CN114901654A - Rna靶向配体、其组合物以及其制备和使用方法 - Google Patents

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J·奥贝
K·李
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Abstract

本公开涉及与如TPP核糖开关等靶RNA分子结合的化合物、包括所述化合物的组合物以及其制备和使用方法。与仅结合到单个RNA结合位点的化合物相比，所述化合物含有两个在结构上不同的片段，所述两个在结构上不同的片段允许在两个不同的结合位点处与靶RNA结合，从而产生更高亲和力的5结合配体。

Description

RNA靶向配体、其组合物以及其制备和使用方法
技术领域
本公开涉及与如TPP核糖开关等靶RNA分子结合的化合物、包括所述化合物的组合物以及其制备和使用方法。与仅结合到单个RNA结合位点的化合物相比，所述化合物含有两个在结构上不同的片段，所述两个在结构上不同的片段允许在两个不同的结合位点处与靶RNA结合，从而产生更高亲和力的结合配体。
通过引用并入序列表
所附序列表中的材料特此通过引用以其整体并入到本申请中。命名为序列表39397600002_ST25的随附文件创建于2020年8月5日并且为4KB。
政府支持
本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的授权号GM098662和AI068462在政府支持下进行的。政府在本发明中享有某些权利。
背景技术
绝大多数小分子配体主要是为了通过靶向蛋白质来操纵生物系统而开发的。蛋白质具有非常复杂的三维结构，为了正常起作用，所述非常复杂的三维结构对于蛋白质来说至关重要并且包含小分子配体能够结合到的裂缝和凹口1，2。转录组-生物体中产生的所有RNA分子的集合-还包含用于研究和操纵生物系统的有希望的靶标。例如，RNA转录组不仅在哺乳动物系统中起着重要作用，而且还存在于细菌和病毒两者中并且因此代表小分子调节基因表达的靶标。
值得注意的是，RNA可以采用复杂性与蛋白质的复杂性相当的三维结构3，这是开发高选择性配体所需的关键特征4，并且RNA在管控生物系统的行为方面发挥普遍的作用5。最初仅被视为仅为了传输用于蛋白质编码和指导蛋白质生物合成过程的消息而存在的遗传信息载体，RNA的现代观点已经演变到涵盖扩展的作用，其中现在已经知道各种RNA分子通过各种机制在调节基因表达和其它生物过程中具有广泛而深远的作用。甚至大量新发现的非编码RNA已经被发现与如癌症等疾病和无致癌性疾病相关。因此，RNA除了编码致病蛋白外，还促成疾病状态的认识提供了大量以前未认识到的治疗靶标。
然而，尽管已经证明小分子配体可以与mRNA结合并且具有上调或下调翻译效率，从而调节细胞中的蛋白质表达的潜力6，7，但在鉴定小分子RNA配体中仍然涉及在靶向蛋白质时未面临的挑战4，11，12。这还包含开发针对非编码RNA的小分子，所述非编码RNA还表示丰富的靶标8-10。不幸的是，尽管开发了用于分析RNA结构的各种技术并发现了新功能，但是高效并且快速地鉴定或设计与RNA结合并扰动RNA功能的抑制剂的能力仍然远远落后。因此，在本领域中有很大的需要开发允许快速并且高效地鉴定靶向RNA分子的小分子配体的新方法和技术。
发明内容
如已经在上文提及的，转录组表示用于小分子配体的一组有吸引力但未充分利用的靶标。靶向信使RNA和非编码RNA的小分子配体(和最终药物)具有调节细胞状态和疾病的潜力。在当前公开中，使用通过引物延伸分析的选择性2′-羟基酰化(SHAPE)和SHAPE-突变谱(MaP)RNA结构探测的基于片段的筛选策略用于发现结合靶RNA结构的小分子片段。具体地，鉴定了以毫摩尔到微摩尔亲和力与TPP核糖开关结合的片段和协同结合的片段对。进行构效关系(SAR)研究以获得信息来高效地设计以高纳摩尔亲和力与TPP核糖开关结合的连接片段配体。根据当前公开的原则不意味着限制于TPP核糖开关，而是还可以广泛适用于其它靶RNA结构，从而利用协同性和多位点结合来针对各种RNA靶标开发高质量的配体。
如此，当前公开的主题的一个方面是具有式(I)结构的化合物：
Figure BDA0003580034520000021
其中
X1、X2和X3在每个实例中独立地选自CR1、CHR1、N、NH、O和S，其中相邻X1、X2和X3不同时选为O或S；
虚线表示任选的双键；
Y1、Y2和Y3在每个实例中独立地选自CR2和N；
n为1或2，其中当n为1时，所述虚线中仅一条虚线是双键；
L选自
Figure BDA0003580034520000031
其中p、q、r和v独立地选自整数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且z选自整数1、2、3、4和5；并且
A选自
Figure BDA0003580034520000032
其中X4、X5、X6和X7独立地选自CR3和N；
其中R1、R2和R3独立地选自-H、-Cl、-Br、-I、-F、-CF3、-OH、-CN、-NO2、-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)2、-COOH、-COO(C1-C6烷基)、-CO(C1-C6烷基)、-O(C1-C6烷基)、-OCO(C1-C6烷基)、-NCO(C1-C6烷基)、-CONH(C1-C6烷基)以及经取代或未经取代的C1-C6烷基；
m为1或2；并且
W是-O或-NR4，其中R4选自选自-H、-CO(C1-C6烷基)、经取代或未经取代的C1-C6烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的环烷基、-CO(芳基)、-CO(杂芳基)以及-CO(环烷基)；
条件是X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的至少两个是N；
或其药学上可接受的盐。
当前公开的主题的另外一个方面包括如本文所述的与RNA分子的区域结合的化合物。
当前公开的主题的另外一个方面包括一种组合物，其包括在药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的治疗有效量的本文所述的化合物。
当前公开的主题的另外一个方面包括一种治疗与RNA表达的功能障碍相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的剂量的本文所述的化合物的组合物。
当前公开的主题的另外一个方面包括用于制备本文所述的化合物的方法。
当前公开的主题的仍另外一个方面将在以下呈现。
附图说明
图1示出了用于RNA筛选构建体和片段筛选工作流程的方案。示出了RNA基序1和2；条形码螺旋；以及结构盒螺旋。在存在或不存在小分子片段的情况下使用SHAPE探测RNA并且通过复用MaP测序读出对应于配体依赖性结构信息的化学修饰。
图2示出了片段命中和未命中的代表性突变率比较。将片段暴露的样品的归一化突变率标记为+配体、+2或+4并且与标记为无配体的无配体迹线进行比较。统计学上显著的突变率变化用三角形标示(对于SHAPE确认数据，请参见图8)。(顶部)未结合测试构建体的代表性片段的突变率比较。(中部)片段对RNA的TPP核糖开关区域的命中。(底部)在整个测试构建体中诱导反应性变化的非特异性命中。在SHAPE谱之下示出了基序1和2标志。
图3A和3B示出了由(图3A)片段17对(图3B)天然TPP配体(2HOJ28)结合的TPP核糖开关的结构的比较。RNA结构在每个图像中以类似的朝向示出。配体与RNA之间的氢键以虚线的形式示出。
图4A和4B示出了片段2和31的热力循环和逐步式配体结合亲和力。图4A示出了由化合物2(深灰色，K1)和化合物31(淡灰色，K2)片段进行的结合的概要。KD值通过ITC确定。图4B示出了显示由片段2和31进行的单化合物结合和协同结合的ITC数据。连接所述两个片段表现出结合能的相加作用，这产生了亚微摩尔配体化合物37(KL)。示出了ITC迹线，其中背景迹线(滴定到缓冲液中的配体)以淡灰色示出，实验迹线以深灰色示出。曲线拟合与95％置信区间以灰色阴影示出。
图5示出了片段17和31的共价连接随接头类型和长度、端基化学型和端基朝向的变化。增加RNA结合亲和力的修饰呈现于化合物36和37(淡灰色)中；负面修饰呈现于化合物35、39和40(淡灰色)中，并且中性修饰呈现于化合物38(淡灰色)中。解离常数通过ITC确定。
图6示出了通过基于片段的方法开发的片段-接头-片段配体的比较，所述配体根据其连接系数(E)排序。值示出于对数轴上。协同连接对应于较低的E值(竖轴的顶部)。片段37表现出2.5的E值和0.34的LE值。单独的片段(左，中)和连接的配体(右)的解离常数标示在组分片段之下；示出了E值(顶部)和配体效率(底部)。片段之间引入的共价连接以淡灰色突出显示。组分片段的结构详见于表7。
图7A和7B示出了筛选构建体设计。图7A示出了具有以下组分的RNA序列(SEQ IDNO：6)：GGUCGCGAGUAAUCGCGACC(SEQ ID NO：7)是结构盒；GCUGCAAGAGAUUGUAGC(SEQ ID NO：8)是RNA条形码(条形码NT加下划线)；GUGGGCACUUCGGUGUCCAC(SEQ ID NO：9)是结构盒；
Figure BDA0003580034520000051
(SEQ IDNO：10)是DENV假结(突变粗体)；AAAACU是接头；
Figure BDA0003580034520000052
Figure BDA0003580034520000053
(SEQ ID NO：11)是TPP核糖开关(突变粗体)；并且GAUCCGGUUCGCCGGAUCAAUCGGGCUUCGGUCCGGUUC(SEQ ID NO：12)是结构盒。图7B示出了RNA序列条形码在其自折叠发夹结构的背景下的二级结构。
图8示出了未命中、命中和非特异性命中片段的SHAPE谱。对应于片段暴露的突变率迹线和无配体对照迹线分别呈纯灰色阴影和黑色轮廓。在片段样品对无片段样品中被确定为在统计学上显著不同的核苷酸以三角形标示。相同片段的突变率迹线在图2中示意性示出。
具体实施方式
现在将在下文中更全面地描述当前公开的主题。然而，受益于前述描述中呈现的教导，当前公开的主题所涉及的领域的技术人员将想到本文所阐述的当前公开的主题的许多修改和其它实施例。因此，应当理解当前公开的主题不限于所公开的具体实施例，并且修改和其它实施例旨在被包含在所附权利要求的范围内。换句话说，本文描述的主题涵盖所有替代、修改和等同形式。如果所结合的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包含但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体并入。
定义
如本文所使用的，术语“烷基”是指含有1到8个、1到6个、1到4个或5到8个碳的饱和烃基。在一些实施例中，所述饱和基团含有超过8个碳。烷基在结构上类似于通过从非环烷烃去除一个氢并用非氢基团或自由基对其替代来修饰的非环烷烃化合物。烷基自由基可以是支链或无支链的。低级烷基自由基具有1到4个碳原子。高级烷基自由基具有5到8个碳原子。烷基自由基、低级烷基自由基和高级烷基自由基的实例包含但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、叔戊基、正戊基、正己基、异辛基等自由基。
如本文所使用的，符号“(CO)”和“C(O)”用于指示羰基部分。合适的羰基部分的实例包含但不限于酮和醛部分。
术语“环烷基”是指具有3-8个成员或3-7个成员或3-6个成员或3-5个成员或3-4个成员的烃并且可以是单环或二环的。所述环可以是饱和的或者可以具有一定的不饱和度。环烷基可以任选地被一个或多个取代基取代。在一个实施例中，环烷基的每个环的0、1、2、3或4个原子可以被取代基取代。环烷基的代表性实例包含环丙基、环戊基、环己基、环丁基、环庚基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。
术语“芳基”是指烃单环、二环或三环的芳香族环系统。芳基可以任选地被一个或多个取代基取代。在一个实施例中，芳基的每个环的0、1、2、3、4、5或6个原子可以被取代基取代。芳基的实例包含苯基、萘基、蒽基、芴基、茚基、薁基等。
术语“杂芳基”是指芳香族5-10元环系统，其中杂原子选自O、N或S，并且其余环原子是碳(除非另有说明，否则具有适当的氢原子)。杂芳基可以任选地被一个或多个取代基取代。在一个实施例中，杂芳基的每个环的0、1、2、3或4个原子可以被取代基取代。杂芳基的实例包含吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、噁二唑基、咪唑基、噻唑基、异噁唑基、喹啉基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、异喹啉基、吲唑基等。
如本文所使用的，术语“经取代的”指代这样的部分(如杂芳基、芳基、烷基和/或烯基)：其中所述部分结合到一个或多个另外的有机或无机取代基自由基。在一些实施例中，经取代的部分包括1、2、3、4或5个另外的取代基基团或自由基。合适的有机和无机取代基自由基包含但不限于羟基、环烷基、芳基、经取代的芳基、杂芳基、杂环、经取代的杂环、氨基、经单取代的氨基、经二取代的氨基、酰氧基、硝基、氰基、羧基、烷氧羰基、烷基甲酰胺、经取代的烷基甲酰胺、二烷基甲酰胺、经取代的二烷基甲酰胺、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、硫代烷基、烷氧基、经取代的烷氧基或卤代烷氧基自由基，其中所述术语在本文中定义。除非本文中另有说明，否则有机取代基可以包括1到4个或5到8个碳原子。当经取代的部分上结合有多于一个取代基自由基时，取代基自由基可以是相同或不同的。
如本文所使用的，术语“未经取代的”是指未结合到如上所述的一个或多个另外的有机或无机取代基自由基的部分(如杂芳基、芳基、烯基和/或烷基)，这意味着此部分仅被氢取代。
应当理解，本文所提供的结构以及对“取代”或“被...取代”的任何陈述包含暗示的条件，即此类结构和取代是根据经取代的原子和取代基的允许的化合价，并且取代产生稳定的化合物，例如，所述化合物不会如通过重排、环化、消除等自发地经历转化。
如本文所使用的，术语“RNA”是指作为在基因的编码、解码、调节和表达中的各种生物学作用中至关重要的聚合物分子的核糖核酸。RNA和DNA是核酸，并且与脂质、蛋白质和碳水化合物一起构成对于所有已知生命形态至关重要的四种主要的大分子。同DNA一样，RNA被组装为核甘酸链，但是与DNA不同的是，自然界中的RNA被发现为自身折叠的单链，而非配对的双链。细胞有机体使用信使RNA(mRNA)来传递指导具体蛋白质的合成的遗传信息(使用由字母G、U、A和C表示的鸟嘌呤、尿嘧啶、腺嘌呤和胞嘧啶的含氮碱基)。许多病毒使用RNA基因组来编码其遗传信息。一些RNA分子通过催化生物反应、控制基因表达或感测并传送对细胞信号的应答而在细胞内起着积极作用。这些积极过程之一是蛋白质合成，所述蛋白质合成是其中RNA分子指导蛋白质在核糖体上合成的普遍功能。此过程使用转移RNA(tRNA)分子以将氨基酸递送到核糖体，在所述核糖体处，核糖体RNA(rRNA)然后将氨基酸连接在一起以形成编码的蛋白质。
如本文所使用的，术语“非编码RNA(ncRNA)”是指不翻译成蛋白质的RNA分子。功能性非编码RNA所转录自的DNA序列通常被称为RNA基因。非编码RNA的大量和功能上重要的类型包含转移RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)以及如微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA、scaRNA等小RNA和如Xist和HOTAIR等长ncRNA。
如本文所使用的，术语“编码RNA”是指编码蛋白质的RNA，即，信使RNS(mRNA)。此类RNA包括转录组。
如本文所使用的，术语“核糖开关”是指信使RNA分子的调节段，所述调节段结合小分子，从而使由mRNA编码的蛋白质的产生发生改变。因此，含有核糖开关的mRNA直接参与响应于其效应分子的浓度而调节其自身的活性。
如本文所使用的，术语“TPP核糖开关”也称为THI元件和Thi-box核糖开关，是指高度保守的RNA二级结构。TPP核糖开关用作直接结合到焦磷酸硫胺素(TPP)以通过各种机制在古生菌、细菌和真核生物中调节基因表达的核糖开关。TPP是硫胺素(维生素B1)的活性形式，其是细菌内通过将嘧啶和噻唑部分偶联而合成的必需辅酶。
如本文所使用的，术语“假结”是指含有至少两个茎-环结构的核酸二级结构，其中一个茎的一半插入另一个茎的两半之间。1982年在芜菁黄花叶病毒中首次发现了假结。假结折叠成结状三维构型但并不是真正的拓扑结。
“适体”是指能够以高亲和力和特异性结合到所关注的特定分子的核酸分子(Tuerk和Gold，1990；Ellington和Szostak，1990)，并且可以是人工程化或自然来源的。配体与适体(所述适体通常为RNA)的结合改变了适体以及适体所位于的核酸的构型。在一些实例中，构型改变抑制适体所位于的mRNA的翻译，例如，或者以其它方式干扰核酸的正常活性。适体还可以由DNA构成或者可以包括非天然核苷酸和核苷酸类似物。适体最典型地是通过针对与靶分子的结合而进行的体外选择来获得的。然而，适体的体内选择也是可能的。适体还是核糖开关的配体结合结构域。适体的长度通常介于约10与约300个核苷酸之间。更常见地，适体的长度介于约30与约100个核苷酸之间。参见例如美国专利第6,949,379号，所述美国专利通过引用并入本文。可用于本发明的适体的实例包含但不限于PSMA适体(McNamara等人，2006)、CTLA4适体(Santulli-Marotto等人，2003)和4-1BB适体(McNamara等人，2007)。
如本文所使用的，术语“PCR”代表聚合酶链反应并且是指在分子生物学中广泛使用以快速制备具体DNA样品的数百万到数十亿个拷贝，从而允许科学家使用非常少的DNA样品并且将其扩增到足够大的数量以仔细研究的方法。
短语“药学上可接受的”指示物质或组合物与构成调配物的其它成分和/或用其治疗的受试者在化学和/或毒理学上相容。
如本文所使用的短语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包含但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate，mesylate)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即，1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可以涉及包含如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子等另一种分子。抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可以在其结构中具有多于一个带电原子。其中多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的实例，所述盐可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
如本文所使用的“载体”包含在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载体通常是含水pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的非限制性实例包含如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等缓冲液；包含抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)的多肽；如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性聚合物；如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；包含葡萄糖、甘露糖或糊精的单糖、二糖和其它碳水化合物；如EDTA等螯合剂；如甘露醇或山梨醇等糖醇；如钠等成盐抗衡离子；和/或如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM等非离子表面活性剂。在某些实施例中，药学上可接受的载体是非天然存在的药学上可接受的载体。
术语“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其中目标是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症，如癌症的发展或扩散。为了本发明的目的，有益的或所期望的临床结果包含但不限于症状的减轻、疾病程度的减轻、疾病的稳定状态(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减缓、以及缓和(不论是部分还是总体)，不论这些结果是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意味着存活期与未接受治疗时的预期存活期相比较延长。需要治疗的那些包含已患有病状或病症的那些以及易患上病状或病症的那些或待预防病状或病症的那些。
术语“施用(administration)”或“施用(administering)”包含将化合物引入到受试者中以执行其预期功能的途径。可以使用的施用途径的实例包含注射(包含但不限于皮下、静脉内、胃肠外、腹膜内、鞘内)、局部、口服、吸入、直肠和透皮。
术语“有效量”包含以剂量计并且持续所需的时间段可有效地实现所期望的结果的量。化合物的有效量可以根据如受试者的疾病状态、年龄和体重等因素以及化合物在受试者中引发期望的应答的能力而变化。剂量方案可以调整以提供最佳的治疗应答。
如本文所使用的短语“全身施用(systemic administration和administeredsystemically)”和“外周施用(peripheral administration和administeredperipherally)”意指施用化合物、药物或其它材料，使得其进入患者的系统，并且因此经历代谢和其它类似过程。
短语“治疗有效量”是指本发明的化合物(i)治疗或预防特定疾病、病状或病症，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病状或病症的一种或多种症状，或者(iii)预防或延迟本文描述的特定疾病、病状或病症的一种或多种症状的发作的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地终止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地终止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的症状中的一种或多种症状。在药物可以阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，功效可以例如通过评估疾病进展时间(TTP)和/或确定应答率(RR)来测量。
术语“受试者”是指如哺乳动物等动物，包含但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施例中，受试者是人。
本公开涉及一种适用于鉴定以高亲和力与特定RNA区域结合的小分子的基于片段的配体发现策略。通常，基于片段的配体发现允许鉴定结合所关注靶标的低到中等亲和力的一个或多个小分子“片段”。然后将这些片段精制或连接以产生更强效的配体13，14。通常，这些片段表现出低于300Da的分子量，并且为了可检测地结合，与所关注的靶标建立实质性的高质量接触。
基于片段的配体发现迄今为止仅成功用于鉴定是针对给定RNA的单片段命中结合的初始命中化合物15-19。对结合相同RNA的多个片段的鉴定将使得可以利用结合凹口内的片段之间的潜在的相加性和协同性相互作用20，21。然而，最近已经证明许多RNA通过多个“亚位点”来结合其配体，所述亚位点是结合凹口的以独立或协同方式接触配体的区域22。进一步地，已经证明即使当亚位点结合仅表现出适度的协同效应，也可以发生高亲和力RNA结合。这些特征是基于片段的配体发现应用于RNA靶标的有效性的良好预兆。
因此，基于上文，本公开涉及鉴定与所关注的RNA，例如TPP核糖开关结合的片段的方法。第二，所公开的方法涉及以大致的核苷酸分辨率来建立在RNA中结合的片段的定位。第三，所公开的方法涉及鉴定在初始片段命中的位点附近结合的第二位点片段。所公开的方法将基于片段的配体发现方法与用于鉴定RNA结合片段和建立片段结合的单独位点的SHAPE-MaP RNA结构探测相结合23，24。通过连接两个片段而最终产生的配体与天然核糖开关配体没有相似之处，并且所述配体以高亲和力结合结构复杂的TPP核糖开关RNA。
所公开的方法和配体的鉴定将在以下进行更详细地描述。
A.化合物
当前公开的主题的第一方面是具有式(I)结构的化合物：
Figure BDA0003580034520000111
其中
X1、X2和X3在每个实例中独立地选自CR1、CHR1、N、NH、O和S，其中相邻X1、X2和X3不同时选为O或S；
虚线表示任选的双键；
Y1、Y2和Y3在每个实例中独立地选自CR2和N；
n为1或2，其中当n为1时，所述虚线中仅一条虚线是双键；
L选自
Figure BDA0003580034520000112
Figure BDA0003580034520000113
其中k、p、q、r和v独立地选自整数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，z选自整数1、2、3、4和5；并且
A选自
Figure BDA0003580034520000114
其中X4、X5、X6和X7独立地选自CR3和N；
其中R1、R2和R3独立地选自-H、-Cl、-Br、-I、-F、-CF3、-OH、-CN、-NO2、-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)2、-COOH、-COO(C1-C6烷基)、-CO(C1-C6烷基)、-O(C1-C6烷基)、-OCO(C1-C6烷基)、-NCO(C1-C6烷基)、-CONH(C1-C6烷基)以及经取代或未经取代的C1-C6烷基；
m为1或2；并且
W是-O或-NR4，其中R4选自选自-H、-CO(C1-C6烷基)、经取代或未经取代的C1-C6烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的环烷基、-CO(芳基)、-CO(杂芳基)以及-CO(环烷基)；
条件是X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的至少两个是N；
或其药学上可接受的盐。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X1、X2或X3中的至少一个是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X1是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X2是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X3是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中在每个实例中，X1、X2和X3中的两个是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X1和X3是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y1、Y2和Y3中的至少一个是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y1是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y2是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y3是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y1、Y2和Y3中的至少一个是CR2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y1是CR2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y2是CR2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y3是CR2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中n为2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其具有式(II)结构：
Figure BDA0003580034520000121
其中
X2a和X2b独立地选自CR1和N；
X1和X3独立地选自CR1和N；
L和A如针对式(I)所规定的；并且
X1、X2a、X2b和X3中的两个是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其具有式(III)结构：
Figure BDA0003580034520000131
其中
L和A如针对式(I)所规定的。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中p、q、r和v独立地选自整数0、1、2和3。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中L选自
Figure BDA0003580034520000132
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中L是
Figure BDA0003580034520000133
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中q和r为0或1。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中q为1。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中r为1。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中r为0。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中q和r为1。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中q为1并且r为0。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中m为1。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中W选自-NH、-O和-N(C1-C6烷基)2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中W是-NH。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X4、X5、X6和X7中的至少一个是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X4是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X5是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X6是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X7是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X4和X6是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X5和X7是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中X5或X6是N，并且X4和X7两者独立地是CR2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中A是
Figure BDA0003580034520000141
如在以上任何实施例中，一种化合物，其具有结构：
Figure BDA0003580034520000142
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中L是
Figure BDA0003580034520000151
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y1、Y2和Y3在每个实例中独立地选自CR2和N，其中R1选自-H、-Cl、-Br、-I、-F、-OH和-NH2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中z为2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y2是N。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中Y2是CR2并且R1选自-H、-F、-OH和-NH2。
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中A是
Figure BDA0003580034520000152
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中所述化合物具有结构：
Figure BDA0003580034520000153
如在以上任何实施例中，一种化合物，其中所述化合物具有结构：
Figure BDA0003580034520000154
Figure BDA0003580034520000161
B.筛选方法
本公开涉及基于通过引物延伸分析的柔性选择性2′-羟基酰化(SHAPE)的片段筛选方法的开发和验证。基于片段的配体发现已经被证明是用于鉴定与包含RNA在内的大分子形成实质性密切接触的化合物的有效方法13，14，17。此发现策略的成功的前提是用于检测配体结合的自适应、高质量的生物物理学测定。因此，在一些实施例中，SHAPE RNA结构探测用于检测配体结合23-25，所述SHAPE RNA结构探测测量局部核苷酸柔性作为核糖2′-羟基对亲电子试剂的相对反应性。SHAPE可以针对任何RNA使用并且在单个实验中提供关于RNA中几乎所有核苷酸的数据，从而除了简单地检测结合以外还产生每核苷酸结构信息，并且在以下进行详细描述。另外，本公开还涉及应用SHAPE-突变谱(MaP)23，24，其将SHAPE与高通量测序的读出相结合，从而实现数千个样品的复用和高效的高通量分析。
因此，在一些实施例中，本公开涉及一种将SHAPE和/或SHAPE-MaP用于鉴定与所关注的RNA分子结合和/或缔合的小分子片段和/或化合物的筛选方法。本文中公开的方法进一步包括将SHAPE和/或SHAPE-MaP用于鉴定与已经用另一小分子片段(例如，片段1)预温育的RNA分子结合和/或缔合的小分子片段(例如，片段2)。未受理论约束，但是据信片段1结合到第一结合位点并且片段2结合到同一RNA分子中的第二结合位点(例如，亚位点)。因此，将片段1和片段2的结构特征组合(例如，用接头L连接两个片段)以产生如本文所公开的化合物被认为使连接的片段配体与单独的片段1和/或片段2相比呈现出增加的RNA结合亲和力。
筛选方法SHAPE和SHAPE-MaP在以下进行更详细地描述。
I.SHAPE化学
SHAPE化学至少部分地基于RNA核糖2′-位置的亲核性对于相邻3′-磷酸二酯基团的电子影响敏感的观察。与碱基配对或以其它方式受约束的核苷酸相比，不受约束的核苷酸更多地采取增强2′-羟基的亲核性的构型。因此，如但不限于N-甲基靛红酸酐(NMIA)等羟基选择性亲电子试剂与柔性RNA核苷酸更快地形成稳定的2′-O-加合物。局部核苷酸柔性可以在单个实验中同时在RNA分子中的所有位置处查询到，因为所有RNA核苷酸(除了携带转录后修饰的少数细胞RNA之外)都具有2′-羟基。可以在RNA中的所有位置中比较绝对SHAPE反应性，因为2′-羟基反应性对于碱基身份不敏感。也有可能核苷酸可以是反应性的，因为所述核苷酸在增强特定2′-羟基的亲核性的构型中受到约束。此类核苷酸预期是极少的，将涉及非典型局部几何结构，并且将根据未配对位置进行正确评分。
当前公开的主题在一些实施例中提供了用于通过查询任意长度和结构复杂性的RNA分子中的结构约束来检测RNA分子中的结构数据的方法。在-些实施例中，所述方法包括：将含有2′-O-加合物的RNA分子用(标记的)引物退火；将不含有2′-O-加合物的RNA分子用(标记的)引物退火作为阴性对照；将引物延伸以产生cDNA的文库；分析cDNA；以及产生包括RNA的结构数据的输出文件。
RNA分子可以存在于生物样品中。在一些实施例中，RNA分子可以在存在蛋白质或其它小和大生物配体和/或化合物的情况下被修饰。引物可以任选地用放射性同位素、荧光标记、重原子、酶标记、化学发光基团、生物素基团、由二级报告基因识别的预定多肽表位或其组合进行标记。分析可以包括分离、定量、分级或其组合。分析可以包括提取作为洗脱时间数据的函数的荧光或染料量数据，所述荧光或染料量数据被称为迹线。例如，可以在毛细管电泳仪的单柱或微流体装置中分析cDNA。
在一些实施例中，可以计算含有2′-O-加合物的RNA分子和不含有2′-O-加合物的RNA分子对核苷酸序列的迹线中的峰面积。迹线可以与RNA的序列进行比较和比对。观察并考虑到由测序产生的那些cDNA的迹线比含有2′-O-加合物的RNA分子和不含有2′-O-加合物的RNA分子的迹线中的对应位置长一个核苷酸。通过执行整个迹线高斯拟合积分可以确定每个峰下的面积。
因此在一些实施例中，本文提供的是用于与复杂生物溶液中的RNA分子形成共价核糖2′-O-加合物的方法。在一些实施例中，所述方法包括使亲电子试剂与RNA分子接触，其中亲电子试剂选择性地修饰RNA分子中的未受约束的核苷酸以形成共价核糖1′-O-加合物。
在一些实施例中，将如但不限于N-甲基靛红酸酐(NMIA)等亲电子试剂溶解于如DMSO等无水、极性、非质子溶剂中。将试剂-溶剂溶液添加到含有RNA分子的复杂生物溶液中。所述溶液可以含有不同浓度和数量的蛋白质、细胞、病毒、脂质、单糖和多糖、氨基酸、核苷酸、DNA以及不同的盐和代谢物。可以调整亲电子试剂的浓度以实现RNA分子中期望的修饰程度。亲电子试剂具有与溶液中的任何自由羟基反应的潜力，从而在RNA分子上产生核糖2′-O-加合物。进一步地，亲电子试剂可以选择性地修饰RNA分子中未配对或以其它方式未受约束的核苷酸。
RNA分子可以以产生少量RNA修饰的浓度暴露于亲电子试剂以形成2′-O-加合物，这可以通过由逆转录酶抑制引物延伸的能力来检测。在单个实验中可以查询到所有RNA位点，因为所述化学靶向2′-羟基的通用反应性。在一些实施例中，去除亲电子试剂以评估背景的对照延伸反应以及用于分配核苷酸位置的双脱氧测序延伸可以并行进行。这些组合步骤被称为通过引物延伸分析的选择性2′-羟基酰化或SHAPE。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：使含有1′-O-加合物的RNA分子与(标记的)引物接触，使不含有2′-O-加合物的RNA与(标记的)引物接触作为阴性对照；延伸引物以产生cDNA的线性阵列，分析cDNA，并且产生包括RNA的结构数据的输出文件。
在单个SHAPE实验中查询的核苷酸数量不仅取决于所使用的分离技术的检测和分辨率，还取决于RNA修饰的性质。在给定反应条件下，存在其中几乎所有RNA分子都具有至少一个修饰的长度。当引物延伸达到这些长度时，延伸cDNA的数量减少，这减弱了实验信号。调整条件以减少修饰产量可以增加读段长度。然而，降低试剂产量还可以降低每个cDNA长度的测得信号。鉴于这些考虑，单个SHAPE读段的优选最大长度大概为RNA的约1千碱基，但是不应限于此。
II.SHAPE-MaP
在SHAPE-MaP中，SHAPE加合物通过突变谱(MaP)来检测，所述突变谱运用了逆转录酶在SHAPE化学加合物的位点处并入非互补核苷酸或产生缺失的能力。在一些实施例中，SHAPE-MaP可以用于文库构建和测序。在一些实施例中，在SHAPE-MaP中可以采用复用技术。
通常，将RNA用在构型动态核苷酸处反应的SHAPE试剂处理。在逆转录期间，聚合酶读取RNA中的化学加合物并且将与原始序列不互补的核苷酸并入到cDNA中。使用任何大规模并行方法对所得cDNA进行测序以产生突变谱(MaP)。将测序读段与参考序列比对并且计算核苷酸分辨率突变率，将所述核苷酸分辨率突变率针对背景进行校正并且归一化，从而产生标准SHAPE反应性谱。然后SHAPE反应性可以用于对二级结构进行建模，可视化竞争性和替代性结构或者对调节局部核苷酸RNA动力学的任何过程或功能进行定量。在RNA分子的SHAPE修饰之后，使用逆转录酶以产生突变谱。此步骤将SHAPE加合物的位置和相对频率编码为cDNA中的突变。使用本领域已知的方法(例如，PCR反应)将cDNA转化成dsDNA，并且将dsDNA在第二PCR反应中进一步扩增，从而添加了用于复用的测序。在纯化后，测序文库的大小均匀并且每个DNA分子含有整个所关注的序列。
因此，根据当前公开的主题的一些实施例，提供了用于检测核酸中一个或多个化学修饰的方法。在一些实施例中，所述方法包括：提供疑似具有化学修饰的核酸；使用聚合酶和所提供的作为模板的核酸来合成核酸，其中合成在聚合酶读取所提供的核酸的化学修饰从而在所得核酸中的化学修饰的位点处产生不正确的核苷酸的条件下发生；以及检测不正确的核苷酸。
根据当前公开的主题的一些实施例，提供了用于检测核酸中的结构数据的方法。在一些实施例中，所述方法包括：提供疑似具有化学修饰的核酸；使用聚合酶和所提供的作为模板的核酸来合成核酸，其中合成在聚合酶读取所提供的核酸的化学修饰从而在所得核酸中的化学修饰的位点处产生不正确的核苷酸的条件下发生；检测不正确的核苷酸；以及产生包括所提供的核酸的结构数据的输出文件。
在当前公开的主题的一些实施例中，所提供的核酸是RNA分子(例如，编码RNA和/或非编码RNA分子)。在一些实施例中，所述方法包括检测两个或更多个化学修饰。在一些实施例中，聚合酶读取多个化学修饰以产生多个不正确的核苷酸并且所述方法包括检测每个不正确的核苷酸。
在一些实施例中，核酸(例如，RNA分子)已经暴露于提供化学修饰的试剂，或者化学修饰预先存在于核酸(例如，RNA分子)中。在一些实施例中，预先存在的修饰是2′-O-甲基和/或由核酸所源自的细胞所引起，如但不限于表观遗传修饰，和/或修饰是1-甲基腺苷、3-甲基胞嘧啶、6-甲基腺苷、3-甲基尿苷和/或2-甲基鸟苷。在一些实施例中，如RNA分子等核酸可以在存在蛋白质或其它小和大生物配体和/或化合物的情况下被修饰。
在一些实施例中，试剂包括亲电子试剂。在一些实施例中，亲电子试剂选择性地修饰RNA分子中未受约束的核苷酸以形成共价核糖2′-O-加合物。在一些实施例中，试剂是1M7、1 M6、NMIA、DMS或其组合。在一些实施例中，核酸存在于生物样品中或源自生物样品。
在一些实施例中，聚合酶是逆转录酶。在一些实施例中，聚合酶是天然聚合酶或突变聚合酶。在一些实施例中，合成的核酸是cDNA。
在一些实施例中，检测不正确的核苷酸包括对核酸进行测序。在一些实施例中，将序列信息与所提供的核酸的序列比对。在一些实施例中，检测不正确的核苷酸包括对核酸使用大规模并行测序。在一些实施例中，所述方法包括对核酸进行扩增。在一些实施例中，所述方法包括通过使用特定引物的定点方法、使用随机引物法的全基因组、使用随机引物法的全转录组或其组合来对核酸进行扩增。
根据当前公开的主题的一些实施例，提供了包括以执行步骤的形式体现在计算机可读介质中的计算机可执行指令的计算机程序产品，所述执行步骤包括当前公开的主题的任何实施例的任何方法步骤。根据当前公开的主题的一些实施例，提供了通过当前公开的主题的任何方法产生的核酸文库。
III.SHAPE亲电子试剂
如上文所公开的，SHAPE化学利用了以下发现：核糖2′-羟基的亲核反应性由局部核苷酸柔性所门控。在由碱基配对或三级相互作用所约束的核苷酸处，3′-磷酸二酯阴离子以及其它相互作用降低了2′-羟基的反应性。相比之下，柔性位置优先采用与包含但不限于NMIA的亲电子试剂反应以形成2′-O-加合物的构型。例如，NMIA与所有四种核苷酸一般地反应并且试剂经历平行、自失活、水解反应。实际上，当前公开的主题提供了可以根据当前公开的主题的一些实施例来采用可以与如本文所公开的核酸反应的任何分子。在一些实施例中，亲电子试剂(也称为SHAPE试剂)可以选自但不限于靛红酸酐衍生物、苯甲酰氰衍生物、苯甲酰氯衍生物、邻苯二甲酸酐衍生物、异氰酸苄酯衍生物和其组合。靛红酸酐衍生物可以包括1-甲基-7-硝基靛红酸酐(1M7)。苯甲酰氰衍生物可以选自包含但不限于以下的组：苯甲酰氰(BC)、3-羧基苯甲酰氰(3-CBC)、4-羧基苯甲酰氰(4-CBC)、3-氨甲基苯甲酰氰(3-AMBC)、4-氨甲基苯甲酰氰和其组合。苯甲酰氯衍生物可以包括苯甲酰氯(BCl)。邻苯二甲酸酐衍生物可以包括4-硝基苯二甲酸酐(4NPA)。异氰酸苄酯衍生物可以包括异氰酸苄酯(BIC)。
IV.RNA分子设计
因为SHAPE反应性可以在一个或多个引物延伸反应中评估，所以信息可能在RNA分子的5′末端和接近引物结合位点处丢失。通常，邻近引物结合位点的10-20个核苷酸处的加合物形成难以定量，这是由于在引物延伸的起始期期间存在反映通过逆转录酶(RT)进行的暂停或非模块化延伸的cDNA片段。由于存在丰富的全长延伸产物，RNA的5′末端处的8-10个位置可能难以可视化。
为了监测所关注的序列的5′和3′末端处的SHAPE反应性，可以将RNA分子嵌入天然序列的大片段内或者置于含有独特引物结合位点的强折叠RNA序列之间。在一些实施例中，结构盒可以被设计成含有核苷酸的5′和3′侧接序列，以允许所关注的RNA分子内的所有位置在提供核苷酸分辨率的任何分离技术中评估，所述分离技术如但不限于测序凝胶、毛细管电泳等。在一些实施例中，5′和3′延伸两者都可以折叠成不干扰各种内部RNA的折叠的稳定的发夹结构。盒的引物结合位点可以有效结合到cDNA引物。可以检查任何5′和3′结构盒元件的序列以确保所述元件不易于与内部序列形成稳定的碱基配对相互反应。
在一些实施例中，所关注的RNA分子包括与核苷酸接头连接的两个不同靶基序。靶基序可以是所关注的任何核苷酸序列。示例性靶基序包含但不限于核糖开关、病毒调节元件、mRNA中的结构化区域、多螺旋结、假结和/或适体。在一些实施例中，第一靶基序是假结，如来自登革热病毒基因组的5′UTR的假结。在一些实施例中，第二靶基序是适体结构域，如TPP核糖开关适体结构域。对于核苷酸接头，核苷酸的数量可以变化。例如，在一些实施例中，接头中的核苷酸的数量在约1到约20个核苷酸、约1到约15个核苷酸、约1到约10个核苷酸或约5到约10个核苷酸的范围内(或为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸)。
在一些实施例中，RNA分子进一步包括RNA条形码区域。RNA条形码区域是允许在RNA分子的混合物中(例如，在复用期间)鉴定特定RNA分子的独特条形码。RNA条形码区域的位置可以变化，但是通常被发现邻近于RNA分子中存在的盒之一。在一些实施例中，RNA条形码被设计以折叠成不与RNA分子的任何其它部分相互作用的独立结构。RNA条形码区域的结构可以变化。在一些实施例中，RNA条形码区域的结构包括碱基对螺旋，所述碱基对螺旋包括约1到约10个碱基对(或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基对)。在一些实施例中，RNA条形码区域包括7个碱基对。在一些实施例中，碱基对用锚定到碱基对螺旋的末端碱基对的四环封盖。碱基对螺旋的封盖保持了RNA条形码区域的整体发夹稳定性。在一些实施例中，四环包括核苷酸序列GNRA，但不意在限于此。在一些实施例中，RNA条形码区域被设计使得任何单独的条形码都经历至少两次突变以被曲解为另一条形码。
V.RNA分子的折叠
当前公开的主题可以用通过包含但不限于体外转录的方法生成的RNA分子和在细胞和病毒中生成的RNA分子来执行。在一些实施例中，RNA分子可以通过变性凝胶电泳来纯化并且复性以实现生物学相关构型。进一步地，在期望的pH(例如，约pH 8)下将RNA分子折叠到期望的构型的任何程序可以被替代。RNA分子首先可以在低离子强度缓冲液中被加热并且快速冷却以消除多聚体形式。然后可以添加折叠溶液以使RNA分子实现适当的构型并且使其准备好用亲电子试剂进行结构敏感性探测。在一些实施例中，RNA可以在单个反应中折叠并且然后分离为(+)和(-)亲电子试剂反应。在一些实施例中，RNA分子在修饰之前不是天然地折叠的。修饰可以在RNA分子通过热和/或低盐条件而变性时进行。
VI.RNA分子修饰
亲电子试剂可以添加到RNA中以在柔性核苷酸位置处产生2′-O-加合物。然后可以将反应可以温育直至几乎所有亲电子试剂已经与RNA反应或者已经由于与水的水解作用而降解。不需要特定的猝灭步骤。修饰可以在存在复杂配体和生物分子的情况下以及在存在各种盐的情况下进行。RNA还可以在细胞和病毒内被修饰。这些盐和复杂配体可以包含镁、钠、锰、铁和/或钴的盐。复杂配体可以包含但不限于蛋白质、脂质、其它RNA分子、DNA或小有机分子。在一些实施例中，复杂配体是如本文所公开的小分子片段。在一些实施例中，复杂配体是如本文所公开的化合物。经修饰的RNA可以通过例如乙醇沉淀从反应产物和可能对引物延伸反应有害的缓冲液组分中纯化。
VII.引物延伸和聚合
根据当前公开的主题的通过引物延伸对RNA加合物的分析在各个实施例中可以包含使用优化的引物结合位点、热稳定逆转录酶、低MgCl2浓度、升高的温度、较短的延伸时间以及前述任一项的组合。无反应副产物和其它小分子污染物的完整的、未降解的RNA还可以用作逆转录的模板。所得RNA-cDNA杂交体的RNA组分可以通过用碱处理而降解。cDNA片段然后可以使用例如在审阅本公开之后对于本领域的普通技术人员而言将显而易见的聚丙烯酰胺测序凝胶、毛细管电泳或其它分离技术来解析。
三磷酸脱氧核糖核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP和/或三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)可以以足够的量单独地或与引物一起添加到合成混合物中，并且可以将所得溶液加热到约50-100℃，持续约1到10分钟。在加热时间段过后，可以冷却溶液。在一些实施例中，可以将用于引起引物延伸反应的适当的药剂添加到冷却的混合物中，并且使反应在本领域已知的条件下进行。在一些实施例中，在热稳定的情况下，可以将用于聚合的药剂与其它试剂一起添加。在一些实施例中，合成(或扩增)反应可以在室温下进行。在一些实施例中，合成(或扩增)反应可以在至多某一温度下进行，在所述温度之上用于聚合的药剂不再起作用。
用于聚合的药剂可以是用于完成包含例如酶的引物延伸产物的合成的任何化合物或系统。用于此目的的合适的酶包含但不限于大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶的克列诺片段(Klenow fragment)、聚合酶突变蛋白、逆转录酶和其它酶，所述其它酶包含热稳定酶(即那些在经受升高到足以引起变性的温度后进行引物延伸的酶)，如鼠或鸟逆转录酶。合适的酶可以促进核苷酸以适当的方式组合以形成与每个多态基因座核酸链互补的引物延伸产物。在一些实施例中，合成可以在每个引物的5′末端处开始并在3′方向上进行，直到合成通过并入三磷酸双脱氧核苷酸而在模板的末端处终止或者在2′-O-加合物处终止，从而产生不同长度的分子。
新合成的链及其互补核酸链可以在本文所述的杂交条件下形成双链分子，并且此杂交体用于后续步骤中，如美国专利第10,240,188号和美国专利第8,318,424号中所述的所公开方法，所述美国专利在本文中以其整体引用。在一些实施例中，新合成的双链分子还可以使用本领域已知的任何程序来经受变性条件以提供单链分子。
VII.原始数据的处理
本文针对如RNA分子等核酸、化学修饰分析和/或核酸结构分析描述的主题可以使用计算机程序产品来实施，所述计算机程序产品包括体现在计算机可读介质中的计算机可执行指令。适合于实施本文所述的主题的示例性计算机可读介质包含芯片存储器装置、盘式存储器装置、可编程逻辑装置和专用集成电路。另外，实施本文所述的主题的计算机程序产品可以位于单个装置或计算平台上或者可以跨多个装置或计算平台分布。因此，本文描述的主题可以包含计算机指令集，所述计算机指令集当由计算机执行时执行用于核酸的特定功能，如RNA结构分析。
考虑到以上提及的条目I-VII，设计了模块化RNA筛选构建体以实施SHAPE作为用于配体结合读出的高通量测定(图1，顶部)。所述构建体被设计为含有两个靶基序，如：来自登革热病毒基因组的5′UTR的假结，所述假结当其结构被破坏时会降低病毒适应性26；以及TPP核糖开关适体结构域27-29。在单个构建体中包含两个不同的结构基序允许每个基序用作另一个基序的内部特异性对照。与两个RNA结构结合的片段很容易被鉴定为非特异性结合剂。这两个结构通过六核苷酸接头连接，被设计为单链，以使两个RNA结构在结构上保持独立。构建体的结构核心侧接有结构盒25；这些茎-环形成区域用作筛选工作流程中所需步骤的引物结合位点并且被设计为不与构建体中的其它结构相互作用(图7)。
筛选构建体的另一组分是RNA条形码；条形编码支持复用，这显著减少了下游工作负载。用于筛选片段文库的96孔板中的每个孔都含有于在其它方面完全相同的构建体的背景下具有独特条形码的RNA；条形码序列因此鉴定孔位置以及复用后存在的一个(或多个)片段(图1)。RNA条形码区域被设计成不与构建体的任何其它部分相互作用的独立的结构。条形码结构是七碱基对螺旋，所述七碱基对螺旋用GNRA四环封盖并用G-C碱基对锚定以保持发夹稳定性(图7)。每组96个条形码被设计成使得任何单独的条形码经历两个或更多个突变以被曲解为另一个条形码。
此结构在选择RNA结构以筛选配体结合方面具有灵活性并且支持简单、直接的筛选实验(图1)。将含有具有独特RNA条形码的在其它方面完全相同的RNA构建体的96孔板中的每个孔与一个或几个小分子片段或无片段对照(溶剂)一起温育并且然后暴露于SHAPE试剂中。所得SHAPE加合物化学地编码每核苷酸结构信息。在SHAPE探测之后，将确定片段身份(RNA条形码)和片段结合(SHAPE加合物模式)所需的信息永久编码到每个RNA链中，因此来自板的96个孔的RNA可以汇集到单个样品中。片段筛选实验的处理方式与标准MaP结构探测工作流程非常相似24。例如，在一些实施例中，专门的松弛保真度逆转录反应用于制备在RNA上任何SHAPE加合物的位置处含有非模板编码序列变化的cDNA30。然后将这些cDNA用于制备用于高通量测序的DNA文库。可以以DNA文库水平对实验的多个板进行条形编码24，以在单次测序运行中收集关于数千种化合物的数据(图1)。所得测序数据含有数百万个单独的读段，每个读段对应于特定的RNA链。通过条形码对这些读段进行分选以允许分析每个小分子片段或片段组合的数据。采用如SHAPE和/或SHAPE-MaP等上述方法测定和鉴定小分子片段(例如，片段1和/或片段2)将在下一节中更详细地描述。
C.配体鉴定和选择
如以上所提及的，SHAPE和SHAPE-MaP用于鉴定与所关注的RNA分子结合或缔合的小分子片段。具体地，在使用SHAPE-Map测试小分子片段时，根据每核苷酸SHAPE-MaP突变率检测结合片段特征涉及多个步骤以在大型实验筛选上对数据进行归一化并确保统计严谨性。基于SHAPE的命中分析策略的关键特征包含：(i)考虑到板与板和孔与孔的变异性而将每个片段暴露的RNA或“实验样品”与五个阴性、无片段暴露的对照样品进行的比较；(ii)对构建体中的两个结构基序(在本公开中为假结和TPP核糖开关)中的每一个结构基序单独进行的命中检测；(iii)跨所有样品掩蔽具有低反应性的单独的核苷酸，因为这些核苷酸不太可能显示出片段诱导的变化；以及(iv)片段暴露的实验样品与无片段暴露的阴性对照样品之间每核苷酸突变率的差异的计算。选择所述基序之一与无片段对照之间突变率差异为20％或更大的核苷酸进行Z-评分分析。然而，技术人员由于认识到突变率可以变化而将能够相应地调整突变率的差异。例如，在一些实施例中，突变率的差异可以是25％、30％、35％、45％或50％或更大。在一些实施例中，突变率的差异可以是15％、10％或5％或更大。如果两个基序之一中的三个或更多个核苷酸的Z-值大于2.7(如通过比较两个基序的泊松计数来确定31，参见实例2)，则确定片段具有显著改变的SHAPE反应性模式。然而，Z-值可以不同，并且技术人员将能够相应地对其进行调整。例如，在一些实施例中，Z-值大于2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3.、3.4、3.5、3.6.、3.7、3.8或3.9。在一些实施例中，Z-值大于1.0.、1.1.、1.2.、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或2.6。
为了用SHAPE和/或SHAPE-MaP鉴定随后连接在一起以产生本文公开的化合物的小分子片段，执行了一系列步骤。首先，进行初级筛选，所述初级筛选对大量化合物，例如至少100种化合物进行筛选，以鉴定对靶RNA分子表现出合适的结合活性的任何初始先导或命中化合物。在步骤2中，然后在构效关系(SAR)研究中进一步检查这些命中化合物，其中随着命中化合物的结构被修饰而确定靶RNA结合亲和力的变化。当多个小分子片段被鉴定为靶RNA分子的适合结合配体时，可以进行另外的结合研究以进一步研究每个小分子片段的结合位点(即步骤3)。例如，在一些实施例中，可以将靶RNA与第一片段(根据步骤2中的SAR研究而被鉴定为靶RNA结合配体)预温育，然后将靶RNA暴露于第二片段(在步骤2的SAR研究中也被鉴定为RNA结合配体)，以鉴定第二片段在第一片段已经结合时是否可以与靶RNA结合。一旦已经鉴定出第二片段与所关注的RNA具有合适的结合活性，就可以用接头将所述第二片段与第一片段连接以产生本文公开的化合物(即，步骤4)。下文更详细地描述以上提及的步骤中的每个步骤。
步骤1：初级筛选
在初级筛选中，测试了1,500个片段并检测到41个片段为命中，初始命中率为2.7％。通过一式三份的SHAPE分析进行命中验证(图2、图8)，并且只有在所有三个重复中检测到化合物为结合剂时，所述化合物才被接受为真正的命中。然后通过等温滴定量热法(ITC)分析这些重复的命中化合物以确定对仅与靶基序相对应的RNA(省略筛选构建体中的侧接序列)的结合亲和力。在这些初始命中中，通过重复分析和ITC验证了八个命中(表1)。所述命中中的七个命中基于其大部分或全部位于测试构建体的TPP核糖开关区域内的突变特征而结合TPP核糖开关。剩余的命中是非特异性的，因为此片段影响了RNA构建体所有部分的核苷酸。未检测到特异性地结合测试构建体的登革热假结区域的化合物。
表1：如通过SHAPE探测检测到的结合TPP核糖开关的片段。
Figure BDA0003580034520000261
命中通过SHAPE结构探测来进行检测并且通过重复分析和ITC进行验证。解离常数通过ITC确定；标有
Figure BDA0003580034520000262
的误差值表示从≥3次重复得出的标准误差，其它误差估计值是基于结合曲线的最小二乘回归的95％置信区间计算的。包含了天然TPP配体以用于比较。
经ITC验证的结合TPP核糖开关的七个片段具有不同的化学型；大多数与天然TPP配体几乎没有相似之处(表1)。总体而言，杂芳香族含氮环占主导地位；这些可能参与氢键相互作用。三种化合物具有吡啶环并且两种具有吡嗪环。唑环部分存在于三种化合物中：两种噻二唑和一种咪唑。天然TPP配体中存在噻唑环，但此部分不参与与RNA的结合相互作用28，29，33。另外，许多已鉴定的片段含有可以用作氢键受体或供体的伯胺、酯和醚以及氟基团。
步骤2：核糖开关结合片段的构效关系(SAR)
接下来，检查了一些初始命中的类似物，目的是增加结合亲和力并且鉴定片段命中可以用接头修饰而不妨碍结合的位置。具体地，考虑了化合物2和5的类似物，因为这两个片段在结构上是不同的并且类似物是可商购获得的。通过ITC对类似物-RNA结合进行评估。测试了2的十六种类似物。通过去除一个或两个环氮来改变2的核心喹喔啉结构引起结合活性的变化(表2A)。
表2A：片段2类似物的SAR。
Figure BDA0003580034520000271
Figure BDA0003580034520000272
检查对喹喔啉核心的修饰并通过ITC获得解离常数。
结合亲和力的改善是由于引入了亚甲基连接的氢键供体或受体引起的(表2B，化合物16和17)。喹喔啉环核心上其它位置处的取代基变化导致结合活性降低。化合物2是基于高度柔性的进一步开发的良好候选物，并且在对C-6位置处的取代基进行修饰后，甚至观察到结合得到改善。
表2B：与TPP核糖开关RNA结合的片段2的类似物的构效关系。对喹喔啉核心的侧基的修饰。解离常数通过ITC获得。
Figure BDA0003580034520000281
Figure BDA0003580034520000282
接下来，对片段5的18种类似物的检查表明，分子的核心吡啶官能度似乎对结合很重要，因为改变环氮的位置、添加或去除环氮都减少或废除了结合(表3)。
表3：与TPP核糖开关RNA结合的片段5的类似物的构效关系。通过ITC获得对吡啶核心的修饰和解离常数。
Figure BDA0003580034520000291
Figure BDA0003580034520000292
对环取代基的修饰通常导致结合活性的显著损失(表4)。唯一增加亲和力的类似物S12的特征在于在C-4位置处的氯，从而产生对TPP核糖开关的亲和力比片段5高大约三倍的化合物。
表4：与TPP核糖开关RNA结合的片段5的类似物的构效关系。对吡啶核心的侧基的修饰。解离常数通过ITC获得。
Figure BDA0003580034520000301
Figure BDA0003580034520000302
步骤3：鉴定与TPP核糖开关上的第二位点结合的片段
采用第二轮筛选来鉴定与预结合到化合物2或S12的筛选构建体的TPP核糖开关区域结合的片段。此筛选鉴定了当2或S12已经结合时由于协同效应或由于初级配体结合时发生的结构变化而使新的结合模式变得可用而优先与TPP核糖开关相互作用的片段(图3)。在筛选的1,500个片段中，五个片段经验证与2或S12同时结合(表5)。
表5：如通过SHAPE所检测的在存在预结合片段配偶体的情况下结合TPP核糖开关的片段。通过重复SHAPE分析验证了命中。初级结合配偶体(2，6)在表1中示出。
Figure BDA0003580034520000311
一种第二次筛选命中29诱导了SHAPE反应性信号的非常强劲的变化并且似乎引起RNA结构的显著改变，包含P1螺旋的展开。此片段引起与非特异性相互作用一致的RNA的其它区的变化，因此此片段未被进一步视为片段连接的候选物。片段28在ITC分析所需的浓度下是不可溶的；因此，通过ITC检查了含有吡啶而不是喹啉环的相关类似物(表6)。这些化合物以弱亲和力结合，尽管如此，31和32显示出与2的明显但适度的结合协同性。
表6：在存在和不存在预结合片段2的情况下与TPP核糖开关RNA结合的片段28的类似物的构效关系。*
Figure BDA0003580034520000321
Figure BDA0003580034520000322
*und(未确定)：由于无法拟合ITC结合曲线；不可溶：化合物在ITC所需的浓度下是不可溶的。
表7：通过基于片段的方法开发的代表性蛋白质和RNA片段-接头-片段配体的详细比较。RNA实例用星号强调。每个条目都详述了两个组分片段及其单独的Kd值、连接的化合物及其对应的Kd值，以及连接的化合物的配体效率(LE)和连接系数(E)22，38，53，54，45-52。
Figure BDA0003580034520000331
Figure BDA0003580034520000341
步骤4：协同性和片段连接
通过ITC对2与31之间的协同结合相互作用进行定量。单独地，2以25μM的Kd结合，并且31以10mM的高得多的Kd结合。如在次级筛选中，当2预结合到TPP核糖开关RNA，从而形成2-RNA复合物时，也检查了片段31的亲和力。在这些条件下，片段31以大约3mM的Kd与2-TPP RNA复合物结合(图4)。此实验还表明，当2的结合饱和时，31与TPP RNA结合，这意味着这两个片段不在同一位置结合。由于2和31以优异且合理的亲和力分别与TPP RNA的不同区域结合，因此两个片段与产生高亲和力配体的目标相关联。
基于对片段命中2(表2B)和28(表4)的SAR分析，制备了最有希望的SAR片段的连接类似物，重点是17的氨甲基位置和片段31的吡啶环中的两个位点(图5)。首先，将与酰胺或胺接头缀合的片段的亲和力进行比较。具有柔性胺接头的化合物(化合物36)的结合亲和力比酰胺连接的型式(化合物35，图5)的结合亲和力高五倍。这些连接是在异羟肟酸的背景下引入的，所述异羟肟酸可以螯合镁离子35，如在具有天然TPP配体的焦磷酸酯部分的情况下发生的27，28。然而，胺连接的异羟肟酸化合物36以与母体片段17的亲和力相似的亲和力结合，这表明异羟肟酸部分不会通过螯合离子来赋予另外的结合亲和力。连接的化合物37以625nM亲和力结合，这表明在正确的近似的情况下连接两个适度亲和力的片段可以实现高纳摩尔结合剂。用叔胺(化合物38)代替片段31实体相对于化合物37降低了亲和力，这表明片段31与RNA的相互作用不仅仅是由基于电荷的效应介导的。最后，相对于化合物37，通过长度(化合物39)或吡啶环连接位点(化合物40)改变17与31部分之间的连接会降低亲和力(图5)。最终，通过将单独与TPP核糖开关以5.0μM(化合物19)和≥10mM(化合物31)的亲和力结合的化合物连接，产生了以625nM的Kd与RNA结合的化合物(37)。
技术人员将理解，上述步骤I-IV并不意味着是限制性的，而仅用作示例性实施例。将充分理解的是，技术人员将能够应用上述步骤I-IV来鉴定可以连接在一起以产生本文公开的对TPP核糖开关具有合适的结合亲和力的化合物的替代片段。进一步地，将充分理解的是，技术人员将能够应用上述步骤I-IV来鉴定可以连接在一起以产生本文公开的结合到所关注的其它RNA分子的化合物的片段。
D.总结和另外的考虑
由于编码(mRNA)和非编码RNA都可以潜在地被操纵以改变细胞调节和疾病的过程，因此寻求开发一种高效的策略来鉴定结构化RNA的小分子配体。本文所公开的研究证明了使用与基于片段的策略融合的检测与RNA结合的配体的SHAPE筛选读出的前景。在这里，此策略用于产生以625nM的Kd结合到TPP核糖开关的在结构上与天然配体无关的配体。融合的SHAPE和基于片段的筛选方法对于可以靶向的RNA结构和可以开发的配体化学型都是通用的。所述策略特别适合于寻找具有复杂结构的RNA的配体，这对于鉴定在三维凹口中结合的RNA基序可能至关重要4。另外，由于使用MaP方法以及通过RNA和DNA条形编码进行复用的应用，筛选一千多个成员片段文库所需的工作量适中，从而使得能够高效地筛选许多在结构上不同的靶标。
获得的许多配体与先前针对单轮筛选报告的配体相似，所述单轮筛选也针对TPP核糖开关进行15，17。初级筛选中的命中似乎适度偏向于更高的亲和力，使得通过SHAPE检测的大多数配体以10-300μM结合。所使用的命中检测测定可能偏向于检测最紧密的片段结合剂和那些诱导SHAPE反应性发生最显著变化的结合剂。较低的亲和力片段可能被遗漏。据信这种对紧密结合片段的偏向总体上是一个优势。未鉴定出以达到满足上述筛查标准所需的亲和力和特异性与登革热假结结合的片段。登革热假结RNA是高度结构化的，并且片段可以扰动此结构的可能性可能较低。另一种可能性是，这种特定假结结构可能不含有可配体的凹口。
其中来自初级筛选的片段命中预结合到RNA并针对另外的片段结合配偶体进行筛选的片段对鉴定策略具体地利用可通过SHAPE获得的每核苷酸信息并在这里成功用于发现诱导拟合片段对(图4)。基于片段的配体开发的核心原则是，两个片段之间的协同性可以通过近端结合来实现并且可以通过用微创共价接头将协同片段连接在一起来利用这种相加性结合20，21，36，37。从初级和次级片段命中中开发出的连接的化合物37表明基于片段的配体发现可以高效地应用于RNA靶标。在2与31之间存在适度的协同性：当2与RNA预结合时，化合物31的结合增强了3到10倍。在连接这两个片段时，观察到其结合能适度的相加性：37的亲和力为625nM。未观察到连接片段2和31的超相加性效应36，这可能是因为没有实现片段的完美定位。接头的长度或几何形状的微小变化导致连接配体的亲和力发生较大变化(图5)，这意味着接头的精确朝向对于最佳地使两个片段朝向非常重要。化合物37的成功开发揭示了没有必要在片段之间的协同性程度或连接其的共价接头的构建上达到完美，以高效地开发亚微摩尔配体。
尽管已经有大量的努力旨在利用片段之间的协同性来获得靶向蛋白质的紧密结合配体，但靶向RNA仍处于起步阶段。探索了所公开的基于SHAPE的筛选策略与先前(以蛋白质为重点)的努力相比与片段的连接相关联的程度。根据连接系数(E)对先前使用基于片段的策略发现的化合物进行排名，所述连接系数是整个系统在连接时一起起作用的效果的量度21，38(图6；在表7中详述)。在不存在正或负影响因素的情况下，两个片段的结合能恰好是相加的，接头是惰性的，并且E等于1.0。协同效应或有利的接头相互作用降低E，并且反协同效应或负接头相互作用增加E。至关重要的是，蛋白质系统中的E值可以按数量级变化。37的连接系数为2.5，略高于学术文献中的连接(蛋白质靶向)配体的平均值。37的配体效率(LE)，即结合的自由能除以非氢原子的数量，与靶向蛋白质的连接片段配体的实例相比是有利的(图6)。通过这些度量，37的性能几乎与TPPc一样好，TPPc是一种与天然TPP核糖开关配体密切相关的配体22。因此，基于片段的配体发现，特别是通过支持SHAPE的复用筛选高效实施的基于片段的配体发现，有很大的希望能够快速开发靶向各种RNA结构的独特配体。
E.制备方法
本公开还涉及用于制备本文所公开的化合物的任何方法。技术人员会意识到此类制备方法可能会有所不同。例如，在一些实施例中，用于制备所公开化合物的方法包括：
使式IV片段：
Figure BDA0003580034520000371
其中
X1、X2和X3独立地选自CHR1、CR1以及杂原子N、NH、O和S，其中相邻X1、X2和X3不同时选为O或S；
虚线表示任选的双键；
Y1、Y2和Y3独立地选自CR2和N；
R1和R2独立地选自-H、-Cl、-Br、-I、-F、-CF3、-OH、-CN、-NO2、-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)2、-COOH、-COO(C1-C6烷基)、-CO(C1-C6烷基)、-O(C1-C6烷基)、-OCO(C1-C6烷基)、-NCO(C1-C6烷基)、-CONHC1-C6(烷基)以及经取代或未经取代的C1-C6烷基；并且
n选自整数1和2，其中当n为1时，所述虚线中仅一条虚线是双键；
与式V-1或V-2片段：
Figure BDA0003580034520000372
其中X是选自F、Br、Cl和I的卤素；
X4、X5、X6和X7独立地选自CR3和N；
R3选自-H、-Cl、-Br、-I、-F、-CF3、-OH、-CN、-NO2、-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)2、-COOH、-COO(C1-C6烷基)、-CO(C1-C6烷基)、-O(C1-C6烷基)、-OCO(C1-C6烷基)、-NCO(C1-C6烷基)、-CONHC1-C6(烷基)以及经取代或未经取代的C1-C6烷基；
m为1或2；并且
W是-O或-NR4，其中R4选自选自-CO(C1-C6烷基)、经取代或未经取代的C1-C6烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的环烷基、-CO(芳基)、-CO(杂芳基)以及-CO(环烷基)，
在存在Pd催化剂的情况下接触。
在一些实施例中，Pd催化剂选自(DPPF)PdCl2、Pd2(dba)3、PdCl2[P(邻甲苯基)3]2、Pd(dba)2和Pd(OAc)2。在一些实施例中，接触步骤进一步包括膦配体。在一些实施例中，膦配体是单齿的。在一些实施例中，膦配体是双齿的。示例性膦配体包含但不限于DPPF、BINAP和rac-BINAP。在一些实施例中，接触步骤进一步包括碱。在一些实施例中，碱是无机的。在一些实施例中，碱是NaOtBu。在一些实施例中，接触步骤纯净地(即，在无溶剂的情况下)进行。在一些实施例中，接触步骤在存在溶剂的情况下进行。在一些实施例中，溶剂是非极性溶剂。示例性溶剂包含但不限于甲苯、苯、二噁烷和四氢呋喃。在一些实施例中，接触步骤在升高的温度下进行。在一些实施例中，接触步骤在50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃或100℃下进行。
在一些实施例中，用于制备所公开化合物的方法包括：
使式IV片段：
Figure BDA0003580034520000381
与式VI-1或VI-2片段：
Figure BDA0003580034520000382
其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、Y1、Y2、Y3、n、m和W如上定义，
在存在还原剂的情况下接触。
在一些实施例中，还原剂可以是任何适用于还原胺化化学的还原剂。示例性还原剂包含但不限于硼氢化物和/或氢化铝。在一些实施例中，还原剂是硼氢化物。在一些实施例中，还原剂是硼氢化钠。在一些实施例中，接触步骤纯净地进行。在一些实施例中，接触步骤在溶剂中进行。示例性溶剂包含但不限于醇类溶剂(例如，甲醇、乙醇、异丙醇)、氯化溶剂(例如，二氯甲烷)和/或醚溶剂(例如，四氢呋喃)。在一些实施例中，接触步骤在室温以下进行。在一些实施例中，接触步骤在升高的温度下进行。
在一些实施例中，用于制备所公开化合物的方法包括：
使式IV片段：
Figure BDA0003580034520000391
与式VII-1或VII-2片段：
Figure BDA0003580034520000392
其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、Y1、Y2、Y3、n、m和W如上定义；并且
G是-F、-Cl、-Br、-OH、-OCH3或-OCH2CH3；
在存在碱的情况下接触。
在一些实施例中，碱是有机的(吡啶和/或三甲胺)。在一些实施例中，碱是无机的(例如，碳酸钾/碳酸钠和/或碳酸氢钾/碳酸氢钠)。在一些实施例中，所述方法进一步包括偶联剂，如DCC和/或EDCI，但不限于此。在一些实施例中，接触步骤纯净地进行。在一些实施例中，接触步骤在存在溶剂的情况下进行。示例性溶剂包含但不限于THF、DCM、ACN和/或DMSO。在一些实施例中，接触步骤在室温下进行。在一些实施例中，接触步骤在升高的温度下进行。
F.组合物
可以将当前公开的化合物与药学上可接受的载体一起调配成药物组合物。
本文公开的化合物可以根据标准药学实践而被调配为药物组合物。根据此方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括与药学上可接受的稀释剂或载体缔合的本文公开的化合物。
典型的调配物通过将本文公开的化合物与载体、稀释剂或赋形剂混合来制备。合适的载体、稀释剂和赋形剂是本领域技术人员公知的，并且包含如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可溶胀性聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等材料。所使用的特定载体、稀释剂或赋形剂将取决于所述化合物的应用方式和用途。溶剂通常基于本领域技术人员认为对于施用于哺乳动物而言为安全(GRAS)的溶剂来选择。一般来说，安全溶剂为无毒水性溶剂，如水和可溶于或可混溶于水中的其它无毒溶剂。合适的水性溶剂包含水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG 400、PEG 300)等及其混合物。调配物还可以包含一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、避光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂以及提供药物(即，本文所公开的化合物或其药物组合物)的优雅呈现或帮助药物产品(即，药物)的制造的其它已知添加剂。
调配物可以使用常规的溶解和混合程序制备。例如，本体药物物质(即本文公开的化合物或所述化合物的稳定形式(例如，与环糊精衍生物或其它已知络合剂的复合物))在存在上述一种或多种赋形剂的情况下溶解在合适的溶剂中。所述化合物通常调配成药物剂型以提供易于控制的药物剂量并使患者能够遵守规定的方案。
用于应用的药物组合物(或调配物)可以根据施用药物所使用的方法以多种方式包装。通常，用于分布的物品包含已经在其中放置呈适当的形式的药物调配物的容器。适合的容器为本领域的技术人员所熟知并且包含如瓶子(塑料和玻璃的)、药囊、安瓿、塑料袋、金属筒等材料。容器还可以包含防拆组合件以防止轻易获取包装的内含物。另外，容器具有放置其上的描述容器的内含物的标签。标签还可以包含适当的警告。
药物调配物可以被制备用于各种途径和类型的施用。例如，如本文公开的具有期望纯度的化合物可以任选地与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂(《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》(1980)第16版，Osol，A.编)以冻干调配物、碾磨粉末或水溶液的形式混合。调配物可以通过在环境温度下在适当的pH下并且在所期望的纯度下与生理学上可接受的载体，即在所采用的剂量以及浓度下对于接受者是无毒的载体相混合完成。调配物的pH主要取决于特定用途以及化合物的浓度，但范围可以是约3到约8。在一种pH为5的乙酸盐缓冲液中的调配物是适合的实施例。
所述化合物可以是无菌的。具体地，用于体内施用的调配物应该是无菌的。此类无菌通过借助于无菌过滤膜过滤而容易地完成。
通常所述化合物可以以固体组合物、冻干的调配物或水溶液的形式储存。
包括本文公开的化合物的药物组合物的调配、给药和施用方式，即，量、浓度、时间表、疗程、媒剂和施用途径，可以与良好的医疗实践相一致。在这一背景下考虑的因素包含所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的起因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间表和开业医生已知的其它因素。要施用的化合物的“治疗有效量”将取决于此类考虑因素并且是预防、改善或治疗凝血因子介导的病症所必需的最小量。此量优选地低于对宿主有毒或使宿主明显更容易出血的量。
可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等缓冲液；包含抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苄烷铵、苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性聚合物；如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；包含葡萄糖、甘露糖或糊精的单糖、二糖和其它碳水化合物；如EDTA等螯合剂；如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇等糖；如钠等成盐抗衡离子；金属络合物(例如，锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。活性药学成分还可以包覆在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶状药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开在《雷明顿药物科学》第16版，Osol，A.编(1980)中。
可以制备化合物的持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包含含有本文公开的化合物的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型物品，例如膜或微胶囊的形式。持续释放基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
所述调配物包含适用于本文描述的施用途径的那些调配物。所述调配物可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过制药领域众所周知的任何方法来制备。通常可以在《雷明顿药物科学》(宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.))中找到技术和调配物。此类方法包含使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载体或精细固体载体或两者均匀充分地缔合并且然后在必要时使产品成形来制备所述调配物。
如本文所公开的适合于口服施用的化合物的调配物可以以离散单位制备，如各自含有预定量的化合物的药片、胶囊剂、扁囊剂或片剂；
可以通过在适合的机器中压制任选地与结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式的活性成分(如粉末或颗粒)来制备压制片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中对用惰性液体稀释剂润湿的粉状活性成分的混合物进行模制来制造。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且任选地被调配以便由此提供活性成分的缓慢或控制释放。
片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊(例如，明胶胶囊)、糖浆或酏剂可以制备供口服使用。如本文所公开的旨在用于口服使用的化合物的调配物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法制备，并且此类组合物可以含有包含甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的一种或多种药剂，以提供可口的制剂。含有与适合用于制造片剂的非毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的片剂是可接受的。例如，这些赋形剂可以是惰性稀释剂，如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，如玉米淀粉或海藻酸；结合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以不包衣或可以通过已知技术包衣，所述技术包含微囊化以延迟在胃肠道中的崩解和吸附，并且因此在较长时间段内提供持续作用。例如，可以单独或与蜡一起采用延时材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
对于眼睛或其它外部组织，例如口腔和皮肤的治疗，调配物可以作为含有例如0.075到20％w/w的量的活性成分的局部软膏或乳膏施加。当调配到软膏中时，所述活性成分可以与石蜡软膏基质或水可混溶的软膏基质一起使用。可替代地，所述活性成分可以用水包油型乳膏基质调配到乳膏中。
若有需要，乳膏基质的水相可以包含多元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，如丙二醇、丁1，3-二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇(包含PEG 400)以及其混合物。这些局部调配物可以期望地包含增强活性成分穿过皮肤或其它受影响区的吸收或渗透的化合物。此类经皮渗透增强剂的实例包含二甲基亚砜和相关类似物。
乳剂的油相可以由已知成分以已知方式构成。虽然所述相可以仅包括乳化剂，但其还可以包括至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油两者的混合物。与亲脂性乳化剂一起被包含在内的亲水性乳化剂可以用作稳定剂。具有或不具有稳定剂的乳化剂一起构成了所谓的乳化蜡，并且所述蜡与所述油和脂肪一起构成了所谓的乳化软膏基质，所述乳化软膏基质形成了乳膏调配物的油性分散相。适合用于调配物的乳化剂和乳化稳定剂包含
Figure BDA0003580034520000431
60、
Figure BDA0003580034520000432
80、十六十八醇、苯甲醇、肉豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯以及月桂基硫酸钠。
化合物的水性悬浮液含有与适合于制造水性混悬液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂包含：悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、交联羧甲基纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；和分散剂或润湿剂，如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇)、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有：一种或多种防腐剂，如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；以及一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
化合物的药物组合物可以呈如无菌可注射水性或油性悬浮液等无菌可注射制剂的形式。此悬浮液可以根据已知技术使用上文已提及的那些适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂来调配。无菌可注射制剂也可以是在如1，3-丁二醇等非毒性的、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。无菌可注射制剂也可以被制备为冻干粉末。可以采用的可接受的媒剂和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油可以常规地用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用包含合成的甘油单酯或甘油二酯在内的任何温和的不挥发性油。另外，如油酸等脂肪酸可以同样用于制备可注射剂。
可以与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量将根据被治疗的主体和特定施用模式而变化。例如，用于口服施用于人的缓释调配物可以含有与适当和方便量的载体材料复混的大约1到1000mg的活性材料，所述适当和方便量可以在总组合物的约5％到约95％(重量∶重量)的范围内变化。药物组合物可以被制备成为施用提供可容易测量的量。例如，旨在用于静脉内输注的水溶液可以含有每毫升溶液约1μg到500μg的活性成分，目的是可以出现以约10毫升/小时到约50毫升/小时的速率输注适合的体积。
适合于肠胃外施用的调配物包含：水性和非水性无菌注射溶液，所述水性和非水性注射溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，所述悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。
适用于局部施用于眼睛的调配物还包含滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体中，尤其是活性成分的水性溶剂中。活性成分优选地以约0.5到20％w/w，例如约0.5到10％w/w，例如约1.5％w/w的浓度存在于此类调配物中。
适合于在口中局部施用的调配物包含：锭剂，所述锭剂包括调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性成分；软锭剂，所述软锭剂包括在惰性基质中的活性成分，所述惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；以及在适合的液体载体中包括活性成分的漱口剂。
用于直肠施用的调配物可以呈现为具有适合的基质(包括例如，可可脂或水杨酸酯)的栓剂形式。
适用于肺内或经鼻施用的调配物具有例如在0.1到500微米范围内的粒度(包含在0.1到500微米范围内、增量为如0.5、1、30微米、35微米等的粒度)，所述调配物通过经鼻通道快速吸入或经口吸入来施用以便到达肺泡囊。适合的调配物包含活性成分的水性或油性溶液。适用于气溶胶或干粉施用的调配物可以根据常规方法制备，并且可以与其它治疗剂一起递送，所述其它治疗剂如至今用于治疗或预防如下描述的病症的化合物。
适用于阴道施用的调配物可以呈现为阴道栓剂、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾调配物的形式，其除了活性成分还含有如本领域已知适当的载体。
所述调配物可以包装于单位剂量或多剂量容器(例如，密封的安瓿瓶和小瓶)中，并且可以在仅需要在使用前一刻添加无菌液体载体(例如，注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。即用型注射溶液和悬浮液由先前所述的种类的无菌粉剂、颗粒和片剂来制备。优选的单位剂量调配物是含有活性成分的如上文所述的每日剂量或单位每日亚剂量、或其适当部分的那些调配物。
所述主题进一步提供了包括至少一种如上所定义的活性成分以及用于其的兽用载体的兽用组合物。兽用载体为适用于施用组合物的目的的材料，并且可以为原本呈惰性或在兽医学领域中可接受的固体、液体或气态材料，并与活性成分相容。这些兽用组合物可以肠胃外、口服或通过任何其它期望途径来施用。
在特定实施例中，包括当前公开的化合物的药物组合物进一步包括化疗剂。在这些实施例中的一些实施例中，化疗剂是免疫治疗剂。
G.治疗方法
本文公开的化合物和组合物还可以在用于治疗各种疾病和/或病症的方法中使用，所述疾病和/或病症已被鉴定为与RNA表达和/或功能的功能障碍有关，或与由mRNA产生的蛋白质的表达和/或功能有关，或与使用小分子切换RNA构型的有用作用有关，或与改变核糖开关的天然功能作为抑制感染性生物体生长的方式有关。如此，本公开的方法涉及治疗与RNA表达和/或功能的功能障碍相关的疾病或病症，或创造新的可切换疗法。参见例如美国专利申请公开第2018/010146号，所述美国专利申请公开特此通过引用整体并入。如此，在一些实施例中，用于治疗本文公开的疾病或病症(例如，与RNA表达和/或功能的功能障碍相关)的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的剂量的本文公开的化合物和/或组合物。
RNA表达的功能障碍的特征在于一个或多个RNA分子的过表达或表达不足。在一些实施例中，所述一个或多个RNA分子与促进待治疗的疾病和/或病症有关。在一些实施例中，RNA分子的特征在于健康细胞机制的一部分，并且因此可以预防和/或改善待治疗的疾病和/或病症。在一些实施例中，待治疗的疾病或病症与和转录、加工和/或翻译相关的RNA功能的功能障碍有关。在一些实施例中，待治疗的疾病或病症与由于RNA分子功能的功能障碍而导致的蛋白质表达不准确有关。在一些实施例中，待治疗的疾病或病症与和基因表达相关的RNA功能的功能障碍有关。在一些实施例中，所述疾病或病症是期望通过将分子与mRNA结合来降低蛋白质表达的疾病或病症。在一些实施例中，所述疾病有利地通过可以使用小分子开启或关闭的疗法来治疗。例如，在一些实施例中，所述疾病或病症是遗传性疾病，其中期望具有开启或关闭治疗基因的表达的能力。
所述待治疗的疾病和病症包含但不限于退行性病症、癌症、糖尿病、自身免疫性病症、心血管病症、凝血病症、眼部疾病、传染病以及由一个或多个基因中的突变引起的疾病。
典型的退行性疾病包含但不限于阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease，AD)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS、卢伽雷氏病(Lou Gehrig′s disease))、癌症、进行性神经性腓骨萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)、慢性创伤性脑病、囊性纤维化、一些细胞色素c氧化酶缺乏症(通常是退行性Leigh综合征的原因)、埃勒斯-当洛综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、进行性骨硬化性纤维发育不良、弗里德希氏共济失调(Friedreich′sataxia)、额颞叶痴呆(FTD)、一些心血管疾病(例如，动脉粥样硬化型心血管疾病，如冠状动脉疾病、主动脉瓣狭窄等)、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington′s disease)、婴儿神经轴索营养不良、圆锥角膜(KC)、球状角膜、脑白质营养不良、黄斑变性(AMD)、马凡氏综合征(Marfan′ssyndrome，MFS)、一些线粒体肌病、线粒体DNA耗竭综合征、多发性硬化症(MS)、多系统萎缩、肌肉萎缩症(MD)、神经元蜡样脂褐质沉积症、尼曼-皮克疾病(Niemann-Pick disease)、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、肺动脉高压、所有朊病毒疾病(克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、致命的家族性失眠等)、进行性核上性麻痹、色素性视网膜炎(RP)、类风湿性关节炎、桑德霍夫病(Sandhoff Disease)、脊髓性肌萎缩(SMA，运动神经元疾病)、亚急性硬化性全脑炎、塔-塞克斯病(Tay-Sachs disease)和血管性痴呆(本身可能不是神经退行性痴呆，但经常与其它形式的退行性痴呆一起出现)。
示例性癌症包含但不限于所有形式的癌、黑色素瘤、母细胞瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，包含但不限于膀胱癌(bladder cancer)、膀胱癌(bladder carcinoma)、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、喉癌、肺癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和甲状腺癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、室管膜瘤、尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌样癌和肾母细胞瘤(维耳姆斯瘤(Wilm′s tumor))。
示例性自身免疫性病症包含但不限于成人史提尔氏病(Adult Still′sdisease)、血中丙球蛋白贫乏、斑秃、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征、自身免疫性血管水肿、自身免疫性家族性自主神经异常、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳疾病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性荨麻疹、轴突和神经元神经病(AMAN)、Baló病(Baló disease)、白塞病(Behcet′s disease)、良性黏膜类天疱疮、大疱性类天疱疮、卡斯特曼病(Castleman disease，CD)、腹腔疾病、查加斯病(Chagasdisease)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿综合征(Churg-Strauss syndrome，CSS)或嗜酸性粒细胞肉芽肿病(EGPA)、瘢痕性天疱疮、科干综合征(Cogan′s syndrome)、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合征、克罗恩病(Crohn′s disease)、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克氏病(Devic′s disease)(视神经脊髓炎)、盘状狼疮、德勒综合征(Dressler′s syndrome)、子宫内膜异位、嗜酸性食管炎(EoE)、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、混合性冷凝球蛋白血症、伊文综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛、纤维化性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、血管球性肾炎、肺出血肾炎综合征(Goodpasture′s syndrome)、肉芽肿合并多血管炎、格雷夫斯病(Graves′disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(PG)、化脓性汗腺炎(HS)(痤疮)、低丙球蛋白血症、IgA肾病、IgG4相关硬化性疾病、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、幼年型关节炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线性IgA病(LAD)、狼疮、慢性莱姆病(Lyme disease chronic)、美尼尔氏病(Meniere′sdisease)、显微镜下多发性血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren′s ulcer)、穆哈二氏病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病变(MMN)或MMNCB、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性嗜睡病、新生儿狼疮、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性天疱疮、视神经炎、复发性风湿症(PR)、PANDAS、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕罗综合征(Parry Romberg syndrome)、睫状体扁平部炎(周边葡萄膜炎)、帕森那-特纳综合征(Parsonage-Turner syndrome)、天疱疮、周围神经病变、静脉周围脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、结节性多发性动脉炎、I、II、III型多腺体综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、牛皮癣、银屑病关节炎、纯红细胞再生障碍性贫血(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺现象(Raynaud′s phenomenon)、反应性关节炎、反射性交感神经营养不良、复发性多软骨炎、多动腿综合征(RLS)、腹膜后纤维化、风湿热、类风湿关节炎、结节病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、硬皮病、干燥综合征(
Figure BDA0003580034520000471
syndrome)、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac′s syndrome)、交感性眼炎(SO)、大动脉炎(Takayasu′s arteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、痛性眼肌麻痹综合征(Tolosa-Huntsyndrome，THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和小柳原田病(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)。
示例性心血管病症包含但不限于冠状动脉疾病(CAD)、心绞痛、心肌梗死、中风、心脏病发作、心力衰竭、高血压性心脏病、风湿性心脏病、心肌病、心律失常、先天性心脏病、瓣膜性心脏病、心脏炎、主动脉瘤、外周动脉疾病、血栓栓塞性疾病和静脉血栓形成。
示例性凝血病症包含但不限于血友病、血管性血友病(von Willebranddisease)、弥散性血管内凝血、肝病、循环抗凝剂过度发育、维生素K缺乏、血小板功能障碍和其它凝血缺陷。
示例性眼部疾病包含但不限于黄斑变性、眼球突出、白内障、巨细胞病毒性视网膜炎(CMV retinitis)、糖尿病性黄斑水肿、青光眼、圆锥角膜、眼高压、眼偏头痛、视网膜母细胞瘤、结膜下出血、翼状胬肉、角膜炎、干眼和角膜擦伤。
示例性传染病包含但不限于急性弛缓性脊髓炎(AFM)、无形体病、炭疽、巴贝虫病、肉毒中毒、布鲁氏菌病、弯曲杆菌病、碳青霉烯类耐药感染(CRE/CRPA)、软下疳、基孔肯雅病毒感染(基孔肯雅热)、衣原体、鱼肉毒(有害藻华(HAB))、艰难梭菌感染、产气荚膜梭状芽胞杆菌(ε毒素(Epsilon Toxin))、球孢子菌病真菌感染(谷热)、COVID-19(2019年冠状病毒病)、克雅士费尔特-雅各布疾病(Creutzfeldt-Jacob Disease)、传染性海绵状脑病(CJD)、隐孢子虫病(隐性)、环孢子虫病、登革热、1，2，3，4(登革热)、白喉、大肠杆菌感染、产志贺毒素(STEC)、东部马脑炎(EEE)、埃博拉出血热(埃博拉)、埃里希氏体病、脑炎、虫媒病毒或类感染、肠道病毒感染、非脊髓灰质炎(非脊髓灰质炎肠道病毒)、肠道病毒感染、D68(EV-D68)、贾第鞭毛虫病(贾第鞭毛虫)、鼻疽病、淋球菌感染(淋病)、腹股沟肉芽肿、乙型流感嗜血杆菌病(Hib或H-流感)、汉坦病毒肺综合征(HPS)、溶血性尿毒症综合征(HUS)、甲型肝炎(Hep A)、乙型肝炎(Hep B)、丙型肝炎(Hep C)、丁型肝炎(Hep D)、戊型肝炎(Hep E)、疱疹、带状疱疹、带状疱疹VZV(带状疱疹(Shingles))、组织胞浆菌病感染(组织胞浆菌病)、人类免疫缺陷病毒/AIDS(HIV/AIDS)、人类乳突病毒(HPV)、流行性感冒(流感)、铅中毒、军团杆菌病(军团病)、麻风病(汉森病(Hansens Disease))、钩端螺旋体病、李斯特菌病(Listeriosis)(李斯特菌(Listeria))、莱姆病(Lyme Disease)、性淋巴肉芽肿感染(LGV)、疟疾、麻疹、类鼻疽病、脑膜炎、病毒(脑膜炎，病毒)、脑膜炎球菌病、细菌(脑膜炎，细菌)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、腮腺炎、诺如病毒(Norovirus)、麻痹性贝类中毒(麻痹性贝类中毒、鱼肉毒)、虱病(虱子、头虱和体虱)、盆腔炎性疾病(PID)、百日咳(Pertussis)(百日咳(Whooping Cough))、鼠疫；腹股沟腺炎、败血症、肺炎(鼠疫)、肺炎球菌病(肺炎)、小儿麻痹症(脊髓灰质炎)、波瓦森(Powassan)、鹦鹉病(鹦鹉热)、虱病(蟹类；阴虱感染)、脓疱疹疾病(天花、猴痘、牛痘)、Q热、狂犬病、蓖麻毒素中毒、立克次体病(落基山斑疹热)、风疹、包含先天性(德国麻疹)、沙门氏菌病胃肠炎(沙门氏菌(Salmonella))、疥疮感染(疥疮)、鲭鱼毒素(Scombroid)、脓毒性休克(败血症)、严重急性呼吸综合征(SARS)、志贺氏菌病胃肠炎(志贺氏菌(Shigella))、天花、葡萄球菌感染、耐甲氧西林(MRSA)、葡萄球菌食物中毒、肠毒素-B类中毒(葡萄球菌食物中毒)、葡萄球菌感染、万古霉素中间体(VISA)、葡萄球菌感染、耐万古霉素(VRSA)、A组(侵袭性)链球菌病(链球菌A(侵袭性))、B组链球菌病(链球菌-B)、链球菌中毒性休克综合征STSS、毒性休克(STSS、TSS)、梅毒(原发性、继发性、早期潜伏、晚期潜伏、先天性)、破伤风感染、破伤风(牙关紧闭)、滴虫病(滴虫感染)、毛发病感染(旋毛虫病)、结核病(TB)、结核病(潜伏性)(LTBI)、兔热病(兔热)、伤寒(D组)、斑疹伤寒、阴道病、细菌(酵母菌感染)、蒸汽吐烟相关肺损伤(电子烟相关肺损伤)、水痘(Varicella)(水痘(Chickenpox))、霍乱弧菌(霍乱)、弧菌病(弧菌)、病毒性出血热(埃博拉(Ebola)、拉沙(Lassa)、马尔堡(Marburg))、西尼罗河病毒(WestNile Virus)、黄热病、耶尔森氏菌(Yersenia)(耶尔森氏菌属(Yersinia))和寨卡病毒感染(寨卡病毒(Zika))。
实例
实例1：RNA的构建体设计和制备
筛选构建体被设计成允许并入各种一个或多个内部靶RNA基序。构建体中存在两个基序：TPP核糖开关结构域27和来自登革热病毒的5′-UTR的假结26。使用RNA结构评估完整构建体序列的设计，所述完整构建体序列包含结构盒、RNA条形码螺旋和两个测试RNA结构(由六核苷酸接头分离)39。为了降低两种测试结构相互作用的可能性，进行了少量的序列改变以阻止通过RNA结构预测的错误折叠结构，同时保留天然折叠(图7)。通过SHAPE-MaP确认最终构建体的结构。
RNA条形码被设计成折叠成独立的发夹(图7)。在完整构建体序列的背景下计算并折叠RNA条形码的所有可能排列，并且从集合中去除任何可能与RNA构建体的另一部分相互作用的条形码。条形编码的构建体通过SHAPE-MaP使用“无配体”方案来探测并使用具有SHAPE反应性约束的RNA结构进行折叠，以确认条形码螺旋折叠成期望的独立发夹。
RNA的制备
用于体外转录的DNA模板(集成DNA技术(Integrated DNA Technologies))编码靶构建体序列(含有登革热假结序列、单链接头和TPP核糖开关序列)和侧接的结构盒25：5′GTGGG CACTT CGGTG TCCAC ACGCG AAGGA AACCG CGTGT CAACT GTGCA ACAGC TGACA AAGAGATTCC TAAAA CTCAG TACTC GGGGT GCCCT TCTGC GTGAA GGCTG AGAAA TACCC GTATC ACCTGATCTG GATAA TGCCA GCGTA GGGAA GTGCT GGATC CGGTT CGCCG GATCA ATCGG GCTTC GGTCC GGTTC-3′(SEQ ID NO：1)。引物结合位点带有下划线。在单独的PCR反应中使用含有独特RNA条形码和T7启动子序列的正向PCR引物将RNA条形码分别添加到96个构建体中的每个构建体中。具有以粗体显示的条形码核苷酸和带有下划线的引物结合位点的样品正向引物序列是：
Figure BDA0003580034520000501
Figure BDA0003580034520000502
(SEQ ID NO：2)。
使用200μM dNTP混合物(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、500nM正向引物、500nM反向引物、1ng DNA模板、20％(v/v)Q5反应缓冲液和0.02U/μL Q5热启动高保真聚合酶(新英格兰生物实验室)通过PCR对DNA进行扩增以创建用于体外转录的模板。对DNA进行纯化(PureLink Pro 96 PCR纯化试剂盒；英杰公司(Invitrogen))并且将其在Tecan Infinite M1000Pro酶标仪上进行定量(Quant-iT dsDNA高灵敏度测定试剂盒；英杰公司)。
以96孔板形式进行体外转录，其中每个孔含有100μL总反应体积。每个孔含有5mMNTP(新英格兰生物实验室)、0.02U/μL无机焦磷酸酶(酵母，新英格兰生物实验室)、含0.05mg/mL T7聚合酶的25mM MgCl2、40mM Tris，pH8.0、2.5mM亚精胺、0.01％Triton、10mMDTT和200-800nM的唯一条形编码DNA模板(通过PCR生成)。将反应在37℃下温育4小时；然后在0.04U/μL的最终浓度下用TurboDNA酶(不含RNA酶，英杰公司)处理；在37℃下温育30分钟；然后第二次添加DNA酶到0.08U/μL的总最终浓度，并在37℃下另外温育30分钟。通过添加EDTA到50mM的最终浓度并置于冰上来停止酶促反应。将RNA以96孔形式纯化(AgencourtRNAclean XP磁珠；贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))并且重新悬浮于10mM Tris pH8.0、1 mM EDTA中。在Tecan Infinite M1000 Pro酶标仪上对RNA浓度进行定量(Quant-iTRNA广程测定试剂盒；英杰公司)，并且将每个孔中的RNA单独稀释到1pmol/μL。将RNA储存在-80℃下。
实例2：小分子片段的化学修饰和筛选
片段以片段筛选文库的形式从Maybridge获得，所述片段筛选文库是其Ro3多样性片段文库的子集并且含有溶解在DMSO中的50mM下的1500种化合物。这些化合物中的大多数化合物都遵循片段化合物的“三法则(rule of three)”；具有＜300Da的分子量，含有≤3个氢键供体和≤3个氢键受体，以及ClogP≤3.0。除实例5中列出的化合物外，所有用于ITC的化合物均购自密理博-西格玛(Millipore-Sigma)并且在不进行进一步纯化的情况下使用。在配备有8通道空气位移移液臂、一次性过滤器尖端、机器人操纵器臂和EchoTherm RIC20遥控加热/冷却干浴(多利松科学(Torrey Pines Scientific))的Tecan Freedom Evo-150液体处理机上以96孔板形式在25μL中进行筛选实验。可根据要求获得用于筛选的液体处理机程序。
对于第一片段配体筛选，在4℃冷却块上将每孔5pmol的RNA在不含RNA酶的水中稀释到19.6μL。然后将板在95℃下加热2分钟，随后在4℃下立刻快速冷却5分钟。向每个孔中添加19.6μL的2×折叠缓冲液(最终浓度50mM，HEPES pH 8.0、200mM乙酸钾和10mM MgCl2)，并将板在37℃下温育30分钟。对于第二片段配体筛选，将每孔24.3μL折叠RNA添加到2.7μL含初级结合片段的DMSO中，至片段的10×Kd的最终浓度，并将样品在37℃下温育10分钟。为了将靶RNA与片段组合，将24.3μL的RNA溶液或RNA加初级结合片段添加到含有2.7μL的10×筛选片段的孔中(在DMSO中以产生1mM的最终片段浓度)。将溶液通过移液彻底混合并在37℃下温育10分钟。对于SHAPE探测，在37℃加热块上将来自筛选板的每个孔的22.5μL的RNA-片段溶液添加到含2.5μL的10×SHAPE试剂的DMSO中，并通过移液快速混合以实现SHAPE试剂与RNA的均匀分布。在适当的反应时间之后，将样品放置在冰上。对于第一片段筛选，使用1-甲基-7-硝基靛红酸酐(1M7)作为SHAPE试剂，最终浓度为10mM，反应5分钟。对于第二片段筛选，使用5-硝基靛红酸酐(5NIA)40作为SHAPE试剂，最终浓度为25mM，反应15分钟。使用AutoScreen-A 96孔板(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))去除过量的片段、溶剂和水解的SHAPE试剂，并将来自96孔板的每个孔中的5μL经修饰的RNA汇集到每个板的单个样品中以进行测序文库制备。
每个筛选由19个片段测试板、含有阳性(片段2，最终浓度1mM)和阴性(溶剂，DMSO)对照的分布的两个板以及用溶剂(DMSO)而不是SHAPE试剂处理的一个阴性SHAPE对照板组成。对于命中验证实验，每个命中片段的孔位置被改变以控制孔位置和RNA条形码效应。还可获得用于初级筛选和次级筛选的板图。
一旦测试片段的筛选完成，就进行统计测试以鉴定给定核苷酸的修饰率的差异。具体而言，筛选分析需要对给定核苷酸在存在片段的情况下与不存在片段的情况下的修饰率进行统计比较。对于每个核苷酸，给定反应中的修饰数量是具有已知方差的泊松过程；因此，可以通过执行两个泊松计数比较检验来确定观察到的两个样品之间修饰率差异的统计显著性31。也就是说，如果测试核苷酸的m1个修饰是在样品1中的n1个读段中进行计数的并且m2个修饰是在样品2中的n2个读段中进行计数的，则测试的虚假设预测，在所有计数的修饰(m1+m2)中，样品1中的修饰比例将为p1＝n1/(n1+n2)。此假设的Z检验为：
Figure BDA0003580034520000521
Figure BDA0003580034520000522
z＝min(|Zp|，|Zn|)
如果Z值超过指定的显著性阈值，则测试的核苷酸被认为受到测试片段存在的统计学显著影响。
接下来，对于每个片段，必须对包括RNA序列的大量核苷酸进行Z检验，从而增加假阳性的可能性。虽然可以通过提高Z显著性阈值来最小化每个核苷酸的SHAPE反应性的假阳性分配的数量，但这种方法会降低筛选的灵敏度(这意味着它会降低检测较弱结合配体的能力)。为了减少进行的Z检验的次数，此类测试仅应用于所关注的区域中的核苷酸，而不是RNA筛选构建体中的所有核苷酸。对于RNA的登革热基序，所关注的区域是位置59-110；对于TPP基序，所关注的区域是位置100-199。通过在两个样品中省略具有低修饰率的核苷酸，进一步减少了z检验的次数。将考虑到核苷酸具有低修饰率的阈值设置为板平均修饰率的25％，所述板平均修饰率是在给定板的所有96个孔中的所有核苷酸上计算的。Z检验仅对那些在两个比较样品中的至少一个样品中修饰率超过此25％阈值的核苷酸进行。
理想情况下，两个比较样品中条件之间的唯一差异是一个样品中存在片段，但在另一个样品中不存在片段。相互测试阴性对照样品可以用于衡量可能引入核苷酸修饰率的跨样品变异性的不受控制因素的普遍性。例如，如果Z显著性阈值设置为2.7，则在不存在任何此类因素的情况下，从理论上讲，应用于阴性对照(无片段)样品对的Z检验应鉴定概率P＝0.0035的差异反应性核苷酸。然而，当将Z检验应用于从初级筛选中测试的587个阴性对照样品中随机选择的阴性对照样品对时，实际概率高90倍，其中P＝0.32。因此，在不存在片段的情况下，单独的核苷酸处的SHAPE反应性存在统计学上显著的变异性。
虽然大多数复制物具有基本上相同的谱，但存在相当多的具有不同谱的复制物；一些决定系数低至0.85。将Z检验应用于不同阴性对照样品产生其中核苷酸被错误地分类为差异反应性的大量实例。为了避免这一结果，将每个样品与五个最高度相关的阴性对照样品进行比较。对Z显著性阈值为2.7的阴性对照的此类选择性对应用Z检验鉴定出概率P＝0.067的差异反应性核苷酸。
此概率比理论P＝0.0035高约20倍，表明样品处理中存在变异性。这种变异性的一些在样品中所有RNA的所有核苷酸的反应性上相等地缩放。这种变异性可以通过缩小反应性较强的样品中的整体反应性来去除，以便与反应性较低的样品中的整体反应性相匹配。此类缩放是通过以下来执行的：(i)针对RNA序列中的每个核苷酸计算其在反应性较强的样品中的修饰率与在反应性较低的样品中的修饰率的比率，以及(ii)将反应性较强的样品中所有核苷酸的修饰率除以步骤(i)中获得的比率的中位数。相关最大化的阴性对照孔对的此类缩放将发现核苷酸命中的概率降低到P＝0.030，比理论概率高9倍。因此，将发生片段的假阳性鉴定，如实际上在所有高通量筛选测定中发生的一样，并且通过重复SHAPE验证和使用ITC的直接配体结合测量来区分来自非配体变异的实际片段命中。
由于有效配体预期会影响靶RNA中多个核苷酸的修饰率，因此只有当反应性与阴性对照中的反应性不同的核苷酸的数量超过设置为2的定义阈值时，片段才被认为是命中。其次，当寻找片段对RNA的相对稳健的影响时，核苷酸反应性的微小相对差异，即使是统计学显著的，也被排除在差异反应性核苷酸的总计数之外。在实践中，最小可接受的差异设置为平均值的20％：
|r1-r2|/(r1+r2)/2＝0.2，
其中r1和r2是两个样品中的核苷酸修饰率。第三，将给定的样品针对与其最高度相关的五个阴性对照样品进行测试。所有五项测试都需要发现测试样品相对于阴性对照样品发生了变化。
最后，通过选择Z显著性阈值来控制筛选的灵敏度和特异性。在多个Z显著性阈值设置下执行对含有片段的样品和所有阴性对照样品的评估。对于每个此类设置，假阳性分数(FPF)被计算为发现被改变的阴性对照样品的分数，并且配体分数(LF)通过从含有片段的改变样品的分数中减去FPF来估算。LF与FPF之间的平衡由它们的比率LF/FPF来定量。TPP核糖开关RNA的最佳平衡(LF/FPF≈1.3)在范围为2.5到2.7的Z显著性阈值下实现，在所述Z显著性阈值下，0.022＞FPF＞0.014。对于登革热假结，最佳平衡(LF/FPF≈4)在范围为2.5到2.65的Z显著性阈值下实现，在所述Z显著性阈值下，0.007＞FPF＞0.005。
实例3：文库制备和测序
对100μL体积中汇集的经修饰的RNA进行逆转录。向71μL汇集的RNA中添加6μL逆转录引物以达到150nM引物的最终浓度，并将样品在65℃下温育5分钟，然后放置于冰上。向此溶液中添加6μL 10×第一链缓冲液(500mM Tris pH 8.0、750mM KCl)、4μL 0.4M DTT、8μLdNTP混合物(每个10mM)和15μL 500mM MnCl2，并将溶液在42℃下温育2分钟，然后添加8μLSuperScript II逆转录酶(英杰公司)。将反应在42℃下温育3小时，然后在70℃下热灭活10分钟，然后放置于冰上。将所得的cDNA产物纯化(Agencourt RNAClean磁珠；贝克曼库尔特公司)，洗脱到不含RNA酶的水中，并储存在-20℃下。逆转录引物的序列为5′-CGGGC TTCGGTCCGG TTC-3′(SEQ ID NO：3)。
使用两步PCR反应以扩增DNA并添加必要的TruSeq衔接子来制备DNA文库以进行测序24。使用200μM dNTP混合物(新英格兰生物实验室)、500nM正向引物、500nM反向引物、1ngcDNA或双链DNA模板、20％(v/v)Q5反应缓冲液(新英格兰生物实验室)和0.02U/μL Q5热启动高保真聚合酶(新英格兰生物实验室)通过PCR对DNA进行扩增。通过亲和纯化去除过量的未并入的dNTP和引物(Agencourt AmpureXP磁珠；贝克曼库尔特公司；样品与珠比率为0.7∶1)。在Qubit荧光计(英杰公司)上对DNA文库进行定量(Qubit dsDNA高灵敏度测定试剂盒；英杰公司)，检查所述DNA文库的质量(Bioanalyzer 2100芯片上电泳仪；安捷伦公司(Agilent))，并在Illumina NextSeq 550高通量测序仪上对所述DNA文库进行测序。
SHAPE-MaP文库制备扩增子特异性正向引物为5′-CCCTA CACGA CGCTC TTCCGATCTN NNNNG GCCTT CGGGC CAAGG A-3′(SEQ ID NO：4)。SHAPE-MaP文库制备扩增子特异性反向引物为5′-GACTG GAGTT CAGAC GTGTG CTCTT CCGAT CTNNN NNTTG AACCG GACCG AAGCC CGATT T-3′(SEQ ID NO：5)。与RNA筛选构建体重叠的序列带有下划线。
实例4：等温滴定量热法
在不含RNA酶的条件下使用Microcal PEAQ-ITC自动化仪器(马尔文分析(MalvernAnalytical))进行ITC实验41。使用离心浓度(Amicon Ultra离心过滤器，10K MWCO，密理博-西格玛)将体外转录的RNA交换到含有100mM CHES，pH 8.0、200mM乙酸钾和3mM MgCl2的折叠缓冲液中。将配体以所需RNA实验浓度的10-20倍的浓度溶解到相同的缓冲液中(以最小化配体添加到RNA中时的混合热)。对RNA浓度进行定量(Nanodrop UV-VIS分光光度计；赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))，将RNA浓度在缓冲液中稀释到预期Kd的1-10倍，并将稀释的RNA重新定量以确认最终的实验RNA浓度。将在折叠缓冲液中稀释的RNA在65℃下加热5分钟，在冰上放置5分钟，并在37℃下折叠15分钟。如果需要的话，则通过以结合配体的所需终浓度的10倍添加0.1体积来将初级结合配体(例如，2)预结合到RNA上，然后在室温下温育10分钟。
每个ITC实验涉及两次运行：一次是将配体滴定到RNA中(实验迹线)，并且另一次是将相同的配体滴定到缓冲液中(对照迹线)。使用以下参数进行ITC实验：25℃细胞温度，8微卡/秒参考功率，750RPM搅拌速度，高反馈模式，0.2μL初始注射，随后19次2μL的注射。每次注射需要4秒才能完成，并且注射之间有180秒的间隔。
使用MicroCal PEAQ-ITC分析软件(马尔文分析)分析ITC数据。首先，手动调整每个注射峰的基线，以解决任何错误选择的注射终点。其次，通过点对点减法从实验迹线中减去对照迹线。第三，使用列文伯格-马夸尔特算法(Levenberg-Marquardt algorithm)将最小二乘回归线拟合到数据中。在弱结合配体(＞500μM)的情况下，手动将N设置为1.0以实现低c值曲线的拟合。
实例5：测试化合物35、36、37、38、39和40的化学合成。
Figure BDA0003580034520000551
化合物35：3-C连接的异羟肟酸35由羧酸S19通过混合的酸酐中间体与含水羟胺反应来制备。酸S19通过用环化酸酐二氢呋喃-2，5-二酮处理喹喔啉-6-胺来获得。
Figure BDA0003580034520000552
化合物36：2-C连接的类似物36由对应的酯S20通过与原位形成的羟胺反应来获得。酯S20是通过喹喔啉-6-胺与丙烯酸乙酯的迈克尔加成来制得的。
Figure BDA0003580034520000553
化合物37：布赫瓦尔德-哈特维希反应(Buchwald-Hartwig reaction)用于合成中间体S21和S22。用含HCl的乙醚去除保护基(Boc)，然后用Na2CO3进一步处理以得到37。
Figure BDA0003580034520000561
化合物38：亚胺的形成和随后硼氢化钠还原喹喔啉-6-甲醛和二胺以得到38。
Figure BDA0003580034520000562
化合物39：使用通过SNAr反应制备的盐酸喹喔啉-6-基甲胺和醛S23的亚胺形成和随后的硼氢化钠还原得到中间体S24，所述中间体用HCl进行(Boc)脱保护后得到39。
Figure BDA0003580034520000563
化合物40：通过用3，5-二溴吡啶进行两次布赫瓦尔德-哈特维希反应，然后用HCl进行(Boc)脱保护制得约束较少的类似物40。
实例6：X射线晶体学
为了评估2的结构变体是否是TPP核糖开关的良好结合候选物，在X射线晶体学研究中研究了化合物17。TPP核糖开关RNA如所描述的那样通过体外转录来制备27。将TPP核糖开关RNA(0.2mM)和17(2mM)在含有50mM乙酸钾(pH 6.8)和5mM MgCl2的缓冲液中在60℃下加热3分钟，在碎冰中快速冷却，并在结晶前在4℃下温育30分钟。对于结晶，将1.0μL的RNA-17配合物与含有0.1M乙酸钠(pH 4.8)、0.35M乙酸铵和28％(v/v)PEG4000的1.0μL储液槽溶液混合。在291K下通过悬滴蒸气扩散在2周内进行结晶。在液氮中快速冷冻之前，在补充有15％甘油的母液中对晶体进行冷冻保护。数据是在NSLS-II(布鲁克海文国家实验室(Brookhaven National Laboratory))的0.9202A波长下的17-ID-2(FMX)光束线上收集的。数据用HKL200043处理。所述结构通过分子置换使用Phenix44和2GDI核糖开关RNA结构来进行解析27。所述结构在Phenix中进行了改进。在改进后期，基于Fo-Fc和2Fo-Fc电子密度图添加有机配体、水分子和离子。
结果表明，化合物17以类似于TPP配体的硫胺素部分的方式结合TPP核糖开关，从而堆叠在J3/2结中的G42与A43之间(图3)27，28。17与RNA形成三个氢键：各自到G40的核糖和沃森-克里克面(Watson-Crick face)的一个氢键以及到G19的核糖的一个氢键。相对于与天然TPP配体复合的RNA，局部RNA结构存在显著变化。在17结合结构中，G72被翻转到TPP配体的焦磷酸酯部分所在的结合位点中。这种结合模式与先前的工作一致，所述工作可视化了在核糖开关结合凹口的硫胺素亚位点中结合的片段的内翻G72朝向17，34。与SAR分析一致，C-6取代基的朝向似乎相对不受与RNA相互作用的阻碍，这意味着此载体将成为片段精制的良好候选物。
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48.
Figure BDA0003580034520000621
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53.Mondal，M.等人天冬氨酸蛋白酶内源性硫胺胃蛋白酶的抑制剂的片段连接和优化：通过动态组合化学促进的基于片段的药物设计(Fragment Linking andOptimization of Inhibitors of the Aspartic Protease Endothiapepsin：Fragment-Based Drug Design Facilitated by Dynamic Combinatorial Chemistry).《应用化学国际版》55，9422-9426(2016)。
54.Swayze，E.E.等人通过MS进行的SAR：一种用于针对结构化RNA靶标的药物先导物发现的基于配体的技术(SAR by MS：A ligand based technique for drug leaddiscovery against structured RNA targets).《药物化学杂志》45，3816-3819(2002)。
序列表
<110> 北卡罗来纳查佩尔山大学（THE UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA AT CHAPELHILL）
<120> RNA靶向配体、其组合物以及其制备和使用方法
<130> LHB2267524P
<150> 62/883,370
<151> 2019-08-06
<150> 63/031,944
<151> 2020-05-29
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 侧接靶序列的结构盒（structure cassette flanking target sequence）
<400> 1
gtgggcactt cggtgtccac acgcgaagga aaccgcgtgt caactgtgca acagctgaca 60
aagagattcc taaaactcag tactcggggt gcccttctgc gtgaaggctg agaaataccc 120
gtatcacctg atctggataa tgccagcgta gggaagtgct ggatccggtt cgccggatca 180
atcgggcttc ggtccggttc 200
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物序列（forward prime sequence）
<400> 2
gaaattacga ctcactatag gtcgcgagta atcgcgaccg gcgctagaga tagtgccgtg 60
ggcacttcgg tgtc 74
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 逆转录引物（reverse transcription primer）
<400> 3
cgggcttcgg tccggttc 18
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 扩增子特异性正向引物（amplicon-specific forward primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(29)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 4
ccctacacga cgctcttccg atctnnnnng gccttcgggc caagga 46
<210> 5
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 扩增子特异性反向引物（amplicon-specific reverse primer）
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(37)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 5
gactggagtt cagacgtgtg ctcttccgat ctnnnnnttg aaccggaccg aagcccgatt 60
t 61
<210> 6
<211> 238
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 靶序列（target sequence）
<400> 6
ggucgcgagu aaucgcgacc gcugcaagag auuguagcgu gggcacuucg guguccacac 60
gcgaaggaaa ccgcguguca acugugcaac agcugacaaa gagauuccua aaacucagua 120
cucggggugc ccuucugcgu gaaggcugag aaauacccgu aucaccugau cuggauaaug 180
ccagcguagg gaagugcugg auccgguucg ccggaucaau cgggcuucgg uccgguuc 238
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 结构盒的部分（portion of structure cassette）
<400> 7
ggucgcgagu aaucgcgacc 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RNA条形码（RNA barcode）
<400> 8
gcugcaagag auuguagc 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 结构盒（structure cassette）
<400> 9
gugggcacuu cgguguccac 20
<210> 10
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DENV假结（DENV pseudoknot）
<400> 10
acgcgaagga aaccgcgugu caacugugca acagcugaca aagagauucc u 51
<210> 11
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TPP核糖开关（TPP riboswitch）
<400> 11
caguacucgg ggugcccuuc ugcgugaagg cugagaaaua cccguaucac cugaucugga 60
uaaugccagc guagggaagu gcug 84
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 结构盒（structure cassette）
<400> 12
gauccgguuc gccggaucaa ucgggcuucg guccgguuc 39

Claims (36)

1.一种具有式(I)结构的化合物：
Figure FDA0003580034510000011
其中
X1、X2和X3在每个实例中独立地选自CR1、CHR1、N、NH、O和S，其中相邻X1、X2和X3不同时选为O或S；
虚线表示任选的双键；
Y1、Y2和Y3在每个实例中独立地选自CR2和N；
n为1或2，其中当n为1时，所述虚线中仅一条虚线是双键；
L选自
Figure FDA0003580034510000012
其中p、q、r和v独立地选自整数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，并且z选自整数1、2、3、4和5；并且
A选自
Figure FDA0003580034510000021
其中X4、X5、X6和X7独立地选自CR3和N；
其中R1、R2和R3独立地选自-H、-Cl、-Br、-I、-F、-CF3、-OH、-CN、-NO2、-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)2、-COOH、-COO(C1-C6烷基)、-CO(C1-C6烷基)、-O(C1-C6烷基)、-OCO(C1-C6烷基)、-NCO(C1-C6烷基)、-CONH(C1-C6烷基)以及经取代或未经取代的C1-C6烷基；
m为1或2；
W是-O或-NR4，其中R4选自选自-H、-CO(C1-C6烷基)、经取代或未经取代的C1-C6烷基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的环烷基、-CO(芳基)、-CO(杂芳基)以及-CO(环烷基)；并且
条件是X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7中的至少两个是N；
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中X1、X2或X3中的至少一个是N。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中n为2。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的化合物，其中在每个实例中，X1、X2和X3中的两个是N。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的化合物，其具有式(II)结构：
Figure FDA0003580034510000022
其中
X2a和X2b独立地选自CR1和N；
X1和X3独立地选自CR1和N；
L和A如针对式(I)所规定的；并且
X1、X2a、X2b和X3中的两个是N。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的化合物，其具有式(III)结构：
Figure FDA0003580034510000031
其中
L和A如针对式(I)所规定的。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的化合物，其中p、q、r和v独立地选自整数0、1、2和3。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的化合物，其中L选自
Figure FDA0003580034510000032
9.根据权利要求1到8中任一项所述的化合物，其中L是
Figure FDA0003580034510000033
10.根据权利要求1到9中任一项所述的化合物，其中q和r为0或1。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的化合物，其中q和r为1。
12.根据权利要求1到10中任一项所述的化合物，其中q为1并且r为0。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的化合物，其中m为1。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的化合物，其中W选自-NH、-O和-N(C1-C6烷基)2。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的化合物，其中W是-NH。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的化合物，其中X4、X5、X6和X7中的至少一个是N。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的化合物，其中X5或X6是N，并且X4和X7两者独立地是CR2。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的化合物，其中A是
Figure FDA0003580034510000041
19.根据权利要求1到18中任一项所述的化合物，其中Y1、Y2和Y3在每个实例中独立地选自CR2和N，其中R1选自-H、-Cl、-Br、-I、-F、-OH和-NH2。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的化合物，其中Y2是N。
21.根据权利要求1到19中任一项所述的化合物，其中Y2是CR2，并且R1选自-H、-F、-OH和-NH2。
22.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有结构：
Figure FDA0003580034510000042
Figure FDA0003580034510000043
或其药学上可接受的盐。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的化合物，其中所述化合物结合到RNA分子的区域。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中所述RNA分子是非编码RNA分子。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中所述非编码RNA分子选自rRNA、微RNA、siRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、exRNA和scaRNA。
26.根据权利要求23所述的化合物，其中所述RNA分子是编码RNA分子。
27.根据权利要求26所述的化合物，其中所述编码RNA分子是mRNA。
28.根据权利要求23所述的化合物，其中所述mRNA的所述区域是核糖开关。
29.根据权利要求28所述的化合物，其中所述核糖开关是TPP核糖开关。
30.根据权利要求23到29中任一项所述的化合物，其中所述化合物表现出约50nM到约100μM的Kd结合亲合力。
31.一种组合物，其包括在药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的治疗有效量的根据权利要求1到30中任一项所述的化合物。
32.一种治疗与RNA表达的功能障碍相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的剂量的根据权利要求1到30中任一项所述的化合物或根据权利要求31所述的组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中由于所述化合物与RNA(例如，mRNA)的结合，施用所述化合物或所述组合物降低了蛋白质表达。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述疾病或病症选自遗传性疾病、退行性病症、癌症、糖尿病、自身免疫性病症、心血管病症、凝血病症、眼部疾病、传染病以及由一个或多个基因中的突变引起的疾病。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病，并且施用所述化合物或所述组合物开启或关闭治疗基因的表达。
36.一种制备根据权利要求1到30中任一项所述的化合物的方法，所述方法包括：
a)在存在Pd催化剂的情况下使式IV片段与式V-1或V-2片段接触；或者
b)在存在还原剂的情况下使式IV片段与式VI-1或VI-2片段接触；或者
c)在存在碱的情况下使式IV片段与式VII-1或VII-2片段接触。
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