CN102652259B - 基于磁性传感器的定量结合动力学分析 - Google Patents

Abstract

提供了定量地测定分子结合相互作用的结合动力学参数的方法。本方法的实施方案的方面包括：制备磁性传感器装置，所述磁性传感器装置包含与分析混合物接触的磁性传感器，所述分析混合物包含磁性标记的分子以产生可检测的分子结合相互作用；从所述磁性传感器中获取实时信号；以及由所述实时信号定量确定分子结合相互作用的结合动力学参数。还提供了被配置为用于所述方法的系统和试剂盒。

Description

基于磁性传感器的定量结合动力学分析

相关申请的引用

根据美国法典第35篇第119条(e)款，本申请要求2010年3月12日提交的美国临时专利申请第61/313,604号的优先权，其公开内容全文特此以引用方式并入本文。

政府支持申明

本发明由美国政府支持通过国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)的基金第1U54CA119367号以及国家科学基金会(NationalScienceFoundation)的基金第ECCS-0801385-000号完成。所述政府在本发明中享有特定权益。

介绍

生物过程决定于第一和第二分子的分子对之间的分子相互作用。这些分子相互作用的实例包括核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受体-配体相互作用，例如，抗体-抗原相互作用和受体-激动剂或拮抗剂相互作用。

对DNA杂交、抗原-抗体结合以及DNA-蛋白质相互作用的基于亲和性的感应均已表明在基础科研、临床诊断、生物分子工程和药物设计中发挥重要作用。随着该领域进展状况，对用于测定分子身份和反应细节的精确、敏感、高通量和迅速的方法的需求在分析方法的演化中造成持续的压力。为满足这些迫切需要，研究者已经转向于分子标记物以期改善对稀少分子检测的敏感度。然而，这些标记物可能会改变扩散以及空间排布现象。此外，高通量或速度的要求通常不允许经典的平衡方法的使用，因而详细了解反应动力学、扩散现象以及表面固定化的含义对于获取有意义的反应参数而言变得至关重要。

当评价给定分子相互作用的动力学时，多种定量动力学参数可能成为目标。一种目标定量动力学参数是结合速率常数。结合速率常数(即，k_a、k_on)是描述两种分子在平衡中的结合亲和性的数学常数，诸如抗体和抗原的结合亲和性。另一种目标定量动力学参数是解离速率常数(即，k_d、k_off)。所述解离速率常数是描述较大物体可逆地分离(解离)成为较小组分的倾向的数学常数，如当受体/配体复合体解离成为其组分分子的时候。第三种目标动力学参数是扩散速率常数k_M，该常数是描述标记的分子向传感器进行扩散的速率的数学常数。

发明概述

提供了对分子结合相互作用的结合动力学参数进行定量地测定的方法。本方法的实施方案的方面包括：制备磁性传感器装置，所述磁性传感器装置包含与分析混合物接触的磁性传感器，所述分析混合物包含磁性标记的分子以产生可检测的分子结合相互作用；从所述磁性传感器中获取实时信号；以及由所述实时信号定量地确定所述分子结合相互作用的结合动力学参数。还提供了被配置为用于所述方法的系统和试剂盒。

本发明的方面包括定量测定分子结合相互作用的结合动力学参数的方法。所述方法包括：制备磁性传感器装置，所述磁性传感器装置包括与分析混合物接触的磁性传感器，所述分析混合物具有磁性标记的分子以产生可检测的分子结合相互作用；从所述磁性传感器中获取实时信号；以及由所述实时信号定量地确定所述分子结合相互作用的结合动力学参数。

在某些实施方案中，所述结合动力学参数是结合速率常数(k_a)。在一些情况下，所述结合动力学参数是解离速率常数(k_d)。在某些情况下，所述结合动力学参数是扩散限制速率常数(k_M)。在某些实施方案中，结合动力学参数为结合速率常数(k_a)、解离速率常数(k_d)和扩散限制速率常数(k_M)中的至少一种。

在某些实施方案中，所述磁性传感器包括与所述磁性标记的分子特异地结合的分子，并且所述接触包括将所述磁性标记的分子涂覆于所述磁性传感器。

在某些实施方案中，所述磁性传感器包括捕获探针，所述捕获探针特异地结合于与所述磁性标记的分子特异地结合的分子，并且所述接触包括将与所述磁性标记的分子特异地结合的分子和所述磁性标记的分子相继地涂覆于所述磁性传感器。

在一些情况下，所述磁性传感器包括捕获探针，所述捕获探针特异地结合于与所述磁性标记的分子特异地结合的分子，并且所述接触包括制备具有与所述磁性标记的分子特异地结合的分子和所述磁性标记的分子的反应混合物，并且随后将所述反应混合物涂覆于所述磁性传感器。

在某些实施方案中，所述磁性传感器是自旋阀传感器。在一些情况下，所述磁性传感器是磁性隧道结传感器。

在某些情况下，所述分子结合相互作用是诸如核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用或蛋白质-核酸相互作用的结合相互作用。

在一些情况下，定量测定的步骤包括用拟合算法处理所述实时信号。在某些情况下，所述拟合算法是二室拟合算法(two-compartmentfittingalgorithm)。在一些实施方案中，所述二室拟合算法包括主体区室(bulkcompartment)和表面区室(surfacecompartment)。

本发明的方面还包括定量测定两种或更多种不同分子结合相互作用的结合动力学参数的方法，其中各个不同分子结合相互作用包括不同磁性标记的分子。所述方法包括：制备包括两个或更多个不同的磁性传感器的磁性传感器装置，各个磁性传感器接触具有磁性标记的分子的分析混合物从而产生两种或更多种不同的分子结合相互作用；从各个磁性传感器中获取实时信号；以及从所述实时信号中定量测定针对所述两种或更多种不同的分子结合相互作用中的每种的结合动力学参数。

在某些实施方案中，所述结合动力学参数是结合速率常数(k_a)。在一些情况下，所述结合动力学参数是解离速率常数(k_d)。在某些情况下，所述结合动力学参数是扩散限制速率常数(k_M)。在某些实施方案中，结合动力学参数是结合速率常数(k_a)、解离速率常数(k_d)和扩散限制速率常数(k_M)中的至少一种。

在某些实施方案中，所述结合相互作用是诸如核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用或蛋白质-核酸相互作用的结合相互作用。

本发明的方面还包括磁性传感器装置。所述磁性传感器装置包括：磁性传感器，所述磁性传感器被配置为检测磁性标记的分子；以及处理器，所述处理器被配置为从所述磁性传感器中获取实时信号和由所述实时信号定量地确定分子结合相互作用的结合动力学参数。

在某些实施方案中，所述结合动力学参数是结合速率常数(k_a)。在一些情况下，所述结合动力学参数是解离速率常数(k_d)。在某些情况下，所述结合动力学参数是扩散限制速率常数(k_M)。在某些实施方案中，结合动力学参数是结合速率常数(k_a)、解离速率常数(k_d)和扩散限制速率常数(k_M)中的至少一种。

在某些情况下，所述磁性传感器是自旋阀传感器。在一些情况下，所述磁性传感器是磁性隧道结传感器。

在某些实施方案中，所述磁性传感器包括两个或更多个感应区。在一些情况下，所述磁性传感器包括四个或更多个感应区。在一些情况下，所述感应区以串联和并联的方式连接。

在某些情况下，所述装置包括两个或更多个不同的磁性传感器。在一些情况下，所述装置包括100个或更多个不同的磁性传感器。在一些情况下，所述装置包括1000个或更多个不同的磁性传感器。

在某些实施方案中，所述装置还包括所述磁性标记的分子和与所述磁性标记的分子特异地结合的分子。

本发明的方面还包括试剂盒，该试剂盒包括：(a)磁性标记物；以及(b)以下物质中的至少一种：(i)计算机可读的媒介，其上储存有计算机程序，当计算机执行该程序时，该程序操控计算机由获自磁性传感器的实时信号定量地确定分子结合相互作用的结合动力学参数；以及(ii)具有用于获得所述计算机程序的地址的物理基板。

附图说明

图1(a)示出了根据本发明实施方案的使用与磁性传感器结合的捕获抗体、与所述捕获抗体结合的分析物和与磁性标签连接的检测抗体进行的夹心分析法的示意图。图1(b)示出了根据本发明实施方案的使用与磁性传感器结合的捕获DNA、与所述捕获DNA结合的靶DNA和与磁性标签连接的检测DNA进行的DNA夹心分析法的示意图。

图2提供了根据本发明实施方案的二室反应扩散模型的示意图。标记的抗体通过运输过程移向传感器表面并且随后通过结合流动(conjugationflux)进行结合和释放。

图3示出了根据本发明实施方案的链霉亲和素-生物素结合相互作用的(a)和EpCAM抗体对EpCAM抗原的(b)的动力学模型与实时结合数据之间的比较图。一旦所述模型与所述结合数据进行了拟合，由所述拟合计算所述结合速率常数、解离速率常数和扩散限制速率常数。图3(c)和3(d)所示的实时结合曲线示出了根据本发明实施方案的以平行实验进行的CEA抗体对CEA抗原的结合动力学监测从而比较磁性纳米传感器与表面等离子体共振(SPR)系统。所述GMR生物传感器具有5.0×10⁴M^-1s^-1的k_a计算值以及4.4×10^-4s^-1的k_d计算值，而SPR实验产生了4.44×10⁴M^-1s^-1的k_a以及1.17×10^-4s^-1的k_d。

图4(a)示出了根据本发明实施方案的抗体-抗原结合(并非按比例绘制)的示意图。在左侧，用磁性标签标记的抗体在浓度为C_s的溶液中靠近所述GMR传感器表面。当未结合时，扩散磁性标记的抗体距离所述GMR传感器过远以致不能被检测到。在所述传感器表面的是抗原，其以n_max的初始表面浓度被固定。正如右侧所描述，一旦所述磁性标记的抗体与所述抗原结合，来自所述磁性标签的磁场就被下方的基于接近度的GMR传感器检出。所述捕获的抗体-抗原复合体以n表示。图4(b)示出了根据本发明实施方案的按比例绘制的磁性标记的抗体的示意图。所述磁性标签包括包埋于葡聚糖聚合物内的若干个氧化铁核并且其随后使用抗体或受体进行功能化。图4(c)示出了根据本发明实施方案的包括1,008个磁性传感器的1mm²芯片的照片。图4(d)示出了根据本发明实施方案的经完全加工的芯片的光学显微照片和扫描电子显微镜(SEM)图像。1,008个GMR生物传感器被分成16个亚阵列，并且各亚阵列占90μm×90μm的面积。

图5(a)示出了根据本发明实施方案的通过方程M.6中的分析模型(虚线)所预测的抗-EpCAM抗体对表面固定化的EpCAM抗原的结合曲线图以及所测得的实验数据(实线)的结合曲线图，其中EpCAM蛋白的表面浓度以2×的系列稀释度从5阿摩尔(n_max)被稀释至20仄摩尔(zeptomole)(n_max/256)。本实验中的全部曲线对通过所述模型所预测曲线的拟合误差为R²＝0.98。图5(b)示出了根据本发明实施方案的分析模型所预测的(虚线)MNP-抗-EpCAM抗体对固定化于所述传感器表面的833仄摩尔(n_max/6)的EpCAM抗原的结合曲线图以及所测得的实验数据(实线)的结合曲线图，其中MNP-抗-EpCAM蛋白的溶液浓度为未经稀释、2×稀释和8×稀释。全部曲线对通过所述模型的拟合误差为R²＝0.96。y-轴以百万分比(ppm)显示了对初始MR进行归一化的MR变化。

图6(a)示出了根据本发明实施方案的在12组重复传感器上的抗CEA抗体对抗原的多元动力学分析以及在3组重复传感器上的抗VEGF抗体对抗原的多重动力学分析图。图6(b)示出了监测生物素对链霉亲和素结合动力学的25组重复传感器示图。图6(c)示出了SPR图并且图6(d)示出了根据本发明实施方案的基于磁性纳米传感器的平台的结果图，当在平行实验中对CEA抗体结合CEA抗原进行监测时所述图提供了类似的实时结合曲线。

图7示出了根据本发明实施方案的每传感器的磁性标签数量随时间变化的图。获得了各个加载团块的SEM图像(示于图7右侧)用以对所述实验中结合的MNP数量与所述模型预测的数量进行比较。

图8示出了根据本发明实施方案的不同固定化抗原加载量随时间的传感器信号图。

图9(a)示出了根据本发明实施方案的针对表位分布和交叉反应因素的选择性蛋白质定向的示意图。图9(b)示出了根据本发明实施方案的用抗-EGFR捕获抗体(作为对照)功能化的抗-EGFRAb传感器的图，其可捕获EGFR并且当所述抗EGFR抗体-MNP复合体结合之时被检出。图9(c)示出了根据本发明实施方案的证实了被监测的动力学与结合EGFR的抗-EGFR抗体-MNP复合体相关的图。y-轴以百万分比(ppm)显示了对初始MR进行归一化的MR变化。

图10示出了根据本发明实施方案的使用高密度GMR传感器阵列产生的2D空间内不同时间下蛋白质扩散动力学的可视化效果。y-轴单位以百万分比(ppm)显示了对初始MR进行归一化的MR变化。

图11(a)示出了根据本发明实施方案的用于监测穿过使用磁性传感器组的芯片阵列的蛋白质扩散动力学的实验装置照片。在图11(a)中，使用捕获抗体将四个四传感器组选择性地固定于CEA。在图11(a)中被圈示的各个传感器组对应于图11(b)内图中的匹配曲线。在将所述未反应捕获抗体洗去之后，将以MNP标签进行标记的检测抗体在反应孔内进行孵育。图11(b)示出了根据本发明实施方案的信号随时间的变化图。在向左上角的孔加入可溶的CEA抗原时，有可能在空间和时间上将CEA蛋白经过所述孔的移动可视化。

图12示出了包含并联和串联的72组传感器条GMR传感器结构的光学显微图像。图12中的插图示出了GME传感器的一个磁性传感器条的扫描电子显微镜(SEM)图像，其上具有多个结合的磁性纳米颗粒标签。

图13示出了根据本发明实施方案的描述方程M.6中各项贡献的对数图，方程M.6是结合于所述传感器表面的磁性标记抗体数量的函数。

图14示出了根据本发明实施方案的由Langmuir吸附模型所预测的(虚线)和实验测得的(实线)抗-EpCAM抗体对表面固定化的EpCAM抗原的结合曲线图。

发明详述

提供了对分子结合相互作用的结合动力学参数进行定量地测定的方法。本方法的实施方案的方面包括：制备磁性传感器装置，所述磁性传感器包含与分析混合物进行接触的磁性传感器，所述分析混合物包含磁性标记的分子以产生可检测的分子结合相互作用；从所述磁性传感器中获取实时信号；以及由所述实时信号定量地确定所述分子结合相互作用的结合动力学参。还提供了被配制为用于所述方法的系统和试剂盒。

在对本发明进行更为详尽的描述之前，应当了解本发明并不限于所描述的特定实施方案，因此本发明当然可以变化。还应了解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且并非意在进行限定，因为本发明的范围应仅由所附的权利要求进行限定。

在提供数值范围的情况下，应当了解本发明涵盖了处于所述范围的上限和下限之间的各中间数值以及该规定范围中的任意所述或中间数值，除非上下文进行清楚地另行指明否则下限精确到十分位。这些较小范围的上限和下限可被独立地包含于所述较小范围内并且亦被涵盖于本发明之内，除在规定范围被明确排除的任何范围限制。在所规定范围包含这些范围限制的之一或全部的情况下，不包括这些被包含的范围限制之一或全部的范围也包含于本发明之内。

特定范围限制在本文中以数值方式给出，其前具有术语“约”。本文所使用的术语“约”在本文中被用于为其后的精确数字以及接近或近似所述术语之后的数字的数字提供文字上的支持。在确定数字是否接近或近似明确提及的数字时，所述接近或近似的未提及数字可以是在其所处的上下文中提供了所述明确提及的数字的实质等价物的实质等效数字。

除非另行定义，否则本文所使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。尽管与本文所述类似或等价的任意方法和材料也可被用于本发明的实施或测试，在此描述了代表性的说明性方法和材料。

本说明所引用的全部出版物和专利以引用的方式并入本文，正如各个出版物或专利被特定且个别地表明通过引用的方式并入，并且其以引用的方式并入本文用以公开和描述与所述出版物通过引用而进行关联的方法和/或材料。任意出版物的引用是对所述出版物在本申报日期之前的公开内容的引用并且不应解释为承认本发明无权通过以在先发明的方式从而先于这些出版物。此外，所提供的出版的日期可与实际出版日期不同，所述实际出版日期可能需要进行独立证实。

应当认识到，本文以及所附的权利要求书中所使用单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包含了复数个指示物，除非上下文明确地另行指明。进一步应认识到，所述权利要求书可被撰写为排除任意可选的要素。同样地，本申明意在用作为与权利要求要素有关的诸如“唯独”、“仅”等等这些排它性术语的使用或“否定”限定的使用的前提基础。

应当了解，出于明了澄清的目的而在不同独立实施方案内所描述的本发明的特定特征也可以结合形式提供于单一实施方案之中。反过来，出于简要的目的而在单一实施方案内所描述本发明的多种特征也可以分别提供或以任何适当的分组进行提供。所述实施方案的所有组合被明确地包含于本发明内并且在本文公开的方式正如各自每一组合被单独和明确地进行公开，其程度使这些组合包含了可操作的加工和/或装置/系统/试剂盒。此外，描述这些可变因素的实施方案中所列的所有亚组合也被本发明明确地包含并且在本文公开的方式正如各自每一化学群体亚组合被单独和明确地在本文中被公开。

正如本领域的技术人员在阅读本发明后所明了，本文所描述和说明的各个单独实施方案具有分立的组分和特征，其在不脱离本发明的范围或精神的情况下可容易地同任意其它多个实施方案的特征进行拆分和组合。任何提及的方法均可以所提及的事件为顺序或以逻辑上可行的任何其它顺序进行实施。

为进一步描述本发明的实施方案，首先将对本方法的实施方案的方面进行更为详尽的描述。随后讨论了可用于实施本发明的方法的系统和试剂盒的实施方案。

方法

根据上文所总结，本发明的实施方案涉及对目标分子结合相互作用的结合动力学参数进行定量测定的方法。在某些实施方案中，所述目标结合相互作用是第一种和第二种分子之间的相互作用，例如第一种和第二种生物分子之间的相互作用。例如，所述第一种和第二种分子之一可以是磁性标记的分子，并且所述第一种和第二种分子之一可以是与所述磁性标记分子特异性结合的分子。“定量测定”意指以数量方式例如以数值的方式表达目标结合动力学参数。“结合动力学参数”意指可测量的结合动力学因子，其至少部分地定义给定分子相互作用并且可被用于定义其行为。目标结合动力学参数包括但不限于，结合速率常数(即，k_a、k_on)、解离速率常数(即，k_d、k_off)、扩散限制速率常数(即，k_M)、活化能(即，E_A)、传输参数如扩散率，等等。

根据上文所总结，本发明的方法可包含下列步骤：

制备与包含磁性标记的分子的分析混合物进行接触的磁性传感器装置；

从磁性传感器装置中获取实时信号；并且

由所述实时信号定量地确定分子结合相互作用的结合动力学参数。

这些步骤均各自进行更为详尽地描述。

制备与包含磁性标记的分子的分析混合物进行接触的磁性传感器装置

所述方法的方面包括制备与包含磁性标记的分子的分析混合物进行接触的磁性传感器装置。所述方法包括，制备磁性传感器与包含目标结合相互作用的构件分子(即，所述目标结合相互作用的结合对构件)和磁性标记物的组合物(如，分析混合物)接触的装置或结构，其中所述磁性标记物可以是所述目标结合相互作用的构件分子之一的部分或结构域，或是不同分子的组分，如，与所述目标结合相互作用的两种构件分子之一特异结合的第三种分子。在与所述磁性传感器进行接触的组合物或分析混合物中，所述磁性标记物可以与所述结合对构件之一稳定地结合例如共价或非共价结合以产生磁性标记的分子。如将下文进一步所描述的，例如在所述结合对构件彼此何时接触方面和或所述磁性传感器方面、与装置相关的所述结合对构件的配置方面，制备与包含磁性标记的分子的分析混合物进行接触的磁性传感器装置的步骤可包含多种不同的过程亚组合。

结合对

根据本文所述的方法，用于进行定量动力学分析的给定结合相互作用可由分子的结合对组成，诸如第一种和第二种生物分子。分子结合对可根据所述目标结合相互作用而广为变动。目标结合相互作用包括所述结合对分子之间的任意相互作用，其中所述结合相互作用以所述分子结合对在所述结合相互作用的环境条件下所具有的特异性而进行。目标结合相互作用的实例包括但不限于：核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受体-配体相互作用如抗体-抗原相互作用和受体-激动剂或拮抗剂相互作用。

具有目标分子结合相互作用的分子的实例包括但不限于：生物聚合物和小分子，所述小分子可以是有机或无机小分子。“生物聚合物”是一种或多种类型的重复单元的聚合物。生物聚合物可见于生物系统中(尽管它们可以通过合成而制备)并且可包含肽、聚核苷酸和多糖，以及这样一些化合物，其包含氨基酸类似物或非氨基酸基团，或核苷酸类似物或非核苷酸基团或由以上这些所构成。同样，生物聚合物包括常规骨架被非天然存在的或合成的骨架所取代的聚核苷酸，并且包括一个或多个常规碱基被能够参与沃森-克里克(Watson-Crick)型氢键相互作用的基团(天然的或合成的)所取代的核酸(或合成的或天然存在的类似物)。例如，“生物聚合物”可包括DNA(包括cDNA)、RNA、寡核苷酸和PNA以及根据美国专利第5,948,902号及其引用参考中的描述其它聚核苷酸。“生物单体”指能够与相同的或其它生物单体连接以形成生物聚合物的单一单元(例如，具有两个连接基团的单一氨基酸或核苷酸，所述连接基团中的一个或两个可具有可去除的保护基团)。

本文所使用的术语“肽”在本文中指通过一个氨基酸的α-羧基基团与另一个基团的α-氨基基团之间的酰胺形成而产生的任意聚合物化合物。所述术语“寡肽”在本文中指具有少于约10个至20个残基即氨基酸单体单元的肽。本文所使用的术语“多肽”在本文中指具有多于约10个至20个残基的肽。本文使用的术语“蛋白质”指具有多于约50个残基的特定序列的多肽并且包括D和L形式、经修饰的形式等等。本文所使用的术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。

本文所使用的术语“核酸”在本文中指由核苷酸构成的聚合物，所述核苷酸的例子如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或可与天然存在的核酸以序列特异性的方式杂交的合成制备的化合物(如，美国专利第5,948,902号及其引用参考中所述的PNA)，所述杂交方式类似于两种天然存在的核酸的杂交，例如，可参与沃森-克里克碱基配对相互作用。核酸可为任意长度，如2个碱基或更长、10个碱基或更长、100个碱基或更长、500个碱基或更长、1000个碱基或更长，包括10,000个碱基或更长。本文使用的术语“聚核苷酸”指由长度一般多于约100个核苷酸的核苷酸单体构成的单链或双链聚合物。聚核苷酸包含单链或多链结构，其中所述链中的一个或多个可以完全或可以不完全与另一个对齐。本文所使用的术语“核糖核酸”和“RNA”在本文中指由核糖核苷酸构成的聚合物。本文所使用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”在本文中指由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。本文所使用的术语“寡核苷酸”在本文中表示单链核苷酸多聚体，其长约10个至约200个核苷酸，诸如长约25个至约175个核苷酸，包括长约50个至约160个核苷酸，如长度为150个核苷酸。

在一些情况下，所述分子结合对是配体和受体，其中给定的受体或配体可以是或可以不是生物聚合物。本文所使用的术语“配体”在本文中指能够与目标化合物共价地或以其它化学方式进行结合的部分。配体可以是天然存在的或人造的。配体的实例包括但不限于，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂、毒素和毒液、病毒表位、激素、阿片剂、甾体类、肽、酶底物、辅因子、药物、血凝素、糖类、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白质等等。

本文所使用的术语“受体”在本文中指对配体具有亲和性的部分。受体可以是天然存在的或人造的。它们可以其未改变的状态或作为与其它物种的聚集体形式被使用。受体可共价地或非共价地、直接地或通过特异性结合物质连接于结合构件。受体的实例包括但不限于，抗体、细胞膜受体、与特异性抗原决定基具有反应性的单克隆抗体和抗血清、病毒、细胞、药物、聚核苷酸、核酸、肽、辅因子、血凝素、糖类、多糖、细胞膜、细胞器等等。受体在本领域中有时被称为抗配体。在本文使用术语受体时在含义上无差别。当两个分子通过分子识别进行结合以形成复合体时，形成了“配体受体对”。

磁性传感器装置

目标磁性传感器装置是响应于与所述传感器表面结合的磁性标记而产生电信号的装置。目标磁性传感器装置包括但不限于磁阻传感器装置，包括巨磁阻(GMR)装置。目标GMR装置包括但不限于自旋阀检测器，以及磁性隧道结(MTJ)检测器。

自旋阀检测器

在一些情况下，所述磁性传感器是自旋阀检测器。自旋阀检测器是由非磁性层如铜间隔开的两个铁磁层的金属多层薄膜结构。一个铁磁层称为扎层，其磁化被钉扎于固定方向，而另一铁磁层被称为自由层，其磁化可在外加磁场下自由转动。自旋阀的电阻取决于所述自由层的磁化对于所述扎层的磁化的相对取向。当所述两个磁化方向平行时，所述电阻最低，当反向平行时，所述电阻最高。电阻的相对变化被称为磁阻(MR)比率。在一些情况下，自旋阀的MR比率可在小磁场例如约100Oe中达到高于约10％。因此，自旋阀可以用作检测结合于所述传感器表面的磁性标记的分子的感应元件。

在某些实施方案中，自旋阀磁阻(MR)比率为约1％至约20％，诸如约3％至约15％，包括约5％至约12％。因此，在某些实施方案中，自旋阀可以以窄带宽(即，约1Hz或更低)或使用锁定检测(lock-indetection)对约10nm大小的单一磁性标记物进行检测。在这些情况下，通过狭化所述噪音带宽甚至可为单纳米颗粒检测获得充分的信噪比(SNR)。

自旋阀检测器可使用面内模式实施(参见，例如Li等，J.Appl.Phys.，93卷(10)：7557(2003))。在其它实施方案中，当在所述检测系统中可检测到AC扰动场(ticklingfield)导致的电磁干扰(EMI)时可使用垂直模式。所述EMI信号倾向于以所述AC扰动场的频率f为中心，因此其可通过在频率2f下进行的锁定检测而基本被消除或降低。此外，在一些情况下，可以使用2桥电路(2-bridgecircuit)来基本去除残余EMI。可以使用具有处于两个不同频率下的AC调制传感电流和AC扰动场的其它信号采集和处理方法(例如S-JHan，H.Yu，B.Murmann，N.Pourmand和S.X.Wang，IEEEInternationalSolid-StateCircuitsConference(ISSCC)Dig.Tech.Papers，SanFranciscoMarriott，CA，USA，2007年2月11-15)。

在某些实施方案中，除所述自旋阀自身的几何特征和偏置磁场之外，来自所述自旋阀检测器的由所述磁性标记物所引起的信号还依赖于所述磁性标记物和所述自旋阀的自由层之间的距离。由单磁性标记物产生的检测器电压信号随着所述颗粒中心与所述自旋阀自由层的中平面之间的距离的增加而降低。

在某些实施方案中，自旋阀的自由层位于扎层的顶部从而为磁性标记物的检测提供便利，这是因为来自磁性颗粒的感应磁场随着所述传感器和该颗粒之间的距离而单调递减。对包括保护所述自旋阀的保护层的厚度在内的所述磁性标记物和所述自由层的顶面之间距离的最小化可以为磁性颗粒的检测提供便利。

在某些实施方案中，自旋阀传感器可以包括在一个或多个检测器表面上的钝化层。在一些实施方案中，检测器结合了钝化薄(例如，60nm或更薄，诸如50nm或更薄，包括40nm或更薄、30nm或更薄、20nm或更薄或者10nm或更薄)层(例如，在检测器被用于具有50nm或更低的平均直径的磁性纳米颗粒标签的实施方案中)。在某些实施方案中，可使用较大的微米尺度的磁性颗粒。在一些情况下，适用于本文公开的检测器的钝化薄层可具有介于约1nm与约10nm之间的厚度，诸如介于约1nm与约5nm之间的厚度，包括介于约1nm与约3nm之间的厚度。在某些实施方案中，适用于本文公开的检测器的钝化薄层可具有介于约10nm与约50nm之间的厚度，诸如介于约20nm与约40nm之间的厚度，包括介于约25nm与约35nm之间的厚度。钝化层可包括但不限于，Ta、Au或它们的氧化物、它们的组合，等等。

涉及自旋阀检测器及它们的应用的方案的进一步细节被提供于美国专利公开号第2005/0100930号和第2009/0104707号；其公开内容以引用的方式并入本文。

磁性隧道结检测器

在某些实施方案中，所述磁性传感器是磁性隧道结(MTJ)检测器。MTJ检测器以类似于自旋阀检测器的方式构建，区别在于磁性间隔层被替换成绝缘层(如，绝缘隧道阻挡层)如氧化铝或MgO，通过该绝缘层所述感应电流垂直于薄膜平面流动。两铁磁电极之间的电子隧穿由两铁磁电极的相对磁化控制，即在其平行之时隧穿电流高并且在其反向平行时隧穿电流低。在某些实施方案中，MTJ检测器包含底电极、布置在隧道阻挡层任一侧的磁性多层以及顶电极。在一些情况下，MTJ检测器具有超过200％的磁阻比率(S.Ikeda，J.Hayakawa，Y.M.Lee，F.Matsukura，Y.Ohno，T.Hanyu和H.Ohno，IEEETransactionsonElectronDevices，卷54，第5期，991-1001(2007))和大装置磁阻，其产生了较高的输出电压信号。

在某些实施方案中，MTJ检测器具有双层顶电极。第一层可以是金属层(如，金层)，其中该层可在某些情况下具有60nm或更低的厚度，诸如50nm或更低，包括40nm或更低、30nm或更低、20nm或更低或者10nm或更低。第二层可以是导电金属，例如铜、铝、钯、钯合金、钯氧化物、铂、铂合金、铂氧化物、钌、钌合金、氧化钌、银、银合金、银氧化物、锡、锡合金、锡氧化物、钛、钛合金、钛氧化物、这些物质的组合，等等。在一些情况下，第二层的孔略小于MTJ的大小。在某些实施方案中，所述传感器被配置为在使用期间使结合的磁性标记物与所述自由磁性层的顶表面之间的距离介于5nm与100nm之间，诸如介于5nm与50nm之间，包括介于5nm与30nm之间，诸如介于5nm与20nm之间，包括介于5nm与10nm之间。在一些情况下，这种布置为降低或基本防止顶电极中的电流聚集提供便利(参见，例如vandeVeerdonk，R.J.M.等，Appl.Phys.Lett.，71：2839(1997))，该现象可在仅使用薄金电极的情况下出现。

除所述感应电流垂直于所述薄膜平面流动之外，MTJ检测器可与自旋阀检测器类似地运行，以所述外加调制场的面内模式或垂直模式均可。根据上文涉及自旋阀检测器的讨论，在某些实施方案中，外加调制场的垂直模式可被用于降低EMI，并且类似地，薄钝化层也适用于MTJ检测器。此外，MTJ检测器上的薄金第一顶电极还可为电导、钝化以及特定生物分子探针的吸附提供便利。

在某些实施方案中，在相同的检测器宽度和颗粒-检测器距离下，MTJ检测器可给出比自旋阀检测器更大的信号。例如，对于具有0.2μm乘0.2μm结面积和1kOhm-μm²的电阻-面积乘积，以250％的MR在250mV的偏压和H_b＝35Oe，H_t＝100Oerms下运行的MTJ检测器，来自直径11nm的中心距离所述自由层面心为35nm的单Co纳米颗粒的电压信号可为约200μV。在一些情况下，该电压比类似大小的自旋阀检测器的电压高出一个或更多的数量级。

涉及MTJ检测器及它们的应用的方案的进一步细节被提供于美国专利公开号第2005/0100930号和第2009/0104707号；其公开内容以引用的方式并入本文。

磁性传感器装置设置

磁性传感器装置可具有多种不同的设置，例如对传感器的设置，无论传感器被设置用于分批还是穿流应用等等。同样，提供所述装置的磁性传感器以与目标分子结合相互作用的结合构件和磁性标记物的混合物任何设置均可被使用。因此，磁性传感器装置的设置可包括但不限于：井设置(其中所述传感器与诸如井这样的液体盛容结构的底部或壁连接)；穿流设置，例如，其中所述传感器与具有流体输入和输出的液流池(flowcell)的壁连接；等等。

在某些实施方案中，本发明的磁性传感器装置包含基板表面，其在所述基板表面上显示两种或更多种不同磁性传感器。在某些实施方案中，所述磁性传感器包含具有磁性传感器阵列的基板表面。

“阵列”包含可寻址区域例如空间可寻址区域的任何二维或基本上二维(以及三维)的布置。当在所述阵列上具有定位于特定预设位置(即，地址)的多个传感器时，阵列是“可寻址的”。阵列特征(即，传感器)可通过中间间隔而隔离。任意给定的基板可携带设置于所述基板前表面的一个、两个、四个或更多个阵列。根据用途，任何或全部所述阵列可感应相同或彼此不同的目标并且各阵列可包含多个不同的磁性传感器。阵列可包含一个或多个，包括两个或更多个、四个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、50个或更多个，或者100个或更多个、1000个或更多个、10,000个或更多个或者100,000个或更多个磁性传感器。例如，64个磁性传感器可被布置到8×8的阵列中。在某些实施方案中，所述磁性传感器可被布置到阵列中，所述阵列具有10cm²或更小的面积，或者5cm²或更小的面积，例如1cm²或更小的面积，包括50mm²或更小的面积、20mm²或更小的面积，诸如10mm²或更小的面积，或者甚至更小的面积。例如，磁性传感器可具有介于10μm×10μm与200μm×200μm之间的面积，包括100μm×100μm或更低的面积，诸如90μm×910μm或更低，例如50μm×50μm或更低。

在某些实施方案中，磁性传感器可包括多个线性磁阻段。例如，磁性传感器可包括4个或更多个，例如8个或更多个，包括12个或更多个，或者16个或更多个，例如32个或更多个，例如64个或更多个，或者72个或更多个，或者128个或更多个线性磁阻段。所述磁阻段可各自宽度为1000nm或更低，例如宽度为750nm或更低，或者宽度为500nm或更低，例如宽度为250nm或更低。在一些情况下，所述磁阻段可各自厚度为50nm或更低，例如厚度为40nm或更低，包括厚度为30nm或更低，或者厚度为20nm或更低，例如厚度为10nm或更低。所述磁阻段可各自长度为1000nm或更低，或者长度为750nm或更低，或者长度为500nm或更低，或者长度为250nm或更低，例如长度为100nm或更低，或者长度为50nm或更低。

所述磁阻段可以串联方式连在一起，或者所述磁阻段可以并联方式连在一起。在一些情况下，所述磁阻段以串联和并联的方式连接。在这些情况下，两个或更多个磁阻段可以并联方式连在一起，并且两组或更多组这些并联连接的磁阻段可以串联方式连在一起。图12中示出了包含以串联和并联方式连接的磁阻段的磁性传感器的实例。

在某些实施方案中，给定装置的磁性传感器中的至少一些或全部具有在与传感器表面稳定结合的结合对构件。所述结合对构件可根据所实施的特定分析的性质而有所不同。同样，所述结合对构件可以是与目标分子结合相互作用中的分子特异性地结合的捕获探针，或是参与目标分子结合相互作用的分子，例如与所述磁性标记的分子特异地结合的分子。“稳定结合”指的是在应用条件下所述结合对构件和传感器表面以超过瞬时的时间保持相对于彼此的空间位置，所述应用条件的例子如所述分析条件。同样，所述结合对构件和传感器表面可非共价或共价地彼此稳定结合。非共价结合的实例包括非特异性吸附、基于静电(如，离子、离子对相互作用)、疏水相互作用、氢键相互作用的结合、通过与所述支持物表面共价连接的特异性结合对构件所进行的特异性结合，等等。共价结合的实例包括结合对构件与存在于所述传感器表面的官能团如-OH之间所形成的共价键，其中所述官能团可以是天然存在的或是作为被引入的连接群体中的一员而存在。因此，所述结合对构件可被吸附、物理吸附、化学吸附或共价连接于所述磁性传感器表面。

在给定装置包含两个或更多个磁性传感器的情况下，各传感器可具有与其表面结合的相同或不同的结合对构件。因此，这些装置的传感器表面可存在与所述磁性标记的分子结合的不同的捕获探针或分子，从而使各个磁性传感器特异性地结合于不同的分子。这类装置还可包含不具有任何结合对构件的传感器(例如，在这些空白传感器可作为参比或对照电信号来源的情况下)。

在多传感器装置中，所述磁性传感器之间可存在不携带任何分析物特异性探针的区域。当这些传感器间区域存在时，其可具有各种大小和设置。在一些情况下，这些传感器间区域可被配置为降低或防止不同传感器间的流体运动，例如在所述传感器间区域包含疏水材料和/或流体屏障(诸如屏壁)的情况下。

在某些实施方案中，所述装置的基板，例如可携带不同传感器的一个或多个阵列的基板，一般被成形为矩形固体(尽管可能是其它形状)，其长度为1mm或更大和150mm或更小，诸如1mm或更大和100mm或更小，例如50mm或更小、10mm或更小；宽度为1mm或更大和150mm或更小，诸如100mm或更小，包括50mm或更小，或者10mm或更小；以及厚度为0.01mm或更大和5.0mm或更小，例如0.1mm或更大和2mm或更小，包括0.2mm或更大和1.5mm或更小，例如0.5mm或更大和1.5mm或更小。

可存在电子通讯元件，例如导电体，其被配置为将传感器与“芯片外”组件电耦接，所述“芯片外”组件诸如装置组件，例如处理器、显示器，等等。

根据下文更为详尽的描述，给定的磁性传感器装置除如上文所述的传感器结构(如，阵列)外可包含多种组件。另外的装置组件可包括但不限于，信号处理组件、数据显示组件(如，图形用户界面)；数据输入和输出装置、电源、流体处理组件等等。

磁性标记物

在所述方法的实施方案中，可使用任意便利的磁性标记物。磁性标记物是在与磁性传感器充分结合时可通过所述磁性传感器检测出并且导致所述磁性传感器输出信号的标记部分。在标记物的中心与所述传感器的表面之间的距离为200nm或更近，诸如100nm或更近，包括50nm或更近的情况下，目标磁性标记物可充分地结合于磁性传感器。

在某些实施方案中，所述磁性标记物是纳米颗粒。在特定实施方案的实施中有用的纳米颗粒是磁性(如，铁磁性)胶体材料和颗粒。所述磁性纳米颗粒可以是超顺磁高磁矩磁性纳米颗粒，或者包含两层或更多层反铁磁性偶联的高磁矩铁磁物的合成反铁磁纳米颗粒。这两种类型的纳米颗粒均在缺乏磁场的情况下表现出“非磁性”并且基本不聚团。根据某些实施方案，适用的可磁化纳米颗粒包含一种或多种材料，例如但不限于，顺磁、超顺磁、铁磁和亚铁磁材料，以及它们的组合。

在某些实施方案中，所述磁性纳米颗粒(本文亦称为磁性标签)具有低残磁以使其在溶液中不聚团。具有低残磁的磁性纳米颗粒的实例包括超顺磁颗粒和反铁磁颗粒。在某些情况下，所述磁性标签在约100Oe的磁场下具有可检测的磁矩。在一些情况下，所述磁性标签的大小与所述靶生物分子的大小是可比较的，从而使所述磁性标签不干扰目标分子间的结合相互作用。在某些实施方案中，所述磁性标签在形状上是基本均一的并且在生物环境中具有化学稳定性，其可辅助它们在分析条件下的应用。在一些情况下，所述磁性标签是生物相容的，即水可溶并且经功能化从而使它们易于结合于目标生物分子，例如特异性结合于靶分析物的受体。

在某些实施方案中，所述磁性纳米颗粒是高磁矩磁性纳米颗粒，诸如Co、Fe或CoFe纳米晶体，其在室温下可以是超顺磁的。所述磁性纳米颗粒可通过化学方法进行制备，例如但不限于，适当溶液中的盐还原或化合物分解。这些磁性纳米颗粒的实例包括但不限于S.Sun和C.B.Murray，J.Appl.Phys.，85：4325(1999)；C.B.Murray等，MRSBulletin，26：985(2001)；以及S.Sun，H.Zeng，D.B.Robinson，S.Raoux，P.M.Rice，S.X.Wang和G.Li，J.Am.Chem.Soc.，126，273-279(2004)所描述的纳米颗粒。在某些实施方案中，所述磁性纳米颗粒可以受控的大小(如，约5-12nm)被合成，具有单分散性并且使用油酸进行稳定化。适用于本文的磁性纳米颗粒包括但不限于，Co、Co合金、铁氧体、氮化钴、氧化钴、Co-Pd、Co-Pt、铁、铁合金、Fe-Au、Fe-Cr、Fe-N、Fe3O4、Fe-Pd、Fe-Pt、Fe-Zr-Nb-B、Mn-N、Nd-Fe-B、Nd-Fe-B-Nb-Cu、Ni、Ni合金，等等。在一些实施方案中，金薄层被镀在磁性核芯之上，或者聚L-赖氨酸包埋的玻璃表面可被连接于磁性核芯。适当的纳米颗粒可购自，例如Nanoprobes，Inc.(Northbrook，IL)和ReadeAdvancedMaterials(Providence，RI)。

在一些情况下，磁性纳米标签可通过物理方法而不是化学方法来制备(参见，例如W.Hu，R.J.Wilson，A.Koh，A.Fu，A.Z.Faranesh，C.M.Earhart，S.J.Osterfeld，S.-J.Han，L.Xu，S.Guccione，R.Sinclair和S.X.Wang，AdvancedMaterials，20，1479-1483(2008))，并且其适用于对待检测的所述靶生物分子进行标记。所述磁性标签可包含两个或更多个铁磁层，诸如Fe_xCo_1-x，其中x介于0.5与0.7之间，或者如基于Fe_xCo_1-x的合金。在一些情况下，Fe_xCo_1-x具有24.5k高斯的饱和磁化。这些铁磁层可被非磁性间隔层所隔离，所述非磁性间隔层诸如Ru、Cr、Au或其合金。在某些情况下，所述间隔层包含以反铁磁方式耦接的铁磁层，从而使所产生的颗粒的净残磁为零或接近于零。在某些实施方案中，所述反铁磁结合可通过RKKY交换相互作用(参见，例如S.S.P.Parkin等，Phys.Rev.Lett.，64(19)：2304(1990))和静磁相互作用(J.C.Slonczewski等，IEEETrans.Magn.，24(3)：2045(1988))而实现。在一些情况下，所述反铁磁耦合强度使得所述颗粒可被100Oe的外部磁场饱和(所有层的磁化变成平行)。在一些情况下，所述反铁磁耦合强度依赖于所述间隔层的层厚和合金组成。

在某些实施方案中，为促进所述纳米颗粒的生物偶联，金覆盖(或功能类似物或等同材料的覆盖)被层叠于反铁磁材料层之上从而使所述纳米颗粒可以通过金-巯基或其它便利的连接而被偶联于生物分子。表面活性剂可被用于所述纳米颗粒，从而使所述纳米颗粒可以成为水溶性的。就化学稳定性而言，所述纳米颗粒的边缘还可以用Au或其它惰性层钝化。

任何便利的方案均可被用于制备本文所述的纳米颗粒。例如，所述纳米颗粒的层可包括沉积在具有基本光滑表面的基板或释放层上的纳米尺度的铁磁层和间隔层。在一些情况下，通过压印(imprinting)、蚀刻、自组装等等可形成遮蔽层(masklayer)。随后，可将所述遮蔽层和其它的不需要的层去除并完全清除掉。随后可去除所述释放层，升出为所述遮蔽层的负像(negativeimage)的纳米颗粒。所述颗粒可随后与表面活性剂和生物分子接触。在一些情况下，所述基板可在完全清除和进行化学机械抛光(CMP)后重复使用。

在其它的实施方案中，所述纳米颗粒可以使用消减制备法(substractivefabricationmethod)进行制备。在该情况下，所述层被直接沉积在释放层之上并随后沉积遮蔽层。通过所述遮蔽层蚀刻所述层并且最终从所述基板上释放。这些纳米颗粒产生于所述遮蔽层的正像(positiveimage)，其与在所述添加制备法中情况相反。

在某些实施方案中，适用于本发明的磁性纳米颗粒的大小与目标分子结合相互作用的生物分子的大小是可比较的，从而使所述纳米颗粒不干扰目标结合相互作用。因此，在一些实施方案中所述磁性纳米颗粒的大小为亚微米尺度，例如介于5nm与250nm之间(平均直径)，诸如介于5nm与150nm之间，包括介于5nm与20nm之间。例如，具有5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm和300nm的平均直径的磁性纳米颗粒以及具有介于这些数值任意二者之间的平均直径的纳米颗粒适用于本文。此外，除球形外，适用于本文的磁性纳米颗粒可以被成形为片状、棒状、线圈、纤维等等。

在一些实施方案中，所述磁性标记物具胶体稳定性，例如，纳米颗粒组合物可以稳定胶体的形式存在。胶体稳定指的是所述纳米颗粒被均匀分散于溶液之中从而使所述纳米颗粒基本不聚团。在某些实施方案中，为防止聚簇，所述纳米颗粒在零外加场下可不具有净磁矩(或具极小磁矩)。所有大小的反铁磁颗粒在零场下均可具零磁矩。与之相反，对于铁磁颗粒，其大小可低于“超顺磁极限”，其在某些情况下是约20nm或更低，诸如约15nm或更低，包括约10nm或更低。

在某些实施方案中，可使用大晶圆(wafer)和标准真空薄膜沉积工艺而大量制备所述合成纳米颗粒。例如，使用6英寸晶圆，假定各颗粒在所述晶圆上占据60nm乘60nm的方形的情况下，可在约5×10¹²颗粒每次运行的速度下制备30-nm直径的纳米颗粒。

在一些情况下，给定的目标结合相互作用的分子和磁性标记物被稳定地结合于彼此。“稳定结合”指的是在应用条件如分析条件下所述生物分子和磁性标记物以超过瞬时的时间保持将相对于彼此的空间位置。同样，所述生物分子和磁性标记物可非共价或共价地彼此稳定结合。非共价结合的实例包括非特异性吸附、基于静电(如，离子、离子对相互作用)、疏水相互作用、氢键相互作用的结合、通过与所述支持物表面共价连接的特异性结合对构件所进行的特异性结合，等等。共价结合的实例包括所述生物分子与存在于所述标记物表面的功能基团如-OH之间所形成的共价键，其中所述功能基团可以是天然存在的或是以引入的连接基团的构件的形式存在。

分析混合物制备

可使用任意数量的不同方案制造包含与分析混合物接触的磁性传感器的磁性传感器装置，所述分析混合物包含磁性标记的分子。例如，与所述磁性标记的分子特异性结合的第一种分子可被结合于所述传感器表面的捕获探针，并且随后与磁性标记的分子(如，可被磁性标记的第二种分子)接触。在这些情况下的方法可包括提供具有磁性传感器的磁性传感器装置，所述磁性传感器展示出与所述第一种分子特异结合的捕获探针，所述第一种分析还与所述磁性标记的分子特异地结合；并且随后使所述磁性传感器与所述第一种分子和所述磁性标记的分子接触。所述接触可包含依次地向所述磁性传感器涂覆第一种分子，所述第一种分子与表面结合并且能够与所述磁性标记的分子特异地结合，并且随后涂覆所述磁性标记的分子。

或者，可以在与传感器接触之前将与所述磁性标记的分子特异地结合的第一种分子和所述磁性标记的分子合并以形成复合体，并且可使所产生的复合体与所述传感器上的捕获探针结合(如，在所述第一种分子和所述捕获探针之间的结合相互作用的结合动力学是研究目标的情况下)。在这些情况下，所述接触包含制备反应混合物，所述混合物包含与所述磁性标记的分子特异性结合的第一种分子以及所述磁性标记的分子，并且随后将所述反应混合物涂覆于所述磁性传感器。

在另一个实施方案中，与所述磁性标记的分子特异地结合的第一种分子被首先定位于所述传感器上，并且随后与磁性标记的第二种分子接触。在这些情况下，所述方法包括提供具有磁性传感器的磁性传感器装置，所述磁性传感器展示出所述第一种分子(无中间捕获探针)，并且随后使所述磁性传感器与磁性标记的分子接触。

图1(a)和1(b)提供了可分别被应用于对抗体/分析物相互作用和核酸杂交相互作用的结合动力学分析的分析方案的示意图。在图1(a)中，所用的方案是夹心分析方案，该方案中与GMR传感器表面稳定结合的捕获抗体被结合于分析物，所述分析物随后被结合于与磁性标签相连接的检测抗体。在图1(b)中，所用的方案是DNA夹心分析，该方案中捕获DNA被结合于GMR传感器表面，靶DNA与所述捕获DNA杂交，并且结合于磁性标签的检测DNA与所述靶DNA杂交。在制备根据图1(a)和1(b)所示的方案的装置中，所关注的可以是所述捕获结合构件(如，捕获抗体或捕获DNA)和所述靶构件(如，分析物或靶DNA)之间的相互作用的结合动力学。在这些实施方案中，所述靶和标记的构件被首先在结合条件下彼此接触，并且所产生的复合体与所述传感器表面接触。或者，在制备根据图1(a)和1(b)所示的方案的装置中，所关注的可以是标记的结合构件(如，标记的抗体或标记的DNA)和所述靶构件(如，分析物或靶DNA)之间的相互作用的结合动力学。在这些实施方案中，所述靶和捕获构件首先在结合条件下彼此接触，并且所产生的结合于传感器表面的复合体与标记的构件接触。

上述接触(包括涂覆)步骤在可发生目标结合相互作用的条件下进行。尽管接触的温度可有所变化，但在一些情况下所述温度在1℃至95℃的范围，诸如5℃至60℃的范围，并且包括20℃至40℃的范围。所述分析的各种组分可存在与水性介质中，所述介质可包含或不包含其它的组分，诸如盐、缓冲剂，等等。在一些情况下，接触在严苛条件下进行。严苛条件特征可在于比所述探针靶二联体的融解温度低15℃至35℃如20℃至30℃的温度范围，所述融解温度取决于多种参数，例如，温度、缓冲组合物、探针和靶的大小、探针和靶的浓度，等等。同样地，所述杂交的温度可在约55℃至70℃的范围，通常在约60℃至68℃的范围。在变性剂存在的情况下，所述温度可在约35℃至约45℃的范围，通常在37℃至42℃的范围。严苛杂交条件特征可在于存在杂交缓冲液，其中所述缓冲液特征在于以下的特征中的一个或多个：(a)具有高盐浓度，如3至6×SSC(或具有类似浓度的其它盐类)；(b)去污剂的存在，诸如SDS(0.1至20％)、Triton×100(0.01至1％)、monidetNP40(0.01至5％)等等；(c)其它添加剂，如EDTA(如，0.1至1μM)、四甲基氯化铵；(d)加速剂，如PEG、硫酸葡聚糖(5至10％)、CTAB、SDS等等；(e)变性剂，如甲酰胺、脲等；等等。严苛条件是在其中严苛性与上文所述的特定条件至少相同的条件。

与传感器表面接触的样品可以是简单样品或复杂样品。“单样品”指的是包含所述结合相互作用的一个或多个构件的样品并且除所述溶剂之外的其它分子种类即使有也是少数的。“复杂样品”指的是包含目标结合相互作用的一个或多个构件并且还包含众多不感兴趣的不同蛋白质或其它分子的样品。在某些实施方案中，所述复杂样品是血样，其为血液或其级分，例如血清。在某些实施方案中，所述复杂样品是血清样品。在某些实施方案中，在本发明的方法中进行分析的复杂样品是包含10种或更多种，诸如20种或更多种，包括100种或更多种，例如10³种或更多种、10⁴种或更多种(诸如15,000种；20,000种甚或25,000种或更多)相区分的(即，不同的)分子实体的复合样品，所述分子实体在分子结构方面相互不同。

从所述磁性传感器中获取实时信号

在制备包含与分析混合物(所述分析混合物包含目标结合相互作用的结合构件和磁性标记物，例如根据上文所述)接触的磁性传感器的装置之后，所述方法的方面包括通过所述磁性传感器获取实时信号。同样地，某些实施方案包括通过所述装置获取实时信号。因此，可观测到与目标结合相互作用的发生相关联的信号的实时演化。所述实时信号由给定的目标时间期间所获得的两个或更多个数据点组成，其中在某些实施方案中所获得的信号是在给定的目标时间期间连续地获得的数据点的连续集合(例如，以轨迹的形式)。目标时间期间可变动，其在一些情况下在1秒至10小时的范围，诸如在10秒至1小时的范围并且包括1分钟至15分钟的范围。所述信号中的数据点的数量也可变动，其中在一些情况下，数据点的数量足以在所述实时信号的时间段上提供数据的连续延伸(continuousstretch)。

在一些实施方案中，当所述分析系统处于所述“湿”条件下时观测所述信号，即，在包含分析成分(例如，所述结合构件和磁性标记物)的溶液仍处于与所述传感器表面的接触的情况下。由此，无须洗去全部非结合或无关分子。该“湿”检测是可行的，这是因为所述磁性标签纳米颗粒(例如，如本文它处所述的具有150nm或更小的直径)所产生的磁场随着与所述纳米颗粒的距离的增加而迅速降低。因此，与所捕获的结合构件结合的标记物的传感器处的磁场超过了来自溶液中的未结合的磁性标记物的磁场，所述非结合磁性标记物不仅与所述检测器的距离较远而且处于布朗运动之中。本文所使用的术语“邻近检测”指的是所结合的纳米颗粒的传感器的主导性。根据所述“邻近检测”设计，处于所述传感器表面的特异结合的磁性标记的偶联物可在不洗去溶液中的非特异磁性纳米标签的情况下被定量。

对于给定的目标结合相互作用，分析可包含获得单结合对构件浓度或多个结合对浓度的实时信号，诸如2个或更多个、3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、100个或更多个、甚或1,000个或更多个不同的浓度。根据需要，给定的分析可使具有相同捕获探针浓度的相同传感器与多个不同的结合对构件浓度接触，或以相反的方式进行接触，或以捕获探针和结合对构件的不同浓度组合进行接触。

通过所述实时信号定量确定结合动力学参数

根据上文所总结，在获得所述实时信号之后，所述方法可包括通过所述实时信号定量确定分子结合相互作用的结合动力学参数。换言之，所述实时信号被用于定量确定所述目标结合动力学参数，从而目标结合动力学参数获得自所述实时信号。

在一些情况下，所述目标结合动力学参数通过使用拟合算法处理所述实时信号而进行定量确定。拟合算法指的是一套法则，其通过将方程与实时信号或获自给定分析信号拟合，所述给定分析例如上文所述分析，从而确定目标结合动力学参数。可使用任意便利的拟合算法。

在一些实施方案中，二室模型被用于拟合所述实时数据。所关注的二室模型假定溶液中的磁性标记的结合分子通过传输过程(扩散或流动)接近表面结合的结合配对物如被捕获的第一种生物分子，并且随后通过结合和解离的化学过程与表面结合的结合配对物结合。在这些情况下，模型中的二室是主体区室和表面区室。图2提供了一些实施方案中使用的二室反应-扩散模型的示意图，其中标记的分子(以标记的抗体演示)通过传输过程向所述传感器表面移动并且随后通过结合流动而结合和释放。在一些情况下，磁性标记分子的浓度被假定在各个区室中是均一的并且仅仅处于所述表面区室(C_s)中的磁性标记的分子将与所述传感器表面的结合位点反应并且处于所述主体区室(C₀)中的磁性标记的分子将向所述表面进行扩散。在一些情况下，所使用的二室模型并不假定发生“快速混合”。

该系统的支配方程写作：

$\frac{d{C}_s}{\mathrm{dt}}{k}_M(c_0-C_s)-d_a{C}_s(B_{\max }-B)+k_{d}B---\left(1\right)$

$\frac{\mathrm{dB}}{\mathrm{dt}}=k_a{C}_s(B_{\max }-B)-k_{d}B---\left(2\right)$

其边界条件为：

C_s|_t＝0＝C₀(3)

B|_t＝0＝0(4)

其中B是传感器表面上所结合的第一/第二生物分子偶联物的浓度，B_max是初始有效受体浓度，k_a(＝k_on)是结合速率常数，k_d(＝k_off)是解离速率常数，并且k_M是扩散限制的速率常数。由于对此常微分方程组无解析解，因此使用了数值拟合算法。

上述第一个方程被用于描述所述表面区室中标记的第二种分子的浓度C_s。该方程假定标记的第二种分子通过来自所述主体区室的扩散向所述表面区室的入流减去第二种分子通过与所述受体的结合和解离的净出流等于C_s增加的速度。在这些实施方案中扩散是唯一的物质传输机制，其中在结合过程期间整个体系被静置。

第二个方式被用于描述传感器表面结合的第一/第二生物分子偶联物浓度B。该方程假定标记的第二种生物分子通过结合而产生的入流减去解离等于B增加的速度。

最后，所述实时信号被假定与B成正比，即

V＝gB，V_max＝gB_max.(5)

存在五个未知参数，其将是拟合参数k_a、k_d、k_M、g和V_max。在这五个拟合参数中，k_a、k_d、k_M和g被假定对于在一个分析中具有相同捕获、第一和第二生物分子的所有传感器是相同的，并且因此被称为全局拟合参数；V_max对于各个传感器是不同的，这是因为表面结合的结合配对物如固定化于所述传感器表面的捕获分子、第一种生物分子的浓度是难以被精确地控制的。即使在所有传感器均位于相同的芯片并且受到相同处理的分析中，在B_max中都会存在某些差别，并且因此在V_max中会存在某些差别。

在一些情况下，所述二室模型是描述于D.Myszka等，Anal.Biochem.(1998)265：326-330中的二室模型的修正，例如其中所述模型被修改以适合于上述参数。

在需要的情况下，固定化的结合配对物的浓度可在不同传感器中被特意地变动，因此可获得并分析具有不同形状的信号曲线，例如，在被称为全局分析或全局拟合的方案中进行。在这些情况下，所述二室结合模型(如，根据上文所述的模型)被同时拟合于使用不同分析物浓度C(和/或不同水平的表面衍生化B_max)而获得的多种实时信号。本领域中被称为“全局拟合”并且基于所述实时数据，这种全局拟合确定了单全局k_a或k_d是否将提供对全部数据的良好拟合。完成的拟合的结果可以图形的方式被提供给以操作人员(operator)，其将所拟合的曲线重叠于所述原始实时数据曲线之上进行显示。

在需要的情况下，所述拟合的接近度还可通过卡方(X²)值的方式给出，其为一种标准的统计学度量。在一些情况下，当所述卡方值与实验中的噪音处于相同的量级之下被认为给出了良好的拟合。可被称为R²的测定系数，也可被用作为拟合良好度的指标。R²可被如下定义：如果所述信号曲线为s_i并且所述拟合曲线为f_i，i＝1，2，......n，当信号曲线中具有n个点时，则

$R^2=1-\frac{{\mathrm{SS}}_{\mathrm{err}}}{{\mathrm{SS}}_{\mathrm{tot}}}---\left(6\right)$

其中是所述拟合的方差之和，并且是所述信号的总变差(totalvariations)。

如果存在来自一个分析的N条信号曲线，则各个信号曲线将具有R²值，应对1-R²的平均值进行最小化以获得对全部N条曲线的最佳拟合。

在一些情况下，还可提供“残差图”，所述残差图给出了所述实验数据偏离被拟合的曲线的程度的图示，其显示了各条曲线的实验和拟合数据之间的差异。操作人员可随后确定所述拟合是否足够有效。如果不够有效，则可排除表现出最差拟合的实时信号并且使用消减的实时信号集合重新运行所述拟合程序。可重复该程序直至所述拟合达到满意程度。

所关注的另一种拟合算法包括特异性拟合算法，其公开于下文的实验部分。

在需要的情况下，以上定量测定方案可在被配置为执行上述方案的软件和/或硬件的辅助下进行。

多元分析

本发明方面包括使用同一传感器对两种或更多种不同的结合相互作用进行的多元分析。“多元分析”指的是不同组结合分子之间的两种或更多种不同结合相互作用被定量分析，其中结合分子和/或磁性标记的分子彼此不同，例如区别于不同的序列。在一些情况下，所述组数量是2个或更多个，诸如4个或更多个、6个或更多个、8个或更多个等等，多达20个或更多个，例如50个或更多个，包括100个或更多个或者1000个或更多个不同组。同样地，在一些情况下，所述磁性传感器装置可包含两种或更多种不同的磁性传感器，诸如2种或更多种、4种或更多种、6种或更多种、8种或更多种等等，多达20种或更多种，例如50种或更多种，包括100种或更多种或者1000种或更多种不同的磁性传感器，各传感器特异地检测不同的结合相互作用。在某些实施方案中，所关注的是2至1000种不同结合相互作用的多元分析，诸如2至50种，或者2至20种不同的结合相互作用。因此，在这些实施方案中，所述磁性传感器装置可包含2至1000个不同的磁性传感器，诸如4至1000个不同的磁性传感器，其各自特异地分析不同的结合相互作用。在其它情况下，所述磁性传感器装置可包含20个或更少的不同磁性传感器，诸如10个或更少，包括4个或更少的不同磁性传感器，其各自特异地分析不同的结合相互作用。

装置和系统

本发明的方面进一步包括磁性传感器装置和系统，其被配置为对目标分子结合相互作用的一种或多种结合动力学参数进行定量测定。所述装置和系统一般包括磁性传感器；以及定量分析模块(如，处理器)，所述定量分析模块被配置为从所述磁性传感器中接收实时信号并由所述实时信号定量地确定分子结合相互作用的结合动力学参数。这两个组件可作为单一装置被整合进入同一产品中，或分置入两个或更多个不同装置中(如，作为系统)，其中所述两个或更多个不同装置彼此进行通讯，例如，通过有线或无线通讯协议。

因此，本发明的方面进一步包括系统，例如，基于计算机的系统，其被配置为定量评价根据上文所述的结合相互作用。“基于计算机的系统”指的是被用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置和数据存储装置。所述基于计算机的系统的实施方案的最低硬件包括中央处理器(CPU)(如，处理器)、输入装置、输出装置和数据存储装置。任意一种当前存在的基于计算机的系统均可适用于本文公布的实施方案。所述数据存储装置可包括任意产品，其包含如上所述的本发明信息的记录品，或者可访问这种产品的存储器访问装置。

在计算机可读介质上“记录”数据、编程或其它信息是指使用本领域已知的任何方法存储信息的过程。根据所使用的访问所存储的信息的装置，可选用任意便利的数据存储结构。多种数据处理器程序和格式可被用于存储，例如，文字处理文本文件，数据库格式，等等。

“处理器”指的是执行其所需的功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文的任何处理器可以是可编程的数字微处理器，诸如以电子控制器、大型机、服务器或个人计算机(例如，桌面或便携式)形式可用的微处理器。在所述处理器是可编程的情况下，适当的程序可从远程位置通讯给所述处理器，或者以计算机程序产品的形式预先存储(所述计算机程序产品诸如便携式或固定化的计算机可读存储介质，无论是基于磁性、光学或固态装置均可)。例如，磁性介质或光盘可携带所述程序，并且可通过在对应的站点与各处理器进行通讯的适当的读取器读取。

本系统的实施方案可包含下列组件：(a)通讯模块，所述通讯模块例如通过用户计算机或工作站为所述系统与一位或多位用户之间的信息传递提供便利；以及(b)处理模块，所述处理模块用于执行包括在所公开的定量分析方法中的一个或多个任务。

在某些实施方案中，描述了包含计算机可用介质的计算机程序产品，所述介质具有存储于其中的控制逻辑(controllogic)(计算机软件程序，包括程序代码)。当被所述计算机的处理器执行的时候，所述控制逻辑使所述处理器执行本文所述的功能。在其它的实施方案中，某些功能主要在使用例如硬件状态机的硬件中实施。为执行本文所述功能的硬件状态机的实施可通过使用任何便利的方法和工艺而实现。

除所述传感器装置和定量分析模块之外，本发明的系统和装置还可包含大量的其它组件，诸如数据输出装置如监视器、打印机和/或扬声器，数据输入装置如交互端口、键盘等等，液体处理组件，电源等等。

用途

本方法、系统和试剂盒在需要定量测定目标结合相互作用的结合动力学参数的多种不同应用中显现用途。在某些实施方案中，所述结合相互作用例如但不限于，核酸杂交、蛋白质-蛋白质相互作用(例如在下文实验部分中被更为详尽地描述的相互作用)、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用、蛋白质-核酸相互作用，等等。

在一些情况下，本方法、系统和试剂盒在需要实时观测分子结合相互作用的药物开发方案中展现用途。例如，药物开发方案可使用本方法、系统和试剂盒来实时监测抗体与抗原之间的分子结合相互作用、或核酸之间的杂交相互作用、或蛋白质之间的结合相互作用、或受体与配体之间的结合相互作用、或酶与底物之间的结合相互作用、或蛋白质与核酸之间的结合相互作用，等等。例如，CEA和VEGF是肿瘤标记物并且抗VEGF抗体药物如贝伐单抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀(Avastin)；Genentech/Roche)是有效的抗癌症药物。另一个实例为抗EpCAM抗体，其被制剂化成为化疗药物依决洛单抗(edrecolomab)。对诸如此类的结合相互作用的监测可为其它基于抗体的药物的开发提供便利。

本方法、系统和试剂盒还在对包含在复杂样品中的结合对之间的分子结合相互作用的分析中展现用途。在一些情况下，所述复杂样品可被直接分析而不将目标结合分子与其它可能处于所述样品中的非感兴趣的蛋白质或分子进行分离。在某些情况下，非感兴趣的蛋白质或分子的非特异性结合以及未结合的磁性纳米颗粒在本方法、系统和试剂盒中基本不产生可检测的信号。因此，本方法、系统和试剂盒在可能使用复杂样品并且在对于目标结合相互作用的检测无需洗涤所述传感器的情况下可实时监测目标结合相互作用而的分析方案中展现用途。

本文公开的实时结合分析和动力学模型可在诸如表位定位的应用中展现用途。例如，所述GMR传感器阵列具有以高度并行方式实施表位定位的能力。使用捕获抗体，可将抗原选择性地固定化于所述传感器表面上的特定分子内结构之中。所述被捕获抗原上暴露的表位的动力学相互作用可以针对多种受体或抗体的亲和性而被探测。例如，表皮生长因子受体(EGFR)能够结合EGF自身以及包含EGF样重复的蛋白质如EpCAM。通过使用不同的单克隆抗体捕获具有EGF样重复的蛋白质以及对EGFR与这些定向蛋白质的结合进行的检测，可测定表位定位以评价EGFR对于包含EGF样重复的多种配体的亲和性。使用GMR传感器以探测暴露出的表位具有从使用特定靶进行的药物相互作用的大规模筛选直至对蛋白质组中的特定目标结构域进行的平行筛选的应用。

本方法、系统和试剂盒还在对分子结合相互作用的空间上和时间上的监测中展现用途。例如，本方法、系统和试剂盒可被用于通过细胞内蛋白质的分泌蛋白质组(secretome)分析而监测定位化的细胞-细胞通讯。通过监测细胞内蛋白质分泌在空间和时间上的扩散，可测定细胞-细胞通讯的机制。

本方法、系统和试剂盒还在了解参与细胞生物学中的信号转导的受体-配体结合相互作用以及在完整蛋白质组中对特定目标化合物进行特征化的基础研究中展现用途。此外，对于临床医学的应用范围之广可从定向蛋白质估测研究中的大规模筛选直至检测药物中靶(on-target)和离靶(off-target)交叉反应结合动力学。

计算机相关实施方案

特定实施方案的方面进一步包括多种计算机相关的实施方案。具体地，可使用计算机实施先前部分中所描述数据分析方法。因此，实施方案提供了基于计算机的系统以对使用上文方法所产生的分析数据进行分析，从而提供目标结合相互作用的结合动力学参数的定量测定。

在某些实施方案中，所述方法以“程序”的形式被编码到计算机可读的介质中，其中本文所使用的术语“计算机可读的介质”指的是任何存储或转移介质，其参与对计算机提供用于执行和/或处理的指令和/或数据。存储介质的实例包括软盘、磁带、CD-ROM、DVD、Blu-Ray、硬盘驱动器、ROM或集成电路、磁光盘或者计算机可读卡如PCMICA卡或闪存卡，等等，无论这些装置属于所述计算机内置或者外置均可。包含信息的文件可被“存储”于计算机可读介质中，其中“存储”指的是记录信息从而使其在随后的时间可为计算机所访问和检索。所需介质是非瞬时的介质，即，所述程序被关联以实体结构的实体介质，例如被记录于其上。非瞬时介质并不包含通过无线协议进行转送的电子线号。

对于计算机可读介质，“永久性存储器”指的是处于永久状态的存储器。永久性存储器不会由于对计算机或处理器的供电终止而消除。计算机硬盘驱动器、CD-ROM、Blu-Ray、软盘和DVD是永久性存储器的全部实例。随机存取存储器(RAM)是非永久性存储器的一个实例。永久性存储器中的文件是可编辑和重写入的。

试剂盒

还提供了用于实施上述方法的一个或多个实施方案的试剂盒。本试剂盒可变动并且可包含多种装置和试剂。目标试剂和装置包括本文针对磁性传感器装置或其组件(诸如，磁性传感器阵列或芯片)、磁性纳米颗粒、结合试剂、缓冲液等等所描述的试剂和装置。

在一些情况下，所述试剂盒至少包含在所述方法(如，上文所述的方法)中使用的试剂；以及存储有计算机程序的计算机可读介质，其中所述计算机程序当加载进入计算机时操作所述计算机由获自磁性传感器的实时信号定量地确定第一种和第二种分子之间的结合相互作用的结合动力学参数；以及具有用于获得所述计算机程序的地址的物理基板。

除以上组件之外，本试剂盒可进一步包含实施本方法的说明。这些说明可以各种形式存在于在本试剂盒中，所述试剂盒中可存在一种或多种所述形式。这些说明可存在的一种形式是在合适的介质或基板上的印刷信息，例如，印有所述信息的纸件，处于所述试剂盒的包装之中或在包装插页上等等。另一种方式为其上记录有所述信息的计算机可读介质，例如，磁盘、CD、DVD、Blu-Ray等等。可存在的另一种方式为网站地址，其可被用于通过国际互联网在远程站点获取所述信息。本试剂盒中可存在任何便利的方式。

下列实施例通过说明的方式而非限制的方式提供。

实验

I.结合动力学测定

A.材料与方法

描述于Osterfield等，Proc.Nat’lAcad.SciUSA(2008)150：20637-206340以及Xu等，Biosens.Bioelectron(2008)24：99-103的巨磁阻(GMR)传感器阵列被用于以下一般方案：

1.表面功能化：传感器表面被功能化以提供结合对构件在所述传感器表面的稳定结合，结合对构件的实例如，捕获抗体、第一种生物分子，等等。诸如聚乙烯亚胺(PEI)这样的阳离子聚合物可被用于通过物理吸附将带电的抗体非特异性结合于所述传感器表面。或者，可利用所述抗体上的自由氨基或自由巯基基团使用共价化学反应。涉及用于寡核苷酸的稳定结合的表面功能化的另外细节提供于Xu等，Biosens.Bioelectron(2008)24：99-103并且对于抗体的稳定结合的表面功能化的另外细节提供于Osterfield等，Proc.Nat′lAcad.SciUSA(2008)150：20637-206340。目标结合对构件随后被接触所述传感器表面用以将所述结合构件稳定地结合于所述传感器表面。

2.在进行表面功能化和结合对结合之后，对所述传感器表面进行封闭以防止所述分析期间的非特异性结合。为封闭所述表面，包含1％BSA的PBS的封闭缓冲液被加入反应孔内一小时。可用的其它封闭方案被描述于Xu等，Biosens.Bioelectron(2008)24：99-103以及Osterfield等，Proc.Nat′lAcad.SciUSA(2008)150：20637-206340。

3.在封闭之后，使所述传感器表面与第一种目标生物分子的溶液如所述第一种生物分子的纯化溶液或包含所述第一种生物分子的复合样品接触。对于本步骤，使用包含～1nL-100μL溶液的反应孔并且根据应用孵育时间在5分钟至2小时的范围。

4.在孵育之后，使包含经目标标签(如，磁性纳米颗粒)进行预标记的第二种生物分子的溶液与所述传感器表面接触。

5.随后，检测所述第二种生物分子与所述第一种生物分子的结合动力学并且用于根据结合轨迹而计算结合速率常数。

B.结果与讨论

来自GMR生物传感器的实时数据被用于计算生物素-链霉亲和素相互作用的结合和解离速度(图3(a))。生物素化双链DNA被固定于所述传感器表面并且经链霉亲和素标记的磁性标签被加入所述系统。结合速度经计算为4.45×10⁶M^-1s^-1，拟合误差为3.2％并且k_M为4.4×10^-4s^-1。当使用BIAcore3000表面等离子共振(SPR)仪器时进行了相同的生物素-链霉亲和素结合实验并且测得结合速度为5.5×10⁶M^-1s^-1，接近于所述GMR传感器分析。

随后，论证了使用GMR传感器阵列进行抗体抗原结合动力学研究的能力(图2)。使用EpCAM蛋白在五至十组重复传感器上以100μg/mL和10μg/mL的浓度对所述阵列中的传感器进行功能化。使用该模型可以模拟经磁性标记的抗体与多种浓度的固定化抗原的结合过程。通过拟合数据(图3(b))，根据测定，对于选定的EpCAM抗体-抗原相互作用k_a为2.93×10⁵M^-1s^-1，k_d为2.83×10^-3s^-1，总拟合误差为3.4％并且k_M为4.2×10^-4s^-1。

进行了类似的实时实验以对高亲和性CEA抗原-抗体结合动力学进行定量。1μg/mL和10μg/mLCEA被固定于所述GMR传感器表面并且通过SPR分析对20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL和1.2μg/mL进行测试。在各个平台上监测了结合和解离速率常数并对结果进行比较(图3(c)和3(d))。再一次，GMR传感器阵列和SPR产生了类似的动力学速率常数。对于所述GMR生物传感器，k_a被测定为5.0×10⁴M^-1s^-1并且k_d为4.4×10^-4s^-1，而SPR实验产生了4.44×10⁴M^-1s^-1的k_a和1.17×10^-4s^-1的k_d。因此，这些结果显示磁响应性生物传感器可被用于精确测量结合速率常数。

II.用于抗体开发和药物筛选的蛋白质相互作用高通量分析和动力学模型

A.材料与方法

1.传感器

本实验中所使用的巨磁阻(GMR)传感器具有以下类型的底部自旋阀结构：Si/Ta(5)/晶种层/IrMn(8)/CoFe(2)/Ru/(0.8)/CoFe(2)/Cu(2.3)/CoFe(1.5)/Ta(3)，括号内所有数字单位为纳米。各个芯片均包含GMR传感器阵列，所述阵列通过300nm厚的Ta/Au/Ta导线(lead)被连接于周边结合垫(peripheralbondingpad)。为保护所述传感器和导线免于腐蚀，通过离子束溅射法沉积两个钝化层：首先，SiO₂(10nm)/Si₃N₄(20nm)/SiO₂(10nm)的薄钝化层被沉积于所有的传感器和导线之上，仅暴露结合垫区域；其次，SiO₂(100nm)/Si₃N₄(150nm)/SiO₂(100nm)的厚保护层被沉积于参比传感器和导线之上，暴露出活性传感器和结合垫区域。在图案化之后的磁阻比率约为12％。所述自旋阀的钉扎方向(pinningdirection)在平面内并且垂直于所述传感器条。通过形状各向异性将所述自由层的易磁化轴设定为平行于所述传感器条。这种结构允许所述GMR传感器在其MR转移曲线的最为敏感区域工作。

由于所述GMR效应，所述传感器的电阻随两个磁性层的磁化取向而变化，所述两个磁性层由铜间隔层进行分隔：

$R\left(\mathrm{\θ}\right)=R_0-\frac{1}{2}\mathrm{\δ}{R}_{\max }\cos \mathrm{\θ}---(M.1)$

此处，R0是零磁场下的电阻，δR_max是最大电阻变化并且θ是所述两磁性层之间的磁化方向间夹角。在所述底部自旋阀结构中，底部磁性层(扎层)的磁化被钉扎于固定方向，而顶磁性层(自由层)的磁场取向能够随外部磁场自由转动。因此，所述磁性标记物的杂散场(strayfield)可改变所述自由层的磁化并且因此改变所述传感器的电阻。

2.磁性标记物

所述磁性标记物获自MiltenyiBiotechInc.，其称为“MACS”颗粒。各MACS颗粒是10nm的Fe₂O₃纳米颗粒的团簇，其通过葡聚糖基质相互结合。由于Fe₂O₃纳米颗粒的细小尺寸，MACS颗粒具超顺磁性，其总体直径为50nm并且包含10％的磁性物质(重量/重量)。使用对应的要研究的分析物对MACS颗粒进行功能化，如对于EpCAM(CEA，VEGF)实验，使用EpCam(CEA，VEGF)抗体对MACS颗粒进行功能化；对于生物素-链霉亲和素实验，使用链霉亲和素对MACS颗粒进行功能化。

3.表面化学

首先使用丙酮、甲醇和异丙醇洗涤所述传感器表面。随后，所述传感器被暴露于氧等离子体三分钟。将2％(w/v)的聚烯丙基胺去离子水溶液涂覆于所述传感器5分钟。根据需要可使用其它溶液，例如但不限于，包括酐类、聚羧酸烯丙酯等在内的溶液。随后使用去离子水洗涤芯片并且在150℃下烘烤45分钟。对于羧化表面，随后在室温下将10％(w/v)的EDC溶液和10％(w/v)的NHS溶液加至所述传感器表面1小时。捕获蛋白(EpCAM(来自RDSystems的960-EP-050)、CEA(来自RDSystems的4128-CM-050)或VEGF(来自RDSystems的293-VE165))，或捕获抗体(EpCAM的抗体(来自Abcam的ab20160或来自R&D的960)、CEA(来自BiosPacific的5910)或VEGF(来自Abcam的ab69479))以360皮升的液滴通过机器人加至各个传感器上三次(总体积1钠升)。为监测重现性，使用相同的捕获蛋白对随机分布于所述GMR传感器阵列中的3至8个传感器进行孵育。以类似的方式使用1mg/mL的BSA或非互补性抗体(一般为500μg/mL的抗生存素(survivin)抗体(H00000332-P01，来自NovusBiologicals，LLC))对对照传感器进行固定化。使用1mg/mL的BSA的PBS溶液对所述传感器阵列的整个表面进行30分钟的封闭。

4.动力学分析

或者，所述动力学分析可如下进行建模：

在使用适当的捕获蛋白对所述传感器表面进行功能化之后，将GMR传感器阵列置于测试器(teststation)内并进行实时监测。洗去BSA封闭缓冲剂并将50μL的磁性标记的检测抗体溶液(根据上文制备)加至反应孔内。在磁性标记的检测抗体与对应蛋白质结合的时间里对所述GMR传感器阵列进行监测。可随后对各个蛋白质所特有的结合曲线进行作图并且可测定结合速率常数。所述分析进行5分钟。

5.模型和拟合

两分子相互作用以产生一种产物的过程可归纳为：

$C_S+L\↔n$

其中C_S是溶液中处于所述表面附近的反应物浓度，L是处于所述表面上的配体或受体浓度，n是所述相互作用的产物的表面浓度。在简单模型中，假定所述反应物中的至少一种是过量。但是，在本文所述的模型中，处于所述传感器表面上的反应物受体并未受到补充。因此，L与n之和应等于L的原始浓度。

对于模型[L]₀＝[n_max]，其中n_max受限于紧密堆积的MNP的最大浓度而非处于所述表面的分析物的最大浓度。使用GMR生物传感器阵列监测在给定的时间与其目标结合的磁性标记的抗体数量n(t)。为对该相互作用的结合速率常数进行定量，通过假定反应物在体积V内和反应传感器表面A内保持质量不变来导出分析模型。下文方程M1.1表达了所述溶液中被标记的抗体的变化速度，而方程M1.2表达了所述标记的抗体对所述传感器表面的结合速度：

$V\frac{d{C}_S}{\mathrm{dt}}=-A{k}_{\mathrm{on}}{C}_S(n_{\max }-n)+A{k}_{\mathrm{off}}n---\left(M1.1\right)$

$A\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=A{k}_{\mathrm{on}}{C}_S(n_{\max }-n)-A{k}_{\mathrm{off}}n---\left(M1.2\right)$

其中C_s是所述传感器表面的磁性标签化的抗体的浓度，C₀是磁性标签化抗体的本体浓度(bulkconcentration)，n_max是所述传感器表面单位面积内的潜在结合位点的最大摩尔数，并且n是已经形成在所述传感器上的被结合的MNP-抗体-抗原复合体的表面浓度。V是所述传感器上的溶液体积，A是反应面积(在这种情况下是各传感器的表面积)。此外，k_on是结合速率常数，k_off是解离速率常数。

该方程组可通过假定koff为零而进行简化，这是因为抗体-抗原解离在本实验的时间尺度内可忽略不计。因此，通过将简化的方程M1.1和M1.2相加，所述守恒表达式如下：

$V\frac{d{C}_S}{\mathrm{dt}}+A\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=0---\left(M1.3\right)$

假设边界条件为t＝0、n＝0和C_s＝C₀，得C_s＝C₀-nA/V，因此

$\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}(C_0-n*\frac{A}{V})(n_{\max }-n)---\left(M1.4\right)$

括号内的项分别表示本体反应物和有效表面位点的消耗。该方程具有方程M1.5的解析解，其精确地对观察所得的结合动力学建立了模型。

$n=C_0\frac{V}{A}\left[\frac{1-e^{-k_{\mathrm{on}}(A/V)(C_0(V/A)-n_{\max })t}}{\frac{C_{0}V}{n_{\max }A}-e^{-k_{\mathrm{on}}(A/V)(C_0(V/A)-n_{\max })t}}\right]---\left(M1.5\right)$

C_s是传感器表面的磁性标签化的抗体的浓度，C₀是磁性标签化抗体的本体浓度(bulkconcentration)，n_max是单位面积内的表面结合位点的最大摩尔数，并且n是已经形成在传感器上的被结合的MNP-抗体-抗原复合体的表面浓度。V是传感器上的溶液体积，并且A是所述反应面积(在这种情况下是各传感器的表面积)。所述溶液具有V/A的比率，其被认为特征性扩散高度。超过该特征化高度之上的溶液中的任何物质应不会在所述实验的时间范围内结合所述传感器。此外，k_on是结合速率常数，k_off是解离速率常数。

由于在体积和表面的动力学均被讨论，不同的维度；因此n和n_max被表达为摩尔/cm²，而C_s和C_o被表达为摩尔/cm³。通过以体积乘以所述溶液速度和以面积乘以所述表面速度，可在各个方程中以相同的单位表示结合速率常数(单位时间的摩尔数)。

存在四种拟合参数k_on、C₀、n_max和V/A(其为所述溶液的反应部分的有效厚度)。其中，k_on和V/A是“全局拟合参数(globalfittingparameter)”，其对于来自相同受体-分析物组对的所有的信号曲线是相同的；而n_max和C₀是“局部拟合参数(localfittingparameter)”，其对于不同的信号曲线会有所不同，这是因为分析物的表面浓度或抗体-MNP复合体的溶液浓度在所有实验中可能不是均匀的。

当C₀V/A＞＞n_max时，所述分析模型化简至所述Langmuir模型。

$n=n_{\max }(1-e^{-k_{\mathrm{on}}{C}_{o}t})---\left(M1.6\right)$

当假定在本实验的时间尺度内k_off可忽略不计时，该方程匹配所述Langmuir模型的解。上述方程与下文所述的方程M.25相同。

6.拟合误差

拟合误差如下进行定义：如果从一个芯片上测量了N个信号曲线，并且曲线j具有n_j个数据点，并且如果设D_i，j为曲线j中的第i个数据点，并且设S_i，j为模拟曲线j的第i个数据点，则对于信号曲线j的拟合误差为

$E_j=\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n_j}{\mathrm{\Σ}}}{\left(\frac{S_{i,j}-D_{i,j}}{D_{\max ,j}}\right)}^2}---(M.2)$

其中D_max，j是信号曲线的最大信号。通过该方式，将传感器阵列中的各个实验结合曲线与由该模型所预测的结合曲线进行了比较。随后对该误差进行最小化以获得最佳拟合并计算k_on。绝对误差通过所述信号曲线的最大信号进行计量，因此所述拟合误差是信号水平的百分比。因此，大信号曲线的基于百分比的相对拟合误差与小信号曲线类似。总拟合误差为：

$E=\sqrt{\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{E}_j^2}---(M.3)$

该总拟合误差在本文所提供的动力学数据的拟合中进行最小化。

7.传统的二室模型

溶液中的配体与表面上的捕获剂的结合动力学可以模化为二室反应。这使反应和传输动力学均得以被并入模型，其中所述表面区室中的可溶配体与所述表面通过结合和解离的化学过程进行反应(参见图2)，并且通过来自本体区室的扩散、流动和对流(convection)而逐步受到补充。在各区室之中，所述浓度被假定在空间内是均一的，但是可随时间而变化。本体区室中的配体浓度C₀被假定为恒定不变，而处于表面区室中的配体浓度C_s由于所述结合反应而被消耗，但是通过本体中的配体的扩散和表面结合复合体的解离而得到补充。该二室反应可被如下描述：

$C_0\stackrel{k_M}{\→}{C}_s---(M.4)$

$C_s+R\underset{k_{\mathrm{off}}}{\overset{k_{\mathrm{on}}}{\↔}}n---(M.5)$

其中C_s和C₀是处于所述表面区室和本体区室中的磁性标签化抗体的溶液浓度，R是固定化于所述表面的配体和受体的表面浓度(即，有效结合位点的表面密度)，n是结合的MNP-抗体-抗原复合体的表面浓度，k_M是扩散限制速率常数，k_on和k_off分别是结合和解离速率常数。C_S和n的净反应速度可通过以下方程组合进行定义：

$V\frac{d{C}_S}{\mathrm{dt}}=V{k}_M(C_0-C_S)-A{k}_{\mathrm{on}}{C}_{S}R+A{k}_{\mathrm{off}}n---(M.6)$

$\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}{C}_{S}R-k_{\mathrm{off}}n---(M.7)$

由于在体积中和表面上均进行了动力学分析，因此R、n和n_max被表达为摩尔m^-2，而C_S和C₀被表达为摩尔m^-3。通过以表面区室体积V乘以溶液速度，并且以传感器的面积A乘以表面速度，各个方程可以以相同的单位进行表示(摩尔/s)。处于时间t＝0的起始条件为C_S＝C₀和n＝0。在释放测量中，所有反应物被洗去，所以C₀＝0。

数值解法可被用于解方程M.6。表面等离子共振(SPR)的实验设置限制了所述二室模型的简化。使用SPR，所述可溶配体是非标记的(其导致快速扩散)并且其以高流速被引入所述反应表面。因此，所述物质传输限制的速率常数k_M可在所观测到的动力学相互作用中发挥主要作用。

8.具有解析解的经修正的二室模型

与SPR仪器运行呈对比，单孔GMR传感器系统的实施方案利用了标记物以增强分子结合事件的信号并且在测量中无人为的流动(deliberateflow)。所述标记物的大小(如，46nm)和流动的缺乏显著地降低了所述可溶配体在本体区室和表面区室之间扩散和对流的速度。如果扩散速度显著地低于反应速度，传统的二室模型有可能被化简成为可进行解析求解的修正形式。

为验证这一假设，使用数值解法对方程M.6和M.7进行求解以拟合EpCAM的实时结合数据(示于图5(a))。我们的磁性标记抗体所得的k_M为约1.0×10^-4s^-1。因此，根据图13所示以及下段的解释，可对结合速度、解离速度(假设k_off对于大多数抗体处于1.0×10^-6s^-1的数量级)和扩散速度的贡献进行作图以确立方程M.6中各个组分的相对重要性。

通过速度方程M.6，所述方程右侧各项被作为表面结合的EpCAM抗体-抗原复合体的数量n的函数进行作图(图13)。根据150个表面结合的MNP产生1ppm的MR信号的关系将归一化的MR信号(单位是ppm)转化成为n(单位是摩尔/μm²)(参见图7)。在整个结合反应过程中，所述结合速度项与所述解离速度和扩散速度项相比均保持高出几个数量级。因此，所述磁性纳米颗粒标记物大到足够显著地减缓所述磁性标记的抗体向所述表面区室中的扩散。这暗示可溶抗体-MNP进入所述表面区室的再生过程可忽略不计(即，k_M～0)。此外，图13显示在这些结合实验中对k_off可忽略不计的假设是有效的。但是，正如下文即将表明，k_off在释放动力学的测量中并非可忽略不计。

图13示出了描述方程M.6中各项贡献的对数图，该方程是结合于所述传感器表面的磁性标记抗体数量的函数。图5(a)中所示的EpCAM结合实验数据被用于对该图的k_on、k_off和k_M进行数值计算。x-轴表示在结合反应过程中结合于所述传感器表面的磁性标记的抗体的表面浓度(图中n值来自于实际实验数据)。在n＝0时所述实验开始，并且在n～120摩尔/μm²时信号接近达到饱和或所述结合实验结束。在整个结合反应过程中，所述结合速度项与所述解离速度和扩散速度项相比均保持高出几个数量级。因此，对k_off可忽略不计的假设是有效的(因为k_off曲线远低于k_on曲线)。此外，所述磁性纳米颗粒标记物大到足以仅仅允许磁性标记的抗体向所述反应区室的缓慢扩散(因为所述k_M曲线远远低于所述k_on曲线)。这暗示可溶抗体-MNP进入所述表面区室的递送可忽略不计(即，k_M约为零)。

由于所述表面区室中的MNP抗体并而受到来自主体区室的缓慢扩散的充分补充，因此质量平衡需要处于所述表面的溶液中未反应抗体-MNP浓度C_S等于初始浓度C₀减去产物形成所消耗的量n_A与体积V的商，如：

$C_S=C_0-n\frac{A}{V}---(M.8)$

类似地，质量平衡需要自由结合位点的表面浓度R等于其初始表面浓度R₀与MNP-抗体-抗原复合体形成中所消耗的量之差。R₀的量级必须略低于处于所述表面之上的紧密堆积的MNP的最大浓度，从而避免“亲合力效应(avidityeffect)”，在该效应中一个MNP与多个抗原结合。因此，R₀被替代为抗原的最大沉积表面浓度n_max，如下所示：

R＝R₀-n＝n_max-n(M.9)

因此，方程M.7化简为：

$\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}(C_0-n\frac{A}{V})(n_{\max }-n)---(M.10)$

此处括号内的两项分别代表标签化抗体在所述表面区室中的消耗以及有效表面结合位点的降低。方程M.7在此具有以下的分析解：

$n=n_{\max }\left[\frac{1-e^{-k_{\mathrm{on}}(C_0-n_{\max }A/V)t}}{1-\frac{n_{\max }A}{C_{0}V}{e}^{-k_{\mathrm{on}}(C_0-n_{\max }A/V)t}}\right]---(M.11)$

众多可进行分析求解的动力学模型需要所述相互作用中的反应物之一保持过量以产生分析解。但是，根据方程M.11中的模型，两种反应物在所述结合过程中可被显著地耗尽。该模型的灵活性实现了更为一般化的实验组合在不违背严格反应条件的情况下的实施。此外，多数动力学模型需要所述系统达到平衡以测定结合速率常数。但是，使用本文所示的模型，不是必须达到平衡并且所述结合速率常数可在5分钟或更短时间内被测定，其远在饱和之前。

所述分析模型中存在五个参数，k_on、C₀、n_max、V和A。在其中，k_on、V和A对于所有曲线被固定为相同值，而在分析物表面浓度或抗体-MNP复合体的溶液浓度被改变的情况下n_max和C₀会有所不同。

9.分析模型可化简为Langmuir吸附

当C₀V/A＞＞n_max时，对应于所述表面区室中可忽略的反应物损耗，方程M.10化简为：

$\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}{C}_0(n_{\max }-n)---(M.12)$

并且该分析模型化简为Langmuir模型。因此，方程M.11化简为：

$n=n_{\max }(1-e^{-k_{\mathrm{on}}{C}_{o}t})---(M.13)$

结合k_off可忽略不计的附加假设，该结果符合Langmuir结合动力学。我们的结合数据与Langmuir模型之间的比较示于图14。分析模型的这一化简形式方程M.13与下文所导出(方程M.14-25)并示于方程M.25中的Langmuir等温线相同。

图14示出了根据Langmuir吸附模型所预测的(虚线)和实验测得的(实线)抗EpCAM抗体对表面固定化的EpCAM抗原的结合曲线。以2×的系列稀释度将EpCAM蛋白的表面覆盖从5阿摩尔(对应于n_max)稀释降至19.5仄摩尔(对应于n_max/256)。根据所述叠置图，所述Langmuir吸附模型并未充分描述所述GMR传感器对于测试的浓度组所观察到的实时结合动力学。因此，产生了新的模型从而对观察到的所述结合动力学进行更好地描述。本文所示的分析模型包含用于解释信号的快速开始和较缓慢持续升高的附加项。

所述Langmuir等温线在固定的温度下使固体表面的分子覆盖或吸附关联于所述表面上方的介质浓度。可通过考虑表面配体L、悬浮于所述介质中的标记分子C以及吸附分子复合体CL而导出所述Langmuir方程，随后所述吸附过程可被表示为

$C+L\↔\mathrm{CL}---(M.14)$

所述结合速度R_a和解离速度R_d分别为，

R_a＝k_on[C][L](M.15)

R_d＝k_off[CL](M.16)

其中k_on和k_off是结合速率常数和解离速率常数，并且方括号表示浓度。

如果总有效配体浓度为[L_max]，并且吸附分子的归一化表面覆盖为θ，则

[L]+[CL]＝[L_max](M.17)

θ＝[CL]/[L_max](M.18)

因此，[L]如下：

[L]＝(1-θ)[L_max](M.19)

将方程M.19和M.18分别代入方程M.15和M.16，可得如下：

R_a＝k_on(1-θ)[L_max][C](M.20)

R_d＝k_offθ[L_max](M.21)

假定k_off在本实验的时间尺度内可忽略不计，并对R_a求解，得出：

$R_a=\frac{d\left[\mathrm{CL}\right]}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}(1-\mathrm{\θ})\left[L_{\max }\right]\left[C\right]---(M.22)$

$\frac{d\left[\mathrm{CL}\right]}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}\left(\right[L_{\max }]-[\mathrm{LC}\left]\right)\left[C\right]---(M.23)$

$\∫\frac{d\left[\mathrm{CL}\right]}{\left[L_{\max }\right]-\left[\mathrm{CL}\right]}=\∫k_{\mathrm{on}}\left[C\right]\mathrm{dt}---(M.24)$

假定[C]不依赖于于时间并且[L_max]不依赖于[CL]，并且通过分部积分进行求解，其解如下：

$\left[\mathrm{CL}\right]=\left[L_{\max }\right](1-e^{-k_{\mathrm{on}}\left[C\right]t})---(M.25)$

10.释放动力学模型：

抗体以极高的亲和性结合其目标。因此，所述解离速率常数一般较小，其需要更长的时间(如，分钟)以观测到这种释放现象。此外，由于抗体的活动性，使用竞争抑制来监测释放动力学。通过在溶液中置入高浓度的目标，可观测到所述释放动力学更为精确的测量。

抗体释放速度的速度方程可如下列出：

$n\stackrel{k_{\mathrm{off}}}{\→}{C}_s+L---(M.26)$

$\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=-k_{\mathrm{off}}n---(M.27)$

因此，加入所述释放溶液之后在时间t的表面结合MNP-抗体浓度为：

$n_{\mathrm{Release}}\left(t\right)=n_{\max e}-k_{\mathrm{off}}t---(M.28)$

其中是n₀为传感器表面的初始吸附MNP-抗体浓度。

B.结果与讨论

提供了测量结合动力学方法，所述方法使用可各自独立寻址的磁性响应的纳米传感器同时地监测多种不同蛋白质的动力学，所述不同蛋白质与固定化于传感器表面的标靶结合。这些磁性纳米传感器被成功地扩展至每1mm²芯片面积超过1,000个传感器。展示了分析物的表位分布并且对溶液中的蛋白质扩散的空间动力学进行了可视化。结合这些实验，可产生对标记的蛋白质与表面固定化的蛋白质的实时结合进行精确描述的分析动力学模型。所述分析模型与使用表面等离子共振进行的类似实验以及来自文献的数据具有紧密的一致性。该模型可以20仄摩尔(20×10^-21)或更低溶质的敏感度应用于抗体-抗原结合。

1.GMR传感器

使用磁性纳米颗粒(MNP)对可溶配体进行预标记以监测配体与固定于所述传感器表面的抗原的复合体的实时结合动力学(图4(a))。在所述复合体被捕获的实时过程中，来自所述抗体-MNP复合体的磁场诱导其下的GMR传感器的电阻变化。由于所述GMR传感器阵列的快速实时读出，所述结合动力学被监测并且定量以测定结合速率常数。

根据TEM分析所测定，对目标蛋白质或抗体进行标记的MNP是包埋于葡聚糖聚合物中的12个10nm的氧化铁核(图4(b))。整个纳米颗粒平均直径46±13nm(根据动态光散射测量的数值)。根据斯托克斯-爱因斯坦关系(Stokes-Einsteinrelation)，这些颗粒具有约8.56×10^-12m²s^-1的平动扩散系数。所述MNP具有-11mV的电动电位。这些颗粒是超顺磁性的并且是胶体稳定的，因此它们在所述反应期间并不聚集或沉淀。此外，所述GMR传感器以来自所述磁性标签的偶极场的基于接近度的检测器的形式运行；因此仅检测传感器表面的150nm以内的标签。因此，未结合的MNP标签在缺乏结合的情况下贡献可忽略的信号。仅仅被结合的磁性标记的抗体可被其下的GMR传感器测出，这使得这种MNP-GMR纳米传感器可用于实时动力学分析。

GMR传感器阵列被制造成在1mm²芯片表面积上有1,008个传感器(图4(c))。所计算出的特征密度为每cm²超过100,000个GMR传感器。所述传感器阵列被设计为亚阵列组的形式，其中各亚阵列占据90μm×90μm的面积(图4(d))。所述传感器阵列适配于自动点样仪(roboticspotters)。亚阵列中的各个传感器通过行列解码器经由使用VLSI技术制造的共享6-位控制总线进行可各自独立地寻址。所述GMR传感器阵列允许蛋白质结合动力学的平行多元监测。

图12中示出了所述GMR传感器的另一个实施方案。在图12中，12个延伸的线性磁性传感器段被以并联的方式连接在一起，并且6组这样的并联段被以串联的方连接在一起，其给出了具有总计72个磁性传感器段的磁性传感器。所述磁性传感器为100μm×100μm。各个磁性传感器段为750nm宽，20nm厚和100μm长。图12中的插图示出了与磁性传感器段结合的纳米颗粒的SEM图像。

2.结合动力学模型：

根据上文描述，产生了能够拟合实施结合动力学数据从而使技术人员能够计算结合速率常数(k_on)和解离速率常数(k_off)的分析模型。

所述结合反应是二步过程，其中本体溶液中的抗体首先通过扩散和流动接近被表面捕获的抗原，并且随后通过结合与解离的化学过程与表面结合的标靶结合或从其上逃逸。如果本体体溶液中的抗体浓度在空间上是均一的，则

$C_S=C_0-n\frac{A}{V}---\left(1\right)$

其中C_s是位于所述传感器表面的磁性标记的抗体的浓度，C₀是磁性标签化的抗体的初始本体浓度，并且n是被结合的MNP-抗体-抗原复合体的表面浓度。V是参与所述结合反应之中的传感器上的溶液体积，A是所述反应面积(在本情况下是一个传感器的表面积)。根据简单动力学，所述表面反应被描述如下：

$\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}(C_0-n\frac{A}{V})(n_{\max }-n)-k_{\mathrm{off}}n---\left(2\right)$

括号内的两项分别对应本体反应物和有效的表面位点，n_max是传感器表面的潜在结合位点的浓度，k_on是结合反应的结合速率常数，并且k_off是结合反应的解离速率常数。在讨论体积和表面浓度之时，n和n_max被表达为摩尔m^-2，而C_s和C₀被表达为摩尔m^-3。注意n_max由紧密堆积的MNP最大浓度限定，而不是由表面上的分析物的最大浓度限定。因此，为排除与MNP在所述传感器表面的聚集相关的空间效应，受测的最高分析物表面浓度至多为紧密堆积的抗体-MNP复合体表面浓度的十分之一。

该方程可通过假定k_off为零而进行简化，这是因为抗体-抗原解离在本实验的时间尺度内可忽略不计。方程2在此具有以下的分析解：

$n=n_{\max }\left[\frac{1-e^{-k_{\mathrm{on}}(C_0-n_{\max }A/V)t}}{1-\frac{n_{\max }A}{C_{0}V}{e}^{-k_{\mathrm{on}}(C_0-n_{\max }A/V)t}}\right]---\left(3\right)$

如果C₀V＞＞n_maxA，这暗示超过有效表面位点的过量溶液分子，则所述动力学遵循Langmuir吸附。然而，当不处于该情况之时，所述溶液的反应物被显著消耗，尤其是接近所述传感器表面，因此反应速度将由于后续反应物在反应前需要进行跨宏观距离(～V/A)的扩散而被减缓(特别是对于标记的分子)。通过定义参与所述结合反应的流体厚度，即可用于结合所述表面的溶液区室，而将这一特征扩散距离V/A计入该动力学模型之中。超过所述特征V/A高度的任何溶质在相关时间范围内可能未在所述结合反应中有所贡献。

C.实验结果

为检验该解析解，使用上述模型测定了上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体-抗原结合动力学并将所述实验结果与文献进行了比较。

结合于传感器的分子的改变浓度

在图5所示的第一组实验中，进行了MNP标记的抗EpCAM抗体与表面结合的EpCAM蛋白质的结合分析。所述模型中的是C₀、n_max和V/A是根据尺寸和浓度所确定的固定值，并且通过以所述动力学模型所预测的结合曲线对实验数据进行的最佳拟合来确定k_on。进行了固定浓度的MNP-抗EpCAM抗体对改变浓度的表面结合EpCAM蛋白的结合分析。使用二倍稀释以制备一系列的传感器表面；其起始于5阿摩尔EpCAM蛋白的加载量(例如，结合于所述传感器表面并且具功能的蛋白质的量)并且进行依次稀释低至20仄摩尔。在结合曲线间变化的唯一参数是n_max，所有其它参数都是不变的。当使这一参数在所述模型中变化时，各实验结合曲线被精确地拟合(图5(a))。所述参数的数值为(未经稀释)n_max＝9.5×10^-10molm^-2，C₀＝6.8×10^-7M，A＝5.4×10^-9m²以及V＝5.5×10^-12m³。因此，k_on＝2.5×10⁴M^-1s^-1对所述数据进行了最佳拟合。本实验中的全部曲线对通过所述模型所预测的曲线的拟合误差为R²＝0.98。此外，在将所述MNP-抗体溶液洗去并用抗原加载缓冲液替换之后，通过将随后的数据对基本指数衰减模型进行拟合而计算解离速率常数，n_Release(t)＝n_maxe^-koff(t)，其中n₀是结合MNP在洗涤时的表面浓度。因此，所述抗EpCAM抗体-抗原解离速率常数k_off被测定为2.0×10^-6s^-1。这证实了上文对于k_off与k_on相比较时可忽略不计的假设。

分析混合物中的改变浓度的分析物

在图5(b)所示的第二组实验中，使用833仄摩尔的EpCAM蛋白的恒定加载量((图5a)所使用的最大量的1/6)对各个传感器进行固定化。涂覆于所述传感器的抗体-MNP复合体的浓度在未稀释、两倍稀释和八倍稀释的抗体-MNP复合体溶液之间变动(对应于所述模型中的C₀、C₀/2和C₀/8)。由于无论C₀被改变还是n_max被改变，抗体-抗原相互作用均保持相同，描述以上相互作用的速率常数在这些实验中保持相同。在对模型的拟合之中，获得了2.5×10⁴M^-1s^-1的相同k_on，这支持了所述分析模型的有效性。全部曲线对通过所述模型的拟合误差为R²＝0.96。这些结果处于文献所报道的正常范围之内，这证实了所述动力学模型对于预测结合的有效性以及所产生的结果的精确度(参见表1)

为对MNP-抗癌胚抗原(CEA)抗体与CEA的结合动力学，MNP-抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体与VEGF的结合动力学，以及MNP-链霉亲和素与生物素的结合动力学进行定量而进行了类似的实时实验(图6(a)和6(d))。对于抗-CEA抗体，在GMR传感器和SPR仪器上均使用相同的试剂对结合和解离速率常数进行了监测并对结果进行了比较(图6(c)和6(d))。

图6(a)所示为在12组重复传感器上的抗CEA抗体对抗原的多元动力学分析以及在3组重复传感器上的抗VEGF抗体对抗原的多种动力学分析图。CEA抗体-抗原的k_on为3.3×10⁴M^-1s^-1，其平均拟合误差为2.8％，并且VEGF抗体-抗原的k_on为1.6×10⁴M^-1s^-1，其平均拟合误差为8.2％。图6(b)示出了监测生物素对链霉亲和素的结合动力学的25组重复传感器示图。k_on为4.67×10⁶M^-1s^-1，其平均拟合误差为1.6％。还是用竞争生物素分析监测了释放动力学。图6(c)示出了SPR图并且图6(d)示出了基于磁纳米传感器的平台，当在平行实验中监测CEA抗体与CEA抗原结合的动力学时所述平台提供了类似的实时结合曲线。GMR生物传感器提供了5.0×10⁴M^-1s^-1的k_on以及4.4×10^-4s^-1的k_off，而SPR实验产生了5.2×10⁴M^-1s^-1的k_on以及3.03×10^-4s^-1的k_off。SPR的动态范围低于两个数量级，而所述GMR传感器具有4个数量级或更大的动态范围。GMR传感器的动态范围可使用更高的溶质浓度而进一步提高。在图6(d)中，所述结合曲线的最初1000秒被用于获得根据所述分析模型的k_on值。

所述GMR传感器阵列和SPR测量产生了相互一致的动力学速率常数并且一致于文献所报道的数值(表1)，这表明当使用本文给出的分析模型之时所述MNP标记对于所测得的速率常数基本无影响。

表1

表1示出了当使用所述GMR传感器阵列和SPR之时，对生物素与链霉亲和素结合的结合速率常数、EpCAM抗原与EpCAM抗体的结合速率常数、CEA抗原与CEA抗体的结合速率常数以及VEGF抗原与VEGF抗体的结合速率常数的比较。对于SPR和GMR传感器实验均使用了相同的抗体对。动力学分析的两种方法均与文献相一致。

与传感器结合的磁性标签数量的定量

扫描电子显微镜(SEM)证实，所述分析系统能够对各个传感器之上所捕获的蛋白质数量进行定量。因此，通过将所述GMR信号对结合于所述传感器表面的磁性标签的绝对数量进行校准而获得了所结合的蛋白质的量和每MNP所产生的信号。例如，在三至八组重复传感器上，EpCAM蛋白从2.5阿摩尔开始被以两倍的降幅进行系列稀释直至78仄摩尔。向全部传感器添加20倍稀释度的MNP-抗体复合体并监测所述结合动力学。在20分钟的孵育时间之后，洗去磁性标记的抗体的溶液以终止所述结合反应，在该点通过SEM对具有各个表面浓度的传感器进行成像(图7)。通过对所述实时实验数据进行归一化并且将其对所述模型进行拟合，以对所述初始MR(ΔMR/MR₀)进行归一化的MR形式测得的传感器信号被转换成为与各传感器结合的磁性标签的数量。例如，使用2.5阿摩尔的EpCAM蛋白进行功能化的传感器在所述实验时间内捕获了192,000个磁性标签。SEM成像显示所述实验结果符合所述动力学模型。因此，所述动力学模型可被用于对各传感器所结合的标签数量以及给定反应期间结合的蛋白质数量进行定量。

使用该模型，每150个MNP产生1ppm的信号。所述传感器的检测下限(LOD)约为20ppm(通过经非互补抗体包埋的传感器的平均背景信号加上两倍标准差所定义)。因此，可检测0.6颗粒/μm²或者更低。

此外，所述模型能够解释所述传感器表面将在何时发生饱和。随着提高分析物的加载量以使蛋白质的表面浓度接近所述传感器表面的最大MACS浓度，可在所述信号中观察到饱和。该饱和在5阿摩尔或更高的加载量下发生。所述加载量通过将已知浓度和体积的蛋白质沉积于所述传感器表面而进行计算。在洗去所述未反应蛋白质之后，使用纳米颗粒对结合蛋白质的量进行标记。通过扫描电子显微镜对具活性的并且被结合的蛋白质的数量进行定量。在5阿摩尔或更高的加载量下，纳米颗粒间的空间效应变得明显。在全部实验中使用了5阿摩尔或更低的加载量。当在传感器表面沉积低蛋白质浓度时，所述传感器表面的结合蛋白质的距离将超过1个MNP直径，由此防止了各个纳米颗粒结合超过一个抗原。例如，在所检测的最高加载量5阿摩尔下，所述传感器表面的平均距离约为60nm。由于所述MNP直径仅为46nm，单一MNP结合极不可能同时结合超过一个被结合蛋白。因此，亲合力(例如，两个或更多个分子之间的多重结合相互作用的组合强度)基本可忽略不计。例如，当在传感器表面沉积10阿摩尔蛋白质时，实验中显现当与5阿摩尔和更低量的信号相比所述传感器表面接近饱和(图8)。通过所述模型，10阿摩尔的加载量据描述相当于n_max等于1.95×10^-9molm^-2。当将所述模型预测的这一饱和值与所述传感器的物理限制和紧密堆积的MNP几何形状进行比较时，这些数据紧密吻合。单层中受限于MNP大小的蛋白质最大表面浓度为1.0×10^-9摩尔m^-2。

表位定位

使用本文所述的实时结合分析和动力学模型进行表位定位实验。将一组不同的抗EpCAM单克隆抗体固定于所述GMR传感器。使用抗EGFR抗体进行功能化的传感器作为内部对照被包含在内。随后将EpCAM加入溶液中并且对以独特的结构在各个捕获抗体上被捕获。随后加入EGFR蛋白。如果所述捕获的EpCAM暴露出EGF样重复，则EGFR能够进行结合。然而，如果所述捕获的EpCAM蛋白以遮蔽所述EGF样重复的方式取向，则EGFR不能进行结合(图9(a))。

图9(b)显示，抗EpCAM抗体#1结合EpCAM蛋白以暴露所述EGF样结构域；然而，EpCAM-抗-EpCAM抗体#2复合体遮藏了所述EGF样结构域。使用特异于EpCAM的独特表位的单克隆抗EpCAM抗体对抗EpCAMAb#1传感器和抗EpCAMAb#2传感器进行功能化。当EpCAM结合抗EpCAM抗体#1时，EGF样结构域被暴露并且抗EGFR抗体-MNP复合体能够进行结合。然而，当被捕获的EpCAM蛋白结合于抗EpCAM抗体#2时，EGF样结构域未被暴露并且不发生结合。

当将所述抗EGFR抗体-MNP复合体与由EpCAM或由EGFR捕获抗体所捕获的EGFR蛋白的结合曲线进行归一化时，所述归一化结合曲线显示结合的动力学相同(图9(c))。即使各个传感器上的大分子结构配制有所不同，所述动力学相互作用仍然相同。在图9(c)中所述结合曲线被归一化。由于两曲线遵循相同的结合轨迹，这两个实验所涉及的动力学相互作用相同。

分子结合相互作用的空间和时间监测

使用所述实时结合分析进行的另一个实验是在空间(由于所述阵列结构的高密度)和时间(由于迅速和实时的读出)上对蛋白质结合事件进行监测。单克隆抗CEA捕获抗体被结合于传感器阵列。在递送所述CEA抗原蛋白质之前，将溶液中以抗CEA抗体标记的磁性标签在所述传感器阵列之上进行孵育。将CEA抗原注入所述阵列，并且当的磁性标记的检测抗原与被捕获的CEA抗原蛋白质结合时，对CEA抗原在所述阵列上的扩散进行监测。CEA抗原蛋白与所述传感器表面的结合以及随后磁性标记的抗体的结合沿着空间分布的传感器产生MR信号的变化。通过观测所述MNP-抗-CEA抗体与所述结合于传感器的CEA抗原的结合动力学而对CEA抗原与所述传感器的结合进行了可视化(图10和图11(a)和11(b))。对四个四磁性传感器组检测了所述信号随时间的变化(图11(a)和11(b))。以高空间和时间分辨率对蛋白质结合事件、蛋白质扩散和蛋白质动力学进行了分析。可通过使用蛋白质扩散模型拟合不同传感器位点的MR信号的时间过程而产生传输参数，诸如被注入蛋白质的扩散率。

实验结果显示，本文公开的实时磁性传感器装置是用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的高通量、高敏感度、实时的结合分析。以上产生的动力学模型提供了参与标记蛋白质-蛋白质相互作用的主要过程的分析模型。所述实时分析结合分析和分析模型被用于测量蛋白质结合速率常数以及对结合于给定传感器的蛋白质数量进行精确定量。还进行了蛋白质表位定位实验和蛋白质扩散实验。

尽管通过说明和实施例已经对前述发明进行了以明确和了解为目的的一定细节的描述，本领域的技术人员通过本发明的指导易于了解，在不背离由附属权利要求书精神和范围的前提下可以作出特定改变和修改。

因此，前文仅仅是对本发明的原理的说明。应当了解，本领域的技术人员应能够设计多种装置，尽管未在本文明确描述或展示，所述装置具体实施了本发明的原理并且被包含于本发明的精神和范围之内。此外，本文描述的全部实施例和和条件性语言主要意在用于帮助读者理解本发明的原理以及发明人在现有技术基础上作出的构思，并且不应解释为对具体描述的实施例和条件的限制。进一步，描述本发明原理、方面和实施方案的本文全部申明及其具体的实施例被用于涵盖其结构上的和功能上的等价物。此外，这些等价物被预期包含当前已知的等价物和未来所开发出的等价物，即，被开发的实施相同功能的任意元件，无论其结构如何。因此，本发明的范围并不意在受限于本文所展示和描述的示例性的实施方案。更确切而言，本发明的范围和精神由附属权利要求书所具体规定。

Claims (15)

1.一种定量地测定分子结合相互作用的结合动力学参数的方法，所述方法包括：

制备磁性传感器装置，所述磁性传感器装置包含反应孔，所述反应孔容纳与分析混合物接触的磁性传感器，所述分析混合物包含磁性标记的分子以产生可检测的分子结合相互作用；

从所述磁性传感器中获取实时信号；以及

由所述实时信号定量确定所述分子结合相互作用的结合动力学参数，其中，所述的定量确定包括利用二室拟合算法对实时信号进行处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合动力学参数是结合速率常数(k_a)、解离速率常数(k_d)与扩散限制速率常数(k_M)中的至少一个。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁性传感器包含特异地与所述磁性标记的分子结合的分子，并且所述接触包括将所述磁性标记的分子涂覆于所述磁性传感器。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁性传感器包含捕获探针，所述捕获探针特异地结合于与所述磁性标记的分子特异地结合的分子，并且所述接触包括将与所述磁性标记的分子特异地结合的分子和所述磁性标记的分子相继地涂覆于所述磁性传感器。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述磁性传感器包含捕获探针，所述捕获探针特异地结合于与所述磁性标记的分子特异地结合的分子，并且所述接触包括制备包含与所述磁性标记的分子特异地结合的分子和所述磁性标记的分子的反应混合物，并且随后将所述反应混合物涂覆于所述磁性传感器。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子结合相互作用选自核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用和蛋白质-核酸相互作用。

7.一种定量测定两种或更多种不同分子结合相互作用的结合动力学参数的方法，其中各个不同分子结合相互作用包括不同的磁性标记的分子，所述方法包括：

制备磁性传感器装置，所述磁性传感器装置包含反应孔，所述反应孔容纳两个或更多个不同的磁性传感器，各个磁性传感器与包含磁性标记的分子的分析混合物从而产生两种或更多种不同的分子结合相互作用；

从各磁性传感器中获取实时信号；以及

由所述实时信号定量确定所述两种或更多种不同的分子结合相互作用中每一种的结合动力学参数，其中，所述的定量确定包括利用二室拟合算法对实时信号进行处理。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述结合动力学参数是结合速率常数(k_a)、解离速率常数(k_d)与扩散限制速率常数(k_M)中的至少一个。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述分子结合相互作用选自核酸杂交相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用、受体-配体相互作用、酶-底物相互作用和蛋白质-核酸相互作用。

10.一种磁性传感器装置，其包含：

反应孔，所述反应孔容纳被配置为检测磁性标记的分子的磁性传感器；以及

被配置为从所述磁性传感器中获得实时信号并且通过利用二室拟合算法对所述实时信号进行处理而由所述实时信号定量确定分子结合相互作用的结合动力学参数的处理器。

11.根据权利要求10所述的磁性传感器装置，其中所述结合动力学参数是所述分子结合相互作用的结合速率常数(k_a)、解离速率常数(k_d)与扩散限制速率常数(k_M)中的至少一个。

12.根据权利要求10所述的磁性传感器装置，其中所述磁性传感器包含以串联和并联相连的四个或更多个感应区域。

13.根据权利要求10所述的磁性传感器装置，其中所述装置包含1000个或更多个不同的磁性传感器。

14.根据权利要求10所述的磁性传感器装置，其中所述装置进一步包含所述磁性标记的分子和与所述磁性标记的分子特异地结合的分子。

15.一种试剂盒，其包含：

(a)磁性标记物；和

(b)以下组成中的至少一种：

(i)计算机可读的媒介，其上储存有计算机程序，当计算机执行所述程序时，所述程序操控计算机利用二室拟合算法对获自包含容纳磁性传感器的反应孔的磁性传感器装置的实时信号进行处理，来从所述实时信号定量地确定分子结合相互作用的结合动力学参数；以及

(ii)具有用于获得所述计算机程序的地址的物理基板。