KR102325668B1 - 고체 표면에 생체분자의 강한 고정용 디티올란 기능화된 뉴클레오시드 아미디트 및 지지체 - Google Patents

고체 표면에 생체분자의 강한 고정용 디티올란 기능화된 뉴클레오시드 아미디트 및 지지체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산화학에 관한 것이고 새로운 1,2-디티올란 기능화된 뉴클레오시드 포스포라미디트 (1, 도표 1) 및 상응하는 고체 지지체 (2, 도표 1)를 기술한다. 상기 유도체 뿐만 아니라, 1,2-디티올란 부분은 또한 도식 1 내지 8에 나타난 핵염기 및 당 부분의 다양한 위치에 기능화될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오시드는 사슬 신장을 위한 4,4'-디메톡시트리틸 (4,4'-dimethoxytrityl, DMTr) 기능을 위한 1차 히드록실기를 전달한다. 또한, 포스포라미디트 기능은 뉴클레오시드의 3'-히드록실기에 부착된다. 이것은 표준 DNA 및 RNA 합성의 화학 조건 및 기술하에 올리고뉴클레오티드 사슬의 연장을 허용하고, 따라서 높은 품질의 올리고뉴클레오티드로 이어진다. 이 유도체는 금, 은 및 양자점과 같은 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5'- 말단에 반응성 티올기의 도입에 유용하다.

Description

고체 표면에 생체분자의 강한 고정용 디티올란 기능화된 뉴클레오시드 아미디트 및 지지체{DITHIOLANE FUNCTIONALIZED NUCLEOSIDE AMIDITES AND SUPPORTS FOR STRONGER IMMOBILIZATION OF BIO-MOLECULES ON SOLID SURFACES}
관련출원에 대한 상호 참조
본 특허협력조약 출원은 2013년 10월 23일에 출원된, 미국 특허 가출원 번호 61/894,872에 기반하고, 그 이익을 주장하며 그의 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 핵산화학에 관한 것이고, 새로운 1,2-디티올란 기능화된 뉴클레오시드 포스포라미디트 (1, 도표 1) 및 상응하는 고체 지지체(2, 도표 1)를 기술한다. 이 유도체는 금, 은 및 양자점과 같은 고체 지지체 상의 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5'- 말단에 반응성 티올기의 도입에 유용하다. 또한, 이러한 프로브의 장점은 비교적 긴 링커암(linker arm)을 가지고 있어서 고체 표면에 단량체의 깨끗한 형성이 가능하고 고체 지지체로부터 최적의 거리에 자가조립 단량체를 유지한다. 본 발명의 뉴클레오시드는 사슬 신장을 위한 4,4'-디메톡시트리틸(4,4'-dimethoxytrityl, DMTr) 기능을 위한 1차 히드록실기를 전달한다. 또한, 포스포라미디트 기능은 뉴클레오시드의 3'-히드록실기에 부착된다. 이것은 표준 DNA 및 RNA 합성의 화학 조건 및 기술하에 올리고뉴클레오티드 사슬의 연장이 가능하도록 하고, 따라서 높은 품질의 올리고뉴클레오티드로 이어진다. 올리고뉴클레오티드-금 나노입자 결합체의 쌍은 디티올란 유닛으로 인해, 신규한 구조, 생체-진단 및 나노 기술 기반 치료제를 조립하기 위한 구성 요소로서, DNA 단편에서 특정 서열을 인식하기 위한 고유한 프로브로서의 역할을 한다.
최근에, 나노 크기의 구조체의 개발이 다양한 분자 생물학적 응용을 위해 많은 관심을 받아오고 있다. 금은 높은 화학적 안정성 (귀금속)을 나타내고, 일정한 파장에서 가시광선을 강하게 흡수하는 능력으로 특징되며, 본래 독성이 없으므로 아마도 가장 적절한 원소이다. 티올(R-SH)이 변형된 올리고뉴클레오티드는 (a) α,β-불포화 케톤; (b) 말레이미드; (c) 다른 마이클 수용체 군; 또는 (d) 이황화 결합을 만들기 위한 단백질 내 시스테인을 포함하는 다양한 리간드와 공유결합을 가능하게 하여 핵산 화학 분야에 거대한 잠재적 응용가능성을 갖는 매력적인 도구의 역할을 한다. 이외에도, 티올은 금과 가역적 공유결합을 형성하기 위해 금 표면과 강한 특이적인 상호작용을 갖는다.
반응성 티올기는 올리고뉴클레오티드의 합성 동안 설파이드 변성 포스포라미디트 단량체를 포함하여 올리고뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다. 일반적으로 이황화 전략 [Jones, D. S., Hachmann, J. P., Conrad, M. J., Coutts, S., Livingston, D. A. US patent Number 5391785, 1995] 또는 S-트리틸 보호 [Connolly, B. A.; Rider, P. Nucleic Acids Res. 1985 13, 4485]를 이용한 설파이드 변성 단량체의 두 가지 다른 유형이 이것을 달성하기 위해 매우 일반적이다. 이황화물로부터 반응성 티올기는 디티오트레이톨(DTT)과 같은 환원제로 올리고뉴클레오티드를 처리하여 생성된다. 반면, 다른 S-트리틸 전략은 질산은에 의해 트리틸기를 절단하여 생성된다. 그러나, 이 전략은 질산은으로 트리틸기의 정교한 절단 과정의 명확한 단점을 가지며, 최종 올리고뉴클레오티드의 상대적으로 낮은 수율을 초래한다. 따라서, 이황화 변성 포스포라미디트는 티올기를 생성하는 우수한 프로브로서의 역할을 한다. 가장 대중적인 이황화 프로브는 일반식 DMT-O-R-S-S-R-O-P(CE)(NiPr2)이고, 여기서 R은 C3 또는 C6의 스페이서 암이다 [Jones, D. S., Hachmann, J. P., Conrad, M. J., Coutts, S., Livingston, D. A. U.S. patent Number 5391785, 1995]. 그것의 흥미있는 특성 때문에, 우리는 상업적인, 연구 및 개발을 위해 고순도의 아실릭 이황화 포스포라미디트 (여기서 R은 C3 스페이서)를 주는 새로운 합성법 및 정제법을 개발하기 위한 상세한 연구를 수행하였다. 우리의 최적화된 합성 프로토콜은 재생가능하며, 멀티 그램 규모에 적합하고 31P NMR (>94%)에 의해 고순도의 표적 포스포라미디트를 생산한다[Srivastava, S. C.; Thatikonda, S. K.; Srivastav, S. K. Shukla, P. U. S. Patent Application No. 2012/000103, 2012].
Nuzzo와 Allara는 반응성 티올기가 금의 표면에 흡착하고 정돈된 단일층을 형성하는 것을 발견했다[Nuzzo, R. G., Allara, D. L. Jour. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 4481]. 이후에, 티올기를 가진 올리고뉴클레오티드는 금 표면에 자가-조립 단일층(SAMs)을 생성하기 위해 매우 많이 사용된다. 다른 분자들(실란, 카르복실산, 피리딘, 황화물 및 티올)이 다른 표면(금, 은, 백금, 구리, 수은, 유리) 상에 고정될 수 있지만, 금에 티올의 화학흡착이 표면에 프로브를 고정시키기 위한 일반적이고 간단한 방법이다. 따라서, DNA 기능화된 금 나노입자는 키(key) 핵산 기반 조립 전략에서 널리 사용되는 구성 요소이고, 신규한 구조물 및 물질[Mucic, R. C., Storhoff, J. J., Mirkin, C. A., Letsinger, R. L. J. Am. Chem. Soc. 1998 120, 12674], 및 바이오 진단 및 나노기술 기반 치료제[Merkins, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. Nature, 1996, 382, 607; Hurst, S. J., Hill, H. D., Mirkin, C. A. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12192]를 조립하기 위한 구성 요소로서 DNA 단편 [Storhoff, J. J., Elghanian, R., Mucic, R. C., Mirkin, C. A., and Letsinger, R. L. J. Am. Chem. Soc. 1998 120, 1959]의 특정 서열을 인식하기 위한 고유한 프로브의 역할을 한다. 이러한 단일층의 형성은 온도, 용매, 완충액 농도, 흡착물의 사슬 길이, 기판의 깨끗함 및 표면과의 반응속도 및 단일층 성분의 흡착의 가역성에 의해 영향을 받는다는 것이 입증되었다. 이러한 응용은 부착된 올리고뉴클레오티드 및 나노입자 사이에 금과 황 결합의 가역적 관계에 의존된다.
단일 티올기가 붙은 올리고뉴클레오티드는 세척단계 동안 불안정하고, 올리고뉴클레오티드의 안정한 부착 형성은 DNA 칩 기술과 같은 응용의 성공에 매우 중요한 특성이다. 금과 황사이의 공유결합은 30 내지 40 Kcal/mol 크기이고, 이것은 표면에 생체 고분자를 고정하기 위해서 상대적으로 약하다 [Dubois L. H., Zegarski B. R., Nuzzo R. G. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1987 84 4739; Liepold, P., Kratzmuller, T., Persike, N., Bandilla, M., Hinz, M., Wieder, 15 H., Hillebrandt, H., Ferrer, E., Hartwich, G. Anal Bioanal Chem, 2008, 391, 1759-1772]. 단일 기능성 티올기가 결합된 올리고뉴클레오티드는 높은 온도 및 높은 염 농도 완충액의 존재하에서 느리게 손실된다는 것이 보고되었다 [Li, Z., Jin, R., Mirkin, C. A., Letsinger, R. L. Nucleic Acids Res. 2002, 30, 1558]. 단일 티올기에 의해 금 표면에 결합한 올리고뉴클레오티드의 자가-조립 단일층에 관한 Letsinger et. al.의 안정성 연구는 DTT[Letsinger, R. L., Elghanian, R., Viswanadham, G., Mirkin, C. A. Bioconj. Chem. 2000, 11, 289]가 포함된 완충용액으로 처리함으로써 완벽하게 대체할 수 있다는 것을 밝혔다. 상기 특징은 중합효소를 위한 안정제로서 DTT를 갖는 PCR 용액과 같은 티올을 포함하고 있는 용액 내의 상기 프로브의 응용을 제한한다.
따라서 더 넓은 생물학적 응용을 위해 올리고뉴클레오티드의 안정한 자가-조립 단일층의 형성이 가능한 새로운 이황화화합물의 개발이 강하게 요구된다. 하나는 단일층의 안정이 올리고뉴클레오티드 당 다수의 많은 금-황 결합에 의해 증가될 수 있는 것으로 기대된다. 올리고뉴클레오티드 당 다수의 티올기를 생산할 수 있는 새로운 티올 변형체를 소개하는 몇몇 보고서 [Letsinger, R. L., Elghanian, R., Viswanadham, G., Mirkin, C. A. Bioconj. Chem. 2000, 11, 289-291; Hartwich, G., Frischmann, P., Ferrer, E., U.S. Pat. No. 7601848, 2002; Seliger, H., Prokein, T. U.S. Patent No 2005/0059728, 2004]가 있다. 상기 변형에 의해 생성된 자가-조립 단일층은 DTT를 포함하는 완충용액 내의 단일 티올 변형체에 의해 생성된 상응하는 자가-조립 단일층에 비해 매우 안정하다 [Letsinger, R. L., Elghanian, R., Viswanadham, G., Mirkin, C. A. Bioconj. Chem. 2000, 11, 289]. 그러나, 개시된 기술에서 측쇄에 붙은 DMT 기는 고체 표면에 부착된 올리고뉴클레오티드의 품질에 영향을 줄 수 있는 2차 히드록시기에 부착된다. 본 발명은 고품질의 디티올란 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 올리고뉴클레오티드 성장 밴드를 위한 뉴클레오시드 5'- DMT 기를 이용한다.
도표 1: N2-구아노신(O6-보호된) 기능화된 디티올란 포스포라미디트 1, 고체 지지체 2, 이전에 공개된 디티올란 포스포라미디트 3 및 그것의 고체 지지체 4의 화학구조.
Figure 112016049339784-pct00001
이전에, 우리는 두개의 티올기 도입을 위한 고정체 3 (도표 1)에 기초를 둔 오원자 이황화물 (디티올란)을 기술하였다 [Srivastava, S. C., Thatikondra, S. K., Srivastav, S. K., Shukla, P.K., Srivastava, A., U.S. Provisional Application is 61/795851, filed October 27, 2012; U.S. Non-Provisional Application 14/065,385, filed October 28, 2013.]. 올리고뉴클레오티드 합성의 목적을 위한 DMT 기에 부착하기 위한 1차 히드록시기에 제공된 상기 디티올란 변형은 높은 품질의 올리고뉴클레오티드를 제공하고, 잠재적으로 더 큰 안정성을 나타내는 금-올리고뉴클레오티드 결합체를 제공할 수 있다.
참조:
Cao, H., Yong, J., Yinsheng W. Jour. of the Am. Chem . Soc . 2007, 129, 12123-12130.
Connolly, B. A., Rider, P. Nucleic Acids Res. 1985 13, 4485
Dubois L. H., Zegarski B. R., Nuzzo R. G. Proc . Nati . Acad . Sci . USA 1987 84 4739-4742.
Hartwich, G., Frischmann, P., Ferrer, E., U.S. pat. No. 7601848, filed Dec 21, 2002.
Hurst, S. J., Hill, H. D., Mirkin, C. A. J. Am. Chem . Soc. 2008, 130, 12192.
Jones, D. S., Hachmann, J. P., Conrad, M. J., Coutts, S., Livingston, D. A. US patent Number 5391785, Date filed Feb 21, 1995.
Letsinger, R. L., Elghanian, R., Viswanadham, G., Mirkin, C. A. Bioconj . Chem. 2000, 11, 15 289-291.
Li, Z., Jin, R., Mirkin, C. A., Letsinger, R. L. Nucleic Acids Res. 2002, 30, 1558-62.
Liepold, P., Kratzmuller, T., Persike, N., Bandilla, M., Hinz, M., Wieder, H., Hillebrandt, H., Ferrer, E., Hartwich, G. Anal Bioanal Chem, 2008, 391, 1759-1772.
Merkins, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. Nature, 1996, 382, 607. 20.
Mucic, R. C., Storhoff, J. J., Mirkin, C. A., Letsinger, R. L. J. Am. Chem . Soc. 1998 120, 12674-12675.
Nuzzo, R. G., Allara, D. L. Jour. Am. Chem . Soc . 1983, 105, 4481.
Seliger, H., Prokein, T. U.S. Patent No 2005/0059728 A1, filed Aug 26, 2004 25.
Srivastava, S. C.; Thatikonda, S. K.; Srivastav, S. K. Shukla, P. U. S. Patent Application No. 2012/000103, 2012.
Srivastava, S. C., Thatikonda, S. K., Srivastav, S., Srivastava, A. The Serial No. for the provisional application is 61/795851, its filing date is October 27, 2012.
Storhoff, J. J., Elghanian, R., Mucic, R. C., Mirkin, C. A., and Letsinger, R. L. J. Am. Chem. Soc. 1998 120, 1959-1964.
포스포라미디트 유도체 구조 1 및 고체 지지체 구조 2.
Figure 112016049339784-pct00002
구조 3, 4에 나타낸 C5-디티올란 기능화된 피리미딘 뉴클레오시드.
Figure 112016049339784-pct00003
구조 5, 6에 나타낸 C8-디티올란 기능화된 퓨린 뉴클레오시드.
Figure 112016049339784-pct00004
구조 7, 8에 나타낸 2'-O-디티올란 기능화된 피리미딘 뉴클레오시드.
Figure 112016049339784-pct00005
구조 9, 10에 나타낸 2'-O-디티올란 기능화된 퓨린 뉴클레오시드.
Figure 112016049339784-pct00006
구조 11, 12에 나타낸 C5-디티올란 기능화된 피리미딘 뉴클레오시드 아미디트.
Figure 112016049339784-pct00007
구조 13, 14에 나타낸 C8-디티올란 기능화된 퓨린 뉴클레오시드 아미디트.
Figure 112016049339784-pct00008
구조 15, 16에 나타낸 2'-O-디티올란 기능화된 피리미딘 뉴클레오시드 아미디트.
Figure 112016049339784-pct00009
구조 17, 18에 나타낸 2'-O-디티올란 기능화된 퓨린 뉴클레오시드 아미디트.
Figure 112016049339784-pct00010
구조 19-22에 나타낸 바와 같은 C-5 기능화된 피리미딘 및 C8-기능화된 퓨린 숙신산.
Figure 112016049339784-pct00011
구조 23-26에 나타낸 바와 같은 2'-O-기능화된 피리미딘 및 퓨린 숙신산.
Figure 112016049339784-pct00012
구조 27-30에 나타낸 바와 같은 C5 기능화된 피리미딘 및 퓨린 고체 지지체.
Figure 112016049339784-pct00013
상기 기술된 C5 및 2'-O-디티올란 기능화된 구조 1 내지 구조 30을 포함하는 올리고리보뉴클레오티드 또는 올리고디옥시리보뉴클레오티드.
하기 도에 제시된 상기 기술된 올리고리보뉴클레오티드 또는 올리고디옥시리보뉴클레오티드와 금, 양자점과 같은 고체 지지체의 결합체.
Figure 112016049339784-pct00014
티올 변형된 올리고뉴클레오티드는 다양한 리간드의 공유결합을 가능하게 하고, 또한 금 표면에 상대적으로 강한 결합을 형성하기 위한 능력을 가지게 함으로써 핵산 화학 분야에서 매우 다양한 응용을 가진다. 따라서, 티올기를 갖는 올리고뉴클레오티드는 금 표면에 화학적 흡착을 할 수 있고 자가-조립 단일층(SAMs)을 형성할 수 있다. DNA 기능화된 금 나노입자는 키 핵산 기반 조립 전략의 구성 요소로 널리 사용되고, 신규한 구조 및 물질, 바이오 진단 및 나노기술 기반 치료제를 조립하기 위한 구성 요소로서 DNA 단편의 특정 서열을 인식하기 위한 고유한 프로브의 역할을 한다.
티올기는 원소 금과 상대적으로 강한 결합을 형성함에도 불구하고 (약 30-40 Kcal/mole), 그것은 더 높은 온도, 높은 염 농도의 완충용액 및 또 다른 티올의 존재 하에 변위된다. 상기 결합체의 많은 응용을 위해 금 나노입자에 올리고뉴클레오티드의 강한 결합이 필요하다. 그러나 티올의 변위를 회피하기 위해, 다수의 티올기가 도입될 수 있는 몇몇 사이클릭 이황화 변형체가 종래기술에 소개되어 왔다. 그것들의 안정성 연구는 상기 멀티-티올 기능화된 올리고뉴클레오티드가 상응하는 단일-티올 유도체에 비해 상대적으로 더 안정한 자가-조립 단일층을 형성한다는 것을 나타냈다.
본 발명에서, 우리는 사이클릭 디티올란 기능화된 포스포라미디트 유도체 1 (도표 1) 및 상응하는 디티올란 숙시닐 고체 지지체 2 (도표 1)의 설계 및 효율적인 합성을 기재하였다. 이전에 우리는 두 개의 티올기 도입을 위한 5원자 이황화 (디티올란) 기반의 결합기 3 및 4(도표 1)를 기술했다[Srivastava, S. C., Thatikonda, S. K., Srivastav, S. K., Shukla, P. K. Srivastava, A. U.S. Provisional Application is 61/795851, filed October 27, 2012; U.S. Non-Provisional Application 14/065,385, filed October 28, 2013]. 상기 디티올란 변형은 합성하기에 간단하고, 광범위하게 유용하고, 잠재적으로 더 큰 안정성을 나타내는 금-올리고뉴클레오티드 결합체를 제공할 수 있다. 본 발명의 과제는 뉴클레오시드 안에 상기 디티올란 기술을 확장하는 것이다. 합성된 디티올란 기능화된 유도체 1 (도표 1) 뿐만 아니라, 우리는 도식 1 내지 8로부터 다양한 다른 기능화된 화합물을 구상한다. 디티올란 부분의 핵산 핵염기 또는 링커 암을 가진 당 부분에 대한 결합은 매우 흥미있는 기능화된 티올 올리고뉴클레오티드를 생성하게 한다. 비교적 긴 링커암의 장점은 고체 표면에서 단량체의 깨끗한 형성을 허용하고 고체 지지체로부터 최적의 거리에 자가-조립 단량체를 유지하게 한다. 올리고뉴클레오티드-금 나노입자 결합체의 쌍은 신규한 구조, 바이오 진단 및 나노기술 기반 치료제를 조립하기 위한 구성 요소로서 DNA 단편의 특정 서열을 인식하기 위한 고유한 프로브의 역할을 한다.
도 1: 2-(12-아미노도데카닐)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-O6-(2-트리메틸실리에틸)-구아노신 (54)의 HPLC 순도 분석. 화합물의 순도 분석은 ChromSep SS 컬럼 (4.6 X 250 mm) 10 및 ChromSep Guard-컬럼 OmniSpher 5 C18을 장착한 Varian Prostar HPLC를 사용하여 조사하였다. 이동상: A 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA); B는 CH3CN. 분석은 20분간 65 내지 98%의 B 증가의 선형구배로 수행하였다. 피크는 254 nm에서 자외선 흡수로 검출하였다.
도 2: 2-(12-아미노도데카닐)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-O6-(2-트리메틸실리에틸)-구아노신 (54)의 HPLC 테이블 피크.
도 3: 2-(12-아미노도데카닐)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-O6-(2-트리메틸실리에틸)-구아노신 (54)의 ESI/MS 스펙트럼. MS m/z (C48H68N6O6Si) [M -H]- 852.4, calcd 853.18. ESI/MS 분석은 Perkin Elmer 30 PE-SCIEX API-150 질량분석기로 수행하였다.
도 4: 2-(12-아미노도데카닐)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-O6-(2-트리메틸실리에틸)-구아노신 (54)의 1H NMR. 1H NMR은 Bruker 500 MHz NMR 분광광도계로 기록하였다. 화학적 이동은 중수소가 포함된 용매 CDCl3 (δ 7.26 ppm)에서 보정되었다.
도 5: 2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-yl)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (55)의 HPLC 순도 분석. 화합물의 순도 분석은 ChromSep SS 컬럼 (4.6 X 250 mm) 10 및 ChromSep Guard-컬럼 OmniSpher 5 C18을 장착한 Varian Prostar HPLC를 사용하여 조사하였다. 이동상: A 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA); B는 CH3CN. 분석은 20분간 0 내지 50%의 B 증가의 선형구배로 수행하였다. 피크는 254 nm에서 자외선 흡수로 검출하였다.
도 6: 2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (55)의 HPLC 테이블 피크.
도 7: 2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (55)의 ESI/MS 스펙트럼. MS m/z C56H80N6O7S2Si ([M + H]+ 1042.2, calcd 1041.18). ESI/MS 분석은 Perkin Elmer 30 PE-SCIEX API-150 질량분석기로 수행하였다.
도 8: 2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (55)의 1H NMR. 1H NMR은 Bruker 500 MHz NMR 분광광도계로 기록하였다. 화학적 이동은 중수소가 포함된 용매 CDCl3 (δ 7.26 ppm)에서 보정되었다.
도 9: 3'-(2-시아노에틸 디이소프로필포스포라미디트)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (1)의 HPLC 순도 분석. 화합물의 순도 분석은 ChromSep SS 컬럼 (4.6 X 250 mm) 10 및 ChromSep Guard-컬럼 OmniSpher 5 C18을 장착한 Varian Prostar HPLC를 사용하여 조사하였다. 이동상: A 0.1M 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA); B는 CH3CN. 분석은 20분간 0 내지 30%의 B 증가의 선형구배로 수행하였다. 피크는 254 nm에서 자외선 흡수로 검출하였다.
도 10: 3'-(2-시아노에틸 디이소프로필포스포라미디트)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (1)의 HPLC의 테이블 피크.
도 11: 3'-(2-시아노에틸 디이소프로필포스포라미디트)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (1)의 ESI/MS 스펙트럼. MS m/z C65H97N8O8PS2Si. ([M + H]+ 1242.3, calcd 1241.58). ESI/MS 분석은 Perkin Elmer 30 PE-SCIEX API-150 질량분석기로 수행하였다.
도 12: 3'-(2-시아노에틸 디이소프로필포스포라미디트)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (1)의 31P NMR 스펙트럼. 31P NMR은 Bruker 202 MHz NMR 분광광도계로 기록하였다. NMR 분석을 위한 용매는 CDCl3이다.
도 13: 3'-(2-시아노에틸 디이소프로필 포스포라미디트)-2'-디옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)-O6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (1)의 UV 흡수 스펙트럼. UV 흡수 스펙트럼은 Cary 50 Bio UV-Visible 분광광도계로 320 내지 240 nm 범위에서 기록하였다.
본 발명은 뉴클레오시드 내로 상기 디티올란 기술을 더 확장한다. 디티올란 부분의 핵산 핵염기 또는 링커 암을 가진 당 부분에 대한 결합은 매우 흥미있는 기능화된 티올 올리고뉴클레오티드를 생성하게 한다. 비교적 긴 링커암의 장점은 고체 표면에서 단량체의 깨끗한 형성을 허용하고 고체 지지체로부터 최적의 거리에 자가-조립 단량체를 유지하게 한다. 올리고뉴클레오티드-금 나노입자 결합체의 쌍은 신규한 구조, 바이오 진단 및 나노기술 기반 치료제를 조립하기 위한 구성 요소로서 DNA 단편의 특정 서열을 인식하기 위한 고유한 프로브의 역할을 한다.
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 구아닌, 2'-디옥시리보스, 상기 구아닌의 N2에 디티올란 유도체; 및 상기 디옥시리보스의 3'-O에 포스포라미디트 유도체, 또는 상기 디옥시리보스의 3'-O에 고체 지지체이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 1 또는 구조 2로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00015
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 피리미딘; 리보스; 및 상기 피리미딘의 C5에 디티올란 유도체이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 3 또는 구조 4로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00016
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 퓨린; 리보스; 및 상기 퓨린의 C8에 디티올란 유도체이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 5 또는 구조 6으로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00017
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 피리미딘; 리보스; 및 상기 리보스의 2'-O 디티올란 유도체이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 7 또는 구조 8로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00018
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 퓨린; 리보스; 및 상기 리보스의 2'-O 디티올란 유도체이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 9 또는 구조 10으로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00019
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 피리미딘; 리보스; 상기 피리미딘의 C5에 디티올란 유도체; 및 상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 11 또는 구조 12로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00020
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 퓨린; 리보스; 상기 퓨린의 C8에 디티올란 유도체; 및 상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 13 또는 구조 14로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00021
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 피리미딘; 리보스; 상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 15 또는 구조 16으로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00022
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 퓨린; 리보스; 상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 및 상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기이고, 상기 뉴클레오시드는 구조 17 또는 구조 18로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00023
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 리보스; 상기 리보스의 3'-O에 숙신기; 및 피리미딘 또는 퓨린, 상기 피리미딘은 C5에 디티올란 유도체를 가지며 상기 피리미딘은 구조 19 또는 구조 20으로 나타내고, 상기 퓨린은 C8에 디티올란 유도체를 가지며, 구조 21 또는 구조 22로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00024
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 핵염기; 리보스; 상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 및 상기 리보스의 3'-O에 숙신기이고, 상기 핵염기가 피리미딘인 경우 구조 23 또는 구조 24로 나타내고, 또는 퓨린인 경우 구조 25 또는 구조 26으로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00025
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 뉴클레오시드에 관한 것이다: 핵염기; 리보스; 상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 및 상기 리보스의 3'-O에 고체 지지체이고, 상기 핵염기가 피리미딘인 경우 구조 27 또는 구조 28로 나타내고, 퓨린인 경우 구조 29 또는 구조 30으로 나타낸다:
Figure 112016049339784-pct00026
본 발명의 일 실시예는 뉴클레오시드에 관한 것이고, 상기 언급된 뉴클레오시드 중에 하나에 따른 디티올란 유도체를 포함하며, 상기 뉴클레오시드는 구조 1 내지 구조 30 중 하나로 나타낸다.
본 발명의 일 실시예는 하기를 포함하는 결합체에 관한 것이고: 상기에 언급된 뉴클레오시드 및 고체 지지체를 포함하며, 여기서 고체 지지체는 금 또는 양자이고, 상기 결합체는 하기 도와 같이 제시된다.
Figure 112016049339784-pct00027
이것을 보기 위해, 우리는 N2-기능화된 디옥시-구아노신 아미디트 (1, 도표 1)를 성공적으로 합성하고, 고체 지지체 (2, 도표 1)를 가진 상응하는 화합물에 대한 스킴을 제안하였다. 이외에도 우리는 다양한 디티올란 기능화된 DNA 및 RNA 아미디트 및 고체 지지체 (도식 1 내지 8)를 제안했다. 상기 단량체는 올리고뉴클레오티드의 3'- 또는 5'-말단에 티올 작용기를 생성하는데 유용한다. 상기 개선으로, 우리는 우리의 프로브가 디티올란 부분으로 구성되는 고품질 프로브의 응용에 이상적으로 적합하게 고안되었다고 강하게 믿는다.
티올 변형된 올리고뉴클레오티드는 다양한 리간드의 공유 결합을 가능하게 하고 또한, 금 표면에 상대적으로 강한 결합을 형성하는 것과 같이 핵산 화학 분야에서 거대한 응용가능성을 가지고 있다. DNA 기능화된 금 나노입자는 키 핵산 기반 조립 전략 및 치료제의 구성 요소로 널리 사용된다. 티올기는 원소 금과 상대적으로 강한 결합을 형성함에도 불구하고 (약 30-40 Kcal/mole), 그것은 더 높은 온도, 높은 염 농도 완충액 및 다른 티올의 존재 하에 변위 된다. 상기 결합체의 많은 응용을 위해 금 나노입자에 올리고뉴클레오티드의 강한 결합이 필요하다. 그러나, 티올의 변위를 회피하기 위해, 다수의 티올기가 도입될 수 있는 몇몇 사이클릭 이황화 변형체가 15 종래기술에 소개되어 왔다. 그들의 안정성 연구는 상기 멀티-티올 기능화된 올리고뉴클레오티드가 상응하는 단일-티올 유도체에 비해 상대적으로 더 안정한 자가-조립 단일층을 형성한다는 것을 밝혔다. 본 출원에서, 우리는 N2 사이클릭 디티올란 기능화된 포스포라미디트 유도체 1 (도표 1)의 고안 및 효율적인 합성을 기술하였고, 상응하는 디티올란 숙시닐 CPG 지지체 2 (도표 1)의 합성을 제안하였다. 합성된 디티올란 기능화된 유도체 1 (도표 1) 뿐만 아니라, 우리는 도식 1 내지 8로부터 다양한 다른 기능화된 화합물을 구상한다. 디티올란 부분의 핵염기 또는 링커 암을 가진 당 부분에 대한 결합은 매우 흥미있는 기능화된 티올 올리고뉴클레오티드를 생성하게 한다. 비교적 긴 링커암의 장점은 고체 표면에서 단량체의 깨끗한 형성을 허용하고 고체 지지체로부터 최적의 거리에 자가-조립 단량체를 유지하게 한다. 올리고뉴클레오티드-금 나노입자 결합체의 쌍은 신규한 구조, 바이오 진단 및 나노기술 기반 치료제를 조립하기 위한 구성 요소로서 DNA 단편의 특정 서열을 인식하기 위한 고유한 프로브의 역할을 한다.
뉴클레오시드 53의 2-플루오로는 [Cao, H., Yong, J., Yinsheng W. Jour. of the Am. Chem. Soc. 2007, 129, 12123-12130] 79%의 수율로 아미노 뉴클레오시드 54를 제공할 수 있는 1, 12-디아미노도데칸에 의해 변위된다. 뉴클레오시드 54는 N2-디티올란과 연결된 생성물 55를 얻기 위해 EDC.HCl를 사용한 티옥 산과 연결되어 있다. 마지막으로 화합물 55는 67% 수율의 무수 THF 하에서 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트 시약 및 N, N’-디이소프로필에틸아민을 사용하여 표적 아미디트 1로 변환된다 (도식 9). 화합물 55는 또한 화합물 2 (도식 10)를 얻기 위해 안정한 고체 지지체를 연결함으로써 따라오는 상응하는 숙신산 57 (도식 10)로 변형될 수 있다. 상기 표적 화합물 1 및 2는 도식 9 및 10에 도시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 서열의 3'- 또는 5'-말단에 디티올란 변형을 얻기 위해 올리고뉴클레오티드 서열 내로 포함될 수 있다.
도식 1: C5-디티올란 기능화된 우리딘 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00028
시약 및 조건: (a) 상응하는 디아민, MeOH; (b) 티옥산, EDC.HCl, N,N'-디메틸포름아미드, rt; (c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N'-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; (d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; (e) HBTU, N,N '-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 1은 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 우리딘 C-5 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. C-5에서 고체 사슬의 다른 변형은 C-5의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 알킬 카복시 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 게다가 2'-F, 2'-O메틸, 2'-O 알킬, 2'- O-아미노 (보호된)와 같은 2'- 디옥시 뉴클레오시드 2'- 변형 뉴클레오시드 또한 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬 뿐만 아니라 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (9)를 붙이기 위해 이용될 수 있다.
도식 2: C5-디티올란 기능화된 시티딘 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00029
시약 및 조건: a) 상응하는 디아민, MeOH; b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt; c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; e) HBTU, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 2는 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 시티딘 C-5 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. C-5에서 고체 사슬의 다른 변형은 C-5의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 알킬 카복시 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 게다가 2'-F, 2'-O메틸, 2'-O 알킬, 2'- O-아미노 (보호된)과 같은 2'- 디옥시 뉴클레오시드 2'- 변형 뉴클레오시드 또한 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬 뿐만 아니라 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (15)를 붙이기 위해 이용될 수 있다.
도식 3: C8-디티올란 기능화된 아데노신 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00030
시약 및 조건: a) 상응하는 디아민, MeOH; b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt; c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; e) HBTU, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 3은 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 디옥시 아데노신 C-8 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. C-8에서 고체 사슬의 다른 변형은 C-8의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 C-8-O-알킬 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 게다가 2'-F, 2'-O메틸, 2'-O 알킬, 2'- O-아미노 (보호된)와 같은 2'- 디옥시 뉴클레오시드 2'- 변형 뉴클레오시드 또한 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬 뿐만 아니라 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (21)을 붙이기 위해 이용될 수 있다.
도식 4: C8-디티올란 기능화된 구아노신 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00031
시약 및 조건: a) 상응하는 디아민, MeOH; b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt; c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; e) HBTU, N,N’-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 4는 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 구아노신 C-8 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. C-8에서 고체 사슬의 다른 변형은 C-8의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 8-O-알킬 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 게다가 2'-F, 2'-O메틸, 2'-O 알킬, 2'- O-아미노 (보호된)와 같은 2'- 디옥시 뉴클레오시드 2'- 변형 뉴클레오시드 또한 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬 뿐만 아니라 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (27)을 붙이기 위해 이용될 수 있다. 제안된 도식 4에서, O6는 구아노신의 유리 O6 카보닐 기능을 생성하기 위한 온화한 조건 하에 제거될 수 있는 보호기에 의해 보호된다.
도식 5: 2'-O-디티올란 기능화된 우리딘 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00032
시약 및 조건: a); b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt; c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; e) HBTU, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 5는 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 우리딘 2'-O-알킬 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. 2'-O-에서 고체 사슬의 다른 변형은 O-2'-의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 알킬 카복시 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬을 합성하기 위한 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (33)을 붙이기 위해 이용될 수 있다.
도식 6: 2'-O-디티올란 기능화된 시티딘 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00033
시약 및 조건: a); b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt; c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; e) HBTU, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 6은 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 시티딘 2'-O-알킬 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. 2'-O-에서 측쇄의 다른 변형은 O-2'-의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 2'-O- 알킬 카복시 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬을 합성하기 위한 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (39)를 붙이기 위해 이용될 수 있다.
도식 7: 2'-O-디티올란 기능화된 아데노신 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00034
시약 및 조건: a); b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt; c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; e) HBTU, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 7은 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 아데노신 2'-O-알킬 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. 2'-O-에서 측쇄의 다른 변형은 O-2'-의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 2'-O- 알킬 카복시 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬을 합성하기 위한 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (45)를 붙이기 위해 이용될 수 있다.
도식 8: 2'-O-디티올란 기능화된 구아노신 아미디트 및 지지체에 대한 합성 도식.
Figure 112016049339784-pct00035
시약 및 조건: a); b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt; c) 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF; d) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; e) HBTU, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 아민 작용기를 가진 고체 지지체.
제안된 도식 8은 디티올란 기능이 붙어있는 말단에, 구아노신 2'-O-알킬 스페이서 부분의 합성의 개요를 나타낸다. 2'-O-에서 고체 사슬의 다른 변형은 O-2'-의 추가적인 신장 및 결국 디티올란 기능을 붙이는 것을 위한 2'-O- 알킬 카복시 기능의 도입 같은 것을 구상할 수 있다. 다양한 발색단은 더 좋고 다양한 검출 응용을 위해 올리고뉴클레오티드 사슬을 합성하기 위한 상기 뉴클레오시드에도 부착될 수 있다. 포스포라미디트 및 숙신산이 구상된다. 후자의 기능은 다양한 고체 지지체에 화합물 (51)을 붙이기 위해 이용될 수 있다.
제안된 도식 8에서, O6는 구아노신의 유리 O6 카보닐 기능을 생성하기 위한 온화한 조건 하에 제거될 수 있는 보호기에 의해 보호된다.
도식 9: N2-구아노신 기능화된 디티올란 포스포라미디트 및 상응하는 올리고뉴클레오티드의 합성.
Figure 112016049339784-pct00036
시약 및 조건: a) MeOH 내 1,12-디아미노도데칸, 40℃, 18 시간, 79%; b) 티옥산, EDC.HCl, N,N ’-디메틸포름아미드, rt, 67%; c) 2-시아노에틸 N,N′- (디이소프로필)포스포라미도클로리디트, N,N ’-디이소프로필에틸아민, 무수 THF, 0℃ 내지 rt, 66%; d) 올리고뉴클레오티드 합성;
도식 10: N2-구아노신 기능화된 디티올란 고체 지지체의 합성 및 올리고 뉴클레오티드의 추후 합성.
Figure 112016049339784-pct00037
시약 및 조건: a) 숙신산 무수물, 4-디메틸아미노피리딘, 무수 피리딘; b) HBTU, N,N’-디이소프로필에틸아민, CPG-긴 사슬 알킬 아민 스페이서.
서열 내 흥미있는 다른 뉴클레오시드를 갖는 56 및 58과 같은 올리고뉴클레오티드는 합성될 수 있다. B는 자연 또는 변형된 뉴클레오시드, 퓨린 또는 피리미딘 변형일 수 있고, 예로 5- 플루오로-U, 5-플루오로 dU, 5-플루오로-dC, 5-플루오로-rC, 슈도 우리딘, 5-메틸-dU, 5-메틸-rU, 5-메틸-dC, 5-메틸-rC, 5-브로모-dU, 5-브로모-rU, 5-브로모-dC, 5-브로모-rC, 5-아이오도-dU, 5-아이오도-rU, 5-비닐-dU, 5-비닐-rU, 5-비닐 티미딘, N-3 메틸디옥시 우리딘, N-3 메틸-리보우리딘, N-3 메틸 티미딘, 4-티오 우리딘, 4-티오-2'-디옥시우리딘, 2,6-디아미노 퓨린 디옥시 리보시드, N-3 메틸 리보티미딘, 2, 6-디아미노퓨린 리보시드, 8-브로모 2'- 디옥시 아데노신, 8-브로모-r-아데노신, 8-옥소-디옥시 아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-2'-디옥시- 아데노신, 8-옥소-리보아데노신, 8-옥소-디옥시 이노신, 8-옥소-리보 이노신, 8-브로모-디옥시 이노신, 8-브로모-리보-이노신, N-1 메틸-리보아데노신, N-1 메틸-2'-디옥시 아데노신, N-1 메틸 2'-디옥시 이노신, N-1 메틸 ㄹ리보데노신, N-1 메틸디옥시 구아노신, N-1-메틸- 리보구아노신, 에테노 아데노신, 에테노 2'- 디옥시 아데노신, 퓨린 2'- 디옥시 리보시드, 퓨린-리보뉴클레오시드, 2-아미노 퓨린-2'-디옥시리보시드, 2-아미노 퓨린-리보 뉴클레오시드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 방법에 의해 합성된 DNA의 내부 위치의 라벨링은 플루오로세인-C-5 dT, 댑실- C-5 티미딘, 내부 카복실기 5-dU-메틸아크릴레이트, 비오틴 dT (dU의 C-5에 스페이서를 통해 부착된 비오틴), 아미노-dT (dU의 C-5에 C-6 스페이서를 통해 붙은 말단 아미노)와 같은 발색단에 의해 달성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 본 발명의 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에 A, C, G, U, 이노신 및 2'- 플루오로를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 디옥시-2'-플루오로 리보 뉴클레오시드 (2'-F-ANAs)로 구성될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 상기 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에, A, C, G, U, 이노신 및 2'- 메톡시를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 디옥시-2'-메톡시 리보 뉴클레오시드 (2'-OMe-)로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 상기 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에, A, C, G, U, 이노신 및 2'- 아미노를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 디옥시-2'-아미노 리보 뉴클레오시드 (2'-NH2)로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 상기 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에, A, C, G, U, 이노신 및 2'-말단 아미노를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은, 뉴클레오시드 상에 2-10 원자가 스페이서를 통해 부착된, 2'- 디옥시-2'-말단 아미노 리보 뉴클레오시드 (2'-말단 NH2)로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 상기 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에, A, C, G, U, 이노신 및 2'-MOE를 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 디옥시-2'-메톡시 에톡시 리보 뉴클레오시드 (2'-MOE)로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드의 당 변형은 상기 방법에 의해 합성된 RNA 또는 DNA 서열의 하나 또는 그 이상의 위치에, A, C, G, U, 이노신 및 2'- 2'-OEt, O-프로파르길, 2'-O-뷰타인을 포함하는 변형된 뉴클레오시드와 같은 2'- 디옥시-2'-에톡시, 프로파르길, 뷰타인 리보 뉴클레오시드 (2'-OEt, O-프로파르길, 2'-O-뷰타인)로 구성될 수 있다.
실시예 1
2-(12- 아미노도데카닐 )-2'- 디옥시 -5'- O -(4,4'- 디메톡시트리틸 )- O 6-(2- 트리메틸실릴에틸 )-구아노신 (54)
2-플루오로-2'-디옥시 구아노신 뉴클레오시드 (5 g, 7.9 mmol)를 MeOH에 신선하게 준비된 1,12-디아미노도데칸(79 mmol, 10:90, v/v) 내에 용해시켰다. 40℃ 에서 18시간 동안 반응 혼합물을 교반한 후, 건조를 위해 증발시키고 백색 고체 물질로서 화합물 54 (5 gr, 79%)를 얻기 위해 CHCl3:트리에틸아민:MeOH (95:5:0 내지 91:5:4, v/v/v)을 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. R f = 0.5 (클로로폼:메탄올:TEA;90:05:05) MS m/z ([M + H]+ 854.2, calcd 853.18), MS m/z (C48H68N6O6Si) [M -H]- 852.4, calcd 853.18); 1H NMR (DMSO,d6) 7.91 (s, 1 H), 7.32-7031 (d, 2H), 7.22-7.15 (m, 7H), 6.80-6.74 (m, 5H), 6.25-6.22 (t, 1H), 4.51 (s, 2H), 4.42 (s, 1H), 3.94-3.91 (q, 1H), 3.71-3.70 (d, 6H), 3.28-2.83 (m, 13H), 2.42-2.39 (q, 1H), 2.29-2.26(q, 1H),1.46 (s, 2H), 1.31-0.91(m, 23H), 11.257 분에서 HPLC 분석 단일 피크 (0.1M TEAA 완충액 내에 65 내지 98% 아세토니트릴) 및 순도는 98.54%.
실시예 2
2'- 디옥시 -5'- O -(4,4'- 디메톡시트리틸 )-2-(12-(5-(1,2- 디티올란 -3-일) 펜탄아미드 )-도데실)- O 6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (55)
화합물 54 (2.5 g, 2.93 mmol)를 무수 N,N ’-디메틸포름아미드 (25 mL)에 용해시키고 EDC.HCL (3.1 g, 16.11 mmol)을 이에 첨가하였다. 30분 동안 반응물을 교반한 후, 티옥산 (3.02 g, 14.65 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반한 후, 건조를 위해 증발시키고, 백색 고체 물질로서 화합물 55 (2.4 g, 67%)를 얻기 위해 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CHCl3:헥세인:아세톤:트리에틸아민:MeOH, 47:30:20:1:2, v/v/v/v/v)에 의해 정제하였다. R f = 0.6 (CHCl3:헥세인:아세톤:트리에틸아민:MeOH, 47:30:20:1:2, v/v/v/v/v);MS m/z C56H80N6O7S2Si ([M + H]+ 1042.2, calcd 1041.18) [M -H]- 1040.3, calcd 1041.18); 1H NMR (DMSO-d6/D2O) 8.23 (s, 1 H), 7.92 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.73-7.75 (t, 1H), 7.28-7.29 (t, 2H), 7.13-7.19 (m, 7H), 6.71-6.77 (dd, 4H), 6.21-6.23 (t, 1H),4.43-4.49(q, 3H), 3.92-3.93 (d, 1H), 3.68-3.69 (d, 6H), 3.52-3.56 (q, 8H), 2.96-3.16 (m, 8H), 2.87 (s, 12H), 2.71(s, 11H), 2.26-2.36 (m, 1H), 2.01-2.06 (m 1H), 2.01-2.04 (t, 2H),1.80-1.82 (m 1H), 1.46-1.48 (m, 5H), 1.10-1.48 (m 23H). 6.527 분에서 HPLC 분석 단일 피크 (0.1M TEAA 완충액 내에 0 내지 50% 아세토니트릴) 및 순도는 97.21%.
실시예 3
3'-(2- 시아노에틸 디이소프로필포스포라미디트)-2'-디옥시-5'- O -(4,4'-디메톡시트리틸)-2-(12-(5-(1,2-디티올란-3-일)펜탄아미드)-도데실)- O 6-(2-트리메틸실릴에틸)-구아노신 (1)
DMT-디티올란 연결된 뉴클레오시드 55 (2.4 g, 2.3 mmol)를 무수 CH3CN (1 × 25 mL)와 동시증발 시켜 건조하고 고진공 펌프에서 밤새 건조시킨 후 무수 THF (25 mL)에 용해시켰다. 이에 N, N’-디이소프로필에틸아민 (1.2 mL, 6.9 mmol)을 첨가하고 얼음처럼 차가운 물 욕조에서 냉각시켰다. 25분 동안 아르곤에 버블링한 후, 완전한 아르곤 공기 하에서 2-시아노에틸 N,N ′-(디이소프로필)포스포라미도클로리디트 (0.565 mL, 2.53 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 1시간 동안 얼음처럼 차가운 물 욕조에서 교반하고, 그 후에 EtOAc (100 mL)로 희석하였다. 유기상을 포화된 수성 NaHCO3 (100 mL)와 포화된 수성 NaCl (100 ml)로 세척하였다. 상기 결합 수성상을 EtOAc (250 mL)로 역추출하였다. 상기 결합된 유기상을 건조를 위해 증발시키고, 결과인 잔여물을 무색의 오일로서 표적 아미디트 1 (1.5 g, 66%)을 얻기 위해 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (29:70:01 헥세인:EtOAc:트리에틸아민, v/v/v)에 의해 정제하였다. R f = 0.5 (EtOAc:헥세인:트리에틸아민, 70:29:01, v/v/v). MS m/z C65H97N8O8PS2Si ([M + H]+ 1242.3, calcd 1241.58). 31P NMR (CDCl3) 149.527 및 149.196 ppm. 14.924 및 16.271 분에서 HPLC 분석 더블 피크 (0.1M TEAA 완충액 내에 0-30% 아세토니트릴) 및 순도는 99.33%.

Claims (14)

  1. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    구아닌,
    2'-디옥시리보스,
    상기 구아닌의 N2에 디티올란 유도체; 및
    상기 디옥시리보스의 3'-O에 포스포라미디트 유도체 또는 상기 디옥시리보스의 3'-O에 고체 지지체,
    상기 뉴클레오시드는 구조 1 또는 구조 2로 나타낸다:

    Figure 112021047705235-pct00038

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이다.
  2. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    피리미딘;
    리보스; 및
    상기 피리미딘의 C5에 디티올란 유도체,
    상기 뉴클레오시드는 구조 3 또는 구조 4로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00039

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이다.
  3. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    퓨린;
    리보스; 및
    상기 퓨린의 C8에 디티올란 유도체,
    상기 뉴클레오시드는 구조 5 또는 구조 6으로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00040

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이고, DMF는 디메틸포름아미딘(dimethylformamidine)이다.
  4. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    피리미딘;
    리보스; 및
    상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체,
    상기 뉴클레오시드는 구조 7 또는 구조 8로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00041

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이다.
  5. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    퓨린;
    리보스; 및
    상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체,
    상기 뉴클레오시드는 구조 9 또는 구조 10으로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00042

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이고, DMA는 디메틸아세트아미딘(dimethylacetamidine)이다.
  6. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    피리미딘;
    리보스; 및
    상기 피리미딘의 C5에 디티올란 유도체; 및
    상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기,
    상기 뉴클레오시드는 구조 11 또는 구조 12로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00043

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이다.
  7. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    퓨린;
    리보스; 및
    상기 퓨린의 C8에 디티올란 유도체; 및
    상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기,
    상기 뉴클레오시드는 구조 13 또는 구조 14로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00044

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이고, DMF는 디메틸포름아미딘(dimethylformamidine)이다.
  8. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    피리미딘;
    리보스; 및
    상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 및
    상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기,
    상기 뉴클레오시드는 구조 15 또는 구조 16으로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00045

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이다.
  9. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    퓨린;
    리보스; 및
    상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 및
    상기 리보스의 3'-O에 포스포라미디트 기,
    상기 뉴클레오시드는 구조 17 또는 구조 18로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00046

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이고, DMA는 디메틸아세트아미딘(dimethylacetamidine)이다.
  10. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    리보스;
    상기 리보스의 3'-O에 숙신기; 및
    피리미딘 또는 퓨린,
    상기 피리미딘은 C5에 디티올란 유도체를 가지며, 상기 피리미딘은 구조 19 또는 구조 20으로 나타내고,
    상기 퓨린은 C8에 디티올란 유도체를 가지며, 구조 21 또는 구조 22로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00047

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이다.
  11. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    핵염기;
    리보스;
    상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 및
    상기 리보스의 3'-O에 숙신기,
    상기 핵염기는 피리미딘 또는 퓨린이고,
    상기 피리미딘은 구조 23 또는 구조 24로 나타내고,
    상기 퓨린은 구조 25 또는 구조 26으로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00048

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이고, DMA는 디메틸아세트아미딘(dimethylacetamidine)이며, DMF는 디메틸포름아미딘(dimethylformamidine)이다.
  12. 하기를 포함하는, 뉴클레오시드:
    핵염기;
    리보스;
    상기 리보스의 2'-O에 디티올란 유도체; 및
    상기 리보스의 3'-O에 고체 지지체,
    상기 핵염기는 피리미딘 또는 퓨린이고,
    상기 피리미딘은 구조 27 또는 구조 28로 나타내고,
    상기 퓨린은 구조 29 또는 구조 30으로 나타낸다:
    Figure 112021047705235-pct00049

    여기서, DMTr은 4,4'-디메톡시트리틸(4,4’-Dimethoxytrityl)이고, Ac는 아세틸(Acetyl)이며, Bz는 벤조일(Benzoyl)이고, DMA는 디메틸아세트아미딘(dimethylacetamidine)이며, DMF는 디메틸포름아미딘(dimethylformamidine)이다.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 디티올란 유도체를 포함하는, 뉴클레오시드로서, 상기 뉴클레오시드는 구조 1 내지 구조 30 중 어느 하나인 것인 뉴클레오시드.
  14. 하기를 포함하는, 결합체:
    복수의 올리고뉴클레오티드; 및
    고체 지지체,
    여기서 각각의 올리고뉴클레오티드는 제13항의 뉴클레오시드를 더 포함하고,
    제13항의 뉴클레오시드의 디티올란 유도체는 적어도 하나의 티올기에 의해 고체 지지체에 부착되며, 상기 고체 지지체는 금 또는 양자점이다.
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