WO2015184566A1

WO2015184566A1 - 一种对核酸适配体序列进行化学修饰的方法及其产品和应用

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Publication number: WO2015184566A1
Application number: PCT/CN2014/000564
Authority: WO
Inventors: 杨振军; 蔡报彬; 范鑫萌; 李理宇; 武芸; 关注; 张礼和
Original assignee: 北京大学
Priority date: 2014-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2015-12-10

Abstract

本发明提供了一种对核酸适配体序列进行化学修饰的方法及其产品，其中采用异核苷或异核苷联合2'-脱氧肌苷对核酸适配体的不同位置的核苷酸进行替换，以达到提高核酸适配体生物活性的目的。还提供了修饰后的人凝血酶的核酸适配体TBA在制备抗心脑血管疾病的药物或试剂中的应用，以及修饰后的核仁素的核酸适配体或hnRNPA1蛋白的核酸适配体在制备治疗癌症或癌症的早期检测方面的药物或试剂中的应用。

Description

一种对核酸适配体序列进行化学修饰的方法及其产品和应用技术领域

本发明涉及一种核酸适配体 (aptamer)序列修饰的方法，特别涉及一种利用异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷对核酸适配体序列进行化学修饰的方法及其产品和应用，本发明属于生物医药领域。背景技术

Aptamer, 即核酸适配体，源于拉丁语" aptus", 是由 20-60个碱基组成的单链寡聚核苷酸（RNA )或单链寡聚脱氧核苷酸（ DNA )。它能特异结合蛋白、小分子、离子和细胞等多种靶分子。核酸适配体于 1990 年由诺贝尔医学奖获得者 Szostak 和 Gold等人发明，其具有很多抗体难以比拟的优势。核酸适配体是通过 SELEX 技术筛选得到的，利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶标高亲和力结合的核酸适配体 (Aptamer)。自 Tuerk等首先运用此技术筛选到特异性吸附噬菌体 T4 DNA聚合酶和有机染料分子的特异寡核苷酸配基后，经过二十几年的发展， SELEX技术已经成为一种重要的研究手段和工具。

SELEX技术的基本原理是从一个化学合成的大容量寡核苷酸库 (R A/DNA) 中，结合 PCR扩增，指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或数十轮筛选过程，获得高亲和力、高特异性的寡核苷酸配基，即适配体。 SELEX的筛选主要包括以下几个部分：（1 ) 建库：首先人工合成一个含 10¹⁴-10¹⁵个单链寡核苷酸序列的随机文库。随机文库可以是 RNA文库，也可以是单链 DNA文库，一般随机 RNA文库较为常用。单链寡核苷酸的序列两端是带有限制性内切酶位点的固定序列，中间是 20-40个碱基的随机序列。固定序列是为增加文库的稳定性和为扩增做准备，此固定序列是 PCR反应及其他酶学反应相关引物的结合位点。随机序列不能太短，太短可能导致没有足够的二级结构同靶标分子结合，也不能太长，太长可能由于全套文库单链寡核苷酸序列一定，导致降低了选择分离出来的配基概率。（2 ) 筛选：在特定的緩冲体系和选定温度下，将所构建的随机序列库与靶标共同孵育，能与靶标进行结合的核酸会粘附在靶标上，与靶标无相互作用的核酸则会游离在緩冲体系中。（3 )分离：将孵育后与靶标结合的核酸通过物理的方法分离出来。先通过透析及电泳等方法将与靶标结合及游离的核酸分离开，然后通过升温等手段将与靶标结合的核酸与靶标分离开，得到初步能与靶标识别的核酸。 ( 4 ) PCR 扩增：将之前分离得到能与靶标结合的核酸进行 PCR扩增。由于之前分离得到的核酸数目较少，无法满足下一轮筛选的要求，因此需要进行 PCR扩增，增加所筛选得到的核酸的数量。以筛选得到的核酸为模板，在核酸聚合酶的作用下以指数的形式增长，增加样品的数量，以满足下一轮的筛选。（5 )再循环：通过 PCR扩增得到数目充足的能与靶标结合的核酸后，重复之前的筛选工作，通过数轮甚至十几轮的筛选后，既可得到与靶标进行高特异性，高亲合力结合的核酸适配体。

理论上，通过 SELEX筛选可以得到针对任何靶标的核酸适配体。利用 SELEX 筛选科学家筛选得到了一系列与人类疾病密切相关的核酸适配体，如针对 HIV-1 逆转录酶、血管内皮生长因子（VEGF )、核仁素、凝血酶、 hnR PAl蛋白等的核酸适配体。其中针对核仁素的核酸适配体 AS1411 已经完成二期临床实验，其对肾癌和非小细胞肺癌都有明显的治疗作用。针对凝血酶的核酸适配体也已经进入临床阶段。因此开展对核酸适配体的研究工作具有非常重要的意义。

目前的核酸适配体绝大多数均是通过 SELEX筛选得到。而 SELEX过程中的四个重要步驟：建库、筛选、分离、 PCR扩增，对筛选是否成功都具有比较重要的影响。目前通过合理的设计筛选库和优化分离方法能够大大提高 SELEX筛选的成功率。在 SELEX筛选中 PCR是比较重要的一个环节。在此环节中以筛选得到的核酸为模板，在 DNA聚合酶的作用下进行扩增。在 DNA的合成过程中 ,由于 DNA 聚合酶有比较强的选择性，只能识别天然的 A、 G、 C、 T四种核苷酸，所以筛选得到的核酸适配体一般只是 A、 G、 C、 T的组合。对于一些理化性质更好的核苷类似物如 UNA、 LNA、 2，-F-araN等， DNA聚合酶无法将其掺入到核酸适配体中。这种局限性限制了 SELEX 的应用。在对目前已经筛选得到的核酸适配体进行 UNA, LNA、 2，-F-araN、 2，-O-methyl修饰发现，这些经过修饰的核酸适配体在一的活性。

为了进一步增加核酸适配体与靶标的特异性，优化核酸适配体的理化性质提高核酸适配体的活性，有必要对核酸适配体进行进一步的优化。而传统的 SELEX筛选已经无法满足此要求。核酸适配体与靶标的识别是一个相互诱导契合的过程。因此在核酸适配体局部进行一定的微调，能够在保持核酸总体二级结构的前提下增强与靶标的相互作用，提高核酸适配体的特异性和生物活性。异核苷是指一类碱基由糖基的 1，位移至其它位置的核苷。类似于天然核糖，根据糖基构型的不同，异核苷又可分为 D-和 L-两种，其中 D-构型与天然核苷类型相同， L-构型则相反。由于异核苷的碱基发生移位，导致异核苷掺入的核酸适配体的局部构象发生改变。当异核苷掺入的位点为核酸适配体与靶标的作用位点时，碱基空间构象的变化会导致与靶标的空间距离发生改变，当用两种构型相反的异核苷分别掺入到核酸与耙标的结合位点时，就会导致一种与靶标的作用距离增加，活性降低，另一种构型异核苷掺入的核酸适配体与靶标的作用距离缩短，活性增加。因此将异核苷引入到核酸适配体中，通过调整核酸适配体局部空间构象，可以达到增强与靶标的作用力，进一步提高核酸适配体生物活性的目的。异核苷的这种修饰策略与 SELEX有所不同， SELEX筛选是从众多无序的核酸序列中寻找到某一条特定的能与靶标特异性结合的核酸，而异核苷修饰策略作用的对象则是对现有核酸适配体的优化。但它们的目标一致，即通过各种方法得到能与靶标高特异性结合的核酸适配体。 SELEX是一种初期的选，异核苷修饰策略是一种后期的优化，异核苷修饰策略和 SELEX歸选方法彼此相互补充和完善了筛选核酸适配体的方法。

本发明利用异核苷的修饰策略对凝血酶核酸适配体 TBA和核仁素的核酸适配体 AS1411进行异核苷修饰，都寻找到了能进一步提高与靶标亲合力的核酸适配体。通过体外实验和动物实验也证明这种异核苷修饰策略优化后的核酸适配体能够明显提高对靶标的生物活性。将这种修饰策略进行进一步的推广，将有望对各种不同的核酸适配体进行优化，从而得到与靶标特异性更强，活性更好的核酸适配体。发明内容

为了提高核酸适配体的稳定性、生物活性以及与靶标作用的特异性，本发明提供了一种利用异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷对核酸适配体序列进行化学修饰的方法及其产品，本发明通过采用异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷对核酸适配体进行化学修饰，改变了核酸适配体与靶标结合部分碱基的空间构象，从而增强了核酸适配体与靶标的相互作用，以达到增强核酸适配体对靶标的特异性，以及提高核酸适配体生物活性的目的。

为了达到上述目的，本发明釆用的技术方案如下：

本发明一种对核酸适配体序列进行化学修饰的方法，其特征在于，在核酸适配体序列的一个或多个核苷位点掺入异核苷，所述异核苷的结构式如化学式 I或化学式 II所示，化学式 I所示的异核苷为 L-构型的异核苷，化学式 II所示的异核苷为 D-构型的异核苷，其中， Base为腺嘌呤八、胸腺嘧啶丁、鸟嘌呤 G或胞嘧啶 C,

用化学式 I或化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联。

在本发明中，优选的，在核酸适配体序列的一个或多个核苷位点掺入异核苷的同时，还包括在核酸适配体序列的一个或多个核苷位点掺入 2，-脱氧肌苷，所述的

2，-脱氧肌苷的结构式如化学式 III所示：

然核苷在相应位置进行偶联。

D/L构型异核苷与天然核苷相比具有如下特点： a. 碱基从糖环的 Γ位移到 2，位； b. L构型异核苷的糖环发生翻转，局部构象变化相比 D构型核苷较大。导致在氨基酸序列不变的前提下，釆用 D/L 异核苷修饰的核酸适配体与天然的核酸适配体相比构象会发生一定的变化。当这种修饰位点处于与靶标结合的区域时，则会起到调节与靶标结合的作用。部分位点掺入异核苷，最终达到提高与靶标的结合力、增强生物活性的目的。 2，-脱氧肌苷的作用与异核苷的作用类似，但它主要通过调整碱基来达到调整局部空间构象的目的。

在本发明所述的化学修饰方法中，在对核酸适配体进行化学修饰前，将化学式 I、化学式 II所示的异核苷化合物和化学式 III所示的 2，-脱氧肌苷化合物分别制备成化学式 IV、化学式 V所示的异核苷亚磷酰胺单体和化学式 VI所示的 2， -脱氧肌苷亚磷酰胺单体，所述的异核苷亚磷酰胺单体的合成方法可参见文献 (HW Yu, LR Zhang, JC Zhuo, LT Ma, LH Zhang, Bioorg. Med. Chem., 1996, 40, 609 - 614)。 NC p oa¾a¾C

其中， Base选自腺嘌呤 A、胸腺嘧啶1\ 鸟嘌呤 G或胞嘧啶(3。

在本发明所述的修饰方法中，使用固相合成技术，采用亚磷酰胺法合成核酸适配体的寡核苷酸链，在 DNA合成仪上，将一个或几个所述的异核苷亚磷酰胺单体或者将一个或几个所述的异核苷亚磷酰胺单体和一个或几个所述的 2，-脱氧肌苷亚磷酰胺单体同时掺入到所合成的序列中代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：脱 DMT、偶联、封闭、氧化。

由于异核苷亚磷酰胺单体常规条件下的偶联收率较低，需增加异核苷亚磷酰胺单体的进样次数和每次进样后的偶联时间以保证合成的收率。合成 DNA寡核苷酸链的条件是采用增加核苷亚磷酰化单体的进样次数至 2-6次；每次进样后的偶联时间为 120-240秒 /次；合成异核苷 /2，-脱氧肌苷修饰的 DNA寡核苷酸链的条件是每次进样后的偶联时间增加至 200-360秒 /次，偶联 2-6次。

进一步的，本发明还提出了按照以上任一项所述的方法合成的异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的核酸适配体序列。

在本发明的具体实施例中，所述的核酸适配体为人的凝血酶的核酸适配体 (TBA) ，核仁素的核酸适配体， hn NPAl蛋白的核酸适配体；其中，修饰前的人的凝血酶的核酸适配体 (TBA)序列如 SEQ ID No.l所示，修饰前的核仁素的核酸适配体序列 (AS1411)序列如 SEQ ID No.2所示，修饰前的 hnR PAl蛋白的核酸适配体序列 (BC15-31)如 SEQ ID No.3所示。

在本发明的具体实施例中，修饰后的凝血酶的核酸适配体序列选自以下序列所组成的群组：

1 )在 SEQ ID No.l所示 TBA序列的 3、 9或 12位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的三条核酸适配体（TBA-3L、 TBA-9L 和 TBA-12L ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T; 2 )在 SEQ ID No. l所示 TBA序列的 7位掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（TBA-7D ), 其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

3 ) 同时在 SEQ ID No. l所示 TBA序列的 7位和 12位分别掺入化学式 II和化学式 I 所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体

( TBA-7D/12L ), 其中， Base为胸腺嘧¹¹定 T; 以及

4 ) 同时在 SEQ ID No. l所示 TBA序列的 7位和 3位掺入化学式 II和化学式 I 所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体

( TBA-7D/3L ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T。

在本发明的具体实施例中，修饰后的核仁素的核酸适配体序列选自以下序列所组成的群组：

1 )在 SEQ ID No.2所示的 AS 1411序列的 6位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（AS1411-6L ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T;

2 )在 SEQ ID No.2所示的 AS 1411序列的 12位掺入式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（AS 1411-12D ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T; 以及

3 ) 同时在 SEQ ID No.2所示的 AS 1411序列的 6位和 12位分别掺入化学式 I 和化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体

( AS 1411-6L/12D ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T; 以及

4 )同时在 SEQ ID No.2所示的 AS1411序列的 6位， 12位和 24分别掺入化学式 I，化学式 II所示的异核苷和化学式 III所示的 2，-脱氧肌苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（AS 1411-6L/12D/24dI ), 其中， Base为胸腺嘧啶丁。

在本发明的具体实施例中 , 修饰后的 hnRNPAl蛋白的核酸适配体序列选自以下序列所组成的群组：

1 )在 SEQ ID No.3所示的 BC 15-31序列的 3位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（BC15-31-3L ), 其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

2 )在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（BC15-31-3D ), 其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

3 )在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 30位掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（ BC15-31-30D );

4 ) 同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 1位和 3位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体

( BC15-31-1L/3L ), 其中， Base为胸腺嘧丁；

5 )同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 1位和 30掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（ BC15-31-1L /30L ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T;

6 )同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位和 30掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（ BC15-31-3L/ 30L ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T;

7 ) 同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位和 30掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体（ BC15-31-3D /30D ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T;

8 )同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位和 30位分别掺入化学式 I, 化学式 II 所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体

( BC15-31-3L/ 30D ), 其中， Base为胸腺嘧啶 T;

以 TBA-3L为例，以上所述在 SEQ ID No.l所示 TBA序列的 3位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联是指 TBA链： 5，-GGT TGG TGT GGT TGG -3' ( SEQ ID No.l所示）核苷酸序列中 5，端开始第 3个核苷酸（即" T" ), 其余以此类推。

研究证明，本发明提供的异核苷修饰的 TBA-12L, AS1411-6L具有理化性质稳定、合成效率高等特点；此外 TBA-12L、 TBA-7D/12L、 TBA-3L/12L、 AS1411-6L、 AS1411-6L/12D/24dI、 BC15-31-3D/30D, BC15-31-3L/30D具有比天然的母体序列更好的生物活性。

在 TBA的 7位掺入化学式 II所示的异胸苷（ TBA-7D )、在 12位掺入化学式 I 所示异胸苷（ TBA-12L )、同时在 TBA的 7和 12位分别掺入化学式 II和化学式 I 所示的异胸苷（TBA-7D/12L ), 代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的修饰后的 TBA能够显著提高其与凝血酶的结合力及其抗凝血活性。将异核苷掺入到 AS1411 中的活性结果应用到 MCF-7 癌细胞系中，蛋白水平及细胞水平结果表明：在 AS1411正义链的 6位掺入化学式 I所示的异胸苷（AS1411-6L )、在 AS1411正义链 12位掺入化学式 II所示的异胸苷（AS1411-12D )及同时在 AS1411正义链的 6 位和 12位分别掺入化学式 I和化学式 II所示的异胸苷（AS1411-6L/12D )代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的修饰后 AS1411能够显著提高其与核仁素的结合力及抑制癌细胞增殖活性。将异核苷联合 2，-脱氧肌苷对 AS1411进行化学修饰发现，同时在 AS1411序列的 6位掺入化学式 I所示的异胸苷，在 12位掺入式 II所示的异胸苷，以及在 24位掺入 III所示的 2，-脱氧肌苷代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的修饰后的核酸适配体（AS1411-6L/12D/24dI )能够进一步提高其与核仁素的结合力及抑制 MCF-7 癌细胞增殖活力，动物实验也表明 AS1411-6L/12D/24dI 能够显示抑制小鼠肿瘤的生长。在动物实验中发现 AS1411-6L, AS1411-12D和 AS1411-AS1411-6L/12D/24dI也能够明显地抑制小鼠肿瘤的生长。

因此，更进一步的，本发明提出了所述的核酸适配体序列在制备抗心脑血管疾病的药物或试剂中的应用，所述的核酸适配体序列为异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的人的凝血酶的核酸适配体 (TBA)。及

所述的核酸适配体序列在制备治疗癌症或癌症的早期检测方面的药物或试剂中的应用，所述的核酸适配体序列为异核苷或异核苷联合 2，-脱氧 ^^苷饰的核仁素的核酸适配体或 hnRNPAl蛋白的核酸适配体。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1. 本发明提供的异核苷修饰 /异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的 TBA、 AS1411、 BC15-31 , 具有理化性质稳定、合成效率高等特点；产物自身具有比天然核酸适体更好的生物活性。

2. 通过全面考察异核苷 /异核苷联合 2，-脱氧肌苷在不同位点掺入的核酸适配体，改善了核酸适配体的血清稳定性增强了核酸适配体与耙标的结合力、提高了核酸适配体的体外活性。此外，动物实验结果也表明异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的核酸适配体可以提高在动物水平对癌组织的抑制作用，为异核苷修饰的核酸适配体的临床应用提供了重要的指导意义。 3. 本发明提供的异核苷化合物能够显著地提高经过其修饰的 TBA 的酶稳定性，与靶标的结合力。通过体外实验与人体血浆进行作用发现经过异核苷修饰的 TBA能够显示提高其抗凝效果，这为异核苷修饰的 TBA在以后的临床应用提供了进一步的理论支持。发现在 TBA的 7位掺入化学式 II所示的异核苷（ TBA-7D )、在 12位掺入式 I所示的异核苷（ TBA-12L )、同时在 7位和 12位分别掺入化学式 II和化学式 I所示的异核苷（ TBA-7D/12L )、同时在 TBA的 7位和 3位分别掺入化学式 II和化学式 I所示的异核苷（ TBA-7D/3L )代替天然核苷在相应位置进行偶联的 TBA能够显著提高 TBA与凝血酶的结合力及其抗凝血活性。其中在 TBA的 12 位掺入化学式 I 所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的 TBA ( TBA-12L )具有最佳的体外活性。经过异核苷修 _饰的 AS1411能够显著提高与靶标的结合力，通过细胞水平的实验及动物实验发现 AS1411-12L能够显著提高抑制 MCF-7癌细胞系增殖的能力，这为异核苷修饰的 AS1411在以后的临床应用提供了进一步的理论支持。经过异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的 AS1411-6L/12D/24dI 能够显著提高与靶标的结合力，在动物水平最强的抑制小鼠肿瘤的生长的活性。经过异核苷修饰的 BC15-31-3D/30D、 BC15-31-3L/30D够明显提高对 A549肿瘤细胞的抑制活性。附图说明

图 1为异核苷修饰 TBA的 CD光傳实验结果图；

图 2为天然的及异核苷修饰的 AS1411的 CD光谱实验结果图；

图 3 为 D/L异核苷修饰 TBA的血清稳定性实验结果图；

图 4为 D/L异核苷修饰 BC15-31在 10%及 50%胎牛血清中的稳定性实验结果图；

图 5为单位点异核苷修饰 TBA与凝血酶亲合力实验结果图；

图 6为双位点异核苷修饰 TBA与凝血酶亲合力实验结果图；

图 7为单位点异核苷修饰 TBA体外抗凝活性结果图；

图 8为双位点异核苷修饰 TBA体外抗凝活性结果图；

图 9为化合物 AS1411及单位点异核苷修饰产物的细胞抑制增殖实验结果图；图 10为双位点异核苷及异核苷联合 2，-脱氧肌苷组合修饰的 AS1411细胞抑制增殖实验结果图；图 11为不同位点修饰的 AS1411对 293细胞的细胞抑制实验结果图；图 12为单位点及双位点异核苷修饰的 BC15-31对 A549肿瘤细胞增殖活性实验结果图；

图 13为不同核酸适配体识别肝癌组织切片结果；

图 14为双位点异核苷及异核苷联合 2，-脱氧肌苷组合修饰 AS1411动物水平活性评价结果。

本发明中使用的化学命名：

AIBN 偶氮二异丁腈

Bu3SnH 三正丁基锡氢

Bz- 苯曱醜基

DBU 1, 8-二氮杂双环 (5.4.0)十一 -7-烯

DMAP 4-二甲氨基吡啶

DMTr 二曱氧基三苯曱基

DMF N-曱酰二甲胺

Py 匕

TFA 三氟乙酸

TMS- 2,4,6-三甲基苯磺酰基

Ts- 对甲苯磺基

9-BBN 9-硼二环 [3.3.1]壬烷具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例 1 异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的 TBA、 AS1411和 BC15-31 固相合成

DNA的合成采用 Appllied Biosystems model 394 DNA固相合成仪。

正常的脱氧核苷亚磷酰化单体 (dT， dGAc, dABz, dCAc)从上海吉玛制药技术有 P艮公司购买； 2， -脱氧肌苷亚磷酰胺单体（化合物 VI )从上海智研科技有限公司 (上海）购买。 CPG(CPG-dG)， CAP-A和 CAP-B , 氧化 12液， C13CCOOH从北京奥科生物科技公司购买； 0.25M的 5-乙巯基 1H-四氮唑溶液从上海智研科技有限公司（上海）购买。

按照文献 (HW Yu, LR Zhang, JC Zhuo, LT Ma, LH Zhang, Bioorg. Med. Chem., 1996, 40, 609-614)的方法，将化学式 I以及化学式 II所示的异核苷化合物分別制备成化学式 IV以及化学式 V所示的异核苷亚磷酰胺单体。即：将单体化合物 I、 II 分别在真空中干燥，加 3.5倍当量的 1H-四氮唑，真空干燥过夜，加入 5ml无水吡啶，水浴条件下，加入 3.5当量的亚磷试剂，反应完成后蒸干溶剂，于无水无氧条件下采用硅胶柱分离，最终得到白色固体，即化合物 IV、 V。

其中， Base选自腺嘌呤 A、胸腺嘧啶 T、鸟嘌呤 G或胞嘧啶。。

合成规模：〜 1.0 μηιοΐ

1H-四氮唑溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成 0.5 M 1H-四氮唑溶液；

核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成 0.12 Μ 溶液；

异核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下取 0.231 mmol的 {5S-[3-O-(4,4，- 二曱氧基三苯基甲基) -曱基 ]-4R-O-[(2-氰乙基 -Ν,Ν'-二异丙基) -亚磷酰胺基 ]-3S- (胸腺嘧啶基 -1-yl)}-四氢呋喃（化学式 IV所示的异核苷化合物），加入 2.5 ml的无水乙腈，配成 0.092 M的溶液；氩气保护下取 0.244 mmol的{51 -[3-0-(4,4，-二甲氧基三苯基曱基) -曱基 ]-4S-O-[(2-氰乙基 -N，N，-二异丙基) -亚磷酰胺基 ]-3R- (胸腺嘧啶基 -1-yl)}-四氢呋喃（化学式 V所示的异核苷化合物；)，加入 2.5 ml的无水乙腈，配成 0.098 M的溶液；

2， -脱氧肌苷亚磷酰胺单体溶液的配制：氩气保护下称量 2， -脱氧肌苷亚磷酰胺单体，加无水乙腈，配成 0.12 M的溶液；

采用固相合成的方法合成了天然的及异核苷修饰的 TBA、 AS 141 K BC15-31 序列。在 DNA合成仪上，将一个或几个所述的异核苷亚磷酰胺单体或者将一个或几个所述的异核苷亚磷酰胺单体和一个或几个所述的 2，-脱氧肌苷亚磷酰胺单体同时掺入到所合成的序列中代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：脱 DMT、偶联、封闭、氧化。

其中，人的凝血酶的核酸适配体 (TBA) 修饰前的序列如 SEQ ID No. l所示，核仁素的核酸适配体序列 (AS1411) ^[ 饰前的序列如 SEQ ID No.2所示， hn PAl 蛋白的核酸适配体序列 (BC15-31)修饰前的序列如 SEQ ID No.3所示，

以合成 TBA-3L为例，在 SEQ ID No. l所示 TBA序列的 3位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联，即在 TBA链： 5，-GGT TGG TGT GGT TGG -3， ( SEQ ID No. l所示）的核苷酸序列中 5，端开始第 3个核苷酸（即" T" ), 的位置处掺入化学式 I ( L构型，其中 Base选自胸腺嘧啶 T )所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联，其余以此类推。

合成步骤：每次称量约 33 mg CPG-dC/CPG-dG装入合成柱中，按照 ABi394 核酸合成仪的标准步骤，每次合成共 84步。正常核苷单体偶联 3次，每次 180秒，异核苷单体偶联 3次，每次 300秒，共计偶联时间 15分钟。

DNA的切割、脱保护：合成结束后，取下 CPG，等体积加入质量分数为 30% 浓氨水以及质量分数为 25%甲胺水溶液，恒温 60。C，摇床振荡反应 60分钟，将寡核苷酸从 CPG上切割下来并脱除部分保护基，离心干燥。然后加入适量纯净水溶解，于 1万 4千转 /分钟的离心机上离心 10分钟，将上清取出，离心干燥，将产物放置 -80°C下保存。

DNA的分离纯化：混合物以纯水溶解， HPLC (Sephedax G-25 , 50% 乙腈的水溶液）脱盐，离心干燥。而后 HPLC 方式纯化，釆用如下条件： Dionex-DNA Pac-PA200阴离子交换柱梯度洗脱， 0-40 min, 10% -30% A液 (B液： 0.02 M tris-HClO₄ 緩沖液， pH 为 8.0，含有 10% (指体积分数） MeCN; A液： 0.4 mol/L NaClO₄ in B 液)，流速 1.2 ml/min。冷冻干燥所得产物， DEPC水复溶， HPLC (Sephedax G-25) 脱盐，冷冻干燥，得到目标单链 DNA, -80°C保存。实施例 2 修饰后的 TB A及 AS 1411序列的基本性质研究

1、样品名称： TBA序列的 3位、 4位、 7位、 9位、 12位或 13位掺入化学式 I或化学式 II所示的异核苷（其中 Base选自胸腺嘧啶 T ), 代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的修饰后的 TBA序列，按照实施例 1方法制备；

AS1411序列的 3位、 6位、 9位、 12位、 13位、 15位或 24位掺入化学式 I 或化学式 II所示的异核苷（其中 Base选自胸腺嘧啶 T ) 或化学式 III所示的 2，-脱氧肌苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的修饰后的 AS1411序列，按照实施例 1方法制备。

2、方法

( 1 ) Tm值测定

将天然的及异核苷修饰的 TBA溶于 Tm緩冲液中（0.1 M KC1, 0.01M次曱砷酸钠，pH 7.0), 所有样品在 95°C变性 5 min后，緩慢降至室温，待测。釆用紫外分光光度计测定样品的紫外吸收，波长范围为 200-400 nm，吸收波长为 295 nm, 升温 ( 25。C至 90°C，升温速度为 0.3。C/min ), 记录紫外吸收随温度变化曲线，采用一阶微分法计算 Tm值。实验结果见表 1。

表 1 D/L异核苷修饰 TBA的热力学稳定性实验结果核酸适配体序列 Tm (°C) △Tm (°C)

TBA 5，-GGTTGGTGTGGTTGG-3， 49.8

TBA-3D 5 '-GGr_DTGGTGTGGTTGG-3 ' 51.3 1.5

TBA-3L 5 '-GGriTGGTGTGGTTGG-3 ' 52.3 2.5

TBA-4D 5'-GGTr_DGGTGTGGTTGG-3' 35.9 -13.9

TBA-4L 5 '-GGr_LTGGTGTGGTTGG-3 ' 44.5 -5.3

TBA-7D 5，-GGTTGG GTGGTTGG-3 ' 55.2 5.4

TBA-7L 5， -GGTTGG7iGTGGTTGG-3 ' 37.1 -12.7

TBA-9D 5， -GGTTGGTGr_DGGTTGG-3 ' 38.6 -11.2

TBA-9L 5， -GGTTGGTGr_L GGTTGG-3 ' 54.9 5.1

TBA-12D 5， -GGTTGGTGTGG2VTGG-3， 50.7 0.9

TBA-12L 5， -GGTTGGTGTGGr_LTGG-3 ' 52.9 3.1

TBA-13D 5 '-GGTTGGTGTGGTr_DGG-3 ' 32.3 -17.5

TBA-13L 5'-GGTTGGTGTGGTriGG-3' 46.5 -3.3

Buffer: 100 mM KC1, 10 mM二甲砷酸钠， pH 7.0 其中 D下标表示 D-异核苷酸修饰， L下标表示 L-异核苷酸修饰； ( 2 ) CD光谱分析

用 lxCD 緩冲液 (138 mM NaCl, 2.7 mM KC1, 10 mM Na₂HPO₄, 1.76 mM KH₂PO₄ , pH 7.4)溶解 TBA序列测试样品，所有样品在 95°C变性 5 min后，緩慢降至室温，待测。 CD扫描范围从 200-400 nm,温度恒定为 25。C,扫描间隔 0.2 nm, 扫描速度 100 nm/min, 每个样品重复 3次扫描，采用仪器自带软件进行平滑处理。实验结果见图 1。

用 PBS溶解 AS 1411序列样品，所有样品在 95。C变性 5min后，緩慢降至室温，待测。 CD扫描范围从 200-400 nm, 温度恒定为 25°C, 扫描间隔 0.2 nm，扫描速度 100 nm/min, 每个样品重复 3次扫描，采用仪器自带软件进行平滑处理。实验结果见图 2。实施例 3 血清稳定性考察

1、样品名称： TBA-9L、 TBA-9D、 TBA-7L、 TBA-7D、 BC15-31-1L/ 30D、 BC15-31-1L/ 3L、 BC15-31-3L/ 30L、 BC15-31-3L/ 30D、 BC15-31-3D/ 30D, 分别按照实施例 1方法制备。

2、方法

分别考察上述不同核酸适配体以及未经修饰核酸适配体 TBA、； BC15-31在 10% 及 50% (体积分数)的胎牛血清中的稳定性。将核酸适配体溶解于 PBS中配制成一定浓度，于 95°C变性 5 min后退火，緩' f曼降至室温，加入不同体积的胎牛血清，用 PBS緩冲液稀释，使胎牛血清的浓度分别达到 10%和 50%，核酸终浓度为 20 g/mL。 37°C 孵育，于不同的时间点取出， -80。C迅速冷冻淬灭反应。样品在 20 % 的变性聚丙浠酰胺凝胶电泳 110V电压条件下分离，用 0.1% SYBR Gold核酸染料染色 15min, 用化学发光凝胶成像系统对电泳结果进行成像分析。实验结果见图 3 和图 4。变性胶配方如下表 2:

2

试剂 20%聚丙烯酰胺凝胶 (mL)

尿素 3.36g

40%丙烯酰胺 4

10%过硫酸铵 0.07

TEMED 0.008

ddH₂O

结果表明，经过修饰后的核酸适配体，相较于未修饰的核酸适配体其血清稳定性得到一定提高。实施例 4 SPR测定异核苷修饰的 TBA序列、异核苷修饰及异核苷联合脱氧肌苷修饰的 AS1411序列、异核苷修饰的 BC15-31序列分别与凝血酶、核仁素蛋白、 hnRNPAl蛋白的亲合力

1、样品名称： TBA-3D、 TBA-3L、 TBA-4D、 TBA-4L、 TBA-7D、 TBA-7L、 TBA-9D、 TBA-9L、 TBA- 12D , TBA-12L、 TBA- 13D . TBA-13L、 TBA-3L7D、 TBA-3L9L、 TBA-3L12L、 TBA-7D9L、 TBA-7D12L、 TBA-9L12L, AS1411-6L、 AS1411-12D. AS1411-13L、 AS1411-6L/12D、 AS1411-6L/12D/24dI、 BC15-31-3L, BC15-31-3D、 BC15-31-1L/3L、 BC15-31-1L/30L 以及 BC15-31-3L/30L, 按照实施例 1方法制备。

2、方法

( 1 )将凝血酶蛋白、核仁素蛋白及 hnRNPAl蛋白固定在 CM5芯片上将一定量的凝血酶 /核仁素 /hnRNPAl蛋白分别用合适的 pH值的醋酸钠溶液配成一系列浓度的溶液，优选蛋白在芯片表面的最佳偶联条件。具体操作如下： PBS 緩冲液为流动工作液，温度 25°C, 流速 10 μΙ7πώι, 稳定基线。将 EDC和 HS混合液以 5 μΐνπήη的流速流过芯片表面 7 min, 活化表面的羧基。分别配制成不同浓度的凝血酶 /核仁素蛋白/ hnRNPAl蛋白溶液，注入芯片表面，找到偶联至芯片表面最合适的浓度。然后，以盐酸乙醇胺（ 1 mmol/L, pH 8.5)封闭未反应的活化羧基，时间约为 2-3 h。以通道 1 为空白对照通道，通道 2作为实验组进行下一步研究。

( 2 ) 天然及异核苷修饰的 TBA、异核苷修饰及异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的 AS1411、异核苷修饰的 BC15-31分别与凝血酶、核仁素蛋白、 hnRNPAl蛋白的相互作用

将天然及异核苷修饰的 TBA、异核苷修饰及及异核苷联合 2'-脱氧肌苷修饰的 AS1411、异核苷修饰的 BC15-31分别配制成 0.02~100μΜ范围内的一系列浓度梯度的溶液（PBS緩冲液），以 30 μΙ7πιίη， 3 min，解离时间为 5 min的流速流过芯片表面，实时记录其与凝血酶的结合情况。反应结束后，用不同浓度的 NaOH作为再生液，根据传感图的 RU值变化，评价其洗脱效果，从中选择合适的再生溶液, 用于芯片的重复使用。

( 3 )动力学实验

根据上述实验筛选的结果，选择合适的不同浓度梯度进行动力学实验，将测得的数据用 Scatchard曲线计算核酸适配体与靶标蛋白相互作用的平衡解离常数 (Kd) 值。再生液 NaOH的浓度选定为 10 mM。

( 4 )数据处理

所有实验数据采用 BIAcore3000的 Bia evaluation分析软件进行处理分析。 3、实验结果

TBA与凝血酶相互作用的亲合力实验结果见图 5和图 6，结果说明在 TBA的 7位掺入由化学式 II所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 V、在 12位掺入由化学式 I所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 IV、同时在 TBA的 7和 12位分别掺入由化学式 II和化合式 I所制备的异核苷亚磷酰胺单体 V和 IV、同时在 TBA的 3位和 7位分别掺入化学式 I和化学式 II所制备的异核苷亚磷酰胺单体 IV和 V代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联的 TBA能够显著提高其与凝血酶的结合力。单位点异核苷修饰的 AS1411与核仁素蛋白的亲合力实验结果见表 3。双位点异核苷修饰 AS1411及异核苷 /2，-脱氧肌苷组合修饰 AS1411与核仁素蛋白的亲合力实验结果见表 4。单位点异核苷修饰的 BC15-31与 hnRNPAl蛋白的亲合力实验结果见表 5。双位点异核苷修饰的 BC15-31与 hnRNPAl蛋白的亲合力实验结果见表 6。

表 3 天然及单位点 D/L异核苷修饰的 AS1411与靶标的亲合力测试实验结果核酸适配体序列 Kd (nmol)

AS1411 5， -GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3' 345

AS1411-6L 5， -GGT GGTz, GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3' 51.2

AS1411-12D 5， -GGT GGT GGT GGT_D TGT GGT GGT GGT GG-3' 69.6

AS1411-13L 5， -GGT GGT GGT GGT T_LGT GGT GGT GGT GG-3' 304

表 4 天然、双位点 D/L异核苷组合修饰、双位点 D/L异核苷联合 2，-脱氧肌苷组合修饰的 AS1411与靶标的亲合力测试实验结果核酸适配体序列 Kd (nM)

AS1411 5，-GGT GGT GGT GGT TGT GGT GGT GGT GG-3' 148.00

AS1411-6L/12D 5，-GGT GGT , GGT GGT_D TGT GGT GGT GGT GG-3 ' 9.56

AS1411-6L/12D/24dI 5， -GGT GGTi GGT GGT_D TGT GGT GGT GGdl GG-3' 4.70 表 5单位点异核苷修饰 BC15-31与靶标的亲合力测试实验结果核酸适配体序列 Kd/nM

BC15-31 5'-TGTGGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATC-3' 255.71

BC15-31-3L 5'-TGT GGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATC-3' 112.87

BC15-31-3D 5'-TGT_DGGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATC-3' 159.57 表 6双位点异核苷修饰 BC15-31与靶标的亲合力测试实验结果核酸适配体 K_d/nM

BC15-31 5'-TGTGGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATC-3' 60.96

BC15-31-1L/3L 5'-TiGTiGGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATC-3' 14.28 BC15-31-1L/30L 5'-TiGTGGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTAT_LC-3' 40.40 BC15-31-3L/30L 5'-TGT GGCGAGGTAGGTGGGGTGTGTGTGTATiC-3' 51.71

实施例 5 异核苷饰的 TBA体外抗凝活性考察

1、样品名称： TBA-3D、 TBA-3L、 TBA-4D、 TBA-4L、 TBA-7D、 TBA-7L、 TBA-9D、 TBA-9L、 TBA-12D、 TBA-12L、 TBA-13D、 TBA-13L、 TBA-3L7D、 TBA-3L9L、 TBA-3L12L、 TBA-7D9L、 TBA-7D12L、 TBA-9L12L, 按照实施例 1 方法制备。

2、方法

将天然及不同位点异核苷修饰的 TBA溶解于 PBS緩冲液中 , 于 95°C下加热 5 min, 后緩慢冷却至室温，用凝血酶时间（ TT ) 测定试剂盒中的緩冲液溶解，使核酸样品的浓度为 0.33μΜ。取人的血液，于 3000转 /分钟离心 30 min, 取上层血浆，备用。取 200μ 人血浆，置于凝血仪中，快速加入 lOO L溶解有核酸样品的 TT緩冲液，测定不同核酸适配体对血液的抗凝时间，实验结果如图 7和图 8所示。实验结果表明在 TBA的 Ί位掺入由化学式 II所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 V、在 3位掺入由化学式 I所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 IV、在 9位掺入由化学式 I所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 IV、在 12位掺入由化学式 I所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 IV、同时在 7位和 12位分别掺入由化学式 II所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 V和由化学式 I所示化合物制备的异核苷亚磷酰胺单体 IV、同时在 3位和 7位分别掺入由化学式 I所示化合物制备的替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联得到的修饰后的 TBA具有更强的体外抗凝活性。实施例 6 异核苷及异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的 AS1411对 MCF-7癌细胞的抑制增殖活性测定及对正常细胞的影响

1、样品名称： AS1411-3D, AS1411-3L、 AS1411-6D、 AS1411-6L、 AS1411-15D、 AS1411-15L、 AS1411-9D、 AS1411-9L、 AS1411-12D、 AS1411-12L、 AS1411-13D、 AS1411-13L, AS1411-24D、 AS1411-24L, AS1411-6L/12D, AS1411-6L/12D/24dI, 按照实施例 1方法制备。

2、方法

将 MCF-7乳腺癌细胞以及 293细胞分别铺板在 96孔板中，以适当的血清为培养基，使细胞浓度为 1.5χ 10³/孔为宜。 16 小时后，使细胞附着，将寡核苷酸（或 PBS作为对照）直接加入到培养基中，使寡核苷酸的终浓度为 0.75 μΜ。在随后的 2-4天内，将寡核苷酸的剂量减半，加入到培养基中。细胞铺板后使用细胞计数试剂盒 CCK-8对每天细胞数量进行计数。在整个实验过程中，不更换培养基。实验结果如图 9 和图 10 所示，结果表明对于 MCF-7 乳腺癌细胞， AS1411-6L、 AS1411-12D、 AS1411-6L/12D(6L/12D)、 AS1411-6L/12D/24dI(6L/12D/24dI)给药组细胞吸光度 OD 值明显低于 AS1411 给药组，说明 AS1411-6L、 AS1411-12D. AS 1411 -6L/ 12D(6L/ 12D)、 AS1411-6L/12D24dI (6L/ 12D/24dI)能够对细胞生长产生更明显的抑制作用。图 11为不同位点修饰的 AS1411对 293细胞的细胞抵制实验结果图，从该结果可以看出对于 293A正常细胞，不同适配体给药均不会抑制细胞生长，即对于正常细胞的生长无影响。

以上实验表明 AS1411-6L/12D、 AS1411-6L/12D/24dI能够显著抑制 MCF-7乳腺癌细胞生长，而对于正常细胞无作用。实施例 7 异核苷修饰的 BC15-31对 A549肿瘤细胞的抑制增殖活性测定

1、样品名称： BC15、 BC15-31、 BC15-31-3D、 BC15-31-3L、 BC15-31-15D、 BC15-31-15L、 BC15-31-22D、 BC15-31-22L、 BC15-31-26D、 BC15-31-26L、 BC15-31-24D、 BC15-31-24L, BC15-31-28L , BC15-31-30D、 BC15-31-30L, 按照实施例 1方法制备。

2、方法

(1) 细胞转染：将对数生长期的 A549肿瘤细胞，加入适量胰酶消化，制备成单细胞悬液。调整细胞浓度，以每孔 2000-4000 个细胞的密度接种于 96孔培养板。培养过夜后，使转染时细胞汇合率达约 50-70%;

(2) 转染：核酸样品 ( g)与 Lipofectamine 2000^L)的比例为 1 : 2.5;

a. 核酸适配体用量为 0.4 μ_δ /孔，用 50 μΐ^无血清培养液稀释，柔和混匀； b. 按上述比例的 Lipofectamine 2000 用 50 无血清培养液稀释，轻轻混匀，室温静置 5 min;

c. 将稀释好的核酸样品和 Lipofectamine 2000 试剂混合，轻柔混匀，室温静置 20min;

d. 转染前约 l h，将细胞培养基更换为无血清培养基；

e. 将约 100 μΐ:混合物加入 96 孔板中，十字形晃匀，培养 4 h后，更换为含

A清培养基培养。

(³) MTT检测：在 ³⁷ °C再继续培养 24 1！〜 ⁹⁶h。弃去培养基，每孔加入 100 新配制的含 20(^L/mL MTS 的无血清无抗生素培养基， 37。C培养 2 h后，用酶标仪检测波长 490 nm 的光吸收值。

实验结果如图 12 所示，相比天然 BC15-31 ， BC15-31-3D/30D 和 BC15-31-3L/30D对于 A549肿瘤细胞的抑制能力有显著提高。实施例 8异核苷修饰的核酸适配体与肝癌组织的特异性结合实验

1、组织切片的处理

石蜡组织切片进行筛选及结合鉴定之前先进行常规脱蜡。组织切片置于二甲苯中浸泡 20min; 更换二甲苯后再浸泡 20min; 依次在无水乙醇、 95%乙醇、 90%乙醇、 80%乙醇、 70%乙醇中各浸泡 5min; 用 PBS浸泡 5min，共 2次。然后进行抗原微波热修复，即将切片放入盛有 0.01mol/L枸橼酸钠緩冲液 (pH 6.0)的容器中，微波炉加热，使容器内液体温度保持在 92°C~98°C并持续约 20min, 取出容器，冷却至室温。

2、核酸适配体与肝组织切片结合实验

抗原修复，所用核酸适配体序列为 BC15-31及其异核苷双位点修饰后的序列： BC15-31-3L/30L, BC15-31-1L/30L以及 BC15-31-1L/3L。

(1) 经抗原修复后的石蜡组织切片用 PBS洗涤 3次，每次 3min;

(2) PBS-0.3%Triton X100室温透化 15min;

(3) PBS-0.3%Tween 20室温透化 15min; (3) 用体积约为 10(^LPBS-l%BSA-0.1 g^L ytRNA-l g^L鲑鱼精 DNA緩冲液，在室温下封闭 15min;

(4) 将约 lOOpmol FAM标记的核酸适配体，孵育体积约为 50μ]:〜100μΙ 湿盒中 37°C避光孵育 2h;

(5) 弃液体，滴加 0.25%伊文氏蓝溶液在室温染色 lOmin;

(6) PBS洗涤 3次，每次 5min;

(7) 擦干组织周边水渍，用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察并留图。

为比较异核苷修饰的 BC15-31 是否具有更优秀的肝癌组织识别能力，采用同一患者的肝癌组织切片进行对比研究。实验操作步骤如上所述。结果见图 13。结果显示：各核酸适配体识别能力依次为 BC15-31-1L/3L>BC15-31-1L/30L> BC 15-31>BC 15-31 -3L/30L>BC 15 , 异核苷双位点修饰后的 BC15-31序列能够特异的结合耙组织切片，即肝癌石蜡组织切片中具有明显异形核变化的癌细胞，染色部位主要在细胞核。此结果与亲和力测定结果基本一致。实施例 9异核苷及异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的 AS1411对小鼠的肿瘤抑制生长实验

通过对小鼠在皮下接种浓度为 5χ 10⁶个细胞 /200 iL的 MCF-7细胞建立异种移植物，每个位点在棵鼠的右背面建立。接种 5天后，当肿瘤体积达到大约 100 mm³ 时，将小鼠随机分为 5组 (n=6)即：空白（PBS)、对照 (AS1411)、 AS1411-12D(12D)、 AS1411-6L12D(6L/12D)、 AS 1411 -6L 12D24dI(6L/ 12D/24dI) ₀ 对已建立肿瘤模型的小鼠，通过腹腔注射核酸适配体的方式进行治疗，注射剂量相当于 2.5 OD/小鼠 / 天。在 1-4天每天注射一次，在第六天和第八天分别注射一次，共注射六次。肿瘤体积使用如下公式计算：

V=LxW2/2

其中， L和 W分别代表在实验过程中使用游标卡尺所测定的肿瘤的长度和宽度。定期测定棵鼠的重量，以进行毒性的考察。从图 14可以看出，双位点异核苷修饰的适配体 AS1411-6L/12D(6L/12D) 及异核苷联合 2，-脱氧肌苷修 _饰的适配体 AS1411-6L/12D/24dI (6L/12D/24dI)能够明显延緩肿瘤生长，通过持续测量肿瘤体积，饰后 AS1411组与天然 AS1411组相比，肿瘤体积明显减小，具有统计学意义（p < 0.01 )，而棵鼠体重未见明显下降，即无明显毒性。

Claims

权利要求

1、一种对核酸适配体序列进行化学修饰的方法，其特征在于，在核酸适配体序列的一个或多个核苷位点掺入异核苷，所述异核苷的结构式如化学式 I或化学式 II所示，化学式 I所示的异核苷为 L-构型的异核苷，化学式 II所示的异核苷为 D- 构型的异核苷，其中， Base为腺嘌呤八、胸腺嘧啶丁、鸟嘌呤 G或胞嘧啶 C，

2、根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，在核酸适配体序列的一个或多个核苷位点掺入异核苷的同时，还包括在核酸适配体序列的一个或多个核苷位点掺入 2，-脱氧肌苷，所述的 2，-脱氧肌苷的结构式如化学式 III所示：

2，-脱氧肌苷代替天然核苷在相应位置进行偶联。

3、根据权利要求 1或 2所述的方法，其特征在于，在对核酸适配体序列进行化学修饰前，将化学式 I、化学式 II所示的异核苷和化学式 III所示的 2，-脱氧肌苷分别制备成化学式 IV、化学式 V所示的异核苷亚磷酰胺单体和化学式 VI所示的 2， -脱氧肌苷亚磷酰胺单体，

其中， Base为腺嘌呤八、胸腺嘧啶1\ 鸟嘌呤 G或胞嘧啶(。

4、根据权利要求 3所述的方法，其特征在于，使用固相合成技术，采用亚磷酰胺法合成核酸适配体的寡核苷酸链，在 DNA合成仪上，将一个或几个权利要求 3所述的异核苷亚磷酰胺单体或者将一个或几个权利要求 3所述的异核苷亚磷酰胺单体和一个或几个权利要求 3所述的 2，-脱氧肌苷亚磷酰胺单体同时掺入到所合成的序列中代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：脱 DMT、偶联、封闭、氧化。

5、根据权利要求 4所述的方法，其特征在于，合成 DNA寡核苷酸链的条件是采用增加异核苷或 2，-脱氧肌苷亚磷酰胺单体的进样次数至 2-6次；每次进样后的偶联时间为 120-240 秒 /次；合成异核苷修饰或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的 DNA寡核苷酸链的条件是每次进样后的偶联时间增加至 200-360秒 /次，偶联 2-6 次。

6、按照权利要求 1-5任一项所述的方法合成的异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的核酸适配体序列。

7、根据权利要求 6所述的异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的核酸适配体序列，其特征在于，所述的核酸适配体为人的凝血酶的核酸适配体 (TBA) , 核仁素的核酸适配体， hnRNPAl 蛋白的核酸适配体；修饰前的人的凝血酶的核酸适配体 (TBA)序列如 SEQ ID No.l所示，修饰前的核仁素的核酸适配体序列 (AS1411)序列如 SEQ ID No.2所示，修饰前的 hnRNPAl蛋白的核酸适配体序列 (BC15-31)如 SEQ ID No.3所示。

8、根据权利要求 7所述的异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的核酸适配体序列，其特征在于，修饰后的凝血酶的核酸适配体序列选自以下序列所组成的群组：

1 )在 SEQ ID No.l所示 TBA序列的 3、 9或 12位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的三条核酸适配体序列，其中， Base 为胸腺嘧 ¹¹定 T;

2 )在 SEQ ID No.l所示 TBA序列的 7位掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T;

3 ) 同时在 SEQ ID No.l所示 TBA序列的 7位和 12位分别掺入化学式 II和化学式 I 所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T; 以及

4 ) 同时在 SEQ ID No.l所示 TBA序列的 7位和 3位掺入化学式 II和化学式 I 所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

修饰后的核仁素的核酸适配体序列选自以下序列所组成的群组：

1 )在 SEQ ID No.2所示的 AS1411序列的 6位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T;

2 )在 SEQ ID No.2所示的 AS1411序列的 12位掺入式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base 为胸腺嘧啶 T; 以及

3 ) 同时在 SEQ ID No.2所示的 AS1411序列的 6位和 12位分别掺入化学式 I 和化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T; 以及

4 )同时在 SEQ ID No.2所示的 AS1411序列的 6位， 12位和 24分别掺入化学式 I, 化学式 II所示的异核苷和化学式 ΙΠ所示的 2，-脱氧肌苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T;

修饰后的 hnRNPAl蛋白的核酸适配体序列选自以下序列所组成的群组：

1 )在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位掺入化学式 I所示的异核苷 « 替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T;

2 )在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T;

3 )在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 30位掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T; 4 ) 同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 1位和 3位掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

5 )同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 1位和 30掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

6 )同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位和 30掺入化学式 I所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

7 ) 同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位和 30掺入化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base 为胸腺嘧啶 T;

8 )同时在 SEQ ID No.3所示的 BC15-31序列的 3位和 30位分别掺入化学式 I, 化学式 II所示的异核苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的核酸适配体，其中， Base为胸腺嘧啶 T。

9、如权利要求 7或 8所述的核酸适配体序列在制备抗心脑血管疾病的药物或试剂中的应用，所述的核酸适配体序列为异核苷或异核苷联合 2，-脱氧肌苷修饰的人的凝血酶的核酸适配体 (ΤΒ Α：)。

10、如权利要求 7或 8所述的核酸适配体序列在制备治疗癌症或癌症的早期检测方面的药物或试剂中的应用，所述的核酸适配体序列为异核苷或异核苷联合 2'- 脱氧肌苷修饰的核仁素的核酸适配体或 hnR PAl蛋白的核酸适配体。