51。
1H NMR(CDCl3)：δ9.28(s，1H)，7.45(d，1H)，7.38-7.22(m，5H)，5.66(s，1H)，4.67(d，1H)，4.56(d，1H)，4.54(s，1H)，4.05(d，1H)，4.01(d，1H)，3.96(s，1H)，3.95(d，1H)，3.83(d，1H)，1.88(d，3H)。
MS(ESI)：360.4Da，确认。
(v)
β-L-LNA-T核苷
将3′-O-苄基-β-L-LNA-T(10g，27.5mmol)、20％碳负载氢氧化钯(5g)和甲酸铵(5.3g，84.6mmol)悬浮在甲醇(70mL)中。将混合物回流10分钟后，过滤出晶体并且用甲醇洗涤。合并的滤液浓缩为白色固体。从15％甲醇在二氯甲烷中的溶液中结晶，得到β-L-LNA-T(6.5g，87％)，为白色固体。
Rf(乙酸乙酯)＝0.11。
1H NMR(DMSO-d6)：δ11.32(br s，1H)，7.60(d，1H)，5.68(d，1H)，5.38(s，1H)，5.20(t，1H)，4.09(s，1H)，3.89(d，1H)，3.80(d，1H)，3.74(d，2H)，3.61(d，1H)，1.75(d，3H)。
MS(ESI)：270.2Da，确认。
(vi)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基）-β-L-LNA-T
将β-L-LNA-T核苷(5g，18.5mmol)与无水吡啶(50mL)共蒸发，并且重新溶解在无水吡啶(150mL)中。加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(7.5g，22.1mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(225mg，1.8mmol)。将溶液在室温搅拌过夜。加入甲醇后，将反应混合物减压浓缩。之后将残留物溶解在乙酸乙酯(150mL)中并且用饱和碳酸氢钠溶液萃取。有机层用盐水(150mL)洗涤，经硫酸钠干燥并减压浓缩至干。通过硅胶柱色谱(从40％己烷在乙酸乙酯中开始)纯化，得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-T(9.3g，88％)，为灰白色固体。
Rf(乙酸乙酯)＝0.60。
1H NMR(CDCl3)：δ9.88(s br，1H)，7.64(d，1H)，7.47-7.14(m，9H)，6.85(dd，4H)，5.56(s，1H)，4.53(s，1H)，4.31(m，1H)，4.00-3.75(m，9H)，3.50(m，2H)，1.65(d，3H)。
MS(ESI)：572.6Da，确认。
(vii)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-T，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺
将5′-O-二甲氧基三苯甲基-β-L-LNA-T(8g，14mmol)溶解在无水二氯甲烷(125mL)中。之后加入N，N-二异丙基乙胺(6.1mL，35mmol)和2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(5.29g，22.4mmol)。将溶液在室温搅拌3小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩至干。将残留物通过硅胶柱色谱(40％己烷在乙酸乙酯中)纯化，以得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-T，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(8.8g，81％)，为白色固体。
31P NMR(CDCl3)：δ149.32，149.18。
MS(ESI)：772.8Da，确认。
实例3
β-L-LNA-C亚磷酰胺化合物
本实例示出经由若干中间产物的多步骤合成，如下文所述。图3示出了合成方案。
(i)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基）-β-L-LNA-N4-苯甲酰基-5-甲基-C
将5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-T(13.5g，23.6mmol)溶解在无水乙腈中。在0℃加入三乙胺(9.86mL，70.8mmol)，然后逐滴加入三甲基氯化硅(7.48mL，59mmol)。将反应在0℃搅拌1小时(反应混合物A)。与此同时，将1，2，4-三唑(24.4g，353.3mmol)溶解在无水乙腈(150mL)中，之后在0℃缓慢加入磷酰氯(7，71mL，82.5mmol)。在0℃搅拌15分钟后，加入三乙胺(59.15mL，424.4mmol)。在0℃继续搅拌50分钟，之后加入反应混合物A。将反应混合物在0℃搅拌3小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液/二氯甲烷萃取。有机相以硫酸钠干燥并减压浓缩至干。将残留物通过硅胶柱色谱(20％己烷在乙酸乙酯中到100％乙酸乙酯)纯化以得到C4-1，2，4-三唑核苷中间体(15.2g)，为白色固体(LC-MS：697.4[M+H]+)。之后，将苯甲酰胺(15,67g，129.4mmol)悬浮在二氧六环(100mL)中。向这一悬浮液中加入60％氢化钠(5.17g，129.4mmol)。在室温搅拌15分钟后，加入C4-1，2，4-三唑核苷中间体在二氧六环(150mL)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌2小时，之后用5％柠檬酸/乙酸乙酯萃取。有机层用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。然后，有机相以硫酸钠干燥并浓缩至干，以得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-3′-O-三甲基硅基-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-5-甲基-C核苷Rf(20％己烷在乙酸乙酯中)＝0.87)。将这一中间体溶解在四氢呋喃(250mL)中，并加入1M四丁基氟化铵在四氢呋喃中的溶液(23.7mL，23.7mmol)。在室温搅拌15分钟后，蒸发溶剂。将残留物溶解在二氯甲烷中，并且用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩至干。将残留物通过硅胶柱色谱(40％己烷在乙酸乙酯中)纯化以得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N4-苯甲酰基-5-甲基-C(14g，88％，从5′-O-二甲氧基三苯甲基-β-L-LNA-T)，为灰白色固体。
Rf(20％己烷在乙酸乙酯中)＝0.64。
1H NMR(CDCl3)：δ8.30(d，2H)，7.80(s，1H)，7.56-7.23(m，12H)，6.86(dd，4H)，5.66(s，1H)，4.46(s，1H)，4.29(s，1H)，3.90-3.79(m，8H)，3.60-3-47(dd，2H)，2.03(s，3H)。
MS(ESI)：675.7Da，确认。
(ii)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N4-苯甲酰基-5-甲基-C，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺
将5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N4-苯甲酰基-5-甲基-C(4.6g，6.8mmol)溶解在无水二氯甲烷(70mL)中。之后加入N，N-二异丙基乙胺(2.37mL，13.6mmol)和2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(3.22g，13.6mmol)。将溶液在室温搅拌1小时，然后用5-10％碳酸氢钠溶液洗涤。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩至干。将残留物通过硅胶柱色谱(40％己烷在乙酸乙酯中)纯化，以得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N4-苯甲酰基-5-甲基-C，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(5.0g，84％)，为白色固体。
Rf(乙酸乙酯/己烷 3∶2)＝0.84。
31P NMR(CDCl3)：δ149.46，149.42。
MS(ESI)：875.9Da，确认。
实例4
β-L-LNA-A亚磷酰胺化合物
本实例示出经由若干中间产物的多步骤合成，如下文所述。图4示出了合成方案。基本上类似于Koshkin等人，Journal of Organic Chemistry 2001，66(25)，8504-8512实施合成。
(i)
9-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)-N6-苯甲酰基腺嘌呤
向1，2-O-二乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-L-核糖(25g，49mmol)和N6-苯甲酰基腺嘌呤(14.06g，58.8mmol)在无水1，2-二氯乙烷(200mL)中的悬浮液中加入N，O-双(三甲基硅基)乙酰胺(32mL，128.8mmol)。将混合物回流1小时，之后在室温加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(17.7mL，98mmol)，并且继续回流48小时。之后，将反应混合物倒入冰冷的饱和碳酸氢钠溶液(200mL)中，搅拌0.5小时并过滤。相分离，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，以硫酸钠干燥，并减压浓缩至干。通过硅胶柱色谱(1-2％甲醇在二氯甲烷中)纯化，给出9-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)-N6-苯甲酰基腺嘌呤(27.4g，81％)，为灰白色固体。
1H NMR(CDCl3)：δ8.76(s，1H)，8.12(s，1H)，8.02(m，2H)，7.61(m，1H)，7.51(m，2H)，7.40-7.34(m，5H)，6.23(d，1H)，6.08(dd，1H)，5.12(d，1H)，4.68(d，1H)，4.67(d，1H)，4.64(d，1H)，4.44(d，1H)，4.39(d，1H)，4.36(d，1H)，3.03(s，3H)，2.87(s，3H)，2.13(s，3H)。
MS(ESI)：689.7Da，确认。
(ii)
3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A
将9-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)-N6-苯甲酰基腺嘌呤(25g，36.3mmol)溶解在四氢呋喃(220mL)和水(150mL)的混合物中。加入一水合氢氧化锂(7.7g，183mmol)，并将反应混合物在室温搅拌3.5小时。将溶液用乙酸(84mL)中和以得到沉淀，过滤出沉淀并用水洗涤，以得到3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A(19.6g，98％)，为白色固体。
1H NMR(CDCl3)：δ8.72(s，1H)，8.15(s，1H)，8.02(m，2H)，7.63-7.59(m，1H)，7.54-7.50(m，2H)，732-7.27(m，5H)，6.10(s，1H)，4.95(s，1H)，4.67(d，1H)，4.62(d，1H)，4.60(d，1H)，4.57(d，1H)，4.33(s，1H)，4.21(d，1H)，4.01(d，1H)，3.04(s，3H)。
MS(ESI)：551.6Da，确认。
(iii)
N6，5′-O-二-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-A
将3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A(18g，31.6mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(700mL)中。之后加入苯甲酸钠(8.45g，58.5mmol)，并将混合物在90℃搅拌7小时，冷却至室温，过滤，减压浓缩，并与乙腈共蒸发。将残留物溶解在二氯甲烷(200mL)中，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，以硫酸钠干燥，并减压浓缩至干。从水/乙醇1∶1中结晶，得到N6，5′-O-二-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-A(15.5g，85％)，为白色固体。
1H NMR(DMSO-d6)：δ11.2(br s，1H)，8.72(s，1H)，8.48(s，1H)，8.06(m，2H)，7.94(m，2H)，7.66(m，2H)，7.54(m，4H)，7.36-7.26(m，5H)，6.11(s，1H)，4.97(s，1H)，4.82(s，2H)，4.77(s，1H)，4.75(d，1H)，4.69(d，1H)，4.19(d，1H)，4.07(d，1H)。
MS(ESI)：577.6Da，确认。
(iv)
3′-O-苄基-β-L-LNA-A
将N6，5′-O-二-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-A(15g，25.9mmol)悬浮在甲醇(150mL)和浓氨水(200mL)的混合物中。将溶液在室温搅拌2天。之后加入甲胺(40％，19.4mL)，并将混合物搅拌过夜。过滤出沉淀，真空干燥，并且从乙醇中结晶以得到3′-O-苄基-β-L-LNA-A(8.1g，85％)，为白色固体。
1H NMR(DMSO-d6)：δ8.18(s，1H)，8.14(s，1H)，7.33-7.30(m，5H)，5.97(s，1H)，5.17(t，1H)，4.73(s，1H)，4.63(s，2H)，4.35(s，1H)，3.95(d，1H)，3.84-3.81(m，3H)。
MS(ESI)：369.4Da，确认。
(v)
β-L-LNA-A核苷
向3′-O-苄基-β-L-LNA-A(7.4g，20.0mmol)在乙醇(100mL)中的悬浮液中加入20％碳负载氢氧化钯(2g)和甲酸铵(6.4g，100.8mmol)。将反应混合物回流3小时，并且再加入甲酸铵(2g，31.8mmol)。2小时后，将热溶液通过硅藻土垫过滤，并且用沸腾的乙醇/水(200mL)洗涤硅藻土垫。合并的滤液减压浓缩以得到β-L-LNA-A核苷(5.5g，98％)，为白色晶体。
1H NMR(DMSO-d6)：δ8.22(s，1H)，8.15(s，1H)，7.30(br s，2H)，5.89(s，1H)，5.68(d，1H)，5.05(t，1H)，4.41(s，1H)，4.25(d，1H)，3.92(d，1H)，3.82(m，2H)，3.76(d，2H)。
MS(ESI)：279.3Da，确认。
(vi)
β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A
将β-L-LNA-A核苷(4.8g，17.2mmol)在无水吡啶(50mL)中共蒸发，之后悬浮在无水吡啶(100mL)中。然后加入三甲基氯化硅(11.6mL，91mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时。然后加入苯甲酰氯(2.6mL，22.4mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时。之后将反应混合物冷却至0℃。然后加入水(20mL)和浓氨水(25mL)。移除冰浴，并将反应混合物在室温搅拌1小时，然后减压浓缩并且用二氯甲烷/水萃取。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩至干，以给出β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A(6.2g，95％)，为白色固体。
1H NMR(甲醇-d4)：δ8.73(s，1H)，8.57(s，1H)，8.11(m，2H)，7.69(m，1H)，7.59(m，2H)，6.16(s，1H)，4.67(s，1H)，4.42(s，1H)，4.12(d，1H)，4.01(s，2H)，3.95(d，1H)。
MS(ESI)：383.4Da，确认。
(vii)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基）-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A
将β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A核苷(5g，13.0mmol)与无水吡啶(50mL)共蒸发，并且重新溶解在无水吡啶(150mL)中。加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(5.3g，15.5mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(0.16g，1.3mmol)。将溶液在室温搅拌过夜。加入甲醇后，将反应混合物减压浓缩。之后将残留物溶解在乙酸乙酯(150mL)中并且用饱和碳酸氢钠萃取。有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并减压浓缩至干。通过硅胶柱色谱(从20％己烷在乙酸乙酯中开始到乙酸乙酯)纯化，得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A(6.7g，75％)，为灰白色固体。
1H NMR(DMSO-d6)：δ11.21(s，1H)，8.75(s，1H)，8.47(s，1H)，8.02(d，2H)，7.65-7.18(m，12H)，6.87(dd，4H)，6.12(s，1H)，5.75(d，1H)，4.57(s，1H)，4.42(d，1H)，3.98(dd，1H)，3.93(dd，1H)，3.70(s，6H)，3.54(dd，1H)，3.31(dd，1H)。
MS(ESI)：685.7Da，确认。
(Viii)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺
将5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A(6.5g，9.4mmol)溶解在无水二氯甲烷(100mL)中。之后加入N，N-二异丙基乙胺(4.1mL，23.7mmol)和2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(3.57g，15.1mmol)。将溶液在室温搅拌3小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩至干。将残留物通过硅胶柱色谱(20％己烷在乙酸乙酯中)纯化，以得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N6-苯甲酰基-A，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(7.0g，84％)。
31P NMR(CDCl3)：δ149.58，149.43。
MS(ESI)：885.9Da，确认。
实例5
β-L-LNA-G亚磷酰胺化合物
本实例示出经由若干中间产物的多步骤合成，如下文所述。图5示出了合成方案。基本上类似于Koshkin等人，Journal of Organic Chemistry 2001，66(25)，8504-8512实施合成
(i)
9-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)-N2-异丁酰基鸟嘌呤
向1，2-O-二乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-L-核糖(25g，49mmol)和N2-异丁酰基鸟嘌呤(12.36g，55.9mmol)在无水1，2-二氯乙烷(200mL)中的悬浮液中加入N，O-双(三甲基硅基)乙酰胺(40.5mL，164.9mmol)。将混合物回流1小时，之后在室温加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(18.2mL，100.4mmol)，并继续回流3.5小时。之后将反应在室温搅拌过夜。然后将反应混合物用二氯甲烷(200mL)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，以硫酸钠干燥，并减压浓缩。将残留物通过硅胶柱色谱(1-2％甲醇在二氯甲烷中)纯化，给出9-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)-N2-异丁酰基鸟嘌呤(27.5g，83％)，为白色固体。
1H NMR(CDCl3)：δ12.20(br s，1H)，9.34(br s，1H)，7.76(s，1H)，7.40-7.30(m，5H)，6.03(d，1H)，5.76(dd，1H)，5.08(d，1H)，4.91(d，1H)，4.67(d，1H)，4.61(d，2H)，4.49(d，1H)，4.39(d，1H)，4.32(d，1H)，3.14(s，3H)，3.02(s，3H)，2.70(m，1H)，2.09(s，3H)1.24(m，6H)。
MS(ESI)：671.7Da，确认。
(ii)
3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G
将9-(2-O-乙酰基-3-O-苄基-5-O-甲磺酰基-4-C-(甲磺酰氧基甲基)-β-L-呋喃核糖基)-N2-异丁酰基鸟嘌呤(25g，37.2mmol)溶解在四氢呋喃(250mL)中。然后，加入1M氢氧化钠(250mL，250mmol)，并将反应混合物在0℃搅拌1小时。之后，将溶液用乙酸(15mL)中和并减压浓缩。用水稀释浓缩的反应混合物，并且用二氯甲烷进行萃取。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩至干，以得到3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(14.7g，74％)，为白色固体，其不经纯化而用于下一反应步骤中。
Rf(5％甲醇在二氯甲烷中)＝0.57
1H NMR(CDCl3)：δ12.14(br s，1H)，9.51(br s，1H)，7.77(s，1H)，7.30-7.26(m，5H)，5.84(s，1H)，4.67(d，1H)，4.63(d，1H)，4.62(s，1H)，4.62(d，1H)，4.56(d，1H)，4.50(s，1H)，4.12(d，1H)，3.93(d，1H)，3.06(s，3H)，2.78(m，1H)，1.26(m，6H)。
MS(ESI)：533.6Da，确认。
(iii)
5′-o-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G
3′-o-苄基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G
将3′-O-苄基-5′-O-甲磺酰基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(12.5g，23.4mmol)溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(250mL)中。之后加入苯甲酸钠(6.8g，47mmol)，并将混合物在90℃搅拌过夜，然后冷却至室温，过滤并减压浓缩。将残留物溶解在乙酸乙酯(200mL)中，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，以硫酸钠干燥，并减压浓缩至干以得到5′-O-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(MS(ESI)：计算值为559.6，实测值为560.1)。产物不经进一步纯化而用于下一反应步骤中。将5′-O-苯甲酰基-3′-O-苄基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G溶解在乙醇/吡啶 8∶1(350mL)中。向这一溶液中加入2M氢氧化钠(13.5mL)中，并将混合物在室温搅拌30分钟。之后加入乙酸(21.5mL)，并将反应混合物减压浓缩。将残留物从水/乙醇 1∶1中结晶以得到3′-O-苄基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(8.2g，77％)，为白色固体。
Rf(10％甲醇在乙酸乙酯中)＝0.75
1H NMR(DMSO-d6)：δ8.05(s，1H)，7.33-7.26(m，5H)，5.85(s，1H)，5.17(t，1H)，4.69(s，1H)，4.64(s，2H)，4.23(s，1H)，3.95(d，1H)，3.83(m，2H)，3.80(d，1H)，2.78(m，1H)，1.12(m，6H)。
MS(ESI)：455.5Da，确认。
(vi)
β-L-LNA-N2-异丁酰基-G
将3′-O-苄基-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(8.2g，18.0mmol)溶解在甲醇(75mL)中。加入20％碳负载氢氧化钯(3g)和甲酸(4.2mL，111.3mmol)。将反应混合物回流5小时，冷却至室温，并且通过硅藻土垫过滤。将滤液减压浓缩以给出β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(6.2g，94％)，为白色固体。
Rf(10％甲醇在乙酸乙酯中)＝约0.3。
1H NMR(DMSO-d6)：δ7.80(s，1H)，5.51(s，1H)，5.44(br s，1H)，4.77(br s，1H)，4.12(s，1H)，3.88(s，1H)，3.65(d，1H)，3.53(m，2H)，3.47(d，1H)，2.50(m，1H)，0.84(m，6H)。
MS(ESI)：365.3Da，确认。
(v)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基）-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G
将β-L-LNA-N2-异丁酰基-G核苷(5g，13.7mmol)与无水吡啶(50mL)共蒸发，并且重新溶解在无水吡啶(150mL)中。加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(6.0g，17.8mmol)和4-(二甲氨基)吡啶(0.17g，1.4mmol)。将溶液在室温搅拌过夜。加入甲醇后，将反应混合物减压浓缩。之后，将残留物溶解在乙酸乙酯(150mL)中，用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，以硫酸钠干燥，并减压浓缩至干。通过硅胶柱色谱(从20％己烷在乙酸乙酯中开始到乙酸乙酯)纯化，得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(8.0g，87％)，为灰白色固体。
Rf(乙酸乙酯)＝0.39。
1H NMR(DMSO-d6)：δ12.09(s，1H)，11.78(s，1H)，8.00(s，1H)，7.39(d，2H)，7.30-7.24(m，7H)，6.88(dd，4H)，5.86(s，1H)，5.73(d，1H)，4.42(s，1H)，4.26(d，1H)，3.92(dd，1H)，3.88(dd，1H)，3.72(s，6H)，3.53(d，1H)，3.30(d，1H)，2.76(m，1H)，1.10(d，6H)。
MS(ESI)：667.7Da，确认。
(vi)
5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺
将5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G(7.5g，11.2mmol)溶解在无水二氯甲烷(100mL)中。之后加入N，N-二异丙基乙胺(4.8mL，28.0mmol)和2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(4.24g，17.9mmol)。将溶液在室温搅拌3小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机层以硫酸钠干燥并减压浓缩至干。将残留物通过硅胶柱色谱(40％己烷在乙酸乙酯中)纯化，以得到5′-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-β-L-LNA-N2-异丁酰基-G，3′-[(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺(6.8g，70％)。
Rf(乙酸乙酯)＝0.66、0.75。
31P NMR(乙腈-d3)：δ148.51，148.12。
MS(ESI)：867.9Da，确认。
实例6
5′-生物素化的β-L-LNA寡核苷酸的合成：
使用标准的自动固相DNA合成程序并应用亚磷酰胺化学方法，在ABI 394 DNA合成仪上以2x1μmol规模合成5′-生物素化的β-L-LNA寡核苷酸。使用Glen UnySupport PS(GlenResearch目录号26-5040)和β-L-LNA亚磷酰胺(来自实例2至5)以及间隔基亚磷酰胺18(Glen Research目录号10-1918)和5′-生物素亚磷酰胺(Glen Research目录号10-5950)作为结构单元。在DNA级乙腈中，所有亚磷酰胺以0.1M的浓度应用。使用了具有延长的偶联时间(180秒)、延长的氧化时间(45秒)和去三苯甲基化时间(85秒)的标准DNA循环以及标准合成试剂和溶剂。5′-生物素化的寡核苷酸被合成为DMToff。应用标准裂解程序通过浓氨水从支持物上裂解LNA寡核苷酸，残留的保护基团也通过以浓氨水处理(在56℃，8小时)而裂解。将粗制5′-生物素化的β-L-LNA寡核苷酸蒸发并通过RP HPLC纯化(柱：PRP-1，7μm，250x21.5mm(Hamilton，产品编号79352))，使用0，1M三乙基乙酸铵pH 7/乙腈梯度。合并产物级分，并通过用水透析(MWCO 1000，SpectraPor 6，产品编号132638)而脱盐。最后，将LNA寡核苷酸定量并冻干。
产量为约800nmol至900nmol。
通过RP18 HPLC(Chromolith RP18e，Merck，产品编号1.02129.0001)使用0，1M pH7的三乙基乙酸铵/乙腈梯度对5′-生物素化的β-L-LNA寡核苷酸进行分析。典型的纯度≥90％。通过LC-MS分析确认5′-生物素化的β-L-LNA寡核苷酸的身份。
实例7
5′-马来酰亚胺修饰的β-L-LNA寡核蒂酸的合成：
使用标准的自动固相DNA合成程序并应用亚磷酰胺化学方法，在
Figure BDA0003066285850000611
Oligopilotplus 10 DNA合成仪(GE Healthcare)上以20μmol规模合成5′-马来酰亚胺修饰的β-L-LNA寡核苷酸。使用Glen UnySupport PS(Glen Research目录号26-5040)和β-L-LNA亚磷酰胺(来自实例2至5)以及间隔基亚磷酰胺18(Glen Research目录号10-1918)和5′-氨基修饰的C6亚磷酰胺(Glen Research目录号10-1906)作为结构单元。在DNA级乙腈中，所有亚磷酰胺的浓度为0.15M。使用了具有延长的偶联时间(240秒)和延长的氧化时间(45秒)的标准DNA循环以及标准合成试剂和溶剂用于5′-马来酰亚胺修饰的β-L-LNA寡核苷酸的组装，该寡核苷酸被合成为MMTon。应用标准裂解程序通过浓氨水从支持物上裂解LNA寡核苷酸，残留的保护基团也通过以浓氨水处理(在56℃，8小时)而裂解。将粗制5′-修饰的β-L-LNA寡核苷酸蒸发并通过RP HPLC纯化(柱：PRP-1，12-20μm，250x30mm(Hamilton，产品编号79352))，使用0,1M三乙基乙酸铵pH 7/乙腈梯度。合并产物级分并通过用水透析(MWCO 1000，SpectraPor6，产品编号132638)而脱盐，从而也裂解了MMTon纯化的寡核苷酸的MMT基团。最后，将5′-氨基修饰的LNA寡核苷酸定量并冻干(典型产量：约3.5μmol)。为了合成5′-马来酰亚胺修饰的β-L-LNA寡核苷酸，将5′-氨基修饰的β-L-LNA寡核苷酸溶解在0.1M硼酸钠缓冲液pH 7.5(2.5mL)中。加入乙腈(0.5mL)和6-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(15mg；Sigma，目录号M9794)之后，将反应混合物在室温振荡0.5小时，以80％乙酸终止反应，并使用Amicon超离心过滤装置(MWCO 3000，Merck，目录号UFC9003)脱盐。将截留物定量并冻干，以得到5′-马来酰亚胺修饰的β-L-LNA寡核苷酸。
典型产量：约2μmol。
通过RP18 HPLC(Chromolith RP18e，Merck，产品编号1.02129.0001)使用0,1M pH7的三乙基乙酸铵/乙腈梯度对5′-马来酰亚胺修饰的β-L-LNA寡核苷酸进行分析。典型纯度为≥90％。通过LC-MS分析确认LNA寡核苷酸的身份。
实例8：
未修饰的β-L-LNA寡核苷酸的合成：
使用标准的自动固相DNA合成程序并应用亚磷酰胺化学方法，在ABI 394 DNA合成仪上以1μmol规模合成未修饰的β-L-LNA寡核苷酸。使用Glen UnySupport PS(GlenResearch目录号26-5040)和β-L-LNA亚磷酰胺(来自实例2至5)作为结构单元。在DNA级乙腈中，所有亚磷酰胺的浓度为0，1M。具有延长的偶联时间(180秒)、延长的氧化时间(45秒)和去三苯甲基化时间(85秒)的标准DNA循环以及标准合成试剂和溶剂用于组装LNA寡核苷酸，该寡核苷酸被合成为5′-DMTon寡核苷酸。然后，应用标准裂解程序通过浓氨水从支持物上裂解LNA寡核苷酸。残留的保护基团通过用浓氨水处理(在56℃，8小时)而裂解。将粗制LNA寡核苷酸蒸发并通过RP HPLC纯化(柱：PRP-1，7μm，250x21.5mm(Hamilton，产品编号79352))，使用0,1M三乙基乙酸铵pH 7/乙腈梯度。在少数情况下，难以纯化的LNA寡核苷酸通过阴离子交换HPLC色谱在变性条件下另外纯化(柱：Source 15Q，GE Healthcare)。合并产物级分并通过用水透析(MWCO 1000，SpectraPor 6，产品编号132638)而脱盐，从而也裂解了DMTon纯化的寡核苷酸的DMT基团。最后，将LNA寡核苷酸定量并冻干。
产量为约100nmol至400nmol。
通过RP18 HPLC(Chromolith RP18e，Merck，产品编号1.02129.0001)使用0,1M pH7的三乙基乙酸铵/乙腈梯度对LNA寡核苷酸进行分析。典型纯度为≥90％。通过LC-MS分析确认LNA寡核苷酸的身份。
实例9
L-LNA寡核苷酸与TSH特异性F(ab′)2片段(促甲状腺素特异性捕获剂)的偶联
F(ab′)2片段与LNA在两步骤反应中缀合。首先，经由与SATP(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯)缀合并通过羟胺进行去乙酰化而将巯基基团引入F(ab′)2片段中(参见Greg T.Hermanson Bioconjugate Techniques，第3版2013)。然后经由马来酰亚胺化学作用将Seq ID NO：9的L-LNA-寡核苷酸缀合至游离的巯基。L-LNA标记的F(ab′)2片段经由Superdex 200体积排阻和单Q阴离子交换色谱纯化以获得高纯度的经缀合的F(ab′)2片段，其中每个缀合物包含单个L-LNA寡聚物。
实例10
互补性L-LNA寡核苷酸在罗氏(Roche)
Figure BDA0003066285850000631
分析性电化学发光免疫测定中用作结合对来确定人血清和血浆中的TSH(促甲状腺素)
ECL(电化学发光)是用于免疫测定检测的罗氏技术。基于这一技术并且与特异性和敏感的TSH免疫测定组合，Elecsys得到了可再现的结果。ECL免疫测定的发展基于钌络合物和三丙胺(TPA)的使用。用于检测反应复合物的化学发光反应是通过向样品溶液施加电压而引发的，导致精确控制的反应。ECL技术可以适应很多免疫测定原理和格式，同时提供优越的性能。
对商业上可获得的
Figure BDA0003066285850000632
TSH试剂盒(编号11731459，罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany))进行的修改。该试剂盒含有三个瓶，一个瓶含有经链霉亲和素涂覆的珠的悬浮液，一个瓶含有第一试剂(R1)，并且一个瓶含有第二试剂(R2)。向含有经链霉亲和素涂覆的珠的瓶中加入两种不同浓度的用生物素-(HEG)4-部分(HEG＝六乙二醇)进行5’标记的Seq ID NO：10的L-LNA寡核苷酸，浓度分别为每毫克珠0.2nmol或0.5nmol L-LNA寡核苷酸。
R1瓶含有与商业上可获得的试剂盒相同的组分，但将生物素-抗TSH抗体缀合物替换为上文实例9所述的L-LNA抗TSH缀合物(浓度2.5μg/ml)。R2瓶中的成分与商业上可获得的试剂盒相同。
使用上文提及的测定试剂来测量样品(校准品和对照品)，与商业上可获得的测定比较。在
Figure BDA0003066285850000633
e411分析仪上实施测量。结果在图6A和图6B中示出。
Figure BDA0003066285850000634
TSH测试特征，商业上可获得的版本，未做修改
Figure BDA0003066285850000635
Figure BDA0003066285850000641
图6A示出使用商业上可获得的测定
Figure BDA0003066285850000642
TSH试剂盒(在图6A中标为“TSH”)与在珠试剂瓶中含有0.2nmol/mg珠(在图6A中标为“0.2L-LNA”)或0.5nmol/mg珠生物素-L-LNA寡核苷酸(在图6A中标为“0.5L-LNA”)的经修改试剂盒测量的信号(计数)的比较。所测量的样品是校准品1(“Cal1”)和第1级对照品(“PCU1”)。试剂1(R1)和试剂2(R2)瓶内容物如上所述。
图6B示出使用商业上可获得的测定
Figure BDA0003066285850000643
TSH试剂盒(在图6B中标为“TSH”)与在珠试剂瓶中含有0.2nmol/mg珠(在图6B中标为“0.2L-LNA”)或0.5nmol/mg珠生物素-L-LNA寡核苷酸(在图6B中标为“0.5L-LNA”)的经修改试剂盒测量的信号(计数)的比较。所测量的样品是校准品2(“Cal2”)和第2级对照品(“PCU2”)。试剂1(R1)和试剂2(R2)瓶内容物如上所述。
罗氏产品Id号为
Figure BDA0003066285850000644
TSH 200测试11731459；TSH CalSet 4x1.3mL04738551；PreciControl Universal(PCU)2x3mL各自11731416；PreciControl TSH 4x2mL11776479；Diluent MultiAssay 2x16mL 03609987。
实例11
L-LNA寡核苷酸与TSH特异性F(ab′)2片段(促甲状腺素特异性捕获剂)的偶联
F(ab′)2片段与LNA在两步骤反应中缀合。首先，经由与SATP(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯)缀合并通过羟胺进行去乙酰化而将巯基基团引入F(ab′)2片段中(参见Greg T.Hermanson Bioconjugate Techniques，第3版2013)。然后经由马来酰亚胺化学作用将Seq ID NO：9的L-LNA-寡核苷酸缀合至游离的巯基。L-LNA标记的F(ab′)2片段经由Superdex 200体积排阻和单Q阴离子交换色谱纯化以获得高纯度的经缀合的F(ab′)2片段，其中每个缀合物包含单个L-LNA寡聚物。
实例12
互补性L-LNA寡核苷酸在罗氏(Roche)
Figure BDA00030662858500006511
分析性电化学发光免疫测定中用作结合对来确定人血清和血浆中的TSH(促甲状腺素)
Figure BDA0003066285850000653
Troponin T免疫测定法是用于对肝素、EDTA血浆和血清中心肌肌钙蛋白T进行体外定量确定的免疫测定法。该免疫测定法旨在辅助进行心肌梗死的诊断。电化学发光免疫测定法“ECLIA”倾向于在
Figure BDA0003066285850000654
系统分析仪上使用。
Figure BDA0003066285850000655
对商业上可获得的
Figure BDA00030662858500006510
TNThs试剂盒(编号05092744190，罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany))进行的修改。该试剂盒含有三个瓶，一个瓶含有经链霉亲和素涂覆的珠的悬浮液，一个瓶含有第一试剂(R1)，并且一个瓶含有第二试剂(R2)。向含有经链霉亲和素涂覆的珠的瓶中加入两种不同浓度的用生物素-(HEG)4-部分(HEG＝六乙二醇)进行5’标记的Seq ID NO：10的L-LNA寡核苷酸，浓度分别为每毫克珠0.2nmol或0.5nmol L-LNA寡核苷酸。
R1瓶含有与商业上可获得的试剂盒相同的组分，但将生物素-抗TNT抗体缀合物替换为上文实例11所述的L-LNA抗TSH缀合物(浓度2.5μg/ml)。R2瓶中的成分与商业上可获得的试剂盒相同。
使用上文提及的测定试剂来测量样品(校准品和对照品)，与商业上可获得的测定比较。在
Figure BDA00030662858500006512
e411分析仪上实施测量。结果在图7A和图7B中示出。
图7A示出使用商业上可获得的测定
Figure BDA0003066285850000668
TNThs试剂盒(在图7A中标为“TNT”)与在珠试剂瓶中含有0.2nmol/mg珠(在图7A中标为“0.2L-LNA”)或0.5nmol/mg珠生物素-L-LNA寡核苷酸(在图7A中标为“0.5L-LNA”)的经修改试剂盒测量的信号(计数)的比较。所测量的样品是校准品1(“Cal2”)和不含分析物的稀释介质(“DilMa”)。试剂1(R1)和试剂2水2)瓶内容物如上所述。
图7B示出使用商业上可获得的测定
Figure BDA0003066285850000669
TSHhs试剂盒(在图7B中标为“TNT”)与在珠试剂瓶中含有0.2nmol/mg珠(在图7B中标为“0.2L-LNA”)或0.5nmol/mg珠生物素-L-LNA寡核苷酸(在图7B中标为“0.5L-LNA”)的经修改试剂盒测量的信号(计数)的比较。所测量的样品是校准品2(“Cal2”)。试剂1(R1)和试剂2(R2)瓶内容物如上所述。
罗氏产品Id号为Elecsys Troponin T高敏感200测试05 092 744 190；ElecsysTTroponin T高敏感(STAT)100测试05 092 728 190；CalSet Troponin T高敏感ElecsysT10校准05 092 752 190；CalSet Troponin T高敏感(STAT)ElecsysT 10校准05 092 736190；Diluent Universal ElecsysT 2×16mL/2×36mL 11 732 277 122/03 183 971 122。
实例13
L-LNA寡核苷酸结合对的形成不受游离生物素干扰的影响
将Troponin T hs
Figure BDA0003066285850000665
测定(Id.05092744190)中的原始
Figure BDA0003066285850000666
珠替换为涂覆有经生物素化的LNA寡核苷酸的Elecsys珠(0,308nMol L-LNA/ml珠)。另外，将R1瓶中的经生物素化的特异性剂Mab<TN-T>-Fab-Bi替换为含有互补L-LNA-寡聚物的Fab缀合物，其位于通过马来酰亚胺化学作用缀合的位置Q195处的经工程化改造的半胱氨酸处。使用LNA杂交将Troponin T免疫复合物固定化在经链霉亲和素涂覆的珠上的这一新TroponinT hs
Figure BDA0003066285850000667
测定变型以及常规商用Troponin T hs Elecsys测定(Id.05092744190)在cobas E170装置上平行运行，使用来自Troponin T hs CalSet(Id.05092752190)的Cal2样品在不使用D-生物素或以100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml和2000ng/ml的浓度补充D-生物素的条件下运行。参见图8，暗条表示未修改的商用测定的结果，亮条代表使用L-LNA寡核苷酸的互补对的测量。与原始测定相比，在使用LNA杂交将Troponin T免疫复合物固定化在经链霉亲和素涂覆的
Figure BDA0003066285850000671
珠上的新测定变型中没有观察到明显的信号损失。
可以使用例如以下的不同结合对获得可比的结果：
5’tgctcctg 3’(Seq ID NO：5) ：5’caggagca 3’(Seq ID NO：6)、
5’gcctgacg 3’(Seq ID NO：7) ：5’cgtcaggc 3’(Seq ID NO：8)、
5’tgctcctgt 3’(Seq ID NO：9) ：5’acaggagca 3’(Seq ID NO：10)、
5’gtgcgtct 3’(Seq ID NO：11) ：5’agacgcac3’(Seq ID NO：12)、
5’gttggtgt 3’(Seq ID NO：13) ：5’acaccaac 3’(Seq ID NO：14)
5’gttggtgtgttggtg 3’(Seq ID NO：15) ：5’caccaacacaccaac 3’(Seq ID NO：16)
5’gttggtgtg 3’(Seq ID NO：17) ：5’cacaccaac 3’(Seq ID NO：18)
5’ggaagagaa 3’(Seq ID NO：19) ：5’ttctcttcc 3’(Seq ID NO：20)。
Figure IDA0003066285920000011
Figure IDA0003066285920000021
Figure IDA0003066285920000031
Figure IDA0003066285920000041

Claims (25)

1.一种固相，其涂覆有(链霉)亲和素并且具有以<生物素：(链霉)亲和素>相互作用的方式与其连接的结合对的经生物素化的第一成员，其中所连接的第一成员能够与所述结合对的第二成员结合但不能与生物素或与(链霉)亲和素结合，其中当所述第二成员是包含分析物、分析物类似物和分析物特异性捕获剂中任意项的缀合物的部分时，所述第二成员能够变为被所述第一成员结合，并且其中所述结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交。
2.根据权利要求1所述的固相，其可以通过根据权利要求10所述的方法获得。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的固相，其中所述结合对选自由以下项组成的组：
第一寡核苷酸镜像体和第二寡核苷酸镜像体，其各自由含有L-核糖的核苷单体或含有L-2′-脱氧核糖的核苷单体组成，所述第一寡核苷酸镜像体能够与所述第二寡核苷酸镜像体杂交；
由β-L-LNA核苷单体组成的第一寡聚物和第二寡聚物，所述第一寡聚物能够与所述第二寡聚物杂交；
抗原和抗原特异性抗体；
半抗原和半抗原特异性抗体；
配体和特异性配体结合结构域；
寡糖或多糖和凝集素，所述凝集素能够与所述寡糖或多糖特异性结合；
组氨酸标签和包含选自Zn2+、Ni2+、Co2+和Cu2+的金属离子的金属螯合复合物，所述金属螯合复合物能够与所述组氨酸标签结合；
铟螯合复合物和CHA255抗体；
葫芦[n]脲主体残基和能够与所述主体残基结合的客体残基；和
第一蛋白质二聚化结构域和第二蛋白质二聚化结构域，任选地在二聚化诱导剂或增强剂的存在下。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的固相，其中所述固相选自由以下项组成的组：微粒、微孔板、试管、比色皿、膜、石英晶体、片、滤纸、盘和芯片。
5.根据权利要求4所述的固相，其中所述固相是直径为0.05μm至200μm的微粒。
6.根据权利要求5所述的固相，其中所述微粒是单分散的顺磁珠。
7.根据权利要求6所述的固相，其中所述珠的所述直径为约3μm。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的固相，其中所述固相与水性液相接触。
9.根据权利要求8所述的固相，其中所述液相中包含缀合物，所述缀合物包含所述结合对的第二成员。
10.一种制备具有与其连接的结合对的成员的固相的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供涂覆有(链霉)亲和素的固相；
(b)选择具有第一成员和第二成员的结合对；
(c)提供在步骤(b)中选择的所述结合对的所述第一成员；
(d)将步骤(c)的所述第一成员生物素化；
(e)通过使获自步骤(d)的所述经生物素化的第一成员与步骤(a)的经涂覆的固相接触并对其进行孵育，将所述经生物素化的第一成员与所述固相连接，从而将所述经生物素化的第一成员以生物素-(链霉)亲和素相互作用的方式与所述固相连接；
其中在步骤(b)中，选择所述对，使得
在不经生物素化的情况下，所述结合对的所述第一成员和所述第二成员不能与链霉亲和素结合，
以经生物素化的形式并且通过生物素：(链霉)亲和素键的方式与所述经涂覆的固相非共价连接，所述结合对的所述第一成员能够与所述第二成员结合，
以经缀合的形式并且与分析物特异性捕获剂共价连接，所述结合对的所述第二成员能够与连接到所述固相的所述经生物素化的第一成员结合，并且
所述结合对的成员无一能够与天然存在的单链核酸杂交；
从而获得所述具有与其连接的所述结合对的所述成员的固相。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的固相或获自根据权利要求10所述的方法的固相在确定样品中的分析物的测定法中的用途。
12.一种用于确定样品中的分析物的试剂盒，所述试剂盒包含处于第一容器中的(a)以及处于第二容器中的(b)或(c)任一者，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中所述固相是根据权利要求1至9中任一项所述的固相或获自根据权利要求10所述的方法的固相，
(b)是第一缀合物，所述缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的所述结合对的第二成员，
(c)是第二缀合物，所述缀合物包含与所述分析物或所述分析物的类似物偶联的所述结合对的第二成员。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒包含(a)和(b)，所述试剂盒进一步包含经标记的分析物特异性检测剂，其中所述检测剂和(b)处于不同的容器中，并且其中(b)的所述分析物特异性捕获剂和所述经标记的分析物特异性检测剂能够与所述分析物形成夹心复合物。
14.根据权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒包含(a)和(c)，所述试剂盒进一步包含经标记的分析物特异性检测剂，其中所述检测剂和(c)处于不同的容器中，并且其中所述缀合物中包含的所述分析物或分析物类似物和所述样品中的分析物能够被所述检测剂结合。
15.一种复合物，其包含(a)以及(b)或(c)任一者，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中所述固相是根据权利要求1至9中任一项所述的固相或获自根据权利要求10所述的方法的固相，
(b)是第一缀合物，所述缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的所述结合对的第二成员，
(c)是第二缀合物，所述缀合物包含与所述分析物或所述分析物的类似物偶联的所述结合对的第二成员，
其中在所述复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，并且其中在所述复合物中，所述结合对的第一成员与所述结合对的第二成员结合。
16.一种根据权利要求15所述的复合物，其可以通过根据权利要求17所述的方法获得。
17.一种形成复合物的方法，所述方法包括使(a)与(b)或(c)任一者接触的步骤，其中
(a)是具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中所述固相是根据权利要求1至9中任一项所述的固相或获自根据权利要求10所述的方法的固相，
(b)是第一缀合物，所述缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的所述结合对的第二成员，
(c)是第二缀合物，所述缀合物包含与所述分析物或所述分析物的类似物偶联的所述结合对的第二成员，
之后为分别孵育(a)以及(b)或(c)任一者的步骤，从而形成所述复合物，
其中在所述复合物中，(a)分别与(b)或(c)结合，并且其中所述结合对的第一成员与所述结合对的第二成员结合。
18.一种确定样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供具有所述分析物的所述样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中所述固相是根据权利要求1至9中任一项所述的固相或获自根据权利要求10所述的方法的固相；
(c)提供缀合物，所述缀合物包含与分析物特异性捕获剂偶联的所述结合对的第二成员；
(d)使(a)的所述样品与(c)的缀合物接触、混合并对其进行孵育，从而形成复合物，所述复合物包含被所述缀合物中包含的所述分析物特异性捕获剂捕获的所述分析物；
(e)通过使步骤(d)中形成的复合物与步骤(b)的所述固相接触并对其进行孵育，将所述复合物固定化，其中所述结合对的所述第一成员与所述第二成员结合；
(f)任选地洗涤获自步骤(e)的经固定化的复合物；
(g)确定经固定化的复合物中包含的分析物；
从而确定所述样品中的所述分析物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤(d)和(e)依次实施或同时实施。
20.根据权利要求18和19中任一项所述的方法，其中
步骤(c)另外包括提供经标记的分析物特异性检测剂，
所述分析物能够同时被所述缀合物中包含的所述捕获剂结合并且被所述检测剂结合，从而能够形成夹心复合物；
步骤(d)包括使(a)的所述样品与(c)的所述缀合物和另外地经标记的分析物特异性检测剂接触、混合并对其进行孵育，从而形成复合物，所述复合物包含夹在所述捕获剂和所述检测剂之间的分析物，并且
步骤(g)通过确定经固定化的复合物中包含的标记而得以实施。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在步骤(g)之前，将未结合的经标记的分析物特异性检测剂从经固定化的复合物中去除。
22.一种确定样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供具有所述分析物的所述样品；
(b)提供具有与其连接的结合对的第一成员的固相，其中所述固相是根据权利要求1至9中任一项所述的固相或获自根据权利要求10所述的方法的固相；
(c)提供缀合物，所述缀合物包含与所述分析物或所述分析物的类似物偶联的所述结合对的第二成员；
(d)提供经标记的分析物特异性检测剂，其中步骤(c)的所述缀合物中包含的所述分析物或分析物类似物和所述样品中的所述分析物能够被所述检测剂结合；
(e)使步骤(a)的所述样品与步骤(c)的缀合物和步骤(d)的检测剂接触、混合并对其进行孵育，从而形成包含所述分析物和所述检测剂的第一复合物以及包含所述缀合物和所述检测剂的第二复合物；
(f)通过使步骤(e)中形成的第二复合物与步骤(b)的所述固相接触并对其进行孵育，将所述复合物固定化，其中所述结合对的所述第一成员与所述第二成员结合；
(g)任选地洗涤获自步骤的经固定化的复合物；
(h)确定获自步骤(f)或步骤(g)的所述经固定化的复合物中包含的标记；
从而确定所述样品中的所述分析物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中步骤(e)和(f)依次实施或同时实施。
24.根据权利要求22和23中任一项所述的方法，其中在步骤(h)之前，将未结合的经标记的分析物特异性检测剂从经固定化的复合物中去除。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中提供预定量的(c)和/或(d)中的每一者。
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