JP5845270B2 - チオフィリック固相およびチオオキソヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間のコンジュゲート - Google Patents

Description

本発明はオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートに関し、ここでその固相はチオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）であり、ここでそのオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基を含み：

式中、ＸはＣＨまたはＮであり、式中、Ｒ１はＨまたはＮＨ２であり、式中、---は共有結合を示し、ここで前記のオリゴヌクレオチドは前記の固相に前記のチオオキソヌクレオチドの硫黄原子を介して結合している。それはそのようなコンジュゲートを製造するための方法ならびにそのようなオリゴヌクレオチド金属コンジュゲートに関する様々な使用も開示する。

生体分子の固体表面へのコンジュゲーションは、例えば免疫アッセイまたは核酸アレイのような多くの診断的適用において重要な工程であり、それらは両方とも生体分子の固相への結合を必要とする。ポリスチレンまたはラテックスの表面または粒子、さらには金属でコートされた表面、金属粒子および量子ドットのような全く異なる固相物質が様々な異なる適用のために利用可能であり、これはそれらの一部にしか言及していない。

利用可能な金属ナノ粒子の中で、量子ドットおよび金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）はそれらの化学的不活性および表面修飾の容易さのため、特別の注目を得た(Mitchell, G.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 8122-8123; Mahtab, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 117 (1995) 9099-9100; Mahtab, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 122 (2000) 14-17; Reynolds III, R.A. et al., Pure Appl. Chem. 72 (2000) 229-235; Thanh, N.T. et al., Anal. Chem. 74 (2002) 1624-1628; Csaki, A. et al., Exp. Rev. Mol. Diagn. 2 (2002) 187-193; Thaxton, C.S., and Mirkin, C.A. in: Nanobiotechnology, Niemeyer, C.M., and Mirkin, C.A. (編者), Wiley-VCH, Weinheim (2004) pp. 288-307)。

例えば、ＤＮＡを金ナノ粒子に結合させることが可能である。そのＤＮＡ金ナノ粒子コンジュゲート系（ＤＮＡ−ＡｕＮＰ）は、金コロイドの好都合な特性をＤＮＡの好都合な特性と組み合わせる。ＤＮＡ分子は、（ｉ）独特の分子認識特性を有し、（ｉｉ）それは自動化されたＤＮＡ合成または酵素的重合により容易に入手され、（ｉｉｉ）一本鎖オリゴヌクレオチドはナノスケールの装置の構築を可能にする多鎖の集合体を形成する能力を有する(Seeman, N.C., Nature 421 (2003) 427-431; Niemeyer, C.M., Curr. Opin. Chem. Biol. 4 (2000) 609-618; Gothelf, K.V. et al., Org. Biom. Chem. 3 (2005) 4023-4037; Seela, F. and Budow, S., Helv. Chim. Acta 89 (2006) 1978-1985; Seela, F. et al., Org. Biomol. Chem. 5 (2007) 1858-1872; Seela, F. et al., Chem. Biodiv. 2 (2005) 84-91)。

オリゴヌクレオチドで機能性付与した（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）金ナノ粒子または金表面は、様々な適用のための、例えばインビトロ診断のために用いられるバイオセンサーのための、インビボ画像化のための、薬物キャリヤーとしての、そして定められたナノ構造物を構築するための核となる要素である。オリゴヌクレオチド金コンジュゲートの使用についての広範囲にわたる文献が存在し、それは以下：Letsinger, R.L. et al., Chemistry of Oligonucleotide - Gold Nanoparticle Conjugates, In: Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, Vol. 144-146 (1999) pp. 359-362; Ingenious nanoprobes in bioassays, Chan, Cangel Pui-yee, Bioanalysis 1 (2009) 115-133;およびBiosensors based on gold nanoparticle labeling, Moeller, R., Annual Review of Nano Research 1 (2006) 429-466において部分的に総説されている。

目的のオリゴヌクレオチドに関する製造の容易さおよびそのようなオリゴヌクレオチドの例えば金粒子への頑強なコンジュゲーション化学は、オリゴヌクレオチドでコートされた金粒子に関する広い範囲の適用を支持する基礎である。

オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）表面上への付着のための一般に用いられるプロトコルは、それらの５’−または３’−末端においてチオール基により修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する(Mirkin, C.A. et al., Nature 382 (1996) 607)。一本鎖オリゴヌクレオチドに、それらの５’−または３’−末端においてそれぞれチオール基を有する非環式リンカーを用いて官能基付与する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）。次いでそのチオールの機能をＡｕＮＰへの共有結合による固定のために用いる。しかし、この修飾は、オリゴヌクレオチド合成の後に追加のカップリング／取り扱い工程を必要とする。

オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）表面上へのコンジュゲーションのための特定の他の方法は、チオールで修飾されたオリゴヌクレオチドの使用に基づく。これらの方法では、チオール基はオリゴヌクレオチド合成の間に商業的に入手可能な“チオール修飾剤”であるホスホラミダイト類を用いることにより導入される。そのチオール基は、硝酸銀を用いる特別な脱保護条件を必要とするトリチル基で保護されるか、またはＤＴＴによる還元により切断されるジスルフィドとして保護されるかのどちらかである。両方の場合で、標準的な脱保護条件は適切でなく、そのオリゴヌクレオチドを金表面に付着させる前に過剰量のこれらの特別な脱保護試薬を完全に除去しなければならない。

オリゴヌクレオチドの化学合成の代わりに、酵素的合成も可能である。チオール修飾剤であるホスホロアミダイト類（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅｓ）はいずれもオリゴヌクレオチド中への酵素的組み込みとは適合不能である。

金反応基の酵素的組み込みに関して、化合物４−チオ−チミジン三リン酸（４−チオＴＴＰ）が用いられた(Incorporation of DNA networks into microelectrode structures; Erler, C. and Mertig, M., Journal of Vacuum Science & Technology, B: Microelectronics and Nanometer Structures--Processing, Measurement, and Phenomena 27 (2009) 939-943)。

対応する４チオＴホスホラミダイトは商業的に入手可能であり、望まれるチオ−ｄＴ含有オリゴヌクレオチドの化学合成において用いることができる。しかし、Ｓ−アルキル４チオＴは求核種に対して非常に反応性である。従って、４チオＴを用いて合成したオリゴヌクレオチドは、アンモニアの存在下でＮａＳＨを用いて切断しなければならない。前に言及したように、あらゆる残存する脱保護試薬は完全に除去されなければならない。

しかし、実施例の節において示されるであろうように、その中に４−チオチミジン（４−チオＴ）が組み込まれたオリゴヌクレオチドは標準的な脱保護条件下での加水分解に対してあまり安定ではなく、一般に求核攻撃を受けやすい可能性がある。これは今度は結果として前記のチオヌクレオチドの組み込みに基づくコンジュゲートの不安定性をもたらすであろう。

上記の先行技術の論考から明らかになるように、オリゴヌクレオチドを含むチオヌクレオチドの合成のための、および／またはそのようなオリゴヌクレオチドを金または量子ドットのようなチオフィリック金属に付着させるための、対費用効果の高い単純な手順に関する必要性が存在する。単純性のための１つの前提条件は、例えばオリゴヌクレオチドの表面への付着を可能にする基をそのオリゴヌクレオチド中に、確立された標準的なオリゴヌクレオチド合成プロトコルから一切逸脱する必要なく、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に直接導入することができることである。

驚くべきことに、式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基のそのようなオリゴヌクレオチド中への組み込みを用いることにより、１個以上のチオール基を含むオリゴヌクレオチドを容易に合成することができることが分かった。

Mitchell, G.P. et al., J. Am. Chem. Soc. 121 (1999) 8122-8123 Mahtab, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 117 (1995) 9099-9100 Mahtab, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 122 (2000) 14-17 Reynolds III, R.A. et al., Pure Appl. Chem. 72 (2000) 229-235 Thanh, N.T. et al., Anal. Chem. 74 (2002) 1624-1628 Csaki, A. et al., Exp. Rev. Mol. Diagn. 2 (2002) 187-193 Thaxton, C.S., and Mirkin, C.A. in: Nanobiotechnology, Niemeyer, C.M., and Mirkin, C.A. (編者), Wiley-VCH, Weinheim (2004) pp. 288-307 Seeman, N.C., Nature 421 (2003) 427-431 Niemeyer, C.M., Curr. Opin. Chem. Biol. 4 (2000) 609-618 Gothelf, K.V. et al., Org. Biom. Chem. 3 (2005) 4023-4037 Seela, F. and Budow, S., Helv. Chim. Acta 89 (2006) 1978-1985 Seela, F. et al., Org. Biomol. Chem. 5 (2007) 1858-1872 Seela, F. et al., Chem. Biodiv. 2 (2005) 84-91 Letsinger, R.L. et al., Chemistry of Oligonucleotide - Gold Nanoparticle Conjugates, In: Phosphorus, Sulfur and Silicon and the Related Elements, Vol. 144-146 (1999) pp. 359-362 Ingenious nanoprobes in bioassays, Chan, Cangel Pui-yee, Bioanalysis 1 (2009) 115-133 Biosensors based on gold nanoparticle labeling, Moeller, R., Annual Review of Nano Research 1 (2006) 429-466 Mirkin, C.A. et al., Nature 382 (1996) 607 Incorporation of DNA networks into microelectrode structures; Erler, C. and Mertig, M., Journal of Vacuum Science & Technology, B: Microelectronics and Nanometer Structures--Processing, Measurement, and Phenomena 27 (2009) 939-943

本発明はオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートに関し、ここでその固相はチオフィリックであり、ここでそのオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基を含み：

式中、ＸはＣＨまたはＮであり、式中、Ｒ１はＨまたはＮＨ２であり、式中、---は共有結合を示し、ここで前記のオリゴヌクレオチドは前記の固相に前記のチオオキソヌクレオチドの硫黄原子を介して結合している。

オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートを製造する方法も開示し、その方法は以下の工程を含む：（ａ）チオフィリック金属、例えばＣｄに基づく量子ドットにおけるようなチオフィリック金属を含む無機酸化物、硫化物、セレン化物またはテルル化物からなる群から選択されるチオフィリック固相を提供し、そして（ｂ）上記で示し、定義したような少なくとも１個の式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基を含有するオリゴヌクレオチドを、前記のチオフィリック固相に結合させる。

核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出法における本発明に従うオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートの使用またはオリゴヌクレオチドナノ粒子コンジュゲートの標識としての使用のような様々な使用も開示し、記述する。

本発明の実施は、別途示さない限り、分子生物学（組み換え技法が含まれる）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を用いると考えられ、それは当技術分野の技術の範囲内である。そのような技法は、以下のような文献において完全に説明されている：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”、第２版(Sambrook et al., 1989);“Oligonucleotide Synthesis”(M. J. Gait, ed., 1984);“Animal Cell Culture”(R. 1. Freshney, 編者, 1987);“Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.);“Current Protocols in Molecular Biology”(F. M. Ausubel et al., 編者, 1987, および定期的な更新);“PCR: The Polymerase Chain Reaction”(Mullis et al., 編者, 1994)。

別途定義しない限り、本明細書で用いられる技術的および科学的用語は、この発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第２版, J. Wiley & Sons (ニューヨーク州ニューヨーク, 1994); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 第４版, John Wiley & Sons (ニューヨーク州ニューヨーク, 1992); Lewin, B., Genes V, Oxford University Pressによる出版(1994), ISBN 0-19-854287 9); Kendrew, J. et al. (編者), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.による出版(1994), ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers, R.A. (編者), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.による出版(1995), ISBN 1-56081-569 8), Mueller, S. (編者) Nucleic Acids from A to Z, A Concise Encyclopedia, Wiley VCH 2008, ISBN-10: 3-527-31211-0)は、当業者に本出願において用いられている用語の多くについての一般的な手引きを提供する。

本明細書で引用される全ての参考文献を、特許出願および刊行物を含め、そのまま援用する。
定義
本明細書で用いられる際、以下の用語のそれぞれはこの節においてそれと関連づけられている意味を有する。

冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１個を、または１個より多くを（すなわち少なくとも１個を）指して用いられる。例として、“抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は１個の抗体または１個より多くの抗体を意味する。用語“少なくとも”は、場合により１個以上のさらなる対象が存在していてよいことを示すために用いられる。例として、少なくとも２個の別個の領域を含むアレイは、場合により２個以上の別個の試験領域を含んでいてよい。

表現“１以上”は、１〜５０、好ましくは１〜２０を意味し、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５も好ましい。
当業者は、そのチオフィリック金属はチオフィリック金属を含む合金、半導体もしくは混合金属半導体であってよく、またはそれは本質的にチオフィリック金属で構成されていてよく、すなわちそれは純金属であってよいことを理解している。

そのチオフィリック金属が銅、金および銀からなる群から選択される貴金属である場合、そのチオフィリック金属固相は好ましくはそのような金属で構成される。チオフィリック半導体物質が固相として用いられる場合、そのチオフィリック金属はそのような物質中に含まれるが、その純金属の形態で存在する必要はない。そのような半導体物質中に、そのチオフィリック金属は好ましくは少なくとも３５％ｗ／ｗまで存在する。やはり好ましくは、そのような半導体物質は少なくとも４０％、４５％または５０％のチオフィリック半導体金属を含む。

当業者は理解しているであろうように、特定の態様において、粒子、例えば金粒子または量子ドットが好ましい選択肢である可能性があるが、他の態様に関して、固体支持体物質上にコートされたチオフィリック金属またはチオフィリック半導体物質の層が好ましい代替物である可能性がある。用語“固相”は、本発明で用いられる際、これらの代替物：ａ）チオフィリック金属で作られた固相およびｂ）チオフィリック金属が固体支持体物質の表面上に存在する固相の両方を含むことを意図している。

固相を形成するためにチオフィリック金属でコートされるべき固体支持体物質は特別な制限を一切受けず、例えば金属（例えばアルミニウム）表面、ＳｉＯ_２を蒸気蒸着させた金属表面、金属／半金属酸化物（例えばＡｌ_２Ｏ_３またはＳｉＯ_２）表面、ガラス表面、ポリマー表面、例えば薄膜の形態のポリマー表面、ナイロン膜またはニトロセルロース膜の中から選択することができる。しかし、基本的に“半固体”またはゲル様の固相支持体も適切であることは、当業者には明らかである。

ガラスの固相支持体としての使用は、１つの好ましい態様である。ガラスは多孔性の表面を有しておらず、チオフィリック金属またはチオフィリック無機酸化物もしくは硫化物の半導体層による均一なコーティングを可能にする。ガラスは機械的に頑強、温度耐性および厳しい洗浄条件に非感受性でもあり、低い内部蛍光を有する。ガラスの全てのタイプおよび種類、例えば石英ガラスが適切である。

そのポリマー固相支持体は、例えばポリプロピレン、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）（アクリルガラスまたはＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ）またはシクロオレフィンコポリマー類（ＣＯＣ類）で構成されていることができる。例えば、適切なＣＯＣはＴｉｃｏｎａから商品名“Ｔｏｐａｚ”の下で入手可能である。

用語“コンジュゲート”は、本明細書で用いられる際、チオオキソヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは固相中に含まれるチオフィリック金属に前記のオリゴヌクレオチド中に含まれる硫黄基を介して結合するという事実に関する。チオフィリック金属およびチオールの間の結合の正確な化学的性質は、まだ研究中である。現行の理論に束縛されることを望むわけではないが、チオール−金結合に関する現在の知識を要約し、下記に示す。

金−硫黄結合は金と硫黄化合物、通常は有機硫黄化合物中の硫黄原子の間の独特の結合である。金と硫黄の間の水安定性金塩類はしばしばその＋１酸化状態（第１金）の金を特徴とし、それはチオエーテル類およびチオレート類のような軟らかいリガンド（ｓｏｆｔ ｌｉｇａｎｄｓ）を用いて形成される。しかし、有機硫黄化合物は、中性のチオエーテル類およびチオール類でさえも、元素の金の表面、例えばコロイド性金ナノ粒子上にある元素の金の表面ならびにバルク金上の表面にもかなり強く結合することができる。

チオール−Ａｕ（０）表面結合のエレクトロニクスは厳密には明らかではないが、それは金の高い電気陰性度（ポーリングの尺度で２．４）のために共有結合に近い傾向があり、かなり強く（１２６〜１４６ｋＪ／ｍｏｌ）、それは中性の配位子および中性のゼロ価貴金属の間のほとんどの表面結合に関して稀である。

何世紀もの間化学者を悩ませてきたこの結合の性質に関して数多くの仮説が提案されてきたが、ある仮説を別の仮説のために除外するであろう実験研究を実施するのは困難であった。その結合はおそらく供与相互作用を特徴とし、逆結合を特徴とする可能性がある。金−硫黄相互作用に関する結合エネルギーは、自己組織化した単層におけるように、表面が硫黄含有化合物で飽和した状態になるにつれて減少する。

チオール上のスルフヒドリル水素に、それが金表面に結合する際に何が起こっているのかは完全には理解されていない。競合する仮説は、それは陽子、水素化物またはヒドリル（Ｈ−ドット）ラジカルとして離れる可能性があり、それはおそらく金により、または最終的には水素の形で安定化されることを示唆している。陽子ＮＭＲ研究を用いるあるグループは、その水素はしばしば全く離れない可能性があることを提唱している。しかし、過剰な（すなわち、金表面の５０％より多くを覆う）チオールが用いられる場合、水素の喪失は“急速かつ不可逆的”である。

用語“チオフィリック金属”はＨＳＡＢ概念に基づいており、軟らかいスルフィドが対応する軟らかい金属に結合する事実を記述している。ＨＳＡＢ概念は硬い（ｈａｒｄ）および軟らかい（ｓｏｆｔ）（ルイス）酸（ａｃｉｄｓ）および塩基（ｂａｓｅｓ）に関する頭字語である。ＨＳＡＢ概念によれば、軟らかい金属イオンは対イオンとして軟らかいスルフィドを好み、従って硬いオキソフィリック（ｏｘｏｐｈｉｌｉｃ）金属イオンに対してチオフィリックとも呼ばれている。

上記でチオフィリック貴金属である金に関して既に説明したように、例えばオリゴヌクレオチド中に含まれるようなチオオキソ基の硫黄原子の間の結合の正確な性質は未知である。しかし、これは適切なチオフィリック金属を選択することができ、望まれる結合が達成される限り、重要ではない。

本発明に従うチオフィリック金属または金属イオンは、好ましくは第１１族：（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）；第１２族（Ｃｄ、Ｈｇ）；第１３族（Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）および第１４族（Ｓｎ、Ｐｂ）金属からなる群から選択される。

本発明に従う１態様において、そのチオフィリック金属は、チオフィリック貴金属およびチオフィリック半導体物質からなる群から選択される。
１態様において、そのチオフィリック金属は、銅、銀および金からなる群から選択される貴金属である。１態様において、そのチオフィリック金属は銀または金から選択されるであろう。１態様において、金がチオフィリック固相物質として用いられる。１態様において、銀がチオフィリック固相物質として用いられる。

当業者が理解しているように、チオフィリック半導体物質は、カドミウム、ガリウムおよびインジウムからなる群から選択される１種類以上の金属（単数または複数）を含んでいてよく、この金属は酸化物、硫化物またはセレン化物として存在している。好ましい態様において、そのチオフィリック半導体物質はカドミウムまたはガリウムに基づく。好ましい態様において、その半導体物質はカドミウムに基づく。

１態様において、そのチオフィリック半導体物質はナノ結晶または量子ドットの形態で存在する。用語“量子ドット”は、そのような構造を全般的に含むように広く解釈されることを意図している。量子ドットは特許および技術文献において記述されており、例えば米国特許第６，３２２，９０１号、第５，９９０，７４９号、および第６，２７４，３２３号、ならびにMurphy, C.J., Analytical Chemistry 74 (2002) 520A-526Aを参照。これらの文書の開示を本明細書に援用する。量子ドットは３つの次元全てが１〜１０ｎｍの長さのスケールに制限されている半導体粒子である。無機半導体には、第１４族（旧第ＩＶ族）元素であるケイ素およびゲルマニウム；ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＩｎＰ、およびＩｎＡｓのような化合物（まとめて第ＩＩＩ〜Ｖ族物質）；ならびにＺｎＯ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、およびＣｄＴｅ（第ＩＩ〜ＶＩ族物質）が含まれる。

量子ドットは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｅｖｉｄｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ等から商業的に入手可能である。
本発明が属する重要な要素の１つは、少なくとも１個の式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドであり：

式中、ＸはＣＨまたはＮであり、式中、Ｒ１はＨまたはＮＨ２であり、式中、---は共有結合を示す。
Ｎ９共有結合を介して、式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基は本発明に従うオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートのオリゴヌクレオチド部分中に結合している。Ｎ９原子が連結されているオリゴヌクレオチド骨格のＣ原子は、天然存在のプリン核酸塩基、すなわちアデノシンまたはグアノシンが通常オリゴヌクレオチド骨格に連結されているＣ原子と同じである。言い換えれば、式Ｉに従う核酸塩基は天然のプリン核酸塩基と置き換わっているが、その骨格への結合の性質および位置づけは天然存在のプリン核酸塩基によるものと同じままである。

式Ｉの核酸塩基に基づくチオオキソヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端に存在することができ、それは目的の配列の一部であることができる。後者の場合では、言い換えれば、式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基は、そうでなければ目的のオリゴヌクレオチド配列中に存在している核酸塩基の１個以上と置き換わっている。

当業者は理解するであろうように、本発明に従うコンジュゲート中に含まれるオリゴヌクレオチドの重要な特徴は、その中に含まれる式Ｉに従う核酸塩基である。この核酸塩基は、例えばそのようなオリゴヌクレオチドのチオフィリック固相への結合を媒介している。

その核酸塩基がＮ９原子を介して共有結合により連結されている骨格の種類は、多くの異なる方式で様々であることができる。本発明に従う複合体の一部である、またはこの発明に従う方法でチオフィリック金属をコートするために用いられるオリゴヌクレオチドは、標準的なホスホリボース骨格を有していてよく、ここでそのリボシル糖部分は２’デオキシＤ−リボース、２’３’−ジデオキシＤ−リボースおよびＤ−リボースからなる群から選択され、またはそれはあらゆる適切な非標準的骨格を有していてよい。

非標準的骨格を有するオリゴヌクレオチドは、好ましくは以下：２’デオキシＬ−リボース、２’Ｏ−メチル、２’フルオロＲＮＡからなる群から選択されるリボシル類似体を含み、またはロックド核酸（ＬＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびモルホリノオリゴヌクレオチドから選択される骨格を有する。

ヌクレオシド（またはチオオキソヌクレオシド）という用語は、本発明で用いられる際、標準的な２’デオキシＤ−リボース、２’３’−ジデオキシＤ−リボースおよびＤ−リボースを糖単位として有するヌクレオシドに限定されず、標準的な核酸塩基（または式Ｉに従う複素環式核酸塩基）の糖単位のリボシル類似体または構造類似体、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびモルホリノオリゴヌクレオチドにおいて用いられているような類似体とのあらゆる組み合わせも含まれる。

式Ｉに従う核酸塩基がオリゴヌクレオチド中に存在する場合、そのオリゴヌクレオチドはチオフィリック固体支持体に付着させることができる。これは標準的なリボシル糖骨格部分に基づくヌクレオチドに、ならびに上記で記述したような非標準的骨格構造に基づくオリゴヌクレオチドに、ならびに１つのオリゴヌクレオチド内に異なるタイプの骨格を有するオリゴヌクレオチドのキメラに当てはまる。

式Ｉの核酸塩基を有するヌクレオチドの、固相合成によるオリゴヌクレオチド中への組み込みに関して、その対応する単量体（例えばホスホロアミダイト類）は、標準的なＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成に関して、または骨格が改変されたオリゴヌクレオチドに関する単量体の合成に関して周知である手順を用いることにより合成することができる。

経済的理由および合成の容易さのために好ましいのは、保護された式Ｉに従う核酸塩基を有し、２’デオキシリボースを糖単位として有するヌクレオシドのベータシアノエチルホスホロアミダイト類である。３’から５’への合成に関して、３’ホスホロアミダイト類も好ましい。

ポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼを用いる酵素的方法による、式Ｉの核酸塩基を有するヌクレオチドのオリゴヌクレオチド中への組み込みのためには、対応するトリホスフェートを合成しなければならない。修飾されたヌクレオシド三リン酸の組み込みは既知であるが、選択された構造に限定される（例えば、ＨＮＡおよびＡＮＡは通常のリボシル糖三リン酸に加えてポリメラーゼにより組み立てられ得る）。酵素的合成に関して好ましいのは、Ｄ−リボース、２’デオキシＤ−リボースおよび２’３’ジデオキシＤリボースをそのヌクレオシド三リン酸の糖単位として有するトリホスフェートである。

表現“ヌクレオシドに基づくヌクレオチド”は、式Ｉのヌクレオシドはオリゴヌクレオチド中への組み込みのために活性化、例えばリン酸化されなければならないことを明確にするために用いられ、それは一度オリゴヌクレオチド中に組み込まれたらヌクレオチドを表す。従ってそのようなヌクレオチドは、式Ｉの核酸塩基を有するヌクレオシドに由来する、または基づくと言われる。

用語“オリゴヌクレオチド”は、本明細書で用いられる際、一般に短い、一般に一本鎖の、少なくとも８ヌクレオチドを、最大で約１０００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ヌクレオチドの長さを有するであろう。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは１０００、５００、３００、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチドより長くない長さを有するであろう。下記でポリヌクレオチドに関して示す記述は、オリゴヌクレオチドに等しく、かつ完全に適用可能である。

オリゴヌクレオチドという用語は非常に広く、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡならびにそれらの類似体および修飾を含む。
本発明に従うチオヌクレオチドが固相オリゴヌクレオチドの間に組み込まれる予定である場合、ある合成化学内で単量体性チオヌクレオシド基本単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）と組み合わせることができる単量体性基本単位および修飾条件（例えばＷＯ２００７／０５９８１６において記述されているような異なる酸化剤を用いる）のみが用いられる。

オリゴヌクレオチドという用語には、核酸塩基において例えばメチル、プロパルギル、またはハロゲンで置換されている、またはペンダント部分もしくは官能基が核酸塩基に結合している天然塩基を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。必要であれば、ヌクレオチド構造への改変がそのポリマーの組み立ての前または後に加えられてよい。オリゴヌクレオチドは重合の後に、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによりさらに修飾されてよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により遮られてよい。非ヌクレオシド構成要素はスペーサーおよびリンカーであり、それは官能基付与されておらず、または−ＮＨ２、−Ｎ３、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−Ｃ＝Ｃ、ＯＮＨ２のような反応性の基で官能基付与されており、またはペンダント部分に連結されている。ペンダント部分は、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、ペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等）、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）、小溝結合剤（例えばジスタマイシン）、キレート剤（例えば放射性金属が含まれる金属およびホウ素）、蛍光または非蛍光色素（例えばクマリン類、フルオレセイン類、ローダミン類、オキサジン類、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン色素（Ｂｏｄｉｐｙ）、アゾ色素、ポリアゾ色素、シアニン類、メロシアニン類、スチルベン類、ペリレン類、ピレン類、フタロシアニン類）および（ビオチン、ジゴキシゲニンのような）部分抗原である。

オリゴヌクレオチドという用語には、標準的な塩基を有する、および／またはＣヌクレオシド類（フォルマイシン、プソイドウリジン）、７デアザプリン類、７デアザ８アザプリン類、および６アザピリミジン類のような塩基類似体（天然の塩基と同じ水素結合パターンを示す類似体）を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような塩基類似体を例えば７Ｂｒ７デアザｄＧのようにさらに置換することもできる。

非標準塩基、例えばニトロインドール、ニトロピロール（ｐｙｒｏｌｌ）のようなユニバーサル塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅｓ）および非水素結合性塩基代替物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ）（例えばジフルオロフェニル（ｄｉｆｌｕｏｒｐｈｅｎｙｌ））および（イソｄＧまたはイソｄＣのような）第３の塩基対を形成することができる非天然塩基も、本発明に従う固定法と適合可能な改変である。

オリゴヌクレオチドという用語には、骨格の改変を有するオリゴヌクレオチド、例えば置換されたデオキシリボース（例えば２’フルオロまたはメトキシ）を有する、二環式糖類（ＬＮＡとして知られている）または６員環糖類似体、例えばヘキシトール（ＨＮＡとして知られている）のような糖類似体、ならびにメチルホスホネート、ホスホロアミダイト類およびホスホロチオエートのような改変されたヌクレオシド間結合を有する骨格を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同じである必要はない。

オリゴヌクレオチドという用語には分枝状オリゴヌクレオチドも含まれ、ここで少なくとも３個のオリゴヌクレオチドが分枝単位を介して互いに連結されている。分枝状オリゴヌクレオチドの合成のための様々な単量体（例えば１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］−３−［５−フルオレノメトキシカルボニルオキシペンチルアミド］−プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト）が商業的に入手可能である。

１態様において、例えばホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）または非ヌクレオチドスペーサー上のチオール基のようなオリゴヌクレオチド中のさらなる基が修飾として存在し、それもチオフィリック表面と反応することができ、そのような修飾は、チオフィリック表面と反応することができる異なる反応部位を有しないように、本発明に従うチオヌクレオシド類のすぐ近くに位置する。本発明に従うチオヌクレオチド類がポリメラーゼを用いる酵素的合成の間にトリホスフェートとして組み込まれる場合、増幅産物中のヌクレオチド修飾の数および種類は、そのポリメラーゼのそれらの修飾されたヌクレオチド三リン酸に関する許容性により制限される。十分に組み込まれるのは５位が置換された（ｄ）ＣＴＰおよび（ｄ）ＵＴＰ、７位が置換された７デアザ−（ｄ）ＧＴＰおよび７デアザ−（ｄ）ＡＴＰであり、ここでその置換基は（例えば５Ｂｒ ｄＵＴＰ、５エチニルｄＵＴＰ、５−アミノアリルｄＵＴＰにおけるような）かさばらない置換基または小さいペンダント部分（例えば標識または部分抗原）または６〜３０原子のスペーサーを介して５または７位に連結されている好ましくは−ＮＨ２、−Ｎ３、および−Ｃ＝Ｃ部分を有する官能基である。

望まれるならば、これらの官能基は、大きいペンダント部分による修飾を得るために、さらに例えばタンパク質のそれらへの結合により修飾されることができる。
用語“アレイ”または“マイクロアレイ”は、本明細書で用いられる際、支持体上のハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）の規則正しい配列を指す。その支持体は固体の支持体、例えばスライドガラス、または半固体の支持体、例えばニトロセルロース膜であることができる。そのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのあらゆる並べ換え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）であることができる。

“標的配列”、“標的核酸”または“標的タンパク質”は、本明細書で用いられる際、その検出が望まれる目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質である。一般に、“鋳型”は、本明細書で用いられる際、標的核酸配列を含有するポリヌクレオチドである。一部の場合において、用語“標的配列”、“鋳型ＤＮＡ”、“鋳型ポリヌクレオチド、“標的核酸”、“標的ポリヌクレオチド”、およびその変形は、互換的に用いられる。

“増幅”は、本明細書で用いられる際、一般に望まれる配列の多数のコピーを生成するプロセスを指す。“多数のコピー”は少なくとも２コピーを意味する。“コピー”は必ずしもその鋳型配列に対する完全な配列の相補性または同一性を意味しない。例えば、コピーにはヌクレオチド類似体、例えばデオキシイノシン、意図的な配列の変更（例えばその鋳型にハイブリダイズ可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーにより導入された配列の変更）、および／または増幅の間に起こる配列のエラーが含まれ得る。

第１試料中の遺伝子、タンパク質またはバイオマーカーの発現／量は、第１試料中のその遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量が第２試料中のその遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量よりも大きい場合、第２試料中の発現／量と比較して高い、または増大している。１態様において、第１試料中のその遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量における増大は、第２試料中のそれぞれの遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×、または１００×である。

第１試料中の遺伝子、タンパク質またはバイオマーカーの発現／量は、第１試料中のその遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量が第２試料中のその遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量よりも小さい場合、第２試料中の発現／量と比較して低い、または減少している。１態様において、第１試料中のその遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量における減少は、第２試料中のそれぞれの遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質またはバイオマーカーの発現レベル／量よりも少なくとも約１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×、または１００×低い。

発現レベル／量は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片および／または遺伝子コピーが含まれるがそれらに限定されない当技術で既知のあらゆる適切な基準に基づいて決定することができる。発現レベル／量は、定性的に、および／または定量的に決定することができる。１態様において、その試料は、アッセイされるＲＮＡまたはタンパク質の量の差および用いられるＲＮＡまたはタンパク質試料の質における変動性の両方に関して標準化される。そのような標準化は、周知のハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨが含まれる特定の標準化遺伝子の発現を測定して組み込むことにより成し遂げることができる。あるいは、標準化はアッセイされた遺伝子の全てまたはその大きな亜集団の平均シグナルまたはシグナルの中央値に基づくことができる（全体的（ｇｌｏｂａｌ）標準化のアプローチ）。遺伝子ごとに（ｇｅｎｅ−ｂｙ−ｇｅｎｅ）を基準にして、患者の腫瘍ｍＲＮＡまたはタンパク質の測定された標準化された量を、基準セット中にあるその量に対して比較する。試験された腫瘍ごとの、患者ごとのそれぞれのｍＲＮＡまたはタンパク質に関する標準化された発現レベルは、その基準セットにおいて測定された発現レベルの百分率として表すことができる。分析されるべき特定の患者の試料において測定された発現レベルは、この範囲内のある百分位数に位置すると考えられ、それは当技術で周知の方法により決定され得る。

“検出”には、直接的および間接的な検出を含め、あらゆる検出の手段が含まれる。
用語“試料”または“試験試料”は、本明細書で用いられる際、例えば物理的、生化学的、化学的および／または生理学的特徴に基づいて特性付けられる、および／または同定されるべき細胞的および／または他の分子的な物を含有する興味の対象から得られる、またはそれに由来する組成物を指す。１態様において、その定義は血液および生物由来の他の液体試料ならびに組織試料、例えば生検標本または組織培養物またはそれに由来する細胞を含む。その組織試料の源は、新しい、凍結された、および／または保存された器官もしくは組織試料または生検または吸引物からの固体組織のような固体組織；血液またはあらゆる血液成分；体液；およびその対象の妊娠または発生におけるあらゆる時点からの細胞または血漿であってよい。試料は対象から処置（例えば癌の処置）の開始の前に、または処置（例えば癌の処置）の開始の後に得られてよい。試料は処置（例えば癌の処置）の開始後２４時間、７、１０、１４、２８、４２、または５６日以内に得られてよい。用語“試料”または“試験試料”には、それらの調達後にあらゆる方法で、例えば試薬を用いた処理、可溶化、または特定の構成要素、例えばタンパク質もしくはポリヌクレオチドに関する濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、または切片に切り分ける目的での半固体もしくは固体母材中への包埋により処理された生物学的試料が含まれる。本明細書における目的に関して、組織試料の“切片”は、組織試料の単一の部分または断片、例えば組織試料から切り取られた組織または細胞の薄切片を意味する。

試料には、初代または培養された細胞または細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、関節液、卵胞液、精液、羊水、乳汁、全血、血液由来の細胞、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物、および組織培養培地、組織抽出物、例えばホモジナイズした組織、腫瘍組織、細胞抽出物、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。１態様において、その試料は臨床試料である。別の態様において、その試料は診断アッセイにおいて用いられる。一部の態様において、その試料は原発または転移腫瘍から得られたものである。組織生検はしばしば腫瘍組織の代表的な断片を得るために用いられる。あるいは、腫瘍細胞は、目的の腫瘍細胞を含有することが既知である、または含有すると考えられる組織または流体の形で間接的に得ることができる。例えば、肺癌病巣の試料は切除、気管支鏡検査、穿刺吸引、気管支擦過法により、または痰、胸膜液もしくは血液から得ることができる。

“プライマー”は、一般に短い一本鎖の、一般に遊離の３’−ＯＨ基を有するポリヌクレオチドであり、それは目的の試料中に存在する可能性のある標的に標的配列とハイブリダイズすることにより結合し、その後その標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する。外側または内側のプライマーまたはプローブの正確な配列は、実際の分析的問題に従って当業者により選択される。例えば、それは検出されるべき、または識別されるべき微生物に特異的なＤＮＡ配列にハイブリダイズする配列を含むことができる。例えば、生物特異的な配列は、配列データベースの比較および必要であれば“アラインメント”により確かめることができる。基本的に、プローブとしてのＤＮＡまたは核酸全般に対する制限は存在しない。それらの既知の利点のため、ＤＮＡ−ＰＮＡ（ペプチド−核酸）ハイブリッドまたはキメラを用いることも可能である。修飾された核酸（例えばｄＩ、ｄＩ−ビオチン、ｄＵ、ｄＵ−ビオチン）を用いることもできる。

“相互に関係させる”または“相互に関係させること”により、第１の分析またはプロトコルの性能および／または結果を第２の分析またはプロトコルの性能および／または結果と何らかの方法で比較することを意味する。例えば、第１の分析またはプロトコルの結果を第２のプロトコルの実施において用いることができ、および／または第１の分析またはプロトコルの結果を第２の分析またはプロトコルを実施すべきかどうかを決定するために用いることができる。遺伝子発現分析またはプロトコルの態様に関して、遺伝子発現分析またはプロトコルの結果を特定の療法計画を実施すべきかどうかを決定するために用いることができる。

語“標識”は、本明細書で用いられる際、直接的または間接的に試薬、例えば核酸プローブまたは抗体に融合しており、それによりそれがコンジュゲートしている、または融合している試薬の検出を促進する場合の本発明に従うコンジュゲートを指す。例えば本発明に従うオリゴヌクレオチド−金コンジュゲートが抗体に融合している場合、そのような抗体はその標識、すなわちそのオリゴヌクレオチド−金コンジュゲート中に含まれる金により検出することができる。

本発明に従うコンジュゲートおよびその使用：
１態様において、本発明はオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートに関し、ここでその固相はチオフィリック金属を含み、ここでそのオリゴヌクレオチドは少なくとも１個の式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基を含み：

式中、ＸはＣＨまたはＮであり、式中、Ｒ１はＨまたはＮＨ２であり、式中、---は共有結合を示し、ここで前記のオリゴヌクレオチドは前記の固相に前記のチオオキソヌクレオチドの硫黄原子を介して結合している。

式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基に基づくチオオキソ核酸塩基のオリゴヌクレオチドの合成における使用は、型にはまった合成手順と適合可能であることが分かっている。式Ｉのヌクレオシドに基づくチオオキソヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドの化学合成において用いることができ、保護基は標準的なプロトコルに従って切断することができる。加えて、式Ｉに従う１個以上のヌクレオチド（単数または複数）を含むオリゴヌクレオチドは、チオフィリック固相に堅固に付着させることができる。

そのチオオキソヌクレオチドが６−デアザ−チオオキソヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドは、それが６−アザヌクレオチドと比較した場合にあらゆる求核攻撃に対してさらにもっと安定であるという追加の利点を有する。従って、好ましい態様において、式ＩにおけるＸはＣＨである。

本発明に従うチオフィリック金属または金属イオンは、好ましくは第１１族：（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）；第１２族（Ｃｄ、Ｈｇ）；第１３族（Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）および第１４族（Ｓｎ、Ｐｂ）金属からなる群から選択される。

本発明の１態様において、そのチオフィリック金属はチオフィリック貴金属およびチオフィリック半導体物質からなる群から選択される。１態様において、そのオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートは１個以上の式Ｉのチオオキソ核酸塩基（単数または複数）を含有するオリゴヌクレオチドおよびチオフィリック貴金属またはチオフィリック金属を含む半導体物質からなる群から選択されるチオフィリック固相を含む。

１態様において、本発明のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート中に含まれるチオフィリック金属は、銅、銀および金からなる群から選択される貴金属である。１態様において、そのチオフィリック金属は銀または金から選択される。１態様において、金がチオフィリック固相物質として用いられる。１態様において、銀がチオフィリック固相物質として用いられる。

当業者が理解しているように、チオフィリック半導体物質は、カドミウム、ガリウムおよびインジウムからなる群から選択される１種類以上の金属（単数または複数）を含んでいてよく、この金属は酸化物、硫化物、テルル化物またはセレン化物として存在している。好ましい態様において、本発明のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート中に含まれるチオフィリック半導体物質はカドミウムまたはガリウムに基づく。好ましい態様において、その半導体物質はカドミウムに基づく。

１態様において、本発明のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート中に含まれるチオフィリック半導体物質はナノ結晶または量子ドットの形態で存在する。
式Ｉの核酸塩基に基づくヌクレオチドは合成の間に容易にオリゴヌクレオチド中に組み込むことができるため、ここで、そのようなヌクレオチドをあらゆる望まれる位置で挿入することも可能であり、２個以上の式Ｉの核酸塩基に基づくヌクレオチドが組み込まれる予定である場合、これは１個のそのようなヌクレオチドから最寄りのそのようなヌクレオチドまであらゆる望まれる距離で行うことができる。１態様において、本発明に従うオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートはチオフィリック固相および少なくとも２個の式Ｉに従う核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドの間で形成される。これらの２個の式Ｉに従う核酸塩基を有するヌクレオチドが少なくとも１個の他のヌクレオチドにより隔てられ、前記のオリゴヌクレオチド中の予め定められた位置に存在するのも好ましい。

１態様において、本発明に従うオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートはチオフィリック固体および少なくとも１個の式Ｉに従う核酸塩基を含むオリゴヌクレオチドの間で形成され、ここで前記のオリゴヌクレオチドは少なくとも８ヌクレオチドの長さである。

１態様において、本発明に従うオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートはチオフィリック固相および式Ｉに従う核酸塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間で形成され、ここで前記のオリゴヌクレオチドは最大で１０００ヌクレオチドの長さである。

一部の態様において、本発明に従うコンジュゲート中に含まれるオリゴヌクレオチドは、それぞれ少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ヌクレオチドの長さを有する。一部の態様において、本発明に従うコンジュゲート中に含まれるオリゴヌクレオチドは、それぞれ１０００、５００、３００、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチドより長くない長さを有する。

本発明に従う方法：
１態様において、本発明はオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートを製造する方法に関し、その方法は以下の工程を含む：（ａ）チオフィリック金属を含む固相を提供し、そして（ｂ）式Ｉに従う核酸塩基を含む少なくとも１個のチオオキソヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドを前記のチオフィリック固相に結合させる；

式中、ＸはＣＨまたはＮであり、式中、Ｒ１はＨまたはＮＨ２であり、式中、---は共有結合を示す。
１つの好ましい態様において、本発明に従うオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートを製造する方法は、式Ｉのヌクレオシドに基づくヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いて実施され、ここで式Ｉ中のＸはＣＨである。

本明細書で開示されるようなオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートを製造するこの方法を、図１において図式的に描写する。
本発明に従うチオフィリック金属または金属イオンは、好ましくは第１１族（Ｃｕ、Ａｇ、Ａｕ）；第１２族（Ｃｄ、Ｈｇ）；第１３族（Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｌ）および第１４族（Ｓｎ、Ｐｂ）金属からなる群から選択される。

１態様において、本発明において開示されるような方法は、チオフィリック貴金属およびチオフィリック半導体物質からなる群から選択されるチオフィリック金属を用いて実施される。

１態様において、本発明に従う方法において用いられるチオフィリック金属は、銅、銀および金からなる群から選択される貴金属である。１態様において、そのチオフィリック金属は銀または金から選択される。１態様において、金がチオフィリック固相物質として用いられる。１態様において、銀がチオフィリック固相物質として用いられる。

好ましい態様において、オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートの製造のための本発明に従う方法において用いられるチオフィリック半導体物質は、カドミウムまたはガリウムから選択される。好ましい態様において、オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートの製造のための本発明に従う方法において用いられる半導体物質はカドミウムである。

１態様において、オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートの製造のための本発明に従う方法において用いられるチオフィリック半導体物質は、ナノ結晶または量子ドットの形態で存在する。

１態様において、オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートの製造のための本発明に従う方法は、式Ｉに従う核酸塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いて実施され、ここで前記のオリゴヌクレオチドは少なくとも８ヌクレオチドの長さである。

１態様において、オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートの製造のための本発明に従う方法は式Ｉに従う核酸塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを用いて実施され、ここで前記のオリゴヌクレオチドは最大で１０００ヌクレオチドの長さである。

本発明に従うコンジュゲートの使用：
本発明において記述されるようなオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートは、多くの極めて重要な目的のために用いることができる。

当業者に直接明らかであるように、本発明において記述されるようなオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートは、１態様において、核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出法において用いられる。そのような使用は、多様な適用に関して、またはバイオセンサーにおいて最高に重要である。

１態様において、本発明において記述されるようなオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート中の固相は、金ナノ粒子およびナノ結晶として存在するチオフィリック半導体物質からなる群から選択されるナノ粒子であり、標識として用いられる。そのような使用は、例えばハイブリダイゼーションの電気化学的検出に関して(Kafka, J. et al., Electrochimica Acta 53 (2008) 7467-7474)、または表面プラズモン共鳴による検出に関して(Milkani, E. et al., Biosensors & Bioelectronics 25 (2010) 1217-1220)記述された使用に類似している。

式Ｉのチオオキソ核酸塩基が６−デアザ−チオオキソヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドは、容易に合成することができ、あらゆる求核攻撃に対して安定である。
以下の実施例、配列リスト、および図は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は添付された特許請求の範囲において述べられている。本発明の精神から逸脱することなく述べられた手順において修正を行うことができることは理解されている。

図１：アンカー分子として式Ｉに従う核酸塩基を有するチオオキソヌクレオシドの選択された例を含むオリゴヌクレオチドの間のオリゴヌクレオチド金コンジュゲート（ＡｕＮＰ）の形成に関する反応経路を図式的に示す。 図２：７デアザ６チオグアノシンに基づくオリゴヌクレオチドの化学合成のための基本単位の合成における工程を図式的に描写する。 図３：酵素消化後に得られたオリゴヌクレオチド７の酵素的加水分解産物のＨＰＬＣ溶離プロフィールを図の左側部分（ａ）に示し、オリゴヌクレオチド７およびチオオキソヌクレオシド１の理論的に予想される加水分解産物を含む人工混合物のＨＰＬＣ溶離プロフィールを図の右側部分（ｂ）に示す。 図４：（ａ）未修飾のＡｕＮＰ溶液（上の線、左端から出発する）、チオヌクレオシド１を用いたＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８（中央の線）およびチオールヘキシルリンカーを含有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ２４（下の線）の紫外−可視スペクトル；（ｂ）それぞれ０分、４時間および１２時間の異なる時間間隔の後に測定された、相補的オリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８・Ａｕ９の紫外−可視スペクトル。 図５：部分（ａ）において、２６０ｎｍにおいて観察された遊離オリゴヌクレオチド二本鎖８・９の融解プロフィールならびに５２０ｎｍにおいて記録された会合体Ａｕ８・Ａｕ９およびＡｕ２４・Ａｕ２５それぞれの融解プロフィールを示す。部分（ｂ）において、全て５２０ｎｍにおいて記録された会合体Ａｕ８・Ａｕ９、Ａｕ１５・Ａｕ１６およびＡｕ１７・Ａｕ１８それぞれの融解プロフィールを示す。 図６：４−チオ−２’−デオキシチミジン（４−ｔｈｉｏ−２’−ｄｅｏｘｙｔｈｍｉｄｉｎｅ）（化合物２６；この図では１として示す）の加水分解安定性に関する逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。（ａ）４−チオ−２’−デオキシチミジン（４−ｔｈｉｏ−２’−ｄｅｏｘｙｔｈｍｉｄｉｎｅ）（１）のＨＰＬＣプロフィール。（ｂ）１の２５％水性アンモニアによる６０℃において１６時間の処理後に得られたＨＰＬＣプロフィール。その化合物を、ＲＰ−１８カラム（２５０×４ｍｍ）上で２６０ｎｍにおいて逆相ＨＰＬＣにより分析した。勾配：０〜１５分 Ａ中０〜３０％Ｂ、３０〜４０分 Ａ中３０〜４０％Ｂ、４０〜４５分 Ａ中４０〜０％Ｂ、流速０．７ｃｍ^３分^−１。この図中の５は５−メチルデオキシシチジンであり；同時注入ＨＰＬＣ実験により確かめた。 図７：２−チオ−２’−デオキシチミジン（２−ｔｈｉｏ−２’−ｄｅｏｘｙｔｈｍｉｄｉｎｅ）（化合物２７；この図では２として示す）の加水分解安定性に関する逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。（ａ）２−チオ−２’−デオキシチミジン（２）のＨＰＬＣプロフィール。（ｂ）２の２５％水性アンモニアによる６０℃において１６時間の処理後に得られたＨＰＬＣプロフィール。その化合物を、ＲＰ−１８カラム（２５０×４ｍｍ）上で２６０ｎｍにおいて逆相ＨＰＬＣにより分析した。勾配：０〜１５分 Ａ中０〜３０％Ｂ、３０〜４０分 Ａ中３０〜４０％Ｂ、４０〜４５分 Ａ中４０〜０％Ｂ、流速０．７ｃｍ^３分^−１。 図８：６−チオ−２’−デオキシグアノシン（化合物２８；この図では３として示す）の加水分解安定性に関する逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。（ａ）６−チオ−２’−デオキシグアノシン（３）のＨＰＬＣプロフィール。（ｂ）３の２５％水性アンモニアによる６０℃において１６時間の処理後に得られたＨＰＬＣプロフィール。その化合物を、ＲＰ−１８カラム（２５０×４ｍｍ）上で２６０ｎｍにおいて逆相ＨＰＬＣにより分析した。勾配：０〜１５分 Ａ中０〜３０％Ｂ、３０〜４０分 Ａ中３０〜４０％Ｂ、４０〜４５分 Ａ中４０〜０％Ｂ、流速０．７ｃｍ^３分^−１。この図中の６は２，６−ジアミノプリン ２’−デオキシリボヌクレオシドであり；同時注入ＨＰＬＣ実験により確かめた。 図９：７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシン（化合物１；この図では４として示す）の加水分解安定性の逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。（ａ）７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシン（４）のＨＰＬＣプロフィール。（ｂ）４の２５％水性アンモニアによる６０℃において１６時間の処理後に得られたＨＰＬＣプロフィール。その化合物を、ＲＰ−１８カラム（２５０×４ｍｍ）上で２６０ｎｍにおいて逆相ＨＰＬＣにより分析した。勾配：０〜１５分 Ａ中０〜３０％Ｂ、３０〜４０分 Ａ中３０〜４０％Ｂ、４０〜４５分 Ａ中４０〜０％Ｂ、流速０．７ｃｍ^３分^−１。この図中の７は２，６−ジアミノ−７−デアザプリン ２’−デオキシリボヌクレオシドであり；同時注入ＨＰＬＣ実験により確かめた。 図１０：この図において、オリゴヌクレオチド合成において用いられたいくつかの異なるチオオキソヌクレオチド類に関する異なるホスホロアミダイト類基本単位を示す。 図１１：この図において、概観およびアラインメントを容易にするために、重要な化合物、用いられた配列、ならびに目的の配列でコートした様々な金粒子を要約する。 図１１：この図において、概観およびアラインメントを容易にするために、重要な化合物、用いられた配列、ならびに目的の配列でコートした様々な金粒子を要約する。 図１１：この図において、概観およびアラインメントを容易にするために、重要な化合物、用いられた配列、ならびに目的の配列でコートした様々な金粒子を要約する。 図１１：この図において、概観およびアラインメントを容易にするために、重要な化合物、用いられた配列、ならびに目的の配列でコートした様々な金粒子を要約する。

方法および試薬に関する全般的な情報
全ての化学物質はＡｃｒｏｓ，ＦｌｕｋａまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，ドイツ、ダイゼンホーフェン）から購入した。５’−メルカプト修飾剤である６−（トリフェニルメチル）−Ｓ−（ＣＨ_２）_６ Ｏ−２−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国、ヴァージニア州）から得た。溶媒は実験室グレードのものであった。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０ Ｆ２５４の０．２ｍｍの層で覆われたアルミニウムのシート（０．２ｍｍ；Ｍｅｒｃｋ，ドイツ、ダルムシュタット）上で実施された。カラムフラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）は、０．４バールにおいてシリカゲル６０Ｈ（ＶＷＲ，ドイツ、ダルムシュタット）上で実施された。紫外−可視スペクトル：Ｕ３２００分光光度計（日本、日立）；ｎｍでのλ_ｍａｘ、ｄｍ^３ｍｏｌ^−１でのε。逆相ＨＰＬＣは、可変波長モニター（モデル６５５Ａ）と連結されたＭｅｒｃｋ−日立ＨＰＬＣポンプ（モデルＬ−６２５０）を備えた２５０×４ｍｍ ＰＲ−１８カラム（Ｍｅｒｃｋ）上で実施された。ＮＭＲスペクトル：Ａｖａｎｃｅ−ＤＰＸ−３００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，ドイツ、ラインシュテッテン）；化学シフト（δ）は内部ＳｉＭｅ_４（^１Ｈ，^１３Ｃ）に関するｐｐｍにおける。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ分光計を用いて、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして用いて記録された。微量分析はＭｉｋｒｏａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅｓ Ｌａｂｏｒ Ｂｅｌｌｅｒ（ドイツ、ゲッティンゲン）により実施された。融解温度曲線は、Ｃａｒｙ熱電制御装置を備えたＣａｒｙ−１００ Ｂｉｏ紫外−可視分光光度計（Ｖａｒｉａｎ，オーストラリア）を用いて測定された。ＭｅｍｂｒａＰｕｒｅ水システム（Ａｓｔａｃｕｓ）からのＮａｎｏｐｕｒｅ水（抵抗＜０．０５５μＳ／ｃｍ）を全ての実験に関して用いた。

実施例１：
チオ置換基を有するオリゴヌクレオチド
１．１ 基本単位の合成
基本単位の合成を、下記の図２およびスキーム２においても図式的に示す。

スキーム２．試薬および条件：（ｉ）Ｍｅ_３ＳｉＣｌ、フェノキシアセチルクロリド、ピリジン、水性ＮＨ_３、４時間、室温；（ｉｉ）３−ブロモプロピオニトリル、無水Ｋ_２ＣＯ_３、ＤＭＦ、一夜、室温；（ｉｉｉ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、３時間、室温；（ｉｖ）（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（ｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、無水ＣＨ_２Ｃｌ_２、２０分間、室温。

7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-2-フェノキシアセトアミノ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4(3H)-チオン（２）。
化合物１(1.6 g, 5.50 mmol)を乾燥ピリジン(3 × 8.0 ml)と同時蒸発させ、次いでピリジン(15 ml)中で懸濁した。トリメチルシリルクロリド(3.6 ml, 28.17 mmol)を乾燥した注射器により添加し、その反応物を１時間撹拌した。フェノキシアセチルクロリド(1.1 ml, 7.96 mmol)を乾燥した注射器により添加し、その反応物を室温で４時間撹拌しておいた。その反応容器を氷浴中で冷却し、水(5 ml)を撹拌しながら添加した。１５分後、濃水性アンモニア(5 ml)を添加し、そのスラリーをさらに１５分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＦＣ(シリカゲル、カラム8 × 15 cm、CH₂Cl₂/MeOH、50:1→25:1)に適用した。主な領域を蒸発させると、２が無色の泡状物質として得られた(1.9 g, 80.9%);融点205 ℃; R_f = 0.53 (CH₂Cl₂/MeOH, 9:1)。UV (MeOH): λ_max (ε) = 333 nm (47600)。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ = 2.15-2.22 (m, 1H, H_α-2’), 2.38-2.47 (m, 1H, H_β-2’), 3.52 (m, 2H, H-5’), 3.82 (m, 1H, H-4’), 4.35 (m, 1H, H-3’), 4.88 (s, 2H, Pac-CH₂), 4.95 (t, ³J(H,H) = 5.3 Hz, 1H, 5’-OH), 5.30 (d, ³J(H,H) = 3.6 Hz, 1H, 3’-OH), 6.41 (m, 1H, H-1’), 6.64 (d, ³J(H,H) = 3.7 Hz, 1H, H-5), 6.96-7.00 (m, 3H, フェノキシ), 7.28-7.34 (m, 2H, フェノキシ), 7.49 (d, ³J(H,H) = 3.7 Hz, 1H, H-6), 11.99 (s, br, 1H, N-H), 12.88 (s, br, 1H, CO-NH)。分析値：C₁₉H₂0N₄O₅S (416.45)に関する計算値: C, 54.80; H, 4.84; N, 13.45。実測値: C, 54.74; H, 4.90; N, 13.40。

4-[(2-シアノエチル)チオ]-7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-2-フェノキシアセトアミノ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン（３）。
3-ブロモプロピオニトリル(4.0 ml, 48.07 mmol)および無水K₂CO₃(3.0 g, 21.71 mmol)を２５ｍｌの乾燥ジメチルホルムアミド(DMF)に添加し、その混合物を強く撹拌した。化合物２(1.9 g, 4.45 mmol)を５ｍｌの乾燥DMF中で溶解させ、その撹拌溶液に３０分以内に滴加した。その混合物を一夜撹拌状態に保った。DMFをキシレンとの同時蒸発により除去し、残留物をＦＣ(シリカゲル、カラム8 × 15 cm、CH₂Cl₂/MeOH、500:1→100:1)に適用した。蒸発後、主な領域から３が無色の固体として得られた(1.2 g, 54.7%); R_f = 0.22 (CH₂Cl₂/MeOH, 95:5)。UV (MeOH): λ_max (ε) = 301 nm (26700); 244 nm (73300)。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ = 2.22 (m, 1H, H_α-2’), 2.50 (m, 1H, H_β-2’), 3.16 (t, 2H, CH₂-CN), 3.51-3.56 (m, 4H, H-5’, H-5’’, CH₂-S), 3.84 (m, 1H, H-4’), 4.37 (m, 1H, H-3’), 4.94 (t, ³J(H,H) = 5.4 Hz, 1H, 5’-OH), 5.00 (s, 2H, Pac-CH₂), 5.32 (d, ³J(H,H) = 5.3 Hz, 1H, 3’-OH), 6.55 (m, 2H, H-5, H-1’), 6.95 (m, 3H, フェノキシ), 7.31 (m, 2H, フェノキシ), 7.65 (d, ³J(H,H) = 3.9 Hz, 1H, H-6), 10.69 (s, 1H, CO-NH)。分析値：C₂₂H₂₃N₅O₅S (469.51)に関する計算値: C, 56.28; H, 4.94; N, 14.92。実測値: C, 56.18; H, 4.98; N, 14.89。

4-[(2-シアノエチル)チオ]-7-[2-デオキシ-5-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-β-D-エリスロ-ペントフラノシル]-2-フェノキシアセトアミノ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン（４）。

化合物６(469.5 mg, 1.00 mmol)を無水ピリジン(3 × 5.0 ml)と同時蒸発させ、次いでピリジン(5.0 ml)中で溶解させた。この溶液に、4,4’-ジメトキシトリフェニルメチルクロリド(DMT-Cl) (440.5 mg, 1.30 mmol)を添加し、その混合物を室温で３時間撹拌した。その反応をＭｅＯＨの添加により停止し、その混合物を蒸発させて乾燥させた。その混合物をCH₂Cl₂ (3.0 ml)中で溶解させ、ＦＣ(カラム4 × 10 cm、CH₂Cl₂/アセトン、20:1による溶離)で処理すると、４が無色の泡状物質として得られた(555.8 mg, 72 %); R_f = 0.61 (CH₂Cl₂/MeOH, 95:5)。UV (MeOH): λ_max (ε) = 302 nm (14400); 240 nm (53500)。¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ = 2.29 (m, 1H, H_α-2’), 2.59 (m, 1H, H_β-2’), 3.16 (m, 4H, CH₂-CN, H-5’, H-5”), 3.54 (m, 2H, CH₂-S), 3.71 (s, 6H, OCH₃), 3.95 (m, 1H, H-4’), 4.37 (m, 1H, H-3’), 5.00 (s, 2H, Pac-CH₂), 5.37 (d, ³J(H,H) = 4.2 Hz, 1H, 3’-OH), 6.52-6.56 (m, 2H, H-5, H-1’), 6.78-7.35 (m, 18H, フェノキシ), 7.46 (d, ³J(H,H) = 3.6 Hz, 1H, H-6), 10.69 (s, 1H, CO-NH)。分析値：C₄₃H₄₁N₅O₇S (771.27)に関する計算値: C, 66.91; H, 5.35; N, 9.07。実測値: C, 67.05, H, 5.20; N, 9.17。

4-[(2-シアノエチル)チオ]-7-[2-デオキシ-5-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-β-D-エリスロ-ペントフラノシル]-2-フェノキシアセトアミノ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン 3’-[(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホラミダイト]（５）。

化合物４(555.8 mg, 0.72 mmol)を無水CH₂Cl₂(3.0 ml)中でＡｒの下で溶解させ、(2-シアノエチル)ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト（ｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）(225 μl, 0.95 mmol)と、ⁱPr₂EtN (220 μl, 1.27 mmol)の存在下で室温において反応させた。２０分後、その反応混合物をCH₂Cl₂で希釈し、その溶液を５％ NaHCO₃水溶液で、続いてブラインで洗浄した。その有機溶液を無水Na₂SO₄で乾燥させ、濾過し、濃縮した。その残留物をＦＣ(カラム4 × 10 cm、CH₂Cl₂/アセトン、25:1)で処理すると、５が無色の泡状物質として得られた(429.1 mg, 61.3%); R_f = 0.64 (CH₂Cl₂/アセトン、95:5)。³¹P NMR (300 MHz, CDCl₃-d₆): δ = 148.6; 148.7。

全ての化合物は紫外スペクトル、^１Ｈ−および^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルにより、ならびに元素分析により特性付けされた（表１および実験の部）。糖部分および保護基の^１３Ｃ ＮＭＲの化学シフトの割り当ては、既に公開されたデータとの組み合わせでのゲート制御デカップリングされたスペクトル（ｇａｔｅｄ−ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ ｓｐｅｃｔｒａ）に基づいてなされた(Christopherson, M.S. and Broom, A.D., Nucleic Acids Res. 19 (1991) 5719-5724)。

１．２ オリゴヌクレオチド合成、そのオリゴヌクレオチドの精製および特性付け
１．２．１ オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドを、自動化されたＤＮＡ合成装置、モデル３９２−０８（ＡＢＩ ３９２，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ドイツ、ヴァイターシュタット）において１μｍｏｌスケールで、標準的なホスホラミダイト類ならびにホスホラミダイト５を用いて、以前に記述されたようなオリゴヌクレオチドの固相合成のための標準的な手順(Seela, F., Budow, S., Helv. Chim. Acta 89 (2006) 1978-1985)に従って合成した。固体支持体からの切断の後、そのオリゴヌクレオチドを２５％アンモニア水溶液中で６０℃において１２〜１６時間脱保護した。

１．２．２ オリゴヌクレオチドの精製
チオヌクレオシド１を含有するオリゴヌクレオチドの精製を、まずＤＭＴ−ｏｎ方式の逆相ＨＰＬＣ（Ｍｅｒｃｋ−日立−ＨＰＬＣ；ＲＰ−１８カラム；勾配系［Ａ：０．１Ｍ （Ｅｔ_３ＮＨ）ＯＡｃ （ｐＨ ７．０）／ＭｅＣＮ ９５：５；Ｂ：ＭｅＣＮ］：３分間、Ａ中２０％Ｂ、１２分間、Ａ中２０〜５０％Ｂ、および２５分間、Ａ中２０％Ｂ、流速１．０ｍｌ／分）上で実施した。その溶液を乾燥させ、２．５％ ＣＨＣｌ_２ＣＯＯＨ−ＣＨ_２Ｃｌ_２（４００μｌ）で０℃において５分間処理して４，４’−ジメトキシトリチル残基を除去した。その脱トリチル化されたオリゴマーを、再度逆相ＨＰＬＣ［勾配：０〜２０分 Ａ中０〜２０％Ｂ；流速１ｍｌ／分］により精製した。そのオリゴマーを短いカラム（ＲＰ−１８、シリカゲル）上で脱塩し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ蒸発装置上で凍結乾燥すると無色の固体が得られ、それを−２４℃で凍結させた。ＨＰＬＣ（勾配：０〜２５分 Ｂ中０〜２０％Ａ；流速１．０ｍｌ／分）。

１．２．３ 質量分析によるオリゴヌクレオチドの特性付け
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＰＲＯ分光計を用いて、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして用いて記録した。

オリゴヌクレオチドを完全な脱保護およびＨＰＬＣ生成、続いて脱塩の後特性付けした。全ての場合において、計算された質量は測定値とよく一致していた（表２）。

１．２．４ 酵素消化によるオリゴヌクレオチドの特性付け
オリゴヌクレオチドの酵素的加水分解を、SeelaおよびBecher(Seela, F., Becher, G., Nucleic Acids Res. 29 (2001) 2069-2078)により記述されたように、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１５．１，ヒガシダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ））およびアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（ドイツ）からのＥＣ ３．１．３．１，大腸菌）を用いて、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中で３７℃において実施し、逆相ＨＰＬＣ上で実施した。（ａ）酵素消化後に得られたオリゴヌクレオチド７の酵素的加水分解産物ならびに（ｂ）オリゴヌクレオチド７およびチオヌクレオシド１の理論的に予想される加水分解産物の人工的な混合物のＨＰＬＣ溶離プロフィールを図３において示す。カラムおよび溶離条件は以下の通りであった：ＲＰ−１８（２００×１０ｍｍ）；勾配［Ａ：０．１Ｍ（Ｅｔ_３ＮＨ）ＯＡｃ（ｐＨ７．０）／ＭｅＣＮ ９５：５；Ｂ：ＭｅＣＮ］：（ａ）および（ｂ）に関して２５分間 Ａ、４０分間 Ａ中０〜６５％Ｂ；（ｃ）および（ｄ）に関して１００％Ａ；流速：０．７ｍｌ／分。

図３（ａ）および図３（ｂ）それぞれの比較から明らかであるように、ヘビ毒ホスホジエステラーゼはチオヌクレオチド１を切断しない。
実施例２：
修飾された金ナノ粒子の合成およびそれらの特性付け
２．１ 金ナノ粒子溶液の調製
１５ｎｍ金ナノ粒子溶液を、Turkevich, J. et al., Discuss. Faraday Soc. 11 (1951) 55において最初に報告され、後にLetsingerおよびMirkinにより記述されたように(Storhoff, J.J. et al., J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 1959-1964、およびJin, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 1643)、ＨＡｕＣｌ_４溶液からシトレート還元により調製した。全てのガラス器具を王水（３部のＨＣｌ、１部のＨＮＯ_３）中で洗浄し、ｎａｎｏｐｕｒｅ水ですすぎ、次いで使用前にオーブンで乾燥させた。水性ＨＡｕＣｌ_４（１ｍＭ，２５０ｍｌ）を撹拌しながら還流状態にした。次いで、３８．８ｍＭのクエン酸三ナトリウム（２５ｍｌ）を素早く添加した。その溶液の色が黄色から赤色へと変化し、還流を１５分間継続した。室温に冷却した後、その赤色の溶液をＭｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．１ミクロンフィルターを通して濾過した。

２．２ ヌクレオシド１を用いたオリゴヌクレオチドを用いる修飾された金ナノ粒子溶液の調製
金ナノ粒子（約６ｎＭ）を、それらの配列内の異なる位置にヌクレオシド１を含有する様々なオリゴヌクレオチドを用いて機能性付与した。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは、１ｍｌの金ナノ粒子溶液を精製したオリゴヌクレオチド溶液（３μＭの最終的なオリゴヌクレオチド濃度）と混合することにより調製した。そのカップリング反応はわずかに高い温度（４０℃）で実施された。２０時間静置した後、５μｌの２Ｍ ＮａＣｌ、０．２ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．０）を一定の撹拌の下で添加してそのコロイド溶液を０．０１Ｍ ＮａＣｌにして６〜８時間静置した。次にコロイドに塩を加えて０．０２Ｍにしてさらに６〜８時間経過させ、次いでそれに塩を加えて０．０５Ｍにして６〜８時間静置し、最後にそれに塩を加えて０．１Ｍ ＮａＣｌにした。続いて、そのＤＮＡ金ナノ粒子溶液を遠心分離し、透明な上清を取り除いて未結合のオリゴヌクレオチドを除去した。その沈殿を１ｍｌの０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．０）中で再度分散させた。保温（２４時間、４０℃）の後、そのコンジュゲート溶液を同じ緩衝液で再度洗浄し、最終的に１ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートが得られた。

実施例３：
チオヌクレオシド１をリンカーとして用いるＤＮＡ−金ナノ粒子コンジュゲートのハイブリダイゼーション
典型的な実験において、０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートを含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液および０．５ｍｌの相補的なオリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートを含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液を一緒に混合した（等濃度）。その両方のＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートを含有する溶液を一夜保温しておいた。この間に、赤色から紫色への色の変化と同時に起こるプラズモン共鳴バンドのゆっくりとした赤方移動および幅の広がりにより明示される、相補的なオリゴヌクレオチドＡｕＮＰコンジュゲートのゆっくりとしたハイブリダイゼーションが起こった。最終的に、そのＤＮＡ金ナノ粒子網状構造の沈殿が観察され、結果として透明な上清および黒ずんだ沈殿が生じた。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液を激しく振盪した後、その沈殿を再度分散させることができ、約５６４ｎｍの紫外／可視極大を有する紫色の溶液がもたらされる。

実施例４：
オリゴヌクレオチドの金表面上での固定
４．１ オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
チオヌクレオシド１を用いるオリゴヌクレオチド二本鎖の溶液中でのハイブリダイゼーション特性。原理的に、７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシン（１）がオリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への結合のためのアンカー基として用いられる場合、そのオリゴヌクレオチド配列内のあらゆる位置を選択することができる。従って、いくつかの異なる修飾部位を組み込みのために選択した。硫黄原子のかさ高さがハイブリダイゼーションを妨げ得ることは周知である。解明のため、化合物１を組み込んだ遊離のオリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーション試験を実施した。１２マーの二本鎖の中心部または周辺部におけるヌクレオシド１の単一置換は、元の未修飾二本鎖５’−ｄ（ＴＡＧ ＧＴＣ ＡＡＴ ＡＣＴ）（１０）・３’−ｄ（ＡＴＣ ＣＡＧ ＴＴＡ ＴＧＡ）（１１）と比較して、その二本鎖の安定性を低減した（表３）。その作用は、１がそのオリゴヌクレオチド二本鎖の中心部に組み込まれた場合（１０・７：ΔＴ_ｍ＝−７℃）に、周辺部に組み込まれた場合（１０・１２：ΔＴ_ｍ＝−３℃）よりも顕著であった。多数の修飾は有意なさらなる不安定化につながった（１３・１４に関してΔＴ_ｍ＝−３０℃）（表３）。一貫して、２個のチオヌクレオシド（１）の２４マー二本鎖の中心部内または周辺部における組み込み（２１・２２、２３・６）は、元の未修飾二本鎖（１９・２０）と比較した場合にその二本鎖の安定性の強い減少に影響した。逆に、突出する末端としてのチオヌクレオシド１の１個または多数の組み込みを含有する二本鎖８・９、１５・１６および１７・１８では、その二本鎖の不安定化は観察されなかった。

４・２ オリゴヌクレオチド金ナノ粒子コンジュゲートの調製
１５ｎｍ金ナノ粒子溶液を、Turkevichにより報告され、後にLetsingerおよびMirkinにより記述されたプロトコル(Elghanian, R., et al., Science 277 (1997) 1078-1081; Mirkin, C.A. et al., Nature 283 (1996) 607-609; Turkevich, J. et al., Discuss. Faraday Soc. 11 (1951) 55)に従って、ＨＡｕＣｌ_４溶液からシトレート還元により調製した。そのナノ粒子濃度は、ε_５２０＝４．２×１０^８Ｍ^−１ｃｍ^−１（紫外／可視_ｍａｘ：５２０ｎｍ）(Demers, L.M. et al., Anal. Chem. 72 (2000) 5535-5541)を用いて、おおよそ６．０ｎＭであると決定された。未修飾の金ナノ粒子溶液の紫外／可視スペクトルを図４ａにおいて示す。未修飾のＡｕＮＰを、表４において示したオリゴヌクレオチドを用いて機能性付与した。

ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８およびＡｕ１８ならびにＡｕ２１およびＡｕ６を、それぞれ（それぞれ表３および４）１ｍｌの金ナノ粒子溶液を精製されたオリゴヌクレオチドの水溶液（１〜５μｌ）と混合して３μＭの最終的なオリゴヌクレオチド濃度をもたらすことにより調製した。そのカップリング反応はわずかに高い温度（４０℃）で実施された。２４時間静置した後、５μｌの２Ｍ ＮａＣｌ、０．２ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．０）を一定の撹拌の下で添加してそのＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液を０．０１ＭのＮａＣｌ濃度にした。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液のＮａＣｌ濃度を、リン酸緩衝液（２Ｍ ＮａＣｌ、０．２ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ ７．０）を用いて０．１Ｍの最終的なＮａＣｌ濃度まで段階的に増大させた。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートを０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．０）で２回洗浄して未結合のオリゴヌクレオチドを除去した。最後に、そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートを１ｍｌの０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）中で分散させた。全ての手順の間、そのＤＮＡ金ナノ粒子溶液の色は濃い赤色のままであった。さらに、結果として得られたＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８、Ａｕ１８およびＡｕ２１、Ａｕ６はそれぞれ予想された約５２５ｎｍのプラズモン共鳴を示し、これは凝集していない状態を示している（表５、図４ａ）。比較のため、５’−ヘキシルチオールリンカーを組み込んだオリゴヌクレオチド２４および２５を、以前に他の者により報告された従来のプロトコル(Hurst, S.J. et al., Anal. Chem. 78 (2006) 8313-8318; Seela, F. et al., Chem. Biodiv. 2 (2005) 84-91)を用いてＡｕＮＰにコンジュゲートさせた（→それぞれＡｕ２４、Ａｕ２５、表５）。１をアンカー分子として用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８の紫外／可視スペクトルは、商業的に入手可能なヘキシルチオールリンカーをアンカー基として用いるコンジュゲートＡｕ２４に関して観察されたプラズモン共鳴（５２３ｎｍ）に非常に近いプラズモン共鳴（５２６ｎｍ）を示す。

オリゴヌクレオチドがＡｕＮＰに内側の位置のチオヌクレオシド１を通して結合するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ２１およびＡｕ６それぞれに関して記録された紫外／可視スペクトルは、それぞれ末端の位置に位置するアンカー分子を有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８およびＡｕ１８ならびにＡｕ２４およびＡｕ２５に関して観察された紫外／可視スペクトルと質的に同一であることを特筆するのは興味深い。

全てのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．０）中で安定であることが分かり；紫外／可視の極大の移動を伴う粒子の凝集は観察されなかった。機能性付与されていない金ナノ粒子溶液はＮａＣｌを含有する緩衝溶液中で数分以内に不可逆的な凝集を経て、その後沈殿するため、これは重要な特性である(Mirkin, C.A. et al., Nature 283 (1996) 607-609)。

両方の結果：（ｉ）約５２３〜５２６ｎｍにおける紫外／可視の極大および（ｉｉ）０．１Ｍ ＮａＣｌリン酸緩衝溶液中での安定性は、オリゴヌクレオチドの７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシン（１）を介した共有結合的付着に関する強い証拠であると考えることができる。それにより、（オリゴヌクレオチドの５’もしくは３’末端における、または内部の位置における）化合物１のあらゆる位置が、安定なＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートの構築を可能にする。

４．３ 組み立てられたＤＮＡ金ナノ粒子コンジュゲートのハイブリダイゼーション実験
この一連の実験において、チオヌクレオシド１を組み込んだＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートのハイブリダイゼーション特性を調べ、５’−ヘキシルチオールリンカーを有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートから得られたハイブリダイゼーション特性に対して比較した。典型的な実験において、相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートプローブ、例えばＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８およびＡｕ９を一緒に混合した（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート、ｐＨ ７．０中で等濃度）。その混合物を保温しておいた。この間に、金ナノ粒子に付着している相補的オリゴヌクレオチドのゆっくりとしたハイブリダイゼーションが起こり；それは赤色から紫色への色の変化と同時に起こるプラズモン共鳴バンドの可視極大の赤方移動（Ａｕ８・Ａｕ９：５２６ｎｍ→５４６ｎｍ）および幅の広がりにより明示された（図４ｂ）。最終的に、そのＤＮＡ金ナノ粒子網状構造の沈殿が観察され、結果として透明な上清および暗赤色の沈殿が生じる。そのハイブリダイズした試料はかなり安定であり、それは再度分散させることができるが、激しく振盪した後でさえ紫色のままである。従って、そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ沈殿の激しい振盪の後でさえ５６４ｎｍの紫外／可視極大（Ａｕ８・Ａｕ９）を有する紫色の溶液が得られる。

４．４ ハイブリダイズしたＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートを用いた融解実験。
相補的なオリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートにより形成された会合体を用いて融解実験を実施した。このために、凝集したＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲート溶液を加熱し（１５℃→７５℃）、そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液を撹拌しながら５２０ｎｍにおける可視吸収の変化を観察した。Ｔ_ｍ値は融解転移の一次導関数の極大値を選ぶことにより決定され、それを表６において列挙する。

Ａｕ８・Ａｕ９の典型的な急な融解プロフィールを図５ａに示し、これは二本鎖８・９により組み立てられたＡｕナノ粒子の３次元の相互に連結された網状構造に関する５４℃のＴ_ｍ値を示している。比較のため、チオールヘキシルリンカーを有する相補的なオリゴヌクレオチドを用いたコンジュゲートＡｕ２４およびＡｕ２５により形成された網状構造の解離を、Ａｕ８・Ａｕ９の会合体に関して記述した条件と正確に同じ条件の下で調べた。Ａｕ２４・Ａｕ２５に関して、５３℃のＴ_ｍ値が決定された（表６）。

チオールヘキシルリンカー（Ａｕ２４・Ａｕ２５）またはチオヌクレオシド１（Ａｕ８・Ａｕ９）を用いる両方の会合体の非常に狭い融解転移（約４℃の範囲）を有する融解プロフィールが図５ａにおいて示したように検出され、一方で遊離のオリゴヌクレオチド二本鎖８・９に関して融解ははるかに広い温度範囲（約２０℃）にわたって起こる（図５ａ）。この発見は、金ナノ粒子に共有結合しているオリゴヌクレオチドは網状構造を形成する二本鎖の非常に協調的な融解プロフィールを示し、それは急になった融解転移により反映されることを報告している、以前に他の者によりなされた観察と一致している(Jin, R. et al., J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 1643-1654; Taton, T.A. et al., Science 289 (2000) 1757-1760)。

さらに、多数の５’突出チオヌクレオシド１で機能性付与されたＡｕＮＰを、相補的なオリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートとハイブリダイズさせた（→Ａｕ１５・Ａｕ１６、Ａｕ１７・Ａｕ１８）。表６において示したように、これらのコンジュゲートの会合体は非常に類似したＴ_ｍ値を示す（Ａｕ１５・Ａｕ１６：Ｔ_ｍ＝５０℃；Ａｕ１７・Ａｕ１８：Ｔ_ｍ＝５１℃）。オリゴヌクレオチド鎖につき１個のチオヌクレオシド（１）のみを用いる会合体Ａｕ８・Ａｕ９に関して見られたＴ_ｍ値と比較して、これらの値は３〜４℃低いが、なお同じ範囲内にある。狭い融解転移範囲（約４℃）を示すＡｕ８・Ａｕ９、Ａｕ１５・Ａｕ１６およびＡｕ１７・Ａｕ１８の融解プロフィールを図５ｂにおいて示す。

チオヌクレオシド１をそれらの配列内の異なる内部位置においてアンカー分子として用いる２４マーオリゴヌクレオチドを有するＤＮＡ−ＡｕＮＰ会合体の融解挙動も調べた（Ａｕ２１・Ａｕ２２、Ａｕ２３・Ａｕ６）。これらのオリゴヌクレオチドは、２４塩基対または部分的なハイブリダイゼーション（１２塩基対）の形成を可能にする２回繰り返される認識配列で構成されている。チオヌクレオシド１が２４マーオリゴヌクレオチド配列の周辺部に位置している会合体Ａｕ２１・Ａｕ２２に関して５３℃のＴ_ｍ値が検出された。このＴ_ｍ値は、ＤＮＡ−ＡｕＮＰ会合体内のオリゴヌクレオチドの部分的なハイブリダイゼーション、例えば（ｉ）解れている（ｆｒａｙｉｎｇ）末端を有し、二本鎖の中心部でのみ塩基対合している完全にマッチした二本鎖または（ｉｉ）表６の項目５において示したような対合していないヌクレオシドを認識部位および金ナノ粒子の間のスペーサーとして残している二本鎖の部分的なハイブリダイゼーションを示している。

逆に、やはり相補的なオリゴヌクレオチドを用いているが化合物１がそれぞれのオリゴヌクレオチドの中心部に位置している、密接に関連するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ２３およびＡｕ６は、ＤＮＡ−ＡｕＮＰの相互に連結された網状構造を形成することができない。一夜の保温でさえもその組み合わせられたコンジュゲート溶液の色の変化をもたらさず、可視極大の移動は観察されなかった。従って、凝集は起こらなかった。この結果は、認識部位と金ナノ粒子の間の距離が会合体の形成に必要であることを示している。

実施例５：
様々なチオオキソヌクレオシドの脱保護条件下での安定性
いくつかのヌクレオシド（１、２６〜２８）のチオオキソ基の安定性を、アルカリ性溶液（標準的なオリゴヌクレオチド脱保護条件：２５％水性ＮＨ_３、１４〜１６時間、６０℃）中で試験した。

チオオキソヌクレオシド１、２６〜２８の標準的な脱保護条件（２５％水性ＮＨ_３、１４〜１６時間、６０℃）下での加水分解安定性を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８、２５０×４ｍｍ）により監視した。ヌクレオシド１、２６〜２８（それぞれ約１ｍｇ）を、密封した容器中で１ｍｌの２５％アンモニア水溶液中で溶解させ、６０℃で保温した。１６時間の保温後、水性アンモニアを蒸発により除去し、残留物を１ｍｌのＨＰＬＣ緩衝液Ａ中で再度溶解させた。５０μｌのそれぞれの試料をＨＰＬＣ装置中に注入し、スペクトルを２６０ｎｍにおいて記録した。以下の溶媒勾配系を用いた：［Ａ：０．１Ｍ （Ｅｔ_３ＮＨ）ＯＡｃ （ｐＨ ７．０）／ＭｅＣＮ ９５：５；Ｂ：ＭｅＣＮ；勾配：０〜１５分 Ａ中０〜３０％Ｂ、３０〜４０分 Ａ中３０〜４０％Ｂ、４０〜４５分 Ａ中４０〜０％Ｂ、流速０．７ｃｍ^３分^−１］。成分の定量化をピーク面積に基づいて行い、それをＨＰＬＣ緩衝液Ａ中のヌクレオシドの消衰係数（ε_２６０）で割った。

以下のヌクレオシドの消衰係数（ε_２６０）を用いた：２６（１５００）、２７（６３００）、２８（７３００）、および１（１０１００）。
表７から、ならびに対応する図６〜９から明らかであるように、ヌクレオシド２７、２８および１は適当な安定性を示し、一方でヌクレオシド２６はかなり不安定であることが分かった。

実施例６：
異なるチオオキソヌクレオシドを組み込んだ様々なオリゴヌクレオチドの金ナノ粒子へのコンジュゲーション
６．１ オリゴヌクレオチドの合成、精製および特性付け。

ヌクレオシド１、２６〜２８を含有する一連のオリゴヌクレオチド（８〜９、３２〜３７）（表８参照）を、固相上で、１μｍスケールで、通常のホスホロアミダイト類およびホスホロアミダイト５、３８〜４０（図１０参照）を用いて、３’−（２−シアノエチル）−ホスホロアミダイト化学に関するプロトコルに従って合成した。固体支持体からの切断の後、２７または１を含有するオリゴヌクレオチドを２５％ＮＨ_３水溶液中で６０℃において１４〜１６時間（標準的な脱保護条件）脱保護した。２６または２８を組み込んだオリゴヌクレオチドを、５０ｍＭ ＮａＳＨを含有する２５％ＮＨ_３水溶液中で、室温において一夜（供給業者の推奨条件）脱保護した。そのＤＭＴ含有オリゴヌクレオチドを、ＤＭＴ−ｏｎ方式の逆相ＨＰＬＣ（Ｍｅｒｃｋ−日立−ＨＰＬＣ；ＲＰ−１８カラム）上で、以下の勾配系を用いて精製した：［Ａ：０．１Ｍ （Ｅｔ_３ＮＨ）ＯＡｃ （ｐＨ ７．０）／ＭｅＣＮ ９５：５；Ｂ：ＭｅＣＮ］：３分間、Ａ中２０％Ｂ、１２分間、Ａ中２０〜５０％Ｂ、および２５分間、Ａ中２０％Ｂ、流速１．０ｍｌ／分。溶媒を蒸発させ、そのオリゴヌクレオチドを２．５％ Ｃｌ_２ＣＨＣＯＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２（４００μｌ）で０℃において５分間処理して４，４’−ジメトキシトリチル残基を除去した。その脱トリチル化されたオリゴマーを、再度逆相ＨＰＬＣ［勾配：０〜２０分 Ａ中０〜２０％Ｂ；流速１ｍｌ／分］により精製した。そのオリゴマーを短いカラム（ＲＰ−１８、シリカゲル）上でＨ_２Ｏを塩の溶離のために用いて脱塩し、一方でそのオリゴマーをＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（３：２）で溶離した。そのオリゴヌクレオチドをＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ蒸発装置上で凍結乾燥すると無色の固体が得られ、それを−２４℃で凍結させた。

オリゴヌクレオチド８〜９、３２〜３７の分子質量を、線形陰性モード（ｌｉｎｅａｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｍｏｄｅ）でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により決定した。その検出された質量は、計算値と同一であった（表８）。

６．２ チオオキソヌクレオシドを分子アンカーとして用いるオリゴヌクレオチド金ナノ粒子コンジュゲートの調製のための一般的な手順
１５ｎｍ金ナノ粒子溶液を、Turkevichにより報告され、後にLetsingerおよびMirkinにより記述されたプロトコル(Mirkin, C.A. et al., Nature 283 (1996) 607-609; Elghanian, R., et al., Science 277 (1997) 1078-1081; Turkevich, J. et al., Faraday Soc. 11 (1951) 55-75)に従って、ＨＡｕＣｌ_４溶液からシトレート還元により調製した。その金ナノ粒子（約３ｎＭ）を、それらの５’末端においてチオオキソヌクレオシド１、２６〜２８の１つを含有するオリゴヌクレオチド８〜９、３２〜３７を用いて機能性付与した。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは、１ｍｌの金ナノ粒子溶液を精製したオリゴヌクレオチド溶液（３μＭの最終的なオリゴヌクレオチド濃度）と混合することにより調製した。そのカップリング反応はわずかに高い温度（４０℃）で実施された。２０時間静置した後、５μｌの２Ｍ ＮａＣｌ、０．２ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．０）を一定の撹拌の下で添加してそのナノ粒子溶液のＮａＣｌ濃度を０．０１Ｍまで増大させた。その溶液を４０℃で６〜８時間保温した。この手順を３回繰り返して、そのナノ粒子コンジュゲート溶液のＮａＣｌ濃度を０．０２Ｍから０．０５Ｍ、そして最終的に０．１Ｍ ＮａＣｌまで段階的に増大させた。その間で、その溶液を常に４０℃で６〜８時間経過させた。続いて、そのＤＮＡ金ナノ粒子溶液を遠心分離し（８０００ｒｐｍ）、透明な上清を取り除いて未結合のオリゴヌクレオチドを除去した。その沈殿を１ｍｌの０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ ７．０）中で再度分散させた。保温（２４時間、４０℃）の後、そのナノ粒子溶液を同じ緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ ７．０）で再度洗浄し、最終的に１ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８−Ａｕ９、Ａｕ３２−Ａｕ３７が得られた。

６．２．１ ４−チオ−２’−デオキシチミジン（４−ｔｈｉｏ−２’−ｄｅｏｘｙｔｈｍｉｄｉｎｅ）に関する実験の詳細
４−チオ−２’−デオキシチミジン（２６）を含有するオリゴヌクレオチド３２および３３の紫外−可視スペクトルは、ヌクレオシド２６のチオオキソ基による３３７ｎｍにおける特徴的な紫外吸収を示す（２６に関する報告された文献の値：３３５ｎｍ；Fox, J.J. et al., J. Am. Chem. Soc. 81 (1959) 178-187）（図９ａ）。オリゴヌクレオチド３２または３３を用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰを、上記で記述したように調製した。結果として得られたＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３２およびＡｕ３３は５２４ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示し、これは凝集していない状態を示している。ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３２およびＡｕ３３の安定性を、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ ７）緩衝溶液中でさらに試験した。ガラスキュベット中での０．２Ｍ ＮａＣｌの存在下での一夜の保温後、両方のコンジュゲートは５２４．５ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示す。しかし、著しい量のＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートがそのキュベットのガラス表面に接着することが分かった。このため、そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲート溶液の吸光度の高さは元の値から約３６％減少した。この結果に基づいて、４−チオ−２’−デオキシチミジン（２６）をアンカー分子として用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは、０．２Ｍ ＮａＣｌの存在下では不安定と分類される（表９、項目１参照）。

次に、チオヌクレオシド２６を組み込んだオリゴヌクレオチドＡｕＮＰコンジュゲートのハイブリダイゼーション特性を調べた。典型的な実験において、０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３２を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液および０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３３を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液を一緒に混合した（等濃度）。ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３２およびＡｕ３３を含有する溶液を一夜保温しておいた。この間に、赤色から紫色への色の変化と同時に起こるプラズモン共鳴バンドのゆっくりとした赤方移動（５２４ｎｍ→５４８ｎｍ）および幅の広がりにより明示される、相補的なオリゴヌクレオチドＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３２およびＡｕ３３のゆっくりとしたハイブリダイゼーションが起こった。最終的に、そのＤＮＡ金ナノ粒子網状構造の沈殿が観察され、結果として透明な上清および黒ずんだ沈殿が生じた。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液を激しく振盪した後、その沈殿を再度分散させることができ、５４８ｎｍの紫外／可視極大を有する紫色の溶液がもたらされる。

６．２．２ ２−チオ−２’−デオキシチミジン（２−ｔｈｉｏ−２’−ｄｅｏｘｙｔｈｍｉｄｉｎｅ）に関する実験の詳細
オリゴヌクレオチド３４および３５の紫外スペクトルは、２６４ｎｍにおいて唯一の吸収極大を示す（２７に関する報告された文献の値：２６４ｎｍ；Vorbrueggen, H. et al., Chem. Ber. 106 (1973) 3039-3061）。オリゴヌクレオチド３４および３５を用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰを、上記で記述したように調製した。結果として得られたＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ−１６およびＡｕ−１７は５２４ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示し、これは０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液中での凝集していない状態を示している。しかし、０．２Ｍ ＮａＣｌ（１０ｍＭホスフェート（ｐＨ ７）緩衝液）の存在下では、凝集（溶液が黒色になる）、それに続く沈殿が即時に起こった。この結果に基づいて、２−チオ−２’−デオキシチミジン（２７）をアンカー分子として用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは、０．２Ｍ ＮａＣｌの存在下では不安定と分類される（表９、項目２参照）。

次に、チオヌクレオシド２７を組み込んだオリゴヌクレオチドＡｕＮＰコンジュゲートのハイブリダイゼーションを試験した。典型的な実験において、０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３４を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液および０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３５を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液を一緒に混合した（等濃度）。ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３４およびＡｕ３５を含有する溶液を一夜保温しておいた。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲート溶液の色の変化は観察されなかった。相補的なコンジュゲートＡｕ３４およびＡｕ３５を含有するＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液の紫外／可視スペクトルは５２４ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示し、これは凝集していない状態を示している
６．２．３ ６−チオ−２’−デオキシグアノシンに関する実験の詳細
６−チオ−２’−デオキシグアノシン（２８）を含有するオリゴヌクレオチド３６および３７の紫外−可視スペクトルは、ヌクレオシド２８のチオオキソ基による３４３ｎｍにおける特徴的な紫外吸収を示す（２８に関する報告された文献の値：３４１ｎｍ；Iwamoto, R.H. et al., J. Med. Chem. 6 (1963) 684-688）。オリゴヌクレオチド３６または３７を用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰを、上記で記述した手順に従って調製した。しかし、我々は、３６または３７を有するＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートの調製は困難に直面することを見出した。オリゴヌクレオチド３６および３７のＡｕＮＰへのコンジュゲーションは数回失敗した（５０％が失敗）。また、その遠心速度を８０００ｒｐｍ（標準的な速度）から５８００ｒｐｍへとかなり低減させなければならず、そうでなければその沈殿を再度分散させることができなかった。

得られたＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３６およびＡｕ３７は５２４ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示し、これは凝集していない状態を示している。ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３６およびＡｕ３７の安定性を、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ ７）緩衝溶液中でさらに試験した（図１３）。ガラスキュベット中での０．２Ｍ ＮａＣｌの存在下での一夜の保温後、両方のコンジュゲートは５２５ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示す。少量のＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートのみがそのキュベットのガラス表面に接着する。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲート溶液の吸光度の高さは元の値から１０〜１４％減少した（図１３）。この結果に基づいて、６−チオ−２’−デオキシグアノシン（２８）をアンカー分子として用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは、０．２Ｍ ＮａＣｌの存在下で安定と分類される（表９、項目３参照）。

次に、チオヌクレオシド２８を組み込んだオリゴヌクレオチドＡｕＮＰコンジュゲートのハイブリダイゼーション特性を調べた。典型的な実験において、０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３６を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液および０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３７を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液を一緒に混合した（等濃度）。ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ３６およびＡｕ３７を含有する溶液を一夜保温しておいた。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲート溶液のごくわずかな色の変化が観察された。相補的なコンジュゲートＡｕ３６およびＡｕ３７を含有するＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液の紫外／可視スペクトルは、プラズモン共鳴バンドの赤方移動（５２４ｎｍ→５３８ｎｍ）、吸収の減少およびプラズモン共鳴バンドのわずかな幅の広がりを示す。しかし、我々は４−チオ−２’−デオキシチミジン（２６）または７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシン（１）に関して記述したような一夜の保温後のＤＮＡ−ＡｕＮＰの沈殿（節６．２．１および６．２．４を参照）を観察しなかった。数日（約１週間）後にようやくＤＮＡ金ナノ粒子網状構造の沈殿が観察され、結果として透明な上清および黒ずんだ沈殿が生じた。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液を激しく振盪した後、その沈殿を再度分散させることができ、５４９．５ｎｍの紫外／可視極大を有する紫色の溶液がもたらされる。

６．２．４ ７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシンに関する実験の詳細
７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシン（１）を含有するオリゴヌクレオチド８および９の紫外−可視スペクトルは、ヌクレオシド１のチオオキソ基による３４５ｎｍにおける特徴的な紫外吸収を示す（１に関する報告された文献の値：３４５ｎｍ；Seela, F. et al., Liebigs Ann. Chem. 1 (1987) 15）。オリゴヌクレオチド８または９を用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰを、上記で記述したように調製した。結果として得られたＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８およびＡｕ９は５２４ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示し、これは凝集していない状態を示している。ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８およびＡｕ９は、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ ７）緩衝溶液中でも再度分散した。

ガラスキュベット中での０．２Ｍ ＮａＣｌの存在下での一夜の保温後、両方のコンジュゲートは５２４．５ｎｍにおけるプラズモン共鳴を示す。少量のＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートのみがそのキュベットのガラス表面に接着する。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲート溶液の吸光度の高さは元の値から１０〜１４％減少した。この結果に基づいて、７−デアザ−６−チオ−２’−デオキシグアノシン（１）をアンカー分子として用いるＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートは、０．２Ｍ ＮａＣｌの存在下で安定と分類される（表９、項目４参照）。

次に、チオヌクレオシド１を組み込んだオリゴヌクレオチドＡｕＮＰコンジュゲートのハイブリダイゼーション特性を調べた。典型的な実験において、０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液および０．５ｍｌのＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ９を含有する０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭホスフェート（ｐＨ７）緩衝溶液を一緒に混合した（等濃度）。ＤＮＡ−ＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８およびＡｕ９を含有する溶液を一夜保温しておいた。この間に、赤色から紫色への色の変化と同時に起こるプラズモン共鳴バンドのゆっくりとした赤方移動（５２４ｎｍ→５６７ｎｍ）および幅の広がりにより明示される、相補的なオリゴヌクレオチドＡｕＮＰコンジュゲートＡｕ８およびＡｕ９のゆっくりとしたハイブリダイゼーションが起こった。最終的に、そのＤＮＡ金ナノ粒子網状構造の沈殿が観察され、結果として透明な上清および黒ずんだ沈殿が生じた。そのＤＮＡ−ＡｕＮＰ溶液を激しく振盪した後、その沈殿を再度分散させることができ、約５６７ｎｍの紫外／可視極大を有する紫色の溶液がもたらされる。

上記で要約した実験（特に表９を参照）から、オリゴヌクレオチドが式Ｉに従うヌクレオシドに基づくチオオキソヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチド金コンジュゲートは、少なくとも特定の技術的観点において、そのオリゴヌクレオチドが先行技術から既知であるようなチオオキソヌクレオチド（例えば、表９の物質２６および２７それぞれ）を含んでいるオリゴヌクレオチド金コンジュゲートよりも優れていると思われる。

Claims (12)

1. オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートであって、該固相がチオフィリック金属を含み、該オリゴヌクレオチドが少なくとも１個の式Ｉに従うチオオキソ核酸塩基を含み：
   式中、ＸはＣＨまたはＮであり、式中、Ｒ１はＨまたはＮＨ_２であり、式中、---は共有結合を示し、ここで前記のオリゴヌクレオチドが前記の固相に前記のチオオキソヌクレオチドの硫黄原子を介して結合している、前記オリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
2. 式ＩのＸがＣＨである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
3. チオフィリック固相がチオフィリック貴金属またはオフィリック金属を含む半導体ナノ結晶からなる群から選択される、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
4. チオフィリック固相が金および銀からなる群から選択される貴金属である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
5. 金属が金である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
6. 固相が金ナノ粒子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
7. 金属が固体支持体上の層として存在する金である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
8. チオフィリック固相がチオフィリック半導体物質である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
9. チオフィリック半導体物質がナノ結晶として存在する、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
10. オリゴヌクレオチドが少なくとも８ヌクレオチドの長さである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲート。
11. 核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出法における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド−固相コンジュゲートの使用。
12. 請求項６または９のオリゴヌクレオチドナノ粒子コンジュゲートの、標識としての使用。