SK500102020A3 - Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu - Google Patents

Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu Download PDF

Info

Publication number
SK500102020A3
SK500102020A3 SK500102020A SK500102020A SK500102020A3 SK 500102020 A3 SK500102020 A3 SK 500102020A3 SK 500102020 A SK500102020 A SK 500102020A SK 500102020 A SK500102020 A SK 500102020A SK 500102020 A3 SK500102020 A3 SK 500102020A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
iso
hsa
mir
seq
mirna
Prior art date
Application number
SK500102020A
Other languages
English (en)
Inventor
doc. RNDr. Rabajdová Miroslava, PhD.
prof. RNDr. Slabý Ondřej, PhD.
RNDr. Šoltys Katarína, PhD.
prof. Ing. CSc. Mareková Maria
doc. MUDr. Toporcerová Silvia, PhD.
Original Assignee
Univerzita Pavla Jozefa Šafárika V Košiciach
Masarykova Univerzita
Univerzita Komenského v Bratislave
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Pavla Jozefa Šafárika V Košiciach, Masarykova Univerzita, Univerzita Komenského v Bratislave filed Critical Univerzita Pavla Jozefa Šafárika V Košiciach
Priority to SK500102020A priority Critical patent/SK500102020A3/sk
Priority to AU2021231356A priority patent/AU2021231356A1/en
Priority to CA3174570A priority patent/CA3174570A1/en
Priority to EP21723451.7A priority patent/EP4114977A1/en
Priority to US17/905,624 priority patent/US20230257809A1/en
Priority to IL296085A priority patent/IL296085A/en
Priority to PCT/SK2021/050004 priority patent/WO2021177904A1/en
Priority to MX2022010721A priority patent/MX2022010721A/es
Publication of SK500102020A3 publication Critical patent/SK500102020A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu zahŕňa dva nezávislé kroky: test identifikácie a analýzy prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov z plazmy periférnej krvi žien v deň in vitro fertilizačného procesu a test prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov z kultivačného média embrya odobraného na 4. až 6. deň kultivácie embrya. Úspešný test identifikácie a analýzy prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov z plazmy periférnej krvi žien v deň in vitro fertilizačného procesu vykazuje hraničné („cut off“) hodnoty vybraných miRNA biomarkerov pri počte čítaní 1, ktoré sú ≥ 1, a hraničnú hodnotu miRNA iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTATGTTGTGTGG pri počte čítaní 5, ktorá je ≥ 5. Úspešný test prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov z kultivačného média embrya vykazuje hraničnú hodnotu vybraných miRNA biomarkerov pri počte čítaní 1, ktorá je ≥ 1. Tieto hodnoty oboch testov predikujú úspešný in vitro fertilizačný proces.

Description

SK 50010-2020 A3
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka identifikácie súboru konkrétnych miRNA molekúl s cieľom určenia úspešnosti/neúspešnosti IVF (in vitro fertilizačného) procesu, ich využitia pri tvorbe diagnostického testu pri predikcii úspešnosti in vitro fertilizačného procesu u žien pri umelom oplodnení.
Doterajší stav techniky
Zdravie ľudskej populácie je jedným z hlavných atribútov fungovania ľudskej spoločnosti. Vysoké spoločenské nároky kladené na človeka prinášajú veľa negatívnych dopadov na jeho celkové zdravie. V súčasnosti neplodnosť postihuje 48,5 milióna párov na svete. Vzhľadom k infertilite, ako celopopulačnému problému, sa v posledných dekádach významne zvýšil počet realizovaných cyklov asistovanej reprodukcie v klinickej praxi. Napriek množstvu technických vylepšení v rámci kultivácie embryí v podmienkach in vitro, a napriek vylepšeniu kultivačných médií, väčšina transferovaných embryí sa v maternici nie je schopná uhniezdiť (de Mouzon a koľ, 2012). Relatívne nízku úspešnosť metód asistovanej reprodukcie preto vylepšujú transfery väčšieho počtu embryí v rámci IVF cyklu. Optimálna selekcia embrya v rámci IVF je rozhodujúcim krokom celej liečby. Na úspešnej implantácii sa okrem iných faktorov podieľa najmä vysokokvalitné embryo vhodné pre IVF proces. Kvalita embrya pre úspešnosť IVF procesu sa okrem základných morfologických znakov (sledovanie v embryoskope) nesleduje a nediagnostikuje. V súčasnosti používané rôzne selekčné a hodnotiace systémy kvality ľudských embryí pravdepodobne dosiahli svoj vrchol a už nemôžu zlepšiť výsledky asistovanej reprodukcie. Percento úspešnosti IVF procesu sa pohybuje na hranici 29 %. Je preto potrebné hľadať iný marker. Samotný oocyt môže predikovať významným spôsobom vývoj včasného embrya, keďže je dodávateľom RNA a celulámych mechanizmov. Mnohé vedecké skupiny sa venujú štúdiu folikulámej tekutiny a jej proteomickému zloženiu s cieľom predikcie kvality embryí (Kosteria a kol., 2017). Odber folikulámej tekutiny z jednotlivých folikulov je však technicky pomerne náročný a v klinickej praxi komplikovaný zákrok. Navyše pravdepodobnosť oplodnenia odobratých oocytov stále nedosahuje požadované percento, a preto ďalšie analýzy a embryologické techniky na tejto úrovni znásobujú ekonomické náklady.
Okrem analýzy markerov angiogenézy a vaskularizácie sa pozornosť vedeckej obce zameriava aj na štúdium nekódujúcich molekúl RNA, tzv. miRNA, ktoré post-transkripčne regulujú génovú expresiu u eukaryotov. Bolo potvrdené, že viac ako 130 miRNA je exprimovaných v ľudskej blastocyste a ich expresia sa líši v závislosti od ploidity a pohlavia embryí. Počas embryogenézy dochádza k značnému exprimovaniu špecifických miRNA molekúl, ktoiých hladiny je možné delegovať aj v kultivačnom materiáli embrya aj počas jeho in vitro kultivácie. Kultivačné médiá sa po uskutočnení transferu embrya alebo zmrazení embrya stávajú „odpadovým materiálom“. Doteraz bolo publikovaných niekoľko štúdií sledujúcich vzťah non-perceptívneho aj receptívneho endometria v korelácii s vývojovou kompetenciou embrya v kultivačnom médiu a miRNA (napr. miR142-5p, miR146a-5p, miR21, miR19b, miR302c). Napriek tomu neboli doposiaľ opublikované štatisticky signifikantné a relevantné výsledky, nesúrodosť ktoiých môže vyplývať aj z využitia rôznych metodík analýzy miRNA. Doposiaľ nebola skúmaná prítomnosť, resp. neprítomnosť miRNA molekúl a ich vzájomný korelačný vzťah v biologickom materiáli žien v procese IVF a žien pri opakovaných implantačných zlyhaniach. Je preto viac než žiadúce vytvoriť algoritmus kombinácie viaceíých biomakerov miRNA molekúl, resp. iných nekódujúcich ncRNA, ktoré by mohli potenciálne určovať úspešnosť/neúspešnosť IVF procesu u žien. Využitím týchto informácii bude možné upresniť stav endometriálnej vnímavosti, obdobie vznikajúceho implantačného okna ako aj najvhodnejšieho času prenosu embrya v procese IVF. Implantácia ľudského embrya je zložitý a multifaktorálny proces. miRNA sú endogénne, evolučné konzervatívne, jednoreťazcové nekódujúce RNA molekuly obsahujúce 20 - 24 nukleotidov, ktoré post-transkripčne regulujú génovú expresiu u eukaryotov, vrátane cicavčích buniek (Asirvatham a koľ, 2009; McCallie a koľ, 2010; Mouillet a koľ, 2015; Catalanotto a kol.,2016). V biologickej databáze miRBase je v súčasnosti evidovaných viac ako 250 ľudských miRNA. Viac ako 130 miRNA je exprimovaných v ľudskej blastocyste (McCallie a koľ, 2010; Rosenbluth a kol., 2013, Chán a kol., 2018). Bolo tiež potvrdené, že expresia miRNA sa v ľudskej blastocyste líši v závislosti od ploidity embryí, rovnako aj v závislosti od pohlavia embrya (Rosenbluth a kol., 2013). Bioinformatická analýza miRNA poukazuje na jej potenciálnu úlohu v rámci regulácie niekoľkých biologických ciest a bunkových funkcií, vrátane inhibície bunkového cyklu a tumor supresorových aktivít (Lee a koľ, 2014). Avšak biologická úloha väčšiny miRNA nie je dodnes presne stanovená. Doteraz bolo publikovaných niekoľko štúdií sledujúcich vzťah vývojovej kompetencie embryí a miRNA. Konsenzus však dodnes nebol v tejto problematike prijatý. Táto nesúrodosť môže byť daná rôznymi metódami analýzy miRNA, časom odberu kultivačného média v závislosti na dni vývoja embrya, a množstvom ďalších faktorov. Okrem toho, počas delenia včasného embrya neustále prebieha syntéza a degradácia miRNA. Bolo dokázané, že miRNA sa dedia od matky a v rámci prvého rozdelenia zygoty dochádza k strate až 60 % miRNA (Táng a kol., 2007). K nárastu expresie miRNA dochádza znovu v štádiu blastocysty (Zhang a koľ, 2016).
SK 50010-2020 A3
Vďaka komplexnosti a vysokému počtu nezávislých procesov, ktoré prebiehajú počas delenia včasného embrya, je nepravdepodobné, aby jeden biomarker bol schopný predikovať vývojovú kompetenciu embrya v rámci programu in vitro fertilizácie. Je preto dôležité, aby sa realizované štúdie sústreďovali na stanovenie základnej kombinácie biomarkerov vyvíjajúceho sa embrya, ešte pred samotnou implantáciou cmbrs a do maternice, ktoré by korelovali s výsledkom tehotnosti.
K ďalším faktorom multifaktoriálneho IVF procesu patrí perceptívne endometrium schopné interakcie s embryom a určenie implantačného okna. V súčasnosti sa na neinvazívne určenie perceptivity endometria využívajú najmä ultrazvukové markery - hrúbka, objem a krvný tok v endometriu (Bonilla-Musoles a kol., 2013). Pri určení implantačného okna sa jedná o časovo obmedzený jav, ktoiý sa vyskytuje iba v obmedzenom časovom období sekrečnej fázy menštruačného cyklu, známom aj ako „okno implantácie“ (OI). Okno implantácie sa najčastejšie objavuje v krátkom období - 20. až 24. deň ovariálneho cyklu a obvykle trvá len dva dni. Dochádza v ňom k špecifickej regulácii expresie vybraných génov zapojených do aktivácie angiogenézy, vaskularizácie a imunitnej odpovede. Súčasné štúdie zamerané na nesprávnu vnímavosť endometria došli k záverom, že odlišná expresia biomarkerov, či už vo zvýšenej alebo zníženej miere, často vedie k poruchám perceptivity. Dochádza k posunu implantačného okna alebo v horšom prípade k jeho zániku. V dôsledku problematickej interpretácie a prediktívnej hodnoty dostupných testov sa v súčasnosti len v malej miere využívajú testy perceptivity endometria (ER) u infertilných žien, resp. u žien pred plánovaným umelým oplodnením (IVF). Zlyhanie implantácie v dôsledku non-perceptívneho endometria zostáva do dnešného dňa nevyriešeným problémom reprodukčnej medicíny a veľmi častou príčinou neplodnosti u inak zdravých žien. Za posledných 5 rokov je aj napriek neustále sa zvyšujúcej snahe o zlepšenie implantačného procesu v podmienkach in vitro percento miery úspešne implantovaných embryí na hranici 29 %. Selekcia správneho embrya, určenie perceptivity endometria a vhodného času implantácie v cykle ženy sú kľúčovými premennými v procese in vitro fertilizácie. Existujú patentované testy perceptivity endometria ako aj implantačného okna. Doteraz však nikto nepatentoval distribúciu konkrétnych kanonických miRNA a iso-miRNA molekúl analyzovaných pomocou NGS (Next Generation Sequencing) pri určení biologickej kompetencie matky pri multifaktoriálnom zohľadnení jej variácie, resp. predikcie implantačnej úspešnosti IVF procesu v kombinácií so selekciou vysokokvalitného embrya v konkrétny deň IVF procesu.
Na svetovom trhu nie je prítomný diagnostický test, ktoiý by do 24 hodín, na základe vyhodnotenia prítomnosti kombinácie kanonických a iso-miRNA molekúl v plazme ženy a v kultivačnom médiu embrya predikoval úspešnosť nasledujúceho IVF procesu a prognosticky selektoval vysokokvalitné embryo vhodné na IVF transfer. Cieľom vynálezu je zvýšiť úspešnosť IVF procesu pri umelom oplodnení a poskytnúť diagnostický test na predikciu úspešnosti IVF procesu.
Podstata vynálezu
Predkladaný opis sa týka identifikácie súboru konkrétnych miRNA molekúl, čiže vytvorenia profilu miRNA s cieľom určiť úspešnosť/neúspešnosť IVF procesu. Okrem toho sa predložený opis týka možného využitia profilu miRNA pri tvorbe inovatívneho diagnostického neinvazívneho testu ako produktu personalizovanej medicíny pri predikcii úspešnosti in vitro fertilizačného procesu u žien podstupujúcich umelé oplodnenie. Diagnostický test zahŕňa dva nezávislé testy identifikácie prognostických kanonických miRNA a isomiRNA biomarkerov. Jeden test je Success test, v ktorom sa miRNA profil stanovuje z plazmy periférnej krvi ženy. Druhý test je CultMed test, v ktorom sa miRNA profil stanovuje z kultivačného média embrya (4. až 6. deň jeho vývoja). Štandardne sa stanovuje profil miRNA z kultivačného média embrya 5. deň vývoja. Kultivačné médium embrya môžeme nazvať „kultivačným odpadom“ alebo „odpadovým materiálom“.
Predložený vynález pojednáva o konkrétnych miRNA molekulách identifikovaných v plazme ženy a v kultivačnom médiu embrya. Konkrétne molekuly kanonických miRNA a iso-miRNA preukázali signifikantne rozdielne zastúpenie a distribúciu v plazme žien v skupine úspešného IVF procesu oproti skupine žien v konkrétny deň neúspešného IVF procesu. Distribúciu konkrétnych kanonických miRNA a iso-miRNA molekúl (miRNA profil) v plazme je možné využiť pre diagnostiku v deň IVF procesu, na zhodnotenie biologickej kompetencie - pripravenosti, resp. nepripravenesti matky na IVF proces. Sekréciu konkrétnych kanonických a iso-miRNA molekúl (miRNA profil) do kultivačného média embrya je možné využiť pre diagnostiku v deň IVF procesu a na zhodnotenie kompetencie, kvality embrya.
Presnosť predikcie IVF procesu bola overená pomocou štyroch nasledovných modelov:
Logistická regresia - model využívajúci logistickú funkciu (Sigmoid) a L2 regularizáciu pre binárnu klasifikáciu na základe predikčných miRNA molekúl
Random Forest - model využívajúci vlastnosti viacnásobne aplikovaných rozhodovacích stromov pre binárnu klasifikáciu na základe predikčných miRNA molekúl
Support Vector Machine (SVM) - komplexný model využívajúci nelineárnu metódu rbf spolu s ďalšími parametrami pre binárnu klasifikáciu predikčných miRNA molekúl
SK 50010-2020 A3
Stochastic gradient descent (SGD) - model využívajúci iteratívnu, náhodne inicializovanú metódu logistickej regresie spolu s SGD učením pre binárnu klasifikáciu na základe predikčných miRNA molekúl.
Podstatou vynálezu je spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti IVF (in vitro fertilizačného) procesu zahŕňajúci dva nezávislé kroky:
• test identifikácie a analýzy prognostických kanonických a iso-miRNA biomarkerov z plazmy periférnej krvi žien v deň IVF procesu (Success test), a • test prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov z kultivačného média embrya odobraného na 4. až 6. deň kultivácie embrya (CultMed test), kde úspešný Success test vykazuje cut off hodnoty vybraných miRNA biomarkerov pri počte čítaní 1, ktoré sú > 1, a cut off hodnom miRNA iso-hsa-let-7b-5p_TGAGGTAGTATGTTGTGTGG pri počte čítaní 5, ktorá je > 5, a úspešný CultMed test vykazuje cut off hodnom vybraných miRNA biomarkerov pri počte čítaní 1, ktorá je > 1, a kde tieto hodnoty oboch testov predikujú úspešný IVF procesu.
Jedna analýza neinvazívneho testovania úspešnosti IVF zahŕňa identifikáciu prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov - Success test so 100 % senzitivitou a 100 % špecificitou, s priemernou presnosťou 4 rôznych modelov 88 %, uskutočnenú v nasledujúcich krokoch:
- Odber vzorky plazmy z periférnej krvi ženy
- Izolácia všetkých miRNA, následná sekvenačná analýza a analýza dát vybraných 19 miRNA: iso-hsa-miR-126-3p zo SEQ ID NO: 1, iso-hsa-let-7i-5p zo SEQ ID NO: 2, iso-hsa-miR-342-3p zo SEQ ID NO: 3, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 4, iso-hsa-miR-132-3p zo SEQ ID NO: 5, iso-hsa-miR-23b-3p zo SEQ ID NO: 6, iso-hsa-miR-125a-5p zo SEQ ID NO: 7, iso-hsa-miR-584-5p zo SEQ ID NO: 8, iso-hsa-miR-127-3p zo SEQ ID NO: 9, iso-hsa-miR-101-3p zo SEQ ID NO: 10, iso-hsa-miR-151a-3p zo SEQ ID NO: 11, iso-hsa-miR-92a-3p zo SEQ ID NO: 12, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 13, iso-hsa-miR-589-5p zo SEQ ID NO: 14, iso-hsa-miR-652-3p zo SEQ ID NO: 15, iso-hsa-miR-1307-3p zo SEQ ID NO: 16, iso-hsa-miR-382-5p zo SEQ ID NO: 17, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 18, iso-hsa-let-7i-5p zo SEQ ID NO: 19.
- Určenie hodnoty počtu čítaní u 19 miRNA biomarkerov z predchádzajúceho kroku.
V druhej časti analýzy neinvazívneho testovania úspešnosti IVF je zahrnutý test analýzy identifikácie prognostických kanonických a iso-miRNA biomarkerov CultMed test so 100 % senzitivitou a 80 % špecificitou, s priemernou presnosťou 4 rôznych modelov 85 %, s nasledujúcimi krokmi:
- Odber vzorky kultivačného média embrya
- Izolácia všetkých miRNA, následne sekvenačná analýza a analýza dát vybraných 17 miRNA: iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 20, iso-hsa-miR-423-5p zo SEQ ID NO: 21, iso-hsa-miR-21-5p zo SEQ ID NO: 22, iso-hsa-miR-486-5p zo SEQ ID NO: 23, iso-hsa-miR-486-5p zo SEQ ID NO: 24, iso-hsa-miR-25-3p zo SEQ ID NO: 25, iso-hsa-miR-3613-5p zo SEQ ID NO: 26, iso-hsa-miR-142-3p zo SEQ ID NO: 27, iso-hsa-miR-664a-5p zo SEQ ID NO: 28, iso-hsa-miR-151a-3p zo SEQ ID NO: 29, iso-hsa-miR-92a-3p zo SEQ ID NO: 30, iso-hsa-let-7a-5p zo SEQ ID NO: 31, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 32, iso-hsa-miR-100-5p zo SEQ ID NO: 33, iso-hsa-miR-191-5p zo SEQ ID NO: 34, iso-hsa-let-7a-5p zo SEQ ID NO: 35, iso-hsa-let-7d-5p zo SEQ ID NO: 36.
- Určenie hodnoty počtu čítaní 17 miRNA biomarkerov z predchádzajúceho kroku.
Test analýzy identifikácie prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov Success test s 99 % presnosťou AUC ROC krivky modelu predikcie zahŕňa:
- Odber vzorky plazmy ženy
- Izoláciu všetkých miRNA, následne sekvenačnú analýzu a analýzu dát vybraných 10 miRNA: iso-hsa-miR-126-3p, iso-hsa-let-7i-5p, iso-hsa-miR-342-3p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-132-3p, iso-hsa-miR-23b-3p, iso-hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-584-5p, iso-hsa-miR-127-3p, iso-hsa-miR-151a-3p.
- Určenie hodnoty počtu čítaní 10 miRNA biomarkerov z predchádzajúceho kroku.
Test analýzy identifikácie prognostických kanonických a iso-miRNA biomarkerov CultMed test s 95 % presnosťou AUC ROC krivky modelu predikcie zahŕňa:
- Odber vzorky kultivačného média embrya
- Izoláciu všetkých miRNA, následne sekvenačnú analýzu a analýzu dát vybraných prvých 14 miRNA: iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-423-5p, iso-hsa-miR-21-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-25-3p, iso-hsa-miR-3613-5p, iso-hsa-miR-142-3p, iso-hsa-miR-664a-5p, iso-hsa-miR-151a-3p, iso-hsa-miR-92a-3p, iso-hsa-let-7a-5p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-100-5p.
- Určenie hodnoty počtu čítaní 14 miRNA biomarkerov z predchádzajúceho kroku.
Spôsob neinvazívneho testovania pomocou Success testu predikuje úspešnosť IVF procesu pri hraničnej hodnote 1, pričom vybrané miRNA molekuly s hodnotou > 1, predikujú úspešný IVF proces a s hodnotou < 1 predikujú neúspešný IVF proces.
Hraničná hodnota 5 rozdeľuje vybrané miRNA molekuly s hodnotou > 5, ako také, ktoré predikujú úspešný IVF proces a hodnoty < 5 predikujú neúspešný IVF proces.
SK 50010-2020 A3
Spôsob neinvazívneho testovania pomocou CultMed testu s hraničnou hodnotou 1, pričom miRNA molekuly s hodnotou > 1 predikujú vysokokompetentné (kvalitné) embryo a s hodnotou < 1 predikujú nízkokompetentné (nekvalitné) embryo.
V ďalšom kroku neinvazívneho testovania sú identifikované miRNA molekuly z plazmy ženy zoradené v závislosti od ich významu pre výsledok testu: iso-hsa-miR-126-3p, hsa-let-7i-5p, iso-hsa-miR-342-3p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-132-3p, iso-hsa-miR-23b-3p, iso-hsa-miR-125a-5p, iso-hsa-miR-584-5p, iso-hsa-miR-127-3p, iso-hsa-miR-101-3p, iso-hsa-miR-151a-3p, iso-hsa-miR-92a-3p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-589-5p, iso-hsa-miR-652-3p, iso-hsa-miR-1307-3p, iso-hsa-miR-382-5p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-let-7i-5p.
V nasledujúcom kroku neinvazívneho testovania sú identifikované miRNA molekuly z kultivačného média embrya zoradené v závislosti od ich významu pre výsledok testu: iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-423-5p, iso-hsa-miR-21-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-25-3p, iso-hsa-miR-3613-5p, iso-hsa-miR-142-3p, iso-hsa-miR-664a-5p, iso-hsa-miR-151a-3p, iso-hsa-miR-92a-3p, iso-hsa-let-7a-5p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-100-5p, iso-hsa-miR-191-5p, iso-hsa-let-7a-5p, iso-hsa-let-7d-5p.
Výhodou diagnostického testu je, že výsledok úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu je stanovený do 24 hod od odobratia biologického materiálu.
Hlavné predmety predkladaného vynálezu boli uskutočnené s využitím metódy masívneho-paralelného sekvenovania nekódujúcich malých RNA molekúl (miRNA) na sekvenačnej platforme Illumina. Na základe špecifickej analýzy dát (Explanatory Data Analysis) a metód strojového učenia (Machine Leaming) s rôznymi modelmi bol vyselektovaný počet predikčných biomarkerov pre jednotlivé typy biologického materiálu.
Ďalšou nosnou časťou vynálezu je zoznam konkrétnych kanonických miRNA a iso-miRNA molekúl identifikovaných z plazmy žien, a kanonických a iso-miRNA molekúl identifikovaných z kultivačného média embrya.
miRNA molekuly delegované Success testom sú uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1 Biomarkery miRNA predikcie úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu
miRNA biomarkery predikcie úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu Coef (koeficient dôležitosti, významnosti) P (p-value, HO: rozloženie dát vzhľadom na výsledok IVF je rovnaké)
iso-hsa-miR-126- 3p_CGTACCGTGAGAAATAATGCGT 11.520844189682128 0.0016884300209033492
iso-hsa-let-7i- 5p_TGTGGTAGTAGTTTGTGCTGTA 10.851674641148328 0.002221447605170916
iso-hsa-miR-342- 3p_TCTCACACAGAAATCGGACCCGTCT 10.765113798008537 0.0023025382184651104
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTAGGTTGTGTGTTA 10.547046485537292 0.002521143336464067
iso-hsa-miR-132- 3p_TAACAGCCTACAGCCATGGTCGT 9.910931174089068 0.0032951920974540376
iso-hsa-miR-23b- 3p_GCACATTGCCAGGGATTACCACT 9.373481781376519 0.0041475542794915604
iso-hsa-miR- 125a- 5p_TCCCTGAGACCTTTTAACCTGT 9.18292128014561 0.004503999211390216
iso-hsa-miR-584- 5p_TATGGTTTGCCTGGGACTG 9.094736842105265 0.004679908836274879
iso-hsa-miR-127- 3p_TCGGATCAGTCTGAGCTTGGCTTTT 9.094736842105265 0.004679908836274879
iso-hsa-miR-101- 3p_TACACTACTGTGATAACTGA 8.845594649607445 0.005217803371020453
iso-hsa-miR- 151a- 3p_TACTAGACTAAAGCTCCTTGAGGT 8.845594649607445 0.005217803371020453
iso-hsa-miR-92a- 3p_GATTGCACTTGTCCCGGCCTGAA 8.845594649607445 0.005217803371020453
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTATGTTGTGTGG 8.816195372750641 0.005285512415951764
SK 50010-2020 A3
iso-hsa-miR-589- 5p_TGAGAACCACGTCCGCTCTGAGC 8.696842105263158 0.0055702068262932485
iso-hsa-miR-652- 3p_GATGGCGCCACTAGGGTTGTGA 8.418140050047175 0.0063009456943287695
iso-hsa-miR-1307- 3p_ACTCGGCGTAGCGTCGGTCGTGT 8.418140050047175 0.0063009456943287695
iso-hsa-miR-382- 5p_GAAGTTGTTCGCGGTGGATTC 8.289473684210527 0.006672365487531239
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTAAGTTGTGTGGTAT 8.289473684210527 0.006672365487531239
iso-hsa-let-7i- 5p_TGAGTTAGTAGTTTGTGCTGTTTT 8.289473684210527 0.006672365487531239
Zoradenie miRNA uvedené v tabuľke 1 je podľa koeficientu ich významnosti, ktoiý určuje, nakoľko je dôležité sa danou molekulou pri analýze zaoberať (akú významnú úlohu má na predikcii výsledku).
Tabuľka 2 Treshold AUC ROC (Receiver operating characteristic of Logistic Regression), senzitivita a špecificita miRNA biomarkerov predikujúcich úspešnosť/neúspešnosť IVF procesu v plazme žien
Treshold, Cut off hodnoty pre miRNA biomarkery predikcie úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu Threshold Senzitivita % Špecificita % AUC CoffNC
iso-hsa-miR-126- 3p_CGTACCGTGAGAAATAATGCGT 0,7 81 35 0.75 1
iso-hsa-let-7i- 5p_TGTGGTAGTAGTTTGTGCTGTA 0.608 1 64 0.68 1
iso-hsa-miR-342- 3 p_TCTCACACAGAAATCGGACCCGTCT 0.768 52 58 0.74 1
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTAGGTTGTGTGTTA 0.651 91 47 0.65 1
iso-hsa-miR-132- 3p_TAACAGCCTACAGCCATGGTCGT 0.81 38 0 0.69 1
iso-hsa-miR-23b- 3p_GCACATTGCCAGGGATTACCACT 0.61 100 65 0.68 1
iso-hsa-miR-125 a- 5p_TCCCTGAGACCTTTTAACCTGT 0.75 48 58 0,71 1
iso-hsa-miR-584- 5p_TATGGTTTGCCTGGGACTG 0.62 100 65 0.68 1
iso-hsa-miR-127- 3 p_TCGGATCAGTCTGAGCTTGGCTTTT 0.61 100 65 0.68 1
iso-hsa-miR-101- 3p_TACACTACTGTGATAACTGA 0.621 95 59 0.68 1
iso-hsa-miR- 151a- 3p_TACTAGACTAAAGCTCCTTGAGGT 0.62 95 59 0.68 1
iso-hsa-miR-92a- 3p_GATTGCACTTGTCCCGGCCTGAA 0.62 95 59 0.69 1
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTATGTTGTGTGG 0.67 67 12 0.78 5
iso-hsa-miR-589- 5p_TGAGAACCACGTCCGCTCTGAGC 0.80 38 0 0.69 1
iso-hsa-miR-652- 3p_GATGGCGCCACTAGGGTTGTGA 0.62 95 59 0.68 1
iso-hsa-miR-1307- 3p_ACTCGGCGTAGCGTCGGTCGTGT 0.63 95 58 0.68 1
SK 50010-2020 A3
iso-hsa-miR-382- 5p_GAAGTTGTTCGCGGTGGATTC 0.59 100 71 0.65 1
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTAAGTTGTGTGGTAT 0.60 100 71 0.72 1
iso-hsa-let-7i- 5p_TGAGTTAGTAGTTTGTGCTGTTTT 0.60 100 70 0.65 1
Cut off hodnota normalizovaných čítaní (CoffNC), CoffNC ABS (TPR-(l-FPR), Hodnota > CoffNC =IVF úspešné; Hodnota < CoffNC =IVF neúspešné
Pri každej z vybraných miRNA molekúl je potrebný minimálny počet sekvenačných čítaní uvedených v poslednom stĺpci tabuľky 2 (cut off hodnota normalizovaných čítaní = 1 alebo 5). Ak pri molekule miRNA je určená hraničná hodnota 1, tak všetky hodnoty > 1 predikujú úspešný IVF proces a cut off hodnoty miRNA molekúl s hodnotou < 1 predikujú neúspešný IVF proces. Molekula iso-hsa-let-7b-5p má určenú cut off hodnotu normalizovaných čítaní 5, čo znamená, že akákoľvek hodnota > 5 predikuje úspešný IVF proces a < 5 neúspešný IVF proces.
Na 100 % predikciu úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu je potrebná analýza každej z vybraných 19 biomarkerových miRNA molekúl (Tab. 2). Na analýzu úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu je možné použiť aj menší počet miRNA molekúl, avšak úspešnosť predikcie výsledku bude nižšia.
Success test je možné využiť ako bezpečný, neinvazívny diagnostický test úspešnosti IVF procesu. Z testuje možné vytvoriť komerčný produkt (službu) určený pre verejnosť.
Uvedené kanonické a iso-miRNA molekuly s uvedenými sekvenciami je možne využiť aj v inej forme diagnostických testov, ako konkrétne próby pre určenie úspešnosti IVF procesu.
V tabuľke 3 je uvedený zoznam konkrétnych kanonických a iso-miRNA molekúl delegovaných z kultivačného média embryí CultMed testom. Molekuly identifikované v kultivačnom médiu embrya sú zoradené podľa dôležitosti, resp. významnosti na základe ich koeficientu významnosti, ktoiý určuje, nakoľko je významné sa danou molekulou pri analýze zaoberať (akú významnú úlohu má na predikcii výsledku).
Tabuľka 3
Predikčné biomarkery selekcie kompetentného embrya/nekompetentného embrya v IVF procese
Predikčné biomarkery selekcie Kompetentného embrya/nekompetentného embrya v IVF procese coef (koeficient dôležitosti, významnosti) P (p-value, HO: rozloženie dát vzhľadom na výsledok IVF je rovnaké)
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTGGTAGGTTGTGTGGT 9.621526827042178 0.003391088823611076
iso-hsa-miR-423- 5p_TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTTA 9.529546351084809 0.003532537765767483
iso-hsa-miR-21- 5p_TAGCTTACCAGACTGATGTTGAC 9.37945619335347 0.003776937060541304
iso-hsa-miR-486- 5p_TCCTGTACTGAGCTGCCCAGAGA 8.899093803575798 0.004687231604519787
iso-hsa-miR-486- 5p_TCCTGTACTGAGCTGCCTCGAG 7.886037735849056 0.007462265245605795
iso-hsa-miR-25- 3p_CATTGCAATTGTCTCGGTCTGA 7.166666666666666 0.010471649328310581
iso-hsa-miR-3613- 5p_TGTTGTACTTTTTTTTTTGTT 6.723975915506861 0.01294940775142319
iso-hsa-miR-142- 3p_TGTAGTGTTTCCTACCTTATGGA 6.254545454545453 0.0162767044425456
iso-hsa-miR-664a- 5p_ACTGGCTAGGGAAAATGATTGGA 6.254545454545453 0.0162767044425456
SK 50010-2020 A3
iso-hsa-miR- 151a- 3p_CAAGACTGAAGCTCCTTGAGG 5.757024793388432 0.020828127625493652
iso-hsa-miR-92a- 3p_TATCGCACTTGTCCCGGCCTGT 5.752285490865144 0.020877563509075946
iso-hsa-let-7a- 5p_TGATGTAGTAGGTTGTATAG 5.676567656765675 0.021684740586716857
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTTA 5.618093452752898 0.022331072190788642
iso-hsa-miR-100- 5p_AACCCGTAGATCCGAACTTGT 5.448383233532933 0.024327313909886367
iso-hsa-miR-191- 5p_CAATGGAATCCCAAAAGCAGCTG 5.3960784313725485 0.024980707010107902
iso-hsa-let-7a- 5p_TGAGTTAGTAGGTTGTATAG 5.3960784313725485 0.024980707010107902
iso-hsa-let-7d 5p_AGAGGTAGTAGGTTGCGTAGTT 5.3960784313725485 0.024980707010107902
Na základe metód strojového učenia bolo vyselektovaných 17 predikčných biomarkerov, ktoré boli klasifikované ako významné predikčné biomarkery na určenie kompetencie embrya v IVF procese.
Tabuľka 4 Treshold AUC ROC, senzitivita a špecificita miRNA biomarkerov predikujúcich vysokokvalitné embryo a nízkokvalitné embryo
Treshold, Cut off hodnoty miRNA biomarkery predikcie úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu Threshold Senzitivita % Špecificita % AUC CoffNC
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTGGTAGGTTGTGTGGT 0.5 92 47 70 1
iso-hsa-miR-423- 5p_TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTTA 0.5 92 43 68 1
iso-hsa-miR-21- 5p_TAGCTTACCAGACTGATGTTGAC 0.4 96 38 67 1
iso-hsa-miR-486- 5p_TCCTGTACTGAGCTGCCCAGAGA 0.4 96 38 67 1
iso-hsa-miR-486- 5p_TCCTGTACTGAGCTGCCTCGAG 0.4 96 38 67 1
iso-hsa-miR-25- 3p_CATTGCAATTGTCTCGGTCTGA 0.3 100 24 62 1
iso-hsa-miR-3613- 5p_TGTTGTACTTTTTTTTTTGTT 0,6 96 29 63 1
iso-hsa-miR-142- 3p_TGTAGTGTTTCCTACCTTATGGA 0.3 100 24 62 1
iso-hsa-miR-664a- 5p_ACTGGCTAGGGAAAATGATTGGA 0.3 100 24 62 1
iso-hsa-miR- 151a- 3p_CAAGACTGAAGCTCCTTGAGG 0.5 50 81 68 1
SK 50010-2020 A3
iso-hsa-miR-92a- 3p_TATCGCACTTGTCCCGGCCTGT 0,5 96 29 63 1
iso-hsa-let-7a- 5p_TGATGTAGTAGGTTGTATAG 0.3 100 24 62 1
iso-hsa-let-7b- 5p_TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTTA 0.6 33 95 65 1
iso-hsa-miR-100- 5p_AACCCGTAGATCCGAACTTGT 0.6 30 95 63 1
iso-hsa-miR-191- 5p_CAATGGAATCCCAAAAGCAGCTG 0.3 100 19 60 1
iso-hsa-let-7a- 5p_TGAGTTAGTAGGTTGTATAG 0.3 100 19 60 1
iso-hsa-let-7d 5p_AGAGGTAGTAGGTTGCGTAGTT 0.3 100 19 60 1
Cut off normalizovaných čítaní (CoffNC); CoffNC ABS (TPR-(l-FPR); Hodnota > CoffNC = vysokokvalitné embryo; Hodnota < CoffNC = nízkokvalitné embryo
V poslednom stĺpci tabuľky 4 je určená hodnota cut off normalizovaných čítaní. Ak pri molekule miRNA je určená hraničná hodnota 1, tak všetky hodnoty > 1 predikujú kvalitné vysokokompetentné embryo a cut off hodnoty miRNA molekúl s hodnotou < 1 predikujú nekvalitné nízkokompetentné embryo. Na základe týchto hodnôt sa dá selektovať vysokokvalitné embryo vhodné na transfer v IVF procese.
Na analýzu predikcie vysokokompetentného/nízkokompetentného embrya so 100 % senzitivitou a 80 % špecificitou je potrebná analýza všetkých vybraných 17 miRNA biomarkerov. Na analýzu vysokokompetentného/nízkokompetentného embrya je možné použiť aj menší počet miRNA molekúl, avšak úspešnosť predikcie výsledku bude nižšia.
CultMed test sa dá využiť ako bezpečný, neinvazívny diagnostický test selekcie vysokokompetentného embrya. Z testu je možné vytvoriť diagnostický produkt (službu), avšak je možné ho využiť aj na selekciu embrya najvhodnejšieho na IVF transfer (komplementárny test k Success testu).
Uvedené kanonické a iso-miRNA molekuly s uvedenými sekvenciami je možne využiť aj v inej forme diagnostických testov, ako konkrétne próby pre selekciu embrya najvhodnejšieho na IVF transfer.
Testy sú nezávislé a je vhodné ich kombinovať, čo zvýši úspešnosť IVF procesu vďaka optimalizácii predikcie termínu IVF u pacientky a zefektívneniu výberu embrya. Dané diagnostické testy je možné ponúknuť neplodným párom formou služby - diagnostika kompetencie matky (výber najvhodnejšieho dňa IVF transferu), selekcia embrya.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 - Výsledná ROC krivka analýzy 19 miRNA biomarkerov z plazmy ženy
Obr. 2 - Výsledná ROC krivka analýzy 10 miRNA biomarkerov z plazmy ženy
Obr. 3 - Výsledná ROC krivka analýzy 17 miRNA biomarkerov z kultivačného média embrya
Obr. 4 - Výsledná ROC krivka analýzy 14 miRNA biomarkerov z kultivačného média embrya
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
V príklade 1 je zaznamenaná uskutočnená detekcia konkrétnych kanonických miRNA a iso-miRNA molekúl izolovaných z plazmy periférnej krvi 37-ich žien vo veku do 37 rokov metódou NGS sekvenovania. V deň transferu embrya bola ženám odobraná periférna krv, ktorá slúžila na analýzu nekódujúcich RNA molekúl z plazmy. Analyzovaných bolo 19 vybraných kanonických miRNA a iso-miRNA molekúl (Tab. 2).
Vyhodnotenie:
V testovaných plazmách dosahovali cut off hodnoty miRNA biomarkerov úroveň > 1.
V prípade biomarkeru iso-hsa-let-7b-5p bola cut off hodnota > 5.
Zvyšné cut off hodnoty dosahovali hodnoty < 1.
SK 50010-2020 A3
Úspešný IVF proces bol zaznamenaný u 20 žien a neúspešný IVF proces bol zaznamenaný u 17-tich žien.
ROC analýza (Receiver Operating Characteristic curve) ukázala, že kombinácia 19 kanonických miRNA molekúl izolovaných z plazmy žien v deň transferu embrya (viď. Tab. 2) predikuje úspešnosť/neúspešnosť IVF procesu so 100 % senzitivitou a 100 % špecificitou (Area Under the ROC curve, AUC = 1,0, [1-1]; pO.001), ako je zobrazené na obrázku 1.
Príklad 2
V príklade 2 je zaznamenaná uskutočnená detekcia konkrétnych kanonických miRNA a iso-miRNA molekúl delegovaných v plazme 37-ich žien vo veku do 37 rokov NGS sekvenovaním. V deň transferu embrya bola ženám odobraná periférna krv, ktorá slúžila na analýzu nekódujúcich RNA molekúl z plazmy. Na analýzu bol použitý menší počet kanonických miRNA. Vybraných bolo 10 kanonických miRNA a iso-miRNA, ktoré sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
miRNA biomarkery predikcie úspešnosti/neúspešnosti IVF procesu iso-hsa-miR-1263p CGTACCGTGAGAAATAATGCGT iso hsa-let-7i-5p_TGTGGTAGTAGTTTGTGCTGTA iso-hsa-miR-3423p_TCTCACACAGAAATCGGACCCGTCT_______ iso-hsa-let-7b5p_TGAGGTAGTAGGTTGTGTGTTA__________ iso-hsa-miR-1323p_TAACAGCCTACAGCCATGGTCGT_________ iso-hsa-miR-23b3p_GCACATTGCCAGGGATTACCACT_________ iso-hsa-miR-125 a5p TCCCTGAGACCTTTTAACCTGT iso-hsa-miR-584-5p_TATGGTTTGCCTGGGACTG iso-hsa-miR-1273p_TCGGATCAGTCTGAGCTTGGCTTTT_______ iso-hsa-miR- 151a3p TACTAGACTAAAGCTCCTTGAGGT
Vyhodnotenie:
Pri zmene počtu významných biomarkerov bola použitá metóda permutácie testovacích a overovacích vzoriek v počte 7 opakovaní v pomere 20/80 percent. Analýza pomocou ROC uvedenej metódy ukázala, že kombinácia kanonických 10 miRNA molekúl analyzovaných z plazmy žien v deň transferu embrya (Obr. 2) predikuje úspešnosť/neúspešnosť IVF procesu. Priemerná hodnota presnosti predikcie meraná pomocou výpočtu AUC je na úrovni 0,97 (resp. 97 %), pri rozptyle +/- 0,06 (Obr. 2). Pri analýze 10 kanonických miRNA (z plazmy) je presnosť predikcie výsledku testu na úrovni 97 %.
Príklad 3
V príklade 3 je zaznamenaná detekcia konkrétnych kanonických a iso-hsa-miRNA molekúl izolovaných zo 45 kultivačných médií embryí. Štandardne bolo kultivačné médium odoberané v piaty deň kultivácie embrya. Embryo vylučovalo do kultivačnej tekutiny nekódujúce RNA molekuly, ktoré slúžia k diferenciálnej selekcii vysokokvalitného embrya. V kultivačnom médiu embrya bolo z množstva delegovaných molekúl vybraných 17 iso-hsa-miRNA molekúl, ktoré boli sekvenované metódou NGS (Tab. 4). Pomocou metód strojového učenia bol určený počet miRNA biomarkerov predikujúcich vysokokvalitné/nízkokvalitné embryo.
Vyhodnotenie:
Cut off hodnoty kultivačných médií vysokokompetentných embryí dosahovali pre všetky testované miRNA biomarkery hodnoty > 1.
Cut off hodnoty kultivačných médií nízkokompetentných embryí dosahovali pre všetky testované miRNA biomarkery hodnoty < 1.
Na základe výsledkov boli kultivačné médiá embryí rozdelené do dvoch skupín: 25 kultivačných médií vykazovalo vysokokompetentné - kvalitné embryo, 20 kultivačných médií vykazovalo nízkokompetentné nekvalitné embryo.
SK 50010-2020 A3
ROC analýza ukázala, že 17 kanonických a iso-miRNA molekúl (tabuľka 4) odlíši, predikuje, diferencuje vysokokompetentné embryo od nízkokompetentného (neúspešného) embrya v IVF procese so 100 % senzitivitou a 80 % špecificitou (AUC = 0,9 [0.8-1.0]; pO.001) ROC zobrazuje obrázok 3.
Príklad 4
Postupovalo sa rovnako ako v príklade 3, avšak na analýzu vysokokompetentného /nízkokompetentného embrya bolo vybraných 14 kanonických a iso-miRNA izolovaných z kultivačných médií embryí, ktoré sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
Predikčné biomarkery selekcie kompetentného/nekompetentného embrya v IVF procese iso-hsa-let-7b-5p_TGAGGTGGTAGGTTGTGTGGT iso-hsa-miR-4235p TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTTA iso-hsa-miR-21 -5p_TAGCTTACC AGACTGATGTTGAC iso-hsa-miR-4865p TCCTGTACTGAGCTGCCCAGAGA iso-hsa-miR-486-5p_TCCTGTACTGAGCTGCCTCGAG iso-hsa-miR-25-3p_CATTGCAATTGTCTCGGTCTGA iso-hsa-miR-3613-5p_TGTTGTACTTTTTTTTTTGTT iso-hsa-miR-142-3p_TGTAGTGTTTCCTACCTTATGGA iso-hsa-miR-664a5p_ACTGGCTAGGGAAAATGATTGGA iso-hsa-miR-151 a-3p_C AAGACTGAAGCTCCTTGAGG iso-hsa-miR-92a-3p_TATCGCACTTGTCCCGGCCTGT iso-hsa-let-7a-5p_TGATGTAGTAGGTTGTATAG iso-hsa-let-7b-5p_TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTTTA iso-hsa-miR-100-5p_AACCCGTAGATCCGAACTTGT
Vyhodnotenie:
Rovnako ako v príklade 2 bola použitá metóda permutácie testovacích a overovacích vzoriek v počte 7 opakovaní v pomere 20/80 percent. Analýza pomocou ROC uvedenej metódy ukázala, že kanonické a iso-miRNA molekuly zobrazené na obrázku 4 odlišujú, predikujú vysokokompetentné embryo od nízkokompe15 tentného (neúspešného) embrya v IVF procese pri nižšom počte predikčných miRNA (14) biomarkerov. Priemerná hodnota presnosti predikcie meraná pomocou výpočtu AUC je na úrovni 0,97 (resp. 97 %), pri rozptyle +/- 0,06 (Obr. 4.). Analýzou 14 kanonických a iso-miRNA z kultivačného média embrya je presnosť predikcie výsledku testu na úrovni 97 %.
SK 50010-2020 A3
Zoznam literatúry de Mouzon, Hazout, Cohen-Bacrie, Belloc, Cohen-Bacrie, Blood type and ovarian reserve, Human Repoduction, 27, (5), 2012, 1544-1545.
Kosteria, Anagnostopoulos, Kanaka-Gantenbein, Chrousos, The Use of Proteomics in Assisted Reproduction, In Vivo, 31(3), 2017, 267-283.
Asirvatham, Magner, miRNA regulation of cytokine genes, Cytokine, 45, (2), 2009, 58-69.
McCallie, Schoolcraft, Katz-Jaffe MG, Aberration of blastocyst microRNA expression is associated with inman infertility, Fertil Steril, 93(7), 2010, 2374-82.
Mouillet, Ouyang, Coyne, MicroRNAs in placental health and disease, American Journal of Obstetrics and Gynecology 213, 2015, 163-S172.
Catalanotto, Cogoni, Zardo, MicroRNA in control of gene expression: an overview of nuclear functions. nternational Journal of Molecular Sciences, 17, 2016.
Rosenbluth, Shelton, Sparks, Devor, Christenson, Van Voorhis, MicroRNA expression in the human blasocyst, Fertil Steril., 1, 99(3), 2013, 855-861.
Lee, Finniss, Cazacu, Xiang, Brodie, Mesenchymal stem cells deliver exogenous miRNAs to neural cells and induce their differentiation and glutamate transportér expression, Stem Cells Dev., 1,(23), 2014 Dec 2851-61.
Chang, Wakeland, Trophoblast lineage specification, differentiation and their regulation by oxygen tension. Journal of Endocrinology 236, 2018, 43-R56.
Táng, Kaneda, O'Carroll, Hajkova, Barton, Sun, Lee, Tarakhovsky, Lao, Surani, Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development, Genes Dev., 21(6), 2007, 644-8.
Zhang, Dunk, Croy To serve and to protect: the role of decidual innate immune cells on human pregnancy. Celí and Tissue Research, 363, 2016 249-265.
Bonilla-Musoles, Raga, Osborne, Castillo, Bonilla, Endometrial receptivity: evaluation with ultrasound, Ultrasound Q., 29(1), 2013, 3-20.

Claims (9)

  1. SK 50010-2020 A3
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa dva nezávislé kroky: test identifikácie a analýzy prognostických kanonických a iso-miRNA biomarkerov z plazmy periférnej krvi žien v deň in vitro fertilizačného procesu - Success test, a test prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov z kultivačného média embrya odobraného na 4. až 6. deň kultivácie embrya - CultMed test, kde úspešný Success test vykazuje cut off hodnoty vybraných miRNA biomarkerov pri počte čítaní 1, ktoré sú > 1, a cut off hodnotu miRNA iso-hsa-let-7b-5p_TGAGGTAGTATGTTGTGTGG pri počte čítaní 5, ktorá je > 5, a úspešný CultMed test vykazuje cut off hodnotu vybraných miRNA biomarkerov pri počte čítaní 1, ktorá je > 1, a kde tieto hodnoty oboch testov predikujú úspešný in vitro fertilizačný proces.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že test analýzy identifikácie prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov v Success teste má 100 % senzitivitu a 100 % špecificitu, a zahŕňa: a) Odber vzorky plazmy z periférnej krvi ženy b) Izoláciu všetkých miRNA, následne sekvenačnú analýzu a analýzu dát vybraných 19 miRNA: iso-hsa-miR-126-3p zo SEQ ID NO: 1, iso-hsa-let-7i-5p zo SEQ ID NO: 2, iso-hsa-miR-342-3p zo SEQ ID NO: 3, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 4, iso-hsa-miR-132-3p zo SEQ ID NO: 5, iso-hsa-miR-23b-3p zo SEQ ID NO: 6, iso-hsa-miR-125a-5p zo SEQ ID NO: 7, iso-hsa-miR-584-5p zo SEQ ID NO: 8, iso-hsa-miR-127-3p zo SEQ ID NO: 9, iso-hsa-miR-101-3p zo SEQ ID NO: 10, iso-hsa-miR-151a-3p zo SEQ ID NO: 11, iso-hsa-miR-92a-3p zo SEQ ID NO: 12, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 13, iso-hsa-miR-589-5p zo SEQ ID NO: 14, iso-hsa-miR-652-3p zo SEQ ID NO: 15, iso-hsa-miR-1307-3p zo SEQ ID NO: 16, iso-hsa-miR-382-5p zo SEQ ID NO: 17, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 18, iso-hsa-let-7i-5p zo SEQ ID NO: 19, c) Určenie hodnoty počtu čítaní 19 miRNA biomarkerov z kroku b).
  3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že test analýzy identifikácie prognostických kanonických a iso-miRNA biomarkerov v CultMed teste so 100 % senzitivitou a 80 % špecificitou zahŕňa: a) Odber vzorky kultivačného média embrya b) Izoláciu všetkých miRNA, následne sekvenačnú analýzu a analýzu dát vybraných 17 miRNA: iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 20, iso-hsa-miR-423-5p zo SEQ ID NO: 21, iso-hsa-miR-21-5p zo SEQ ID NO: 22, iso-hsa-miR-486-5p zo SEQ ID NO: 23, iso-hsa-miR-486-5p zo SEQ ID NO: 24, iso-hsa-miR-25-3p zo SEQ ID NO: 25, iso-hsa-miR-3613-5p zo SEQ ID NO: 26, iso-hsa-miR-142-3p zo SEQ ID NO: 27, iso-hsa-miR-664a-5p zo SEQ ID NO: 28, iso-hsa-miR-151a-3p zo SEQ ID NO: 29, iso-hsa-miR-92a-3p zo SEQ ID NO: 30, iso-hsa-let-7a-5p zo SEQ ID NO: 31, iso-hsa-let-7b-5p zo SEQ ID NO: 32, iso-hsa-miR-100-5p zo SEQ ID NO: 33, iso-hsa-miR-191-5p zo SEQ ID NO: 34, iso-hsa-let-7a-5p zo SEQ ID NO: 35, iso-hsa-let-7d-5p zo SEQ ID NO: 36, c) Určenie hodnoty počtu čítaní 17 miRNA biomarkerov z kroku b).
  4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že test analýzy identifikácie prognostických kanonických miRNA a iso-miRNA biomarkerov v Success teste s 99 % presnosťou AUC ROC krivky modelu predikcie zahŕňa: a) Odber vzorky plazmy z periférnej krvi ženy, b) Izoláciu všetkých miRNA, následne sekvenačnú analýzu a analýzu dát vybraných 10 miRNA: iso-hsa-miR-126-3p, iso-hsa-let-7i-5p, iso-hsa-miR-342-3p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-132-3p, iso-hsa-miR-23b-3p, iso-hsa-miR-125a-5p, iso-hsa-miR-584-5p, iso-hsa-miR-127-3p, iso-hsa-miR-151a-3p, c) Určenie hodnoty počtu čítaní 10 miRNA biomarkerov z kroku b).
  5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že test analýzy identifikácie prognostických kanonických a iso-miRNA biomarkerov v CultMed teste s 95 % presnosťou AUC ROC krivky modelu predikcie zahŕňa: a) Odber vzorky kultivačného média embrya, b) Izoláciu všetkých miRNA, následne sekvenačnú analýzu a analýzu dát vybraných prvých 14 miRNA: iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-423-5p, iso-hsa-miR-21-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-25-3p, iso-hsa-miR-3613-5p, iso-hsa-miR-142-3p, iso-hsa-miR-664a-5p, iso-hsa-miR-151a-3p, iso-hsa-miR-92a-3p, iso-hsa-let-7a-5p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-100-5p, c) Určenie hodnoty počtu čítaní 14 miRNA biomarkerov z kroku b).
  6. 6. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa tým, že cut off (hraničná) hodnota 1 Success testu rozdeľuje miRNA molekuly s hodnotou > 1, ktoré predikujú úspešný IVF proces a s hodnotou < 1, ktoré predikujú neúspešný IVF proces, a cut off (hraničná) hodnota 5, ktorá rozdeľuje miRNA molekuly s hodnotou > 5, ktoré predikujú úspešný IVF proces a hodnoty < 5 predikujúce neúspešný IVF proces.
  7. 7. Spôsob podľa nároku 1, v y z n a č u j ú c i sa tým, že cut off (hraničná) hodnota 1 CultMed testu určuje miRNA molekuly s hodnotou > 1, ktoré predikujú vysokokompetentné (kvalitné) embryo a hodnoty < 1 predikujú nízkokompetentné (nekvalitné) embryo.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že identifikované miRNA molekuly izolované z plazmy ženy sú zoradené podľa závislosti ich významu pre výsledok testu: iso-hsa-miR-126-3p, iso-hsa-let-7i-5p, iso-hsa-miR-342-3p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-132-3p, iso-hsa-miR-23b-3p, iso-hsa-miR-125a-5p, iso-hsa-miR-584-5p, iso-hsa-miR-127-3p, iso-hsa-miR-101-3p, iso-hsa-miR-151a-3p, iso
    SK 50010-2020 A3
    -hsa-miR-92a-3p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-589-5p, iso-hsa-miR-652-3p, iso-hsa-miR-1307-3p, iso-hsa-miR-382-5p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-let-7i-5p.
  9. 9. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že identifikované miRNA molekuly z kultivačného média embrya sú zoradené v závislosti od ich významu pre výsledok testu: iso-hsa-let-7b-5p, 5 iso-hsa-miR-423-5p, iso-hsa-miR-21-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-486-5p, iso-hsa-miR-25-3p, iso-hsa-miR-3613-5p, iso-hsa-miR-142-3p, iso-hsa-miR-664a-5p, iso-hsa-miR-151a-3p, iso-hsa-miR-92a-3p, iso-hsa-let-7a-5p, iso-hsa-let-7b-5p, iso-hsa-miR-100-5p, iso-hsa-miR-191-5p, iso-hsa-let-7a-5p, iso-hsa-let-7d-5p.
    4 výkresy
SK500102020A 2020-03-02 2020-03-02 Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu SK500102020A3 (sk)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK500102020A SK500102020A3 (sk) 2020-03-02 2020-03-02 Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu
AU2021231356A AU2021231356A1 (en) 2020-03-02 2021-03-01 Non-invasive successfulness test of in vitro fertilization process
CA3174570A CA3174570A1 (en) 2020-03-02 2021-03-01 Non-invasive successfulness test of in vitro fertilization process
EP21723451.7A EP4114977A1 (en) 2020-03-02 2021-03-01 Non-invasive successfulness test of in vitro fertilization process
US17/905,624 US20230257809A1 (en) 2020-03-02 2021-03-01 Non-Invasive Successfulness Test of In Vitro Fertilization Process
IL296085A IL296085A (en) 2020-03-02 2021-03-01 Non-invasive testing of the success of the IVF process
PCT/SK2021/050004 WO2021177904A1 (en) 2020-03-02 2021-03-01 Non-invasive successfulness test of in vitro fertilization process
MX2022010721A MX2022010721A (es) 2020-03-02 2021-03-01 Prueba de exito no invasiva del proceso de fecundacion in vitro.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SK500102020A SK500102020A3 (sk) 2020-03-02 2020-03-02 Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK500102020A3 true SK500102020A3 (sk) 2021-09-16

Family

ID=75787199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK500102020A SK500102020A3 (sk) 2020-03-02 2020-03-02 Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230257809A1 (sk)
EP (1) EP4114977A1 (sk)
AU (1) AU2021231356A1 (sk)
CA (1) CA3174570A1 (sk)
IL (1) IL296085A (sk)
MX (1) MX2022010721A (sk)
SK (1) SK500102020A3 (sk)
WO (1) WO2021177904A1 (sk)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013056002A1 (en) * 2011-10-12 2013-04-18 University Of Iowa Research Foundation Use of microrna for assessing embryos grown in vitro and improving culture media
WO2014062442A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 University Of Iowa Research Foundation Use of microrna for assessing fertility in a female patient
CN109504784B (zh) * 2018-12-20 2022-03-15 华中科技大学同济医学院生殖医学中心(武汉同济生殖医学专科医院) 用于预测人辅助生殖技术中早期胚胎质量的miRNA分子标志及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022010721A (es) 2022-10-21
AU2021231356A1 (en) 2022-11-03
CA3174570A1 (en) 2021-09-10
WO2021177904A1 (en) 2021-09-10
US20230257809A1 (en) 2023-08-17
WO2021177904A4 (en) 2021-10-28
IL296085A (en) 2022-11-01
EP4114977A1 (en) 2023-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Molecular landscapes of human hippocampal immature neurons across lifespan
Batiuk et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution
Milewski et al. Time-lapse imaging of cleavage divisions in embryo quality assessment
Short et al. The contribution of branching morphogenesis to kidney development and disease
Moreno et al. Follicular fluid and mural granulosa cells microRNA profiles vary in in vitro fertilization patients depending on their age and oocyte maturation stage
Varberg et al. ASCL2 reciprocally controls key trophoblast lineage decisions during hemochorial placenta development
Sharkey et al. The science of implantation emerges blinking into the light
CN110042156A (zh) 一种判断子宫内膜容受性的方法及其应用
CN105224827A (zh) 用于评价临床不育的方法和系统
Garrido et al. Assessment of sperm using mRNA microarray technology
US20210404001A1 (en) Biomarker for diagnosing or predicting reactivity of ovary to fsh and use thereof
McNeill et al. Mental health dished up—the use of iPSC models in neuropsychiatric research
Humby et al. A pharmacological mouse model suggests a novel risk pathway for postpartum psychosis
JP5455219B2 (ja) 軟骨細胞表現型の安定性の確認および軟骨生成に影響を及ぼす因子のスクリーニングにおける使用のためのマーカー遺伝子
Laisk-Podar et al. Genetic variants associated with female reproductive ageing–potential markers for assessing ovarian function and ovarian stimulation outcome
KR102333797B1 (ko) 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매의 선별 진단을 위한 신규 마이크로 rna 바이오마커
KR102341233B1 (ko) 경도인지장애 또는 알츠하이머성 치매 조기 진단을 위한 신규 마이크로 rna 바이오마커
Ortiz et al. Application of machine learning to predict aneuploidy and mosaicism in embryos from in vitro fertilization cycles
SK500102020A3 (sk) Spôsob neinvazívneho testovania úspešnosti in vitro fertilizačného procesu
KR102321753B1 (ko) 알츠하이머성 치매 조기 진단용 신규 마이크로 rna 바이오마커
Moore et al. Riding brain “waves” to identify human memory genes
Varberg et al. Extravillous trophoblast cell lineage development is associated with active remodeling of the chromatin landscape
Bui et al. Sharing a placenta is associated with a greater similarity in DNA methylation in monochorionic versus dichorionic twin pars in blood at age 14
CN105018576B (zh) 15种男性生育相关蛋白或其组合的应用
Liao et al. Human-specific epigenomic states in spermatogenesis

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Assignment and transfer of rights

Owner name: FETUS, IVF A. S., PRAHA, CZ

Free format text: FORMER OWNER: UNIVERZITA PAVLA JOZEFA SAFARIKA V KOSICIACH, KOSICE, SK; MASARYKOVA UNIVERZITA, BRNO, CZ; UNIVERZITA KOMENSKEHO V BRATISLAVE, BRATISLAVA, SK

Effective date: 20230427