JP2010509927A - 軟骨細胞表現型の安定性の確認および軟骨生成に影響を及ぼす因子のスクリーニングにおける使用のためのマーカー遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、軟骨細胞表現型の安定性を調べるための方法およびツール、ならびに軟骨欠損および軟骨関連疾患の処置に有用な化合物を特定するためのスクリーニングシステムに関する。
軟骨欠損の修復は、主に、外科的方法(骨髄刺激術など)、または軟骨形成性細胞(軟骨細胞、その(軟骨)前駆細胞(progenitor)および一過性細胞(precursor)もしくは軟骨に発達する幹細胞)の移植によって行なわれる。これに鑑みると、インビボ軟骨形成に正に影響を及ぼし得る因子の特定は重要である。実際、欠損部内または欠損部近傍に存在する局所細胞によって媒介される軟骨形成に正に影響を及ぼし得る外科処置または治療法もしくは治療用化合物が特定されることが望ましい。また、細胞系療法剤は、拡大培養または継代培養された単離細胞集団がインビボで安定な軟骨を生成する能力に正に影響を及ぼし得る因子または処置が、インビトロで特定されるものであることが重要である。
本発明は、任意の所与の状況において、すなわち細胞にとって天然であれ誘発された状態であれ、軟骨形成を示す特異的マーカープロファイルを提供するという新規な概念に基づくものであり、これは、軟骨形成に影響を及ぼし得る因子の特定における標的プロファイルとみなされ得る。
たは条件の効果を判定することを含む方法を提供する。本明細書に記載の方法の特定の実施形態では、FRZB、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2およびRASF−PLAからなる群より選択される1つ以上の陽性マーカー遺伝子の発現を増大させ得る化合物または条件は、軟骨形成に正に影響を及ぼすと特定され、PEDFおよび/またはALK−1のいずれかの発現を増大させ得る化合物は軟骨形成に負に影響を及ぼすと特定される(より具体的には、細胞がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力)。
はプローブが試験対象のマーカーに特異的なPCRプライマーのセットであるキットである。種々の型のプローブを備えるキットも想定される。キットのさらなる特定の実施形態では、標識されたプローブが提供される。
定義
用語「軟骨形成性(の)」は、細胞または集団に適用される場合、該細胞または集団が適切な状況下で軟骨を生成するか、または軟骨成長を刺激する固有の能力をいう。
マトリックス上に播種するか、またはその内部に封入し、皮下に約6〜8週間皮下移植した後、血管浸潤または軟骨内性骨形成の徴候のない安定な軟骨移植組織の発生を調べてもよい。本発明によれば、インビボで安定な硝子軟骨を生成し得る細胞集団は、本明細書に記載の表現型安定性の特定のマーカーの組合せの存在を特徴とする。軟骨細胞表現型の安定性は、継代培養すると成熟軟骨細胞において徐々に失われる。
FRZB:Frizzled関連タンパク質1[OMIM 605083、Genbank U91903]
ALK1:アクチビンA受容体、II型様キナーゼ1[OMIM 601284、Genbank Z22533]
PEDF:色素上皮由来因子[OMIM 172860、Genbank M76979]
COL11:コラーゲン、XI型A1[OMIM 120280、Genbank J04177]
COL2:コラーゲン、II型、α1[OMIM 120140、Genbank L10347]
FGFR3:線維芽細胞増殖因子受容体3[OMIM 134934、Genbank
M58051]
BMP−2:骨形成タンパク質2[OMIM 112261、Genbank M22489]
RASF−PLA2:ホスホリパーゼA2、IIA群[OMIM 172411、Ge
nbank M22430]
OPN:オステオポンチン[OMIM 166490、Genbank X13694]
である。
。実際には、多数のマーカー遺伝子のセットの中の1つのマーカー遺伝子の発現の変化は、該多数のマーカー遺伝子の発現スコア全体に対してほとんど影響がない。このような論拠および特定された種々のマーカーの観察された相対寄与に基づき、3〜9個の任意の数のマーカーが、細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性の測定、または細胞集団の軟骨細胞表現型の安定性に対する化合物または条件の影響の評価に好適であると決定された。一実施形態によれば、5つ、6つまたは7つのマーカーのセットが、かかるマーカーの組から得られるスコアの正確さと、ハイスループットスクリーニングにおけるこのアッセイの実用的な実現可能性とを最適に両立させる。
を用いて行われ、評価の結果は、報告書に記載されるか、または品質管理シートにまとめられる。細胞集団は、ヒトまたは動物組織から採取されたP0または該細胞集団の任意の継代培養物であり得る。一実施形態によれば、細胞集団は、ヒト軟骨生検材料から採取したP2〜P6の集団である。あるいはまた、集団倍加数が考慮され得る。本発明との関連において考慮されるほとんどの細胞集団では、継代培養ごとに2〜3の集団倍加を伴う。したがって、本発明との関連において、細胞集団は1または2の集団倍加(P0)後に評価される。任意選択で、細胞集団は、1種または種々の生検材料由来の細胞の種々の継代培養物の組合せ(任意選択で、P0を含む)である。細胞の自己移植が意図される場合、特定の患者の1種類以上の生検材料から採取された細胞を、任意選択で合わせ、(合わせる前および/または後に)軟骨細胞表現型の安定性について確認する。典型的には、品質評価は、特定の時点で、すなわち、移植(骨格またはマトリックス内の細胞または2Dもしくは3D組織として)の前、保存(例えば、凍結)の前、および/または保存からの回復時、細胞集団を特定の処理および/または条件に供する前および/または供した後に行われる。
形成に対するインビボ潜在効果を有する化合物のスクリーニングおよび特定に有用である。本発明のスクリーニング方法の用途としては、処置対象の患者の体内の局所細胞による軟骨形成および/または細胞移植の状況における細胞による軟骨形成に影響を及ぼす化合物の特定が想定される。該スクリーニング方法を用いて、病的状況に存在する因子または条件を妨げ得る化合物が特定および/または評価され得る。例えば、細胞を例えばIL−1で刺激した後(炎症状態を刺激するため、異化経路を増強するため、および同化プロセスを下方調節するため)、この効果を妨げる潜在能を有する化合物が添加され得る。
ルは異なり得るため、当業者には、選択したハウスキーピング遺伝子と比較したマーカー遺伝子の相対発現は、事前に、使用する各ハウスキーピング遺伝子について、軟骨細胞表現型の安定性を有する集団において確立されている必要があることが理解されよう。本発明によれば、選択したマーカーの発現に関する情報の併合により、該細胞がインビボで軟骨形成し得るか否かが示される。
属させる。
促進する化合物の添加)は、軟骨形成潜在能スコアを減少させる。
細胞、骨軟骨細胞系統に誘導され得る一過性細胞または幹細胞である。本発明のアッセイは、この細胞が骨軟骨細胞系統になるように拘束されたものであるか否かを判定するために使用され得る。
リーまたは化合物ライブラリーの古典的なスクリーニングにも適している。このようなライブラリーを構成する化合物としては、限定されないが、合成により作製されるか、または天然供給源から得られる生物製剤および有機または無機化合物が挙げられる。使用され得るその例は、化合物のライブラリー、例えば、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディスプレイライブラリー、ペプチドライブラリー(例えば、LOPAP#、Sigma Aldrich)、脂質ライブラリー(BioMol)、合成化合物ライブラリー(例えば、LOPAC@、Sigma Aldrich)または天然化合物ライブラリー(Specs、TimTec)などである。
以下の実施例は本発明を説明することが意図され、なんら本発明を本明細書に記載の特定の実施形態に限定することを示唆するものではない。これらの実施例は、添付の図面に図示される。
軟骨細胞の培養
Dell’Accioら(2001),Arthritis Rheum.44、1608−1619)に記載の標準的な条件を用いて成人ヒト関節軟骨由来の軟骨細胞を単離し、インビトロで拡大培養した。
本発明のマーカーを、別々の人から採取した48例の軟骨細胞試料の組を用いて検証し、新鮮単離したもの、または1回から5回まで継代培養されたものとした。軟骨細胞の一部をマーカー解析(実施例3参照)に使用し、一方で、別の一部を各試料の軟骨形成能を検証するためのインビボアッセイに使用した。雌NMRI nu/nuマウス(大腿部の尾側部分)に、約500万個のヒト細胞を筋肉内注射した。移植組織を2週間後に収集した[Lipmanら(1983)Calcif.Tissue Int.35,767−772;Ostrowskiら(1975)Somatic Cell Genet.1,391−395]。軟骨移植組織を筋肉から解離し、ヘマトキシリン−エオシン、トルイジンブルーおよびサフラニンO染色を用いて組織学的検査を行なった。染色後の移植組織に1〜3の範囲の組織学的検査スコアを帰属させる。組織学的検査スコア3は、高度に硫酸化されたプロテオグリカンを有する硝子様軟骨、トルイジンブルーおよびサフラニンOによる強い染色を示す。組織学的検査スコア2は、充分分化した硝子様軟骨、トルイジンブルーによる強い染色、サフラニンOによる弱い染色を示す。組織学的検査スコア1は、未分化線維性組織である「線維軟骨」、トルイジンブルーによる染色なしまたは弱い染色を示す。組織学的検査スコア0は、移植組織が回収されなかった実験を示す。組織学的検査スコア2または3の軟骨は成功裡の移植を示す。組織学的検査スコア0または1の軟骨は非成功裡の移植を示す。
注射された細胞の一部を遺伝子発現解析に使用した。RNAの単離、逆転写およびPC
Rは、WO0124832に記載の方法を用いて行なった。これらのマーカーに対するPCRプライマーを表1に示す。
実施例1で測定した軟骨形成潜在能スコアと組織学的検査スコアとの相関関係を表3および図1に示す。軟骨形成潜在能スコアと組織学的検査スコアとの相関係数は0.78であり、統計学的に有意である(p<0.0001)。
く生じない。軟骨形成潜在能スコア2以上の試料では、常に硝子軟骨が生じる。軟骨形成潜在能スコア1の試料では、6例中1例に硝子軟骨が生じる。
軟骨形成潜在能スコアと組織学的検査スコアとの関係を図1および表3に示す。
「順序分類尺度(ordered categorical scale)」は、単にカテゴリーに番号付けして、その順位を示す尺度である。割り当てられた実際の数値は他の情報を示さない。例えば、ここでは、組織学的検査の尺度は0、1、2、3の値をとる。これを順序分類尺度と解釈するということは、1は0よりも良好であることを示すが、どれだけ良好であるかは言及していない。しかしながら、間隔尺度は、実際の数値が意味を持つとみなされ、例えば1が0よりも良好である量は2が1よりも良好である量と同じである。表3の場合の平均値の計算では、組織学的検査スコアは間隔尺度として有効に処理され得るという暗黙の想定がなされる。
軟骨形成潜在能スコアを間隔尺度として処理する場合、観察された応答は、ロジスティック解析を用いてスムージング処理され得る。この方法により、所望のカテゴリー(2または3)である確率が予測される。フィット値は妥当な範囲(0〜100%)を超えない。このようなフィット値を表3の最後の欄に示し、スムージングの効果を示す。このようなフィット推定値は、任意の所与の軟骨形成潜在能スコアで2または3の組織学的検査スコアが得られる可能性に関して、他の方法よりも信頼性のある予測をもたらすと考えられる。特に軟骨形成潜在能スコア−1では、フィットモデルによって、2または3が得られる可能性が41.5%で予測されている結果、スコア−1は許容されるべきか否かという問題が生じることに注意されたい。
個々のマーカーの影響は、実施例1の軟骨形成潜在能スコアを決定したマーカーのセットの6つのマーカーの代わりに5つのマーカーの発現プロフィールを再計算することにより評価される。同じスコアリングシステムを適用したが、この場合、スコアは−5〜+5の範囲であり得る。
実施例1のマーカーのセットから除外した場合)。
累加マーカースコアを用いた軟骨細胞表現型の安定性の評価を、細胞がインビボで安定な軟骨を生成する能力に影響を及ぼし得る化合物を特定するため、および該細胞に対するかかる化合物の効果の性質を調べるためのスクリーニングアッセイにおいて試験した。
化合物Aは、軟骨保護効果を有すること、および軟骨細胞表現型に対する推定安定化効果を有することが予測される候補化合物であった。累加マーカースコア、より具体的には実施例1の軟骨形成潜在能スコアの決定を用いて、軟骨細胞単層培養物の軟骨細胞表現型の安定性に対するこの化合物の効果を調べた。
軟骨細胞を単層培養にて、T25フラスコ内で4×104細胞/mlで培養した。化合物Aを、平板培養直後の細胞に添加した。最終総容量5mlの完全培地(DMEM+10%FBS)を添加した。各条件(1μMまたは10μMの化合物A、DMSO対照)に対して3つのフラスコを使用した。培地と化合物を1週間に1回交換した。コンフルエントになったら、継代培養0の軟骨細胞(P0)をトリプシン処理し、計数し、2×105細胞を再度平板培養してP1培養物とした。残りの細胞を溶解培地に入れ、RNA抽出を行なった。同じ手順を、P1、P2およびP3軟骨細胞培養物に対して行なった。TaqMan RT−PCRを用いて軟骨形成マーカーの発現を調べた。
単層培養により得た軟骨細胞をPBSで洗浄し、1%のメルカプトエタノールを含有するRLTバッファー(Qiagen)を用いて溶解させた。溶解細胞は、使用するまで−80℃で保存した。mRNAは、RNeasyマイクロキット(Qiagen)を製造業者の使用説明書に従って用いて精製した。cDNAは、ランダムヘキサマーを用いて製造業者の使用説明書(Invitrogen)に従って合成した。
リアルタイム定量的PCR(RT−PCR)は、ABI prism 7700配列検出装置システムを用いて行なった。RT−PCRにはMastermix qPCRキット(Eurogentec)を、製造業者の使用説明書に従って使用した。TaqMan解析に使用するプライマーおよびプローブは、Applied BiosystemsまたはEurogentecにオーダーした。リアルタイムPCRのデータは、2−deltadeltaCT(2DDCT)法を用いて計算した。これは、内因性参照(β−アクチン)に対して標準化し、標準物質(この場合は、コントロール条件(DMSO)下での選択した遺伝子の発現レベル)と比較した標的遺伝子の量と定義される。
化合物Aは、軟骨形成能、表現型安定性および軟骨細胞の恒常性を示すいくつかの分子マーカーの発現に対して効果を有し、単層培養での軟骨細胞の拡大培養中、軟骨形成潜在能スコアの減少を妨げる能力を有した(図2参照)。したがって、1μMおよび10μMの両方の濃度で、P0およびP3の軟骨細胞の軟骨形成潜在能スコアは、該化合物の非存在下で培養された軟骨細胞と比較すると、同等であったか、または上昇している場合さえあった。後者の場合、P0軟骨細胞に対してP3軟骨細胞では累加マーカースコアの低下が観察された。
14種類の化合物を、アルジネート培養物の脱分化軟骨細胞の再分化を増強する能力についてスクリーニングした。該化合物が3D培養状態での軟骨形成性表現型の細胞の収集に影響を及ぼす能力を評価するため、種々の分子マーカー発現に対する該分子の効果、および累加マーカースコア(実施例1で測定した軟骨形成潜在能スコア)に対する該分子の効果を調べた。
完全培地中での単層培養における拡大培養後、5例のOA患者(50〜65歳)から採取した3回継代培養のヒト軟骨細胞(P3)をトリプシン処理によって解離させ、計数し、トリパン排除試験によってバイアビリティを試験した。軟骨細胞を2%アルジネートに懸濁させ、等量のHBSSを添加した。細胞懸濁液を10ml容シリンジニードル内に吸引し、24ゲージ針で1滴ずつ塩化カルシウム溶液中に移した(5粒/ウェル、細胞総数
250000/ウェル)。この粒をNaClで洗浄し、新たな完全培地(DMEM+10%FBS)を添加した。4日間の培養後、上清みを除去し、新たな培地を、10μMの濃度の該化合物とともに添加した。化合物添加の4日後、上清みを除去し、細胞を粒から遊離させ、溶解させた。mRNAおよびcDNAを作製し、TaqMan RT−PCRを用いて実施例1に記載のようにして、COL2、COL11、FGR3、FRZB、ALK1、PEDFの発現を測定した。
アルジネート中で培養された軟骨細胞におけるマーカー遺伝子発現のアップレギュレートまたはダウンレギュレートに対する化合物の相対効果を表11にまとめる。効果は、分子の非存在(但しビヒクルDMSOの存在下)で培養された軟骨細胞と比較したものである。結果をコントロール(軟骨細胞+DMSO)と比べた平均発現(5例のOA患者の平均)で示す。NS=有意でない;−=阻害;+=増強;#=p<0.05(コントロールDMSOと比較したとき有意)。化合物は10μMで使用した。
軟骨形成潜在能スコアに有意に影響を及ぼす実施例4の化合物について、細胞の軟骨細胞表現型の安定性に対する該化合物の効果もまたインビボで試験される。この目的のため、細胞集団を試験化合物またはバッファーのいずれかと接触させ、インキュベーション後、ヌードマウスモデル(上記参照)に注射する。各細胞集団が安定な硝子軟骨を生成する能力を評価する。軟骨形成潜在能スコアに対する化合物の効果は、該細胞集団の軟骨形成
潜在能に対する効果と相関することが確立される。
Claims (22)
- 細胞集団がインビボで安定な硝子軟骨を生成する能力を調べるためのインビトロ方法であって、前記集団によるFRZBと、ALK1と、PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2およびRASF−PLAからなる群より選択される1つ以上のマーカーとを含む少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットの発現を調べることを含む、方法。
- 細胞集団を化合物または条件と接触させる、請求項1に記載の方法。
- − 細胞集団を化合物または条件と接触させる工程、ならびに
− 前記細胞集団によるFRZBと、ALK1と、PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2およびRASF−PLAからなる群より選択される1つ以上のマーカー遺伝子とを含む少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットの発現レベルを測定する工程
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - さらに、
− 前記接触させる工程の前に、前記細胞集団による前記少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットの発現レベルを測定する工程、ならびに
− 前記接触させる工程の後に、該化合物または条件が、前記少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットの中の1つ以上の発現に影響を及ぼし得るものであるか否かを判定する工程
を含む、請求項3に記載の方法。 - 該少なくとも3つのマーカーのセットが、FRZBと、ALK1と、それぞれPEDF、COL11、COL2およびFGFR3からなる群より選択される2つ、3つおよび4つのマーカー遺伝子とを含む少なくとも4つ、5つまたは6つのマーカー遺伝子のセットである、請求項1〜4いずれか1項に記載の方法。
- 該少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットが、FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2およびFGFR3を含む少なくとも6つのマーカー遺伝子のセットである、請求項1〜5いずれか1項に記載の方法。
- さらに、該少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットの発現に対する該化合物の存在の効果に基づいて、該化合物が、インビボで安定な硝子軟骨を生成する細胞集団の能力に影響を及ぼす能力を測定することを含む、請求項3または4に記載の方法。
- FRZB、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2およびRASF−PLAからなる群より選択される1つ以上の陽性マーカー遺伝子の発現を増大させ得る化合物が軟骨形成に正に影響を及ぼすと特定され、PEDFおよび/またはALK−1のいずれかの発現を増大させ得る化合物が軟骨形成に負に影響を及ぼすと特定される、請求項7に記載の方法。
- 化合物または条件が軟骨形成に影響を及ぼす能力が、FRZB、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2、RASF−PLAからなる群より選択される陽性マーカー遺伝子と、陰性マーカー遺伝子PEDFおよび/またはALK−1の発現に対する該化合物または条件の累加効果に基づいて測定される、請求項8に記載の方法。
- 細胞集団が関節から採取されたものである、請求項1〜9いずれか1項に記載の方法。
- 細胞集団が健常ドナーから採取されたものである、請求項1〜10いずれか1項に記載の方法。
- 細胞集団が骨軟骨欠損を有する個体から採取されたものである、請求項1〜10いずれか1項に記載の方法。
- 該マーカーのセットのマーカーの発現レベルが定量的方法を用いて測定される、請求項1〜12いずれか1項に記載の方法。
- 細胞が軟骨形成をもたらす能力に影響を及ぼし得る化合物をインビトロで特定するためのマーカーのセットの使用であって、該マーカーのセットが、FRZBと、ALK1と、PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2およびRASF−PLAからなる群より選択される1つ以上のマーカーとを含む少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットを含むことを特徴とする、使用。
- 該マーカーのセットが、FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2およびFGFR3を含む少なくとも6つのマーカーを含む、請求項14に記載の使用。
- 軟骨形成性細胞における遺伝子のセットの発現を検出するためのプローブを備えるキットであって、該遺伝子のセットが、FRZBと、ALK1と、PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2およびRASF−PLAからなる群より選択される1つ以上のマーカーとを含む少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットを含む、キット。
- 該少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットが、FRZB、ALK1、PEDF、COL11、COL2およびFGFR3を含む、請求項16に記載のキット。
- 該マーカー遺伝子の少なくとも1つの検出のためのプローブが、mRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである、請求項16に記載のキット。
- 該マーカー遺伝子の少なくとも1つの検出のためのプローブが抗体である、請求項16に記載のキット。
- 該マーカー遺伝子の少なくとも1つの検出のためのプローブが、PCRプライマーのセットである、請求項16に記載のキット。
- 該プローブが標識されている、請求項16〜20いずれか1項に記載のキット。
- 軟骨形成性細胞における遺伝子のセットの発現を検出するためのデバイスであって、下記のFRZBと、ALK1と、PEDF、COL11、COL2、FGFR3、OPN、BMP−2およびRASF−PLAからなる群より選択される1つ以上のマーカーとを含む少なくとも3つのマーカー遺伝子のセットを含むマーカー遺伝子の発現を検出するためのユニットの1つ以上を備える、デバイス。
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