JP2022544098A

JP2022544098A - Ｒｎａを標的とするリガンド、それらの組成物、およびそれを作製し使用する方法

Info

Publication number: JP2022544098A
Application number: JP2022507316A
Authority: JP
Inventors: ウィークス，ケビン; オーブ，ジェフリー; リー，ケリン; ゼラー，メレディス
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2019-08-06
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2022-10-17
Also published as: KR20220059472A; CN114901654A; EP4010332A4; EP4010332A1; MX2022001548A; CA3169412A1; US20220289688A1; WO2021026245A1; IL290331A; AU2020326762A1; BR112022002218A2

Abstract

本開示は、ＴＰＰリボスイッチなどの標的ＲＮＡ分子に結合する化合物、これらの化合物を含む組成物、およびそれらを作製し使用する方法を対象とする。本化合物は、２つの異なる結合部位において標的ＲＮＡと結合し、それによって、単一のＲＮＡ結合部位のみに結合する化合物と比較して、より高い親和性の５結合リガンドを産生することを可能にする、２つの構造的に異なる断片を含有する。【選択図】図１

Description

本開示は、ＴＰＰリボスイッチなどの標的ＲＮＡ分子に結合する化合物、これらの化合物を含む組成物、およびそれらを作製し使用する方法を対象とする。本化合物は、２つの異なる結合部位において標的ＲＮＡと結合し、それによって、単一のＲＮＡ結合部位のみに結合する化合物と比較して、より高い親和性の結合リガンドを産生することを可能にする、２つの構造的に異なる断片を含有する。

配列表の引用参照
添付の配列表内の材料は、参照により、その全体が本出願に組み込まれる。ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ３９３９７６００００２＿ＳＴ２５という名称の添付ファイルは、２０２０年８月５日に作成され、４ＫＢである。

政府の支援
本発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって付与された許可番号ＧＭ０９８６６２およびＡＩ０６８４６２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

大部分の小分子リガンドは、主に、タンパク質を標的とすることによって生体系を操作するために開発される。タンパク質は、非常に複雑な三次元構造を有しており、このことは、タンパク質が適切に機能するために重要であり、小分子リガンドが結合することができる窪みおよびポケットを含む^１、２。トランスクリプトームは、生物内で産生されるすべてのＲＮＡ分子のセットであり、生体系を研究し、操作するための有望な標的も含む。例えば、ＲＮＡトランスクリプトームは、哺乳動物系において重要な役割を果たすだけではなく、細菌およびウイルスの両方にも存在し、したがって、小分子が遺伝子発現を調節するための標的を表す。

ＲＮＡは、高度に選択的なリガンドの開発に必要な主要な特徴である^４、タンパク質に匹敵する複雑さを有する三次元構造を採用することができ^３、ＲＮＡは、生体系の挙動を管理する際に一般的な役割を果たす^５ことに留意されたい。元々は、単に、タンパク質コーディングのためのメッセージを伝達し、タンパク質整合性のプロセスを導くためにのみ存在する遺伝情報の担体であるとみられていたが、ＲＮＡの現代の見解は、拡張された役割を包含するように進化しており、現在、多様な範囲のＲＮＡ分子は、様々な機構によって遺伝子発現および他の生物学的プロセスを調節する、広範かつ深遠な役割を有することが理解されている。新たに発見された多数の非コードＲＮＡでさえも、がんおよび非腫瘍原性疾患などの疾患と関連することが見出されている。したがって、ＲＮＡが病原性タンパク質のコーディングとは別に疾患状態に寄与するという認識は、以前には認識されていない豊富な治療標的を提供する。

しかしながら、小分子リガンドがｍＲＮＡに結合することができ、翻訳効率を上方調節または下方調節する可能性を有するため、細胞中のタンパク質発現を調整することができることが示されている^６、７が、タンパク質を標的とするときに直面していない小分子ＲＮＡリガンドの識別には困難がある^{４、１１、１２}。これには、標的の豊富なプールも表す、非コードＲＮＡを対象とする小分子の開発も含まれる^８～１０。残念ながら、ＲＮＡ構造の分析および新たな機能の発見のための種々の技術の開発にもかかわらず、ＲＮＡに結合し、ＲＮＡの機能を乱す阻害剤を効率的かつ迅速に識別または設計する能力は、はるかに遅れている。したがって、ＲＮＡ分子を標的とする小分子リガンドの迅速かつ効率的な識別を可能にする新しい方法および技術を開発することが当該技術分野において非常に必要である。

上で既に述べたように、トランスクリプトームは、小分子リガンドのための、魅力的ではあるが、十分に活用していない標的のセットを表す。メッセンジャーＲＮＡおよび非コードＲＮＡを標的とする小分子リガンド（および最終的には薬物）は、細胞の状態および疾患を調節する可能性を有する。本開示では、プライマー伸長（ＳＨＡＰＥ）およびＳＨＡＰＥ変異プロファイリング（ＭａＰ）ＲＮＡ構造プロービングによって分析された選択的２’－ヒドロキシルアシル化を使用する、断片に基づくスクリーニング戦略を使用して、標的ＲＮＡ構造に結合する小分子断片を開発した。特に、ミリモル濃度からマイクロモル濃度の親和性でＴＰＰリボスイッチに結合する断片および協働して結合する断片対を識別した。高いナノモル濃度の親和性でＴＰＰリボスイッチに結合する、連結した断片リガンドを効率的に設計するための情報を得るために、構造－活性関係（ＳＡＲ）試験を行った。本開示からの原理は、ＴＰＰリボスイッチに限定されることを意味していないが、多様なＲＮＡ標的のための高品質リガンドを開発するための協働性および多部位結合を利用する、他の標的ＲＮＡ構造にも広く適用可能であり得る。

そのため、本開示の主題の一態様は、式（Ｉ）の構造を有する化合物であって、

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、それぞれの場合に、独立して、ＣＲ_１、ＣＨＲ_１、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、およびＳから選択され、隣接するＸ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、同時にＯもしくはＳであるように選択されず、
破線は、任意選択の二重結合を表し、
Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３は、それぞれの場合に、独立して、ＣＲ_２およびＮから選択され、
ｎは、１もしくは２であり、ｎが１である場合、破線のうちの１つだけが二重結合であり、
Ｌは、

から選択され、
式中、ｐ、ｑ、ｒ、およびｖは、独立して、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択され、ｚは、整数１、２、３、４、および５から選択され、
Ａは、

から選択され、
式中、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７は、独立して、ＣＲ_３およびＮから選択され、
Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、独立して、－Ｈ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｆ、－ＣＦ_３、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｏ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＯＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＮＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、および置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキルから選択され、
ｍは、１もしくは２であり、
Ｗは、－Ｏもしくは－ＮＲ_４であり、Ｒ_４は、－Ｈ、－ＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換シクロアルキル、－ＣＯ（アリール）、－ＣＯ（ヘテロアリール）、および－ＣＯ（シクロアルキル）から選択されるから選択され、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７のうちの少なくとも２つがＮであることを条件とする、化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。

本開示の主題のさらなる態様は、ＲＮＡ分子の領域に結合する、本明細書に記載の化合物を含む。

本開示の主題のさらなる態様は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤中に、治療有効量の本明細書に記載の化合物を含む、組成物を含む。

本開示の主題のさらなる態様は、ＲＮＡ発現の機能障害に関連する疾患または障害を治療する方法であって、本方法が、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載の化合物の組成物の用量を投与することを含む、方法を含む。

本開示の主題のさらなる態様は、本明細書に記載の化合物を作製するための方法を含む。

本開示の主題のなおさらなる態様は、以下に提示される。

ＲＮＡスクリーニング構築物および断片スクリーニングワークフローのスキームを示す。ＲＮＡモチーフ１および２、バーコードヘリックス、ならびに構造カセットヘリックスが示される。ＲＮＡは、小分子断片の存在下または非存在下でＳＨＡＰＥを使用してプローブされ、リガンド依存性構造情報に対応する化学修飾は、マルチプレックスＭａＰ配列決定によって読み出される。断片のヒットおよび非ヒットの代表的な変異率の比較を示す。断片に曝露した試料についての正規化された変異率は、＋リガンド、＋２、または＋４とラベル付けされ、リガンドなしとラベル付けされたリガンドを含まないトレースと比較する。変異率の統計的に有意な変化は、三角形を付して示される（ＳＨＡＰＥ確認データについては図８を参照）。（上）試験構築物に結合しない代表的な断片の変異率の比較。（中央）ＲＮＡのＴＰＰリボスイッチ領域にヒットする断片。（下）試験構築物全体にわたって反応性の変化を誘発する、非特異的ヒット。モチーフ１および２のランドマークは、ＳＨＡＰＥプロファイルの下に示される。（図３Ａ）断片１７によって結合されたＴＰＰリボスイッチの構造の、（図３Ｂ）天然ＴＰＰリガンド（２ＨＯＪ^２８）との比較を示す。ＲＮＡ構造は、各画像において、同様の配向で示される。リガンドとＲＮＡとの間の水素結合は、破線として示される。断片２および３１についての熱力学的サイクルおよび段階的リガンド結合親和性を示す。図４Ａは、化合物２（濃灰色、Ｋ_１）断片および化合物３１（淡灰色、Ｋ_２）断片による結合のまとめを示す。ＩＴＣによって決定されたＫ_Ｄ値。図４Ｂは、断片２および３１による単一化合物の結合および協働性の結合を示すＩＴＣデータを示す。この２つの断片を連結すると、結合エネルギーにおいて相加効果を示し、マイクロモル濃度未満のリガンドである化合物３７（Ｋ_Ｌ）が得られる。ＩＴＣトレースは、淡灰色としてのバックグラウンドトレース（緩衝液内で滴定されたリガンド）、濃灰色での実験トレースと共に示される。曲線フィッティングは、灰色の網掛けの９５％信頼区間と共に示されている。リンカーの種類および長さ、末端基の化学型、および末端基の配向の関数として、断片１７および３１の共有結合性の連結を示す。ＲＮＡ結合親和性を増加させる修飾は、化合物３６および３７中に存在し（淡灰色）、負の修飾は、化合物３５、３９、および４０中に存在し（淡灰色）、中性の修飾は、化合物３８中に存在する（淡灰色）。ＩＴＣによって決定される解離定数。その連結係数（Ｅ）によって順序付けられた、断片に基づく方法によって開発された、断片－リンカー－断片リガンドの比較を示す。対数軸上に表示される値。協働性の連結は、より低いＥ値（垂直軸の上部）に対応する。断片３７は、Ｅ値２．５、およびＬＥ値０．３４を示す。個々の断片（左、中央）および連結されたリガンド（右）の解離定数を、構成要素の断片の下に示し、Ｅ値（上）およびリガンド効率（下）が示される。断片間に導入された共有結合性の連結は、淡灰色で強調表示されている。構成要素の断片の構造を表７に詳細に示す。スクリーニング構築物設計を示す。図７Ａは、以下の構成要素を有するＲＮＡ配列（配列番号６）を示す。ＧＧＵＣＧＣＧＡＧＵＡＡＵＣＧＣＧＡＣＣ（配列番号７）は、構造カセットであり、

は、ＲＮＡバーコード（下線が引かれたバーコードＮＴ）であり、ＧＵＧＧＧＣＡＣＵＵＣＧＧＵＧＵＣＣＡＣ（配列番号９）は、構造カセットであり、

は、ＤＥＮＶシュードノット（太字が変異）であり、ＡＡＡＡＣＵは、リンカーであり、

は、ＴＰＰリボスイッチ（太字が変異）であり、ＧＡＵＣＣＧＧＵＵＣＧＣＣＧＧＡＵＣＡＡＵＣＧＧＧＣＵＵＣＧＧＵＣＣＧＧＵＵＣ（配列番号１２）は、構造カセットである。図７Ｂは、その自己折り畳みヘアピンの文脈でＲＮＡ配列バーコードの二次構造を示す。
非ヒット、ヒット、および非特異的ヒット断片のＳＨＡＰＥプロファイルを示す。曝露した断片に対応する変異率トレースおよびリガンドなしの対照トレースは、それぞれ、実線の灰色網掛けおよび黒色の輪郭である。断片対断片なしの試料において統計的に有意に異なると決定されたヌクレオチドは、三角形によって示される。同じ断片についての変異率トレースを、図２に概略的に示す。

本開示の主題を、本明細書で以下により詳細に説明する。しかしながら、本明細書に記載される本開示の主題の多くの修正および他の実施形態は、本開示の主題が関連する分野の当業者に想起され、前述の説明に提示される教示の利益を有する。したがって、本開示の主題は、開示される特定の実施形態に限定されるべきではなく、修正および他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。言い換えると、本明細書に記載の主題は、すべての代替物、修正、および等価物を網羅する。組み込まれた文献、特許、および類似の資料のうちの１つ以上が、定義された用語、用語の使用、記載された技術などを含むが、これらに限定されない本出願とは異なるか、または矛盾する場合には、本出願が制御する。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

定義
本明細書で使用される場合、「アルキル基」という用語は、１～８個、１～６個、１～４個、または５～８個の炭素を含有する飽和炭化水素ラジカルを指す。いくつかの実施形態では、飽和ラジカルは、８個より多い炭素を含有する。アルキル基は、非環状アルカンから１個の水素を除去し、したがって、非水素基またはラジカルの置換によって修飾された非環状アルカン化合物と構造的に類似している。アルキル基ラジカルは、分枝鎖であってもよく、または非分枝鎖であってもよい。低級アルキル基ラジカルは、１～４個の炭素原子を有する。より高級のアルキル基ラジカルは、５～８個の炭素原子を有する。アルキル、低級アルキル、およびより高級のアルキル基ラジカルの例としては、限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃブチル、ｔブチル、アミル、ｔアミル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｉ－オクチルなどのラジカルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「（ＣＯ）」および「Ｃ（Ｏ）」という表記は、カルボニル部分を示すために使用される。好適なカルボニル部分の例としては、限定されないが、ケトン部分およびアルデヒド部分が挙げられる。

「シクロアルキル」という用語は、３～８個の環員または３～７個の環員または３～６個の環員または３～５個の環員または３～４個の環員を有する炭化水素を指し、単環式または二環式であり得る。環は、飽和していてもよく、またはある程度の不飽和度を有していてもよい。シクロアルキル基は、任意選択で、１つ以上の置換基で置換されていてもよい。一実施形態では、シクロアルキル基の各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基によって置換されていてもよい。シクロアルキル基の代表的な例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロブチル、シクロヘプチル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニルなどが挙げられる。

「アリール」という用語は、炭化水素の単環式、二環式または三環式の芳香族環系を指す。アリール基は、任意選択で、１つ以上の置換基で置換されていてもよい。一実施形態では、アリール基の各環の０、１、２、３、４、５、または６個の原子は、置換基によって置換されていてもよい。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニルなどが挙げられる。

「ヘテロアリール」という用語は、ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択され、残りの環原子が炭素である（別段の指示がない限り、適切な水素原子を有する）芳香族５～１０員環系を指す。ヘテロアリール基は、任意選択で、１つ以上の置換基で置換されていてもよい。一実施形態では、ヘテロアリール基の各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フラニル、チエニル、ピローリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、キノリニル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、イソキノリニル、インダゾリルなどが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「置換」という用語は、その部分が、１つ以上の追加の有機または無機の置換基ラジカルに結合している部分（例えば、ヘテロアリール、アリール、アルキル、および／またはアルケニル）を指す。いくつかの実施形態では、置換された部分は、１、２、３、４、または５個の追加の置換基またはラジカルを含む。好適な有機および無機の置換基ラジカルとしては、限定されないが、ヒドロキシル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ヘテロ環式環、置換ヘテロ環式環、アミノ、一置換アミノ、二置換アミノ、アシルオキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、アルキルカルボキサミド、置換アルキルカルボキサミド、ジアルキルカルボキサミド、置換ジアルキルカルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、チオアルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、またはハロアルコキシラジカルが挙げられ、この用語は、本明細書で定義される。本明細書で別段の指示がない限り、有機置換基は、１～４個または５～８個の炭素原子を含み得る。置換された部分が、その上で１個より多い置換基ラジカルと結合している場合、その置換基ラジカルは、同じであってもよく、または異なっていてもよい。

本明細書で使用される場合、「非置換」という用語は、上述の１つ以上の追加の有機または無機の置換基ラジカルに結合していない部分（例えば、ヘテロアリール、アリール、アルケニル、および／またはアルキル）を指し、かかる部分が、水素でのみ置換されていることを意味している。

本明細書に提供される構造および「置換」または「～で置換される」の任意の列挙は、このような構造および置換が、置換された原子および置換基の許容される原子価に従い、かつ置換によって安定した化合物をもたらす、例えば、再配列、環化、脱離などによる変換を自然には受けないという暗黙の条件を含むことが理解されるであろう。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」という用語は、遺伝子のコーディング、デコーディング、調節および発現における様々な生物学的役割に不可欠なポリマー分子であるリボ核酸を指す。ＲＮＡおよびＤＮＡは核酸であり、脂質、タンパク質および炭水化物と共に、すべての既知の形態の生命に不可欠な４つの主要な巨大分子を構成する。ＤＮＡと同様に、ＲＮＡはヌクレオチドの鎖として組み立てられるが、ＤＮＡとは異なり、ＲＮＡは、対になった二本鎖ではなく、それ自体で折り畳まれた一本鎖として自然界に見出される。細胞生物は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して、特定のタンパク質の合成を指令する遺伝情報を伝達する（文字Ｇ、Ｕ、Ａ、およびＣによって示される、グアニン、ウラシル、アデニン、およびシトシンの窒素塩基を使用して）。多くのウイルスは、ＲＮＡゲノムを使用して、その遺伝情報をコードする。いくつかのＲＮＡ分子は、生物学的反応を触媒するか、遺伝子発現を制御するか、または細胞シグナルに対する応答を感知し、伝達することによって、細胞内で能動的な役割を果たす。これらの能動的なプロセスの１つは、ＲＮＡ分子がリボソーム上のタンパク質の合成を指令する普遍的な機能であるタンパク質合成である。このプロセスは、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子を使用して、リボソームにアミノ酸を送達し、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、次いでアミノ酸を一緒に連結して、コードされたタンパク質を形成する。

本明細書で使用される場合、「非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）」という用語は、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ分子を指す。機能的非コードＲＮＡが転写されるＤＮＡ配列は、ＲＮＡ遺伝子と呼ばれることが多い。豊富であり、機能的に重要な種類の非コードＲＮＡとしては、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡｓ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡｓ）、ならびに低分子ＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡｓ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、および長鎖ｎｃＲＮＡ、例えば、ＸｉｓｔおよびＨＯＴＡＩＲが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「コードＲＮＡ」という用語は、タンパク質をコードするＲＮＡ、すなわち、メッセンジャーＲＮＳ（ｍＲＮＡ）を指す。かかるＲＮＡは、トランスクリプトームを含む。

本明細書で使用される場合、「リボスイッチ」という用語は、小分子に結合し、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を変化させる、メッセンジャーＲＮＡ分子の調節セグメントを指す。したがって、リボスイッチを含有するｍＲＮＡは、そのエフェクター分子の濃度に応答して、自身の活性の調節に直接関与する。

本明細書で使用される場合、「ＴＰＰリボスイッチ」という用語は、ＴＨＩエレメントおよびＴｈｉ－ｂｏｘリボスイッチとしても知られており、高度に保存されたＲＮＡ二次構造を指す。チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に直接的に結合して、古細菌、細菌および真核生物における様々な機構を介して遺伝子発現を調節するリボスイッチとして機能する。ＴＰＰは、細菌中のピリミジン部分およびチアゾール部分のカップリングによって合成される必須補酵素である、チアミン（ビタミンＢ１）の活性形態である。

本明細書で使用される場合、「シュードノット」という用語は、１つのステムの半分が、別のステムの２つの半分の間にインターカレーションされる、少なくとも２つのステム－ループ構造を含有する核酸二次構造を指す。シュードノットは、１９８２年にハクサイ黄化モザイクウイルスで初めて認められた。シュードノットは、ノット形状の三次元立体配座に折り畳まれるが、真のトポロジカルノットではない。

「アプタマー」は、高い親和性および特異性で目的の特定の分子に結合することができる核酸分子を指し（ＴｕｅｒｋａｎｄＧｏｌｄ，１９９０、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎａｎｄＳｚｏｓｔａｋ，１９９０）、ヒト遺伝子操作されているか、または天然由来のいずれかであり得る。典型的にはＲＮＡであるアプタマーに対するリガンドの結合は、アプタマーおよびアプタマーが位置する中の核酸の立体配座を変化させる。いくつかの場合に、立体配座の変化は、アプタマーが位置するｍＲＮＡの翻訳を阻害するか、または例えば、他の方法で核酸の正常な活性を妨げる。アプタマーはまた、ＤＮＡから構成されてもよく、または非天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含んでいてもよい。アプタマーは、最も典型的には、標的分子の結合についてのインビトロ選択によって得られるであろう。しかしながら、アプタマーのインビボ選択も可能である。アプタマーは、リボスイッチのリガンド結合ドメインでもある。アプタマーは、典型的には、約１０～約３００ヌクレオチド長である。より一般的には、アプタマーは、約３０～約１００ヌクレオチド長である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９４９，３７９号を参照されたい。本発明に有用なアプタマーの例としては、限定されないが、ＰＳＭＡアプタマー（ＭｃＮａｍａｒａｅｔａｌ．，２００６）、ＣＴＬＡ４アプタマー（Ｓａｎｔｕｌｌｉ－Ｍａｒｏｔｔｏｅｔａｌ．，２００３）、および４－１ＢＢアプタマー（ＭｃＮａｍａｒａｅｔａｌ．，２００７）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ」という用語は、ポリメラーゼ連鎖反応を表し、特定のＤＮＡ試料の数百～数十億のコピーを迅速に作製し、科学者がＤＮＡの非常に小さな試料を採取し、それを詳細に研究するのに十分な多い量まで増幅することを可能にするために、分子生物学で広く使用される方法を指す。

「薬学的に許容される」という語句は、物質または組成物が、化学的および／または毒性額的に、他の成分を含む製剤、および／またはそれらを用いて治療される対象と適合性であることを示す。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という語句は、本発明の化合物の薬学的に許容される有機塩または無機塩を指す。例示的な塩としては、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシル酸塩」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエ酸））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウムおよびカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン、または他の対イオンなどの別の分子の包含を伴ってもよい。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であってもよい。さらに、薬学的に許容される塩は、その構造中に１つより多い帯電した原子を有し得る。複数の帯電した原子が、薬学的に許容される塩の一部である場合、塩は、複数の対イオンを有し得る。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の帯電した原子および／または１つ以上の対イオンを有し得る。

本明細書で使用される場合、「担体」は、使用される投薬量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の非限定的な例としては、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は、天然に存在しない薬学的に許容される担体である。

「治療する」および「治療」という用語は、治療的治療および防止的もしくは予防的測定の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害、例えば、がんの発生または拡散を予防するか、または遅らせる（少なくする）ことである。本発明の目的のために、有益または所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能であるか、検出不可能であるかにかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または遅れ、疾患の状態の改善もしくは緩和、および寛解（部分的または完全な）が挙げられる。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を延長することも意味し得る。治療を必要とするものとしては、既に状態もしくは障害を有するもの、ならびに状態もしくは障害を有する傾向があるもの、または状態もしくは障害が予防されるべきものが含まれる。

「投与」または「投与すること」という用語は、化合物を対象に導入して、それらの意図される機能を発揮する経路を含む。使用され得る投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、くも膜下腔内を含むが、これらに限定されない）、局所、経口、吸入、直腸および経皮が挙げられる。

「有効量」という用語は、所望の結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量を含む。化合物の有効量は、対象の疾患状態、年齢、および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する化合物の能力などの因子に応じて変動し得る。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整されてもよい。

「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」および「末梢投与される」という語句は、本明細書で使用される場合、化合物、薬物、または他の材料が、患者の系に入り、したがって、代謝および他の同様のプロセスを受けるような投与を意味する。

「治療有効量」という語句は、（ｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害を治療もしくは予防する、（ｉｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害の１つ以上の症状を軽減するか、改善するか、もしくはなくす、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、状態、もしくは障害の１つ以上の症状の発症を予防するか、もしくは遅延させる、本発明の化合物の量を意味する。がんの場合、治療有効量の薬物は、がん細胞の数を減少させ、腫瘍のサイズを減少させ、末梢臓器へのがん細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させ）、腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させ）、腫瘍成長をある程度まで阻害し、および／またはがんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度緩和し得る。薬物が、既に存在するがん細胞の成長を予防するか、および／または死滅させ得る程度まで、薬物は、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。がん療法の場合、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価すること、および／または奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。

「対象」という用語は、限定されないが、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む、哺乳動物などの動物を指す。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

本開示は、高い親和性で特定のＲＮＡ領域に結合する小分子の識別に適した、断片に基づくリガンド発見戦略を対象とする。一般に、断片に基づくリガンド発見は、目的の標的に結合する低～中程度の親和性の１つ以上の小分子「断片」の識別を可能にする。次いで、これらの断片を精製するか、または連結するかのいずれかによって、より強力なリガンドを作成する^{１３、１４}。典型的には、これらの断片は、３００Ｄａ未満の分子質量を示し、検出可能に結合するために、目的の標的と実質的に高品質な接触を作製する。

断片に基づくリガンド発見は、所与のＲＮＡに対して結合する単一の断片ヒットである初期ヒット化合物を識別するために、これまで首尾良く用いられてきたに過ぎない^{１５～１９}。同じＲＮＡに結合する複数の断片の識別は、結合ポケット内の断片間の潜在的な相加的および協働性の相互作用を利用することを可能にする^{２０、２１}。しかしながら、多くのＲＮＡが、複数の「サブサイト」を介してそれらのリガンドに結合することが近年示されており、サブサイトは、独立した方法または協働性の方法でリガンドに接触する結合ポケットの領域である^２２。さらに、高親和性ＲＮＡ結合は、サブサイトの結合が弱い協働性効果のみを示す場合であっても生じ得ることが示されている。これらの特徴は、ＲＮＡ標的に適用される断片に基づくリガンド発見開発の有効性のための良好な前兆である。

したがって、上に基づいて、本開示は、例えば、ＴＰＰリボスイッチなどの目的のＲＮＡに結合する断片を識別する方法を対象とする。第２に、開示される方法は、ＲＮＡ中の断片結合の位置を、おおよそヌクレオチド分解能で確立することを対象とする。第３に、開示される方法は、初期断片ヒットの部位付近に結合した第２の部位断片を識別することを対象とする。開示される方法は、断片に基づくリガンド発見アプローチと、ＳＨＡＰＥ－ＭａＰＲＮＡ構造プロービングとを融合させ^{２３、２４}、これを両方とも使用して、ＲＮＡ結合断片を識別し、断片結合の個々の部位を確立した。２つの断片を連結することによって最終的に作成されるリガンドは、天然リボスイッチリガンドとは類似性を有しておらず、構造的に複雑なＴＰＰリボスイッチＲＮＡと高い親和性で結合する。

開示される方法、およびリガンドの識別は、以下により詳細に説明される。

Ａ．化合物
本開示の主題の第１の態様は、式（Ｉ）の構造を有する化合物であって、

から選択され、式中、ｋ、ｐ、ｑ、ｒ、およびｖは、独立して、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択され、ｚは、整数１、２、３、４、および５から選択され、
Ａは、

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_１、Ｘ_２、またはＸ_３のうちの少なくとも１つが、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_１が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_２が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_３が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、それぞれの場合に、Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３のうちの２つが、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_１およびＸ_３が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３のうちの少なくとも１つが、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_１が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_２が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_３が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３のうちの少なくとも１つが、ＣＲ_２である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_１が、ＣＲ_２である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_２が、ＣＲ_２である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_３が、ＣＲ_２である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｎが２である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、式（ＩＩ）の構造を有し、

式中、
Ｘ_２ａおよびＸ_２ｂは、独立して、ＣＲ_１およびＮから選択され、
Ｘ_１およびＸ_３は、独立して、ＣＲ_１およびＮから選択され、
ＬおよびＡは、式（Ｉ）について提供される通りであり、
Ｘ_１、Ｘ_２ａ、Ｘ_２ｂ、およびＸ_３のうちの２つは、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、式（ＩＩＩ）の構造を有し、

式中、
ＬおよびＡは、式（Ｉ）について提供される通りである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｐ、ｑ、ｒ、およびｖが、独立して、整数０、１、２、および３から選択される、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｌが、

から選択される、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｌが、

である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｑおよびｒが、０または１である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｑが１である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｒが１である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｒが０である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｑおよびｒが１である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｑが１であり、ｒが０である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｍが１である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｗが、－ＮＨ、－Ｏ、および－Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）_２から選択される、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｗが、－ＮＨである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７のうちの少なくとも１つが、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_４が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_５が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_６が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_７が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_４およびＸ_６が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_５およびＸ_７が、Ｎである、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｘ_５またはＸ_６が、Ｎであり、Ｘ_４およびＸ_７の両方が、独立して、ＣＲ_２である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ａが、

である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、以下の構造

を有する、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｌが、

である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３が、それぞれの場合に、独立して、ＣＲ_２およびＮから選択され、Ｒ_１が、－Ｈ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｆ、－ＯＨ、および－ＮＨ_２から選択される、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、ｚが２である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ｙ_２が、ＣＲ_２であり、Ｒ_１が、－Ｈ、－Ｆ、－ＯＨ、および－ＮＨ_２から選択される、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、Ａが、

である、化合物。

いずれかの上述の実施形態のように、上述の化合物が、以下の構造

を有する、化合物。

を有する、化合物。

Ｂ．スクリーニング方法
本開示は、プライマー伸長（ＳＨＡＰＥ）に基づく断片スクリーニング方法によって分析された、柔軟性のある選択的２’－ヒドロキシルアシル化の開発および検証を対象とする。断片に基づくリガンド発見は、ＲＮＡを含む巨大分子と実質的に密接な接触を形成する化合物を識別するための有効なアプローチであることが証明されている^{１３、１４、１７}。この発見戦略を成功させるための前提条件は、リガンド結合を検出するための適応可能で高品質の生物物理学的アッセイである。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＨＡＰＥＲＮＡ構造プロービングを利用して、リガンド結合を検出し^{２３～２５}、求電子試薬に対するリボース２’－ヒドロキシル基の相対的反応性として局所的なヌクレオチド柔軟性を測定する。ＳＨＡＰＥを、任意のＲＮＡ上で使用することができ、単一の実験においてＲＮＡ中の実質的にすべてのヌクレオチドに対するデータを提供し、結合を単純に検出することに加えて、ヌクレオチド当たりの構造情報を得て、これを以下により詳細に説明する。加えて、本開示はまた、ＳＨＡＰＥ変異プロファイリング（ＭａＰ）を適用することを対象とし^{２３、２４}、ＳＨＡＰＥと、高スループット配列決定による読み出しとを融合させ、何千もの試料の多重化および効率的な高スループット分析を可能にする。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、目的のＲＮＡ分子に結合し、および／またはそれと関連する小分子断片および／または化合物を識別するためのＳＨＡＰＥおよび／またはＳＨＡＰＥ－ＭａＰを利用するスクリーニング方法を対象とする。本明細書に開示される方法は、別の小分子断片（例えば、断片１）で既に予めインキュベートされたＲＮＡ分子に結合し、および／またはそれと会合する小分子断片（例えば、断片２）を識別するためのＳＨＡＰＥおよび／またはＳＨＡＰＥ－ＭａＰを利用することをさらに含む。理論に束縛されるべきではないが、断片１は、第１の結合部位に結合し、断片２は、同じＲＮＡ分子中の第２の結合部位（例えば、サブサイト）に結合すると考えられている。したがって、断片１および断片２の構造的特徴を組み合わせて（例えば、この２つの断片をリンカーＬで接続して）、本明細書に開示される化合物を生成することで、断片１および／または断片２単独と比較して、ＲＮＡ結合親和性が増加した、連結した断片リガンドをもたらすと考えられる。

スクリーニング方法ＳＨＡＰＥおよびＳＨＡＰＥ－ＭａＰを以下により詳細に説明する。

Ｉ．ＳＨＡＰＥ化学
ＳＨＡＰＥ化学は、ＲＮＡリボースの２’位置の求核性が、隣接する３’－ホスホジエステル基の電子的影響に感受性であるという観察結果に少なくとも部分的に基づく。拘束されていないヌクレオチドは、塩基対になっているか、またはその他の拘束されたヌクレオチドよりも、２’－ヒドロキシル基の求核性を増強する、より多くの立体配座をサンプリングする。したがって、ヒドロキシル選択的求電子剤（例えば、限定されないが、Ｎ－メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ））は、柔軟性のあるＲＮＡヌクレオチドと共に安定な２’－Ｏ付加物をより迅速に形成する。局所的なヌクレオチド柔軟性は、すべてのＲＮＡヌクレオチド（転写後修飾を有するいくつかの細胞ＲＮＡを除く）が２’－ヒドロキシル基を有するため、単一の実験において、ＲＮＡ分子中のすべての位置で同時に調べることができる。２’－ヒドロキシル反応性が、塩基同一性に対して感受性がないため、絶対的なＳＨＡＰＥ反応性を、ＲＮＡ中のすべての位置にわたって比較することができる。ヌクレオチドは、特定の２’－ヒドロキシルの求核性を増強する立体配座に拘束されているため、反応性であり得ることも可能である。この種類のヌクレオチドは、稀であると予想され、非標準的な局所幾何形状を伴い、対になっていない位置として正しくスコアリングされるであろう。

本開示の主題は、いくつかの実施形態では、任意の長さおよび構造的複雑性を有するＲＮＡ分子中の構造的な拘束を調べることによって、ＲＮＡ分子中の構造データを検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、２’－Ｏ－付加物を含有するＲＮＡ分子を、（標識された）プライマーでアニーリングすることと、２’－Ｏ－付加物を含有しないＲＮＡ分子を、陰性対照として（標識された）プライマーでアニーリングすることと、プライマーを伸長してｃＤＮＡのライブラリを生成することと、ｃＤＮＡを分析することと、ＲＮＡについての構造データを含む出力ファイルを生成することと、を含む。

ＲＮＡ分子は、生体試料中に存在し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、タンパク質または他の小さいおよび大きい生物学的リガンドおよび／または化合物の存在下で修飾され得る。プライマーは、任意選択で、放射性同位体、蛍光標識、重原子、酵素標識、化学発光基、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ、またはこれらの組み合わせで標識することができる。分析することは、分離すること、定量化すること、サイズ調整すること、またはそれらの組み合わせを含み得る。分析することは、トレースと呼ばれる、溶出時間データの関数として、蛍光または染料の量データを抽出することを含み得る。例として、ｃＤＮＡは、単一カラムのキャピラリー電気泳動機器で、またはマイクロ流体デバイスで分析することができる。

いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列に対する、２’－Ｏ－付加物を含有するＲＮＡ分子および２’－Ｏ－付加物を含有しないＲＮＡ分子についてのトレースのピーク面積を計算することができる。トレースを、ＲＮＡの配列と比較し、アラインメントすることができる。配列決定によって生成された、これらのｃＤＮＡを観察し、説明するトレースは、２’－Ｏ－付加物を含有するＲＮＡおよび２’－Ｏ－付加物を含有しないＲＮＡ分子についてのトレース中の対応する位置よりも長い１ヌクレオチドである。各ピークの下側の面積は、全トレースのＧａｕｓｓｉａｎフィット積分を行うことによって決定することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、複雑な生体溶液のＲＮＡ分子と共有結合性のリボース２’－Ｏ－付加物を形成するための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、求電子剤とＲＮＡ分子とを接触させることを含み、求電子剤は、ＲＮＡ分子中の拘束されていないヌクレオチドを選択的に修飾し、共有結合したリボース１’－Ｏ－付加物を形成する。

いくつかの実施形態では、求電子剤、例えば、限定されないが、Ｎ－メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ）を、ＤＭＳＯなどの無水極性非プロトン性溶媒に溶解する。試薬－溶媒溶液を、ＲＮＡ分子を含有する複雑な生体溶液に添加する。この溶液は、異なる濃度および量のタンパク質、細胞、ウイルス、脂質、単糖類および多糖類、アミノ酸、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ならびに異なる塩および代謝産物を含有し得る。求電子剤の濃度は、ＲＮＡ分子における所望の修飾度を達成するように調整することができる。求電子剤は、溶液中のすべての遊離ヒドロキシル基と反応する可能性を有しており、ＲＮＡ分子上でリボース２’－Ｏ－付加物を産生する。さらに、求電子剤は、ＲＮＡ分子中の対になっていないか、または他の方法で拘束されていないヌクレオチドを選択的に修飾することができる。

ＲＮＡ分子を、２’－Ｏ－付加物を形成する少ないＲＮＡ修飾を得る濃度で求電子剤に曝露することができ、逆転写酵素によるプライマー伸長を阻害する能力によって検出することができる。この化学が、２’－ヒドロキシル基の一般的な反応性を標的とするため、すべてのＲＮＡ部位を単一の実験で調べることができる。いくつかの実施形態では、バックグラウンドを評価するために求電子剤を省いた対照伸長反応、およびヌクレオチド位置を割り当てるためのジデオキシ配列決定伸長を並行して実施することができる。これらの合わせたステップは、プライマー伸長、またはＳＨＡＰＥによって分析される選択的２’－ヒドロキシルアシル化と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、本方法はさらに、１’－Ｏ－付加物を含有するＲＮＡ分子を、（標識された）プライマーと接触させることと、２’－Ｏ－付加物を含有しないＲＮＡ分子を、陰性対照として（標識された）プライマーと接触させることと、プライマーを伸長してｃＤＮＡの線形アレイを生成することと、ｃＤＮＡを分析することと、ＲＮＡの構造データを含む出力ファイルを生成することと、を含む。

単一のＳＨＡＰＥ実験で調べたヌクレオチドの数は、使用される分離技術の検出および分解能だけでなく、ＲＮＡ修飾の性質にも依存する。反応条件を考慮すると、ほぼすべてのＲＮＡ分子が少なくとも１つの修飾を有する長さが存在する。プライマー伸長が、これらの長さに達すると、伸長するｃＤＮＡの量は減少し、実験シグナルを減衰させる。修飾収率を低下させるように条件を調整すると、リード長さを増加させることができる。しかしながら、試薬収率を下げると、各ｃＤＮＡ長についての測定されたシグナルを減少させることもできる。これらの考慮事項を考慮すると、単一のＳＨＡＰＥリードの好ましい最大長は、おそらく、約１キロベースのＲＮＡであるが、これに限定されるべきではない。

ＩＩ．ＳＨＡＰＥ－ＭａＰ
ＳＨＡＰＥ－ＭａＰでは、ＳＨＡＰＥ付加物は、逆転写酵素がＳＨＡＰＥ化学付加物の部位に非相補的なヌクレオチドを組み込むか、または欠失を生成する能力を活用する変異プロファイリング（ＭａＰ）によって検出される。いくつかの実施形態では、ＳＨＡＰＥ－ＭａＰを、ライブラリ構築および配列決定に使用することができる。いくつかの実施形態では、多重化技術をＳＨＡＰＥ－ＭａＰに使用することができる。

典型的には、ＲＮＡを、立体配座的に動的なヌクレオチドで反応するＳＨＡＰＥ試薬で処理する。逆転写の間、ポリメラーゼは、ＲＮＡ中の化学付加物を通して読み取られ、元々の配列に非相補的なヌクレオチドをｃＤＮＡに組み込む。得られたｃＤＮＡを、任意の超並列アプローチを使用して配列決定し、変異プロファイル（ＭａＰ）を作成する。配列決定リードを参照配列とアラインメントし、ヌクレオチド分解能変異率を計算し、バックグラウンドについて補正し、正規化し、標準的なＳＨＡＰＥ反応性プロファイルを生成する。次いで、ＳＨＡＰＥ反応性を使用して、二次構造をモデル化するか、競合構造および代替構造を可視化するか、または局所的なヌクレオチドＲＮＡ動態を調節する任意のプロセスもしくは機能を定量化することができる。ＲＮＡ分子のＳＨＡＰＥ修飾の後、逆転写酵素を使用して、変異プロファイルを作成する。このステップは、ｃＤＮＡ中の変異としてのＳＨＡＰＥ付加物の位置および相対頻度をコードする。当技術分野で既知の方法（例えば、ＰＣＲ反応）を使用して、ｃＤＮＡをｄｓＤＮＡに変換し、ｄｓＤＮＡを第２のＰＣＲ反応でさらに増幅し、それによって、多重化のための配列決定を追加する。精製後、配列決定ライブラリは、均一なサイズを有し、各ＤＮＡ分子は、目的の配列全体を含有する。

したがって、本開示の主題のいくつかの実施形態によれば、核酸中の１つ以上の化学修飾を検出するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、化学修飾を有することが疑われる核酸を提供することと、ポリメラーゼおよび提供された核酸をテンプレートとして使用して核酸を合成することであって、合成することが、ポリメラーゼが提供された核酸中の化学修飾を通じて読み取られ、それによって化学修飾の部位で得られた核酸中に正しくないヌクレオチドを産生する条件下で起こる、合成することと、正しくないヌクレオチドを検出することと、を含む。

本開示の主題のいくつかの実施形態によれば、核酸中の構造データを検出するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、化学修飾を有することが疑われる核酸を提供することと、ポリメラーゼおよび提供された核酸をテンプレートとして使用して核酸を合成することであって、合成することが、ポリメラーゼが提供された核酸中の化学修飾を通じて読み取られ、それによって化学修飾の部位で得られた核酸中に正しくないヌクレオチドを産生する条件下で起こる、合成することと、正しくないヌクレオチドを検出することと、提供された核酸についての構造データを含む出力ファイルを生成することと、を含む。

本開示の主題のいくつかの実施形態では、提供された核酸は、ＲＮＡ分子（例えば、コードＲＮＡおよび／または非コードＲＮＡ分子）である。いくつかの実施形態では、方法は、２つ以上の化学修飾を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、複数の化学修飾を通じて読み取られ、複数の正しくないヌクレオチドを産生し、本方法は、各々の正しくないヌクレオチドを検出することを含む。

いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ分子）は、化学修飾を提供する試薬に曝露されているか、または化学修飾が、核酸（例えば、ＲＮＡ分子）中に既に存在している。いくつかの実施形態では、既に存在している修飾は、２’－Ｏ－メチル基であり、および／または核酸の由来となる細胞によって作成され、例えば、限定されないが、エピジェネティクス修飾および／または複数の修飾は、１－メチルアデノシン、３－メチルシトシン、６－メチルアデノシン、３－メチルウリジン、および／または２－メチルグアノシンである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子などの核酸は、タンパク質または他の小さいおよび大きい生物学的リガンドおよび／または化合物の存在下で修飾され得る。

いくつかの実施形態では、試薬は、求電子剤を含む。いくつかの実施形態では、求電子剤は、ＲＮＡ分子中の拘束されていないヌクレオチドを選択的に修飾し、共有結合したリボース２’－Ｏ－付加物を形成する。いくつかの実施形態では、試薬は、１Ｍ７、１Ｍ６、ＮＭＩＡ、ＤＭＳ、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、核酸は、生体試料中に存在するか、または生体試料に由来する。

いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、逆転写酵素である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、天然ポリメラーゼまたは変異体ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、合成核酸は、ｃＤＮＡである。

いくつかの実施形態では、正しくないヌクレオチドを検出することは、核酸を配列決定することを含む。いくつかの実施形態では、配列情報は、提供される核酸の配列とアラインメントされる。いくつかの実施形態では、正しくないヌクレオチドを検出することは、核酸に対して超並列配列決定を使用することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、核酸を増幅することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、特異的プライマー、ランダムプライミングを使用する全ゲノム、ランダムプライミングを使用する全トランスクリプトーム、またはそれらの組み合わせを使用する部位特異的アプローチを使用して核酸を増幅することを含む。

本開示の主題のいくつかの実施形態によれば、本開示の主題の任意の実施形態の任意の方法ステップを含むステップを実行する際に、コンピュータ可読媒体に具体化されたコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラム製品が提供される。本開示の主題のいくつかの実施形態によれば、本開示の主題の任意の方法によって生成される核酸ライブラリが提供される。

ＩＩＩ．ＳＨＡＰＥ求電子剤
本明細書で上に開示されるように、ＳＨＡＰＥ化学は、リボース２’－ヒドロキシル基の求核反応性が、局所的なヌクレオチド柔軟性によってゲート制御されるという発見を利用する。塩基対形成または三次相互作用によって拘束されるヌクレオチドで、３’－ホスホジエステルアニオンおよび他の相互作用は、２’－ヒドロキシルの反応性を低下させる。対照的に、柔軟性のある位置は、求電子剤（限定されないが、ＮＭＩＡを含む）と反応して２’－Ｏ－付加物を形成する立体配座を優先的に採用する。例として、ＮＭＩＡは、４つのヌクレオチドすべてと一般的に反応し、試薬は、並列な自己不活性化加水分解反応を受ける。実際に、本開示の主題は、本明細書に開示される核酸と反応することができる任意の分子を、本開示の主題のいくつかの実施形態に従って使用することができることを提供する。いくつかの実施形態では、求電子剤（ＳＨＡＰＥ試薬とも称される）は、限定されないが、イサト酸無水物誘導体、ベンゾイルシアニド誘導体、塩化ベンゾイル誘導体、フタル酸無水物誘導体、ベンジルイソシアネート誘導体、およびそれらの組み合わせから選択され得る。イサト酸無水物誘導体は、１－メチル－７－ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７）を含み得る。ベンゾイルシアニド誘導体は、限定されないが、ベンゾイルシアニド（ＢＣ）、３－カルボキシベンゾイルシアニド（３－ＣＢＣ）、４－カルボキシベンゾイルシアニド（４－ＣＢＣ）、３－アミノメチルベンゾイルシアニド（３－ＡＭＢＣ）、４－アミノメチルベンゾイルシアニド、およびこれらの組み合わせを含む群から選択され得る。塩化ベンゾイル誘導体は、塩化ベンゾイル（ＢＣｌ）を含み得る。フタル酸無水物誘導体は、４－ニトロフタル酸無水物（４ＮＰＡ）を含み得る。ベンジルイソシアネート誘導体は、ベンジルイソシアネート（ＢＩＣ）を含み得る。

ＩＶ．ＲＮＡ分子設計
ＳＨＡＰＥ反応性を、１つ以上のプライマー伸長反応で評価することができるため、情報は、ＲＮＡ分子の５’末端およびプライマー結合部位付近の両方で失われ得る。典型的には、プライマー結合部位に隣接する１０～２０ヌクレオチドでの付加物形成は、プライマー伸長の初期段階中の逆転写酵素（ＲＴ）酵素による停留または非テンプレート化伸長を反映するｃＤＮＡ断片の存在に起因して、定量化することが困難である。ＲＮＡの５’末端の８～１０位置は、豊富な全長伸長産物の存在に起因して、可視化することが困難な場合がある。

目的の配列の５’末端および３’末端でのＳＨＡＰＥ反応性を監視するために、ＲＮＡ分子を、天然配列のより大きな断片内に埋め込むか、または固有のプライマー結合部位を含有する強く折り畳まれたＲＮＡ配列の間に配置することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの５’および３’隣接配列を含有する構造カセットは、例えば、限定されないが、配列決定ゲル、キャピラリー電気泳動などの目的のＲＮＡ分子内のすべての位置をヌクレオチド分解能を付与する任意の分離技術で評価することが可能なように設計することができる。いくつかの実施形態では、５’および３’伸長の両方を、多様な内部ＲＮＡの折り畳みを妨害しない安定なヘアピン構造に折り畳むことができる。カセットのプライマー結合部位は、ｃＤＮＡプライマーに効率的に結合することができる。任意の５’および３’構造カセットエレメントの配列を調べ、それらが内部配列と安定した塩基対相互作用を形成しにくいことを確実にすることができる。

いくつかの実施形態では、目的のＲＮＡ分子は、ヌクレオチドリンカーと接続されている２つの異なる標的モチーフを含む。標的モチーフは、目的の任意のヌクレオチド配列であり得る。例示的な標的モチーフとしては、限定されないが、リボスイッチ、ウイルス調節エレメント、ｍＲＮＡ中の構造化された領域、多重ヘリックス接合部、シュードノットおよび／またはアプタマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、第１の標的モチーフは、シュードノット、例えば、デングウイルスゲノムの５’ＵＴＲからのシュードノットである。いくつかの実施形態では、第２の標的モチーフは、アプタマードメイン、例えば、ＴＰＰリボスイッチアプタマードメインである。ヌクレオチドリンカーについて、ヌクレオチドの数は、変動し得る。例えば、いくつかの実施形態では、リンカー中のヌクレオチドの数は、約１～約２０ヌクレオチド、約１～約１５ヌクレオチド、約１～約１０ヌクレオチド、または約５～約１０ヌクレオチド（または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド）の範囲である。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡバーコード領域をさらに含む。ＲＮＡバーコード領域は、（例えば、多重化の間に）ＲＮＡ分子の混合物中の特定のＲＮＡ分子の識別を可能にする固有のバーコードである。ＲＮＡバーコード領域の位置は、様々であってもよいが、典型的には、ＲＮＡ分子中に存在するカセットのうちの１つに隣接して見出される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡバーコードは、ＲＮＡ分子の任意の他の部分と相互作用しない、自己を含む構造に折り畳まれるように設計される。ＲＮＡバーコード領域の構造は、様々であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡバーコード領域の構造は、約１～約１０塩基対（または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基対）を含む塩基対ヘリックスを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡバーコード領域は、７塩基対を含む。いくつかの実施形態では、塩基対は、塩基対ヘリックスの末端塩基対に固定されたテトラループでキャップされる。塩基対ヘリックスをキャップすると、ＲＮＡバーコード領域の全体的なヘアピン安定性を維持する。いくつかの実施形態では、テトラループは、ヌクレオチド配列ＧＮＲＡを含むが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡバーコード領域は、任意の個々のバーコードが、別のバーコードとして誤って解釈される少なくとも２つの変異を受けるように設計される。

Ｖ．ＲＮＡ分子の折り畳み
本開示の主題は、限定されないが、インビトロ転写を含む方法によって生成されるＲＮＡ分子、ならびに細胞およびウイルス中で生成されるＲＮＡ分子を用いて実行され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ゲル電気泳動を変性させることによって精製され、生物学的に関連する立体配座を達成するために再生され得る。さらに、ＲＮＡ分子を所望のｐＨ（例えば、約ｐＨ８）で所望の立体配座に折り畳む任意の手順を置換することができる。まず、ＲＮＡ分子を加熱し、低イオン強度緩衝液中で迅速冷却して、多量体形態を排除することができる。次いで、折り畳み溶液を添加して、ＲＮＡ分子が適切な立体配座を達成し、求電子剤を用いた構造感受性プロービングのためにそれを調製することを可能にすることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、単一の反応で折り畳まれ、その後で（＋）および（－）求電子剤反応に分離することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、修飾前に自然には折り畳まれない。修飾は、ＲＮＡ分子が熱および／または低塩条件によって変性されている間に行われ得る。

ＶＩ．ＲＮＡ分子修飾
求電子剤をＲＮＡに添加して、柔軟性のあるヌクレオチド位置で２’－Ｏ－付加物を得ることができる。次いで、求電子剤の本質的にすべてが、ＲＮＡと反応するか、または水による加水分解に起因して分解されるまで、反応物をインキュベートすることができる。特定のクエンチステップは必要とされない。修飾は、複合体リガンドおよび生体分子の存在下、ならびに様々な塩の存在下で行われ得る。ＲＮＡは、細胞およびウイルス内で同様に修飾されてもよい。これらの塩および複合体リガンドは、マグネシウム、ナトリウム、マンガン、鉄、および／またはコバルトの塩を含み得る。複合体リガンドとしては、限定されないが、タンパク質、脂質、他のＲＮＡ分子、ＤＮＡ、または小さな有機分子が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、複合体リガンドは、本明細書に開示される小分子断片である。いくつかの実施形態では、複合体リガンドは、本明細書に開示される化合物である。修飾ＲＮＡは、例えば、エタノール沈殿によってプライマー伸長反応にとって有害であり得る反応生成物および緩衝成分から精製され得る。

ＶＩＩ．プライマー伸長および重合
本開示の主題によるプライマー伸長によるＲＮＡ付加物の分析は、種々の実施形態では、最適化されたプライマー結合部位、熱安定性逆転写酵素、低ＭｇＣｌ_２濃度、高温、短い伸長時間、および前述のいずれかの組み合わせの使用を含み得る。反応副生成物および他の小分子汚染物質を含まない、無傷の分解していないＲＮＡも、逆転写のためのテンプレートとして使用することができる。得られたＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ成分は、塩基での処理によって分解することができる。次いで、ｃＤＮＡ断片を、例えば、ポリアクリルアミド配列決定ゲル、キャピラリー電気泳動、または本開示のレビュー後に当業者に明らかになる他の分離技術を使用して分割することができる。

デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、別々に、またはプライマーと共に、十分な量で合成混合物に添加することができ、得られた溶液を、約１～１０分間かけて約５０～１００℃に加熱することができる。加熱時間の後、溶液を冷却することができる。いくつかの実施形態では、プライマー伸長反応をもたらすための適切な薬剤を、冷却した混合物に添加し、反応を当該技術分野で既知の条件下で生じさせることができる。いくつかの実施形態では、重合のための薬剤は、熱安定性である場合には、他の試薬と一緒に添加することができる。いくつかの実施形態では、合成（または増幅）反応は、室温で生じ得る。いくつかの実施形態では、合成（または増幅）反応は、重合のための薬剤が機能しなくなる温度まで生じ得る。

重合のための薬剤は、例えば、酵素を含む、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能する任意の化合物または系であり得る。この目的のための好適な酵素としては、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片、ポリメラーゼムテイン、逆転写酵素、ならびに熱安定性酵素（すなわち、変性を引き起こすのに十分に高い温度にさらされた後にプライマー伸長を行う酵素）、例えば、マウスもしくは鳥の逆転写酵素を含む他の酵素が挙げられる。好適な酵素は、ヌクレオチドの適切な方法での組み合わせを促進して、各多型遺伝子座核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成することができる。いくつかの実施形態では、合成は、各プライマーの５’末端で開始し、合成がテンプレートの末端で終了するまで、３’方向に進むことができ、ジデオキシヌクレオチド三リン酸の組み込みによって、または２’－Ｏ－付加物で、異なる長さの分子を生成することができる。

新たに合成された鎖およびその相補的核酸鎖は、本明細書に記載されるハイブリダイゼーション条件下で二本鎖分子を形成することができ、このハイブリッドは、参照によりそれらの全体が本明細書に参照される米国特許第１０，２４０，１８８号および米国特許第８，３１８，４２４号に記載される開示された方法のように、後のステップで使用される。いくつかの実施形態では、新しく合成された二本鎖分子は、一本鎖分子を提供するための当該技術分野で既知の手順のいずれかを使用して、変性条件にさらすこともできる。

ＶＩＩ．生データの処理
ＲＮＡ分子、化学修飾分析、および／または核酸構造分析などの核酸のための本明細書に記載の主題は、コンピュータ可読媒体に具体化されたコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラム製品を使用して実装することができる。本明細書に記載の主題を実装するのに好適な例示的なコンピュータ可読媒体としては、チップメモリデバイス、ディスクメモリデバイス、プログラマブルロジックデバイス、および特定用途向け集積回路が挙げられる。加えて、本明細書に記載の主題を実装するコンピュータプログラム製品は、単一のデバイスまたはコンピューティングプラットフォーム上に位置することができ、または複数のデバイスまたはコンピューティングプラットフォームにわたって分散され得る。したがって、本明細書に記載の主題は、コンピュータによって実行されたときに、ＲＮＡ構造解析などの核酸のための特定の機能を実行する、コンピュータ命令のセットを含み得る。

上述の項目Ｉ～ＶＩＩを考慮して、モジュラーＲＮＡスクリーニング構築物を、リガンド結合の読み出しのための高スループットアッセイとしてＳＨＡＰＥを実装するように設計した（図１、上）。構築物は、その構造が破壊されたときにウイルス適合性を低下させるデングウイルスゲノムの５’ＵＴＲからのシュードノット^２６、およびＴＰＰリボスイッチアプタマードメイン^{２７～２９}などの２つの標的モチーフを含有するように設計された。単一の構築物に２つの異なる構造モチーフを含めることにより、各々が他方に対する内部特異性制御として機能することが可能となった。両方のＲＮＡ構造に結合する断片は、非特異的バインダーとして容易に識別された。これらの２つの構造は、２つのＲＮＡ構造が構造的に独立したまま保持されることを可能にするように、一本鎖であるように設計された６ヌクレオチドリンカーによって接続された。構築物の構造コアに隣接するのは、構造カセット^２５であり、これらのステム－ループ形成領域は、スクリーニングワークフローで必要とされるステップのためのプライマー結合部位として使用され、構築物中の他の構造と相互作用しないように設計された（図７）。

スクリーニング構築物の別の構成要素は、ＲＮＡバーコードであり、バーコード化することで、下流のワークロードを実質的に低減する多重化を可能にする。断片ライブラリをスクリーニングするために使用される９６ウェルプレート中の各ウェルは、それ以外は同一の構築物の観点で固有のバーコードを有するＲＮＡを含有し、したがって、バーコード配列は、ウェル位置と、多重化後に存在する断片（または複数の断片）とを識別する（図１）。ＲＮＡバーコード領域は、構築物の任意の他の部分と相互作用しない、自己を含む構造に折り畳まれるように設計された。バーコード構造は、ＧＮＲＡテトラループでキャップされ、ヘアピンの安定性を維持するためにＧ－Ｃ塩基対で固定された、７塩基対のヘリックスである（図７）。９６個のバーコードの各セットは、任意の個々のバーコードが、別のバーコードとして誤って解釈される２つ以上の変異を受けるように設計された。

この構築物は、リガンド結合をスクリーニングするためのＲＮＡ構造を選択する際の柔軟性を提供し、単純で直接的なスクリーニング実験を補助する（図１）。固有のＲＮＡバーコードを有するそれ以外は同一のＲＮＡ構築物を含有する９６ウェルプレート中の各ウェルを、１つまたは数個の小分子断片または断片なしの対照（溶媒）でインキュベートし、次いで、ＳＨＡＰＥ試薬に曝露する。得られたＳＨＡＰＥ付加物は、ヌクレオチド当たりの構造情報を化学的にコードする。ＳＨＡＰＥプロービングの後、断片同一性（ＲＮＡバーコード）および断片結合（ＳＨＡＰＥ付加物パターン）を決定するために必要な情報が各ＲＮＡ鎖に永久的にコードされるため、プレートの９６ウェルからのＲＮＡを単一の試料にプールすることができる。断片スクリーニング実験は、標準的なＭａＰ構造プロービングワークフロー^２４と非常に類似した方法で処理される。例えば、いくつかの実施形態では、特殊な緩和された忠実度逆転写反応を使用して、ＲＮＡ上の任意のＳＨＡＰＥ付加物の位置に、非テンプレートコード配列の変化を含有するｃＤＮＡを作製する^３０。次いで、これらのｃＤＮＡを使用して、高スループット配列決定のためのＤＮＡライブラリを調製する。実験の複数のプレートを、ＤＮＡライブラリレベルでバーコード化し^２４、単一の配列決定の試行において数千の化合物に関するデータを集めることができる（図１）。得られた配列決定データは、各々が特定のＲＮＡ鎖に対応する、数百万の個々のリードを含有する。これらのリードは、バーコードによってソートされ、各々の小分子断片または断片の組み合わせについてのデータの分析を可能にする。ＳＨＡＰＥおよび／またはＳＨＡＰＥ－ＭａＰなどの上述の方法を使用する小分子断片（例えば、断片１および／または断片２）の決定および識別は、次のセクションでより詳細に説明される。

Ｃ．リガンドの識別および選択
上述のように、ＳＨＡＰＥおよびＳＨＡＰＥ－ＭａＰを使用して、目的のＲＮＡ分子に結合する、または目的のＲＮＡ分子と会合する小分子断片を識別した。特にＳＨＡＰＥ－ＭａＰを使用して小分子断片を試験する場合、１ヌクレオチド当たりのＳＨＡＰＥ－ＭａＰ変異率からの結合した断片シグネチャの検出は、大きな実験スクリーニングにわたってデータを正規化し、統計的厳密性を確保する複数のステップを伴う。ＳＨＡＰＥに基づくヒット分析戦略の鍵となる特徴は、（ｉ）各断片に曝露したＲＮＡ、もしくは「実験試料」を、５つの陰性の断片に曝露していない対照試料と比較して、プレート間の変動性およびウェル間の変動性を説明すること、（ｉｉ）構築物中の２つの構造モチーフ、本開示ではシュードノットおよびＴＰＰリボスイッチの各々について独立して実施されるヒット検出、（ｉｉｉ）個々のヌクレオチドが、断片によって誘発される変化を示す可能性が低いため、すべての試料にわたって低い反応性を有する個々のヌクレオチドのマスキング、ならびに（ｉｖ）断片に曝露した実験試料と、断片に曝露していない陰性対照試料との間の変異率のヌクレオチド当たりの差の計算を伴う。Ｚスコア分析のために、モチーフの１つと、断片を含まない対照との間の変異率の差が２０％以上であるこれらのヌクレオチドを選択した。しかしながら、当業者であれば、変異率の差が変化し得ることを認識して、それに応じて変異率の差を調整することができるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、変異率の差は、２５％、３０％、３５％、４５％、または５０％、またはそれより大きくてもよい。いくつかの実施形態では、変異率の差は、１５％、１０％、または５％、またはそれより大きくてもよい。２つのモチーフのうちの１つにおける３つ以上のヌクレオチドが、２．７より大きなＺ値を有する（２つのモチーフについてのＰｏｉｓｓｏｎ数の比較^３１によって決定されるような、実施例２を参照）場合に、断片は、ＳＨＡＰＥ反応性パターンを有意に変化させたと決定された。しかしながら、Ｚ値は変化してもよく、当業者はそれに応じて調整することができるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、Ｚ値は、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３．、３．４、３．５、３．６．、３．７、３．８、または３．９より大きい。いくつかの実施形態では、Ｚ値は、１．０．、１．１．、１．２．、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、または２．６より大きい。

その後に一緒に連結して本明細書に開示される化合物を生成するＳＨＡＰＥおよび／またはＳＨＡＰＥ－ＭａＰを有する小分子断片を識別するために、一連のステップを実行する。まず、一次スクリーニングを実施し、多数の化合物（例えば、少なくとも１００個の化合物）をスクリーニングして、標的ＲＮＡ分子に対して好適な結合活性を示す任意の初期リードまたはヒット化合物を識別する。ステップ２では、次いで、これらのヒット化合物を、構造－活性関係（ＳＡＲ）試験でさらに調べ、標的ＲＮＡの結合親和性の変化を、修飾されるヒット化合物の構造として決定する。複数の小分子断片が、標的ＲＮＡ分子に好適な結合リガンドであると識別される場合、追加の結合試験を実施し、各小分子断片についての結合部位をさらに調べてもよい（すなわち、ステップ３）。例えば、いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡを、第１の断片（ステップ２において、ＳＡＲ試験に従って標的ＲＮＡ結合リガンドとして識別された）と共にプレインキュベートした後、標的ＲＮＡを、第２の断片（これもステップ２のＳＡＲ試験においてＲＮＡ結合リガンドとして識別された）に曝露して、第１の断片が既に結合しているときに、第２の断片が標的ＲＮＡに結合することができるかどうかを識別することができる。目的のＲＮＡに対して好適な結合活性を有する第２の断片が識別されたら、第２の断片をリンカーを用いて第１の断片に連結して、本明細書に開示されるような化合物にすることができる（すなわち、ステップ４）。上述の各ステップは、以下でより詳細に説明される。

ステップ１：一次スクリーニング
一次スクリーニングでは、１，５００個の断片が試験され、４１個の断片がヒットとして検出され、初期ヒット率は２．７％であった。３複製物のＳＨＡＰＥ分析によりヒットの検証を行い（図２、図８）、３複製物すべてにおいてバインダーとして検出された場合にのみ、化合物が真のヒットとして受け入れられた。次いで、これらの複製物のヒット化合物を、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）によって分析し、標的モチーフにちょうど対応する（スクリーニング構築物中の隣接配列を省く）ＲＮＡに対する結合親和性を決定した。これらの初期ヒットのうち、複製物分析およびＩＴＣによって、８ヒットが検証された（表１）。ヒットのうちの７つが、試験構築物のＴＰＰリボスイッチ領域内に大部分または完全に局在化するそれらの変異シグネチャに基づいて、ＴＰＰリボスイッチに結合した。残りのヒットは、この断片がＲＮＡ構築物のすべての部分にわたってヌクレオチドに影響を及ぼしたため、非特異的であった。試験構築物のデングシュードノット領域に特異的に結合する化合物は検出されなかった。

ＳＨＡＰＥ構造プロービングによってヒットが検出され、それを複製物分析およびＩＴＣによって検証した。解離定数は、ＩＴＣによって決定され、‡でマークされた誤差値は、３複製物以上に由来する標準誤差を示し、他の誤差推定値は、結合曲線の最小二乗回帰の９５％信頼区間に基づいて計算される。比較のために、天然のＴＰＰリガンドが含まれる。

ＩＴＣによって検証されるように、ＴＰＰリボスイッチに結合した７つの断片は、多様な化学型を有し、ほとんどの断片は、天然のＴＰＰリガンドとの類似性をほとんど有さないか、または全く有さない（表１）。全体的に、ヘテロ芳香族窒素を含有する環が優勢であり、これらが水素結合相互作用に関与している可能性が高い。３つの化合物は、ピリジン環を有しており、２つはピラジン環を有している。アゾール環部分は、２つのチアジアゾールおよび１つのイミダゾールの３つの化合物中に存在している。天然のＴＰＰリガンド中にチアゾール環が存在するが、この部分は、ＲＮＡとの結合相互作用に関与しない^{２８、２９、３３}。加えて、多数の識別された断片は、水素結合受容体または供与体として機能し得る一級アミン、エステルおよびエーテル、ならびにフッ素基を含有する。

ステップ２：リボスイッチ結合断片の構造－活性関係（ＳＡＲ）
次に、結合親和性を増加させ、結合を妨げることなく断片ヒットがリンカーで修飾され得る位置を識別することを目的に、初期ヒットのいくつかの類似体を調べた。特に、化合物２および５の類似体は、これら２つの断片が構造的に異なっており、類似体が市販されているため、検討された。ＩＴＣによって、類似体－ＲＮＡ結合を評価した。２の１６の類似体を試験した。一方または両方の環窒素を除去することによって、２のコアキノキサリン構造を変化させることにより、結合活性が変化した（表２Ａ）。

キノキサリンコアに対する修飾を調べ、解離定数をＩＴＣによって得た。

結合親和性の改善は、メチレン連結水素結合受容体または供与体の導入によってもたらされた（表２Ｂ、化合物１６および１７）。キノキサリン環コア上の他の位置の置換基を変化させることにより、結合活性が低下した。化合物２は、Ｃ－６位置での置換基の修飾時に観察された、高度な柔軟性、および結合のさらなる改善に基づいて、さらなる開発のための良好な候補であった。

次に、断片５の１８個の類似体を調べたところ、環窒素位置を変更すること、環窒素を付加するもしくは除去することがすべて、結合を低下させるか、または結合を無効にするため、分子のコアピリジン官能性が結合にとって重要であるようであることを示唆していた（表３）。

環置換基に対する修飾は、一般に、結合活性を著しく消失させた（表４）。唯一の親和性を増加させる類似体は、Ｃ－４位置の塩素を特徴としており（Ｓ１２）、断片５よりもＴＰＰリボスイッチに対して約３倍高い親和性を有する化合物が得られた。

ステップ３：ＴＰＰリボスイッチ上の第２の部位に結合する断片の識別
第２のラウンドのスクリーニングを用いて、化合物２またはＳ１２に予め結合したスクリーニング構築物のＴＰＰリボスイッチ領域に結合した断片を識別した。このスクリーニングは、協働性効果に起因して、または新しい態様の結合が、一次リガンド結合時に生じる構造変化に起因して利用可能になるため、２またはＳ１２が既に結合しているときにＴＰＰリボスイッチと優先的に相互作用する断片を識別した（図３）。スクリーニングした１，５００個の断片のうち、５個は、２またはＳ１２のいずれかと同時に結合することが検証された（表５）。

１つの第２のスクリーニングヒット２９は、ＳＨＡＰＥ反応性シグナルにおける非常に安定した変化を誘発し、Ｐ１ヘリックスのアンフォールディングを含め、ＲＮＡ構造のかなりの変化を引き起こすようであった。この断片は、非特異的相互作用と一致するＲＮＡの他の領域の変化を引き起こしたため、この断片は、断片連結の候補としてさらに検討されなかった。断片２８は、ＩＴＣ分析に必要な濃度では不溶性であったため、キノリン環の代わりにピリジンを含有する関連類似体をＩＴＣによって調べた（表６）。これらの化合物は、弱い親和性で結合したが、それにもかかわらず、３１および３２は、２と明確ではあるが弱い結合協働性を示した。

^＊ＩＴＣ結合曲線にフィッティングすることができないことに起因して、ｕｎｄ（決定されない）、不溶性、ＩＴＣに必要な濃度で不溶性な化合物。

ステップ４：協働性および断片連結
２と３１との間の協働性結合相互作用をＩＴＣによって定量化した。個々に、２は、２５μＭのＫ_ｄで結合し、３１は、はるかに高い１０ｍＭのＫ_ｄで結合した。二次スクリーニングと同様に、断片３１の親和性も、２がＴＰＰリボスイッチＲＮＡと予め結合しており、２－ＲＮＡ複合体を形成する場合に調べた。これらの条件下で、断片３１は、約３ｍＭのＫ_ｄで２－ＴＰＰＲＮＡ複合体に結合した（図４）。この実験はまた、２による結合が飽和している場合、３１がＴＰＰＲＮＡに結合することも示しており、このことは、これら２つの断片が同じ位置に結合しないことを暗示している。２および３１が、ＴＰＰＲＮＡの異なる領域に対してそれぞれ優れた妥当な親和性で結合したため、この２つの断片は、高親和性リガンドを作成することを目的に連結された。

断片ヒット２（表２Ｂ）および２８（表４）のＳＡＲ分析に基づいて、１７のアミノメチル位置および断片３１のピリジン環中の２つの部位に着目して、最も有望なＳＡＲ断片の連結した類似体を調製した（図５）。まず、アミドまたはアミンリンカーとコンジュゲートした断片の親和性を比較した。柔軟性のあるアミンリンカーを有する化合物（化合物３６）は、アミン連結した態様よりも５倍高い結合親和性を有していた（化合物３５、図５）。これらの連結は、天然のＴＰＰリガンドのピロホスフェート部分で生じるように^{２７、２８}、マグネシウムイオンとキレート化し得るヒドロキサム酸の文脈で導入された^３５。しかしながら、アミン連結したヒドロキサム酸化合物３６は、親断片１７と同様の親和性で結合し、このことは、ヒドロキサム酸部分が、イオンをキレート化することによって追加の結合親和性を付与しないことを示唆している。連結した化合物３７は、６２５ｎＭの親和性で結合し、このことは、正しい近似により、弱い親和性の２つの断片を連結することは、より高いナノモル濃度のバインダーを達成することができることを示している。断片３１のエンティティを三級アミンと置き換えると（化合物３８）、化合物３７と比較して親和性が低下し、このことは、断片３１とＲＮＡとの相互作用が、単なる電荷由来の効果より高い効果によって媒介されることを示唆している。最後に、１７部分と３１部分との連結の長さを変えること（化合物３９）、またはピリジン環連結部位によって変えること（化合物４０）で、化合物３７と比較して親和性が低下する（図５）。最終的に、個々に結合した化合物をＴＰＰリボスイッチに５．０μＭ（化合物１９）および１０ｍＭ以上（化合物３１）の親和性で連結することによって、６２５ｎＭのＫ_ｄでＲＮＡに結合する化合物（３７）を作成した。

当業者は、上のステップＩ～ＩＶが限定することを意味しておらず、単に例示的な実施形態として機能することを理解するであろう。当業者は、上述のステップＩ～ＩＶを適用して、一緒に連結して、ＴＰＰリボスイッチに対して好適な結合親和性を有する本明細書に開示される化合物にすることができる代替の断片を識別することができることが十分に理解されるであろう。さらに、当業者は、上述のステップＩ～ＩＶを適用して、一緒に連結して、目的の他のＲＮＡ分子に結合する本明細書に開示される化合物にすることができる断片を識別することができることが十分に理解されるであろう。

Ｄ．まとめ、および追加の考慮事項
コード（ｍＲＮＡ）および非コードＲＮＡの両方を潜在的に操作して、細胞調節および疾患の経過を変化させることができるため、構造化ＲＮＡの小分子リガンドを識別するための効率的な戦略を開発することが求められた。本明細書に開示される研究は、断片に基づく戦略と融合させたＲＮＡに対するリガンド結合を検出するＳＨＡＰＥスクリーニング読み出しを使用することの有望性を実証する。ここで、この戦略を使用して、６２５ｎＭのＫ_ｄで、天然リガンドとは構造的に無関係なＴＰＰリボスイッチに結合するリガンドを生成した。融合したＳＨＡＰＥおよび断片に基づくスクリーニングのアプローチは、標的化され得るＲＮＡ構造および開発され得るリガンド化学型の両方に対して一般的である。この戦略は、複雑な構造を有するＲＮＡのリガンドを発見するのに十分に適しており、これは、三次元ポケット中で結合するＲＮＡモチーフを識別するのに不可欠であり得る^４。加えて、ＭａＰアプローチの使用およびＲＮＡおよびＤＮＡバーコード化の両方による多重化の適用に起因して、１０００を超えるメンバーの断片ライブラリをスクリーニングするのに必要な労力は少なめであり、多くの構造的に異なる標的の効率的なスクリーニングを可能にする。

得られたリガンドの多くは、同様にＴＰＰリボスイッチについて実施した１回のラウンドのスクリーニングについて既に報告されたものと同様であった^{１５、１７}。一次スクリーニングにおけるヒットは、より高い親和性の方にわずかに偏っているように思われ、その結果、ＳＨＡＰＥによって検出されたリガンドの大部分が、１０～３００μＭの範囲で結合した。使用されるヒット検出アッセイは、最も緊密な断片バインダー、およびＳＨＡＰＥ反応性において最も実質的な変化を誘発するバインダーの検出の方に偏っている可能性が高い。より低い親和性の断片は、見逃された可能性が高い。この緊密な結合断片に対する偏りが、全体的に利点であると考えられている。上述のスクリーニング基準を満たすために必要な親和性および特異性に達したデングシュードノットに結合した断片は、識別されなかった。デングシュードノットＲＮＡは、高度に構造化されており、ある断片がこの構造を乱す可能性は、低い可能性がある。別の可能性は、この特定のシュードノット構造が、リガンド結合可能なポケットを含有していないかもしれないことである。

一次スクリーニングからの断片ヒットがＲＮＡに予め結合され、追加の断片結合パートナーについてスクリーニングされた断片対識別戦略は、具体的には、ＳＨＡＰＥによって得ることができるヌクレオチド当たりの情報を活用し、これを首尾良く使用して、誘発された適合断片対を発見することであった（図４）。断片に基づくリガンド開発の核となる信条は、２つの断片間の協働性を、近接した結合によって達成することができることと、この相加的な結合を、この協働性の断片を最小限の侵襲性の共有結合性リンカーを用いて一緒に連結することによって利用することができることである^{２０、２１、３６、３７}。一次断片ヒットおよび二次断片ヒットからの連結した化合物３７の開発は、断片に基づくリガンド発見が、ＲＮＡ標的に効率的に適用され得ることを示す。２と３１との間には弱い程度の協働性が存在する。化合物３１による結合は、２がＲＮＡに予め結合している場合に、３～１０倍強かった。これらの２つの断片を連結すると、それらの結合エネルギーの弱い相加性が観察された。３７は、６２５ｎＭの親和性を有していた。おそらくこれらの断片の完璧な位置決めが達成されなかったため、断片２および３１を連結する相加効果を超える効果は観察されなかった^３６。リンカーの長さまたは幾何形状の小さな変化によって、連結されたリガンドの親和性が大きく変化し（図５）、このことは、リンカーの正確な位置決めが、２つの断片を最適に配向させるために重要であることを暗示している。化合物３７の開発の成功は、断片間の協働性の程度、またはマイクロモル濃度未満のリガンドを効率的に開発するためのこれらを接続する共有結合性リンカーの構築のいずれかにおいて完璧を達成することが必要ではないことを明らかにしている。

断片間の協働性を利用して、タンパク質を標的とする緊密に結合するリガンドを得るように設計された多数の取り組みが存在したが、ＲＮＡを標的とすることは、その初期段階にある。以前の（タンパク質に焦点を当てた）取り組みと比較して、開示されたＳＨＡＰＥに基づくスクリーニング戦略が、断片の連結とどの程度うまく組み合わされているかを検討した。その連結係数（Ｅ）に従って、断片に基づく戦略を使用して以前に発見された化合物をランク付けし、これは、連結したときに系全体が一緒になってどのように十分に機能するかの尺度である^{２１、３８}（図６、表７で拡張）。正または負の寄与因子が存在しない場合、２つの断片の結合エネルギーは、正確に相加的であり、リンカーは不活性であり、Ｅは１．０に等しい。協働性効果または好ましいリンカー相互作用は、Ｅを低下させ、反協働性効果または負のリンカー相互作用は、Ｅを増加させる。重要なことに、Ｅ値は、タンパク質系において、数桁変動し得る。３７の連結係数は、２．５であり、学術文献における連結された（タンパク質を標的とする）リガンドの平均をわずかに上回る。３７は、タンパク質を標的とする連結された断片リガンドの例と比較して好ましい、結合の自由エネルギーを非水素原子の数で割り算したリガンド効率（ＬＥ）を有する（図６）。これらの評価基準によって、３７は、天然ＴＰＰリボスイッチリガンドに密接に関連するリガンドＴＰＰｃとほぼ同様に十分に機能する^２２。したがって、断片に基づくリガンドの発見は、特に、ＳＨＡＰＥを可能にする多重化スクリーニングによって効率的に実装されるように、ＲＮＡ構造の広大な世界を標的とする固有のリガンドの迅速な開発を可能にする大きな将来性を有している。

Ｅ．作製する方法
本開示はまた、本明細書に開示される化合物を調製するための任意の方法も対象とする。当業者は、そのような調製方法が変化し得ることを認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、開示される化合物の調製方法は、
式ＩＶの断片

（式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、独立して、ＣＨＲ_１、ＣＲ_１、ならびにヘテロ原子Ｎ、ＮＨ、Ｏ、およびＳから選択され、隣接するＸ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、同時にＯもしくはＳであるように選択されず、
破線は、任意選択の二重結合を表し、
Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３は、独立して、ＣＲ_２およびＮから選択され、
Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、－Ｈ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｆ、－ＣＦ_３、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｏ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＯＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＮＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯＮＨＣ_１～Ｃ_６（アルキル）、および置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキルから選択され、
ｎは、整数１および２から選択され、ｎが１である場合、破線のうちの１つだけが二重結合である）を、
式Ｖ－１もしくはＶ－２の断片

（式中、Ｘは、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、およびＩから選択されるハロゲンであり、
Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７は、独立して、ＣＲ_３およびＮから選択され、
Ｒ_３は、－Ｈ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｆ、－ＣＦ_３、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｏ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＯＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＮＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯＮＨＣ_１～Ｃ_６（アルキル）、および置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキルから選択され、
ｍは、１もしくは２であり、
Ｗは、－Ｏもしくは－ＮＲ_４であり、Ｒ_４は、－ＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換シクロアルキル、－ＣＯ（アリール）、－ＣＯ（ヘテロアリール）、および－ＣＯ（シクロアルキル）から選択されるから選択される）と、
Ｐｄ触媒の存在下で接触させることを含む。

いくつかの実施形態では、Ｐｄ触媒は、（ＤＰＰＦ）ＰｄＣｌ_２、Ｐｄ_２（ｄｂａ）_３、ＰｄＣｌ_２［Ｐ（ｏ－トリル）_３］_２、Ｐｄ（ｄｂａ）_２、およびＰｄ（ＯＡｃ）_２から選択される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、ホスフィンリガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ホスフィンリガンドは、単座である。いくつかの実施形態では、ホスフィンリガンドは、二座である。例示的なホスフィンリガンドとしては、限定されないが、ＤＰＰＦ、ＢＩＮＡＰ、およびｒａｃ－ＢＩＮＡＰが挙げられる。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、塩基をさらに含む。いくつかの実施形態では、塩基は、無機である。いくつかの実施形態では、塩基は、ＮａＯｔＢｕである。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、無溶媒で（すなわち、溶媒なしで）実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、溶媒存在下で実施される。いくつかの実施形態では、溶媒は、非極性溶媒である。例示的な溶媒としては、限定されないが、トルエン、ベンゼン、ジオキサン、およびテトラヒドロフランが挙げられる。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、高温で実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、または１００℃で実施される。

いくつかの実施形態では、開示される化合物を調製するための方法は、
式ＩＶの断片

を、式ＶＩ－１もしくはＶＩ－２の断片

（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｙ_１、Ｙ_２、Ｙ_３、ｎ、ｍ、およびＷは、上に定義される通りである）と、
還元剤の存在下で接触させることを含む。

いくつかの実施形態では、還元剤は、還元アミノ化化学に適用可能な任意の還元剤であり得る。例示的な還元剤としては、限定されないが、ヒドロホウ素化物および／または水素化アルミニウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、還元剤は、ヒドロホウ素化物である。いくつかの実施形態では、還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムである。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、無溶媒で実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、溶媒中で実施される。例示的な溶媒としては、限定されないが、アルコール溶媒（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、塩素化溶媒（例えば、ジクロロメタン）、および／またはエーテル溶媒（例えば、テトラヒドロフラン）が挙げられる。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、室温未満で実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、高温で実施される。

を、式ＶＩＩ－１もしくはＶＩＩ－２の断片

（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｙ_１、Ｙ_２、Ｙ_３、ｎ、ｍ、およびＷは、上に定義される通りであり、
Ｇは、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－ＯＨ、－ＯＣＨ_３、または－ＯＣＨ_２ＣＨ_３である）と、
塩基の存在下で接触させることを含む。

いくつかの実施形態では、塩基は、有機（ピリジンおよび／またはトリメチルアミン）である。いくつかの実施形態では、塩基は、無機（例えば、炭酸カリウム／ナトリウムおよび／または炭酸水素カリウム／ナトリウム）である。いくつかの実施形態では、本方法は、ＤＣＣおよび／またはＥＤＣＩなどのカップリング剤をさらに含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、無溶媒で実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、溶媒存在下で実施される。例示的な溶媒としては、限定されないが、ＴＨＦ、ＤＣＭ、ＡＣＮおよび／またはＤＭＳＯが挙げられる。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、室温で実施される。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、高温で実施される。

Ｆ．組成物
本開示の化合物は、薬学的に許容される担体と共に、薬学的組成物に製剤化され得る。

本明細書に開示される化合物は、薬学的組成物として標準的な医薬慣行に従って製剤化され得る。この態様によれば、薬学的に許容される希釈剤または担体と関連して、本明細書に開示される化合物を含む薬学的組成物が提供される。

典型的な製剤は、本明細書に開示される化合物と、担体、希釈剤、または賦形剤とを混合することによって調製される。好適な担体、希釈剤、および賦形剤は、当業者に周知であり、炭水化物、ワックス、水溶性および／または膨張性ポリマー、親水性または疎水性材料、ゼラチン、油、溶媒、水などの材料が挙げられる。使用される特定の担体、希釈剤または賦形剤は、化合物が適用される手段および目的に依存する。溶媒は、一般に、哺乳動物に投与される、安全である（ＧＲＡＳ）として当業者に認識される溶媒に基づいて選択される。一般に、安全な溶媒は、水および水に可溶性または混和性である他の非毒性溶媒などの非毒性水性溶媒である。好適な水性溶媒としては、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）など、およびこれらの混合物が挙げられる。製剤はまた、薬物（すなわち、本明細書に開示される化合物またはその薬学的組成物）の上品な提示を提供するか、または薬剤製品（すなわち、医薬）の製造を補助するために、１つ以上の緩衝液、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤、抗酸化剤、不透明化剤、滑剤、加工助剤、着色剤、甘味剤、芳香剤、香味剤、および他の既知の添加剤を含み得る。

製剤は、従来の溶解および混合手順を使用して調製され得る。例えば、バルク原薬物質（すなわち、本明細書に開示される化合物または化合物の安定化形態（例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知の複合体化剤との複合体））は、上述の賦形剤のうちの１つ以上の存在下で好適な溶媒中に溶解される。化合物は、典型的には、薬物の容易に制御可能な投薬量を提供し、処方されたレジメンに対する患者のコンプライアンスを可能にするために、薬学的剤形に製剤化される。

適用のための薬学的組成物（または製剤）は、薬物を投与するために使用される方法に応じて、様々な様式で包装され得る。一般に、分配のための物品は、医薬製剤を適切な形態でその中に堆積させた容器を含む。好適な容器は、当業者に周知であり、ボトル（プラスチックおよびガラス）、小袋、アンプル、プラスチックバッグ、金属シリンダなどの材料を含む。容器はまた、パッケージの内容物への不注意なアクセスを防止するための不正開封防止アセンブリを含んでもよい。加えて、容器には、容器の内容物を記載したラベルが貼られている。ラベルは、適切な警告も含んでいてもよい。

薬学的製剤は、様々な経路および種類の投与のために調製されてもよい。例えば、所望の純度を有する本明細書に開示される化合物は、凍結乾燥製剤、粉砕された粉末、または水溶液の形態で、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．）と任意選択で混合されてもよい。製剤化は、適切なｐＨで、所望の純度で、周囲温度で、生理学的に許容される担体（すなわち、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である担体）と混合することによって実施され得る。製剤のｐＨは、主に特定の使用および化合物の濃度に依存するが、約３～約８の範囲であってもよい。ｐＨ５の酢酸緩衝液中の製剤は、好適な実施形態である。

化合物は、滅菌され得る。特に、インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されているべきである。このような滅菌は、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。

化合物は、通常、固体組成物、凍結乾燥製剤として、または水溶液として保存することができる。

本明細書に開示される化合物を含む薬学的組成物は、良好な医療行為と一致する様式、すなわち、量、濃度、スケジュール、経路、ビヒクル、および投与経路で製剤化され、投薬され、投与され得る。この文脈で考慮される因子としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師に既知の他の因子が挙げられる。投与される化合物の「治療有効量」は、そのような考慮事項によって管理され、凝固因子媒介性障害を予防するか、改善するか、または治療するために必要な最小量である。かかる量は、好ましくは、宿主に対して毒性であるか、または宿主が顕著に出血しやすくなる量を下回る。

許容される希釈剤、担体、賦形剤、および安定剤は、使用される投薬量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸を含む緩衝液、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質、防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、およびｍ－クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。活性医薬成分はまた、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに、例えば、コアセルベーション技術により、または界面重合により調製されたマイクロエマルション、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルに封入されてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

化合物の徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例としては、本明細書に開示される化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透明性マトリックスが挙げられ、マトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸およびガンマ－エチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性ビニレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

製剤には、本明細書に詳述される投与経路に好適なものが含まれる。製剤は、簡便には、単位剤形で提示されてもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。技術および製剤は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）に見出される。そのような方法としては、活性成分を、１つ以上の付属成分を構成する担体と会合させるステップが挙げられる。一般に、製剤は、活性成分を、液体担体または微細に分割された固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて、製品を成形することによって調製される。

経口投与に好適な本明細書に開示される化合物の製剤は、各々が所定量の化合物を含有する丸薬、カプセル、カシェ剤、または錠剤などの個別の単位として調製され得る。

圧縮錠剤は、任意選択でバインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、表面活性剤または分散剤と混合した、粉末または顆粒などの自由に流動する形態で活性成分を好適な機械で圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状活性成分の混合物を好適な機械で成形することによって作製され得る。錠剤は、任意選択で、コーティングされてもよく、または分割錠化されてもよく、任意選択で、その錠剤から活性成分をゆっくりとした放出、または制御放出を提供するように製剤化される。

錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルション、ハードカプセルまたはソフトカプセル、例えば、ゼラチンカプセル、シロップ、またはエリキシル剤は、経口使用のために調製され得る。経口使用を意図した本明細書に開示される化合物の製剤は、薬学的組成物の製造のための当該技術分野に既知の任意の方法に従って調製されてもよく、かかる組成物は、口当たりの良い調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤を含む１つ以上の薬剤を含有し得る。錠剤の製造に適した、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含有する錠剤は許容される。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウムもしくはナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムもしくはナトリウム、造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、もしくはアルギン酸、結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンもしくはアカシア、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクであり得る。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、またはマイクロカプセル化を含む既知の技術によってコーティングされ、胃腸管内の崩壊および吸着を遅延させ、それによって、より長い期間にわたって持続的な作用を提供してもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料を、単独で、またはワックスと共に用いてもよい。

眼または他の外部組織、例えば、口および皮膚の治療のために、製剤は、例えば、０．０７５～２０重量％／重量％の量で、活性成分を含有する局所軟膏またはクリームとして適用されてもよい。軟膏で製剤化される場合、活性成分は、パラフィンまたは水混和性軟膏基剤のいずれかと共に用いられ得る。代替的に、活性成分は、水中油性クリーム基剤を有するクリームで製剤化されてもよい。

所望な場合、クリーム基剤の水相は、多価アルコール、すなわち、プロピレングリコール、ブタン１，３－ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００を含む）などの２個以上のヒドロキシル基を有するアルコール、ならびにそれらの混合物を含み得る。局所製剤は、皮膚または他の患部を通る活性成分の吸収または浸透を増強する化合物を含むことが望ましい場合がある。かかる皮膚浸透増強剤の例としては、ジメチルスルホキシドおよび関連する類似体が挙げられる。

エマルションの油性相は、公知の方法で公知の成分から構成され得る。相は、乳化剤のみを含んでもよいが、少なくとも１つの乳化剤と脂肪もしくは油、または脂肪と油の両方の混合物を含んでもよい。親油性乳化剤と共に含まれる親水性乳化剤は、安定剤として機能し得る。合わせて、安定剤の有無にかかわらず、乳化剤は、いわゆる乳化ワックスを構成し、ワックスは、油および脂肪と共に、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を構成する。製剤に使用するのに好適な乳化剤および乳剤安定剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、セトステアリルアルコール、ベンジルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリルおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。

化合物の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。かかる賦形剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなどの懸濁剤、ならびに分散剤または湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸に由来する部分エステルおよびヘキシトール無水物との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。水性懸濁液はまた、１つ以上の防腐剤、例えば、エチルまたはｎ－プロピルｐ－ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、および１つ以上の甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンを含有してもよい。

化合物の薬学的組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液などの滅菌注射用調製物の形態であってもよい。この懸濁液は、上述したこれらの好適な分散剤または湿潤剤ならびに懸濁剤を使用して、既知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用調製物はまた、１，３－ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。滅菌注射用調製物はまた、凍結乾燥粉末として調製され得る。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として慣例的に用いられ得る。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意のブランドの固定油が、用いられ得る。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用され得る。

単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせてもよい活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変化する。例えば、ヒトへの経口投与を意図する時間放出型製剤は、全組成物の約５～約９５％（重量：重量）まで変動し得る適切かつ簡便な量の担体材料と混合した約１～１０００ｍｇの活性材料を含有し得る。薬学的組成物は、投与のために容易に測定可能な量を提供するように調製され得る。例えば、静脈内注入を目的とした水溶液は、約１０ｍＬ／時間～約５０ｍＬ／時間の速度での好適な体積の注入が生じ得るように、溶液１ミリリットル当たり約１～５００μｇの活性成分を含有し得る。

非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、バクテリオスタット、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る水性および非水性の滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。

眼への局所投与に好適な製剤には、活性成分が好適な担体、特に活性成分のための水性溶媒に溶解または懸濁される点眼剤も含まれる。活性成分は、好ましくは、そのような製剤中に、約０．５～２０重量／重量％、例えば、約０．５～１０重量／重量％、例えば、約１．５重量／重量％の濃度で存在する。

口腔内の局所投与に好適な製剤としては、香味ベースの通常はスクロースおよびアカシアもしくはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ錠、不活性ベースで例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア中に活性成分を含む香錠、ならびに好適な液体担体中に活性成分を含むマウスウォッシュが挙げられる。

直腸投与のための製剤は、例えば、カカオバターまたはサリチレートを含む好適な塩基を有する座薬として提示されてもよい。

肺内投与または経鼻投与に好適な製剤は、例えば、０．１～５００ミクロンの範囲の粒径（０．５、１、３０ミクロン、３５ミクロンなどのミクロンずつ増分した０．１～５００ミクロンの範囲の粒径を含む）を有し、経鼻経路を通しての急速な吸入によって、または肺胞嚢に到達するように、口腔を通しての吸入によって投与される。好適な製剤としては、活性成分の水溶液または油性溶液が挙げられる。エアロゾルまたは乾燥粉末投与に好適な製剤は、従来の方法に従って調製されてもよく、以下に記載される治療または予防障害においてこれまで使用されてきた化合物などの他の治療剤と共に送達され得る。

膣投与に好適な製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当該技術分野で知られているような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤として提示され得る。

製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルに包装されてもよく、使用直前に注射するために滅菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とする凍結させて乾燥した（凍結乾燥した）状態で保存されてもよい。即時注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製される。好ましい単位投薬量製剤は、活性成分の１日用量または１日単位の部分用量（本明細書で上に列挙される）、またはその適切な部分を含有する製剤である。

本主題はさらに、獣医用担体と共に上で定義した少なくとも１つの活性成分を含む獣医用組成物を提供する。獣医用担体は、組成物を投与する目的で有用な材料であり、別の方法で不活性であるか、または獣医技術分野で許容され、活性成分と適合性である固体、液体、または気体材料であり得る。これらの獣医用組成物は、非経口で、経口で、または任意の他の所望の経路によって投与され得る。

特定の実施形態では、本開示の化合物を含む薬学的組成物は、化学療法剤をさらに含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、化学療法剤は、免疫療法剤である。

Ｇ．治療する方法
本明細書に開示される化合物および組成物は、ＲＮＡ発現および／もしくは機能の機能障害、またはｍＲＮＡから産生されるタンパク質の発現および／もしくは機能、または小分子を使用してＲＮＡの立体配座を切り替える有用な役割、または感染性生物の成長を阻害する方法としてリボスイッチの天然の機能を変化させることに関連するとして識別された種々の疾患および／または障害を治療するための方法でも使用することができる。したがって、本開示の方法は、ＲＮＡ発現および／もしくは機能の機能障害に関連する疾患もしくは障害を治療すること、または新しい切り替え可能な治療薬を作成することを対象とする。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１８／０１０１４６号を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される疾患もしくは障害（例えば、ＲＮＡ発現および／もしくは機能の機能障害に関連する）を治療するための方法は、それを必要とする対象に、本明細書に開示される治療有効量の化合物および／または組成物の用量を投与することを含む。

ＲＮＡ発現の機能障害は、１つ以上のＲＮＡ分子の過剰発現または過小発現を特徴とする。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡ分子は、治療される疾患および／または障害を促進することに関連している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、健康な細胞の機構の一部であることを特徴とし、したがって、治療される疾患および／または障害を予防および／または改善する。いくつかの実施形態では、治療される疾患または障害は、転写、プロセシング、および／または翻訳に関連するＲＮＡ機能の機能障害と関連する。いくつかの実施形態では、治療される疾患または障害は、機能障害のＲＮＡ分子機能の結果としてのタンパク質の不正確な発現と関連する。いくつかの実施形態では、治療される疾患または障害は、遺伝子発現に関連するＲＮＡ機能の機能障害と関連する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、分子をｍＲＮＡに結合させることによってタンパク質発現を低下させることが所望される疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患は、小分子を使用してオンまたはオフに切り替えることができる療法によって有利に治療される。例えば、いくつかの実施形態では、疾患または障害は、治療遺伝子の発現をオンまたはオフに切り替える能力を有することが所望される遺伝性疾患である。

治療される疾患または障害としては、限定されないが、変性障害、がん、糖尿病、自己免疫障害、心血管障害、凝固障害、眼の疾患、感染性疾患、および１つ以上の遺伝子の変異によって引き起こされる疾患が挙げられる。

例示的な変性疾患としては、限定されないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病）、がん、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、慢性外傷性脳症、嚢胞性線維症、いくつかのシトクロムｃオキシダーゼ欠乏症（多くの場合に変性リー症候群の原因）、エーラス・ダンロス症候群、進行性骨化性線維異形成症、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、いくつかの心血管疾患（例えば、冠動脈疾患、大動脈弁狭窄症などのアテローム性動脈硬化症）、ハンチントン病、乳児神経軸索ジストロフィー、円錐角膜（ＫＣ）、球状角膜、白質ジストロフィー、黄斑変性（ＡＭＤ）、マルファン症候群（ＭＦＳ）、いくつかのミトコンドリア筋症、ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、多系統萎縮症、筋ジストロフィー（ＭＤ）、神経セロイドリポフスチン症、ニーマン・ピック病、変形性関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、肺動脈性肺高血圧症、すべてのプリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症など）、進行性核上性麻痺、網膜色素変性症（ＲＰ）、関節リウマチ、サンドホフ病、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ、運動ニューロン疾患）、亜急性硬化性全脳炎、テイ・サックス病、および血管性認知症（それ自体が神経変性ではないが、多くの場合、変性性認知症の他の形態と一緒に現れる）が挙げられる。

例示的ながんとしては、限定されないが、あらゆる形態のがん腫、黒色腫、芽細胞腫、肉腫、リンパ腫および白血病が挙げられ、限定されないが、膀胱がん、膀胱がん腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、子宮内膜がん、肝細胞がん、喉頭がん、肺がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がんおよび甲状腺がん、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、上衣腫、ユーイング肉腫、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ラブドイドがん、および腎芽腫（ウィルムス腫瘍）が挙げられる。

例示的な自己免疫障害としては、限定されないが、成人スティル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性自立神経失調症、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性蕁麻疹、軸索神経ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロ病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）または好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心臓ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合性クリオグロブリン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性疱疹または妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッカ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）またはＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼類瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、腫瘍随伴性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、扁平部炎（末梢ぶどう膜炎）、パーソネイジ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢ニューロパチー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強皮症、シェーグレン症候群、自己免疫性精子精巣形成障害、スティッフパーソン症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、サザック症候群、交感性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、およびフォークト・小柳・原田病が挙げられる。

例示的な心血管障害としては、限定されないが、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、狭心症、心筋梗塞、卒中、心臓発作、心不全、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患（ｔｈｅｕｍａｔｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ）、心筋症、異常な心調律、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、血栓塞栓性疾患、および静脈血栓塞栓症が挙げられる。

例示的な凝固障害としては、限定されないが、血友病、フォン・ヴィレブランド病、播種性血管内凝固、肝疾患、循環抗凝血素の過剰発生、ビタミンＫ欠乏症、血小板機能障害、および他の凝固不全が挙げられる。

例示的な眼の疾患としては、限定されないが、黄斑変性、眼球突出、白内障、ＣＭＶ網膜炎、糖尿病黄斑浮腫、緑内障、円錐角膜、高眼圧症、眼性片頭痛、網膜芽細胞腫、結膜下出血、翼状片、角膜炎、ドライアイ、および角膜剥離が挙げられる。

例示的な感染性疾患としては、限定されないが、急性弛緩性脊髄炎（ＡＦＭ）、アナプラズマ病、炭疽、バベシア症、ボツリヌス症、ブルセラ症、カンピロバクター症、カルバペネム耐性感染（ＣＲＥ／ＣＲＰＡ）、軟性下疳、チクングニアウイルス感染（チクングニア）、クラミジア、シガテラ（有毒な藻類ブルーム（ＨＡＢ））、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＤｉｆｆｉｃｉｌｅ感染、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＰｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（イプシロン毒素）、コクシジオイデス真菌感染（バレー熱）、ＣＯＶＩＤ－１９（コロナウイルス病２０１９）、クロイツフェルト・ヤコブ病、伝達性海綿状脳症（ＣＪＤ）、クリプトスポリジウム症（クリプト）、サイクロスポラ症、デング１，２，３，４（デング熱）、ジフテリア、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、志賀毒素産生（ＳＴＥＣ）、東部馬脳炎（ＥＥＥ）、エボラ出血熱（Ｅｂｏｌａ）、エールリヒア症、脳炎、アルボウイルスまたは傍感染性、エンテロウイルス感染、非ポリオ（非ポリオエンテロウイルス）、エンテロウイルス感染、Ｄ６８（ＥＶ－Ｄ６８）、ジアルジア症（ジアルジア）、鼻疽、淋菌感染（淋病）、鼠径部肉芽腫、ヘモフィルスインフルエンザ感染症、Ｂ型（ＨｉｂまたはＨ－ｆｌｕ）、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、Ａ型肝炎（ＨｅｐＡ）、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）、Ｃ型肝炎（ＨｅｐＣ）、Ｄ型肝炎（ＨｅｐＤ）、Ｅ型肝炎（ＨｅｐＥ）、ヘルペス、帯状疱疹、水痘ＶＺＶ（帯状疱疹）、ヒストプラスマ感染（ヒストプラスマ症）、ヒト免疫不全ウイルス／ＡＩＤＳ（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザ（Ｆｌｕ）、鉛中毒、レジオネラ症（レジオネラ病）、レプロシー（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症（リステリア）、ライム病、Ｌｙｍｐｈｏｇｒａｎｕｌｏｍａｖｅｎｅｒｅｕｍ感染（ＬＧＶ）、マラリア、麻疹、類鼻疽、髄膜炎、ウイルス性（髄膜炎、ウイルス性）、髄膜炎菌感染症、細菌性（髄膜炎、細菌性）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ムンプス、ノロウイルス、麻痺性貝毒中毒（麻痺性貝毒中毒、シガテラ）、シラミ寄生症（シラミ、頭部および身体のシラミ）、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＷｈｏｏｐｉｎｇＣｏｕｇｈ））ペスト、腺、敗血性、肺（ペスト）、肺炎球菌感染症（肺炎）、灰白髄炎（ポリオ）、ポワサン、オウム病（オウム熱）、乾癬（毛ジラミ、陰部シラミ感染）、膿疱性乾癬（天然痘、サル痘、牛痘）、Ｑ熱、狂犬病、リシン中毒、リケッチア症（ロッキー山紅斑熱）、風疹、先天性を含む（三日はしか）、サルモネラ胃腸炎（サルモネラ）、疥癬感染（疥癬）、スコンブロイド、敗血症性ショック（敗血症）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、細菌性赤痢胃腸炎（赤痢菌）、天然痘、黄色ブドウ球菌感染、メチシリン耐性（ＭＲＳＡ）、黄色ブドウ球菌食中毒、エンテロトキシン－Ｂ中毒（黄色ブドウ球菌食中毒）、黄色ブドウ球菌感染、バンコマイシン中間耐性（ＶＩＳＡ）、黄色ブドウ球菌感染、バンコマイシン耐性（ＶＲＳＡ）、レンサ球菌感染症、Ａ群（侵襲性）（ＳｔｒｅｐＡ（侵襲性））、レンサ球菌感染症、Ｂ群（Ｓｔｒｅｐ－Ｂ）、レンサ球菌毒素性ショック症候群、ＳＴＳＳ、毒素性ショック（ＳＴＳＳ、ＴＳＳ）、梅毒（第１期、第２期、早期潜伏、後期潜伏、先天性）、破傷風感染、破傷風（開口障害）、トリコモナス症（トリコモナス感染）、トリコノシス感染（トリヒナ症）、結核（ＴＢ）、結核（潜在性）（ＬＴＢＩ）、野兎病（野兎熱）、チフス熱（Ｄ群）、チフス、膣炎、細菌性（酵母感染）、ベイピング関連肺傷害（電子タバコ関連肺傷害）、水痘感染症（Ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）、ビブリオ感染症（ビブリオ）、ウイルス性出血熱（エボラ、ラッサ、マールブルグ）、ウエストナイルウイルス、黄熱、エルシニア感染症（エルシニア）、およびジカウイルス感染（ジカ）が挙げられる。

実施例１：ＲＮＡの構築物設計および調製
多種多様な１つ以上の内部標的ＲＮＡモチーフの組み込みを可能にするように、スクリーニング構築物を設計した。以下の２つのモチーフが構築物中に存在した。ＴＰＰリボスイッチドメイン^２７、およびデングウイルスの５’－ＵＴＲからのシュードノット^２６。構造カセットと、ＲＮＡバーコードヘリックスと、２つの試験ＲＮＡ構造（６ヌクレオチドリンカーによって分離された）とを含む、完全な構築物配列のための設計を、ＲＮＡ構造を使用して評価した^３９。２つの試験構造が相互作用する可能性を減少させるために、天然の折り畳みを保持しつつ、ＲＮＡ構造によって予想される誤って折り畳まれた構造を阻止するために、少数の配列変化を作製した（図７）。最終構築物の構造を、ＳＨＡＰＥ－ＭａＰによって確認した。

ＲＮＡバーコードを、自己を含むヘアピンへと折り畳まれるように設計した（図７）。ＲＮＡバーコードのすべての可能な置き換えを計算し、全構築配列の観点で折り畳み、ＲＮＡ構築物の別の部分と相互作用する可能性を有していた任意のバーコードを、このセットから除去した。バーコード化された構築物を、「リガンドなし」プロトコルを使用して、ＳＨＡＰＥ－ＭａＰによってプロービングし、ＳＨＡＰＥ反応性の拘束を有するＲＮＡ構造を使用して折り畳み、バーコードヘリックスが、所望な自己を含むヘアピンへと折り畳まれることを確認した。

ＲＮＡの調製
インビトロ転写のためのＤＮＡテンプレート（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、標的構築物配列（デングシュードノット配列、一本鎖リンカー、およびＴＰＰリボスイッチ配列を含有する）および隣接する構造カセット^２５をコードした。

プライマー結合部位は、下線が引かれている。固有のＲＮＡバーコードおよびＴ７プロモーター配列を含有する順方向ＰＣＲプライマーを使用して、個々のＰＣＲ反応において、９６個の構築物各々にＲＮＡバーコードを個々に付加した。太字のバーコードヌクレオチドと、下線が引かれているプライマー結合部位とを有する、試料の順方向プライマー配列は、

である。

２００μＭのｄＮＴＰミックス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、５００ｎＭの順方向プライマー、５００ｎＭの逆方向プライマー、１ｎｇのＤＮＡテンプレート、２０％（ｖ／ｖ）のＱ５反応緩衝液、および０．０２Ｕ／μＬのＱ５ホットスタート高忠実度ポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用したＰＣＲによってＤＮＡを増幅させ、インビトロ転写のためのテンプレートを作成した。ＤＮＡを精製し、（ＰｕｒｅＬｉｎｋＰｒｏ９６ＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００Ｐｒｏマイクロプレートリーダで定量化した（Ｑｕａｎｔ－ｉＴｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

インビトロ転写を、各ウェルが１００μＬの総反応体積を含有する９６ウェルプレートフォーマットで実施した。各ウェルは、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、４０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭのスペルミジン、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ、１０ｍＭのＤＴＴ、および２００～８００ｎＭの固有にバーコード化されたＤＮＡテンプレート（ＰＣＲによって生成された）中、５ｍＭのＮＴＰ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、０．０２Ｕ／μＬの無機ピロホスファターゼ（酵母、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、０．０５ｍｇ／ｍＬのＴ７ポリメラーゼを含有していた。反応物を３７℃で４時間インキュベートし、次いで、ＴｕｒｂｏＤＮａｓｅ（ＲＮａｓｅを含まない、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、最終濃度０．０４Ｕ／μＬで処理し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、第２のＤＮａｓｅを総最終濃度が０．０８Ｕ／μＬになるまで添加し、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを最終濃度が５０ｍＭになるまで添加することによって酵素反応を停止させ、氷上に置いた。ＲＮＡを、９６ウェルフォーマットで精製し（ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＲＮＡｃｌｅａｎＸＰ磁気ビーズ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁させた。ＲＮＡ濃度を、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００Ｐｒｏマイクロプレートリーダで定量化し（Ｑｕａｎｔ－ｉＴＲＮＡ広範囲アッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、各ウェル中のＲＮＡを、個々に１ｐｍｏｌ／μＬまで希釈した。ＲＮＡを－８０℃で保管した。

実施例２：小分子断片の化学修飾およびスクリーニング
それらのＲｏ３多様性断片ライブラリのサブセットであり、５０ｍＭでＤＭＳＯに溶解した１５００個の化合物を含有する、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅからの断片スクリーニングライブラリとして、断片を得た。これらの化合物の大部分は、３００Ｄａ未満の分子質量を有する、３個以下の水素結合供与体および３個以下の水素結合受容体を含有する、ならびにＣｌｏｇＰ≦３．０という断片化合物についての「３つのルール」を忠実に守っていた。実施例５に列挙されている化合物を除き、ＩＴＣに使用されるすべての化合物は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａから購入され、さらに精製することなく使用された。スクリーニング実験は、８チャネル空気入れ替えピペッティングアームと、使い捨てフィルタチップと、ロボットマニピュレータアームとＥｃｈｏＴｈｅｒｍＲＩＣ２０遠隔制御加熱／冷却乾燥浴（ＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を取り付けたＴｅｃａｎＦｒｅｅｄｏｍＥｖｏ－１５０液体ハンドラ上で、９６ウェルプレートフォーマット中、２５μＬで実施した。スクリーニングに使用される液体ハンドラのプログラムは、要求に応じて利用可能である。

第１の断片－リガンドスクリーニングについて、ウェル当たり５ｐｍｏｌのＲＮＡを、４℃の冷却ブロック上で、ＲＮａｓｅを含まない水中１９．６μＬまで希釈した。プレートを９５℃で２分間加熱し、直後に４℃で５分間、迅速冷却した。各ウェルに、１９．６μＬの２倍の折り畳み緩衝液（最終濃度５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ８．０、２００ｍＭ酢酸カリウム、および１０ｍＭＭｇＣｌ_２）を加え、プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。第２の断片－リガンドスクリーニングについて、ウェル当たり２４．３μＬの折り畳まれたＲＮＡを、ＤＭＳＯ中の２．７μＬの一次結合断片に最終濃度が断片のＫ_ｄの１０倍になるまで加え、試料を３７℃で１０分間インキュベートした。標的ＲＮＡを断片と組み合わせるために、２４．３μＬのＲＮＡ溶液またはＲＮＡと一次結合断片を、２．７μＬの１０倍のスクリーニング断片を含有するウェルに加えた（ＤＭＳＯ中で、最終断片濃度１ｍＭが得られる）。溶液をピペッティングにより十分に混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。ＳＨＡＰＥプロービングについて、スクリーニングプレートの各ウェルからの２２．５μＬのＲＮＡ断片溶液を、３７℃の加熱ブロック上で、２．５μＬのＤＭＳＯ中の１０倍ＳＨＡＰＥ試薬に加え、ピペッティングによって迅速に混合し、ＳＨＡＰＥ試薬とＲＮＡの均一な分布を達成した。適切な反応時間後、試料を氷上に置いた。第１の断片スクリーニングについて、１－メチル－７－ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７）を１０ｍＭの最終濃度でＳＨＡＰＥ試薬として使用して、５分間反応させた。第２の断片スクリーニングについて、５－ニトロイサト酸無水物（５ＮＩＡ）^４０を２５ｍＭの最終濃度でＳＨＡＰＥ試薬として使用して、１５分間反応させた。過剰な断片、溶媒、および加水分解したＳＨＡＰＥ試薬を、ＡｕｔｏＳｃｒｅｅｎ－Ａ９６－ＷｅｌｌＰｌａｔｅｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して除去し、９６ウェルプレートの各ウェルからの５μＬの修飾ＲＮＡを、配列決定ライブラリ調製のために、プレートごとに単一の試料にプールした。

各スクリーニングは、１９個の断片試験プレートと、陽性（断片２、最終濃度１ｍＭ）および陰性（溶媒、ＤＭＳＯ）対照の分布を含有する２つのプレートと、ＳＨＡＰＥ試薬の代わりに溶媒（ＤＭＳＯ）で処理された１つの陰性ＳＨＡＰＥ対照プレートとからなっていた。ヒット検証実験について、各ヒット断片のウェル位置を変更して、ウェル位置およびＲＮＡバーコード効果を制御した。一次スクリーニングと二次スクリーニングの両方についてのプレートマップも同様に利用可能であった。

試験断片のスクリーニングが完了したら、統計検定を行い、所与のヌクレオチドの修飾率の差を識別する。具体的には、スクリーニング分析は、断片の存在下での所与のヌクレオチドの修飾率を、断片の非存在下と比較して、統計的に比較することを必要とする。各ヌクレオチドについて、所与の反応物における修飾の数は、既知の分散を有するＰｏｉｓｓｏｎプロセスであり、したがって、２つの試料間の修飾率の観察された差の統計的有意性は、ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｗｏＰｏｉｓｓｏｎＣｏｕｎｔｓ検定^３１を実行することによって確認することができる。すなわち、試験したヌクレオチドのｍ_１修飾を試料１のｎ_１リードの中でカウントし、ｍ_２修飾を試料２のｎ_２リードの中でカウントする場合、試験されたヌル仮説は、すべてのカウントされた修飾（ｍ_１＋ｍ_２）の中で、試料１における修飾の割合が、ｐ_１＝ｎ_１／（ｎ_１＋ｎ_２）であることを予測する。この仮説のＺ検定は、

である。

Ｚ値が、指定された有意性閾値を超える場合、試験されたヌクレオチドは、試験断片の存在によって統計的に有意に影響を受けると解釈される。

次に、各断片について、Ｚ検定は、偽陽性の確率が増加する、ＲＮＡ配列を含む多数のヌクレオチドに対して行われる必要がある。ヌクレオチド当たりのＳＨＡＰＥ反応性の偽陽性の割り当て数は、Ｚ有意性閾値を上げることによって最小限に抑えることができるが、このアプローチは、スクリーニングの感度を低下させる（より弱い結合リガンドを検出する能力を低下させることを意味する）。実施されるＺ検定の数を減らすために、このような検定を、ＲＮＡスクリーニング構築物中のすべてのヌクレオチドではなく、目的の領域中のヌクレオチドにのみ適用した。ＲＮＡのデングモチーフについて、目的の領域は、位置５９～１１０であった。ＴＰＰモチーフについて、目的の領域は、位置１００～１９９であった。両方の試料において低い修飾率を有するヌクレオチドを省くことによって、Ｚ検定の数をさらに減らした。ヌクレオチドが低い修飾率を有するとみなすための閾値を、所与のプレートのすべての９６ウェル中のすべてのヌクレオチドにわたって計算したプレート平均修飾率の２５％に設定した。Ｚ検定は、２つの比較された試料のうちの少なくとも１つにおいて、この２５％の閾値を超える修飾率を有するヌクレオチドに対してのみ実施された。

理想的には、２つの比較された試料における条件間の唯一の差は、一方の試料には断片が存在するが、他方には存在しないことであろう。陰性対照試料を互いに対して試験することを利用して、ヌクレオチド修飾率の試料間変動を導入し得る制御できない因子の発生率を判断することができる。例えば、Ｚ有意性閾値を２．７に設定した場合、任意のそのような因子が存在しない場合、陰性対照（断片なし）試料の対に適用されるＺ検定は、理論的には、確率Ｐ＝０．００３５で異なる反応性のヌクレオチドを識別するはずである。しかし、一次スクリーニングで試験した５８７個の陰性対照試料からランダムに選択した陰性対照試料の対にＺ検定を適用すると、実際の確率はＰ＝０．３２であり、９０倍高かった。したがって、個々のヌクレオチドにおいて、断片の非存在下でのＳＨＡＰＥ反応性に統計的に有意な変動があった。

大部分の複製物は、本質的に同じプロファイルを共有していたが、異なるプロファイルを有する複製物が相当数存在した。いくつかの決定係数は、０．８５と低かった。Ｚ検定を異なる陰性対照試料に適用すると、多数の場合が生成され、ヌクレオチドが、反応性に差があると誤って分類された。この結果を回避するために、各試料を、最も相関性の高い５つの陰性対照試料と比較した。Ｚ有意性閾値が２．７の陰性対照のこのような選択的な対に適用されるＺ検定は、確率Ｐ＝０．０６７で異なる反応性のヌクレオチドを識別した。

この確率は、理論上のＰ＝０．００３５より約２０倍高く、このことは、試料処理に変動があることを示している。この変動のいくつかは、試料中のすべてのＲＮＡのすべてのヌクレオチドの反応性にわたって等しいスケールで存在する。この変動は、より反応性の低い試料中の全体的な反応性と一致するように、より反応性の高い試料中の全体的な反応性をスケールダウンすることによって除去することができる。このようなスケーリングは、（ｉ）ＲＮＡ配列中の各ヌクレオチドについて、より反応性の低い試料中の修飾率に対する、より反応性の高い試料中の修飾率の比率を計算し、（ｉｉ）より反応性の高い試料中のすべてのヌクレオチドの修飾率を、ステップ（ｉ）で得られた比率の中央値で割り算することによって実施された。陰性対照ウェルの相関を最大化した対のこのようなスケーリングは、ヌクレオチドヒットを発見する確率をＰ＝０．０３０まで下げ、これは理論的確率よりも９倍高かった。したがって、実際にすべての高スループットスクリーニングアッセイにおいて生じるため、断片の偽陽性識別が生じ、リガンド以外の変動からの実際の断片ヒットは、複製物ＳＨＡＰＥ検証と、ＩＴＣを使用する直接的なリガンド結合測定によって区別された。

有効なリガンドは、標的ＲＮＡ中の複数のヌクレオチドの修飾率に影響を及ぼすと予想されるため、陰性対照とは異なる反応性を有するヌクレオチドの数が、２に設定された所定の閾値を超える場合にのみ、断片がヒットであると認識された。第２に、断片がＲＮＡに及ぼす比較的安定した影響を探究する場合、ヌクレオチドの反応性における小さな相対的な差は、統計的に有意であっても、異なる反応性のヌクレオチドの総数から除外された。実際には、最小許容差は、平均の２０％に設定され、
｜ｒ_１－ｒ_２｜／（ｒ_１＋ｒ_２）／２＝０．２、
式中、ｒ_１およびｒ_２は、２つの試料中のヌクレオチド修飾率である。第３に、所与の試料を、最も相関性の高い５つの陰性対照試料に対して試験した。５つの試験はすべて、陰性対照試料に対して変化した試験試料を発見するために必要であった。

最後に、スクリーニングの感度および特異性を、Ｚ有意性閾値の選択によって制御した。断片を含有する試料およびすべての陰性対照試料の評価を、複数のＺ有意性閾値設定で行った。かかる設定ごとに、偽陽性断片（ＦＰＦ）を、変化したことが発見された陰性対照試料の分率として計算し、リガンド分率（ＬＦ）を、断片を含有する変化した試料の分率からＦＰＦを引き算することによって概算した。ＬＦとＦＰＦのバランスは、それらの比率であるＬＦ／ＦＰＦによって定量化した。ＴＰＰリボスイッチＲＮＡの最良のバランス

は、２．５～２．７の範囲のＺ有意性閾値（０．０２２＞ＦＰＦ＞０．０１４）で達成された。デングシュードノットについて、最良のバランス

は、２．５～２．６５の範囲のＺ有意性閾値（０．００７＞ＦＰＦ＞０．００５）で達成された。

実施例３：ライブラリ調製および配列決定
１００μＬの体積でプールされた修飾ＲＮＡに対して逆転写を行った。７１μＬのプールしたＲＮＡに、６μＬの逆転写プライマーを添加して、１５０ｎＭのプライマー最終濃度を達成し、試料を６５℃で５分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。この溶液に、６μＬの１０倍の第１の鎖緩衝液（５００ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、７５０ｍＭＫＣｌ）、４μＬの０．４ＭＤＴＴ、８μＬのｄＮＴＰミックス（各々１０ｍＭ）、および１５μＬの５００ｍＭＭｎＣｌ_２を添加し、溶液を４２℃で２分間インキュベートした後、８μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。反応物を４２℃で３時間インキュベートし、その後、７０℃の熱不活性化を１０分間行った後、氷上に置いた。得られたｃＤＮＡ産物を精製し（ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＲＮＡＣｌｅａｎ磁気ビーズ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）、ＲＮａｓｅを含まない水に溶出させ、－２０℃で保存した。逆転写プライマーの配列は、５’－ＣＧＧＧＣＴＴＣＧＧＴＣＣＧＧＴＴＣ－３’（配列番号３）であった。

ＤＮＡを増幅し、必要なＴｒｕＳｅｑアダプター^２４を添加するための２ステップＰＣＲ反応を使用して、配列決定のためにＤＮＡライブラリを調製した。２００μＭのｄＮＴＰミックス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、５００ｎＭの順方向プライマー、５００ｎＭの逆方向プライマー、１ｎｇのｃＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡテンプレート、２０％（ｖ／ｖ）のＱ５反応緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、および０．０２Ｕ／μＬのＱ５ホットスタート高忠実度ポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用したＰＣＲによってＤＮＡを増幅させた。過剰な組み込まれていないｄＮＴＰおよびプライマーをアフィニティ精製（ＡｇｅｎｃｏｕｒｔＡｍｐｕｒｅＸＰ磁気ビーズ、ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、試料とビーズの比率０．７：１で）によって除去した。ＤＮＡライブラリをＱｕｂｉｔ蛍光計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で定量化し（ＱｕｂｉｔｄｓＤＮＡＨｉｇｈＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙアッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、品質をチェックし（Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００オンチップ電気泳動機器、Ａｇｉｌｅｎｔ）、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ５５０高スループットシーケンサで配列決定した。

ＳＨＡＰＥ－ＭａＰライブラリ調製アンプリコン特異的順方向プライマーは、

であった。ＳＨＡＰＥ－ＭａＰライブラリ調製アンプリコン特異的逆方向プライマーは、

であった。ＲＮＡスクリーニング構築物と重複する配列は、下線が引かれている。

実施例４：等温滴定カロリメトリー
ＩＴＣ実験は、ＲＮａｓｅを含まない条件下で、ＭｉｃｒｏｃａｌＰＥＡＱ－ＩＴＣ自動化機器（ＭａｌｖｅｒｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して実施した^４１。インビトロで転写されたＲＮＡを、遠心分離濃度（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心分離フィルタ、１０ＫＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－Ｓｉｇｍａ）を使用して、１００ｍＭのＣＨＥＳ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭの酢酸カリウム、および３ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する折り畳み緩衝液に交換した。リガンドを、ＲＮＡの所望の実験濃度の１０～２０倍の濃度で、同じ緩衝液に溶解した（リガンドをＲＮＡに添加したときの混合の熱を最小限に抑えるために）。ＲＮＡ濃度を定量化し（ＮａｎｏｄｒｏｐＵＶ－ＶＩＳ分光計、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、緩衝液中、予想されるＫ_ｄの１～１０倍まで希釈し、希釈されたＲＮＡを再定量化し、最終的な実験ＲＮＡ濃度を確認した。折り畳み緩衝液で希釈したＲＮＡを６５℃で５分間加熱し、氷上に５分間置き、３７℃で１５分間かけて折り畳んだ。必要に応じて、一次結合リガンド（例えば、２）を、結合したリガンドの所望の最終濃度の１０倍で０．１体積を添加することによってＲＮＡに予め結合し、その後、室温で１０分間インキュベートした。

各ＩＴＣ実験は、リガンドをＲＮＡに滴定したもの（実験トレース）と、同じリガンドを緩衝液に滴定したもの（対照トレース）の２回の試行を伴っていた。ＩＴＣ実験を、以下のパラメータを使用して実施した。２５℃のセル温度、８μＣａｌ／秒の参照電力、７５０ＲＰＭの撹拌速度、高フィードバックモード、０．２μＬの初期注射、続いて２μＬの１９回の注射。各注射は、完了するのに４秒を必要とし、注射の間に１８０秒の間隔があった。

ＩＴＣデータを、ＭｉｃｒｏＣａｌＰＥＡＱ－ＩＴＣＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ（ＭａｌｖｅｒｎＡｎａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して分析した。まず、各注射ピークについてのベースラインを手動で調整して、誤って選択された注射エンドポイントを解消した。第２に、対照トレースを、点同士の引き算によって実験トレースから引き算した。第３に、最小二乗回帰線を、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムを使用して、データにフィッティングした。弱く結合したリガンド（５００μＭを超える）の場合、Ｎを手動で１．０に設定し、低ｃ値曲線のフィッティングを可能にした。

実施例５：試験化合物３５、３６、３７、３８、３９、および４０の化学合成

化合物３５：カルボン酸Ｓ１９から、混合した酸無水物中間体を介し、ヒドロキシルアミン水溶液と反応させることによって、３－Ｃ連結したヒドロキサム酸３５を調製した。酸Ｓ１９は、キノキサリン－６－アミンを、環化無水ジヒドロフラン－２，５－ジオンで処理することによって入手した。

化合物３６：対応するエステルＳ２０から、系中で形成されたヒドロキシルアミンと反応させることによって、２－Ｃ連結した類似体３６を得た。キノキサリン－６－アミンとアクリル酸エチルとのマイケル付加によって、エステルＳ２０を作製した。

化合物３７：中間体Ｓ２１およびＳ２２の合成のために、Ｂｕｃｈｗａｌｄ－Ｈａｒｔｗｉｇ反応を使用した。エーテル中のＨＣｌを用い、保護基（Ｂｏｃ）の除去を達成し、その後、Ｎａ_２ＣＯ_３でさらに処理して３７を得た。

化合物３８：イミン形成、ならびにその後のキノキサリン－６－カルバルデヒドおよびジアミンの水素化ホウ素ナトリウム還元により、３８を得た。

化合物３９：イミン形成、ならびにその後のキノキサリン－６－イルメタンアミン塩酸塩およびアルデヒドＳ２３の水素化ホウ素ナトリウム還元、Ｓ_ＮＡｒ反応によって中間体Ｓ２４を得て、ＨＣｌを用いた（Ｂｏｃ）脱保護の後、３９を得た。

化合物４０：３，５－ジブロモピリジンとの２回のＢｕｃｈｗａｌｄ－Ｈａｒｔｗｉｇ反応の後、ＨＣｌを用いた（Ｂｏｃ）脱保護によって、拘束がほとんどない類似体４０を作製した。

実施例６：Ｘ線結晶学
２の構造バリアントが、ＴＰＰリボスイッチの良好な結合候補であるかどうかを評価するために、化合物１７をＸ線結晶学的研究で調べた。ＴＰＰリボスイッチＲＮＡは、記載されるようにインビトロ転写によって調製した^２７。ＴＰＰリボスイッチＲＮＡ（０．２ｍＭ）および１７（２ｍＭ）を、５０ｍＭの酢酸カリウム（ｐＨ６．８）および５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中、６０℃で３分間加熱し、砕いた氷で迅速冷却し、４℃で３０分間インキュベートした後、結晶化した。結晶化のために、１．０μＬのＲＮＡ－１７複合体を、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）、０．３５Ｍの酢酸アンモニウム、および２８％（ｖ／ｖ）のＰＥＧ４０００を含有する１．０μＬの貯蔵溶液と混合した。２週間にわたるハンギングドロップ蒸気拡散によって、２９１Ｋで結晶化を行った。結晶を、１５％のグリセロールを追加した母液中で凍結保護した後、液体窒素中で迅速凍結させた。ＮＳＬＳ－ＩＩ（ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、波長０．９２０２Å、１７－ＩＤ－２（ＦＭＸ）ビームラインでデータを集めた。ＨＫＬ２０００４３でデータを処理した。Ｐｈｅｎｉｘ４４および２ＧＤＩリボスイッチＲＮＡ構造を使用して、構造を分子置換によって解決した^２７。構造をＰｈｅｎｉｘで精緻化した。有機リガンド、水分子およびイオンを、Ｆｏ－Ｆｃおよび２Ｆｏ－Ｆｃ電子密度マップに基づいて、精緻化の後期段階で添加した。

結果は、化合物１７が、Ｊ３／２接合部中のＧ４２およびＡ４３の間に積み重なって、ＴＰＰリガンドのチアミン部分と同様の様式でＴＰＰリボスイッチに結合することを示した（図３）^{２７、２８}。１７は、ＲＮＡと、Ｇ４０のリボースおよびＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ面に対して各々１個、Ｇ１９のリボースに対して１個の３個の水素結合を形成する。天然ＴＰＰリガンドとの複合体中のＲＮＡと比較して、局所的なＲＮＡ構造に有意な変化がある。１７結合構造では、Ｇ７２は、ＴＰＰリガンドのピロリン酸部分が存在する結合部位内でひっくり返る。この結合モードは、リボスイッチ結合ポケットのチアミンサブサイトに結合された断片のためのひっくり返ったＧ７２配向を可視化した従来の研究と一致する^{１７、３４}。ＳＡＲ分析と一致して、Ｃ－６置換基の配向は、ＲＮＡとの相互作用によって比較的妨げられていないように思われ、このことは、このベクターが断片精製のための良好な候補となることを暗示している。

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２９．Ｔｈｏｒｅ，Ｓ．，Ｆｒｉｃｋ，Ｃ．＆Ｂａｎ，Ｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂａｓｉｓｏｆｔｈｉａｍｉｎｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅａｎａｌｏｇｕｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１１６－８１１７（２００８）．
３０．Ｂｕｓａｎ，Ｓ．＆Ｗｅｅｋｓ，Ｋ．Ｍ．ＡｃｃｕｒａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｉｎＲＮＡｂｙｍｕｔａｔｉｏｎａｌｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＭａＰ）ｗｉｔｈＳｈａｐｅＭａｐｐｅｒ２．ＲＮＡ２４，１４３－１４８（２０１８）．
３１．Ｗｏｏｌｓｏｎ，Ｒ．ＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＤａｔａ．（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７）．
３２．Ｊｈｏｔｉ，Ｈ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．，Ｒｅｅｓ，Ｄ．Ｃ．＆Ｍｕｒｒａｙ，Ｃ．Ｗ．Ｔｈｅ ‘ｒｕｌｅｏｆｔｈｒｅｅ’ ｆｏｒｆｒａｇｍｅｎｔ－ｂａｓｅｄｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：Ｗｈｅｒｅａｒｅｗｅｎｏｗ？Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．１２，６４４（２０１３）．
３３．Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｂｉｎｇｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ－ｌｉｇａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｔｈｉａｍｉｎｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０，５９２４－５９３１（２０１２）．
３４．Ｗａｒｎｅｒ，Ｋ．Ｄ．＆Ｆｅｒｒｅ－Ｄ’Ａｍａｒｅ，Ａ．Ｒ．ＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＴＰＰｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈｂｉｎｄｉｎｇｂｙｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｌｉｇａｎｄｓｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｔｈｒｏｕｇｈｆｒａｇｍｅｎｔ－ｂａｓｅｄｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．５４９，２２１－２３３（２０１４）．
３５．Ｃｏｄｄ，Ｒ．Ｔｒａｖｅｒｓｉｎｇｔｈｅｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｂｉｏｌｏｇｙｏｆｈｙｄｒｏｘａｍｉｃａｃｉｄｓ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２５２，１３８７－１４０８（２００８）．
３６．Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．Ｏｎｔｈｅａｔｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄａｄｄｉｔｉｖｉｔｙｏｆｂｉｎｄｉｎｇｅｎｅｒｇｉｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，４０４６－４０５０（１９８１）．
３７．Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋ，Ｅ．Ｔ．ｅｔａｌ．Ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｄｅｓｉｇｎｅｄｆｒｏｍｗｅａｋｌｙｂｏｕｎｄｆｒａｇｍｅｎｔｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｉｎｋｉｎｇａｎｄｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，５８２８－５８３２（１９９７）．
３８．Ｂｏｒｓｉ，Ｖ．，Ｃａｌｄｅｒｏｎｅ，Ｖ．，Ｆｒａｇａｉ，Ｍ．，Ｌｕｃｈｉｎａｔ，Ｃ．＆Ｓａｒｔｉ，Ｎ．Ｅｎｔｒｏｐｉｃｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｔｏｔｈｅｌｉｎｋｉｎｇｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｂａｓｅｄｄｒｕｇｄｅｓｉｇｎ：Ａｃａｓｅｓｔｕｄｙ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５３，４２８５－４２８９（２０１０）．
３９．Ｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．Ｓ．＆Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｓｏｆｔｗａｒｅｆｏｒＲＮＡｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ．ＢＭＣＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１１，１２９（２０１０）．
４０．Ｂｕｓａｎ，Ｓ．，Ｗｅｉｄｍａｎｎ，Ｃ．Ａ．，Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ａ．＆Ｗｅｅｋｓ，Ｋ．Ｍ．ＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒＳＨＡＰＥＲｅａｇｅｎｔＣｈｏｉｃｅａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｔｒａｔｅｇｙｆｏｒＲＮＡＳｔｒｕｃｔｕｒｅＰｒｏｂｉｎｇＳｔｕｄｉｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５８，２６５５－２６６４（２０１９）．
４１．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｓ．Ｄ．＆Ｂａｔｅｙ，Ｒ．Ｔ．ＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇＲＮＡ－ｌｉｇａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｔｉｔｒａｔｉｏｎｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５４０，９７－１１４（２００９）．
４２．Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｗ．Ｂ．ＤｉｖｉｄｅｄＷｅＦａｌｌ？ＳｔｕｄｙｉｎｇｌｏｗａｆｆｉｎｉｔｙｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆｌｉｇａｎｄｓｂｙＩＴＣ．ＭｉｃｒｏｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＮｏｔｅｓ（２００５）．
４３．Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．＆Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆＸ－ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎｄａｔａｃｏｌｌｅｃｔｅｄｉｎｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｍｏｄｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）．ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００７６－６８７９（９７）７６０６６－Ｘ．
４４．Ｌｉｅｂｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．ｅｔａｌ．ＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＸ－ｒａｙｓ，ｎｅｕｔｒｏｎｓａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎｓ：ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＰｈｅｎｉｘ．ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．７５，８６１－８７７（２０１９）．
４５．Ｈａｊｄｕｋ，Ｐ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｐｏｔｅｎｔｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｕｓｉｎｇＳＡＲｂｙＮＭＲ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，５８１８－５８２７（１９９７）．
４６．Ｈｏｗａｒｄ，Ｎ．ｅｔａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｒａｇｍｅｎｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｉｎｋｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｎｏｖｅｌｔｈｒｏｍｂｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４９，１３４６－１３５５（２００６）．
４７．Ｂａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆａｎｏｖｅｌＨｓｐ９０ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｂｙｆｒａｇｍｅｎｔｌｉｎｋｉｎｇ．ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ５，１６９７－１７００（２０１０）．
４８．Ｍｏｂｉｔｚ，Ｈ．ｅｔａｌ．ＤｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆＰｏｔｅｎｔ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ，ａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙＮｏｖｅｌＤｏｔ１ＬＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｂｙａＦｒａｇｍｅｎｔＬｉｎｋｉｎｇＡｐｐｒｏａｃｈ．ＡＣＳＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８，３３８－３４３（２０１７）．
４９．Ｈｕｎｇ，Ａ．Ｗ．ｅｔａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｒａｇｍｅｎｔｇｒｏｗｉｎｇａｎｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｉｎｋｉｎｇｔｏｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．４８，８４５２－８４５６（２００９）．
５０．Ｊｏｒｄａｎ，Ｊ．Ｂ．ｅｔａｌ．Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ＬｉｎｋｉｎｇＡｐｐｒｏａｃｈＵｓｉｎｇ１９ＦＮＭＲＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｔｏＯｂｔａｉｎＨｉｇｈｌｙＰｏｔｅｎｔａｎｄＳｅｌｅｃｔｉｖｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆ β－Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５９，３７３２－３７４９（２０１６）．
５１．Ｍａｌｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｃｈｏｏｎｇ，Ｉ．Ｃ．＆Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌｔａｒｇｅｔ－ｇｕｉｄｅｄｌｉｇａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｔｅｎｔｓｕｂｔｙｐｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃ－Ｓｒｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，２４１９－２４２４（２０００）．
５２．Ｓｈｕｋｅｒ，Ｓ．Ｂ．，Ｈａｊｄｕｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｍｅａｄｏｗｓ，Ｒ．Ｐ．＆Ｆｅｓｉｋ，Ｓ．Ｗ．ＤｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇＨｉｇｈ－ＡｆｆｉｎｉｔｙＬｉｇａｎｄｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＳＡＲｂｙＮＭＲ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（８０－．）．２７４，１５３１－１５３４（１９９６）．
５３．Ｍｏｎｄａｌ，Ｍ．ｅｔａｌ．ＦｒａｇｍｅｎｔＬｉｎｋｉｎｇａｎｄＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｔｈｅＡｓｐａｒｔｉｃＰｒｏｔｅａｓｅＥｎｄｏｔｈｉａｐｅｐｓｉｎ：Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ＢａｓｅｄＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎＦａｃｉｌｉｔａｔｅｄｂｙＤｙｎａｍｉｃＣｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５５，９４２２－９４２６（２０１６）．
５４．Ｓｗａｙｚｅ，Ｅ．Ｅ．ｅｔａｌ．ＳＡＲｂｙＭＳ：ＡｌｉｇａｎｄｂａｓｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｄｒｕｇｌｅａｄｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｇａｉｎｓｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄＲＮＡｔａｒｇｅｔｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，３８１６－３８１９（２００２）．

Claims

式（Ｉ）の構造を有する化合物であって、

式中、
Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、それぞれの場合に、独立して、ＣＲ_１、ＣＨＲ_１、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、およびＳから選択され、隣接するＸ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、同時にＯもしくはＳであるように選択されず、
破線は、任意選択の二重結合を表し、
Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３は、それぞれの場合に、独立して、ＣＲ_２およびＮから選択され、
ｎは、１もしくは２であり、ｎが１である場合、前記破線のうちの１つだけが二重結合であり、
Ｌは、

から選択され、
式中、ｐ、ｑ、ｒ、およびｖは、独立して、整数０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０から選択され、ｚは、整数１、２、３、４、および５から選択され、
Ａは、

から選択され、
式中、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７は、独立して、ＣＲ_３およびＮから選択され、
Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３は、独立して、－Ｈ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｆ、－ＣＦ_３、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＮＨ_２、－ＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）_２、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－Ｏ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＯＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＮＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、－ＣＯＮＨ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、および置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキルから選択され、
ｍは、１もしくは２であり、
Ｗは、－Ｏまたは－ＮＲ_４であり、Ｒ_４は、－Ｈ、－ＣＯ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）、置換もしくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換シクロアルキル、－ＣＯ（アリール）、－ＣＯ（ヘテロアリール）、および－ＣＯ（シクロアルキル）から選択されるから選択され、
Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７のうちの少なくとも２つがＮであることを条件とする、化合物、
またはその薬学的に許容される塩。
Ｘ_１、Ｘ_２、またはＸ_３のうちの少なくとも１つが、Ｎである、請求項１に記載の化合物。
ｎが２である、請求項１または２に記載の化合物。
それぞれの場合に、Ｘ_１、Ｘ_２、およびＸ_３のうちの２つが、Ｎである、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
式（ＩＩ）の構造を有し、

式中、
Ｘ_２ａおよびＸ_２ｂは、独立して、ＣＲ_１およびＮから選択され、
Ｘ_１およびＸ_３は、独立して、ＣＲ_１およびＮから選択され、
ＬおよびＡは、式（Ｉ）について提供される通りであり、
Ｘ_１、Ｘ_２ａ、Ｘ_２ｂ、およびＸ_３のうちの２つは、Ｎである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
式（ＩＩＩ）の構造を有し、

式中、
ＬおよびＡは、式（Ｉ）について提供される通りである、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
ｐ、ｑ、ｒ、およびｖが、独立して、整数０、１、２、および３から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物。
Ｌが、

から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
Ｌが、

である、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物。
ｑおよびｒが、０または１である、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
ｑおよびｒが、１である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
ｑが１であり、ｒが０である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
ｍが１である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の化合物。
Ｗが、－ＮＨ、－Ｏ、および－Ｎ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）_２から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の化合物。
Ｗが、－ＮＨである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の化合物。
Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、およびＸ_７のうちの少なくとも１つが、Ｎである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の化合物。
Ｘ_５またはＸ_６が、Ｎであり、Ｘ_４およびＸ_７の両方が、独立して、ＣＲ_２である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
Ａが、

である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の化合物。
Ｙ_１、Ｙ_２、およびＹ_３が、それぞれの場合に、独立して、ＣＲ_２およびＮから選択され、Ｒ_１が、－Ｈ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ｆ、－ＯＨ、－および－ＮＨ_２から選択される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物。
Ｙ_２が、Ｎである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の化合物。
Ｙ_２が、ＣＲ_２であり、Ｒ_１が、－Ｈ、－Ｆ、－ＯＨ、－および－ＮＨ_２から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の化合物。
前記化合物は、以下の構造

を有する、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
前記化合物が、ＲＮＡ分子の領域に結合する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物。
前記ＲＮＡ分子が、非コードＲＮＡ分子である、請求項２３に記載の化合物。
前記非コードＲＮＡ分子が、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、およびｓｃａＲＮＡから選択される、請求項２４に記載の化合物。
前記ＲＮＡ分子が、コードＲＮＡ分子である、請求項２３に記載の化合物。
前記コードＲＮＡ分子が、ｍＲＮＡである、請求項２６に記載の化合物。
前記ｍＲＮＡの前記領域が、リボスイッチである、請求項２３に記載の化合物。
前記リボスイッチが、ＴＰＰリボスイッチである、請求項２８に記載の化合物。
前記化合物が、約５０ｎＭ～約１００μＭのＫ_ｄ結合親和性を示す、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の化合物。
薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤中に、治療有効量の請求項１～３０のいずれか一項に記載の化合物を含む、組成物。
ＲＮＡ発現の機能障害に関連する疾患または障害を治療する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１～３０のいずれか一項に記載の化合物または請求項３１に記載の組成物の用量を投与することを含む、方法。
前記化合物または組成物を投与することが、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に対する前記化合物の結合に起因するタンパク質発現を低下させる、請求項３２に記載の方法。
前記疾患または障害が、遺伝性疾患、変性障害、がん、糖尿病、自己免疫障害、心血管障害、凝固障害、眼の疾患、感染性疾患、および１つ以上の遺伝子の変異によって引き起こされる疾患から選択される、請求項３２または３３に記載の方法。
前記疾患または障害が、遺伝性疾患であり、前記化合物または前記組成物を投与することが、治療遺伝子の発現をオンまたはオフに切り替える、請求項３４に記載の方法。
前記方法が、
ａ）Ｐｄ触媒の存在下で、式ＩＶの断片を、式Ｖ－１もしくはＶ－２の断片と接触させること、または
ｂ）還元剤の存在下で、式ＩＶの断片を、式ＶＩ－１もしくはＶＩ－２の断片と接触させること、または
ｃ）塩基の存在下で、式ＩＶの断片を、式ＶＩＩ－１もしくはＶＩＩ－２の断片と接触させることを含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の化合物を作製する方法。