BR112019027474B1 - Método para produção de tecido de cartilagem transplantável - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a um método de produção de tecido de cartilagem pela seleção e escolha de condrócitos ou esferoides e utilização dos mesmos como composição farmacêutica, produto medicinal ou transplante. Em particular, a invenção refere-se a marcadores para identificação de condrócitos adequados, para a produção de tecido de cartilagem, em particular, para fins de transplante.

Description

DESCRIÇÃO
[0001] A presente invenção se refere a um método para produção de tecido de cartilagem selecionando e escolhendo condrócitos ou esferoides, e à utilização dos mesmos como composição farmacêutica, medicamento ou material de transplante. Em particular, a invenção se refere a marcadores para identificar condrócitos adequados para a produção de tecido de cartilagem, em particular para fins de transplante.
[0002] Embora cartilagem articular demonstre resiliência notável, esse tecido não tem capacidade ou dificilmente pode ser restaurado ou regenerado por si mesmo, e as lesões não tratadas podem levar à osteoartrite. Esse baixo potencial de regeneração espontânea levou ao desenvolvimento de terapias celulares, como o transplante de condrócitos autólogos (ACT), com o objetivo de fornecer uma restauração funcional e sem dor das áreas lesionadas da cartilagem articular. Há uma grande necessidade de métodos para regeneração da cartilagem, por exemplo em pacientes jovens ativos com lesões traumáticas, ou mesmo com sintomas de degeneração da cartilagem, e para o tratamento de áreas lesionadas na cartilagem.
[0003] Estudos bioquímicos e moleculares com condrócitos humanos foram prejudicados por uma série de fatores, como a falta de disponibilidade de tecido humano, em conjunto com o número muito pequeno de células disponíveis em uma biópsia, a capacidade limitada de proliferação e a alta instabilidade fenotípica dos condrócitos cultivados.
[0004] Um condrócito (célula cartilaginosa) é uma célula que se origina de condroblastos e que é estabelecida no tecido de cartilagem. Junto com as substâncias intercelulares (matriz extracelular (MEC)), os condrócitos formam os componentes primários da cartilagem, em particular, a cartilagem articular.
[0005] Já é conhecido, por imitação de determinados processos de desenvolvimento embrionário, por exemplo, o cultivo de células de cartilagem humana tridimensionalmente em um substrato de agarose, de modo que agregados celulares sejam produzidos, os quais são superiores às células de monocamada, em termos de capacidade de diferenciação, e que, por exemplo, têm propriedades semelhantes a cartilagens. Essas propriedades, que refletem o tecido de cartilagem articular nativa, da maneira mais precisa possível, são caracterizadas pela expressão do colágeno II (proteína estrutural primária na matriz extracelular da cartilagem hialina), dos proteoglicanos, por exemplo, agrecano, e da proteína específica do condrócito intracelular S100.
[0006] Além disso, é desejável que a expressão do colágeno I, que tem necessariamente regulação positiva durante a fase de multiplicação celular na cultura de monocamada, seja reduzida novamente nos agregados celulares, uma vez que essa proteína está praticamente ausente na cartilagem articular nativa. Os agregados celulares gerados desse modo (esferoides) têm sido oferecidos desde 2002, pelo requerente, para tratar as áreas lesionadas da cartilagem, causadas por lesões, em pacientes mais jovens. Para esse fim, o tecido de cartilagem articular nativa é removido do paciente, e uma biópsia da cartilagem hialina é removida de uma área saudável da cartilagem. Pela digestão enzimática do tecido de cartilagem, por meio de uma solução de colagenase, as células da cartilagem (condrócitos), localizadas no tecido de cartilagem, são isoladas e multiplicadas por meio de condições-padrão de cultura de células, em frascos de cultura de células (cultura de monocamada), na presença de soro autólogo, e são fornecidos condrócitos suficientes para a produção de tecido de cartilagem transplantável. As células multiplicadas formam agregados celulares, ou que se conhece como esferoides, que podem ser transplantados. No entanto, os agregados celulares produzidos desse modo são limitados, em relação ao seu status de diferenciação, e, em geral, demonstram uma expressão local relativamente fraca do colágeno II de substância importante e uma síntese marginal de proteoglicanos com expressão relativamente forte do colágeno I de substância indesejável. A fim de melhorar ainda mais a diferenciação desses agregados celulares, é possível enriquecer o meio de cultura com determinadas substâncias bioativas. Essas incluem principalmente os fatores de crescimento TGF-β1 - 3 e ácido ascórbico (vitamina C) descritos, em muitos casos, na literatura como cofator para a síntese de colágeno. No entanto, esse estímulo bioquímico, por um lado, com frequência, é insuficiente para induzir a diferenciação das células da cartilagem no agregado celular 3D, ao ponto de construtos típicos de cartilagem serem produzidos e, por outro lado, o uso de fatores de crescimento, como TGF-β é disputado, em particular, para uso clínico em humanos.
[0007] O cultivo de células humanas na forma de agregados celulares tridimensionais, por exemplo, na forma do que se conhece como esferoides, já é descrito para uso clínico em humanos, por exemplo, como transplante de cartilagem autóloga, no documento n° DE 100 13 223, que diz respeito a um método para a produção in vitro de tecido de cartilagem tridimensional e tecido ósseo a partir de células- tronco ósseas, células-tronco de cartilagem ou células-tronco mesenquimais. Aqui, as células são cultivadas primeiramente em uma cultura de monocamada e, em seguida, são cultivadas em suspensão, até que um agregado celular seja produzido, que contenha pelo menos 40% em vol. de matriz extracelular, à qual células diferenciadas são incorporadas.
[0008] No método, os agregados celulares são produzidos cultivando células por pelo menos 1 a 2 semanas em recipientes de cultura celular revestidos com agarose.
[0009] O documento n° US 7887843 B2 descreve um método para a produção in vitro de tecido de cartilagem tridimensional e tecido ósseo, em que esferoides transplantáveis são produzidos a partir de células- tronco ósseas, células-tronco de cartilagem ou células-tronco mesenquimais cultivando 1 x 105 células, por pelo menos duas semanas.
[0010] Anderer et al. (Journal of Bone and Mineral Research (2002), Nova Iorque, NY, EUA, Vol. 17, n° 8, p. 1420 a 1429) também descrevem um método para a produção in vitro de tecido de cartilagem tridimensional. De acordo com esse método, 1 x 105 ou 2 x 105 condrócitos são cultivados por 5 dias, 2 semanas, 1, 2 e 3 meses para produzir esferoides.
[0011] Os tecidos de cartilagem produzidos in vitro, descritos na técnica anterior, não apresentam nenhum padrão de expressão de proteínas essenciais da matriz, como o colágeno tipo II, que são semelhantes àquelas dos tecidos nativos. Ao contrário, a composição da matriz extracelular (MEC), produzida in vitro a partir dos condrócitos, desvia-se significativamente do tecido da cartilagem nativa. No entanto, a composição da MEC é essencial para a funcionalidade biológica da cartilagem, por exemplo, a capacidade portadora de carga mecânica. Por essa razão, são necessárias novas técnicas para a produção de tecido de cartilagem e também para o controle de qualidade.
[0012] "Tecido de cartilagem transplantável" significa a produção ex vivo, ou com a ajuda de uma técnica in vitro, em que o tecido produzido corresponde, em grande parte, ao tecido nativo, ou é idêntico ao tecido nativo. No sentido da invenção, o tecido de cartilagem transplantável corresponde, em grande parte, ao tecido nativo, por exemplo, em relação à expressão ou ao padrão de expressão da matriz extracelular, por exemplo, em relação à expressão ou ao padrão de expressão de proteínas ou proteínas estruturais, como colágeno do tipo II e/ou proteína S100 e/ou proteoglicanos específicos de tecido, por exemplo, proteoglicanos específicos de cartilagem, tais como agrecano. A expressão ou o padrão de expressão pode ser detectado, por exemplo, histológica ou imuno-histologicamente.
[0013] O tecido a partir do qual os condrócitos são isolados é selecionado, por exemplo, a partir de tecido musculoesquelético, tecido esquelético, cartilagem, osso, menisco, disco intervertebral, medula óssea, articulações ou tendões. O tecido de cartilagem transplantável produzido pelo método, de acordo com a invenção, é similar ao tecido nativo, em relação à composição e expressão de proteínas (ver acima).
[0014] O tecido de cartilagem articular nativa tem uma composição da matriz extracelular formada de aproximadamente 60 a 80% de água, em relação ao peso líquido do tecido articular. O alto teor de água é importante para a capacidade mecânica portadora de carga do tecido de cartilagem e, junto com os proteoglicanos, é importante para o “efeito esponja”. Além da água, a cartilagem articular nativa contém as proteínas estruturais ou proteínas da matriz. No presente documento, as macromoléculas estruturais são responsáveis por aproximadamente 20 a 40% do peso líquido do tecido de cartilagem articular.
[0015] No caso do tecido de cartilagem articular nativo, a proporção de colágeno é de 60%, a proporção de proteoglicano é de 25 a 35% e a proporção de glicoproteínas e proteínas não colágenas é de 15 a 20% em relação ao peso seco da cartilagem. O colágeno do tipo II é responsável por aproximadamente 90 a 95% do teor total de colágeno do tecido de cartilagem articular nativa.
[0016] O tecido de cartilagem articular humana nativa contém aproximadamente 1 a 5% de células da cartilagem (condrócitos), em relação ao volume do tecido. No presente documento, as células da cartilagem são os produtores essenciais das moléculas da matriz do tecido nativo funcional.
[0017] Desse modo, existe uma grande necessidade de fornecer condrócitos que tenham uma qualidade suficiente e possam produzir um tecido de cartilagem transplantável adequado que corresponda ao tecido nativo, de modo que se possa esperar o sucesso do tratamento. Esse sucesso do tratamento depende, em grande parte, da qualidade do tecido de cartilagem transplantável.
[0018] O objetivo da invenção é, por essa razão, fornecer um tecido de cartilagem transplantável melhorado, em particular, com propriedades melhoradas, em particular, qualidade suficiente, como identidade com condrócitos nativos e esferoides de melhor qualidade, de modo que transplantes de alta qualidade possam ser obtidos, em particular, para o sucesso do tratamento e da terapia das áreas lesionadas da cartilagem articular.
[0019] Os inventores, de forma surpreendente, tiveram capacidade de identificar marcadores em condrócitos isolados que permitem uma qualidade suficiente para a produção de tecido de cartilagem transplantável. Os marcadores, de acordo com a invenção, permitem, em particular, a determinação da identidade das células da cartilagem ("marcadores de identidade") dos condrócitos isolados em uma cultura para os condrócitos nativos.
[0020] Uma identidade adequada de células de cartilagem, por sua vez, permite a produção de tecido de cartilagem transplantável adequado, uma vez que, por um lado, uma matriz extracelular específica da cartilagem suficiente (MEC) pode ser alcançada e, por outro lado, um tratamento melhorado das áreas lesionadas da cartilagem articular é alcançado.
[0021] Em uma modalidade adicional, os marcadores, de acordo com a invenção, permitem a determinação da pureza ou impureza dos condrócitos ou esferoides isolados ("marcadores de pureza").
[0022] Os marcadores mencionados acima garantem uma qualidade suficiente e, por essa razão, constituem "marcadores de qualidade".
[0023] A invenção se refere, por essa razão, a um método para a seleção de condrócitos ou esferoides para a produção de tecido de cartilagem transplantável, em que pelo menos um marcador de qualidade ou marcador de identidade ou marcador de pureza é determinado.
[0024] O método, de acordo com a invenção, para a seleção de condrócitos ou esferoides para a produção de tecido de cartilagem transplantável compreende, em uma primeira etapa, que os condrócitos sejam multiplicados em uma cultura de monocamada (ver acima, o que é conhecido como cultura de expansão bidimensional) e, em uma segunda etapa, que possam se agregar para formar esferoides (ver acima, o que é conhecido como cultivo 3D), de modo que os condrócitos se agregem para formar esferoides, e os esferoides possam ser selecionados.
[0025] Em uma modalidade preferencial, o marcador de qualidade ou marcador de identidade ou marcador de pureza é selecionado do grupo KAL1, CRTAC1, NRN1 ou EBF3, que é(são) determinado(s) in vitro.
[0026] Em uma modalidade preferencial, os marcadores de qualidade ou marcadores de identidade são selecionados do grupo KAL1, CRTAC1 e/ou os marcadores de pureza são EBF3, NRN1. Em particular, os sinoviócitos são impurezas desvantajosas que podem ser determinadas in vitro pelo marcador de pureza EBF3. Tais impurezas podem reduzir a qualidade dos condrócitos e também dos esferoides.
[0027] Em uma outra modalidade preferencial, o que é conhecido como marcador potencial pode ser buscado, de acordo com a invenção, além dos marcadores mencionados acima, em que o marcador potencial permite que uma previsão da atividade e da capacidade de regeneração do tecido de cartilagem transplantável seja obtida dos esferoides. Tais marcadores potenciais, de acordo com a invenção, são, de preferência, proteoglicanos, de forma particularmente preferencial, agrecano (ACAN). Tabela 1: Genes marcadores, de acordo com a invenção
[0028] As sequências de DNA associadas podem ser claramente identificadas pelo número de acesso (por exemplo, NCBI).
[0029] A determinação in vitro dos marcadores, de acordo com a invenção, de preferência, é alcançada por meio da determinação da expressão gênica desses marcadores e também do nível da expressão gênica nos condrócitos isolados e nos esferoides obtidos, que, por exemplo, podem ser determinados rotineiramente pela reação em cadeia da polimerase (PCR, em particular qPCR); ver os exemplos.
[0030] De acordo com a invenção, os marcadores mostram expressão gênica, bem como expressão gênica aumentada ou reduzida no método, de acordo com a invenção, o que demonstra, desse modo, sua capacidade de adequação como marcadores.
[0031] Em uma modalidade adicional, a expressão gênica ou o nível de expressão gênica também pode ser determinado na presença, e em comparação com genes de referência e expressão gênica ou seu nível de expressão gênica. Isso permite uma normalização da expressão gênica e sua quantificação, também por meio de suporte de software; ver Michael W. Pfaffl, A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR, Nucleic Acids Research, 2001, vol. 29, n. 9. Tabela 2: Genes de referência, de acordo com a invenção
[0032] As sequências de DNA associadas podem ser claramente identificadas pelo número de acesso (por exemplo, NCBI).
[0033] Dentro do escopo desta invenção, o termo "seleção" significa que, por exemplo, condrócitos ou esferoides que não têm expressão gênica dos marcadores, de acordo com a invenção, ou que têm uma expressão gênica relativamente baixa, ou nível de expressão gênica, em comparação com outros condrócitos ou esferoides, são descartados. Uma pessoa versada na técnica tem capacidade para distinguir entre uma expressão gênica mais forte e uma expressão gênica mais fraca para um ou mais condrócitos/esferoides com base nos padrões de expressão gênica obtidos e, consequentemente, de escolha de tais condrócitos/esferoides.
[0034] Em uma modalidade adicional preferencial, após a multiplicação, os condrócitos e esferoides isolados obtidos a partir dos mesmos, que têm as seguintes razões de expressão gênica para um/ambos os genes de referência (R), mais especificamente, B2M e/ou TOP1, devem ser selecionados e escolhidos: CRTAC1 / R > 0,003 NRN1 / R > 0,1 KAL1 / R > 1,0 EBF3 / R < 0,4 ACAN / R > 0,29
[0035] As razões adicionalmente preferenciais são CRTAC1 / R > 0,006, em particular, > 0,009 e > 0,012 NRN1 / R > 0,2, em particular, > 0,3 e > 0,4 KAL1 / R > 2,0, em particular, > 3,0 e > 4,0 EBF3 / R < 0,3, em particular, < 0,2 e < 0,1 ACAN / R > 0,39, em particular, > 0,49 e > 0,59
[0036] Os valores declarados são entendidos como valores de limiares adequados.
[0037] A invenção se refere, por essa razão, a um método para selecionar condrócitos ou esferoides para a produção de tecido de cartilagem transplantável, em que os marcadores, de acordo com a invenção, são determinados em comparação com um gene de referência.
[0038] Em uma modalidade adicionalmente preferencial, durante o curso das determinações realizadas do marcador de pureza EBF3, a proporção de sinoviócitos, como impureza nos condrócitos isolados, após multiplicação, ou nos esferoides obtidos, em relação ao número total de células, é menor ou igual a 9%, em particular, menor ou igual a 5%.
[0039] O método, de acordo com a invenção, permite a seleção de condrócitos e esferoides que são escolhidos, de forma específica, para um tecido de cartilagem a ser transplantado. Esse se baseia nas propriedades particulares dos marcadores, de acordo com a invenção, especificamente, marcador de qualidade ou marcador de identidade ou marcador de pureza. Consequentemente, os condrócitos e esferoides que têm uma expressão genética específica são escolhidos, e os produtos genéticos correspondentes podem ser detectados, por exemplo, por meio de PCR.
[0040] A invenção se refere, por essa razão, a condrócitos isolados ou esferoides obtidos isolados, obteníveis por um método, de acordo com a invenção. Também é compreendido um tecido de cartilagem transplantável, em particular, na forma de um fármaco ou produto medicinal, ou na forma de uma composição farmacêutica que contém tais condrócitos ou esferoides, em particular, para uso no tratamento de áreas lesionadas da cartilagem articular e/ou transplante autólogo de condrócitos.
[0041] Em outra modalidade preferencial da invenção, o tecido de cartilagem transplantável, de acordo com a invenção, é administrado a um paciente com a ajuda de um aplicador (ver o documento n° EP2345450B1 (co.fix 150 do aplicante) ou o documento n° DE102009025347A1). O tecido da cartilagem transplantada, de preferência, pode ser mantido na forma de uma composição farmacêutica, em uma solução salina fisiológica, junto com outros auxiliares e aditivos.
[0042] Os desenhos e exemplos a seguir servem para explicar a invenção, mas sem limitar os desenhos e exemplos.
EXEMPLO 1:
[0043] Isolamento de células da cartilagem (condrócitos) oriundas da biópsia de cartilagem e do cultivo de células
[0044] As células específicas da cartilagem (condrócitos) foram isoladas a partir de uma biópsia de cartilagem, por meio de digestão enzimática, com uso de colagenase (350 unidades/mL). A digestão enzimática durou entre 4 e 6 horas, e ocorreu a 37 °C. A biópsia da cartilagem foi realizada nos côndilos do fêmur da articulação do joelho. Após a digestão enzimática, os condrócitos foram centrifugados, lavados, contados e semeados em frascos de cultura de tecidos, junto com o meio de cultura de células (Alpha MEM / F12 de Ham 1:1, 1% de glutamina) e soro autólogo (10 a 15% de soro humano). Para expansão, as células foram cultivadas in vitro por entre 7 e 38 dias, a 37 °C, na cultura de expansão bidimensional (monocamada). O meio de cultura de células foi substituído a cada 3 a 6 dias. Se as culturas de células foram confluentes, a cultura de células foi cultivada com a ajuda de papaína, e dividida entre vários frascos de cultura.
[0045] Depois de atingir um número suficiente de células da cultura de monocamada, 200.000 células foram semeadas por poço, em placas de microtitulação revestidas com 2% de agarose. As células agregaram e formaram uma estrutura arredondada tridimensional (esferoide). Durante o cultivo dos esferoides, o meio de cultura de células (Alpha MEM / F12 de Ham 1:1; 1% de glutamina), que foi misturado com 10% de soro autólogo, foi substituído com regularidade (a cada 3 a 6 dias). O cultivo 3D durou entre 14 e 42 dias.
[0046] Após o cultivo de esferoides, o transplante de células da cartilagem foi preparado para transporte e implantação coletando os esferoides no veículo de produtos médicos (NaCl a 0,9%) e, em seguida, transfererindo-os para o sistema de aplicador co.fix 150, ou para uma seringa.
[0047] Em suma, a produção de transplantes de células da cartilagem foi constituída por uma fase de cultivo em monocamada, de modo a multiplicar os condrócitos isolados, e por uma fase de cultivo 3D, de modo a agregar os condrócitos para formar esferoides. O transplante de células da cartilagem foi destinado à aplicação autóloga, ou seja, foi destinado ao implante no joelho do mesmo paciente.
Exemplo 2: a.) Isolamento de RNA
[0048] As células da cartilagem foram cultivadas em uma cultura de expansão bidimensional (monocamada) até a produção dos esferoides, e foram removidas do fundo do frasco de cultura de células e do complexo celular com o auxílio de uma solução enzimática (papaína). 1x10E6 dessas células da cartilagem foram removidos da suspensão de células para o teste de identidade, e transferidos para um recipiente de reação, ao passo que o restante das células foi usado para a produção subsequente dos esferoides. As células de monocamada relevantes para o teste foram centrifugadas, e o sedimento celular foi lisado no tampão de lise apropriado (PeqGOLD, Peqlab), congelado por choque e armazenado a -70 °C, até o isolamento do RNA. Para o teste de marcador em esferoides de células da cartilagem, 8 esferoides foram removidos da placa do poço, após duas semanas de tempo de cultura, foram lavados com PBS e lisados com o tampão de lise apropriado (PeqGOLD, Peqlab). Os esferoides recebidos no tampão de lise foram homogeneizados mecanicamente por seringa e cânula, para o rompimento ideal das células, sendo retirados e expelidos. O lisado, em seguida, foi congelado por choque em nitrogênio líquido e armazenado a -70 °C, até o isolamento do RNA.
[0049] A extração do RNA total dos esferoides das células da cartilagem e das células de monocamada foi realizada com base no kit de RNA total peqGOLD, da Peqlab, ou com uso do Mini Kit RNeasy Plus da Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante. O RNA isolado foi eluído em água livre de nuclease e armazenado a -70 °C, até a síntese de cDNA. Após o isolamento do RNA, a quantidade, a qualidade e a integridade do RNA foram determinadas com uso de um espectrofotômetro (NanoDrop, Thermo Scientific) e por meio de um bioanalisador (Agilent), de acordo com as instruções do fabricante.
b.) síntese de cDNA
[0050] A síntese de cDNA foi realizada com base no Kit de síntese de cDNA da primeira fita do transcritor (Roche), de acordo com as instruções do fabricante. Para cada amostra, 80 ng de RNA total foram transcritos com o uso do iniciador aleatório Hexamer. A mistura de iniciador e modelo foi colocada em um recipiente reator estéril para um volume de reação de 20 μL. Os seguintes componentes adicionais foram pipetados para a mistura de iniciador e modelo: Tampão de Reação da Transcriptase Reversa do Transcritor, Inibidor Protetor da RNase, Mistura Desoxinucleotídica, Transcriptase Reversa do Transcritor. Os lotes de reação foram misturados, centrifugados juntos e depois incubados em um termociclador. O cDNA de transcrição reversa, em seguida, foi diluído com água livre de nuclease, até uma concentração final de 1 ng/μL. As amostras foram armazenadas a -20 °C, até seu uso posterior nas análises de qPCR.
c.) qPCR
[0051] Para as análises de qPCR, foi usada a técnica de qPCT com o LightCycler® 480 Instrument II (Roche) no formato de 384 poços. Os iniciadores foram purificados por HPLC e foram dissolvidos em água livre de nuclease, até uma concentração de 10 μM. As amostras foram usadas em uma concentração de 10 μM. Para os marcadores a serem medidos, foram estabelecidas condições de reação de qPCR previamente definidas, em relação à concentração do iniciador e da amostra e ao uso de aditivos. Para todas as amostras, uma mistura principal foi produzida, de acordo com a condição de reação do iniciador específico. 8 μL da mistura de reação específica para cada gene-alvo foram pipetados para o poço correspondente na placa de 384 poços e, em seguida, foram adicionados 2 μL de amostra de cDNA (1 ng/μL), com um volume total de 10 μL para cada reação de qPCR.
[0052] A análise de qPCR é baseada no aumento exponencial dos produtos de amplificação por PCR marcados com fluorescência do gene de interesse. Os dados do qPCR foram analisados com o auxílio do software LightCycler® 480, com o uso do módulo do software de Quantificação Relativa Avançada (Roche). O formato de detecção usado foi o chamado Programa de Amostra de Amostra/URL de Hidrólise Monocromática, com os seguintes parâmetros: filtro de excitação de 483 nm, filtro de emissão de 533 nm, combinação de filtros FAM. Os dados do qPCR foram gerados e analisados com os módulos de software para a quantificação relativa. Os dados absolutos de qPCR (valores de CP) dos vários genes-alvo foram gerados pelo método Abs Quant/2nd Derivative Max. O valor de Cp (ponto de cruzamento ou limiar do ciclo) é o número de ciclos de PCR necessários para exceder um valor de limiar definido do sinal de fluorescência. A detecção do sinal de fluorescência foi realizada no final de cada ciclo, a 72 °C.
[0053] A normalização do nível de expressão de mRNA do gene- alvo, em relação ao gene de referência, foi realizada com o auxílio do chamado método de “eficiência”, com o uso do módulo de software de Quantificação Relativa Avançada (Roche). Dois genes de referência, TOP1 e B2M, também foram medidos como controle interno de normalização para cada amostra. A expressão do gene-alvo foi normalizada para esse gene de referência, e os dados normalizados foram fornecidos automaticamente a partir do Módulo de Software de Quantificação Relativa Avançada como valores-alvo/de referência (T/R). O modelo matemático que forma a base desse módulo de software é baseado na relação entre os valores de Cp do gene-alvo, em comparação com os genes de referência, e em consideração, inter alia, à eficiência de amplificação específica do iniciador.
[0054] Os valores de expressão normalizados foram utilizados para testar a qualidade do transplante de células da cartilagem. Os atributos críticos de qualidade foram a identidade, a pureza e o potencial, em que pelo menos um marcador específico foi identificado para cada parâmetro de qualidade e pôde ser medido, a fim de confirmar a qualidade suficiente. Os valores de expressão normalizados de um marcador tiveram que satisfazer os limites de aceitação definidos para a confirmação de qualidade suficiente. O valor para o parâmetro de qualidade foi baseado no nível de expressão do mRNA nas células da cartilagem monocamada (KAL1) ou nos esferoides (CRTAC1, NRN1, EBF3 e ACAN).
[0055] A Tabela 3 mostra a aplicação da seleção descrita em produtos de transplante de cartilagem. No total, 48 produtos de transplante de cartilagem foram produzidos, conforme descrito, e submetidos a testes de identidade, pureza (impureza) e potencial com os marcadores, de acordo com a invenção. Dos 48 transplantes de cartilagem, 48 preencheram os critérios de identidade na monocamada (KAL1) e no esferoide (CRTAC1). Dos 48 transplantes de cartilagem, 4 não cumpriram o critério de pureza (impureza) (EBF3, NRN1) e 19 dos 48 transplantes de cartilagem falharam em satisfazer o critério de potencial. No total, 22 dos 48 transplantes de cartilagem falharam em satisfazer o critério de qualidade das células da cartilagem (identidade, pureza/ impureza ou potencial). 26 dos 48 transplantes de células da cartilagem satisfizeram o critério de qualidade das células da cartilagem (identidade, pureza/ impureza ou potencial) e foram adequados para a produção de tecido de cartilagem transplantável, e foram escolhidos.
[0056] Tabela 3: Escolha de acordo com os valores de limiar estabelecidos n.d.= não determinado ID = identificador. T/R = razão de alvo para referência
EXEMPLO 3:
[0057] Produção de tecido de cartilagem a ser transplantado por meio de células da cartilagem multiplicadas em cultura de monocamada de qualidade definida, nesse caso: identidade.
[0058] Uma biópsia de cartilagem hialina foi retirada de uma área saudável da cartilagem de um paciente com áreas lesionadas na cartilagem a ser tratada. Por digestão enzimática do tecido da cartilagem, com uma solução de colagenase, as células da cartilagem (condrócitos), no tecido da cartilagem, foram isoladas e multiplicadas por meio de condições-padrão de cultura de células em frascos de cultura de células (cultura de monocamada), na presença de soro autólogo, de modo que um nível máximo de duplicação da população (PDL) de 10 não se excedeu, e os condrócitos suficientes para a produção de tecido de cartilagem transplantável ficaram disponíveis. Uma parte das células da cartilagem multiplicada na monocamada foi usada para determinar a identidade das células da cartilagem, e a parte restante foi usada para produzir tecido de cartilagem transplantável.
[0059] Os marcadores para a identidade celular da cartilagem, na cultura de monocamada, descreveram que as células da cartilagem estavam presentes na cultura de células da cartilagem. Para a identidade celular da cartilagem, na cultura de monocamada, o RNA total dos condrócitos cultivados na monocamada foi isolado por meio de técnicas convencionais de biologia molecular e foi transcrito em cDNA por meio de transcriptase reversa. A expressão de pelo menos um gene de referência (acima, Tabela 2) e do marcador de identidade "KAL1" foi determinada por meio de reação em cadeia da polimerase convencional. A expressão de "KAL1" foi definida em relação à expressão do gene de referência e, por essa razão, forneceu um valor de expressão do gene normalizado para o marcador de identidade "KAL1". A expressão de "KAL1" indicou a presença de condrócitos de qualidade suficiente (identidade) para a produção de tecido de cartilagem transplantável.
[0060] Para produzir o tecido de cartilagem transplantável, pelo menos 100.000 dos condrócitos de qualidade suficiente (identidade) multiplicada na monocamada foram transferidos para um recipiente de cultura de células, na presença de meios de cultura de células padrão e soro autólogo. O recipiente de cultura de células impede a aderência dos condrócitos, por exemplo, por meio de um revestimento de agarose no fundo da cultura de células. Após alguns dias, os condrócitos se uniram e formaram agregados, ou o que são conhecidos como esferoides. Os esferoides foram cultivados durante um período de pelo menos 1 a 2 semanas e formaram uma matriz extracelular do tipo cartilagem (cultura de esferoides). Esse tecido cartilaginoso (condrócitos de qualidade suficiente (identidade) e matriz extracelular semelhante a cartilagem) foi adequado, após a introdução na área lesionada da cartilagem do paciente a ser tratado, para a construção de um tecido de cartilagem substituto que preenchesse a área lesionada e desempenhasse a função de tecido natural da cartilagem.
[0061] O tecido de cartilagem de qualidade insuficiente (identidade na cultura de monocamada) não é adequado para a construção de tecido de cartilagem substituto e foi descartado.
EXEMPLO 4:
[0062] Produção de tecido de cartilagem a ser transplantado por meio de células de cartilagem em cultura de esferoide de qualidade definida, nesse caso: identidade.
[0063] As células de cartilagem isoladas no Exemplo 3 e multiplicadas na monocamada foram usadas para a produção de tecido de cartilagem transplantável.
[0064] Conforme descrito no Exemplo 3, os condrócitos multiplicados na monocamada foram transferidos para um recipiente especial de cultura de células que impediu a aderência dos condrócitos, de modo que, após alguns dias, formaram-se agregados ou o que é conhecido como esferoides. Os esferoides foram cultivados durante um período de pelo menos 1 a 2 semanas e formaram uma matriz extracelular do tipo cartilagem (cultura de esferoides). O marcador para a identidade das células de cartilagem, na cultura de esferoides, indicou que as células da cartilagem estavam presentes na cultura de esferoides. A fim de determinar a identidade das células de cartilagem, na cultura de esferoides, o RNA total de parte dos condrócitos cultivados nos esferóides foi isolado por meio de técnicas convencionais de biologia molecular e foi transcrito em cDNA por meio de transcriptase reversa. A expressão de pelo menos um gene de referência (acima, Tabela 2) e do marcador de identidade "CRTAC1" foi determinada por meio da reação em cadeia da polimerase padrão (PCR). A expressão de "CRTAC1" foi definida em relação à expressão do gene de referência e, desse modo, forneceu um valor de expressão gênica normalizado para o marcador de identidade "CRTAC1". A expressão de "CRTAC1" descreveu que condrócitos de qualidade suficiente (identidade) para transplante do tecido cartilaginoso estavam presentes no esferoide. Esse tecido de cartilagem (condrócitos de qualidade suficiente (identidade) e matriz extracelular semelhante a cartilagem) foi adequado, após a introdução na área lesionada de cartilagem do paciente a ser tratado, para a construção de um tecido de cartilagem substituto, que preencheu a área lesionada e desempenhou a função do tecido natural da cartilagem. O tecido de cartilagem de qualidade insuficiente (identidade na cultura de esferoide) não é adequado para a construção de tecido de cartilagem substituto e foi descartado.
EXEMPLO 5:
[0065] Produção de tecido de cartilagem a ser transplantado por meio de células de cartilagem, em cultura de esferoide de qualidade definida, nesse caso: pureza.
[0066] As células de cartilagem, isoladas no Exemplo 3 e multiplicadas na monocamada, foram usadas para a produção de tecido de cartilagem transplantável.
[0067] Conforme descrito no Exemplo 3, os condrócitos multiplicados na monocamada foram transferidos para um recipiente especial de cultura de células que impediu a aderência dos condrócitos, de modo que, após alguns dias, formaram-se agregados ou o que é conhecido como esferoides. Os esferoides foram cultivados durante um período de pelo menos 1 a 2 semanas e formaram uma matriz extracelular do tipo cartilagem (cultura de esferoides).
[0068] O marcador de pureza das células da cartilagem descreveu o teor das células da cartilagem na cultura de esferoides. Para determinar a pureza das células da cartilagem, na cultura de esferoides, o RNA total de parte dos condrócitos cultivados em esferoides foi isolado por meio de técnicas convencionais de biologia molecular e foi transcrito em cDNA por meio de transcriptase reversa. A expressão de pelo menos um gene de referência (acima, Tabela 2) e do marcador de identidade "NRN1" foi determinada por meio da reação em cadeia da polimerase padrão (PCR). A expressão de "NR1" foi definida em relação à expressão do gene de referência e, desse modo, forneceu um valor de expressão gênica normalizado para o marcador de pureza "NRN1". Se a expressão de "NRN1" exceder o valor de limiar previamente definido para a pureza, por exemplo 1,0, isso mostra que os condrócitos de qualidade suficiente (pureza) para transplante do tecido de cartilagem estiveram presentes no esferoide. Se o valor de limiar para a pureza for atingido, os condrócitos de qualidade insuficiente (pureza) estão presentes no esferoide para transplante do tecido de cartilagem.
[0069] Esse tecido de cartilagem (condrócitos de qualidade suficiente (pureza) e matriz extracelular semelhante a cartilagem) é adequado, após a introdução na área lesionada de cartilagem do paciente a ser tratado, para a construção de um tecido de cartilagem substituto, que preenche a área lesionada e desempenha a função do tecido natural da cartilagem. O tecido de cartilagem de qualidade insuficiente (identidade na cultura de esferoide) não é adequado para a construção de tecido de cartilagem de substituição, e foi descartado.
EXEMPLO 6:
[0070] Produção de tecido de cartilagem a ser transportado por meio de células de cartilagem em cultura de esferoides e impurezas celulares definidas.
[0071] As células da cartilagem isoladas no Exemplo 3 e multiplicadas na monocamada foram usadas para a produção de tecido de cartilagem transplantável.
[0072] Conforme descrito no Exemplo 3, os esferoides foram formados e cultivados durante um período de pelo menos 1 a 2 semanas, a fim de formar uma matriz extracelular do tipo cartilagem (cultura de esferoides).
[0073] O marcador de impureza celular da cartilagem indica o teor de impurezas celulares com células sinoviais, células ósseas e/ou células adiposas na cultura de esferoides. Para determinar as impurezas celulares das células da cartilagem na cultura de esferoides, o RNA total de parte dos condrócitos cultivados nos esferoides foi isolado por meio de técnicas convencionais de biologia molecular e foi transcrito em cDNA por meio de transcriptase reversa. A expressão de pelo menos um gene de referência (acima, Tabela 2) e do marcador de impureza "EBF3" foi determinada por meio da reação em cadeia da polimerase padrão (PCR). A expressão de "EBF3" foi definida em relação à expressão do gene de referência e, desse modo, fornece um valor de expressão gênica normalizado para o marcador de impureza "EBF3". Se a expressão de "EBF3" ultrapassou o valor de limiar previamente definido para a impureza, por exemplo 0,8, isso indicou que não havia impurezas celulares excessivas por sinoviócitos no esferóide para transplante do tecido de cartilagem. Se o valor de limiar da impureza fosse excedido, estariam presentes condrócitos de qualidade insuficiente (impureza) no esferoide para transplante do tecido de cartilagem. Esse tecido de cartilagem (condrócitos de qualidade suficiente (impureza) e matriz extracelular semelhante a cartilagem) foi adequado, após a introdução na área lesionada de cartilagem do paciente a ser tratado, para a construção de um tecido de cartilagem substituto, que preenchesse a área lesionada e desempenhasse a função do tecido natural da cartilagem. O tecido de cartilagem de qualidade insuficiente (aumento do teor de impurezas celulares) não foi adequado para a construção de tecido cartilaginoso substituto e foi descartado.
EXEMPLO 7:
[0074] Produção de tecido de cartilagem a ser transplantado por meio de células de cartilagem em cultura de esferoide de potencial definido.
[0075] As células da cartilagem isoladas no Exemplo 3 e multiplicadas na monocamada foram usadas para a produção de tecido de cartilagem transplantável.
[0076] Conforme descrito no Exemplo 3, os esferoides foram formados e cultivados durante um período de pelo menos 1 a 2 semanas, a fim de formar uma matriz extracelular do tipo cartilagem (cultura de esferoides).
[0077] O marcador para o potencial celular de cartilagem descreveu que as células de cartilagem, na cultura de esferoides, tinham a capacidade de formar uma matriz extracelular semelhante a cartilagem. Para determinar o potencial das células da cartilagem, na cultura de esferóides, o RNA total de parte dos condrócitos cultivados nos esferóides foi isolado por meio de técnicas convencionais de biologia molecular e foi transcrito em cDNA por meio de transcriptase reversa. A expressão de pelo menos um gene de referência e do marcador potencial "Agrecano" foi determinada por meio da reação em cadeia da polimerase padrão (PCR). A expressão de "Agrecano" foi definida em relação à expressão do gene de referência e, desse modo, forneceu um valor de expressão do gene normalizado para o marcador de impureza "Agrecano". Se a expressão de "Agrecano" exceder o valor de limiar previamente definido para o potencial, por exemplo, 0,1, isso indica que condrócitos de qualidade (potencial) suficiente estão presentes no esferoide para transplante de tecido de cartilagem. Se o valor de limiar do potencial fosse atingido, os condrócitos de qualidade insuficiente (potencial insuficiente) estariam presentes no esferoide para transplante do tecido de cartilagem. Esse tecido de cartilagem (condrócitos de qualidade suficiente (potencial) e matriz extracelular semelhante a cartilagem) foi adequado, após a introdução na área lesionada de cartilagem do paciente a ser tratado, para a construção de um tecido de cartilagem substituto que preenchesse a área lesionada e desempenhasse a função do tecido natural da cartilagem. O tecido de cartilagem de qualidade insuficiente (potencial) não foi adequado para a construção de tecido de cartilagem substituto e foi descartado.
EXEMPLO 8:
[0078] Produção de tecido de cartilagem a ser transplantado por meio de células de cartilagem de qualidade definida.
[0079] As células da cartilagem isoladas no Exemplo 3 e multiplicadas na monocamada foram usadas para a produção de tecido de cartilagem transplantável.
[0080] Conforme descrito no Exemplo 3, os esferoides foram formados e cultivados durante um período de pelo menos 1 a 2 semanas, a fim de formar uma matriz extracelular do tipo cartilagem (cultura de esferoides).
[0081] Para detectar culturas de esferoides de alta qualidade para transplante e regeneração de áreas lesionadas da cartilagem articular, conforme descrito no Exemplo 3, a identidade foi determinada por meio do marcador de identidade "KAL1" e por meio do marcador de identidade "CRTAC1", conforme descrito no Exemplo 4. Além disso, o marcador de pureza "NRN1" foi determinado, conforme descrito no Exemplo 5, e o marcador de pureza "EBF3" foi determinado, conforme descrito no Exemplo 6. O marcador potencial "Agrecano" também foi determinado, conforme descrito no Exemplo 7.
[0082] O tecido cartilaginoso (condrócitos de qualidade suficiente (identidade na cultura de monocamada e/ou cultura de esferoides, pureza suficiente e/ou grau aceitável de impurezas celulares e potencial suficiente para formar uma matriz extracelular semelhante a cartilagem) e matriz extracelular semelhante a cartilagem) foi adequado, após a introdução na área lesionada da cartilagem do paciente a ser tratado, para a construção de um tecido de cartilagem de substituição que preenchesse o defeito e desempenhasse a função do tecido natural da cartilagem. O tecido de cartilagem de qualidade insuficiente (ausência de identidade comprovada na cultura de monocamada e/ou cultura esferoide, pureza insuficiente e/ou grau insuficiente de impurezas celulares e potencial insuficiente para formar matriz extracelular semelhante a cartilagem) não foi adequado para a construção de tecido de cartilagem de substituição e foi descartado.
EXEMPLO 9:
[0083] O procedimento descrito no presente documento, no Exemplo 8, foi aplicado retrospectivamente ao tecido da cartilagem para ser transplantado de 20 pacientes, em que foi utilizado tecido de cartilagem para regeneração de danos na cartilagem articular. A capacidade do tecido de cartilagem transplantado de construir tecido de cartilagem de reposição foi avaliada clinicamente com base em uma pontuação estabelecida de restauração da cartilagem (KOOS - Knee injury and Osteoarthritis Outcome Score: Roos EM &Lohmander LS, Health and Quality of Life Outcomes 2003, I:64), ou seja, o sucesso clínico do tratamento. Para esse fim, o KOOS de cada paciente foi determinado por meio de um questionário do paciente, antes do tratamento com o tecido de cartilagem a ser transplantado (valor de base). O sucesso clínico ou terapêutico do tratamento foi confirmado se a diferença (KOOS delta) entre o valor de acompanhamento de 1 ano e o valor base for de pelo menos 8 pontos (Roos EM & Lohmander LS, Health and Quality of Life Outcomes 2003, I:64). Se a diferença (KOOS delta) entre o valor de acompanhamento de 1 ano e o valor de base for inferior a 8 pontos, não houve melhora clínica como resultado do tratamento, ou seja, a terapia foi considerada sem sucesso.
[0084] Verificou-se que, no tecido da cartilagem transplantável de 4 dos 20 pacientes (5697 - 1607, 5862 - 1311, 6070 - 2413, 6988 - 2423), o marcador de potencial “Agrecano” estava abaixo do valor de limiar definido, enquanto a identidade das células da cartilagem pode ser determinada com base nos marcadores de identidade "KAL1" e "CRTAC1". Os valores da expressão estavam acima dos valores de limiar definidos. A pureza do tecido da cartilagem a ser transplantado também pôde ser determinada com base no marcador de impureza “EBF3” e foi confirmada; no presente documento, os valores de expressão estavam abaixo dos valores de limiar definidos. Esses 4 tecidos de cartilagem a serem transplantados, por essa razão, demonstraram qualidade insuficiente para a construção de tecido de cartilagem substituto e foram descartados. Isso correspondeu a uma taxa de rejeição de 20% (4 de 20 tecidos de cartilagem a serem transplantados).
[0085] Verificou-se que, no tecido da cartilagem transplantável de 16 dos 20 pacientes (6266 - 2601, 6658 - 2420, 7494 - 2284, 8528 - 2286, 9070 - 2709, 9110 - 2294, 5669 - 2263, 9110 - 2294, 6094 - 1312, 6340 - 2277, 6611 - 2418, 8315 - 2434, 8916 - 2440, 8931 - 1126, 8948 - 2706, 8966 - 2441), o marcador de potencial "Agrecano" também estava acima do valor de limiar definido, e a identidade das células da cartilagem podem ser determinadas com base nos marcadores de identidade “KAL1” e “CRTAC1”. Os valores da expressão também estavam acima dos valores de limiar definidos. A pureza do tecido da cartilagem a ser transplantado também pôde ser determinada com base no marcador de impureza “EBF3” e foi confirmada; no presente documento, os valores da expressão estavam abaixo dos valores de limiar definidos. Por essa razão, esses 16 tecidos de cartilagem a serem transplantados demonstraram qualidade suficiente para a construção de tecido de cartilagem de substituição e foram usados para transplante. Isso correspondeu a uma taxa de sucesso de 80% (16 dos 20 tecidos de cartilagem a serem transplantados).
[0086] O tecido de cartilagem transplantável de 4 dos 20 pacientes (5697 - 1607, 5862 - 1311, 6070 - 2413, 6988 - 2423), desse modo, demonstrou um tecido de cartilagem de qualidade insuficiente (nenhuma identidade comprovada na estrutura de monocamada e/ou na estrutura de esferóides, pureza insuficiente e/ou grau insuficiente de impurezas celulares e potencial insuficiente para formar matriz extracelular do tipo cartilagem), ao passo que o tecido ósseo transplantável de 16 dos 20 pacientes (6266 - 2601, 6658 - 2420, 7494 - 2284, 8528 - 2286 , 9070 - 2709, 9110 - 2294, 5669 - 2263, 9110 - 2294, 6094 - 1312, 6340 - 2277, 6611 - 2418, 8315 - 2434, 8916 - 2440, 8931 - 1126, 8948 - 2706, 8966 - 2441) teve um tecido de cartilagem de qualidade suficiente (identidade na estrutura de monocamada e/ou na estrutura esferoide, pureza suficiente e/ou grau suficiente de impurezas celulares e potencial suficiente para formar matriz extracelular semelhante a cartilagem).
[0087] Com relação ao sucesso clínico ou terapêutico do tratamento, verificou-se (ver Tabela 4) que, naqueles 4 dos 20 pacientes (5697 - 1607, 5862 - 1311, 6070 - 2413, 6988 - 2423) nos quais um tecido de cartilagem transplantável, de qualidade insuficiente, foi determinado retrospectivamente, não houve melhora clínica como resultado do tratamento. A diferença entre o valor de acompanhamento de 1 ano do KOOS e o valor de base do KOOS foi inferior a 8 pontos e, consequentemente, a terapia não teve êxito. Por outro lado, verificou-se que naqueles 16 dos 20 pacientes (6266 - 2601, 6658 - 2420, 7494 - 2284, 8528 - 2286, 9070 - 2709, 9110 - 2294, 5669 - 2263, 9110 - 2294, 6094 - 1312 , 6340 - 2277, 6611 - 2418, 8315 - 2434, 8916 - 2440, 8931 - 1126, 8948 - 2706, 8966 - 2441), nos quais um tecido de cartilagem transplantável de qualidade suficiente havia sido determinado, houve uma melhora clínica como resultado do tratamento. A diferença entre o valor de acompanhamento KOOS de 1 ano e o valor de base de KOOS foi de pelo menos 8 pontos, e a terapia, consequentemente, foi bem- sucedida. Tabela 4: Marcadores de qualidade para identidade, pureza/ impureza e potencial de 20 pacientes com resultado de tratamento clínico conhecido (KOOS delta) KOOS: Lesão no joelho e pontuação de resultado de osteoartrite. n.d. = não determinado.

Claims (13)

1. Método para selecionar condrócitos para a produção de tecido de cartilagem transplantável, caracterizado pelo fato de que pelo menos um marcador de identidade ou marcador de pureza, selecionado do grupo KAL1, NRN1 ou EBF3 é determinado in vitro, em que os marcadores são determinados em comparação com um gene de referência e pelo menos uma razão da expressão gênica selecionada do grupo: CRTAC1 / R > 0,003 NRN1 / R > 0,1 KAL1 / R > 1,0 EBF3 / R < 0,4 está determinada.
2. Método para selecionar condrócitos para a produção de tecido de cartilagem transplantável, caracterizado pelo fato de que os marcadores de identidade selecionados do grupo KAL1, CRTAC1, e os marcadores de pureza selecionados do grupo NRN1, EBF3 são determinados in vitro, em que os marcadores são determinados em comparação com um gene de referência e pelo menos uma razão da expressão gênica selecionada do grupo: CRTAC1 / R > 0,003 NRN1 / R > 0,1 KAL1 / R > 1,0 EBF3 / R < 0,4 está determinada.
3. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que, para produzir tecido de cartilagem transplantável, os condrócitos, em uma primeira etapa, são multiplicados em uma cultura de monocamada e em uma segunda etapa são agregados para formar esferoides.
4. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os condrócitos são agregados para formar esferoides, e os esferoides são escolhidos.
5. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: (i) condrócitos em uma cultura de monocamada com o marcador de identidade KAL1 são determinados in vitro e/ou (ii) condrócitos em esferoides com pelo menos um marcador de identidade CRTAC1, são determinados in vitro.
6. Método para selecionar condrócitos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os proteoglicanos são adicionalmente determinados in vitro.
7. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que agrecano é adicionalmente determinado in vitro.
8. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma razão da expressão gênica selecionada do grupo: CRTAC1 / R > 0,006 NRN1 / R > 0,2 KAL1 / R > 2,0 EBF3 / R < 0,3 ACAN / R > 0,39 é determinada.
9. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma razão da expressão gênica selecionada do grupo: CRTAC1 / R > 0,009 NRN1 / R > 0,3 KAL1 / R > 3,0 EBF3 / R < 0,2 ACAN/R > 0,49 é determinada.
10. Método para selecionar de condrócitos, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma razão da expressão gênica selecionada do grupo: CRTAC1 / R > 0,012 NRN1 / R > 0,4 KAL1 / R > 4,0 EBF3 / R < 0,1 ACAN/R > 0,59 é determinada.
11. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proporção de sinoviócitos nos condrócitos isolados após a multiplicação ou nos esferoides obtidos em relação ao número total de células é inferior ou igual a 9%.
12. Método para selecionar condrócitos, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proporção de sinoviócitos nos condrócitos isolados após a multiplicação ou nos esferoides obtidos em relação ao número total de células é inferior ou igual a 5%.
13. Uso dos esferoides isolados obteníveis pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um tecido de cartilagem transplantável para o tratamento de defeitos de cartilagem articular ou transplante autólogo de condrócitos em um indivíduo em necessidade do mesmo.
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