ES2524088T3 - Conjugado entre una fase sólida tiofílica y un oligonucleótido que comprende un tiooxonucleótido - Google Patents
Conjugado entre una fase sólida tiofílica y un oligonucleótido que comprende un tiooxonucleótido Download PDFInfo
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Abstract
Conjugado de oligonucleótido-fase sólida, en el que la fase sólida comprende un metal tiofílico, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos una tiooxonucleobase según la fórmula I:**Fórmula** en la que X es CH o N, en la que R1 es H o NH2, en la que --- indica un enlace covalente, y en el que dicho oligonucleótido se une a dicha fase sólida mediante el átomo de azufre de dicho tiooxonucleótido.
Description
E11773415
17-11-2014
- 5’-d(27-T10-AGT ATT GAC CTA) (35)
- 7006,68 7007,20
- 5’-d(28-T10-TAG GTC AAT ACT) (36)
- 7031,69 7032,49
- 5’-d(28-T10-AGT ATT GAC CTA) (37)
- 7031,69 7032,96
- 5’-d(1-T10-TAG GTC AAT ACT) (8)
- 7030,17 7030,81
- 5’-d(1-T10-AGT ATT GAC CTA) (9)
- 7030,17 7031,08
- Espaciador T10 = 5’-d(TTT TTT TTT T).
6.2 Procedimiento general para la preparación de conjugados de oligonucleótido-nanopartícula de oro que utilizan tiooxo-nucleósidos como anclaje molecular.
5 Se preparó una solución de nanopartículas de oro de 15 nm a partir de una solución de HAuCl4 mediante reducción de citrato según el protocolo informado por Turkevich y posteriormente descrito por Letsinger y Mirkin (Mirkin C.A. et al., Nature 283:607-609, 1996; Elghanian R. et al., Science 277:1078-1081, 1997; Turkevich J. et al., Faraday Soc. 11:55-75, 1951). Las nanopartículas de oro (~3 nM) se funcionalizaron con los oligonucleótidos 8 y 9, y 32 a 37 que contenían uno de los tiooxonucleósidos 1, y 26 a 28 en los extremo 5' (Tabla 2). Se prepararon los conjugados de
10 ADN-NPAu mediante la mezcla de 1 ml de la solución de nanopartículas de oro con soluciones purificadas de oligonucleótidos (concentración final de oligonucleótido: 3 μM). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo a temperatura ligeramente elevada (40ºC). Tras dejar en reposo durante 20 h, se añadieron 5 ml de una solución tampón de NaCl 2 M, fosfato 0,2 mM (pH 7,0) bajo agitación constante para incrementar la concentración de NaCl de la solución de nanopartículas a 0,01 M. Las soluciones se incubaron durante 6 a 8 h a 40ºC. Este procedimiento se
15 repitió tres veces para incrementar la concentración de NaCl de la solución de conjugado de nanopartículas escalonadamente de 0,02 M, 0,05 M y finalmente a 0,1 M de NaCl. Entre medio se dejó en todos los casos que las soluciones envejeciesen durante 6 a 8 h a 40ºC. A continuación, se centrifugaron las soluciones de ADNnanopartículas de oro (8.000 rpm) y se separó el sobrenadante transparente para eliminar los oligonucleótidos no unidos. El precipitado se redispersó en 1 ml de una solución tampón de NaCl 0,1 M, fosfato 10 mM (pH 7,0). Tras la
20 incubación (24 h, 40ºC), se lavaron nuevamente las soluciones de nanopartículas con el mismo tampón (tampón de NaCl 0,1 M, fosfato 10 mM, pH 7,0), rindiendo finalmente 1 ml de los conjugados de ADN-NPAu Au8 y Au9 y Au32 a Au37.
Tabla 9. Aplicabilidad de los tiooxonucleósidos 1 y 26 a 28 a la formación de conjugados de nanopartículas de oro.
- Entrada
- Nucleósido Conjugado Conjugado Hibridación de conjugados complementariosc
- 1
- X=26 Au32: sía / nob Au33: sía / nob sí
- 2
- X=27 Au34: sía / nob Au35: sía / nob no
- 3
- X=28 Au36: sía,b Au37: sía,b sí*
- 4
- X=1 Au8: sía,b Au9: sía,b sí
- imagen22
- aSe obtuvieron conjugados estables de oligonucleótido-nanopartícula de oro en tampón de NaCl 0,1 M y fosfato 10 mM, pH 7,0. bSe obtuvieron conjugados estables de oligonucleótido-nanopartícula de oro en tampón de NaCl 0,2 M y fosfato 10 mM, pH 7,0. cEl experimento de hibridación se llevó a cabo en tampón de NaCl 0,1 M y fosfato 10 mM, pH 7,0, con incubación durante la noche. *La formación de la red de ADN-nanopartículas de oro se produjo mucho más lentamente y requirió varios días. Espaciador T10 = 5’-d(TTT TTT TTT T). s=nanopartícula de oro de 15 nm de diámetro.
23
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-
imagen1 imagen2
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