KR20220059472A - Rna-표적화 리간드, 이의 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본원의 개시내용은 표적 RNA 분자, 예를 들어, TPP 리보스위치에 결합하는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 화합물은 2개의 상이한 결합 부위에서 표적 RNA와의 결합을 가능하게 하는 2개의 구조적으로 상이한 단편을 함유하여 단일 RNA 결합 부위에만 결합하는 화합물과 비교하여 보다 높은 친화성 결합 리간드를 생성한다.

Description

RNA-표적화 리간드, 이의 조성물, 및 이의 제조 및 사용 방법

본원의 개시내용은 표적 RNA 분자, 예를 들어, TPP 리보스위치 (riboswitch)에 결합하는 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 화합물은 2개의 상이한 결합 부위에서 표적 RNA와의 결합을 가능하게 하는 2개의 구조적으로 상이한 단편을 함유하여, 단일 RNA 결합 부위에만 결합하는 화합물과 비교하여 보다 높은 친화성 결합 리간드를 생성한다.

서열 목록의 참조 인용

첨부된 서열 목록에서 자료는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 서열 목록 39397600002_ST25 명칭의 첨부 파일은 2020년 8월 5일자로 작성하였고 4 KB이다.

정부의 지원

본 발명은 국가 보건원 (NIH)에 의해 부여된 승인 번호 GM098662 및 AI068462 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.

대다수의 소분자 리간드는 주로 단백질을 표적화함에 의해 생물학적 시스템을 조작하기 위해 개발된다. 단백질은 매우 복잡한 3차원 구조를 갖고 있고, 이는 이들이 적당히 기능하기 위해 중요하고 소분자 리간드가 결합할 수 있는 틈과 포켓을 포함한다^1,2. 유기체에서 생성된 모든 RNA 분자의 세트-인 전사체는 또한 생물학적 시스템을 연구하고 조작하기 위해 전망있는 표적을 포함한다. 예를 들어, RNA 전사체는 포유동물 시스템에서 중요한 역할을 수행할 뿐만 아니라 이들은 또한 세균 및 바이러스 둘 다에 존재하고 따라서 소분자에 대한 표적을 제공하여 유전자 발현을 조절한다.

주지할만한 것은 고도로 선택적 리간드의 개발을 위해 필요한 주요 특징⁴인 단백질의 구조에 필적하는 복잡한 3차원 구조³를 채택할 수 있고, RNA는 생물학적 시스템의 거동을 지배하는 만연된 역할을 수행한다는 것이다⁵. 본래에는 단백질 암호화 및 단백질 생합성 공정을 가이드하기 위한 메시지를 전송하기 위해 존재하는 유전학적 정보의 운반자로서만 검토되었지만 현대의 RNA 관점은 확장된 역할을 포괄하도록 진화되었고, 여기서, 다양한 범위의 RNA 분자는 다양한 기전에 의해 유전자 발현 및 다른 생물학적 공정을 조절하는데 매우 광범위한 역할을 갖는 것으로 현재 이해되고 있다. 심지어 대다수의 새롭게 발견된 비암호화 RNA는 암 및 비종양형성 질환과 같은 질환과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, RNA가 병원성 단백질을 암호화하는 것과는 별개로 질환 상태에 기여한다는 현실 상황은 이전에 인지되지 못한 풍부한 치료학적 표적을 제공한다.

그러나, 소분자 리간드가 mRNA에 결합할 수 있고, 해독 효율을 상향- 또는 하향-조절함에 따라서 세포에서 단백질 발현을 조정하는 잠재력을 갖는 것으로 나타났지만^6,7, 단백질을 표적화하는 경우 직면하지 못한 소분자 RNA의 동정과 관련된 문제점들이 있다^4,11,12. 그것은 또한 풍부한 표적 풀을 나타내는 비-암호화 RNA에 지시된 소분자의 개발을 포함한다^8-10. 불행하게도, RNA 구조의 분석 및 새로운 기능의 발견을 위한 다양한 기술이 개발되었지만, RNA에 결합하여 이의 기능을 방해하는 억제제를 효율적이고 신속하게 동정하거나 디자인하는 능력은 매우 뒤처져 있다. 따라서, 당업계에서는 RNA 분자를 표적화하는 소-분자 리간드의 신속하고 효율적인 동정을 가능하게 하는 새로운 방법 및 기술의 개발이 당업계에서 크게 요구되고 있다.

개요

상기 이미 언급된 바와 같이, 상기 전사체는 소분자 리간드에 대한 표적의 매력적이지만 활용도가 낮은 세트를 나타낸다. 전령 RNA에 및 비-암호화 RNA에 표적화된 소분자 리간드(및 궁극적으로 약물)는 세포 상태 및 질환을 조절하는 잠재력을 갖는다. 본원의 개시내용에서, 프라이머 연장에 의해 분석된 선택적 2'-하이드록실 아실화 (SHAPE) 및 SHAPE-돌연변이 프로파일링 (MaP) RNA 구조를 사용한 단편 기반 스크리닝 전략을 사용하여 표적 RNA 구조에 결합하는 소분자 단편을 발견하였다. 특히, 밀리몰 내지 마이크로몰 친화성으로 TPP 리보스위치에 결합하는 단편 및 협력적 결합 단편 쌍이 동정되었다. 구조-활성-관계 (SAR) 연구를 수행하여 높은 나노몰 친화성으로 TPP 리보스위치에 결합하는 연결된 단편 리간드에 효율적으로 디자인하기 위한 정보를 수득하였다. 본원 개시내용의 원리는 TPP 리보스위치에 제한되는 것을 의미하지 않지만, 다양한 RNA 표적에 대한 고품질 리간드를 개발하기 위해 협력적 및 다중부위 결합을 활용하여 다른 표적 RNA 구조에 광범위하게 적용될 수도 있다.

이와 같이, 본원에 개시된 주요 요지의 하나의 양상은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:

화학식 I

상기 식에서,

X₁, X₂, 및 X₃은 각각의 경우에 CR₁, CHR₁, N, NH, O 및 S로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, 인접한 X₁, X₂, 및 X₃은 O 또는 S인 것으로 동시에 선택되지 않고;

파선은 임의의 이중 결합을 나타내고;

Y₁, Y₂, 및 Y₃은 각각의 경우에 CR₂ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

n은 1 또는 2이고, 여기서, n이 1인 경우, 파선 중 단지 하나가 이중 결합이고;

L은

,

,

, 및

로부터 선택되고,

여기서, p, q, r, 및 v는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고, z는 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되고;

A는

,

, 및

로부터 선택되고,

여기서, X₄, X₅, X₆, 및 X₇은 CR₃ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

여기서, R₁, R₂, 및 R₃은 -H, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -OH, -CN, -NO₂, -NH₂, -NH(C₁-C₆ 알킬), -N(C₁-C₆ 알킬)₂, -COOH, -COO(C₁-C₆ 알킬), -CO(C₁-C₆ 알킬), -O(C₁-C₆ 알킬), -OCO(C₁-C₆ 알킬), -NCO(C₁-C₆ 알킬), -CONH(C₁-C₆ 알킬), 및 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

m은 1 또는 2이고;

W는 -O 또는 -NR₄이고, 여기서, R₄는 -H, -CO(C₁-C₆ 알킬), 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, -CO(아릴), -CO(헤테로아릴), 및 -CO(사이클로알킬)로부터 선택되고;

단, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, 및 X₇ 중 적어도 2개는 N이다.

본원에 기재된 주요 요지의 추가의 양상은 RNA 분자의 영역에 결합하는 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 포함한다.

본원에 기재된 주요 요지의 추가의 양상은 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 중에 본원에 기재된 치료학적 유효량의 화합물을 포함하는 조성물을 포함한다.

본원에 기재된 주요 요지의 추가의 양상은 RNA 발현에서 기능부전과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본원에 기재된 치료학적 유효량의 화합물의 용량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본원에 개시된 주요 요지의 추가의 양상은 본원에 기재된 화합물을 제조하기 위한 방법을 포함한다.

본원에 기재된 주요 요지의 여전히 추가의 양상은 하기에 제공된다.

도 1은 RNA 스크리닝 작제물 및 단편 스크리닝 작업흐름에 대한 도식을 보여준다. RNA 모티프 1 및 2, 바코드 나선; 및 구조 카세트 나선을 나타낸다. RNA는 소분자 단편의 존재 또는 부재하에 SHAPE를 사용하여 탐지되고 리간드-의존성 구조 정보에 상응하는 화학적 변형은 멀티플렉스 MaP 서열분석에 의해 판독된다.
도 2는 단편 히트 및 비-히트에 대한 대표적인 돌연변이율을 보여준다. 단편-노출된 샘플에 대한 정규화된 돌연변이율은 +리간드, +2 또는 +4로서 표지되고, 리간드 부재로서 표지된 리간드 부재 추적과 비교한다. 돌연변이율에서 통계학적으로 유의적인 변화는 삼각형으로 나타낸다(SHAPE 확인 데이터에 대해 도 8을 참조한다). (상부) 시험 작제물에 결합하지 않는 대표적인 화합물에 대한 돌연변이율 비교. (중앙) RNA의 TPP 리보스위치 영역에 대한 단편 히트. (하부) 시험 작제물의 전반에 걸쳐 반응성 변화를 유도하는 비특이적 히트. 모티프 1 및 2 랜드마크는 SHAPE 프로필 아래에 나타낸다.
도 3a 및 3b는 (도 3a) 단편 17 대 (도 3b)　고유 TPP 리간드 (2HOJ²⁸)에 의해 결합된 TPP 리보스위치의 구조의 비교를 보여준다. RNA 구조는 각각의 이미지에서 유사한 배향으로 나타낸다. 리간드와 RNA 간의 수소 결합은 파선으로서 나타낸다.
도 4a 및 4b는 열역학 사이클 및 단편 2 및 31에 대한 단계적 리간드 결합 친화성을 보여준다. 도 4a는 화합물 2 (암갈색, K ₁) 및 화합물 31 (담갈색, K ₂) 단편에 의한 결합의 개요를 보여준다. K_D 값은 ITC에 의해 결정된다. 도 4b는 단일-화합물 및 단편 2 및 31에 의한 협력적 결합을 보여주는 ITC 데이터를 보여준다. 2개의 단편의 연결은 결합 에너지에서 상가 (additive) 효과를 보여주고, 서브-마이크로몰 리간드인 화합물 37 (K _L)을 유도한다. ITC 추적은 담갈색으로서 기본 추적 (리간드는 완충액으로 적정됨), 암갈색 중 실험 추적으로서 나타낸다. 곡선 피트는 갈색 음영에서 95% 신뢰 구간으로 나타낸다.
도 5는 링커 유형 및 길이, 말단 그룹 화학유형, 및 말단 그룹 배향의 함수로서 단편 17 및 31의 단편의 공유 연결을 보여준다. RNA 결합 친화성을 증가시키는 변형은 화합물 36 및 37에 존재하고 (담갈색); 음성 변형은 화합물 35, 39, 및 40 (담갈색)에 존재하고, 중성 변형은 화합물 38 (담갈색)에 존재한다. ITC에 의해 결정된 해리 상수.
도 6은 단편 기반 방법에 의해 개발되고, 이들의 연결 계수 (E)에 의해 정렬된 단편-링커-단편 리간드의 비교를 보여준다. 로그 축 상에 나타낸 값. 협력적 연결은 보다 낮은 E 값 (수직 축의 상부)에 상응한다. 단편 37은 2.5의 E 값 및 0.34의 LE 값을 나타낸다. 개별 단편 (좌측, 중앙) 및 연결된 리간드 (우측)에 대한 해리 상수는 성분 단편 아래에 나타내고; E-값 (상부) 및 리간드 효율 (하부)을 나타낸다. 단편 사이에 도입된 공유 연결은 담갈색으로 강조된다. 성분 단편에 대한 구조는 표 7에 상세히 나타낸다.
도 7a 및 7b는 스크리닝 작제 디자인을 보여준다. 도 7a는 하기의 성분을 갖는 RNA 서열 (서열번호 6)을 보여준다: GGUCGCGAGUAAUCGCGACC (서열번호 7)는 구조 카세트이고; GCUGCAAGAGAUUGUAGC (서열번호 8)는 RNA 바코드(바코드 NT 밑줄 친); GUGGGCACUUCGGUGUCCAC (서열번호 9)는 구조 카세트이고; ACGCGAAGGAAACCGCGUGUCAACUGUGCAACAGCUGACAAAGAGAUUCCU (서열번호 10)는 DENV 유사매듭 (pseudoknot) (돌연변이 볼드체); AAAACU는 링커이고; CAGUACUCGGGGUGCCCUUCUGCGUGAAGGCUGAGAAAUACCCGUAUCACCUGAUCUGGAUAAUGCCAGCGUAGGGAAGUGCUG (서열번호 11)는 TPP 리보스위치 (돌연변이 볼드체)이고; GAUCCGGUUCGCCGGAUCAAUCGGGCUUCGGUCCGGUUC (서열번호 12)는 구조 카세트이다. 도 7b는 이의 자가-폴딩 헤어핀과 관련하여 RNA-서열 바코드의 2차 구조를 보여준다.
도 8은 비-히트, 히트 및 비특이적 히트 단편에 대한 SHAPE 프로필을 보여준다. 단편-노출되고 리간드 부재 대조군 추적에 상응하는 돌연변이율 추적은 각각 고체 갈색 음영 및 검정 윤곽선으로 나타낸다. 단편 대 단편 부재 샘플에서 통계학적으로 유의적으로 상이한 것으로 결정된 뉴클레오타이드는 삼각형으로 나타낸다. 동일한 단편에 대한 돌연변이율 추적은 도 2에 도식적으로 나타낸다.

본원에 개시된 주요 요지는 지금 이후 보다 완전하게 기재된다. 그러나, 본원에 제시된 본원에 개시된 주요 요지의 많은 변형 및 다른 구현예는 본원에 개시된 주요 요지가 속하는 당업계의 기술자에게 상기될 것이고 이전의 기재에서 제공된 교시의 이득을 갖는다. 따라서, 본원에 기재된 주요 요지가 기재된 특정 구현예로 제한되지 않고, 변형 및 다른 구현예가 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 다른 말로, 본원에 기재된 주요 요지는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함한다. 정의된 용어, 용어 사용법, 기술된 기술 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 통합 문헌, 특허 및 유사한 자료 중 하나 이상이 본 출원과 다르거나 모순되는 경우 본 출원이 우선한다. 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 당업자의 기술자가 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조 문헌은 그 내용 전체가 참조로 인용된다.

정의

본원에 사용된 바와 같은 용어 "알킬 그룹"은 1 내지 8개, 1 내지 6개, 1 내지 4개, 또는 5 내지 8개 탄소를 함유하는 포화된 탄화수소 라디칼을 언급한다. 일부 구현예에서, 포화된 라디칼은 8개 초과의 탄소를 함유한다. 알킬 그룹은 구조적으로 비사이클릭 알칸으로부터 하나의 수소의 제거 및 따라서 비-수소 그룹 또는 라디칼의 치환에 의해 변형된 비사이클릭 알칸 화합물과 유사하다. 알킬 그룹 라디칼은 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 저급 알킬 그룹 라디칼은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 고급 알킬 그룹 라디칼은 5 내지 8개 탄소 원자를 갖는다. 알킬, 저급 알킬 및 고급 알킬 그룹 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 2급 부틸, t 부틸, 아밀, t 아밀, n-펜틸, n-헥실, i-옥틸 등의 라디칼을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은, 명칭 "(CO)" 및 "C(O)"는 카보닐 모이어티를 지적하기 위해 사용된다. 적합한 카보닐 모이어티의 예는 케톤 및 알데하이드 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "사이클로알킬"은 3-8 구성원 또는 3-7 구성원 또는 3-6 구성원 또는 3-5 구성원 또는 3-4 구성원을 갖는 탄화수소를 언급하고 모노사이클릭 또는 바이사이클릭일 수 있다. 환은 포화될 수 있거나 일부 불포화도를 가질 수 있다. 사이클로알킬 그룹은 임의로 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다. 하나의 구현예에서, 사이클로알킬 그룹의 각각의 환의 0, 1, 2, 3, 또는 4개 원자는 하나의 치환체에 의해 치환될 수 있다. 사이클로알킬 그룹의 대표적인 예는 사이클로프로필, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로부틸, 사이클로헵틸, 사이클로펜테닐, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헥사디에닐 등을 포함한다.

용어 "아릴"은 탄화수소 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭 방향족 환 시스템을 언급한다. 아릴 그룹은 임의로 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다. 하나의 구현예에서, 아릴 그룹의 각각의 환의 0, 1, 2, 3, 4. 5 또는 6개 원자는 하나의 치환체에 의해 치환될 수 있다. 아릴 그룹의 예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 플루오레닐, 인데닐, 아줄레닐 등을 포함한다.

용어 "헤테로아릴"은 방향족 5-10원 환 시스템을 언급하고, 여기서, 헤테로원자는 O, N, 또는 S로부터 선택되고, 나머지 환 원자는 탄소(달리 지적되지 않는 경우 적절한 수소 원자를 갖는)이다. 헤테로아릴 그룹은 임의로 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다. 하나의 구현예에서, 헤테로아릴 그룹의 각각의 환의 0, 1, 2, 3, 또는 4개 원자는 하나의 치환체에 의해 치환될 수 있다. 헤테로아릴 그룹의 예는 피리딜, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 이속사졸릴, 퀴놀리닐, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트리아지닐, 이소퀴놀리닐, 인다졸릴 등을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치환된"은 모이어티 (예를 들어, 헤테로아릴, 아릴, 알킬 및/또는 알케닐)을 언급하고, 여기서, 상기 모이어티는 하나 이상의 추가의 유기 또는 무기 치환체 라디칼에 결합된다. 일부 구현예에서, 치환된 모이어티는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 추가의 치환체 그룹 또는 라디칼을 포함한다. 적합한 유기산 및 무기산 치환체 라디칼은 하이드록실, 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 환, 치환된 헤테로사이클릭 환, 아미노, 일치환된 아미노, 이치환된 아미노, 아실옥시, 니트로, 시아노, 카복시, 카보알콕시, 알킬 카복사미드, 치환된 알킬 카복스아미드, 디알킬 카복사미드, 치환된 디알킬 카복사미드, 알킬설포닐, 알킬설피닐, 티오알킬, 알콕시, 치환된 알콕시 또는 할로알콕시 라디칼을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 상기 용어는 본원에 정의되어 있다. 본원에서 달리 지적되지 않는 경우, 유기 치환체는 1 내지 4개 또는 5 내지 8개 탄소원자를 포함할 수 있다. 치환된 모이어티가 이의 위에 하나 초과의 치환체 라디칼과 결합되는 경우, 치환체 라디칼은 동일하거나 상이할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "비치환된"은 상기된 바와 같은 하나 이상의 추가의 유기산 또는 무기산 치환체 라디칼에 결합되지 않은 모이어티 (예를 들어, 헤테로아릴, 아릴, 알케닐, 및/또는 알킬)를 언급하고 이는 상기 모이어티가 단지 수소로만 치환됨을 의미한다.

본원에 제공된 구조 및 "치환" 또는 "로 치환된"이, 상기 구조 및 치환이 치환된 원자 및 치환체의 허용된 원자가에 따르고, 상기 치환이 예를 들어, 재배열, 폐환, 제거 등에 의해서와 같이 전환을 자발적으로 진행하지 않는 안정한 화합물을 유도한다는 절대적 단서조항을 포함하는 것으로 이해된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "RNA"는 유전자를 암호화하고, 탈암호화하고, 조절하고 발현하는데 다양한 생물학적 역할에 필수적인 중합체 분자인 리보핵산을 언급한다. RNA 및 DNA는 핵산이고, 지질, 단백질 및 탄수화물과 함께 모든 공지된 생활 형태에 필수적인 4개의 주요 거대분자를 구성한다. DNA와 같이, RNA는 뉴클레오타이드 쇄로서 어셈블리되지만, DNA 같지 않게, RNA는 천연적으로 쌍 형성 이중 가닥 보다는 차라리 그 자체로 폴딩된 단일 가닥으로서 발견된다. 세포 유기체는 특이적 단백질의 합성을 지시하는 유전학적 정보 (G, U, A 및 C 문자에 지칭되는 구아닌, 우라실, 아데닌 및 시토신의 질소 염기를 사용하는)를 전달하기 위해 전령 RNA (mRNA)를 사용한다. 많은 바이러스는 RNA 게놈을 사용하여 이들의 유전학적 정보를 암호화한다. 일부 RNA 분자는 유전자 발현을 조절하거나, 세포 신호에 대한 반응을 감지하고 소통하는 생물학적 반응을 촉매함에 의해 세포내 활성 역할을 수행한다. 이들 활성 공정 중 하나는 RNA 분자가 리보솜 상에 단백질의 합성을 지시하는 보편적인 기능인 단백질 합성이다. 상기 공정은 아미노산을 리보솜으로 전달하는 운반 RNA (tRNA) 분자를 사용하고, 여기서, 리보솜 RNA (rRNA)는 이어서 아미노산을 함께 연결하여 암호화된 단백질을 형성한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "비-암호화 RNA (ncRNA)"는 단백질로 해독되지 않는 RNA 분자를 언급한다. 이로부터 기능성 비-암호화 RNA가 전사되는 DNA 서열은 흔히 RNA 유전자로 불리운다. 비-암호화 RNA의 풍부하고 기능적으로 중요한 유형은 운반 RNA (tRNA) 및 리보솜 RNA (rRNA), 및 소형 RNA, 예를 들어, 마이크로 RNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA, scaRNA 및 긴 ncRNA, 예를 들어, Xist 및 HOTAIR을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "암호화 RNA"는 단백질을 암호화하는 RNA, 즉, 전령 RNS (mRNA)를 언급한다. 상기 RNA는 전사체 (transcriptome)를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "리보스위치"는 RNA 소분자에 결합하여 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 생성에서의 변화를 유도하는 전령 RNA 분자의 조절 분절을 언급한다. 따라서, 리보스위치를 함유하는 mRNA는 이의 이펙터 분자의 농도에 반응하여 이 자신의 활성을 조절하는데 직접적으로 관여한다.

THI 요소 및 Thi-박스 리보스위치로서도 공지된 본원에 사용된 바와 같은 용어 "TPP 리보스위치"는 고도로 보존된 RNA 2차 구조를 언급한다. 이것은 티아민 피로포스페이트 (TPP)에 직접적으로 결합하여 고세균, 세균 및 진핵세포에서 다양한 기전을 통해 유전자 발현을 조절하는 리보스위치로서 작용한다. TPP는 세균에서 피리미딘 및 티아졸 모이어티의 커플링에 의해 합성된 필수 조효소인 활성 형태의 티아민 (비타민 B1)이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유사매듭"은 적어도 2개의 스템-루프 구조를 함유하는 핵산 2차 구조를 언급하고, 여기서, 하나의 스템의 절반은 또 다른 스템의 2개의 절반 사이에 삽입되어 있다. 유사매듭은 처음에 1982년에 순무 노란색 모자이크 바이러스에서 인지되었다. 유사매듭은 매듭 형상의 3차원 형태로 폴딩되지만 진정한 형태학적 매듭이 아니다.

"압타머"는 고친화성 및 특이성으로 관심 대상의 특정 분자에 결합할 수 있는 핵산 분자를 언급하고 (Tuerk 및 Gold, 1990; Ellington and Szostak, 1990), 인간 가공되거나 천연 기원일 수 있다. 전형적으로 RNA인 압타머로의 리간드의 결합은 압타머 및 이의 내부에 상기 압타머가 위치한 핵산의 형태를 변화시킨다. 일부 경우에, 상기 형태 변화는 압타머가 위치한 mRNA의 해독을 억제하거나 핵산의 정상적인 활성을 방해한다. 압타머는 또한 DNA로 구성될 수 있거나 비-천연 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 압타머는 대부분 전형적으로 표적 분자의 결합을 위한 시험관내 선택에 의해 수득되었다. 그러나, 압타머의 생체내 선택이 또한 가능하다. 압타머는 또한 리보스위치의 리간드-결합 도메인이다. 압타머는 전형적으로 약 10 내지 약 300개 뉴클레오타이드 길이이다. 보다 통상적으로, 압타머는 약 30 내지 약 100개 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,949,379호를 참조한다. 본 발명을 위해 유용한 압타머의 예는 PSMA 압타머 (McNamara 등, 2006), CTLA4 압타머 (Santulli-Marotto 등, 2003) 및 4-1BB 압타머 (McNamara 등, 2007)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "PCR"은 폴리머라제 연쇄 반응을 의미하고 분자 생물학에서 수백만 개 내지 수십억 개의 특정 DNA 샘플의 카피물을 신속하게 제조하여 과학자가 매우 작은 샘플의 DNA를 취득하여 이를 세부적으로 연구하기에 충분히 많은 양으로 증폭시킬 수 있게 하는 광범위하게 사용되는 방법을 언급한다.

용어 "약제학적으로 허용되는"은 물질 또는 조성물이 제형을 구성하는 다른 성분 및/또는 이들로 치료받는 대상체와 화학적으로 및/또는 독성학적으로 양립할 수 있음을 지적한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 허용되는 유기산 또는 무기산 염을 언급한다. 예시적인 염은 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산성 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산성 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트 "메실레이트", 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 파모에이트 (즉, 1.1'-메틸렌-비스-(2-하이드록시-3-나프토에이트)) 염, 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨) 염, 알칼린 토금속 (예를 들어, 마그네슘) 염, 및 암모늄 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염은 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대 이온과 같은 또 다른 분자의 내포를 포함할 수 있다. 상기 반대 이온은 모 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기산 또는 무기산 모이어티일 수 있다. 추가로, 약제학적으로 허용되는 염은 이의 구조에서 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약제학적으로 허용되는 염의 일부인 경우에, 상기 염은 다수의 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약제학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "담체"는 사용되는 용량 및 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유류에 비독성인, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 흔히, 약제학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예는 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS™와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 특정 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 비-천연적으로 존재하는 약제학적으로 허용되는 담체이다.

용어 "치료한다" 및 "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 또는 예방적 대책 둘 다를 언급하고, 여기서, 상기 목적은 암의 발병 또는 확산과 같은 목적하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 서행시키는 것이다. 본원 발명의 목적을 위해, 유익하거나 목적하는 임상 결과는 검출되든 검출될 수 없든 상관없이 증상의 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 (부분적이거나 완전한)를 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우의 예상된 생존율과 비교하여 생존율을 연장시킴을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 것들은 병태 또는 장애 또는 상기 병태 또는 장애가 예방되어야만 하는 것들을 갖는 경향이 있는 것들 뿐만 아니라 병태 또는 장애를 이미 갖는 것들을 포함한다.

용어 "투여" 또는 "투여하는"은 상기 화합물(들)을 대상체에게 도입하여 이들의 의도된 기능을 수행하는 경로를 포함한다. 사용될 수 있는 투여 경로의 예는 주사 (피하, 정맥내, 비경구, 복막내, 척추강내를 포함하나 이에 제한되지 않음), 국소, 경구, 흡입, 직장 및 경피를 포함한다.

용어 "유효량"은 목적하는 결과를 달성하기 위해 필요한 용량 및 기간 동안 유효한 양을 포함한다. 화합물의 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령 및 체중, 및 대상체에서 목적하는 반응을 유발하는 화합물의 능력과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 투여 용법은 최적의 치료학적 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "전신 투여", "전신 투여되는", "말초 투여" 및 "말초로 투여되는"은 화합물(들), 약물 또는 기타 물질이 환자의 시스템에 진입함에 따라서, 대사 및 기타 유사한 공정에 적용되도록 이들의 투여를 의미한다.

용어 "치료학적 유효량"은 (i) 특정 질환, 병태 또는 장애를 치료하거나 예방하거나, (ii) 특정 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화, 개선 또는 제거하거나 (iii) 본원에 기재된 특정 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발병을 예방하거나 지연시키는 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 암의 경우, 약물의 치료학적 유효량은 암세포의 수를 감소시키고; 종양 크기를 감소시키고; 말초 기관으로의 암세포 침윤을 억제하고 (즉, 어느 정도 느리게 하고 바람직하게는 중지시키고); 종양 전이를 억제하고 (즉, 어느 정도 서행시키고 바람직하게는 중지시키고); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물이 성장을 예방하고/하거나 기존 암세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 세포증식 억제 및/또는 세포 독성이 있을 수 있다. 암 치료요법의 경우, 효능은 예를 들어 질환 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하고/하거나 반응률(RR)을 결정함으로써 측정될 수 있다.

용어 "대상체"는 영장류 (예를 들어, 인간), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유류와 같은 동물을 언급한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 사람이다.

본원 개시내용은 고친화성으로 특정 RNA 영역에 결합하는 소분자의 동정을 위해 적합한 단편-기반 리간드 발견 전략에 관한 것이다. 일반적으로, 단편-기반 리간드 발견은 관심 대상의 표적에 결합하는 낮은 내지 중간 정도의 친화성의 하나 이상의 소-분자 "단편"의 동정을 가능하게 한다. 그런 다음 이들 단편을 정교하게 만들거나 연결하여 보다 강력한 리간드를 생성한다^13,14. 전형적으로, 이들 단편은 300 Da 미만의 분자량을 나타내고, 검출 가능하게 결합하기 위해 관심 대상의 표적과 상당한 고품질의 접촉을 만든다.

단편 기반 리간드 발견은 소정의 RNA에 대한 단일 단편 히트 결합인 초기 히트 화합물을 동정하는 데 지금까지 성공적으로 사용되었다^15-19. 동일한 RNA에 결합하는 다수의 단편의 동정은 결합 포켓 내 단편 간의 잠재적인 상가 및 협력적 상호작용을 이용할 수 있게 할 것이다^20,21. 그러나 최근에 많은 RNA가 리간드와 독립적이거나 협력적인 방식으로 접촉하는 결합 포켓 영역인 다중 "서브 부위"를 통해 리간드에 결합하는 것으로 나타났다²². 추가로, 서브 부위 결합이 약간의 협력 효과만을 나타내는 경우에도 고친화성 RNA 결합이 발생할 수 있는 것으로 나타났다. 이들 특성은 RNA 표적에 적용된 바와 같은 단편 기반 리간드 발견의 효과에 대한 좋은 징조이다.

따라서, 상기에 기초하여, 본원 개시내용은 예를 들어 TPP 리보스위치와 같은 관심대상의 RNA에 결합하는 단편을 동정하는 방법에 관한 것이다. 두 번째로, 본원에 개시된 방법은 대략적으로 뉴클레오타이드 분리에서 RNA 내 단편 결합의 위치화를 확립하는 것에 관한 것이다. 셋 째로, 본원에 개시된 방법은 초기 단편 히트의 부위 근처에 결합된 제2-부위 단편을 동정하는 것에 관한 것이다. 본원의 개시된 방법은 단편 기반 리간드 발견 접근법 방식을 SHAPE-MaP RNA 구조 탐지와 조합하여^23,24, 이는 둘 다를 RNA 결합 단편을 동정하고 단편 결합의 개별 부위를 확립하는데 사용되었다. 2개의 단편을 연결함에 의해 궁극적으로 생성된 리간드는 천연 리보스위치 리간드와 유사하지 않으며, 구조적으로 복잡한 TPP 리보스위치 RNA에 고친화성으로 결합한다.

본원에 개시된 방법 및 리간드의 동정은 하기에 보다 상세히 설명될 것이다.

A. 화합물

본원에 개시된 주요 요지의 제1 양상은 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:

화학식 I

상기 식에서,

X₁, X₂, 및 X₃은 각각의 경우에 CR₁, CHR₁, N, NH, O 및 S로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, 인접한 X₁, X₂, 및 X₃은 O 또는 S인 것으로 동시에 선택되지 않고;

파선은 임의의 이중 결합을 나타내고;

Y₁, Y₂, 및 Y₃은 각각의 경우에 CR₂ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

n은 1 또는 2이고, 여기서, n이 1인 경우, 파선 중 단지 하나가 이중 결합이고;

L은

,

,

,

, 및

으로부터 선택되고, 여기서, k, p, q, r, 및 v는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고, z는 1, 2, 3, 4, 및 5의 정수로부터 선택되고;

A는

,

, 및

로부터 선택되고,

여기서, X₄, X₅, X₆, 및 X₇은 CR₃ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

여기서, R₁, R₂, 및 R₃은 -H, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -OH, -CN, -NO₂, -NH₂, -NH(C₁-C₆ 알킬), -N(C₁-C₆ 알킬)₂, -COOH, -COO(C₁-C₆ 알킬), -CO(C₁-C₆ 알킬), -O(C₁-C₆ 알킬), -OCO(C₁-C₆ 알킬), -NCO(C₁-C₆ 알킬), -CONH(C₁-C₆ 알킬), 및 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

m은 1 또는 2이고;

W는 -O 또는 -NR₄이고, 여기서, R₄는 -H, -CO(C₁-C₆ 알킬), 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, -CO(아릴), -CO(헤테로아릴), 및 -CO(사이클로알킬)로부터 선택되고;

단, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, 및 X₇ 중 적어도 2개는 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₁, X₂, 또는 X₃ 중 적어도 하나가 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₁이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₂이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₃이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 각각의 경우에 X₁, X₂, 및 X₃ 중 2개가 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₁ 및 X₃이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₁, Y₂, 및 Y₃ 중 적어도 하나가 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₁이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₂가 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₃가 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₁, Y₂, 및 Y₃ 중 적어도 하나가 CR₂이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₁이 CR₂이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₂가 CR₂이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₃가 CR₂이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 n이 2이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 화학식 II의 구조를 갖는다:

화학식 II

상기 식에서,

X_2a 및 X_2b는 CR₁ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

X₁ 및 X₃은 CR₁ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

L 및 A는 화학식 I에 대해 제공된 바와 같고;

X₁, X_2a, X_2b, 및 X₃ 중 2개는 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 화학식 III의 구조를 갖는다:

화학식 III

상기 식에서,

L 및 A는 화학식 I에 대해 제공된 바와 같다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 p, q, r, 및 v가 0, 1, 2, 및 3의 정수로부터 독립적으로 선택된다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 L이 하기로부터 선택된다:

,

, 및

.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 L이

이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 q 및 r이 0 또는 1이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 q가 1이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 r이 1이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 r이 0이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 q 및 r이 1이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 q가 1이고 r이 0이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 m이 1이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 W가 -NH, -O, 및 -N(C₁-C₆ 알킬)₂로부터 선택된다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 W가 -NH이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₄, X₅, X₆ 및 X₇ 중 적어도 하나가 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₄이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₅이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₆이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₇이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₄ 및 X₆이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₅ 및 X₇이 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 X₅ 또는 X₆이 N이고, X₄ 및 X₇ 둘 다가 독립적으로 CR₂이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 A가

이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 하기의 구조를 갖는다:

.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 L이

또는

이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₁, Y₂, 및 Y₃가 각각의 경우에 CR₂ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, R₁이 -H, -Cl, -Br, -I, -F, -OH, 및 -NH₂로부터 선택된다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 z가 2이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₂가 N이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 Y₂가 CR₂이고, R₁이 -H, -F, -OH, 및 -NH₂로부터 선택된다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 A가

이다.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 하기의 구조를 갖는다:

또는

.

임의의 상기 구현예에서와 같이, 화합물은 하기의 구조를 갖는다:

,

, 또는

.

B. 스크리닝 방법

본원의 개시내용은 프라이머 연장 (SHAPE)-기반 단편 스크리닝 방법에 의해 분석된 가요성 선택적 2'-하이드록실 아실화의 개발 및 입증에 관한 것이다. 단편-기반 리간드 발견은 RNA를 포함하는 거대 분자와 상당한 친밀한 접촉을 형성하는 화합물을 동정하기 위해 효과적인 접근법임을 입증하였다^13,14,17. 상기 발견 전략의 성공을 위한 전제조건은 리간드 결합을 검출하기 위해 채택될 수 있는 고품질의 생물리학적 검정이다. 따라서, 일부 구현예에서, SHAPE RNA 구조 탐지를 사용하여 리간드 결합을 검출하였고^23-25, 이는 친전자성 시약을 향한 리보스 2'-하이드록실 그룹의 상대적 반응성으로서 국소 뉴클레오타이드 가요성을 측정한다. SHAPE는 모든 RNA에 사용될 수 있고, 단일 실험에서 RNA의 거의 모든 뉴클레오티드에 대한 데이터를 제공하여 단순히 결합을 검출하는 것 외에도 뉴클레오티드당 구조 정보를 생성하며 하기에서 보다 상세히 기재되어 있다. 추가로, 본원의 개시내용은 또한 SHAPE-돌연변이 프로파일링 (MaP)^23,24을 적용하는 것에 관한 것이고, 이는 SHAPE를 고속처리 서열분석에 의한 판독과 조합하여 수천 개의 샘플의 멀티플렉싱 및 효율적인 고속처리 분석을 가능하게 한다.

따라서, 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 관심 대상의 RNA 분자에 결합 및/또는 연합하는 소분자 단편 및/또는 화합물을 동정하기 위해 SHAPE 및/또는 SHAPE-MaP를 사용하는 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법은 추가로 또 다른 소분자 단편 (예를 들어, 단편 1)으로 사전에 이미 항온처리된 RNA 분자와 결합하고/하거나 연합하는 RNA 분자와 결합하고/하거나 연합하는 소분자 단편 (예를 들어, 단편 2)을 동정하기 위한 SHAPE 및/또는 SHAPE-MaP를 사용함을 포함한다. 이론에 구속되지는 않지만, 단편 1은 동일한 RNA 분자에서 제1 결합 부위에 결합하고 단편 2는 제2 결합 부위 (예를 들어, 서브 부위)에 결합하는 것으로 사료된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 생성하기 위한 단편 1 및 단편 2의 구조적 특성의 조합 (예를 들어, 링커 L로 2개의 단편을 연결하는)은 단독의 단편 1 및/또는 단편 2와 비교하여 증가된 RNA 결합 친화성의 연결된 단편 리간드를 부여하는 것으로 사료된다.

스크리닝 방법 SHAPE 및 SHAPE-MaP는 하기에 보다 상세하게 기재된다.

I. SHAPE 화학

SHAPE 화학은 RNA 리보스 2'-위치의 친핵성이 인접한 3'-포스포디에스테르 그룹의 전자적 영향에 민감하다는 관찰에 적어도 부분적으로 기반으로 한다. 비제약 뉴클레오타이드는 염기쌍을 형성하거나 다르게는 구속된 뉴클레오타이드보다 2'-하이드록실기의 친핵성을 증진시키는 더 많은 형태를 샘플링한다. 따라서, 이에 제한되지 않지만 N-메틸이사토산 무수물 (NMIA)과 같은 하이드록실 선택적 친전자체는 가요성 RNA 뉴클레오티드를 사용하여 보다 신속하게 안정한 2'-O-부가물을 형성한다. 모든 RNA 뉴클레오타이드 (전사 후 변형을 갖는 소수의 세포 RNA 제외)는 2'-하이드록실 그룹을 갖기 때문에, 단일 실험에서 RNA 분자의 모든 위치에서 국소 뉴클레오타이드 가요성은 동시에 조사될 수 있다. 2'-하이드록실 반응성은 염기 동일성에 둔감하기 때문에 절대 SHAPE 반응성은 RNA의 모든 위치에서 비교될 수 있다. 또한 뉴클레오타이드가 특정 2'-하이드록실의 친핵성을 증진시키는 형태로 제약되어 있기 때문에 뉴클레오타이드는 반응성일 가능성이 있다. 상기 부류의 뉴클레오타이드는 희귀한 것으로 예상되고, 비-카노니칼 국소 기하학을 포함하고 쌍을 이루지 않은 위치로서 올바르게 스코어링된다.

현재 개시된 주요 요지는 일부 구현예에서 임의의 길이 및 구조적 복잡성의 RNA 분자에서 구조적 제약을 조사함으로써 RNA 분자에서 구조적 데이터를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 2'-O-부가물을 함유하는 RNA 분자를 (표지된) 프라이머로 어닐링하는 단계; 음성 대조군으로서 (표지된) 프라이머로 2'-O-부가물을 함유하지 않는 RNA 분자를 어닐링하는 단계; 프라이머를 연장하여 cDNA 라이브러리를 생성하는 단계; cDNA를 분석하는 단계; 및 RNA에 대한 구조적 데이터를 포함하는 출력 (output) 파일을 생성하는 단계를 포함한다.

RNA 분자는 생물학적 샘플 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 단백질 또는 기타 작고 큰 생물학적 리간드 및/또는 화합물의 존재 하에 변형될 수 있다. 프라이머는 임의로 방사성동위원소, 형광 표지, 중원자, 효소 표지, 화학발광 그룹, 비오티닐 그룹, 2차 리포터에 의해 인지되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프, 또는 이들의 조합으로 표지될 수 있다. 분석은 분리, 정량화, 사이징 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 분석은 추적 (trace)이라고 불리우는 용출 시간 데이터의 함수로서 형광 또는 염료 양 데이터를 추출하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA는 모세관 전기영동 장비의 단일 컬럼에서 또는 미세유동 장치에서 분석될 수 있다.

일부 구현예에서, 2'-O-부가물을 함유하는 RNA 분자에 대해 및 2'-O-부가물을 함유하지 않는 RNA 분자에 대해 추적 중에 있는 최대 면적은 계산될 수 있다. 상기 추적은 비교될 수 있고 RNA의 서열과 정렬될 수 있다. 서열분석에 의해 생성된 cDNA를 관찰하고 설명하는 추적은 2'-O-부가물을 함유하는 RNA에 대해 및 2'-O-부가물을 함유하지 않는 RNA 분자에 대해 추적 중에 이는 상응하는 위치 보다 더 긴 하나의 뉴클레오타이드이다. 각각의 피크 이하의 면적은 전체 추적 가우시안-피트 통합 (Gaussian-fit integration)을 수행함에 의해 결정될 수 있다.

따라서, 본원에서 일부 구현예에서 복잡한 생물학적 용액 중에 RNA 분자를 갖는 공유 리보스 2'-O-부가물을 형성하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 친전자체를 RNA 분자와 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 상기 친전자체는 RNA 분자 내 비제약된 뉴클레오타이드를 선택적으로 변형시켜 공유 리보스 1'-O-부가물을 형성한다.

일부 구현예에서, N-메틸이사토산 무수물 (MMIA)과 같은 친전자체는 DMSO와 같은 무수 극성 비양성자성 용매 중에 용해된다. 시약-용매 용액은 RNA 분자를 함유하는 복잡한 생물학적 용액에 첨가된다. 상기 용액은 상이한 농도 및 양의 단백질, 세포, 바이러스, 지질, 모노- 및 폴리사카라이드, 아미노산, 뉴클레오타이드, DNA, 및 상이한 염 및 대사물을 함유할 수 있다. 친전자체의 농도는 RNA 분자 내 목적하는 변형 정도를 성취하기 위해 조정될 수 있다. 친전자체는 용액 중에 모든 유리된 하이드록실 그룹과 반응하여 RNA 분자 상에 리보스 2'-O-부가물을 생성하는 잠재력을 갖는다. 추가로, 친전자체는 RNA 분자에서 쌍을 형성하지 않거나 달리 비제약된 뉴클레오타이드를 선택적으로 변형시킬 수 있다.

RNA 분자는 2'-O-부가물을 형성하기 위한 희박한 RNA 변형을 생성하는 농도에서 친전자체에 노출될 수 있으며, 이는 역전사효소에 의한 프라이머 연장을 억제하는 능력에 의해 검출될 수 있다. 화학물질이 2'-하이드록실 그룹의 일반적인 반응성을 표적화하기 때문에 단일 실험에서 모든 RNA 부위가 조사될 수 있다. 일부 구현예에서, 배경을 평가하기 위해 친전자체가 제외된 대조군 연장 반응 및 뉴클레오티드 위치를 할당하기 위한 디데옥시 서열분석 연장을 병행하여 수행할 수 있다. 이들 조합된 단계는 프라이머 연장 또는 SHAPE에 의해 분석된 선택적 2'-하이드록실 아실화로 불리운다.

일부 구현예에서, 상기 방법은 1'-O-부가물을 함유하는 RNA 분자를 (표지된) 프라이머와 접촉시키는 단계; 음성 대조군으로서 2'-O-부가물을 함유하지 않는 RNA를 (표지된) 프라이머로 접촉시키는 단계; 프라이머를 연장하여 선형 cDNA의 어레이를 생성하는 단계; cDNA를 분석하는 단계; 및 RNA에 대한 구조적 데이터를 포함하는 출력 (output) 파일을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.

단일 SHAPE 실험에서 조사되는 뉴클레오타이드의 수는 사용된 분리 기술의 검출 및 분리능뿐만 아니라 RNA 변형의 특성에 따라 다양하다. 소정의 반응 조건을 고려하여, 거의 모든 RNA 분자가 적어도 하나의 변형을 갖는 길이가 있다. 프라이머 확장이 이러한 길이에 도달함에 따라 연장 cDNA의 양은 감소하여 실험 신호가 약화된다. 변형 수율을 감소시키기 위해 조건을 조정하면 판독 길이가 증가할 수 있다. 그러나, 시약 수율의 저하는 또한 각각의 cDNA 길이에 대해 측정된 신호를 감소시킬 수 있다. 이들 고려사항을 고려하여, 단일 SHAPE 판독의 바람직한 최대 길이는 바람직하게 약 1킬로베이스의 RNA이지만 이로 제한되지 말아야 한다.

II. SHAPE-MaP

SHAPE-MaP에서, SHAPE 부가물은 돌연변이 프로파일링 (MaP)에 의해 검출되고, 이는 SHAPE 화학적 부가물의 부위에서 비-상보성 뉴클레오타이드를 삽입하거나 결실을 생성하는 역전사효소의 능력을 사용한다. 일부 구현예에서, SHAPE-MaP는 라이브러리 작제 및 서열분석에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 멀티플렉싱 기술은 SHAPE-MaP에 사용될 수 있다.

일반적으로 RNA는 형태적으로 역학적 뉴클레오티드에서 반응하는 SHAPE 시약으로 처리된다. 역전사 동안에, 폴리머라제는 RNA에서 화학적 부가물을 통해 판독하고 본래의 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드를 cDNA로 혼입시킨다. 수득한 cDNA는 임의의 대량의 병행 접근법을 사용하여 돌연변이 프로필(MaP)을 생성하기 위해 서열분석된다. 서열분석 판독은 참조 서열에 정렬되고, 뉴클레오타이드-분리 돌연변이율이 계산되고 기본 배경에 대해 보정하고 정규화하여 표준 SHAPE 반응성 프로필을 생성한다. 그런 다음 SHAPE 반응성을 사용하여 2차 구조를 모델링하고 경쟁 및 대안적 구조를 가시화하거나 국소 뉴클레오티드 RNA 역학을 조절하는 임의의 공정 또는 기능을 정량화할 수 있다. RNA 분자의 SHAPE 변형 후, 역전사효소를 사용하여 돌연변이 프로필을 생성한다. 상기 단계는 cDNA 내 돌연변이로서 SHAPE 부가물의 위치 및 상대적 빈도를 암호화한다. cDNA는 당업계에 공지된 방법 (예를 들어, PCR 반응)을 사용하여 dsDNA로 전환되고 dsDNA는 추가로 제2 PCR 반응에서 증폭됨으로써 멀티플렉싱을 위한 서열 분석을 부가한다. 정제 후, 서열분석 라이브러리는 균일한 크기를 갖고 각각의 DNA 분자는 관심 대상의 전체 서열을 함유한다.

따라서, 본원에 개시된 주요 요지의 일부 구현예에 따르면, 핵산에서 하나 이상의 화학적 변형을 검출하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 화학적 변형을 갖는 것으로 의심되는 핵산을 제공하는 단계; 폴리머라제 및 제공된 핵산을 주형으로 사용하여 핵산을 합성하는 단계로서, 여기서, 상기 합성은 폴리머라제가 제공된 핵산의 화학적 변형을 통해 판독하여 화학적 변형의 부위에서 수득한 핵산에서 부정확한 뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 수행되는 단계; 및 부정확한 뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 포함한다.

본원에 개시된 주요 요지의 일부 구현예에 따라, 핵산 내 구조적 데이터를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 화학적 변형을 갖는 것으로 의심되는 핵산을 제공하는 단계; 폴리머라제 및 제공된 핵산을 주형으로 사용하여 핵산을 합성하는 단계로서, 여기서, 상기 합성은 폴리머라제가 제공된 핵산의 화학적 변형을 통해 판독하여 화학적 변형의 부위에서 수득한 핵산에서 부정확한 뉴클레오타이드를 생성하는 조건 하에 수행되는 단계; 및 부정확한 뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 및 제공된 핵산에 대한 구조적 데이터를 포함하는 출력 파일을 생성하는 단계를 포함한다.

본원에 개시된 주요 요지의 일부 구현예에서, 제공된 핵산은 RNA 분자 (예를 들어, 암호화 RNA 및/또는 비-암호화 RNA 분자)이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 2개 이상의 화학적 변형을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리머라제는 다중 화학적 변형을 통해 판독하여 다수의 부정확한 뉴클레오타이드를 생성하고, 상기 방법은 각각의 부정확한 뉴클레오타이드를 검출하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 (예를 들어, RNA 분자)은 화학적 변형을 제공하는 시약에 노출되거나, 상기 화학적 변형은 핵산 (예를 들어, RNA 분자)내 이미 존재한다. 일부 구현예에서, 이미 존재하는 변형은 2'-O-메틸 그룹이고/이거나 이에 제한되지 않지만 후성적 변형과 같이 핵산이 유래된 세포에 의해 생성되고/되거나, 상기 변형은 1-메틸 아데노신, 3-메틸 시토신, 6-메틸 아데노신, 3-메틸 우리딘, 및/또는 2-메틸 구아노신이다. 일부 구현예에서, RNA 분자와 같은 핵산은 단백질 또는 기타 작고 큰 생물학적 리간드 및/또는 화합물의 존재 하에 변형될 수 있다.

일부 구현예에서, 시약은 친전자체를 포함한다. 일부 구현예에서, 친전자체는 선택적으로 RNA 분자 내 비제약된 뉴클레오타이드를 변형시켜 공유 리보스 2'-O-부가물을 형성한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 1 M7, 1 M6, NMIA, DMS, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 핵산은 생물학적 샘플에 존재하거나 또는 이로부터 유래한다.

일부 구현예에서, 폴리머라제는 역전사효소이다. 일부 구현예에서, 폴리머라제는 고유 폴리머라제 또는 돌연변이체 폴리머라제이다. 일부 구현예에서, 합성된 핵산은 cDNA이다.

일부 구현예에서, 부정확한 뉴클레오타이드의 검출은 핵산을 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 정보는 제공된 핵산의 서열과 정렬된다. 일부 구현예에서, 부정확한 뉴클레오타이드의 검출은 핵산에 대한 대량 병행의 서열분석을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 특이적 프라이머를 사용한 부위-지시된 접근법, 무작위 프라이밍을 사용한 전체-게놈, 무작위 프라이밍을 사용한 전체-전사체, 또는 이의 조합을 사용하여 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다.

현재 개시된 주요 요지의 일부 구현예에 따르면, 현재 개시된 주요 요지의 임의의 구현예의 임의의 방법 단계를 포함하는 단계를 수행할 때 컴퓨터 판독 가능한 매체에 구현된 컴퓨터 실행 가능한 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이 제공된다. 본원에 개시된 주요 요지의 일부 구현예에 따라, 본원에 개시된 주요 요지의 임의의 방법에 의해 생성된 핵산 라이브러리가 제공된다.

III. SHAPE 친전자체

상기 본원에 개시된 바와 같이, SHAPE 화학은 리보스 2'-하이드록실 그룹의 친핵성 반응성이 국소 뉴클레오타이드 가요성에 의해 게이팅된다는 발견을 이용한다. 염기 쌍형성 또는 3원 상호작용에 의해 제약된 뉴클레오타이드에서, 3'-포스포디에스테르 음이온 및 기타 상호작용은 2'-하이드록실의 반응성을 감소시킨다. 대조적으로, 가요성 위치는 우선적으로 MMIA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 친전자체와 반응하는 형태를 우선적으로 채택하여 2'-O-부가물을 형성한다. 예를 들어, NMIA는 일반적으로 모든 4개의 뉴클레오타이드와 반응하고 시약은 병행의 자가-불활성화 가수분해 반응을 진행한다. 실제로, 본원에 개시된 주요 요지는 본원에 기재된 바와 같은 핵산과 반응할 수 있는 임의의 분자가 본원에 개시된 주요 요지의 일부 구현예에 따라 사용될 수 있음을 제공한다. 일부 구현예에서, 친전자체 (SHAPE 시약으로도 지칭됨)는 이사토산 무수물 유도체, 벤조일 시안화물 유도체, 벤조일 클로라이드 유도체, 프탈산 무수물 유도체, 벤질 이소시아네이트 유도체 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 이사토산 무수물 유도체는 1-메틸-7-니트로이사토산 무수물 (1M7)을 포함할 수 있다. 벤조일 시안화물 유도체는 벤조일 시안화물 (BC), 3-카복시벤조일 시안화물 (3-CBC), 4-카복시벤조일 시안화물 (4-CBC), 3-아미노메틸벤조일 시안화물 (3-AMBC), 4-아미노메틸벤조일 시안화물, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 벤조일 클로라이드 유도체는 벤조일 클로라이드 (BCl)를 포함할 수 있다. 프탈산 무수물 유도체는 4-니트로프탈산 무수물 (4NPA)을 포함할 수 있다. 벤질 이소시아네이트 유도체는 벤질 이소시아네이트(BIC)를 포함할 수 있다.

IV. RNA 분자 디자인

SHAPE 반응성은 하나 이상의 프라이머 연장 반응에서 평가될 수 있고, 정보는 5' 말단 둘 다에서 및 RNA 분자의 프라이머 결합 부위 근처에서 상실될 수 있다. 전형적으로, 프라이머 결합 부위에 인접한 10 내지 20개 뉴클레오타이드에서 부가물 형성은 프라이머 연장의 초기 단계 동안에 역전사효소 (RT) 효소에 의해 중단 또는 비-주형 연장을 반영하는 cDNA 단편의 존재로 인해 정량하기가 어렵다. RNA의 5' 말단에서 8-10개 위치는 풍부한 전장 연장 생성물의 존재를 가시화하기가 어려울 수 있다.

관심 대상의 서열의 5' 및 3' 말단에서 SHAPE 반응성을 모니터링하기 위해, RNA 분자는 본래의 서열의 보다 큰 단편 내에 매립되거나 고유 프라이머 결합 부위를 함유하는 강하게 폴딩된 RNA 서열 사이에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드의 5' 및 3' 플랭킹 서열을 포함하는 구조 카세트를 설계하여 관심 대상의 RNA 분자 내의 모든 위치가 이에 제한되지 않지만 서열 분석 겔, 모세관 전기영동 등과 같은 뉴클레오티드 분리능을 부여하는 임의의 분리 기술에서 평가될 수 있도록 한다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 연장부 둘 다는 다양한 내부 RNA의 폴딩과 방해하지 않는 안정한 헤어핀 구조로 폴딩될 수 있다. 카세트의 프라이머 결합 부위는 cDNA 프라이머에 효율적으로 결합할 수 있다. 5' 및 3' 구조 카세트 요소의 서열은 내부 서열과 안정적인 염기쌍 형성 상호작용을 형성하는 경향이 없는지를 확실히하기 위해 검사할 수 있다.

일부 구현예에서, 관심 대상의 RNA 분자는 뉴클레오타이드 링커와 연결된 2개의 상이한 표적 모티프를 포함한다. 표적 모티프는 관심 대상의 임의의 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 예시적인 표적 모티프는 mRNA, 다중-나선 접합부, 유사매듭 및/또는 압타머에서 리보스위치, 바이러스 조절 요소, 구조적 영역을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 표적 모티프는 유사매듭, 예를 들어, 뎅기열 바이러스 게놈의 5' UTR로부터의 유사매듭이다. 일부 구현예에서, 제2 표적 모티프는 TPP 리보스위치 압타머 도메인과 같은 압타머 도메인이다. 뉴클레오타이드 링커에 대해, 뉴클레오타이드의 수는 다양할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 링커 내 뉴클레오타이드의 수는 약 1 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 1 내지 약 15개 뉴클레오타이드, 약 1 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 또는 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오타이드 (또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 뉴클레오타이드) 범위이다.

일부 구현예에서, RNA 분자는 RNA 바코드 영역을 추가로 포함한다. RNA 바코드 영역은 RNA 분자의 혼합물에서 (예를 들어, 멀티플렉싱 동안에) 특정 RNA 분자의 동정을 가능하게 하는 특유의 바코드이다. RNA 바코드 영역의 위치는 다양할 수 있지만 전형적으로 RNA 분자에 존재하는 카세트 중 하나에 인접하여 발견된다. 일부 구현예에서, RNA 바코드는 RNA 분자의 임의의 다른 부분과 상호작용하지 않는 자체 포함된 구조로 폴딩되도록 디자인된다. RNA 바코드 영역의 구조는 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 바코드 영역의 구조는 약 1 내지 약 10개의 염기쌍(또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 염기쌍)을 포함하는 염기쌍 나선을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA 바코드 영역은 7개의 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 염기쌍은 염기쌍 나선의 말단 염기쌍에 고정된 테트라루프로 캡핑된다. 염기쌍 나선의 캡핑은 RNA 바코드 영역의 전반적인 헤어핀 안정성을 유지한다. 일부 구현예에서, 테트라루프는 뉴클레오타이드 서열 GNRA를 포함하지만 여기에 제한되는 것으로 의미되지 않는다. 일부 구현예에서, RNA 바코드 영역은 임의의 개별 바코드가 다른 바코드로 잘못 해석되도록 적어도 2개의 돌연변이를 진행되도록 디자인된다.

V. RNA 분자의 폴딩

본원에 개시된 주요 요지는 시험관내 전사 및 세포 및 바이러스에서 생성된 RNA 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 방법에 의해 생성된 RNA 분자로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 겔 전기영동을 변성시켜 정제하고 재생성하여 생물학적으로 관련된 형태를 성취할 수 있다. 추가로, 목적하는 pH(예를 들어, 약 pH 8)에서 목적하는 형태로 RNA 분자를 폴딩하는 모든 절차가 대체될 수 있다. RNA 분자는 먼저 가열되고 낮은 이온 강도 완충액에서 급속 냉각되어 다량체 형태를 제거할 수 있다. 이어서 폴딩 용액을 첨가하여 RNA 분자가 적절한 형태를 달성하고 친전자체로 구조에 민감한 프로빙을 위해 이를 제조할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, RNA는 단일 반응으로 폴딩될 수 있고 이후에 (+) 및 (-) 친전자체 반응으로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 변형 전에 자연적으로 폴딩되지 않는다. RNA 분자가 가열 및/또는 저염 조건에 의해 변성되는 동안 변형이 일어날 수 있다.

VI. RNA 분자 변형

친전자체는 RNA에 첨가하여 가요성 뉴클레오타이드 위치에서 2'-O-부가물을 생성할 수 있다. 이어서, 반응은 본질적으로 모든 친전자체가 RNA와 반응하거나 물에 의한 가수분해로 인해 분해될 때까지 배양될 수 있다. 어떠한 특이적 켄칭 단계가 요구되지 않는다. 변형은 복잡한 리간드 및 생분자의 존재뿐만 아니라 다양한 염의 존재 하에 수행될 수 있다. RNA는 또한 세포 및 바이러스내 변형될 수 있다. 이들 염 및 복잡한 리간드는 마그네슘, 나트륨, 망간, 철 및/또는 코발트의 염을 포함할 수 있다. 복잡한 리간드는 단백질, 지질, 다른 RNA 분자, DNA 또는 유기산 소분자를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 복잡한 리간드는 본원에 기재된 바와 같이 소분자 단편이다. 일부 구현예에서, 복잡한 리간드는 본원에 기재된 바와 같은 화합물이다. 변형된 RNA는 예를 들어 에탄올 침전에 의해 프라이머 연장 반응에 해로울 수 있는 반응 생성물 및 완충액 성분으로부터 정제될 수 있다.

VII. 프라이머 연장 및 중합

본원에 개시된 주요 요지에 따라 프라이머 연장에 의한 RNA 부가물의 분석은 다양한 구현예에서 최적화된 프라이머 결합 부위, 열안정성 역전사효소, 낮은 MgCl₂ 농도, 상승된 온도, 짧은 연장 시간 및 이전의 임의의 조합의 용도를 포함할 수 있다. 반응 부산물 및 다른 소분자 오염물이 없는 온전한 분해되지 않은 RNA는 또한 역전사를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 수득한 RNA-cDNA 하이브리드의 RNA 성분은 염기로 처리함에 의해 분해될 수 있다. 이어서, cDNA 단편은 본원 개시내용을 검토한 후 당업자에게 명백한 바와 같이, 예를 들어 폴리아크릴아미드 서열분석 겔, 모세관 전기영동 또는 기타 분리 기술을 사용하여 분리될 수 있다.

데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)는 프라이머와 함께 또는 별도로 적절한 양으로 합성 혼합물에 첨가할 수 있고 수득된 용액을 약 1분 내지 10분 동안 약 50-100℃로 가열될 수 있다. 가열 기간 후, 용액은 냉각될 수 있다. 일부 구현예에서, 프라이머 연장 반응을 수행하기 위한 적절한 제제는 냉각된 혼합물에 첨가될 수 있고, 반응은 당업계에 공지된 조건 하에 일어나도록 허용된다. 일부 구현예에서, 중합용 제제는 열에 안정하다면 다른 시약과 함께 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 (또는 증폭) 반응은 실온에서 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 (또는 증폭) 반응은 중합용 제제가 더 이상 기능하지 않는 온도까지 일어날 수 있다.

중합용 제제는 예를 들어 효소를 포함하는 프라이머 연장 생성물의 합성을 성취하는 기능을 하는 임의의 화합물 또는 시스템일 수 있다. 상기 목적을 위해 적합한 효소는 이. 콜라이 (E. coli) DNA 폴리머라제 I, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제의 Klenow 단편, 폴리머라제 뮤테인, 역전사효소, 및 열에 안정한 효소 (즉, 변성을 유발할 만큼 충분히 상승된 온도에 노출된 후 프라이머 연장을 수행하는 효소), 예를 들어, 뮤린 또는 조류 역전사효소 효소를 포함하는 기타 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 효소는 각각의 다형성 유전자좌 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물을 형성하기 위해 적절한 방식으로 뉴클레오티드의 조합을 촉진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 합성은 각 프라이머의 5' 말단에서 개시되고 합성이 디데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 또는 2'-O-부가물의 혼입에 의해 주형 (template) 말단에서 종료될 때까지 3' 방향으로 진행되어 다양한 길이의 분자를 생성할 수 있다.

새롭게 합성된 가닥 및 이의 상보적 핵산 가닥은 본원에 기재된 하이브리드화 조건 하에서 이중-가닥 분자를 형성할 수 있으며, 상기 하이브리드는 이의 전문이 본원에 참조로 인용되는, 미국 특허 제10,240,188호 및 미국 특허 제8,318,424호에 기재된 방법에 개시된 바와 같이 후속 단계에서 사용된다. 일부 구현예에서, 새롭게 합성된 이중 가닥 분자는 또한 단일 가닥 분자를 제공하기 위해 당업계에 공지된 임의의 절차를 사용하여 변성 조건에 적용될 수 있다.

VII. 미가공 데이터의 가공

RNA 분자와 같은 핵산, 화학적 변형 분석 및/또는 핵산 구조 분석에 대해 본원에 기재된 주요 요지는 컴퓨터 판독가능 매체에 구현된 컴퓨터 실행 가능한 명령어를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품을 사용하여 구현될 수 있다. 본원에 기재된 주요 요지를 구현하기에 적합한 예시적인 컴퓨터 판독 가능한 매체는 칩 메모리 장치, 디스크 메모리 장치, 프로그램 가능한 논리 장치, 및 응용 특정 집적 회로를 포함한다. 또한, 여기에 기재된 주요 요지를 구현하는 컴퓨터 프로그램 제품은 단일 장치 또는 컴퓨팅 플랫폼에 위치할 수 있거나 여러 장치 또는 컴퓨팅 플랫폼에 걸쳐 분포될 수 있다. 따라서, 여기에 기재된 주요 요지는 컴퓨터에 의해 실행될 때 RNA 구조 분석과 같은 핵산에 대한 특정 기능을 수행하는 컴퓨터 명령 세트를 포함할 수 있다.

상기 언급된 항목 I-VII를 고려하여, 모듈러 RNA 스크리닝 작제물은 리간드 결합의 판독을 위한 고속처리 검정으로서 SHAPE를 구현하도록 디자인되었다 (도　1, 상부). 작제물은 2개의 표적 모티프, 예를 들어, 이의 구조가 붕괴되는 경우 바이러스 적합성을 감소시키는 뎅기열 바이러스 게놈의 5' UTR ²⁶ 및 TPP 리보스위치 압타머 도메인으로부터의 유사매듭을 함유하도록 디자인되었다^27-29. 단일 작제물내 2개의 별개의 구조적 모티프를 포함하면 각각이 다른 것에 대한 내부 특이성 제어 역할을 할 수 있게 한다. RNA 구조 둘 다에 결합된 단편은 비특이적 결합체로서 용이하게 동정되었다. 이들 2개의 구조는 단일 가닥이도록 디자인된 6개 뉴클레오타이드 링커로 연결되어 2개 RNA 구조가 구조적으로 독립적으로 유지되도록 한다. 작제물의 구조적 코어를 플랭킹하는 것은 구조 카세트²⁵이고; 이들 스템-루프-형성 영역은 스크리닝 작업흐름에 요구되는 단계를 위한 프라이머-결합 부위로서 사용되고 작재물 내 다른 구조물과 상호작용하지 않도록 디자인되었다 (도 7).

스크리닝 작제물의 또 다른 성분은 RNA 바코드이고; 바코딩은 다운스트림 작업부하를 상당히 감소시키는 멀티플렉싱을 가능하게 한다. 단편 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용되는 96웰 플레이트에서 각각의 웰은 다른 동일한 작제물의 맥락에서 고유한 바코드가 있는 RNA를 함유하고, 따라서 바코드 서열은 웰 위치와 멀티플렉싱 후 존재하는 단편 (또는 단편들)을 동정한다 (도 1). RNA 바코드 영역은 작제물의 임의의 다른 부분과 상호 작용하지 않는 자체 함유된 구조로 폴딩하도록 디자인되었다. 바코드 구조는 GNRA 테트라루프로 캡핑된 7개 염기쌍 나선 구조이며 헤어핀 안정성을 유지하기 위해 G-C 염기쌍으로 고정되어 있다 (도 7). 96개의 바코드의 각각의 세트는 임의의 개별 바코드가 2개 이상의 돌연변이를 거쳐 또 다른 바코드로 잘못 해석되도록 디자인되었다.

상기 작제물은 리간드 결합에 대해 스크리닝하기 위해 RNA 구조를 선택하는데 가요성을 제공하고 단순하고 간단한 스크리닝 실험을 지원한다 (도 1). 고유한 RNA 바코드가 있는 달리 동일한 RNA 작제물을 함유하는 96웰 플레이트에서 각각의 웰은 하나 또는 몇 개의 소분자 단편 또는 단편 부재의 대조군(용매)으로 항온처리되고 이어서 SHAPE 시약에 노출된다. 수득한 SHAPE 부가물은 뉴클레오타이드당 구조 정보를 화학적으로 암호화한다. SHAPE-탐지 후, 단편 실체(RNA 바코드) 및 단편 결합(SHAPE 부가물 패턴)을 결정하기 위해 요구되는 정보는 영구적으로 각각의 RNA 가닥에 암호화되어 있고, 따라서, 플레이트의 96웰로부터의 RNA는 단일 샘플에 풀링될 수 있다. 단편 스크리닝 실험은 표준 MaP 구조-탐지 작업흐름과 매우 유사한 방식으로 처리된다²⁴. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전문화된 이완된 충실도 역전사 반응을 사용하여 RNA 상의 임의의 SHAPE 부가물의 위치에서 비-주형 암호화된 서열 변화를 함유하는 cDNA를 제조한다³⁰. 이들 cDNA는 이어서 고속처리 서열분석을 위해 DNA 라이브러리를 제조하기 위해 사용된다. 실험의 다중 플레이트는 DNA 라이브러리 수준에서 바코드되어²⁴ 단일 서열분석 수행에서 수천 개의 화합물에 대한 데이터 수집을 가능하게 할 수 있다 (도 1). 수득한 서열분석 데이터는 수백 개의 개별 판독을 함유하고, 각각은 특정 RNA 가닥에 상응한다. 이들 판독은 각 소분자 단편 또는 단편 조합에 대한 데이터를 분석할 수 있도록 바코드별로 분류된다. SHAPE 및/또는 SHAPE-MaP와 같은 위에서 상기된 방법을 사용하는 소분자 단편(예를 들어, 단편 1 및/또는 단편 2)의 결정 및 동정은 다음 섹션에서 보다 자세히 기재된다.

C. 리간드 동정 및 선택

상기 언급된 바와 같이, SHAPE 및 SHAPE-MaP는 관심 대상의 RNA 분자에 결합하거나 이와 연합된 소분자 단편을 동정하는데 사용되었다. 특히 SHAPE-Map을 사용하여 소분자 단편을 시험하는 경우, 뉴클레오티드 당 SHAPE-MaP 돌연변이율로 결합된 단편 시그니처의 검출은 대규모 실험 스크린에 걸쳐 데이터를 정규화하고 통계적 엄격함을 보장하기 위한 여러 단계를 포함한다. SHAPE-기반 히트 분석 전략의 주요 특성은 다음을 포함한다: (i) 플레이트-대-플레이트 및 웰-대-웰 다양성을 설명하기 위해 각각의 단편-노출된 RNA 또는 "실험 샘플"과 5개의 음성의 단편 부재 노출된 대조군 샘플과의 비교; (ii) 본원 개시내용에서 작제물 내 2개의 구조적 모티프인 유사매듭 및 TPP 리보스위치 각각에 대해 독립적으로 수행된 히트 검출; (iii) 이들 뉴클레오타이드는 단편 유도된 변화를 보여줄 가능성이 없으므로 모든 샘플에 걸쳐 낮은 반응성을 갖는 개별 뉴클레오타이드의 차폐; 및 (iv) 단편-노출된 실험 샘플과 단편 부재 노출된 음성 대조군 샘플 간의 돌연변이율에서 뉴클레오타이드 당 차이의 계산. 모티프 중 하나와 단편 부재 대조군 간의 돌연변이율에서 20% 이상의 차이를 갖는 이들 뉴클레오타이드는 Z-스코어 분석을 위해 선택되었다. 그러나 당업자는 돌연변이율에서의 차이가 변화할 수 있음을 인지하여 그에 따라 돌연변이율의 차이를 조정할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 돌연변이율에서의 차이는 25%, 30%, 35%, 45%, 또는 50% 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이율에서의 차이는 15%, 10%, 또는 5% 이상일 수 있다. 단편은 2개의 모티프 중 하나에서 3개 이상의 뉴클레오타이드가 2.7 초과의 Z-값을 갖는 경우 (2개의 모티프에 대한 포이손 (Poisson) 수의 비교에 의한 결정시³¹, 실시예 2를 참조) SHAPE 반응성 패턴을 유의적으로 변경시키는 것으로 결정되었다. 그러나, Z-값은 다양할 수 있고, 당업자는 이들을 그에 따라 조정할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, Z-값은 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3., 3.4, 3.5, 3.6., 3.7, 3.8, 또는 3.9 초과이다. 일부 구현예에서, Z-값은 1.0., 1.1., 1.2., 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 또는 2.6 초과이다.

이후에 함께 연결되어 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 생성하는 SHAPE 및/또는 SHAPE-MaP를 갖는 소분자 단편을 확인하기 위해, 일련의 단계가 수행된다. 먼저, 표적 RNA 분자에 대해 적합한 결합 활성을 나타내는 임의의 초기 리드 또는 히트 화합물을 동정하기 위해 다수의 화합물, 예를 들어 적어도 100개의 화합물을 스크리닝하는 1차 스크리닝이 수행된다. 단계 2에서 이들 히트 화합물은 히트 화합물의 구조가 변형됨에 따라 표적 RNA 결합 친화성에서의 변화가 결정되는 구조-활성-관계 (SAR) 연구에서 추가로 조사된다. 다수의 소분자 단편이 표적 RNA 분자에 적합한 결합 리간드로 동정된 경우, 각 소분자 단편에 대한 결합 부위를 추가로 조사하기 위해 추가 결합 연구가 수행될 수 있다 (즉, 단계 3). 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적 RNA는 표적 RNA의 제2 단편 (단계 2의 SAR 연구에서 RNA 결합 리간드로서 동정된)으로의 노출 전 제1 단편 (단계 2에서 SAR 연구에 따른 표적 RNA 결합 리간드로서 동정된)과 예비 항온처리되어 제2 단편이, 제1 단편이 이미 결합된 경우 표적 RNA에 결합할 수 있는지의 여부를 동정할 수 있다. 관심대상의 RNA에 대한 적합한 결합 활성을 갖는 제2 단편이 동정되면, 링커로 제1 단편을 연결하여 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 생성할 수 있다 (즉, 단계 4). 상기 언급된 단계 각각은 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.

단계 1: 1차 스크리닝

1차 스크리닝에서 1,500개의 단편이 시험되었고 41개의 단편이 히트로 검출되어 초기 히트율이 2.7%였다. 히트 확증은 3중 SHAPE 분석을 통해 수행되었고 (도 2, 도 8), 화합물은 3회 반복 모두에서 결합제로서 검출된 경우에만 진정한 히트로 허용되었다. 이어서, 이들 복제된 히트 화합물을 등온 적정 열량측정법 (ITC)으로 분석하여 단지 표적 모티프에 해당하는 RNA에 대한 결합 친화성을 결정하였다 (스크리닝 작제물에서 플랭킹 서열 제외). 이들 초기 히트 중, 8개의 히트가 복제 분석 및 ITC에 의해 확증되었다 (표 1). 히트 중 7개는 시험 작제물의 TPP 리보스위치 영역 내 대부분 또는 전반적으로 위치하는 이들의 돌연변이 시그니처를 기반으로 TPP 리보스위치에 결합하였다. 상기 단편이 RNA 작제물의 모든 부분에 걸쳐 뉴클레오티드에 영향을 미치기 때문에 나머지 히트는 비특이적이었다. 시험 작제물의 뎅기열 유사매듭 영역에 특이적으로 결합하는 화합물이 검출되지 않았다.

[표 1] SHAPE 탐지에 의해 검출된 바와 같이 TPP 리보스위치에 결합하는 단편.

히트는 SHAPE 구조 탐지에 의해 검출되었고 레플리케이트 분석 및 ITC에 의해 입증되었다. 해리 상수는 ITC에 의해 결정되었고; ‡로 표시된 오차 값은 ≥3회 레플리케이트로부터 유래된 표준 오차를 나타내며, 다른 오차 추정치는 결합 곡선의 최소 제곱 회귀에 대한 95% 신뢰 구간을 기반으로 계산된다. 고유 TPP 리간드는 비교를 위해 포함된다.

ITC에서 확증된 바와 같은 TPP 리보스위치에 결합하는 7개의 단편은 다양한 화학형을 갖고 있고; 대부분은 고유 TPP 리간드와 유사성이 거의 없거나 전혀 없다 (표 1). 전반적으로 헤테로방향족 질소 함유 환이 우세하고; 이들은 수소 결합 상호 작용에 참여할 가능성이 있다. 3개의 화합물은 피리딘 환을 갖고 2개는 피라진 환을 갖는다. 아졸 환 모이어티는 3개의 화합물에 존재한다: 2개의 티아디아졸 및 이미다졸. 고유 TPP 리간드에는 티아졸 환이 있지만 상기 모이어티는 RNA와의 결합 상호작용에 참여하지 않는다^28,29,33. 추가로, 다수의 동정된 단편은 1급 아민, 에스테르 및 에테르, 및 수소 결합 수용자 또는 공여자로서 작용할 수 있는 불소 그룹을 함유한다.

단계 2: 리보스위치-결합 단편의 구조-활성 관계(SAR)

다음으로, 결합 친화성을 증가시키고 결합을 방해하지 않고 링커로 단편 히트가 변형될 수 있는 위치를 동정하기 위한 목표로 초기 히트 중 일부의 유사체를 조사하였다. 특히, 화합물 2와 5의 유사체는 이들 두 단편이 구조적으로 구별되고 유사체가 시판되고 있으므로 고려되었다. 유사체-RNA 결합은 ITC에 의해 평가하였다. 2의 16개 유사체는 시험되었다. 환 질소 중 하나 또는 둘 다를 제거함에 의해 2의 코어 퀴녹살린 구조의 변경은 결합 활성의 변화를 유도하였다 (표 2A).

[표 2A] 단편 2 유사체에 대한 SAR.

퀴녹살린 코어에 대한 변형을 조사하고 ITC에 의해 해리 상수를 수득하였다.

결합 친화성에서의 개선은 메틸렌 연결된 수소 결합 공여자 또는 수용자의 도입으로부터 비롯되었다 (표 2B, 화합물 16 및 17). 퀴녹살린 환 코어 상의 다른 위치에서 다양한 치환체는 결합 활성을 감소시켰다. 화합물 2는 C-6 위치에서 치환체가 변형될 때 관찰되는 높은 정도의 가요성 및 심지어 결합 개선에 기반하여 추가 개발을 위한 양호한 후보였다.

[표 2B] TPP 리보스위치 RNA에 결합하는 단편 2의 유사체에 대한 구조-활성 관계. 퀴녹살린 코어의 펜던트 그룹에 대한 변형. 해리 상수는 ITC에 의해 수득되었다.

이어서, 단편 5의 18개 유사체를 조사한 결과 분자의 코어 피리딘 기능이 결합에 중요한 것으로 나타났는데 환 질소 위치를 변화시키거나 환 질소를 추가 또는 제거하면 결합이 모두 감소되거나 폐지되기 때문이다 (표 3).

[표 3] TPP 리보스위치 RNA에 결합하는 단편 5의 유사체에 대한 구조-활성 관계. 피리딘 코어 및 해리 상수에 대한 변형은 ITC에 의해 수득되었다.

환 치환체에 대한 변형은 일반적으로 결합 활성을 상당히 상실시켰다 (표 4). 유일한 친화성 증가 유사체는 C-4 위치, S12에 염소가 있어 단편 5보다 TPP 리보스위치에 대해 약 3배 더 높은 친화성을 갖는 화합물을 생성하였다.

[표 4] TPP 리보스위치 RNA에 결합하는 단편 5의 유사체에 대한 구조-활성 관계. 피리딘 코어의 펜던트 그룹에 대한 변형. 해리 상수는 ITC에 의해 수득되었다.

단계 3: TPP 리보스위치 상의 제2 부위에 결합하는 단편의 동정

2차 라운드의 스크리닝을 사용하여 화합물 2 또는 S12에 미리 결합된 스크리닝 작제물의 TPP 리보스위치 영역에 결합된 단편을 동정하였다. 상기 스크리닝은 2 또는 S12가 이미 결합되어 있을 때 TPP 리보스위치와 우선적으로 상호작용하는 단편을 동정하였고, 이는 협력 효과로 인해 또는 1차 리간드 결합 시 발생하는 구조적 변화로 인해 새로운 결합 모드가 가용화될 수 있게 되었기 때문이다 (도 3). 스크리닝된 1,500개 단편 중에, 5개는 2 또는 S12와 동시에 결합하는 것으로 확증되었다 (표　5).

[표 5] SHAPE에 의한 검출 시 예비 결합된 단편 파트너의 존재하에 TPP 리보스위치에 결합하는 단편. 히트는 레플리케이트 SHAPE 분석에 의해 확증되었다. 1차 결합 파트너 (2,6)는 표 1에 나타낸다.

하나의 두 번째 스크리닝 히트 (29)는 SHAPE 반응성 신호에서 매우 강력한 변화를 유도했으며 P1 나선의 언폴딩을 포함하여, RNA 구조의 상당한 변경을 일으키는 것으로 나타났다. 이 단편은 비특이적 상호작용과 일치하는 RNA의 다른 영역에서의 변화를 유발함에 따라서 상기 단편은 추가로 단편 연결을 위한 후보로서 고려되지 않았다. 단편 28은 ITC 분석에 필요한 농도에서 불용성이었고; 따라서, 퀴놀린 환 대신 피리딘을 함유하는 관련 유사체를 ITC에 의해 조사하였다 (표 6). 이들 화합물은 약한 친화성으로 결합되었고 그럼에도 불구하고 31 및 32는 2와 명확하지만 2와 약간의 결합 협력을 나타냈다.

[표 6] 미리 결합된 단편 2의 존재 및 부재에서 TPP 리보스위치 RNA에 결합하는 단편 28의 유사체에 대한 구조-활성 관계.*

*und(미정)는 ITC 결합 곡선에 피팅하는 무능력으로 인한 것이고; 불용성, ITC에 필요한 농도에서 불용성 화합물.

[표 7] 단편 기반 방법으로 개발된 대표적인 단백질 및 RNA 단편-링커-단편 리간드의 상세한 비교. RNA 예는 별표로 강조한다. 각 항목은 2개 구성 요소 단편과 개별 Kd 값, 연결된 화합물 및 상응하는 Kd 값, 연결된 화합물에 대한 리간드 효율(LE) 및 연결 계수(E)를 상세히 설명한다^{22,38,53,54,45-52}

단계 4: 협력성 및 단편 연결

2와 31 사이의 협력적 결합 상호작용은 ITC에 의해 정량하였다. 개별적으로 2개는 25 μM의 K_d로 결합하고 31개는 10 mM의 훨씬 더 높은 K_d로 결합한다. 2차 스크리닝에서와 같이, 단편 31의 친화성은 2가 TPP 리보스위치 RNA에 사전 결합되어 2-RNA 복합체를 형성할 때 조사되었다. 이들 조건하에서, 단편 31은 대략 3 mM의 K_d로 2-TPP RNA 복합체에 결합되었다 (도 4). 상기 실험은 또한 2에 의한 결합이 포화될 때 31이 TPP RNA에 결합한다는 것을 보여주었으며, 이는 상기 2개의 단편이 동일한 위치에서 결합하지 않음을 의미한다. 2와 31은 각각 TPP RNA의 서로 다른 영역에 우수하고 합리적 친화성으로 결합함으로써, 2개의 단편은 고친화성 리간드를 생성하는 목적으로 연결되었다.

단편 히트 2 (표 2B) 및 28 (표 4)의 SAR 분석에 기초하여, 단편 31의 피리딘 환에서 17번의 아미노메틸 위치와 2개 부위에 초점을 맞춰 가장 유망한 SAR 단편의 연결된 유사체를 제조하였다 (도 5). 먼저, 아미드 또는 아민 링커와 접합된 단편의 친화도를 비교하였다. 가요성 아민 링커가 있는 화합물 (화합물 36)은 아미드 연결된 버전 (화합물 35, 도 5)보다 5배 더 높은 결합 친화성을 가졌다. 이들 연결은 고유 TPP 리간드의 피로포스페이트 모이어티에서 발생하는 바와 같이 마그네슘 이온³⁵을 킬레이팅할 수 있는 하이드록삼산과 관련하여 도입되었다^27,28. 그러나, 아민 결합된 하이드록삼산 화합물 36은 모 단편 17의 것과 유사한 친화성으로 결합하고, 이는 하이드록삼산 모이어티가 이온을 킬레이팅함에 의해 추가의 결합 친화성을 부여하지 않음을 시사한다. 연결된 화합물 37은 625 nM 친화성으로 결합하여 -적절한 근사값-으로 적당한 친화성의 2개의 단편의 연결이 높은 나노몰 결합제를 성취할 수 있음을 보여준다. 단편 31 실체의 3급 아민 (화합물 38)으로의 대체가 화합물 37에 비해 친화성을 감소시켰고, 이는 단편 31과 RNA의 상호작용이 단지 하전된 기반의 효과 초과로 매개됨을 시사한다. 마지막으로, 길이 (화합물 39) 또는 피리딘 환 연결 부위 (화합물 40)에 의한 17 및 31 모이어티 간의 연결을 변화시키면 화합물 37에 대한 친화성이 감소한다 (도 5). 궁극적으로 5.0 μM (화합물 19) 및 ≥10 mM (화합물 31)의 친화성으로 TPP 리보스위치에 개별적으로 결합하는 화합물을 연결하여 625 nM의 K_d로 RNA에 결합하는 화합물 (37)을 생성하였다.

당업자는 상기 단계 I-IV가 제한을 의미하지 않고 단지 예시적인 구현예로서 작용한다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 TPP 리보스위치에 대한 적합한 결합 친화성을 갖는 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 제공하기 위해 함께 연결될 수 있는 대안적 단편을 동정하기 위해 상기 단계 I-IV를 적용할 수 있음이 잘 이해될 것이다. 추가로, 당업자는 다른 관심 RNA 분자에 결합하는 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 제공하기 위해 함께 연결될 수 있는 단편을 동정하기 위해 상기 단계 I-IV를 적용할 수 있음이 잘 이해될 것이다.

D. 개요 및 추가의 고려사항

암호화(mRNA) 및 비-암호화 RNA 둘 다가 잠재적으로 세포 조절 및 질환의 과정을 변경하도록 조작될 수 있기 때문에, 구조화된 RNA에 대한 소분자 리간드를 동정하기 위해 효율적인 전략을 개발하고자 모색하였다. 본원에 개시된 연구는 단편 기반 전략과 조합된 RNA에 대한 리간드 결합을 검출하는 SHAPE 스크리닝 판독값을 사용하는 전망을 입증한다. 여기에서, 상기 전략은 625 nM의 Kd로 천연 리간드와 구조적으로 관련이 없는 TPP 리보스위치에 결합하는 리간드를 생성하기 위해 사용되었다. 조합된 SHAPE 및 단편 기반 스크리닝 접근법은 표적화될 수 있는 RNA 구조와 개발할 수 있는 리간드 화학형 둘 다와 관련하여 일반적이다. 상기 전략은 구체적으로 3차원 포켓 내에서 결합하는 RNA 모티프를 동정하기 위해 필수적인 복합체 구조를 갖는 RNA의 리간드를 발견하는데 매우-적합하다⁴. 추가로, MaP 접근법의 사용과 RNA 및 DNA 바코딩 둘 다를 통한 멀티플렉싱의 적용으로 인해, 천 개 이상의 구성원 단편 라이브러리를 스크리닝하는 데 요구되는 노력이 적당하여 구조적으로 많은 상이한 표적을 효율적으로 스크리닝할 수 있게 한다.

수득된 많은 리간드는 TPP 리보스위치에 대해서도 수행된 단일 라운드 스크리닝에 대해 이전에 보고된 것과 유사하였다^15,17. 1차 스크리닝 내 히트는 SHAPE에 의해 검출된 대부분의 리간드가 10-300 μM 범위로 결합되도록 더 높은 친화성으로 약간 편향된 것으로 나타났다. 사용되는 히트 검출 검정은 SHAPE 반응성에서 가장 단단한 단편 결합제 및 가장 실질적인 변화를 유도하는 결합제의 검출에 편향될 가능성이 있다. 친화성이 보다 낮은 단편은 누락될 가능성이 있다. 단단한 결합 단편으로의 편향은 전반적으로 이점이 있는 것으로 사료된다. 상기 스크리닝 기준을 충족하기 위해 요구되는 친화성 및 특이성에 도달한 뎅기열 유사매듭에 결합된 어떠한 단편도 동정되지 않았다. 뎅기열 유사매듭 RNA는 고도로 구조화되어 있고, 단편이 상기 구조를 동요시킬 수 있는 가능성이 낮을 수 있다. 또 다른 가능성은 상기 특정 유사매듭 구조가 리간드 가능한 포켓을 함유하지 않을 수 있다는 것이다.

1차 스크리닝으로부터의 단편 히트가 RNA에 미리 결합되고 추가 단편 결합 파트너에 대해 스크리닝되는 단편 쌍 동정 전략은 구체적으로 SHAPE에 의해 수득될 수 있는 뉴클레오티드 당 정보를 활용하고 여기에서 성공적으로 유도된 피트(fit) 쌍을 발견하기 위해 사용되었다 (도 4). 단편 기반 리간드 개발의 핵심 주의 사항은 2개의 단편 간의 협력이 근위 결합을 통해 달성될 수 있고 상기 부가적 결합이 최소 침습 공유 링커와 함께 협력적 단편을 연결함으로써 이용될 수 있다는 것이다^20,21,36,37. 1차 및 2차 단편 히트로부터 연결된 화합물 37의 개발은 단편 기반 리간드 발견이 RNA 표적에 효율적으로 적용될 수 있음을 보여준다. 2와 31 간에 적당한 정도의 협력이 있다. 화합물에 의한 결합은 2가 RNA에 미리 결합된 경우 3 내지 10배까지 보다 강하였다. 이들 2개의 단편을 연결하는 즉시, 이들의 결합 에너지의 적당한 가산성이 관찰되었다. 37은 625 nM의 친화성을 가졌다. 단편의 완벽한 위치화가 달성되지 않았기 때문에 단편 2 및 31을 연결하는 경우 어떠한 초-부가 효과가 관찰되지 않았다³⁶. 링커의 길이 또는 기하학의 작은 변화는 연결된 리간드의 친화성에 큰 변화를 유도하였고 (도 5), 이는 링커의 정확한 배향이 2개 단편의 최적으로 배향시키는데 중요함을 의미한다. 화합물 37의 성공적인 개발은 단편 간의 협력의 정도 또는 서브-마이크로몰 리간드를 효율적으로 개발하기 위해 이들을 연결하는 공유 링커의 구성에서 완벽을 달성할 필요가 없다는 것을 밝힌다.

단백질을 표적화하는 단단한 결합 리간드를 수득하기 위해 단편 간의 협력을 이용하도록 설계된 많은 노력이 있었지만 표적화 RNA는 초기 단계에 있다. 본원에 개시된 SHAPE 기반 스크리닝 전략이 이전 (단백질 중심) 노력과 비교하여 단편 연결과 얼마나 잘 커플링되어 있는지가 조사되었다. 이전에 단편 기반 전략을 사용하여 발견된 화합물은 연결 계수 (E)에 따라 순위가 매겨졌으며, 연결될 때 전체 시스템이 함께 기능하는 정도를 측정하였다 (도 6, 표 7에서 확장된). 양성 또는 음성 기여 인자의 부재하에, 2개의 단편의 결합 에너지는 정확하게 부가적이고, 링커는 불활성이고 E는 1.0과 동일하다. 협력적 효과 또는 선호될 수 있는 링커 상호작용은 E를 감소시키고, 항-협력적 노력 또는 음성 링커 상호작용은 E를 증가시킨다. 결정적으로, E 값은 단백질 시스템에서 크기의 순서로 다양할 수 있다. 37에 대한 연결 계수는 2.5로 학술 문헌에서 연결된 (단백질-표적화된) 리간드에 대한 평균보다 약간 높았다. 37은 결합의 자유 에너지를 비수소 원자의 수로 나눈 리간드 효율 (LE)을 가지며, 이는 단백질을 표적화하는 연결된 단편 리간드의 예와 유리하게 비교된다 (도 6). 이러한 측정 기준에 따르면, 37은 고유 TPP 리보스위치 리간드와 밀접하게 관련된 리간드인 TPPc와 거의 동일하게 기능한다²². 따라서, 특히 SHAPE 지원 멀티플렉싱된 스크리닝에 의해 효율적으로 구현되는 단편 기반 리간드 발견은 광대한 RNA 구조를 표적화하는 독특한 리간드의 신속한 개발을 가능하게 하는 유의적인 전망을 보유하고 있다.

E. 제조 방법

본원의 개시내용은 또한 본원에 개시된 화합물을 제조하기 위한 임의의 방법에 관한 것이다. 당업자는 이러한 제조 방법이 다양할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 화합물을 제조하기 위한 방법은:

화학식 IV의 단편을 Pd 촉매의 존재하에 화학식 V-1 또는 V-2와 접촉시키는 단계를 포함한다:

화학식 IV

상기 식에서,

X₁, X₂, 및 X₃은 CHR_1, CR₁, 및 헤테로원자 N, NH, O 및 S로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, 인접한 X₁, X₂, 및 X₃은 O 또는 S인 것으로 동시에 선택되지 않고;

파선은 임의의 이중 결합을 나타내고;

Y₁, Y₂ 및 Y₃은 CR₂ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

R₁ 및 R₂는 -H, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -OH, -CN, -NO₂, -NH₂, -NH(C₁-C₆ 알킬), -N(C₁-C₆ 알킬)₂, -COOH, -COO(C₁-C₆ 알킬), -CO(C₁-C₆ 알킬), -O(C₁-C₆ 알킬), -OCO(C₁-C₆ 알킬), -NCO(C₁-C₆ 알킬), -CONH(C₁-C₆ 알킬), 및 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬로부터 독립적으로 선택되고;

n은 1 및 2의 정수로부터 선택되고, 여기서, n이 1인 경우, 파선 중 단지 하나는 이중 결합이고;

화학식 V-1

화학식 V2

상기 식에서,

X는 F, Br, Cl 및 I로부터 선택되는 할로겐이고;

X₄, X₅, X₆, 및 X₇은 CR₃ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;

R₃은 -H, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -OH, -CN, -NO₂, -NH₂, -NH(C₁-C₆ 알킬), -N(C₁-C₆ 알킬)₂, -COOH, -COO(C₁-C₆ 알킬), -CO(C₁-C₆ 알킬), -O(C₁-C₆ 알킬), -OCO(C₁-C₆ 알킬), -NCO(C₁-C₆ 알킬), -CONH C₁-C₆ (알킬), 및 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬로부터 선택되고;

m은 1 또는 2이고;

W는 -O 또는 -NR₄이고, 여기서, R₄는 -H, -CO(C₁-C₆ 알킬), 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, -CO(아릴), -CO(헤테로아릴), 및 -CO(사이클로알킬)로부터 선택되고,

일부 구현예에서, Pd 촉매는 (DPPF)PdCl₂, Pd₂(dba)₃, PdCl₂[P(o-톨릴)₃]₂, Pd(dba)₂, 및 Pd(OAc)₂로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 포스핀 리간드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 포스핀 리간드는 모노덴테이트이다. 일부 구현예에서, 포스핀 리간드는 바이덴테이트이다. 예시적인 포스핀 리간드는 DPPF, BINAP, 및 rac-BINAP를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 염기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 염기는 무기산이다. 일부 구현예에서, 염기는 NaOtBu이다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 순수하게 수행된다 (즉, 용매 없이). 일부 구현예에서, 접촉 단계는 용매의 존재하에 수행된다. 일부 구현예에서, 용매는 비극성 용매이다. 예시적인 용매는 톨루엔, 벤젠, 디옥산 및 테트라하이드로푸란을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 승온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 또는 100℃에서 수행된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 화합물을 제조하기 위한 방법은:

화학식 IV의 단편을 환원제의 존재하에 화학식 VI-1 또는 Vi-2의 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다:

화학식 IV

화학식 VI-1

화학식 VI-2

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, Y₁, Y₂, Y₃, n, m, 및 W는 상기 정의된 바와 같다.

일부 구현예에서, 환원제는 환원 아민화 화학을 위해 적용될 수 있는 임의의 환원제일 수 있다. 예시적인 환원제는 수소화붕소 및/또는 수소화알루미늄을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 환원제는 수소화붕소이다. 일부 구현예에서, 환원제는 수소화붕소나트륨이다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 순수하게 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 용매 중에서 수행된다. 예시적인 용매는 알코올 용매 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올), 염소화된 용매 (예를 들어, 디클로로메탄), 및/또는 에테르 용매 (예를 들어, 테트라하이드로푸란)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 실온 미만에서 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 승온에서 수행된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 화합물을 제조하기 위한 방법은:

화학식 IV의 단편을 염기 존재하에 화학식 V-1 또는 V-2의 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다:

화학식 IV

화학식 VII-1

화학식 VII-2

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, Y₁, Y₂, Y₃, n, m, 및 W는 상기 정의된 바와 같고;

G는 -F, -Cl, -Br, -OH, -OCH₃, 또는 -OCH₂CH₃이다.

일부 구현예에서, 염기는 유기산 (피리딘 및/또는 트리메틸아민)이다. 일부 구현예에서, 염기는 무기산 (예를 들어, 탄산칼륨/나트륨 및/또는 중탄산칼륨/나트륨)이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 DCC 및/또는 EDCI와 같은 커플링제를 추가로 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 순수하게 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 용매의 존재하에 수행된다. 예시적인 용매는 THF, DCM, ACN 및/또는 DMSO를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 승온에서 수행된다.

F. 조성물

본원에 개시된 화합물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적 조성물에 제형화될 수 있다.

본원에 개시된 화합물은 약제학적 조성물로서 표준 약제학적 수행에 따라 제형화될 수 있다. 상기 양상에 따라, 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 연합하여 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

전형적인 제형은 본원에 개시된 바와 같은 화합물 및 담체, 희석제 또는 부형제를 혼합함에 의해 제조된다. 적합한 담체, 희석제 및 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 탄수화물, 왁스, 수용성 및/또는 팽윤성 중합체, 친수성 또는 소수성 물질, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등과 같은 물질을 포함한다. 사용되는 특정 담체, 희석제 또는 부형제는 화합물이 적용되는 수단 및 목적에 의존한다. 용매는 일반적으로 포유류에게 투여하기에 안전한 것으로서 당업자에 의해 인지되는 용매 (GRAS)를 기준으로 선택된다. 일반적으로, 안전한 용매는 비-독성 수성 용매, 예를 들어, 물 및 수용성이거나 수혼화성인 다른 비-독성 용매이다. 적합한 수성 용매는 물, 에탄올, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 400, PEG 300) 등 및 이의 혼합물을 포함한다. 제형은 또한 하나 이상의 완충액, 안정화제, 계면활성제, 습윤화제, 윤활제, 유화제, 현탁제, 방부제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미료, 향제, 향미제 및 약물 (즉, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 이의 약제학적 조성물) 또는 약제학적 제품 (즉, 약물)의 제조에 있어서 보조제를 섬세하게 제공하기 위해 기타 공지된 첨가제를 포함할 수 있다.

제형은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 벌크 약물 물질 (즉, 본원에 개시된 바와 같은 화합물 또는 화합물의 안정화된 형태 (예를 들어, 사이클로덱스트린 유도체 또는 기타 공지된 착화제와의 복합체))는 상기된 하나 이상의 부형제의 존재하에 적합한 용매에 용해된다. 화합물은 일반적으로 약물의 쉽게 제어 가능한 용량을 제공하고 환자가 처방된 용법에 순응할 수 있도록 약제학적 투여 형태로 제형화된다. 적용을 위한 약제학적 조성물 (또는 제형)은 약물의 투여를 위해 사용되는 방법에 의존하여 다양한 방식으로 팩키징될 수 있다. 일반적으로, 유통을 위한 물품은 적절한 형태로 약제학적 제형이 내부에 침착된 컨테이너를 포함한다. 적합한 컨테이너는 당업자에게 널리 공지되어 있고 병 (플라스틱 및 유리), 사쉐, 앰푸울, 플라스틱 백, 금속 실린더 등과 같은 물질을 포함한다. 컨테이너는 또한 팩키지 내용물에 대한 부주의한 접근을 방지하기 위해 변조 방지 어셈블리를 포함할 수 있다. 추가로, 컨테이너는 컨테이너의 내용물을 기재하는 표지가 이의 위에 붙어있다. 상기 표지는 또한 적당한 경고를 포함할 수 있다.

약제학적 제형은 다양한 투여 경로 및 투여 유형을 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 정도의 순도를 갖는 본원에 개시된 바와 같은 화합물은 동결건조된 제형, 분쇄된 분말 또는 수용액 형태로 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16th edition, Osol, A. Ed.)와 임의로 혼합될 수 있다. 제형화는 적절한 pH 및 목적하는 순도로 주위 온도에서 생리학적으로 허용되는 담체, 즉 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성인 담체와 혼합하여 수행될 수 있다. 제형의 pH는 주로 화합물의 특정 용도 및 농도에 의존하지만 약 3 내지 약 8의 범위일 수 있다. pH 5에서 아세테이트 완충액 중에 제형은 적합한 구현예이다.

화합물은 멸균성일 수 있다. 특히, 생체내 투여를 위해 사용될 제형은 멸균성이어야만 한다. 상기 멸균은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 성취된다.

화합물은 통상적으로 고체 조성물, 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 저장될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로, 즉 양, 농도, 스케줄, 과정, 비히클 및 투여 경로로 제형화, 투약 및 투여될 수 있다. 상기 맥락에서 고려해야 할 요소는 치료 중인 특정 장애, 치료 중인 특정 포유류, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 종사자에게 알려진 기타 요인을 포함한다. 투여될 화합물의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 좌우될 것이고, 응고 인자 매개 장애를 예방, 개선 또는 치료하는 데 필요한 최소량이다. 이러한 양은 바람직하게는 숙주에 독성이 있거나 숙주가 출혈에 훨씬 더 민감하게 만드는 양 미만이다.

허용되는 희석제, 담체, 부형제 및 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 활성 약제학적 성분들은 또한 예를 들어, 각각 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 겔라틴-마이크로캡슐 및 폴리-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 중에서 제조된 마이크로캡슐 중에 또는 마크로에멀젼 중에 포집될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 기재되어 있다.

화합물의 지연 방출 제제는 제조될 수 있다. 지연 방출 제제의 적합한 예는 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형된 제품 형태, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 있다. 지연 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐 알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

제형은 본원에 상세히 기재된 투여 경로를 위해 적합한 것들을 포함한다. 제형은 단위 투여 형태로 간편하게 제공될 수 있고 약학 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.))에서 발견된다. 상기 방법은 하나 이상의 악세서리 성분을 구성하는 담체와 활성 성분을 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 활성 성분을 균일하게 및 친밀하게 연합시키고 이어서 필요하다면 생성물을 성형함에 의해 제조된다.

경구 투여에 적합한 본원에 개시된 바와 같은 화합물의 제형은 각각 소정량의 화합물을 함유하는 환제, 캡슐제, 카쉐제 또는 정제와 같은 별개의 단위로서 제조될 수 있다.

압축 정제는 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합된 자유 유동성 형태, 예를 들어 분말 또는 과립의 활성 성분을 적합한 기계에서 압축함으로써 제조될 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 적신 분말 활성 성분의 혼합물을 적합한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제는 임의로 코팅되거나 스코어링될 수 있고, 임의로 그로부터 활성 성분의 느린 방출 또는 제어 방출을 제공하도록 제형화된다.

정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 예를 들어 겔라틴 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르가 경구 사용을 위해 제조될 수 있다. 경구 사용을 위해 의도된 본원에 개시된 바와 같은 화합물의 제형은 약제학적 조성물의 제조를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있고, 이러한 조성물은 맛있는 제제를 제공하기 위해 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 포함하는 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 정제 제조에 적합한 무독성 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하여 활성 성분을 함유하는 정제가 허용된다. 이들 부형제는 예를 들어 칼슘 또는 탄산나트륨, 락토스, 칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; 옥수수 전분 또는 알긴산과 같은 과립화 및 붕해제; 전분, 젤라틴 또는 아카시아와 같은 결합제; 및 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크와 같은 윤활제일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나 위장관에서 붕해 및 흡착을 지연시켜 장기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공하는 미세캡슐화를 포함하는 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.

눈 또는 기타 외부 조직, 예를 들어 입 및 피부의 치료를 위해, 제형은 예를 들어 0.075 내지 20% w/w의 양으로 활성 성분(들)을 함유하는 국소 연고 또는 크림으로 적용될 수 있다. 연고로 제형화되는 경우, 활성 성분은 파라핀계 또는 수혼화성 연고 기제와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 수중유 크림 베이스와 함께 크림으로 제형화될 수 있다.

경우에 따라, 크림 기제의 수상은 다가 알코올, 즉 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG 400 포함)과 같은 2개 이상의 하이드록실 그룹을 갖는 알코올 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 국소 제형은 바람직하게는 피부 또는 다른 환부를 통해 활성 성분의 흡수 또는 침투를 증진시키는 화합물을 포함할 수 있다. 상기 피부 침투 증진제의 예는 디메틸 설폭사이드 및 관련 유사체를 포함한다.

에멀젼의 오일상은 공지된 방식으로 공지된 성분으로부터 구성될 수 있다. 상은 유화제만을 포함할 수 있지만, 또한 적어도 하나의 유화제와 지방 또는 오일, 또는 지방과 오일 둘 다의 혼합물을 포함할 수 있다. 친수성 유화제와 함께 포함되는 친유성 유화제는 안정화제로서 작용할 수 있다. 종합하여, 안정화제(들)의 존재 또는 부재하에 유화제(들)는 소위 유화 왁스를 구성하고, 왁스는 오일 및 지방과 함께 크림 제형의 오일 분산 상을 형성하는 소위 유화 연고 기제를 구성한다. 제형에 사용하기에 적합한 유화제 및 유화 안정화제는 Tween® 60, Span® 80, 세토스테아릴 알코올, 벤질 알코올, 미리스틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트 및 나트륨 라우릴 설페이트를 포함한다.

화합물의 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 물질을 함유한다. 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 크로스카멜로스, 포비돈, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가간트 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤화제, 예를 들어, 천연적으로 존재하는 포스파티드 (예를 들어, 렉시틴), 알킬렌 산화물과 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 산화물과 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀), 지방산과 헥시톨 무수물에서 유래된 부분 에스테르와 에틸렌 산화물의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 포함한다. 수성 현탁액은 또한 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트와 같은 하나 이상의 방부제, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어 슈크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.

화합물의 약제학적 조성물은 멸균 주사용 제제 형태, 예를 들어, 멸균성 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 상기 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제 및 상기 언급한 현탁제들을 사용하여 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 멸균 주사용 제제는 또한 1,3-부탄디올과 같은 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 동결건조된 분말로서 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클과 용매로는, 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨을 들 수 있다. 또한, 멸균 고정유도 용매 또는 현탁 매질로서 일반적으로 이용될 수 있다. 상기 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 비롯한 임의의 통상적인 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산도 마찬가지로 주사제의 제조에 사용될 수 있다.

단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받을 숙주 및 특정 투여 방식에 의존하여 다양하다. 예를 들어, 사람에 대한 경구 투여를 위해 의도된 시간-방출 제형은 약 1 내지 1000 mg의 활성 물질을 함유할 수 있으며, 이는 전체 조성물의 약 5 내지 약 95% (중량:중량)로 다양할 수 있는 적당량 및 간편한 양으로 혼합된다. 약제학적 조성물은 투여를 위해 쉽게 측정 가능한 양을 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 주입을 위한 수용액은 약 10 mL/시간 내지 약 50 mL/시간의 속도로 적합한 용적의 주입이 가능하도록 하기 위해 용액 1 밀리리터당 약 1 내지 500 μg의 활성 성분을 함유할 수 있다.

비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제 및 해당 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성의 제형을 부여하는 수성 및 비수성의 등장성 멸균 주사액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다.

눈에 대한 국소 투여에 적합한 제형은 또한 활성 성분이 적합한 담체, 특히 활성 성분에 대한 수성 용매에 용해되거나 현탁된 점안액을 포함한다. 활성 성분은 바람직하게는 약 0.5 내지 20% w/w, 예를 들어, 약 0.5 내지 10% w/w, 예를 들어 약 1.5% w/w의 농도로 이러한 제제에 존재한다.

구강 내 국소 투여에 적합한 제형은 활성 성분을 향미 베이스, 일반적으로 슈크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트에 포함하는 로젠지 (lozenge); 겔라틴 및 글리세린, 또는 슈크로스 및 아카시아와 같은 불활성 기반의 활성 성분을 포함하는 알약; 및 적합한 액체 담체에 활성 성분을 포함하는 구강청결제를 포함한다.

직장 투여용 제형은 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 기제와 함께 좌제로 제공될 수 있다.

폐내 또는 비강 투여에 적합한 제형은 예를 들어 0.1 내지 500 마이크론 범위의 입자 크기를 갖고 (0.5, 1, 30 마이크론, 35 마이크론 등과 같이 마이크론 단위의 증분으로 0.1 내지 500 마이크론 범위의 입자 크기를 포함하는) 이는 비강을 통한 급속 흡입 또는 폐포에 도달하도록 구강을 통한 흡입에 의해 투여된다. 적합한 제형은 활성 성분의 수성 또는 오일 용액을 포함한다. 에어로졸 또는 건조 분말 투여에 적합한 제형은 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있고 하기 기재된 바와 같이 장애의 치료 또는 예방에 지금까지 사용된 화합물과 같은 다른 치료제와 함께 전달될 수 있다.

질 투여에 적합한 제형은 활성 성분 외에 당업계에 적절한 것으로 알려진 담체를 함유하는 페서리 (pessary), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포 또는 분무 제형으로 제공될 수 있다.

상기 제형은 단일 용량 또는 다회 용량의 컨테이너, 예를 들어, 밀봉된 앰푸울 및 바이알로 팩키징될 수 있으며, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가를 요구하는 동결 건조된 (냉동건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조되었다. 바람직한 유닛 용량 제형은 활성 성분의 상기 본원에 인용된 바와 같이 매일 투여용 용량 또는 매일 유닛 서브-용량을 함유하는 것들이거나 이의 적당한 분획이다.

상기 주요 요지는 따라서 수의학적 담체와 함께 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 수의학적 조성물을 추가로 제공한다. 수의학적 담체는 조성물을 투여하는 목적에 유용한 물질이며, 그렇지 않으면 수의학 분야에서 불활성이거나 허용되고 활성 성분과 상용성인 고체, 액체 또는 기체 물질일 수 있다. 이들 수의학적 조성물은 비경구, 경구 또는 임의의 다른 목적하는 경로에 의해 투여될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 개시된 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 추가로 화학치료학적 제제를 포함한다. 이들 구현예의 일부에서, 상기 화학치료학적 제제는 면역치료학적 제제이다.

G. 치료 방법

본원에 개시된 화합물 및 조성물은 또한 RNA 발현 및/또는 기능의 기능부전, 또는 mRNA로부터 생성되는 단백질의 발현 및/또는 기능과 또는 mRNA로부터 생성되거나, 소분자를 이용하여 RNA의 형태를 바꾸는 유용한 역할과 또는 감염성 유기체의 성장을 억제하는 방식으로서 리보스위치의 고유 기능을 변화시키는 역할과 연관된 것으로 동정된 다양한 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 그와 같이 본원의 개시내용의 방법은 RNA 발현 및/또는 기능과 연관된 장애를 치료하거나 새로운 전환 가능한 치료제를 생성하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2018/010146호를 참조하고, 이는 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 (예를 들어, RNA 발현 및/또는 기능의 기능부전과 연관된) 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 본원에 개시된 바와 같은 치료학적 유효량의 화합물 및/또는 조성물의 용량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

RNA 발현에서 기능부전은 하나 이상의 RNA 분자(들)의 과발현 또는 저발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 RNA 분자(들)는 치료될 질환 및/또는 장애를 촉진하는 것과 관련된다. 일부 구현예에서, RNA 분자(들)는 건강한 세포 기구의 일부인 것으로 특징지어지고 따라서 치료될 질환 및/또는 장애를 예방 및/또는 개선할 것이다. 일부 구현예에서, 치료될 질환 또는 장애는 전사, 프로세싱 및/또는 해독과 관련된 RNA 기능의 기능부전과 연관된다. 일부 구현예에서, 치료될 질환 또는 장애는 기능부전 RNA 분자 기능의 결과로서 단백질의 부정확한 발현과 연관된다. 일부 구현예에서, 치료될 질환 또는 장애는 유전자 발현과 관련된 RNA 기능의 기능부전과 연관된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 분자를 상기 mRNA에 결합시킴에 의해 단백질 발현을 저하시키고자 하는 질환 또는 장애이다. 일부 구현예에서, 질환은 소분자를 사용하여 가동 또는 중단으로 전환될 수 있는 치료요법에 의해 유리하게 치료된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 치료학적 유전자의 발현을 가동 또는 중단으로 전환시키는 능력을 갖는 것으로 요구되는 유전학적 질환이다.

치료될 질환 및 장애는 퇴행성 장애, 암, 당뇨병, 자가면역 장애, 심혈관 장애, 응고 장애, 눈의 질환, 감염성 질환 및 하나 이상의 유전자 내 돌연변이에 의해 유발된 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 퇴행성 질환은 알츠하이머 질환 (AD), 근위축성 측삭 경화증 (ALS, 루게릭 질환), 암, 샤르코-마리-투스 (Charcot-Marie-Tooth) (CMT) 질환, 만성 외상성 뇌병증, 낭포성 섬유증, 일부 시토크롬 c 옥시다제 결핍 (종종 퇴행성 리 (Leigh) 증후군의 원인), 엘러스-단로스 (Ehlers-Danlos) 증후군, 진행성 골화섬유형성이상증, 프리드라이히 (Friedreich) 운동실조, 전두측두엽 치매 (FTD), 일부 심혈관 질환 (예를 들어, 관상동맥 질환, 대동맥 협착증 등과 같은 죽상경화증), 헌팅턴 질환, 영아 신경축삭 이영양증, 원추각막 (KC), 구형각막, 백반이영양증, 황반변성 (AMD), 마르판 증후군 (MFS), 일부 미토콘드리아 근병증, 미토콘드리아 DNA 고갈 증후군, 다발성 경화증 (MS), 다계통 위축, 근이영양증 (MD), 신경세로이드 지방푸신증, 니만픽병, 골관절염, 골다공증, 파킨슨 질환, 폐동맥고혈압, 모든 프리온 질환 (크로이츠펠트-야콥 질환, 치명적 가족성 불면증 등), 진행성 핵상 마비, 색소성 망막염(RP), 류마티스 관절염, 샌드호프병, 척수성 근위축증 (SMA, 운동 신경 질환), 아급성 경화성 범뇌염, 테이-삭스 (Tay-Sachs) 질환 및 혈관성 치매 (그 자체가 신경퇴행성은 아니지만 종종 다른 형태의 퇴행성 치매와 함께 나타남)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 암은 모든 형태의 암종, 흑색종, 모세포종, 육종, 림프종 및 백혈병을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 예를 들어 방광암, 방광 암종, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 결장직장암, 식도암, 자궁내막암, 간세포암종, 후두암, 폐암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암 및 갑상선암, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 뇌실막종, 유잉 육종, 교모세포종, 수모세포종, 신경모세포종, 골육종, 횡문근육종, 횡문양암 및 신모세포종 (윌름 종양)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 자가면역 장애는 성인 스틸 질환, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군, 자가면역 혈관부종, 자가면역성 자율신경이상증, 자가면역 뇌척수염, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환 (AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 난소염, 자가면역 고환염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막병증, 자가면역 두드러기, 축삭 및 신경 신경병증 (AMAN), 발로 질환, 베체트 (Behcet) 질환, 양성 점막 천포창병, 수포성 유사천포창, 캐슬만 질환 (CD), 셀리악 질환, 샤가스 질환, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염 (CRMO), 처그-스트라우스 증후군 (CSS) 또는 호산구성 육아종증 (EGPA), 반흔 천포창, 코간 증후군, 한냉 응집소 질환, 선천성 심장 블록, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론병, 표진성 피부염, 피부근염, 데빅 질환 (시신경척수염), 원판형 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염 (EoE), 호산구성 근막염, 결절 홍반, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐렴, 거대 세포 관절염(관자동맥염), 거대세포 심근염, 사구체신염, 굿파스쳐 (Goodpasture) 증후군, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 그레이브스 질환, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반병 (HSP), 임신성 포진 또는 천포창양 임신 (PG), 화농성한선염 (HS) (역성 여드름), 저감마글로불린혈증, IgA 신병증, IgG4 관련 경화성 질환, 면역성 혈소판 감소성 자반병 (ITP), 봉입체 근염(IBM), 간질성 방광염 (IC), 소아 관절염, 소아 당뇨병 (1형 당뇨병), 소아 근염 (JM), 가와사키 질환, 램버트-이튼 증후군, 백혈구모세포성 혈관염, 편평태선, 경화태선, 목질 결막염, 선형 IgA 질환 (LAD), 루푸스, 만성 라임병, 메니에르 질환, 현미경적 다발혈관염(MPA), 혼합 연결 조직 질환 (MCTD), 무렌 궤양, 무하-하버만 질환, 다초점 운동 신경병증 (MMN) 또는 MMNCB, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 신생아 루푸스, 시신경 척수염, 호중구감소증, 안구 반점 천포창, 시신경염, 회문형 류머티즘(PR), PANDAS, 아급성 소뇌 퇴화 (CD), 발작성 야간혈색소 요증 (PNH), 안면편측 위축증, 평면부염 (말초 포도막염), 파소니지-터너 증후군, 천포창, 말초 신경병증, 정맥 뇌척수염, 악성 빈혈 (PA), POEMS 증후군, 결절다발동맥염 증후군, 다선 증후군 유형 I, II, III, 류마티스성 다발성 근육통, 류마티스성 다발성 근육통, 다발근염, 심근후 경색 증후군, 심막절개술후증후군, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선 관절염, 순수 적혈구 무형성증 (PRCA), 괴저성 농피증, 레이노 현상, 반응성 관절염, 반사 교감신경 이영양증, 재발성 다발성 연골염, 하지불안 증후군 (RLS), 복막후 섬유증, 류마티스열, 류마티스 관절염, 사르코이도증, 슈미트 증후군, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 경직된 사람 증후군 (SPS), 아급성 세균성 심내막염 (SBE), 수삭 증후군, 교감성 안염 (SO), 타카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판 감소성 자반병(TTP), 톨로사-헌트 증후군 (Tolosa-Hunt syndrome) (THS), 횡단 척수염, 1형 당뇨병, 궤양성 대장염(UC), 미분화 연결 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증 및 보그트-고야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 심혈관 장애는 관상 동맥 질환 (CAD), 협심증, 심근경색증, 뇌졸중, 심장마비, 심부전, 고혈압성 심장 질환, 주제별 심장 질환, 심근병증, 비정상적인 심장 박동, 선천성 심장 질환, 판막 심장 질환, 심장염, 대동맥류, 말초 동맥 질환, 혈전 색전증 및 정맥 혈전증을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 응고 장애는 혈우병, 폰 빌레브란트 질환, 파종성 혈관내 응고, 간 질환, 순환 항응고제의 과발달, 비타민 K 결핍, 혈소판 기능부전 및 기타 응고 결핍을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

예시적인 눈 질환은 황반 변성, 돌출된 눈, 백내장, CMV 망막염, 당뇨병성 황반 부종, 녹내장, 원추각막, 안고혈압, 안구 편두통, 망막모세포종, 결막하 출혈, 익상편, 각막염, 안구 건조, 및 각막 찰과상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

예시적인 감염성 질환은 급성 이완성 척수염 (AFM), 아나플라즈마증, 탄저병, 바베시오증, 보툴리누스 중독, 브루셀라증, 캄필로박테리아증, 카르바페넴 내성 감염 (CRE/CRPA), 샹크로이드, 치쿤구니아 바이러스 감염 (치쿤구니야), 클라미디아, 시구아테라 (유해한 조류 브룸 (HAB)), 클로스트리디움 디피실레 감염, 클로스트리디움 퍼프린겐스 (엡실론 톡신), 콕시디오이데스 진균류 감염 (계곡열), COVID-19 (코로나바이러스 질환 2019), 크루츠펠트-전파성-야폰 (Creutzfeldt-transmissible-Jacphon) 질환, 크립토스포리디움증 (Crypto), 원포자충증, 뎅기열, 1,2,3,4 (뎅기열), 디프테리아, 이. 콜라이 감염, 시가 독소 생성 (STEC), 동부 말 뇌염 (EEE), 에볼라 출혈열 (에볼라), 에를리키아증, 뇌염, 아르보바이러스 또는 부감염성 (parainfectious), 엔테로바이러스 감염, 비-폴리오 (Non-Polio) (비-폴리오 엔테로바이러스), 엔테로바이러스 감염, D68 (EV-D68), 기아디아시스 (Giardiasis) (기아디아), 글랜더 (Glanders), 임균 감염 (Gonorrhea), 사타구니육아종, 헤모필루스 인플루엔자 질환, B형 (Hib 또는 H-flu), 한타바이러스 폐 증후군 (HPS), 용혈성 요독 증후군 (HUS), A형 간염 (A형), B형 간염 (B형), C형 간염 (C형), D형 간염 (Hep A), E형 간염 (E형 간염), 헤르페스, 대상포진, VZV 대상포진 (대상포진 (Shingles)), 히스토플라스마증 감염 (히스토플라스마증), 인간 면역결핍 바이러스/AIDS (HIV/AIDS), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인플루엔자 (독감), 납중독, 레지오넬라증 (군인병), 나병 (한센병), 렙토스피라증, 리스테리아증 (리스테리아), 라임병, 성성림프육아종 감염 (LGV), 말라리아, 홍역, 멜리오이드증, 수막염, 바이러스성 (뇌수막염, 바이러스성), 수막구균성 질환, 세균성 (수막염, 세균성), 중동호흡기증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV), 볼거리, 노로바이러스, 마비성 패류 중독(마비성 패류 중독, 시구아테라), 소아마비 (이, 머릿니), 골반 염증성 질환 (PID), 백일해 (Whooping Cough), 전염병; 림프절, 패혈성, 폐렴 (전염병), 폐렴구균성 질환 (폐렴), 소아마비 (polio), 포와산, 시타코증 (앵무새열병), 비구균 (게; 사면발이 감염), 농포성 발진 질환 (천연두, 원숭이두), 소두 -발열, 광견병, 리신중독, 리케차증 (록키산반점열), 풍진 포함 선천성 (독일홍역), 살모넬라증 위장염 (살모넬라), 옴 감염 (옴), 스콤브로이드, 패혈성 쇼크 (패혈증), 중증급성호흡기증후군 (사스 (SARS), 이질성 위장염 (시겔라), 천연두, 포도상구균 감염, 메티실린 내성 (MRSA), 포도상구균 식중독, 장독소 B 중독 (포도상구균 식중독), 포도상구균 감염, 반코마이신 중간체 (VISA), 포도상구균 감염 (VRSA), 연쇄상 구균 질환, A군 (침습성) (연쇄상 구균성 질환 (침습성)), 연쇄구균성 질환, B군 (연쇄구균-B), 연쇄상 구균 독성 쇼크 증후군, STSS, 독성 쇼크 (STSS, TSS), 매독 (원발성, 속발성, 조기 잠복성, 잠복성, 선천성), 파상풍 감염, 파상풍 (Lock Jaw), 트리코모나스증 (트리코모나스 감염), 트리코모나스 감염 (선모충증), 결핵(TB), 결핵 (잠복성) (LTBI), 야토병 (토끼) 발열), 장티푸스(D군), 장티푸스, 질염, 세균성(효모 감염), 전자담배 관련 폐 손상 (전자담배 관련 폐 손상), 수두(수두), 콜레라 비브리오 (콜레라), 비브리오증 (비브리오), 바이러스성 출혈열 (에볼라, 라사, 마르부르크), 웨스트 나일 바이러스, 황열병, 예르세니아 (예시니아), 지카 바이러스 감염 (지카)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

실시예

실시예 1 : RNA의 작제물 디자인 및 제조

스크리닝 작제물은 다양한 하나 이상의 내부 표적 RNA 모티프의 통합을 허용하도록 디자인하였다. 2개의 모티프는 상기 작제물에 존재한다: 뎅기열 바이러스의²⁷ 5'-UTR로부터 TPP 리보스위치 도메인 및 유사매듭²⁶. 구조 카세트, RNA 바코드 나선 및 2개의 시험 RNA 구조 (6개 뉴클레오타이드 링커에 의해 분리됨)를 포함하는 완전한 작제물 서열에 대한 디자인은 RNA 구조를 사용하여 평가하였다³⁹. 2개의 시험 구조가 상호 작용할 가능성을 줄이기 위해, 고유 폴딩을 유지하면서 RNA 구조에 의해 예측된 잘못 폴딩된 구조를 방지하기 위해 소수의 서열을 변경하였다 (도 7). 최종 작제물의 구조는 SHAPE-MaP에 의해 확인되었다.

RNA 바코드는 자가 함유된 헤어핀으로 폴딩되도록 디자인하였다 (도 7). RNA 바코드의 가능한 모든 순열은 전체 작제물 서열의 맥락에서 계산되고 폴딩되었으며 RNA 작제물의 또 다른 부분과 상호작용할 가능성이 있는 임의의 바코드는 세트에서 제거하였다. 바코드된 작제물은 "리간드 부재" 프로토콜을 사용하여 SHAPE-MaP에 의해 탐지되었고 바코드 나선이 목적하는 자체 포함된 헤어핀으로 폴딩되었는지를 확인하기 위해 SHAPE 반응성 제약이 있는 RNA 구조를 사용하여 폴딩되었다.

RNA의 제조

시험관 내 전사를 위한 DNA 주형 (통합 DNA 기술)은 표적 작제물 서열 (뎅기열 유사매듭 서열, 단일 가닥 링커 및 TPP 리보스위치 서열 포함) 및 플랭킹 구조 카세트를 암호화하였다²⁵: 5'-GTGGG CACTT CGGTG TCCAC ACGCG AAGGA AACCG CGTGT CAACT GTGCA ACAGC TGACA AAGAG ATTCC TAAAA CTCAG TACTC GGGGT GCCCT TCTGC GTGAA GGCTG AGAAA TACCC GTATC ACCTG ATCTG GATAA TGCCA GCGTA GGGAA GTGCT GGATC CGGTT CGCCG GATCA ATCGG GCTTC GGTCC GGTTC-3' (서열번호 1). 프라이머 결합 부위는 밑줄쳐져 있다. 독특한 RNA 바코드와 T7 프로모터 서열을 포함하는 정배향 PCR 프라이머를 사용하여 개별적 PCR 반응에서 96개 작제물 각각에 RNA 바코드를 개별적으로 부가하였다. 볼드체 바코드 뉴클레오타이드 및 밑줄쳐진 프라이머 결합 부위를 갖는 샘플 정배향 프라이머 서열은 다음과 같다: 5'- GAAAT TACGA CTCAC TATAG GTCGC GAGTA ATCGC GACCG GCGCT AGAGA TAGTG CCGTG GGCAC TTCGG TGTC -3' (서열번호 2).

DNA는 200 μM dNTP 믹스 (New England Biolabs), 500 nM 정배향 프라이머, 500 nM 역배향 프라이머, 1ng DNA 주형, 20%(v/v) Q5 반응 완충액 및 0.02U/μL Q5 핫-스타트 고충실성 폴리머라제를 사용한 PCR에 의해 증폭되어 시험관 내 전사를 위한 주형을 생성하였다. DNA를 정제하였고 (PureLink Pro 96 PCR 정제 키트; Invitrogen) 및 Tecan 무한 (Infinite) M1000 프로 마이크로플레이트 판독기 상에서 정량하였다 (Quant-iT dsDNA 고민감성 검정 키트; Invitrogen).

시험관내 전사는 96-웰 플레이트 포맷으로 수행하였고 각각의 웰은 100　μL의 총 반응 용적을 함유한다. 각각의 웰은 25 mM MgCl2, 40 mM Tris, pH 8.0, 2.5 mM 스퍼미딘, 0.01% Triton, 10 mM DTT, 및 200-800 nM의 독특하게 바코드된 DNA 주형 (PCR에 의해 생성된) 중에 5 mM NTP(New England Biolabs), 0.02U/μL 무기 피로포스파타제 (효모, New England Biolabs), 0.05 mg/mL의 T7 폴리머라제를 함유하였다. 반응물을 37℃에서 4시간 동안 항온처리하고 이어서 0.04 U/μL의 최종 농도에서 TurboDNase (RNase-free, Invitrogen)로 처리하였고; 30분 동안 37℃에서 항온처리하고 이어서 0.08 U/μL의 총 최종 농도에 두 번째 DNase를 추가하고 37℃에서 추가로 30분 항온처리한다. EDTA를 50 mM의 최종 농도로 첨가하여 효소 반응을 중단시키고 빙상 위에 놓았다. RNA를 96웰 포맷으로 정제하고 (Agencourt RNAclean XP 자기 비드; Beckman Coulter) 10 mM Tris pH 8.0, 1mM EDTA에 재현탁시켰다. Tecan 무한 M1000 Pro 마이크로플레이트 리더 상에서 RNA 농도를 정량화하고 (Quant-iT RNA 광범위 검정 키트; Invitrogen), 각 웰의 RNA를 1 pmol/μL로 개별적으로 희석하였다. RNA는 -80 ℃에서 저장하였다.

실시예 2: 소분자 단편의 화학적 변형 및 스크리닝

단편은 Ro3 다양성 단편 라이브러리의 서브세트이고 50 mM에서 DMSO에 용해된 1500개 화합물을 포함하는 Maybridge로부터 단편 스크리닝 라이브러리로서 수득하였다. 이들 화합물의 대부분은 단편 화합물에 대한 "3의 법칙"을 따르고; 분자 질량 < 300 Da를 갖고, ≤ 3의 수소 결합 공여자 및 ≤ 3의 수소 결합 수용체 및 ClogP≤3.0를 함유한다. 실시예 5에 열거된 화합물을 제외하고 ITC에 사용된 모든 화합물은 Millipore-Sigma에서 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. 스크리닝 실험은 8-채널 공기 치환 피펫팅 아암, 1회용 필터 팁, 로봇식 조작기 아암 및 EchoTherm RIC20 원격 제어 가열/냉각 건조 욕조 (Torrey Pines Scientific)가 장착된 Tecan Freedom Evo-150 액체 처리기 상에서 96웰 플레이트 포맷으로 25 μL에서 수행되었다. 스크리닝을 위해 사용되는 액체 처리기 프로그램은 요구시 가용하다.

첫 번째 단편-리간드 스크리닝의 경우, 4℃ 냉각 블록 상에서 RNase가 없는 물에서 웰당 5 pmol의 RNA를 19.6 μL로 희석하였다. 플레이트를 95℃에서 2분 동안 가열한 다음 즉시 4℃에서 5분 동안 급랭시켰다. 각각의 웰에 19.6 μL의 2× 폴딩 완충액 (최종 농도 50 mM HEPES pH 8.0, 200 mM 칼륨 아세테이트 및 10　mM MgCl₂)을 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 제2 단편 리간드 스크리닝을 위해, 웰 당 24.3 μL의 폴딩된 RNA는 DMSO 중에 2.7 μL의 1차 결합 단편에 최종 농도가 10x K _d의 단편이 되도록 첨가하였고, 샘플은 10분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 표적 RNA를 단편과 조합하기 위해, 24.3 μL의 RNA 용액 또는 RNA + 1차 결합 단편을 2.7 μL의 10x 스크리닝 단편 (1 mM의 최종 단편 농도를 산출하기 위해 DMSO 중에서)을 함유하는 웰에 첨가하였다. 용액은 피펫팅에 의해 완전히 혼합하였고 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. SHAPE 탐지를 위해, 스크리닝 플레이트의 각각의 웰로부터 22.5 μL의 RNA-단편 용액은 37℃ 가열 블록 상에서 DMSO 중에 2.5 μL의 10x SHAPE 시약에 첨가하였고 피펫팅함에 의해 신속하게 혼합함에 의해 RNA를 사용한 SHAPE 시약의 균일한 분포를 성취하였다. 적당한 반응 시간 후, 샘플을 빙상에 놓았다. 제1 단편 스크리닝을 위해, 1-메틸-7-니트로이사토산 무수물 (1M7)은 5분 동안 반응과 함께 10 mM의 최종 농도로 SHAPE 시약으로서 사용하였다. 제2 단편 스크리닝을 위해, 5-니트로이사토산 무수물 (5NIA)⁴⁰은 15분 동안 반응과 함께 25 mM의 최종 농도에서 SHAPE 시약으로서 사용하였다. AutoScreen-A 96-웰 플레이트 (GE Healthcare Life Sciences)를 사용하여 과잉 단편, 용매 및 가수분해된 SHAPE 시약을 제거하고 96-웰 플레이트의 각 웰에서 5 μL의 변형된 RNA를 라이브러리 제제를 서열분석하기 위해 플레이트당 단일 샘플로 풀링하였다.

각각의 스크리닝은 19개의 단편 시험 플레이트, 양성 (단편 2, 최종 농도 1mM) 및 음성 (용매, DMSO) 대조군의 분포를 포함하는 2개의 플레이트 및 SHAPE 시약 대신 용매 (DMSO)로 처리된 1개의 음성 SHAPE 대조군 플레이트로 이루어졌다. 히트 확증 실험의 경우, 각 히트 단편의 웰 위치는 웰 위치 및 RNA 바코드 효과를 제어하기 위해 변화시켰다. 1차 및 2차 스크리닝 둘 다에 대한 플레이트 맵도 사용할 수 있다.

시험 단편의 스크리닝이 완료되면, 소정의 뉴클레오티드의 변형률의 차이를 동정하기 위해 통계적 시험이 수행되었다. 구체적으로, 스크리닝 분석은 부재와 비교하여 단편의 존재하에 소정의 뉴클레오타이드의 변형률의 통계적 비교를 필요로 한다. 각 뉴클레오타이드에 대해 소정의 반응의 변형 수는 공지된 분산이 있는 푸아송 (Poisson) 과정이고; 따라서 2개 샘플 간의 변형률에서 관찰된 차이의 통계적 유의성은 2개 푸아송 계수 비교 시험을 수행하여 확인할 수 있다³¹. 즉, 샘플 1의 n₁ 판독 중 시험된 뉴클레오타이드의 m₁개 변형을 계수하고 샘플 2의 n₂개 판독 중 m²개 변형을 계수하는 경우, 시험된 귀무 가설은 계수된 모든 변형 (m₁ + m₂) 중에서 샘플 1에서의 변형 비율은 p₁ = n₁/(n₁ + n₂)이다. 상기 가설의 Z-시험은 다음과 같다:

Z 값이 지정된 유의성 임계값을 초과하는 경우, 시험된 뉴클레오타이드는 시험 단편의 존재에 의해 통계적으로 유의하게 영향을 받는 것으로 간주된다.

다음으로, 각 단편에 대해 RNA 서열을 포함하는 다수의 뉴클레오타이드에 대해 Z-검정을 수행해야 하고 위양성 확률을 증가시킨다. 뉴클레오타이드당 SHAPE 반응성의 위양성 할당 수는 Z 유의성 임계값을 높여 최소화할 수 있지만, 상기 접근법은 스크리닝의 감도를 감소시킨다 (이는 보다 약한 결합 리간드를 검출하는 능력을 감소시킴을 의미한다). 수행된 Z-시험의 수를 줄이기 위해, 이러한 시험은 RNA 스크리닝 작제물에서 모든 뉴클레오타이드가 아니라 관심 대상의 뉴클레오타이드에만 적용되었다. RNA의 뎅기열 모티프의 경우, 관심 대상의 영역은 59-110번 위치였고; TPP 모티브의 경우, 관심 대상 영역은 100-199번 위치였다. 샘플 둘 다에서 변형률이 낮은 뉴클레오타이드를 제거하여 Z-시험의 수를 추가로 감소시켰다. 낮은 변형률을 갖는 뉴클레오타이드를 고려하기 위한 임계값은 플레이트 평균 변형률의 25%로 설정되었으며, 이는 소정의 플레이트의 모든 96개 웰에 있는 모든 뉴클레오타이드에 대해 계산되었다. 2개의 비교된 샘플 중 적어도 하나에서 변형률이 상기 25% 임계값을 초과하도록 하는 뉴클레오타이드에 대해서만 Z-시험을 수행하였다.

이상적으로, 2개의 비교 샘플에서 조건 간의 유일한 차이점은 하나의 샘플에는 단편이 존재하지만 다른 샘플에는 존재하지 않는다는 것이다. 서로에 대해 음성 대조군 샘플의 시험을 사용하여 뉴클레오타이드 변형률의 샘플 중에 변동성을 도입할 수 있는 제어되지 않는 요인의 유병률을 측정할 수 있다. 예를 들어, Z 유의성 임계값이 2.7로 설정된 경우, 임의의 상기 인자의 부재하에, 음성 대조군 (단편 없음) 샘플 쌍에 적용된 Z-시험은 이론적으로 확률 P = 0.0035로 차등 반응성 뉴클레오타이드를 동정해야 한다. 그러나, 1차 스크리닝에서 시험된 587개의 음성대조군 샘플로부터 무작위로 선택된 음성대조군 샘플 쌍에 Z-시험을 적용했을 때 실제 확률은 P=0.32로 90배 높았다. 따라서, 단편이 없는 개별 뉴클레오타이드에서 SHAPE 반응성에 통계적으로 유의한 변동성이 있다.

대부분의 레플리케이트는 본질적으로 동일한 프로필을 공유했지만, 프로필이 서로 다른 상당수의 레플리케이트가 있고; 일부 결정 계수는 0.85만큼 낮았다. 상이한 음성 대조군 샘플에 Z-시험의 적용은 많은 경우 생성된 뉴클레오타이드가 차등 반응성으로 잘못 분류되었다. 이 결과를 피하기 위해 각 샘플을 가장 상관관계가 높은 5개의 음성 대조군 샘플과 비교하였다. 2.7의 Z 유의성 임계값을 갖는 음성 대조군의 이러한 선택적 쌍에 적용된 Z-시험은 확률 P = 0.067로 차등 반응성 뉴클레오타이드의 동정을 초래하였다.

상기 확률은 이론적인 P = 0.0035보다 약 20배 높으며 이는 샘플 처리에 변동성이 있음을 나타낸다. 이러한 변동성 중 일부는 샘플에 있는 모든 RNA의 모든 뉴클레오타이드의 반응성에 걸쳐 균등하게 확장된다. 상기 변동성은 덜 반응성인 샘플의 전체 반응성과 일치하도록 반응성이 더 큰 샘플의 전체 반응성을 축소함으로써 제거할 수 있다. 상기 스케일링은 (i) RNA 서열에서 각 뉴클레오타이드에 대해 반응성이 더 큰 샘플의 변형률 대 덜 반응성인 샘플에서의 변형률의 비율을 계산하고 (ii) 반응성이 더 큰 샘플에서 모든 뉴클레오타이드의 변형률을 단계 (i)에서 수득된 비율의 메디안으로 나눔으로써 수행되었다. 음성 대조군 웰의 상관관계가 최대화된 쌍의 상기 스케일링은 뉴클레오티드 히트를 발견할 확률을 이론적인 확률보다 9-배 높은 P = 0.030으로 감소하였다. 따라서 모든 고속처리 스크리닝 검정에서 실제로 수행되는 것처럼 단편의 위양성 동정이 수행되고 비-리간드 변이로부터의 실제 단편 히트는 레플리케이트 SHAPE 확증에 의해 및 ITC를 사용한 직접적인 리간드 결합 측정에 의해 구별되었다.

효과적인 리간드는 표적 RNA에서 다중 뉴클레오타이드의 변형률에 영향을 미칠 것으로 예상되기 때문에, 반응성 대조군과 상이한 반응성을 갖는 뉴클레오타이드의 수가 정의된 2로 설정된 임계값을 초과하는 경우에만 단편을 히트로 인지하였다. 둘째, RNA에 대한 단편의 상대적으로 강력한 효과를 찾을 때 뉴클레오타이드의 반응성에서 작은 상대적 차이는 통계적으로 유의적인 것이라도 차등 반응성 뉴클레오타이드의 총 수에서 제외되었다. 실제로 허용되는 최소 차이는 평균의 20%로 설정되었다.

여기서, r ₁ 및 r ₂는 2개의 샘플에서 뉴클레오타이드 변형률이다. 셋째, 소정의 샘플은 가장 높은 상관관계를 보이는 5개의 음성 대조군 샘플에 대해 시험하였다. 음성 대조군 샘플과 비교하여 변경된 시험 샘플을 모색하기 위해 5가지 시험 모두가 요구되었다.

마지막으로, 스크리닝의 민감성과 특이성은 Z 유의성 임계값의 선택에 의해 제어되었다. 단편 및 모든 음성 대조군 샘플을 함유하는 샘플의 평가는 다중 Z 유의성 임계값 설정에서 수행되었다. 이러한 각각의 세팅에 대해 위양성 분획 (FPF)은 변경된 것으로 확인된 음성 대조군 샘플의 분획으로 계산되었고, 리간드 분획(LF)은 단편을 함유하는 변경된 샘플의 분획으로부터 FPF를 공제함에 의해 평가되었다. LF와 FPF 사이의 균형은 LF/FPF 비율로 정량화하였다. TPP 리보스위치 RNA에 대한 최상의 균형 (1.3)은 0.022 > FPF > 0.014인 2.5와 2.7 사이의 범위에서 Z 유의성 임계값으로 달성되었다. 뎅기열 유사매듭에 대해, 최상의 균형 (LF/FPF

4)은 0.007 > FPF > 0.005인 2.5와 2.65 사이의 범위에서 Z 유의성 임계값으로 달성되었다.

실시예 3: 라이브러리 제조 및 서열분석

역전사는 100 μL 용적의 풀링된 변형된 RNA에 대해 수행되었다. 풀링된 RNA 71 μL에 6 μL의 역전사 프라이머를 첨가하여 최종 농도가 150 nM 프라이머가 되도록 하고, 샘플을 65℃에서 5분 동안 항온처리한 다음 빙상에 두었다. 상기 용액에 6 μL의 10x 첫 번째 가닥 완충액 (500 mM Tris pH 8.0, 750 mM KCl), 4 μL 0.4M DTT, 8 μL dNTP 믹스 (각각 10 mM) 및 15 μL 500 mM MnCl₂를 첨가하고 8 μL SuperScript II 역전사효소 (Invitrogen)를 추가하기 전에 용액을 42℃에서 2분 동안 항온처리하였다. 반응물을 42℃에서 3시간 동안 항온처리한 다음, 빙상에 놓기 전에 10분 동안 70℃ 열 불활성화를 수행하였다. 생성된 cDNA 생성물을 정제하고 (Agencourt RNAClean 자기 비드; Beckman Coulter), RNase가 없는 물에 용리시키고 -20℃에서 저장하였다. 역전사 프라이머의 서열은 5'-CGGGC TTCGG TCCGG TTC-3' (서열번호 3)였다.

DNA를 증폭하고 필요한 TruSeq 어댑터를 첨가하기 위해 2단계 PCR 반응을 사용하여 서열분석을 위해 DNA 라이브러리를 제조하였다²⁴. DNA는 200 μM dNTP 믹스 (New England Biolabs), 500 nM 정배향 프라이머, 500 nM 역배향 프라이머, 1ng DNA 또는 이중 가닥 DNA 주형, 20% (v/v) Q5 반응 완충액 및 0.02U/μL Q5 핫-스타트 고충실성 폴리머라제를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 과량의 통합되지 않은 dNTP 및 프라이머는 친화성 정제 (Agencourt AmpureXP 자기 비드, Beckman Coulter, 0.7:1 샘플 대 비드 비율)에 의해 제거하였다. DNA 라이브러리를 Qubit 형광계 (Invitrogen)에서 정량화하고 (Qubit dsDNA 고감도 검정 키트; Invitrogen), 품질을 확인하고 (Bioanalyzer 2100 온칩 전기영동 기기, Agilent), Illumina NextSeq 550 고속처리 서열분석기에서 서열분석하였다.

SHAPE-MaP 라이브러리 제조 앰플리콘-특이적 정배향 프라이머는 5'CCCTA CACGA CGCTC TTCCG ATCTN NNNNG GCCTT CGGGC CAAGG A-3' (서열번호 4)이었다. SHAPE-MaP 라이브러리 제조 앰플리콘-특이적 역배향 프라이머는 5'GACTG GAGTT CAGAC GTGTG CTCTT CCGAT CTNNN NNTTG AACCG GACCG AAGCC CGATT T-3' (서열번호 5)이었다. RNA 스크리닝 작제물과 중첩되는 서열은 밑줄친다.

실시예 4: 등온 적정 열량계

ITC 실험은 RNase가 없는 조건하에서 Microcal PEAQ-ITC 자동화 기기 (Malvern Analytical)를 사용하여 수행되었다⁴¹. 시험관 내 전사된 RNA는 원심분리 농축 (Amicon Ultra 원심 필터, 10K MWCO, Millipore-Sigma)을 사용하여 100 mM CHES, pH 8.0, 200 mM 칼륨 아세테이트 및 3 mM MgC_l2를 포함하는 폴딩 완충액으로 교환되었다. 리간드를 목적하는 실험 농도의 RNA의 10-20배 농도에서 동일한 완충액(RNA에 리간드를 첨가할 때 혼합 열을 최소화하기 위해)에 용해시켰다. RNA 농도를 정량화하고 (Nanodrop UV-VIS 분광계; ThermoFisher Scientific) 완충액에서 예상 K_d의 1-10배로 희석하고, 희석된 RNA를 재정량하여 최종 실험 RNA 농도를 확인하였다. 폴딩 완충액에 희석된 RNA를 65℃에서 5분 동안 가열하고, 빙상에 5분 동안 놓고, 37℃에서 15분 동안 폴딩되도록 하였다. 필요한 경우, 1차 결합 리간드(예를 들어, 2)는 결합된 리간드의 목적하는 최종 농도의 10배에 0.1 용적을 첨가하여 RNA에 미리 결합시키고 이어서 실온에서 10분 동안 항온처리하였다.

각각의 ITC 실험은 2개의 수행을 포함하였다: 리간드가 RNA로 적정된 것 (실험 추적)과 동일한 리간드가 완충액으로 적정된 것 (대조군 추적). ITC 실험은 하기의 파라미터를 사용하여 수행하였다: 25℃ 셀 온도에서, 8 μCal/sec 참조 전력, 750 RPM 교반 속도, 높은 피드백 모드, 0.2 μL 초기 주입에 이어서 2 μL 19회 주사. 각 주입은 완료하는 데 4초가 필요했으며 주사 사이에는 180초의 간격이 있다.

ITC 데이터는 MicroCal PEAQ-ITC 분석 소프트웨어(Malvern Analytical)를 사용하여 분석되었다. 첫째, 부정확하게 선택된 주사 종점을 해결하기 위해 각 주사 피크에 대한 기준선을 수동으로 조정하였다. 둘째, 점대점 (point-to-point) 공제에 의해 실험 추적으로부터 대조군 추적을 공제하였다. 셋째, Levenberg-Marquardt 알고리즘을 사용하여 최소 제곱 회귀선을 데이터에 피팅하였다. 약하게 결합하는 리간드 (>500 μM)의 경우에 낮은 c-값 곡선의 피팅을 가능하게 하기 위해 N을 수동으로 1.0으로 설정하였다.

실시예 5: 시험 화합물 35, 36, 37, 38, 39 및 40의 화학적 합성.

화합물 35: 3-C 연결된 하이드록삼산 35는 수성 하이드록실아민과 반응시켜 혼합 무수물 중간체를 통해 카복실산 S19로부터 제조하였다. 퀴녹살린-6-아민을 폐환된 무수물 디하이드로푸란-2,5-디온으로 처리하여 산 S19에 접근하였다.

화합물 36: 2-C 연결된 유사체 36은 원위치에서 형성된 하이드록실아민과 반응시켜 상응하는 에스테르 S20으로부터 수득하였다. 에스테르 S20은 에틸 아크릴레이트와 함께 퀴녹살린-6-아민의 마이클 (Michael) 첨가를 통해 제조하였다.

화합물 37: 부흐발트-하트위그 (Buchwald-Hartwig) 반응은 중간체 S21 및 S22의 합성을 위해 사용하였다. 보호 그룹 (Boc) 제거는 에테르 중에 HCl를 사용하여 성취하고 이어서 Na₂CO₃로 추가 처리하여 37을 수득하였다.

화합물 38: 이민 형성, 및 퀴녹살린-6-카브알데하이드 및 디아민의 후속 수소화붕소나트륨 환원으로 38을 생성한다.

화합물 39: 이민 형성, 및 S_NAr 반응을 통해 제조된 퀴녹살린-6-일메탄아민 하이드로클로라이드 및 알데하이드 S23을 사용한 후속 수소화붕소나트륨 환원으로 중간체 24를 수득하고, 이후 HCl로 (Boc) 탈보호하여 39를 수득하였다.

화합물 40: 덜 속박된 유사체 40은 3,5-디브로모피리딘을 사용한 두 번의 부흐발트-하트위그로 반응시키고 이어서 HCl로 (Boc) 탈보호하여 제조하였다.

실시예 6: X-선 결정학

2의 구조적 변이체가 TPP 리보스위치에 대한 우수한 결합 후보인지의 여부를 평가하기 위해, X선 결정학 연구에서 화합물 17을 조사하였다. TPP 리보스위치 RNA는 기재된 바와 같이 시험관내 전사에 의해 제조하였다²⁷. TPP 리보스위치 RNA (0.2 mM) 및 17 (2 mM)을 50 mM 칼륨 아세테이트 (pH 6.8) 및 5 mM MgCl₂를 함유하는 완충액에서 60℃에서 3분 동안 가열하고, 분쇄된 얼음에서 급속 냉각시키고, 결정화 전에 4℃서 30분 동안 항온처리하였다. 결정화를 위해, 1.0 μL의 RNA-17 복합체를 0.1 M 나트륨 아세테이트 (pH 4.8), 0.35 M 암모늄 아세테이트 및 28%　(v/v) PEG4000을 함유하는 1.0 μL의 저장소 용액과 혼합하였다. 2주에 걸쳐 적가 증기 확산에 적용하여 291K에서 결정화를 수행하였다. 결정은 액체 질소에서 급속 동결 전에 15%의 글리세롤이 보충된 모액에서 동결 보호하였다. 데이터는 0.9202Å 파장에서 NSLS-II (Brookhaven National Laboratory)의 17-ID-2 (FMX) 빔라인에서 수집되었다. 데이터는 HKL200043으로 가공하였다. Phenix44 및 2GDI 리보스위치 RNA 구조를 사용하여 분자 대체로 구조를 밝혔다²⁷. 구조는 Phenix에서 개량하였다. 유기 리간드, 물 분자 및 이온은 Fo-Fc 및 2Fo-Fc 전자 밀도 맵을 기준으로 후기 개량 단계에서 첨가하였다.

결과는 화합물 17이 J3/2 접합부에서 G42와 A43 사이에 스택킹하는 TPP 리간드의 티아민 모이어티와 유사한 방식으로 TPP 리보스위치에 결합함을 보여주었다 (도 3)^27,28. 17은 RNA와 3개의 수소 결합을 형성한다: G40의 리보스 및 왓슨-크릭 면에 결합된 하나 및 G19의 리보스에 결합된 하나. 고유 TPP 리간드와의 복합체 중에 RNA에 비해, 국소 RNA 구조에 상당한 변화가 있다. 17-결합된 구조에서, G72는 TPP 리간드의 피로포스페이트 모이어티가 있는 결합 부위에 플립핑된다. 이 결합 모드는 리보스위치 결합 포켓의 티아민 서브 부위에 결합된 단편에 대해 플립핑된 G72 배향을 가시화한 이전 작업과 일치한다^17,34. SAR 분석과 일치하게, C-6 치환체의 배향은 RNA와의 상호작용에 의해 상대적으로 방해받지 않는 것으로 보이며, 이는 이 벡터가 단편 정교화를 위한 좋은 후보가 될 것임을 암시한다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> University of North Carolina at Chapel Hill Weeks, Kevin Aube, Jeff <120> RNA-TARGETING LIGANDS, COMPOSITIONS THEREOF, AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> 393976-00002 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> structure cassette flanking target sequence <400> 1 gtgggcactt cggtgtccac acgcgaagga aaccgcgtgt caactgtgca acagctgaca 60 aagagattcc taaaactcag tactcggggt gcccttctgc gtgaaggctg agaaataccc 120 gtatcacctg atctggataa tgccagcgta gggaagtgct ggatccggtt cgccggatca 180 atcgggcttc ggtccggttc 200 <210> 2 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward prime sequence <400> 2 gaaattacga ctcactatag gtcgcgagta atcgcgaccg gcgctagaga tagtgccgtg 60 ggcacttcgg tgtc 74 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse transcription primer <400> 3 cgggcttcgg tccggttc 18 <210> 4 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplicon-specific forward primer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> n is a, c, g, t or u <400> 4 ccctacacga cgctcttccg atctnnnnng gccttcgggc caagga 46 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amplicon-specific reverse primer <220> <221> misc_feature <222> (33)..(37) <223> n is a, c, g, t or u <400> 5 gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnttg aaccggaccg aagcccgatt 60 t 61 <210> 6 <211> 238 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 6 ggucgcgagu aaucgcgacc gcugcaagag auuguagcgu gggcacuucg guguccacac 60 gcgaaggaaa ccgcguguca acugugcaac agcugacaaa gagauuccua aaacucagua 120 cucggggugc ccuucugcgu gaaggcugag aaauacccgu aucaccugau cuggauaaug 180 ccagcguagg gaagugcugg auccgguucg ccggaucaau cgggcuucgg uccgguuc 238 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> portion of structure cassette <400> 7 ggucgcgagu aaucgcgacc 20 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA barcode <400> 8 gcugcaagag auuguagc 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> structure cassette <400> 9 gugggcacuu cgguguccac 20 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DENV pseudoknot <400> 10 acgcgaagga aaccgcgugu caacugugca acagcugaca aagagauucc u 51 <210> 11 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TPP riboswitch <400> 11 caguacucgg ggugcccuuc ugcgugaagg cugagaaaua cccguaucac cugaucugga 60 uaaugccagc guagggaagu gcug 84 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> structure cassette <400> 12 gauccgguuc gccggaucaa ucgggcuucg guccgguuc 39

Claims (36)

1. 화학식 I의 구조를 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
   화학식 I
   

   

   
   상기 식에서,
   X₁, X₂, 및 X₃은 각각의 경우에 CR₁, CHR₁, N, NH, O 및 S로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, 인접한 X₁, X₂, 및 X₃은 O 또는 S인 것으로 동시에 선택되지 않고;
   파선은 임의의 이중 결합을 나타내고;
   Y₁, Y₂, 및 Y₃은 각각의 경우에 CR₂ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
   n은 1 또는 2이고, 여기서, n이 1인 경우, 파선 중 단지 하나가 이중 결합이고;
   L은
   

   

   ,

   

   ,

   

   , 및

   

   로부터 선택되고,
   여기서, p, q, r, 및 v는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 정수로부터 독립적으로 선택되고, z는 1, 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되고;
   A는

   

   ,

   

   , 및

   

   로부터 선택되고,
   여기서, X₄, X₅, X₆, 및 X₇은 CR₃ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
   여기서, R₁, R₂, 및 R₃은 -H, -Cl, -Br, -I, -F, -CF₃, -OH, -CN, -NO₂, -NH₂, -NH(C₁-C₆ 알킬), -N(C₁-C₆ 알킬)₂, -COOH, -COO(C₁-C₆ 알킬), -CO(C₁-C₆ 알킬), -O(C₁-C₆ 알킬), -OCO(C₁-C₆ 알킬), -NCO(C₁-C₆ 알킬), -CONH(C₁-C₆ 알킬), 및 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬로부터 독립적으로 선택되고;
   m은 1 또는 2이고;
   W는 -O 또는 -NR₄이고, 여기서, R₄는 -H, -CO(C₁-C₆ 알킬), 치환되거나 비치환된 C₁-C₆ 알킬, 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 치환되거나 비치환된 사이클로알킬, -CO(아릴), -CO(헤테로아릴), 및 -CO(사이클로알킬)로부터 선택되고;
   단, X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, 및 X₇ 중 적어도 2개는 N이다.
2. 청구항 1에 있어서, X₁, X₂, 또는 X₃ 중 적어도 하나가 N인, 화합물.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, n이 2인, 화합물.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 경우에 X₁, X₂, 및 X₃ 중 2개가 N인, 화합물.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 구조를 갖는 화합물:
   화학식 II
   

   

   
   상기 식에서,
   X_2a 및 X_2b는 CR₁ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
   X₁ 및 X₃은 CR₁ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
   L 및 A는 화학식 I에 대해 제공된 바와 같고;
   X₁, X_2a, X_2b, 및 X₃ 중 2개는 N이다.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 III의 구조를 갖는 화합물:
   화학식 III
   

   

   
   상기 식에서,
   L 및 A는 화학식 I에 대해 제공된 바와 같다.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, p, q, r, 및 v가 0, 1, 2, 및 3의 정수로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, L이
   

   

   및

   

   로부터 선택되는, 화합물.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, L이
   

   

   인, 화합물.
10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, q 및 r이 0 또는 1인, 화합물.
11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, q 및 r이 1인, 화합물.
12. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, q가 1이고, r이 0인, 화합물.
13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, m이 1인, 화합물.
14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, W가 -NH, -O, 및 -N(C₁-C₆ 알킬)₂로부터 선택되는, 화합물.
15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, W가 -NH인, 화합물.
16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X₄, X₅, X₆ 및 X₇ 중 적어도 하나가 N인, 화합물.
17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, X₅ 또는 X₆이 N이고, X₄ 및 X₇ 둘 다가 독립적으로 CR₂인, 화합물.
18. 청구항 1 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, A가
    

    

    인, 화합물.
19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, Y₁, Y₂, 및 Y₃가 각각의 경우에 CR₂ 및 N으로부터 독립적으로 선택되고, 여기서, R₁이 -H, -Cl, -Br, -I, -F, -OH, 및 -NH₂로부터 선택되는, 화합물.
20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, Y₂가 N인, 화합물.
21. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, Y₂가 CR₂이고, R₁이 -H, -F, -OH, 및 -NH₂로부터 선택되는, 화합물.
22. 청구항 1항에 있어서, 상기 화합물이 하기의 구조를 갖는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    

    

    ,

    

    , 또는

    

    .
23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 RNA 분자의 영역에 결합하는, 화합물.
24. 청구항 23에 있어서, 상기 RNA 분자가 비-암호화 RNA 분자인, 화합물.
25. 청구항 24에 있어서, 상기 비-암호화 RNA 분자가 rRNA, microRNA, siRNA, piRNA, snoRNA, snRNA, exRNA 및 scaRNA로부터 선택되는, 화합물.
26. 청구항 23에 있어서, 상기 RNA 분자가 암호화 RNA 분자인, 화합물.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 암호화 RNA 분자가 mRNA인, 화합물.
28. 청구항 23에 있어서, 상기 mRNA의 영역이 리보스위치인, 화합물.
29. 청구항 28에 있어서, 상기 리보스위치가 TPP 리보스위치인, 화합물.
30. 청구항 23 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물이 약 50 nM 내지 약 100 μM의 K_d 결합 친화성을 나타내는, 화합물.
31. 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제 중에 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항의 치료학적 유효량의 화합물을 포함하는, 조성물.
32. RNA 발현에서 기능부전과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항의 치료학적 유효량의 화합물 또는 청구항 31의 조성물의 용량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
33. 청구항 32에 있어서, 상기 화합물 또는 조성물의 투여가 화합물의 RNA (예를 들어, mRNA)로의 결합으로 인해 단백질 발현을 저하시키는, 방법.
34. 청구항 32 또는 33에 있어서, 상기 질환 및 장애가 유전학적 질환, 퇴행성 장애, 암, 당뇨병, 자가면역 장애, 심혈관 장애, 응고 장애, 눈의 질환, 감염성 질환 및 하나 이상의 유전자 내 돌연변이에 의해 유발된 질환으로부터 선택되는, 방법.
35. 청구항 34에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 유전학적 질환이고, 상기 화합물 또는 조성물의 투여가 치료학 유전자의 발현을 가동 또는 중단되도록 전환하는, 방법.
36. 청구항 1 내지 30 중 어느 한 항의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 화학식 IV의 단편을 Pd-촉매의 존재하에 화학식 V-1 또는 V-2의 단편과 접촉시키는 단계; 또는
    b) 화학식 IV의 단편을 환원제의 존재하에 화학식 VI-1 또는 Vi-2의 단편과 접촉시키는 단계; 또는
    c) 화학식 IV의 단편을 염기의 존재하에 화학식 VII-1 또는 VII-2의 단편과 접촉시키는 단계
    를 포함하는, 방법.

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