BR122020018576B1 - Método de preparação de uma composição terapêutica adequada para gerar uma resposta regenerativa em um rim de um indivíduo, composição terapêutica e uso da mesma - Google Patents

Método de preparação de uma composição terapêutica adequada para gerar uma resposta regenerativa em um rim de um indivíduo, composição terapêutica e uso da mesma Download PDF

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Abstract

A presente invenção envolve populações de célula renal de mamífero heterogêneas enriquecidas caracterizadas por biomarcadores e métodos de fazer e usar as mesmas.

Description

[001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório US N.° série 61/718.150, intitulado "Isolated Regenerative Renal Cells and Uses Thereof", depositado em 24 de outubro de 2012, e 61/876.616, intitulado "Renal Cell Populations and Uses Thereof" depositado em 11 de setembro de 2013.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente descrição refere-se genericamente a uma população de células derivada de rim mamífero heterogênea, os métodos de identificação da população de células, métodos para a sua utilização na preparação de uma terapia de medicina regenerativa, e métodos para tratamento de doença renal por administração da população de células derivadas de rim heterogêneas enriquecida a um indivíduo mamífero são aqui fornecidos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] O colágeno e biomateriais à base de gelatina foram empregues com sucesso para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos (Rohanizadeh et al. J Mater Sci Mater Med 2008; 19: 1173-1182; Takemoto et al. Tissue Eng Part A 2008; 14: 1629-1638; Young et al. J Control Release 2005; 109: 256-274). Ambas estas macromoléculas são caracterizadas por excelente biocompatibilidade e baixa antigenicidade (Cenni et al. J Biomater Sci Polym Ed 2000; 11: 685-699; Lee et al. Int J Pharm 2001; 221: 1-22; Waksman et al. J Immunol 1949; 63: 427-433); No entanto, uma vez que a gelatina é obtida pela hidrólise de colágeno, tem certas vantagens sobre os mesmos: (a) é prontamente disponível e fácil de utilizar; (b) oferece opções em relação ao peso molecular e (ou seja, o controle sobre propriedades físicas); e (c), é mais flexível em relação a modificação química e mais simples de fabricar. Além disso, do ponto de vista biológico, a gelatina mantém propriedades de citocompatibilidade e adesão celular semelhantes ao colágeno Engvall et al. Int J Cancer 1977;20: 1-5; Kim et al. Oral Surg Pathol Oral Med Oral Oral Radiol Endod 2009; 108: e94-100).
[004] Vários métodos têm sido relatados para a reticulação destas macromoléculas para a finalidade de retardar a sua biodegradação para prolongar a sua residência in vivo (em aplicações de engenharia de tecidos) ou adaptando a sua capacidade de liberação de fármaco (quando utilizados como carreadores de fármacos). Diversos métodos foram publicados por reticulação química ou fotoquímica de colágeno ou gelatina (Adhirajan et al. J Microencapsul 2007; 24: 647-659; Chang et al. Macromol Biosci 2007; 7: 500-507; Gagnieu et al. Biomed Mater Eng 2007; 17: 9-18; Kimura et al. J Biomater Sci Polym Ed 2010; 21: 463-476; Ma et al. J Biomed Mater Res A 2004; 71: 334-342; Vandelli et al. Int J Pharm 2001; 215: 175-184; Vandelli et al. J Control Release 2004; 96: 67-84). A maioria destes procedimentos é direcionada para reduzir a susceptibilidade destes biomateriais para degradação enzimática e aumentar o seu tempo de residência in vivo (Chang et al. supra 2007; Ma et al. supra 2004). Outros métodos de ligação cruzada são tipicamente empregues para se obter gelatina ou biomaterial à base de colágeno adequados como fármaco de liberação lenta, ou de proteínas transportadoras de ácidos nucleicos (Kimura supra 2010; Vandelli supra 2004; Kommareddy et al. Nanomedicine 2007; 3: 32-42; Sehgal et al. Expert Opin Drug Deliv 2009; 6: 687-695; Sutter et al. J Control Release 2007; 119: 301-312). Uma classe de agente de reticulação utilizado para o colágeno e gelatina, bem como outros sistemas compatíveis com engenharia de tecidos é a de carbodi-imidas (Adhirajan supra 2007; Olde Damink et al. Biomaterials 1996; 17: 765773; Pieper et al. Biomaterials 2000; 21: 581-593; Cornwell et al. Clin Podiatr Med Surg 2009; 26: 507-523). Estas moléculas são conhecidas como agentes de reticulação de comprimento zero e atuam pela mediação da formação de ligações amida entre funcionalidades carboxil e amina primária presentes na espécie a ser reticulado. Além disso, carbodi-imidas são menos citotóxicas em comparação com outro agente de reticulação comum (por exemplo, glutaraldeído) (Lai et al. J Mater Sci Mater Med 2010; 21: 1899-1911). Glutaraldeído é usado como um agente de reticulação em esferas Cultispher™. Burg Patente US 6.991.652 descreve compostos de engenharia de tecidos que contêm construções de suporte tridimensional de células que podem ser liberadas a um indivíduo.
[005] Tecnologias de medicina regenerativa fornecem opções terapêuticas de próxima geração para doença renal crônica (DRC). Presnell et al. WO/2010/056328 e Ilagan et al. PCT/US2011/036347 descrevem células renais isoladas bioativos, incluindo populações de células renais e tubulares produtoras de eritropoietina (EPO), e métodos de isolamento e cultura da mesma., bem como métodos de tratamento de um indivíduo com essa necessidade com as populações de células.
[006] Existe uma necessidade de formulações terapêuticas que são adequadas para liberação de agentes ativos, tais como, por exemplo, células bioativas em aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa, a indivíduos com necessidade.
[007] O rim é um órgão complexo que realiza muitas funções para manter o sangue limpo e quimicamente equilibrado. Além da remoção de resíduos, os rins liberam três hormônios importantes: eritropoietina, ou EPO, que estimula a medula óssea para produzir glóbulos vermelhos; renina, que regula a pressão arterial; e calcitriol, a forma ativa da vitamina D, que ajuda a manter o cálcio para ossos e para o equilíbrio químico normal no corpo.
[008] Para executar essas funções o rim compreende numerosos tipos de células diferentes. No entanto, nem todas as células renais são necessárias para uma resposta regenerativa e identificar a combinação de células úteis para desencadear uma resposta regenerativa tem sido objeto de investigação. Assim, continua a existir uma necessidade de métodos que identifiquem uma população de célula renal heterogênea, isto é, células bioativas, que encontram uso nas formulações terapêuticas aqui divulgadas, SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[009] É divulgada aqui uma população heterogênea de células renais de mamíferos a partir de tecido de rim de mamífero. Os métodos para o isolamento e purificação da população de células derivadas de rim de mamífero são fornecidos. Uma população única de células derivadas de rim de mamífero é caracterizada por características fenotípicas, por exemplo, fenótipo biomarcador. Expressão fenótipo biomarcador é mantido após múltiplas passagens da população de mamífero de células derivadas de rim em cultura e é adequado para utilização na preparação de um tratamento regenerativo.
[0010] É descrita aqui uma população selecionada de população de células renais humanas caracterizada por biomarcadores específicos e à sua utilização.
[0011] A população selecionada de células renais humanas permite o uso de um número menor de células que fornece um estímulo regenerativo. Este número menor é vantajoso porque reduz a possibilidade de eventos imunológicos adversos, bem como proporcionar um estímulo regenerativo. A população de células renais selecionada não requer uma grande proporção de células-tronco para ser eficaz como um estímulo regenerativo. A população de células renais selecionada pode ser recuperada a partir de um rim doente.
[0012] Em um aspecto, são fornecidos métodos para identificar e/ou caracterizar uma população de célula renal heterogênea. Em uma modalidade, a população heterogênea de células renais é caracterizada pela sua expressão fenotípica dos biomarcadores. Em certas modalidades, as células renais são identificadas com um ou mais reagentes que permitem a detecção dos biomarcadores sobre/na população heterogênea de células renais. A detecção dos biomarcadores pode ser realizada por qualquer método adequado, por exemplo, aqueles com base em microscopia de imunofluorescência, citometria de fluxo, citometria por varredura de fibra óptica, ou citometria de varredura a laser. Em uma modalidade, um método de identificação de uma população heterogênea de células renais adequado para implantação e/ou indução de uma resposta regenerativa, o referido método compreendendo as etapas de: isolamento de células a partir de uma amostra de rim de mamífero; expor as referidas células isoladas a uma ou mais porção de detecção marcada, em que cada porção de detecção marcada é dirigida a um biomarcador diferente e é marcada com um marcador diferente; determinação da percentagem de células que expressam cada um dos referidos biomarcadores.
[0013] Em uma modalidade, a população celular é uma população de células que expressa SRC dois ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 12.2 e 12.3. Em uma modalidade, os biomarcadores têm níveis de expressão, tal como previsto na Tabela 12.4. Em uma modalidade, a população de células SRC tem níveis de expressão de GGT-1 e CK18 maior do que 18% e 80%, respectivamente.
[0014] Em um aspecto, são fornecidas formulações injetáveis, contendo agentes terapêuticos ativos, por exemplo, células bioativas. Em uma modalidade, a formulação injetável compreende células bioativas e um biomaterial estabilizador de célula sensível à temperatura. Em outra modalidade, o um biomaterial estabilizador de célula sensível à temperatura mantém a (i) um estado substancialmente sólido a cerca de 8°C ou menos e/ou (ii) um estado substancialmente líquido em temperatura ambiente ou acima. Em uma modalidade, as células bioativas compreendem células renais, tal como aqui descrito. Em outra modalidade, as células bioativas são substancialmente uniformemente dispersas em todo o volume do biomaterial de estabilização de célula. Em outras modalidades, o biomaterial tem um estado de transição sólido-líquido entre cerca de 8°C e cerca da temperatura ambiente ou acima. Em uma modalidade, o estado substancialmente sólido é um estado de gel, em outra modalidade, o biomaterial de estabilização de célula compreende um hidrogel. Em outra modalidade, o hidrogel compreende gelatina. Em outras modalidades, a gelatina está presente na formulação a cerca de 0,5% a cerca de 1% (p/v). Em uma modalidade, a gelatina está presente na formulação a cerca de 0,75% (p/v). Em outra modalidade, a formulação inclui, além disso, um agente de viabilidade celular. Em outra modalidade, o agente de viabilidade celular compreende um agente selecionado a partir do grupo que consiste em um antioxidante, um carreador de oxigênio, um fator imunomodulador, um fator de recrutamento de células, um fator de fixação celular, um agente anti- inflamatório, um imunossupressor, um fator angiogênico, e um fator de cicatrização de feridas. Em algumas modalidades, o agente de viabilidade celular é um antioxidante. Em uma modalidade, o antioxidante é Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico. Em outra modalidade, o ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico está presente em cerca de 50 μM a cerca de 150 μM. Em outra modalidade, o ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico está presente em cerca de 100 μM, em algumas modalidades, o agente de viabilidade celular é um carreador de oxigênio. Em uma modalidade, o carreador de oxigênio é um perfluorcarbono. Em outras modalidades, o agente de viabilidade celular é um agente imunomodulador. Em uma modalidade, o agente de viabilidade celular é um imunossupressor.
[0015] Em outro aspecto, são fornecidas formulações terapêuticas injetáveis, contendo células renais bioativas. Em uma modalidade, a formulação compreende células renais bioativos, cerca de 0,75% (p/v) de gelatina e cerca de 100 μM de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico, em que a formulação tem (i) um estado substancialmente sólido a cerca de 8°C ou inferior, e (ii) um estado substancialmente líquido em temperatura ambiente ou acima. Em outra modalidade, as células renais bioativos estão substancialmente uniformemente dispersas em todo o volume do biomaterial estabilizador de célula. Em outra modalidade, o biomaterial compreende um estado de transição sólido-líquido entre cerca de 8°C e cerca da temperatura ambiente. Em outras modalidades, o estado substancialmente sólido é um estado de gel. Em algumas modalidades, a formulação inclui, além disso, um agente de viabilidade celular. Ainda em outra modalidade, o agente de viabilidade celular compreende um agente selecionado a partir do grupo que consiste em um antioxidante, um carreador de oxigênio, um fator imunomodulador, um fator de recrutamento celular, um fator de ligação de células, um agente anti-inflamatório, um fator angiogênico, e um fator de cicatrização de feridas. Em uma modalidade, o agente de viabilidade celular é um carreador de oxigênio. Em outra modalidade, o carreador de oxigênio é um perfluorcarbono. Em outra modalidade, o agente de viabilidade celular é um agente imunomodulador. Em outras modalidades, o agente de viabilidade celular é um imunossupressor.
[0016] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma formulação aqui descrita que inclui adicionalmente grânulos biocompatíveis. Em uma modalidade, os grânulos compreendem um biomaterial biocompatível. Em outra modalidade, os grânulos são reticulados. Em outra modalidade, os grânulos reticulados têm uma susceptibilidade reduzida à degradação enzimática em comparação com grânulos biocompatíveis não reticulados. Em outras modalidades, os grânulos reticulados são grânulos carbodi-imida reticuladas. Em uma modalidade, a carbodi-imida é selecionada a partir do grupo que consiste em 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodi-imida cloridrato (EDC), DCC-N,N'-diciclohexilcarbodi-imida (DCC), e, N,N'- dissopropilcarbodi-imida (DIPC). Em outra modalidade, a carbodi-imida é 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodi-imida cloridrato (EDC). Em outra modalidade, os grânulos reticulados compreendem um número reduzido de aminas primárias livres em comparação com grânulos não reticulados, em outras modalidades, o número de aminas primárias livres é detectável por espectrofotometria a cerca de 355 nm. Em algumas modalidades, os grânulos são semeados com células bioativas. Em uma modalidade, as células bioativas são células renais. Em outra modalidade, a formulação compreende adicionalmente grânulos biocompatíveis adicionais que compreendem um biomaterial sensível à temperatura que mantém (i) um estado substancialmente sólido à temperatura ambiente ou inferior, e (ii) um estado substancialmente líquido a cerca de 37°C ou acima. Em outra modalidade, o biomaterial dos grânulos compreende um estado de transição sólido-líquido entre a temperatura ambiente e cerca de 37°C. Em outras modalidades, o estado substancialmente sólido é um estado de gel. Em uma modalidade, o biomaterial dos grânulos compreende um hidrogel. Em outra modalidade, o hidrogel compreende gelatina. Em outra modalidade, os grânulos compreendem gelatina a cerca de 5% (p/v) a cerca de 10% (p/v). Em algumas modalidades, os grânulos biocompatíveis adicionais são grânulos de espaçador. Em outras modalidades, os grânulos de espaçador não são semeados com células bioativas.
[0017] Em outro aspecto, as formulações da presente invenção contêm produtos secretados por uma população de células renais. Em uma modalidade, as formulações compreendem produtos secretados por uma população de células renais e/ou células bioativas. Em outra modalidade, as células são células renais bioativas. Em outra modalidade, os produtos compreendem um ou mais dos fatores parácrinos, fatores endócrinos, e fatores juxtácrinos. Em outra modalidade, os produtos compreendem vesículas. Em outras modalidades, as vesículas compreendem microvesículas. Em uma modalidade, as vesículas compreendem exossomas. Em outra modalidade, as vesículas compreendem um produto secretado selecionado a partir do grupo que consiste em fatores parácrinos, fatores endócrinos, fatores juxtácrinos, e RNA.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0018] A Figura 1 é um diagrama de fluxo do processo de fabricação NKA geral aqui descrito.
[0019] A Figura 2 A-D é um diagrama de fluxo fornecendo mais detalhes do processo representado na Figura 1 e aqui descrito.
[0020] A Figura 3 é um gráfico que ilustra as variações na duração de cultura de células e rendimentos a partir de seis pacientes.
[0021] A Figura 4 é uma imagem da bandagem SRC em um gradiente de densidade 7% OptiPrep®. É feita referência ao Exemplo 5.
[0022] A Figura 5 é um gráfico de barras que descreve a expressão de marcadores de células renais em populações humanas SRC. É feita referência ao Exemplo 12.
[0023] A Figura 6 é um gráfico de barras que representa a atividade enzimática de SRC humano. É feita referência ao Exemplo 12.
[0024] A Figura 7A-D descreve injeção de NNA no rim: (a) agulha inserida no córtex renal, (b) liberação de NKA, (c) vários pontos de liberação no rim, e d) implante final da NKA (exemplar.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0025] São aqui descritas formulações terapêuticas para os agentes ativos, tais como células bioativas, assim como a métodos de preparação das mesmas e métodos de tratamento de um indivíduo com essa necessidade com as formulações. As formulações de células bioativas podem ser adequadas para misturas heterogêneas ou frações de células renais bioativas (BRCs). As células renais bioativas podem ser isoladas de células renais incluindo células renais e tubulares produtoras de eritropoietina (EPO). As populações de células BRC podem incluir populações de células tubulares enriquecidas e produtoras de EPO. As BRCs podem ser derivadas a partir de ou são elas próprias fracções de células renais de indivíduos saudáveis. Além disso, são fornecidas fracções de células renais obtidas a partir de um indivíduo saudável que podem ser desprovidos de determinados componentes celulares quando comparado com as correspondentes frações de células renais de um indivíduo saudável, no entanto ainda retêm propriedades terapêuticas. A presente invenção também proporciona populações de células terapeuticamente ativas que são desprovidas de componentes celulares em comparação com um indivíduo saudável, cujas populações de células podem ser, em uma modalidade, isoladas e expandidas a partir de fontes autólogas em vários estados de doença.
[0026] Embora as formulações de células bioativas sejam aqui descritas, a presente descrição contempla formulações que contêm uma variedade de outros agentes ativos. Outros agentes ativos adequados incluem, entre outros, agregados celulares, biomateriais acelulares, produtos secretados a partir de células bioativas, moléculas terapêuticas grandes e pequenas, assim como as suas combinações. Por exemplo, um tipo de células bioativas pode ser combinado com microtransportadores à base de biomateriais com ou sem moléculas terapêuticas ou outro tipo de células bioativas, células não ligadas podem ser combinadas com partículas acelulares.
1. Definições
[0027] A menos que definido de outro modo, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um especialista na técnica à qual essa invenção pertence. Principles of Tissue Engineering, 3aEd, (Editado por R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007 fornece um especialista na técnica com um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido. Um especialista na técnica irá reconhecer que muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, que podem ser utilizados na prática da presente invenção, de fato, a presente invenção não está de modo algum limitada aos métodos e materiais descritos.
[0028] O termo "população de células", tal como aqui utilizado refere-se a um número de células diretamente obtido por isolamento a partir de uma fonte de tecido apropriada, geralmente a partir de um mamífero. A população de células isolada pode ser subsequentemente cultivada in vitro. Os especialistas na técnica irão apreciar que vários métodos para o isolamento e cultura de populações celulares para utilização com a presente invenção e vários números de células em uma população de células são adequados para utilização na presente invenção. Uma população de células pode ser uma população de células não fracionadas, heterogêneas derivadas de um órgão ou tecido, por exemplo, o rim. Por exemplo, uma população heterogênea de células pode ser isolada a partir de uma biópsia de tecido ou de tecido do órgão inteiro. Alternativamente, a população celular heterogênea pode ser derivada a partir de culturas in vitro de células de mamíferos, estabelecidas a partir de biópsias de tecidos ou de órgãos de tecido todo. Uma população heterogênea de células não fracionada pode também ser referida como uma população de células não enriquecida. Em uma modalidade, as populações de células contêm células bioativas.
[0029] O termo "órgão nativo" significa o órgão de um indivíduo vivo. O indivíduo pode ser saudável ou não saudável. Um indivíduo saudável pode ter uma doença associada com o órgão particular.
[0030] O termo "rim nativo" pode significar o rim de um indivíduo vivo. O indivíduo pode ser saudável ou não saudável. Um indivíduo pouco saudável pode ter uma doença renal.
[0031] O termo "efeito regenerador" significa um efeito que proporciona um benefício para um órgão nativo, tal como o rim. O efeito pode incluir, sem limitação, a redução do grau de lesão de um órgão nativo ou uma melhoria em restauração de, ou a estabilização de uma função do órgão nativo. A lesão renal pode estar na forma de fibrose, inflamação, hipertrofia glomerular, etc, e relacionada com uma doença associada com o órgão nativo no indivíduo.
[0032] O termo "mistura", tal como aqui utilizado refere-se a uma combinação de duas ou mais populações de células isoladas, enriquecidas derivadas de uma população de célula heterogênea não fracionada. De acordo com certas modalidades, as populações celulares são populações de células renais.
[0033] Uma população de células "enriquecida" ou preparação se refere a uma população de células derivadas a partir de uma população de células a partir de órgãos (por exemplo, uma população de células heterogêneas não fracionada) que contém uma maior percentagem de um tipo específico de célula do que a percentagem desse tipo de célula na população de partida. Por exemplo, uma população de células renais de partida pode ser enriquecida para uma primeira, uma segunda, uma terceira, uma quarta, uma quinta, e assim por diante, população de células de interesse. Tal como aqui utilizado, os termos "população de células", "preparação de células" e "protótipo de célula" são usadas indistintamente.
[0034] Em um aspecto, o termo população de células "enriquecida" tal como aqui utilizado refere-se a uma população de células derivadas a partir de uma população de células a partir de órgãos (por exemplo, uma suspensão de células a partir de uma biopsia renal ou células renais de mamífero cultivadas) que contém uma percentagem de células capazes de produzir EPO que é maior do que a percentagem de células capazes de produzir EPO na população de partida. Por exemplo, o termo "B4" é uma população de células derivadas a partir de uma população de células renais que contém uma maior percentagem de células produtoras de EPO, células glomerulares, e células vasculares, em comparação com a população de partida. As populações de células podem ser enriquecidas por um ou mais tipos de células e esgotadas de um ou mais outros tipos de células. Por exemplo, uma população de células produtoras de EPO enriquecida pode ser enriquecida por fibroblastos intersticiais e esgotadas de células tubulares e coletando células epiteliais do ducto em relação aos fibroblastos intersticiais e células tubulares em uma população de células não enriquecidas, isto é, a população de células a partir da qual a população de células enriquecida é derivada. Em todas as modalidades citar populações "B4" ou enriquecidas em EPO, as populações de células enriquecidas são populações heterogêneas de células contendo as células que podem produzir EPO de uma forma regulada por oxigênio, como demonstrado por expressão de EPO sintonizável por oxigênio do gene de EPO nativo endógeno.
[0035] Em outro aspecto, uma população de células renais enriquecida, que contém uma percentagem maior de um tipo específico de célula, por exemplo, células vasculares, glomerulares ou endócrinos, que a percentagem do referido tipo de células na população de partida, pode também ser desprovida ou deficiente de um ou mais tipos de células, por exemplo, células vasculares, glomerulares ou endócrinas, em comparação com uma população de células renais de partida derivadas a partir de um indivíduo ou indivíduo saudável. Por exemplo, o termo "B4", ou "B4 prime", em um aspecto, é uma população de células derivada a partir de uma população de células renais de partida que não tem ou é deficiente em um ou mais tipos de células, por exemplo, vasculares, endócrinas ou glomerulares, dependendo do estado da doença a partir da amostra, em comparação com um indivíduo saudável. Em uma modalidade, a população de células B4' é derivada de um indivíduo com doença renal crônica. Em uma modalidade, a população de células B4' é derivada a partir de um indivíduo tendo glomeruloesclerose segmentar focal (FSGS). Em outra modalidade, a população de células B4' é derivada a partir de um indivíduo possuindo glomerulonefrite autoimune. Em outro aspecto, B4' é uma população de células derivada a partir de uma população de célula de partida, incluindo todos os tipos de células, por exemplo, células vasculares, glomerulares, ou endócrinas, que mais tarde é esgotada de ou tornado deficiente em um ou mais tipos celulares, por exemplo, células vasculares, glomerulares ou endócrinas. Em ainda outro aspecto, B4' é uma população de células derivada a partir de uma população de células de partida, incluindo todos tipos de células, por exemplo, células vasculares, glomerulares ou endócrinas, em que um ou mais tipos específicos de células, por exemplo, células vasculares, glomerulares ou endócrinas, são posteriormente enriquecidas. Por exemplo. Em uma modalidade, uma população de célula B4' pode ser enriquecida para células vasculares, mas desprovida de células glomerulares e/ou endócrinas. Em outra modalidade, uma população de células B4' pode ser enriquecida para células glomerulares mas esgotada para células vasculares e/ou endócrinas. Em outra modalidade, uma população de células B4' pode ser enriquecida para células endócrinas mas esgotada para células vasculares e/ou glomerulares. Em outra modalidade, uma população de células B4' pode ser enriquecida para células vasculares e endócrinas, mas desprovida de células glomerulares. Em modalidades preferenciais, a população de células B4', sozinha ou misturada com outra população celular enriquecida, por exemplo, B2 e/ou B3, mantém as suas propriedades terapêuticas. Uma população de células B4', por exemplo, é aqui descrita nos Exemplos, por exemplo, Exemplos 11-13.
[0036] Em outro aspecto, uma população de células enriquecida pode também referir-se a uma população celular derivada de uma população de células renais de partida tal como discutido acima, que contém uma percentagem de células que expressa um ou mais marcadores vasculares, glomerulares e tubulares proximais com algumas células produtoras de EPO que é maior do que a percentagem de células que expressam um ou mais marcadores vasculares, glomerulares e tubulares proximais com algumas células produtoras de EPO na população de partida. Por exemplo, o termo "B3" refere-se a uma população de células derivadas a partir de uma população de células renais de partida que contém uma maior percentagem de células tubulares proximais, bem como células vasculares e as glomerulares, em comparação com a população inicial. Em uma modalidade, a população de células B3 contém uma maior percentagem de células tubulares proximais, em comparação com a população de partida, mas uma percentagem menor de células tubulares proximais em comparação com a população de células B2. Em outra modalidade, a população de células B3 contém uma percentagem maior de marcadores vasculares e as células glomerulares com algumas células produtoras de EPO em comparação com a população de partida, mas uma percentagem menor de marcadores de células vasculares e as glomerulares com algumas células produtoras de EPO em comparação com a população de células B4.
[0037] Em outro aspecto, uma população de células enriquecidas pode também referir-se a uma população de células derivadas a partir de uma população de células renais de partida tal como discutido acima, que contém uma percentagem de células que expressam um ou mais marcadores de células tubulares que é maior do que a percentagem de células expressando um ou mais marcadores de células tubulares na população de partida. Por exemplo, o termo "B2" se refere a uma população de células derivadas a partir de uma população de células renais de partida que contém uma maior percentagem de células tubulares em comparação com a população de partida. Além disso, uma população de células enriquecidas em células que expressam um ou mais marcadores de células tubulares (ou "B2") pode conter algumas células epiteliais do sistema de ducto coletor. Embora a população de células enriquecida em células que expressam um ou mais marcadores de células tubulares (ou "B2") seja relativamente desprovida de células produtoras de EPO, as células glomerulares, e células vasculares, a população enriquecida pode conter menor percentagem destas células (produtoras de EPO, glomerular e vascular), em comparação com a população de partida. Em geral, uma população celular heterogênea está esgotada de um ou mais tipos de células de modo a que a população de células esgotada contém uma proporção menor dos tipos de células em relação com a proporção de tipos de células contidas na população celular heterogênea antes da depleção. Os tipos de células que podem ser esgotadas são qualquer tipo de célula renal. Por exemplo, em certas modalidades, os tipos de células que podem ser esgotadas incluem células com grande granularidade do sistema de ducto coletor e tubular e com uma densidade de < cerca de 1,045 g/mL, referido como "B1". Em certas outras modalidades, os tipos de células que podem ser esgotadas incluem detritos e pequena células de granularidade baixa e viabilidade e com uma densidade de > cerca de 1,095 g/mL, referido como "B5". Em algumas modalidades, a população de células enriquecidas em células tubulares é relativamente desprovida de todos os seguintes: "B1", "B5", células que expressam EPO sintonizável por oxigênio, as células glomerulares, e células vasculares.
[0038] O termo condições de cultura "hipóxicas" tal como aqui utilizado refere-se a condições de cultura em que as células são submetidas a uma redução nos níveis de oxigênio disponível no sistema de cultura em relação às condições de cultura padrão em que as células são cultivadas a níveis de oxigênio atmosférico (cerca de 21%). Condições não hipóxicas são aqui referidas como condições de cultura normais ou de normóxicas.
[0039] O termo "sintonizável por oxigênio", tal como aqui utilizado refere-se à capacidade das células em modular a expressão do gene (para cima ou para baixo) com base na quantidade de oxigênio disponível para as células. "Induzível por hipóxia" refere-se à suprarregulação da expressão de genes em resposta a uma redução da tensão de oxigênio (independentemente da pré-indução ou a partir da tensão de oxigênio).
[0040] O termo "biomaterial", tal como aqui utilizado refere-se a um material biocompatível natural ou sintético, que é adequado para introdução em tecido vivo. Um biomaterial natural é um material que é feito ou se origina a partir de um organismo vivo. Biomateriais sintéticos são materiais que não são feitos por ou não originários de um sistema vivo. Os biomateriais aqui divulgados podem ser uma combinação de materiais biocompatíveis naturais e sintéticos. Tal como aqui utilizado, biomateriais incluem, por exemplo, matrizes de polímeros e suportes. Os especialistas na técnica irão apreciar que os biomateriais podem ser configurados em várias formas, por exemplo, como uma espuma porosa, géis, líquidos, grânulos, sólidos, e pode compreender um ou mais materiais biocompatíveis naturais ou sintéticos. Em uma modalidade, o biomaterial está na forma líquida de uma solução que é capaz de se tornar um hidrogel.
[0041] O termo "liberação modificada" ou os termos equivalentes "liberação controlada", "liberação retardada", ou "liberação lenta" referem-se às formulações que liberam um agente ativo, tal como as células bioativas, ao longo do tempo ou em mais de um ponto no tempo após administração a um indivíduo.
[0042] Liberação modificada de um agente ativo, que pode ocorrer ao longo de uma faixa de tempos desejados, por exemplo, minutos, horas, dias, semanas, ou mais, dependendo da formulação, está em contraste com as formulações padrão, em que, substancialmente, toda a unidade de dosagem está disponível imediatamente após a administração. Para aplicações de engenharia de tecidos e medicina regenerativa, as formulações preferenciais de liberação modificada fornecem a liberação de um agente ativo em vários pontos de tempo após administração local (por exemplo, a administração de um agente ativo diretamente a um órgão sólido). Por exemplo, uma formulação de liberação modificada de células bioativas iria proporcionar uma liberação inicial de células imediatamente no momento da administração e depois uma segunda liberação de células em um momento posterior. O tempo de atraso para a segunda liberação de um agente ativo pode ser minutos, horas ou dias após a administração inicial. Em geral, o período de tempo durante o atraso de liberação corresponde ao período de tempo que leva para um transportador de biomaterial do agente ativo perder sua integridade estrutural. A liberação retardada de um agente ativo conforme tal integridade começa a se degradar e é completada no tempo em que a integridade falha completamente. Os especialistas na técnica irão apreciar outros mecanismos adequados de liberação.
[0043] O termo "anemia", tal como aqui utilizado refere-se a um déficit no número de células vermelhas do sangue e/ou os níveis de hemoglobina, devido a uma produção inadequada de proteína EPO funcional pelas células produtoras de EPO de um objeto, e/ou liberação inadequada de proteína EPO em circulação sistêmica, e/ou a incapacidade de eritroblastos na medula óssea para responder a proteína EPO. Um indivíduo com anemia é incapaz de manter a homeostase de eritroide. Em geral, a anemia pode ocorrer com uma diminuição ou a perda da função renal (por exemplo, insuficiência renal crônica), anemia associada à deficiência relativa de EPO, a anemia associada a insuficiência cardíaca congestiva, anemia associada com a terapia mielo-supressiva, tais como a quimioterapia ou terapia antiviral (por exemplo, AXT), anemia associada com cânceres não mieloides, anemia associada a infecções virais, tais como HIV e anemia de doenças crônicas, como doenças autoimunes (por exemplo, artrite reumatoide), doenças do fígado e insuficiência do sistema de múltiplos órgãos.
[0044] O termo "deficiência de EPO" refere-se a qualquer condição ou distúrbio que é tratável com um agonista do receptor de eritropoietina (por exemplo, EPO recombinante ou os análogos de EPO), incluindo anemia.
[0045] O termo "doença relacionada com o órgão" como aqui utilizado refere-se a distúrbios associados com qualquer fase ou o grau de insuficiência de órgãos aguda ou crônica que resulta em uma perda de capacidade do órgão de desempenhar a sua função.
[0046] O termo "doença renal", tal como aqui utilizado refere-se a distúrbios associados com qualquer fase ou o grau de insuficiência renal aguda ou crônica que resulta em uma perda de capacidade do rim de realizar a função de filtração do sangue e eliminação do excesso de fluidos, eletrólitos, e resíduos a partir do sangue. Doença renal também inclui disfunções endócrinas tais como anemia (deficiência de eritropoietina) e desequilíbrio mineral (deficiência de vitamina D). A doença renal pode ter origem no rim ou pode ser secundária a uma variedade de condições, incluindo (entre outras) insuficiência cardíaca, hipertensão, diabetes, doença autoimune, ou doenças do fígado. Doença renal pode ser uma condição de insuficiência renal crônica que se desenvolve após uma lesão aguda no rim. Por exemplo, a lesão por isquemia renal e/ou exposição a agentes tóxicos podem causar insuficiência renal aguda; recuperação incompleta após a lesão renal aguda pode levar ao desenvolvimento de insuficiência renal crônica.
[0047] O termo "tratamento" refere-se a tratamento terapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas para doenças renais, a anemia, a deficiência de EPO, a deficiência de transporte tubular, ou deficiência de filtração glomerular em que o objeto é reverter, prevenir ou retardar (diminuir) o distúrbio alvo. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com uma doença renal, anemia, deficiência de EPO, deficiência de transporte tubular, ou deficiência de filtração glomerular, bem como aqueles propensos a ter uma doença renal, anemia, deficiência de EPO, deficiência de transporte tubular, ou deficiência de filtração glomerular ou aqueles em que a doença renal, anemia, deficiência de EPO, deficiência de transporte tubular, ou deficiência de filtração glomerular deve ser prevenido. O termo "tratamento", tal como aqui utilizado, inclui a estabilização e/ou melhoria da função renal.
[0048] O termo "fazer contatar in vivo", tal como aqui utilizado refere-se ao contato direto in vivo entre os produtos secretados por uma população enriquecida de células e um órgão nativo. Por exemplo, os produtos secretados por uma população enriquecida de células renais (ou uma mistura ou construção contendo células renais/frações de células renais) in vivo pode contatar um rim nativo. O contato direto in vivo pode ser parácrino, endócrino, ou juxtácrino na natureza. Os produtos secretados podem ser uma população heterogênea de diferentes produtos aqui descritos.
[0049] O termo "ácido ribonucleico" ou "RNA", tal como aqui utilizado refere-se a uma cadeia de unidades de nucleotídeos, em que cada unidade é constituída por uma base nitrogenada, um açúcar ribose, e um fosfato. O RNA pode ser na forma de fita simples ou dupla. O RNA pode ser parte de, dentro de, ou associado com uma vesícula. A vesícula pode ser uma exossoma. RNAs incluem, sem limitação, mRNAs, rRNA, pequenos RNAs, snRNAs, snoRNAs, microRNAs (miRNAs), pequenos RNA interferentes (siRNAs), e RNAs não codificantes. O RNA é preferencialmente RNA humano.
[0050] O termo "construção" refere-se a uma ou mais populações celulares depositadas sobre ou dentro de uma superfície de uma estrutura ou matriz feita de um ou mais materiais biocompatíveis sintéticos ou de ocorrência natural. As uma ou mais populações de células podem ser revestidas com, depositadas em, incorporadas em, ligadas a, semeadas, ou encapsuladas em um biomaterial composto de um ou mais biomateriais biocompatíveis sintéticos ou que ocorrem naturalmente, polímeros, proteínas ou peptídeos. As uma ou mais populações de células podem ser combinadas com um ou biomaterial ou estrutura ou matriz in vitro ou in vivo. Em geral, os um ou mais materiais biocompatíveis usados para formar a estrutura/biomaterial são selecionados para dirigir, facilitar ou permitir a formação de organização multicelular, tridimensional de, pelo menos, uma das populações celulares depositadas nestas. Os um ou mais biomateriais utilizados para gerar a construção podem também ser selecionados para dirigir, facilitar ou permitir dispersão e/ou integração da construção ou componentes celulares da construção com o tecido do hospedeiro endógeno, ou para dirigir, facilitar, ou permitir a sobrevivência, enxerto, tolerância, ou o desempenho funcional da construção ou componentes celulares da construção.
[0051] O termo "marcador" ou "biomarcador" refere-se geralmente a DNA, RNA, uma proteína, carboidrato, ou marcador molecular à base de glicolipídeo, a expressão ou presença do qual em uma população de células cultivadas pode ser detectada através de métodos padrões (ou métodos aqui revelados) e é consistente com uma ou mais células na população de células em cultura, sendo um tipo particular de célula. Tais biomarcadores incluem, entre outros, os genes descritos nas Tabelas X e Y. O marcador pode ser um polipeptídeo expresso pela célula ou uma localização física identificável em um cromossoma, tal como um gene, um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo (por exemplo, um mRNA) expresso pela célula nativa. O marcador pode ser uma região expressa de um gene referido como um "marcador de expressão do gene", ou alguns segmentos de DNA com nenhuma função de codificação conhecida. Os biomarcadores podem ser derivados de células, por exemplo, produtos secretados.
[0052] Os termos "assinatura de biomarcador", "assinatura", "assinatura de expressão de biomarcador", ou "assinatura de expressão" são aqui utilizados indiferentemente e referem-se a um ou uma combinação dos biomarcadores cuja expressão é um indicador dos tipos celulares, por exemplo, epitelial, tubular, etc, compreendendo uma população de células, por exemplo, células renais bioativas. A assinatura de biomarcador pode servir como um indicador de adequação da população de células para utilização nos métodos e fabricações previstas neste documento. Em algumas modalidades, a assinatura de biomarcador é uma "assinatura de gene." O termo "assinatura de gene" é usado intercambiavelmente com "assinatura de expressão de gene" e refere-se a um ou uma combinação de polinucleotídeos cuja expressão é um indicador de tipo de célula, por exemplo, epitelial, tubular, etc. Em algumas modalidades, a assinatura de biomarcador é uma "assinatura de proteína." O termo "assinatura de proteína" é utilizado alternadamente com "assinatura de expressão de proteína" e refere-se a um ou uma combinação de polipeptídeos cuja expressão é um indicador de tipo de célula, por exemplo, epitelial, tubular, etc.
[0053] Os termos "nível de expressão" ou "nível de expressão" são utilizados indiferentemente e referem-se geralmente a quantidade de um polinucleotídeo ou um produto de aminoácidos ou proteína em uma amostra biológica, ou a percentagem de células que expressam o polinucleotídeo ou um produto de aminoácidos ou proteína, "Expressar" ou "Expressão" e suas variantes gramaticais referem-se à presença de um polinucleotídeo ou um produto de aminoácidos ou proteína em uma quantidade detectável em uma amostra biológica. Por exemplo, uma proteína que é detectável (acima do fundo ou valores de controle) pode ser dita para expressar a proteína. Da mesma forma, se uma porção de células em uma amostra expressa a proteína, a amostra pode ser dita para expressar a proteína. Em alternativa, a amostra pode ser considerada como tendo um nível de expressão sobre a percentagem de células que expressam a proteína, por exemplo, se 60% das células em uma amostra expressam a proteína, em seguida, o nível de expressão é de 60%.
[0054] Os termos "gene expresso diferencialmente", "expressão diferencial de genes" e os seus sinônimos, que são utilizados indiferentemente, referem-se a um gene cuja expressão é ativada a um nível mais alto ou mais baixo em uma primeira célula ou população celular, em relação à sua expressão em uma segunda célula ou população de células. Os termos também incluem genes cuja expressão é ativada a um nível mais alto ou mais baixo em diferentes fases ao longo do tempo durante a passagem da primeira ou da segunda célula em cultura. Também é entendido que um gene expresso diferencialmente pode ser ou ativado ou inibido ao nível do ácido nucleico ou nível da proteína, ou pode ser indivíduo a splicing alternativo para resultar em um produto polipeptídeo diferente. Tais diferenças podem ser evidenciadas por uma alteração nos níveis de mRNA, a expressão BA superfície, secreção ou outro particionamento de um polipeptídeo, por exemplo. A expressão do gene diferencial pode incluir uma comparação de expressão entre dois ou mais genes ou os seus produtos de genes, ou uma comparação dos índices de expressão entre dois ou mais genes ou os seus produtos do gene, ou mesmo uma comparação de dois produtos processados diferentemente do mesmo gene, os quais diferem entre a primeira célula e a segunda célula. A expressão diferencial inclui diferenças quantitativas e qualitativas, no padrão de expressão temporal ou celular em um gene ou seus produtos de expressão, entre, por exemplo, a primeira célula e a segunda célula. Para a finalidade da presente revelação, "expressão diferencial de genes" é considerado estando presente quando existe uma diferença entre a expressão de um dado gene na primeira célula e a segunda célula. A expressão diferencial de um marcador pode estar nas células a partir de um paciente antes da administração de uma população de células, mistura ou construção (primeira célula) em relação à expressão em células do paciente após a administração (a segunda célula).
[0055] Os termos "inibir", "regular para baixo", "sub-expressar" e "reduzir" são utilizados alternadamente e significam que a expressão de um gene, ou o nível de moléculas de RNA ou moléculas equivalentes a RNA que codificam uma ou mais proteínas ou subunidades proteicas, ou a atividade de uma ou mais proteínas ou subunidades de proteína, é reduzida em relação a um ou mais controles, tais como, por exemplo, um ou mais controles positivos e/ou negativos. A sub-expressão pode ser em células de um paciente antes da administração de uma população de células, mistura, ou construção em relação às células do paciente após a administração.
[0056] O termo "regular para cima" ou "superexpressar" é usado para significar que a expressão de um gene, ou nível de moléculas de RNA ou moléculas equivalentes a RNA que codifica uma ou mais proteínas ou subunidades de proteína, ou a atividade de uma ou mais proteínas ou subunidades de proteína, é elevada em relação a um ou mais controles, tais como, por exemplo, um ou mais controles positivos e/ou negativos. A superexpressão pode ser em células de um paciente após a administração de uma população de células, mistura, ou construção em relação às células do paciente antes da administração.
[0057] O termo "indivíduo", qualquer indivíduo humano único, incluindo um paciente, elegível para o tratamento, que está experimentado ou experimentou um ou mais sinais, sintomas, ou outros indicadores de uma doença relacionada com o órgão, como doença renal, anemia, ou deficiência de EPO. Esses temas incluem, entre outros, indivíduos que são recém diagnosticados ou diagnosticados anteriormente e estão agora experimentando uma recorrência ou recidiva, ou estão em risco para uma doença renal, anemia ou deficiência de EPO, não importa a causa. O indivíduo pode ter sido previamente tratado para uma doença renal, anemia ou deficiência de EPO, ou não tratado.
[0058] O termo "paciente" refere-se a um único animal, mais preferencialmente um mamífero (incluindo os animais não humanos como, por exemplo, cães, gatos, cavalos, coelhos, animais de jardim zoológico, vacas, porcos, ovelhas, e primatas não humanos) para os quais é desejado um tratamento. Mais preferencialmente, o paciente aqui é um ser humano.
[0059] O termo "amostra" ou "amostra do paciente" ou "amostra biológica" são, em geral, qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo ou paciente, fluido do corpo, tecido do corpo, linhagem celular, cultura de tecidos ou outra fonte. O termo inclui biópsias de tecidos, tais como, por exemplo, biópsias renais. O termo inclui células em cultura, tais como, por exemplo, células nos rins de mamíferos cultivadas. Os métodos para a obtenção de biópsias de tecidos e células de cultura de mamíferos são bem conhecidos na técnica. Se o termo "amostra" é usado sozinho, ele ainda deve significar que a "amostra" é uma "amostra biológica" ou "amostra do paciente", isto é, os termos são usados alternadamente.
[0060] O termo "amostra de teste" refere-se a uma amostra de um indivíduo que tenha sido tratado por um método aqui descrito. A amostra de teste pode se originar de diversas fontes do indivíduo mamífero incluindo, entre outros, sangue, sêmen, soro, urina, medula óssea, mucosa, tecido, etc.
[0061] O termo "controle" ou "amostra de controle" refere-se um controle negativo ou positivo, no qual se espera que um resultado negativo ou positivo possa ajudar a correlacionar um resultado na amostra de teste. Controles adequados incluem, entre outros, um exemplo conhecido por exibir indicadores característicos da homeostase de eritroides normais, uma amostra conhecida por exibir indicadores característicos da anemia, uma amostra obtida de um indivíduo que se sabe não estar anêmico, e uma amostra obtida de um indivíduo conhecido por ser anêmico. Controles adicionais adequados para utilização nos métodos aqui proporcionados incluem, entre outros, as amostras derivadas de indivíduos que foram tratados com agentes farmacológicos conhecidos para modular a eritropoiese (por exemplo, EPO recombinante ou os análogos de EPO). Além disso, o controle pode ser uma amostra obtida de um indivíduo, antes de ser tratado por um método aqui divulgado. Um controle adequado adicional pode ser uma amostra de teste obtida de um indivíduo conhecido por ter qualquer tipo ou estágio da doença renal, e uma amostra de um indivíduo que se sabe não ter qualquer tipo ou da fase de doença renal. Um controle pode ser um controle pareado saudável normal. Os especialistas na técnica irão apreciar outros controles adequados para utilização na presente invenção.
[0062] "Prognóstico de regeneração", "prognóstico regenerativo", ou "prognóstico para a regeneração" geralmente se refere a uma previsão do curso regenerativo provável ou resultado da administração ou a implantação de uma população de células, mistura ou construção aqui descrita. Para um prognóstico de regeneração, a previsão pode ser informada por um ou mais dos seguintes: melhoria de um órgão funcional (por exemplo, rim) após a implantação ou administração, o desenvolvimento de um rim funcional após a implantação ou administração, desenvolvimento melhorado de função renal ou capacidade após a implantação ou administração, e a expressão de certos marcadores pelo rim nativo após a implantação ou administração.
[0063] "Órgão regenerado" refere-se a um órgão nativo após a implantação ou administração de uma população de células, mistura, ou construção, tal como aqui descrita. O órgão regenerado é caracterizado por vários indicadores, incluindo, entre outros, desenvolvimento da função ou capacidade no órgão nativo, melhoria da função ou capacidade no órgão nativo, e a expressão de certos marcadores no órgão nativo. Os especialistas na técnica apreciarão que outros indicadores podem ser adequados para a caracterização de um órgão regenerado.
[0064] "Rim regenerado" refere-se a um rim nativo após a implantação ou administração de uma população de células, mistura, ou construção, tal como aqui descrita. O rim regenerado é caracterizado por vários indicadores, incluindo, entre outros, desenvolvimento da função ou capacidade no rim nativo, melhoria da função ou capacidade no rim nativo, e a expressão de certos marcadores no rim nativo. Os especialistas na técnica apreciarão que outros indicadores podem ser adequados para a caracterização de um rim regenerado.
[0065] O termo "agregado celular" ou "esferoide" refere-se a um agregado ou conjunto de células de cultura para permitir o crescimento 3D, em oposição ao crescimento em monocamada. Note-se que o termo "esferoide" não implica que o agregado é uma esfera geométrica. O agregado pode ser altamente organizado com uma morfologia bem definida ou pode ser uma massa desorganizada; esta pode incluir um único tipo de célula ou mais do que um tipo de célula. As células podem ser isolados primários, ou uma linhagem celular permanente, ou uma combinação dos dois. Estão incluídos nesta definição culturas organoides e organotípicas.
[0066] O termo "temperatura ambiente" refere-se à temperatura na qual as formulações da presente invenção serão administradas a um indivíduo. Em geral, a temperatura ambiente é a temperatura de um ambiente com temperatura controlada. A temperatura ambiente varia de cerca de 18°C até cerca de 30°C. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é de cerca de 18°C, cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, ou cerca de 30°C.
[0067] A palavra "marcador", quando aqui utilizada, refere-se a um composto ou composição que é conjugado ou fundido direta ou indiretamente a um reagente, tal como uma sonda de ácido nucleico ou um anticorpo e facilita a detecção do reagente ao qual é conjugado ou fundido. O marcador pode ser ele próprio (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) detectável ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detectável. O termo destina- se a abranger a marcação direta de uma sonda ou anticorpo por acoplamento (isto é, ligando fisicamente) de uma substância detectável à sonda ou anticorpo, assim como marcação indireta da sonda ou anticorpo por reatividade com outro reagente que é diretamente marcado. Exemplos de marcação indireta incluem detecção de um anticorpo primário, utilizando um anticorpo secundário marcado com fluorescência e marcação de extremidade de uma sonda de DNA com biotina de tal modo que possa ser detectada com estreptavidina marcada com fluorescência.
[0068] O termo "detecção" inclui qualquer meio de detecção, incluindo a detecção direta e indireta.
[0069] Um "kit" é qualquer fabricação (por exemplo, uma embalagem ou recipiente) compreendendo pelo menos um reagente, por exemplo, um medicamento para o tratamento de uma doença do rim, ou uma sonda para detectar especificamente um gene ou proteína biomarcadora, tal como aqui divulgado. A fabricação é, de preferência promovida, distribuída ou vendida como uma unidade para realizar os métodos aqui revelados.
2. Populações de células.
[0070] As formulações da presente invenção podem conter, populações heterogêneas de células renais isoladas, e suas misturas, enriquecida para os componentes bioativos específicos ou tipos de células e/ou depleção de componentes inativos ou indesejados específicos ou tipos de células para utilização no tratamento da doença renal, ou seja, proporcionando a estabilização e/ou melhoria e/ou regeneração da função renal, foram previamente descritos em Presnell et al. US 2011-0117162 e Ilagan et al, PCT/US2011/036347, o conteúdo total dos quais é aqui incorporado por referência. As formulações podem conter frações de células renais isoladas desprovidas de componentes celulares, em comparação com um indivíduo saudável ainda retêm propriedades terapêuticas, isto é, proporcionar a estabilização e/ou melhoria e/ou regeneração da função renal. As populações de células, frações de células, e/ou misturas de células aqui descritas podem ser derivadas a partir de indivíduos saudáveis, indivíduos com uma doença renal, ou indivíduos, tal como aqui descrito.
[0071] A presente invenção proporciona formulações que são adequadas para utilização com várias populações de células bioativas incluindo, entre outros, a população de células isoladas, frações de células, misturas, populações de células enriquecidas, agregados celulares, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, as populações de células bioativas são células renais bioativas. Populações de células bioativas
[0072] A presente descrição contempla formulações terapêuticas adequadas para populações de células bioativas que devem ser administradas para atingir órgãos ou tecidos em um indivíduo em necessidade. Uma população de células bioativas, geralmente refere- se a uma população de células possuindo propriedades terapêuticas potencialmente quando da administração a um indivíduo. Por exemplo, após administração a um indivíduo com essa necessidade, uma população de células renais bioativas pode proporcionar a estabilização e/ou melhoria e/ou regeneração da função renal no indivíduo. As propriedades terapêuticas podem incluir um efeito regenerador.
[0073] Populações de células bioativas incluem, entre outras, as células-tronco (por exemplo, pluripotentes, multipotentes, oligopotentes, ou unipotentes), tais como as células-tronco embrionárias, células- tronco amnióticas, células-tronco adultas (por exemplo, hematopoiética, mamárias, intestinais, mesenquimais, placenta, pulmão, medula óssea, sangue, cordão umbilical, endotelial, polpa dentária, tecido adiposo, neural, olfativo, crista neural, testicular), as células-tronco pluripotentes induzidas; células geneticamente modificadas; bem como as populações de células ou explantes de tecidos derivados de qualquer fonte do corpo. As formulações da presente invenção também podem ser utilizadas com populações de células renais derivadas de tecido adiposo como descrito em Basu et al. PCT/USLL/39859 depositado em 9 de junho de 2011; e com células musculares listas derivadas de tecido adiposo ou derivadas de sangue periférico descritas em Ludlow et al. US 2010-0131075 e Ludlow et al. PCT/US11/35058 depositado em 03 de maio de 2011; ou células musculares lisas ou uroteliais derivadas de bexiga tal como descrito em Atala US 6.576.019, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade. As populações de células bioativas podem ser isoladas, enriquecidas, purificadas, homogêneas, ou de natureza heterogênea. Os especialistas na técnica irão apreciar outras populações de células bioativas que são adequadas para utilização nas formulações da presente invenção.
[0074] Em uma modalidade, a fonte de células é a mesma que o órgão ou tecido alvo a que se destinam. Por exemplo, células renais podem ser originadas a partir do rim para ser usadas em uma formulação a ser administrada para o rim. Em outra modalidade, a fonte de células não é a mesma que o órgão ou tecido alvo a que se destinam. Por exemplo, as células que expressam eritropoietina podem ser originadas a partir de tecido adiposo renal a ser utilizado em uma formulação a ser administrada para o rim.
[0075] Em um aspecto, a presente invenção proporciona formulações contendo determinadas subfrações de uma população heterogênea de células renais, enriquecidas em componentes bioativos e esgotadas de componentes inativos ou indesejados que fornecem resultados superiores terapêuticos e regenerativos do que a população de partida. Por exemplo, células renais bioativas aqui descritas, por exemplo, B2, B4, e B3, que são desprovidas de componentes inativos ou indesejados, por exemplo, B1 e B5, sozinhos ou em misturas, podem ser parte de uma formulação para ser utilizada para a estabilização e/ou melhoria e/ou regeneração da função renal.
[0076] Em outro aspecto, as formulações contêm uma subfração específica, B4, esgotada ou de deficiente em um ou mais tipos de células, por exemplo, vasculares, endócrinas ou endoteliais, ou seja, B4', que retêm as propriedades terapêuticas, por exemplo, estabilização e/ou melhoria e/ou regeneração da função renal, isoladamente ou quando misturada com outras subfrações bioativas, por exemplo, B2 e/ou B3. Em uma modalidade preferencial, a população de células bioativas é B2. Em certas modalidades, a população de células B2 é misturada com ou B4 ou B4'. Em outras modalidades, a população de células B2 é misturada com B3. Em outras modalidades, a população de células B2 é misturada com ambos os componentes celulares B3 e B4, ou específicas de B3 e/ou B4.
[0077] A população de células B2 é caracterizada pela expressão de um marcador de célula tubular selecionado a partir do grupo que consiste em um ou mais dos seguintes: megalina, cubilina, ácido hialurônico 2 sintase (HAS2), vitamina D3 25-hidroxilase (CYP2D25), N -caderina (cad), E-caderina (Ecad), Aquaporina-1 (Aqp1), Aquaporina-2 (Aqp 2), RAB17, membro da família oncogene RAS (Rab17), proteína de ligação GATA 3 (GATA3), regulador de transporte de íon contendo domínio FXYD 4 (Fxyd4), família portadora de soluto 9 (trocador de hidrogênio/sódio), membro 4 (Slc9a4), família aldeído desidrogenase 3, membro B1 (Aldh3b1), família aldeído desidrogenase 1, membro A3 (Aldh3b1), e Calpaina-8 (Capn8), e marcador de duto de coleta Aquaporina-4 (Aqp4). B2 é maior e mais granulado que B3 e/ou B4 e, assim, tem uma densidade de flutuação entre cerca de 1,045 g/mL e cerca de 1,063 g/mL (roedor), entre cerca de 1,045 g/mL e 1,052 g/mL (humano), e entre cerca de 1,045 g/mL e cerca de 1,058 g/mL (canino).
[0078] A população de células B3 é caracterizada pela expressão de marcadores vasculares, glomerulares e tubulares proximais com algumas células produtoras de EPO, sendo de um tamanho intermediário e granularidade em comparação com B2 e B4, e, assim, tem uma densidade de flutuação entre cerca de 1,063 g/mL e cerca de 1,073 g/mL (roedor), entre cerca de 1,052 g/mL e cerca de 1,063 g/mL (humano), e entre cerca de 1,058 g/mL e cerca de 1,063 g/mL (canino). B3 é caracterizada pela expressão de marcadores selecionado a partir do grupo que consiste em um ou mais dos seguintes: aquaporina 7 (Aqp7), regulador de transporte de íon contendo domínio FXYD 2 (Fxyd2), família transportadora de soluto 17 (fosfato de sódio), membro 3 (Slcl7a3), família transportadora de soluto 3, membro 1 (Slc3al), claudina 2 (Cldn2) Napsina A peptidase aspártico (Napsa), família portadora de soluto 2 (transportador de glicose facilitado), membro 2 (Slc2a2), alanil (membrana) aminopeptidase (Anpep), proteína transmembranar 27 (Tmem27), membro da família acil-CoA sintetase de cadeia média 2 (Acsm2); glutationa peroxidase 3 (GPx3), frutose-1,6- bisfosfatase 1 (Fbp1) e alanina-glioxilato aminotransferase 2 (Agxt2), B3 é também caracterizada pelo marcador de expressão vascular de molécula de adesão celular endotelial de plaquetas (Pecam) e o marcador de expressão glomerular podocina (Podn).
[0079] A população de células B4 é caracterizada pela expressão de um conjunto de marcador vascular contendo um ou mais dos seguintes: PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146; um conjunto de marcadores glomerulares contendo um ou mais dos seguintes: Podocina (Podn), e efrina (Neph); e uma população enriquecida de EPO sintonizável por oxigênio em comparação com não fracionada (UNFX), B2 e B3. B4 é também caracterizada pela expressão de um ou mais dos seguintes marcadores: quimioquina (motivo C-X-C) receptor 4 (Cxcr4), tipo do receptor de endotelina B (Ednrb), colágeno, tipo V, alfa 2 (Col5a2), caderina 5 (Cdh5), ativador de plasminogênio, tecido (Plat), angiopoietina 2 (Angpt2), receptor de proteína do domínio de inserção da quinase (KDR), proteína secretada, ácida, rica em cisteína (osteonectina) (Sparc), serglicina (Srgn), TIMP inibidor de metalopeptidase 3 (TIMP3), tumor de Wilms 1 (Wt1), família de sítio de integração de MMTV tipo sem asas, membro 4 (Wnt4), Regulador de sinalização de G 4 (Rgs4 ), molécula de adesão celular endotelial de plaqueta (Pecam), e eritropoietina (EPO). B4 é também caracterizada por as células menores, menos granulados em comparação com B2 ou B3, com uma densidade de flutuação entre cerca de 1,073 g/mL e cerca de 1,091g ml (roedores), entre cerca de 1,063 g/mL e cerca de 1,091 g/mL (humano e canino).
[0080] A população de células B4' é definida como tendo uma densidade de flutuação de entre 1,063 g/mL e 1,091 g/mL e expressando um ou mais dos seguintes marcadores: PECAM, vEGF, KDR, HSF1a, podocina, nefrina, EPO, CK7, CK8/18/19. Em uma modalidade, a população de células B4' é caracterizada pela expressão de um conjunto de marcador vascular contendo um ou mais dos seguintes: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146. Em outra modalidade, a população de células B4' é caracterizada pela expressão de um marcador endócrino EPO. Em uma modalidade, a população celular B4' é caracterizada pela expressão de um conjunto de marcadores glomerulares contendo um ou mais dos seguintes: Podocina (Podn), e nefrina (Neph). Em certas modalidades, a população celular B4' é caracterizada pela expressão um conjunto de marcadores vasculares contendo um ou mais dos seguintes: PECAM, vEGF, KDR, HSF1a e pela expressão de um marcador endócrino EPO. Em outra modalidade, B4' também é caracterizada por células menores, menos granuladas em comparação com ou B2 ou B3, com uma densidade de flutuação entre cerca de 1,073 g/mL e cerca de 1.091g/mL (em roedores), entre cerca de 1,063 g/mL e cerca de 1,091 g/mL (humano e canino).
[0081] Em um aspecto, a presente invenção proporciona formulações que contêm uma população B4 enriquecida isolada de células renais humanas que compreendem pelo menos um de células produtoras de eritropoietina (EPO), células vasculares, células glomerulares e com uma densidade entre 1,063 g/mL e 1,091 g/mL. Em uma modalidade, a população de células B4' é caracterizada pela expressão de um marcador vascular. Em certas modalidades, a população de células B4' não é caracterizada pela expressão de um marcador glomerular, em algumas modalidades, a população de células B4' é capaz de expressão de eritropoietina (EPO) sintonizável por oxigênio.
[0082] Em uma modalidade, a formulação contém população de células B4, mas não inclui uma população de células B2 compreendendo células tubulares tendo uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL. Em outra modalidade, a formulação população de células B4' não inclui uma população de células B1 que compreende células grandes granulares do sistema de ducto de coleta de tubulares e tendo uma densidade de <1,045 g/mL. Em ainda outra modalidade, a formulação população de células B4' não inclui uma população de células B5 compreendendo detritos e células pequenas e de baixa granularidade e viabilidade com uma densidade de> 1,091 g/mL.
[0083] Em uma modalidade, a formulação contendo população de células B4' não inclui uma população de células B2 compreendendo as células tubulares tendo uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL; uma população de células B1 compreendendo grandes células granulares do sistema de ducto de coleta tubulares e tendo uma densidade de <1,045 g/mL; e uma população de células B5 compreendendo detritos e pequenas células de granularidade baixa e viabilidade com uma densidade de > 1,091 g/mL. Em algumas modalidades, a população de células B4' pode ser derivada a partir de um indivíduo com doença renal.
[0084] Em um aspecto, a presente invenção proporciona formulações contendo misturas de células renais humanas compreendendo uma primeira população celular, B2, compreendendo, uma população isolada de células tubulares enriquecidas com uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL, e uma segunda célula população, B4', compreendendo células produtoras de eritropoietina (IEP) e células vasculares, mas sem células glomerulares com uma densidade entre cerca de 1,063 g/mL e 1,091 g/mL, em que a mistura não inclui uma população de células que compreende células B1 grandes granulares do sistema de ducto de coleta e tubular e tendo uma densidade de < 1,045 g/mL, ou uma população de células B5 compreendendo detritos e pequenas células de granularidade baixa e viabilidade com uma densidade de > 1,091 g/mL. Em certas modalidades, a população de células B4' é caracterizada pela expressão de um marcador vascular. Em uma modalidade, a população de células B4' não é caracterizada pela expressão de um marcador glomerular. Em certas modalidades, B2 compreende ainda coletar células epiteliais do ducto. Em uma modalidade, a formulação contém uma mistura de células que é capaz de absorção de albumina mediada pelo receptor. Em outra modalidade, a mistura de células é capaz de expressão de eritropoietina (EPO) sintonizável por oxigênio. Em uma modalidade, a mistura contém células capazes de expressar TEM-2 de produzir e/ou estimular a produção de espécies de elevado peso molecular de ácido hialurônico (HA), tanto in vitro e in vivo. Em todas as modalidades, as primeira e segunda populações de células podem ser derivadas a partir de tecido de rim ou células de rim cultivadas (Basu et al, Lipids in Health and Disease, 2011, 10: 171).
[0085] Em uma modalidade, a formulação contém uma mistura que é capaz de proporcionar um estímulo regenerativo sobre a liberação in vivo. Em outras modalidades, a mistura é capaz de reduzir o declínio de, estabilizar, ou melhorar a filtração glomerular, reabsorção tubular, produção de urina, e/ou função endócrina sobre a liberação in vivo. Em uma modalidade, a população celular B4' é derivada de um indivíduo tendo doença renal.
[0086] Em um aspecto, a presente invenção proporciona formulações que contêm uma população de células B4' enriquecida isolada de células renais humanas compreendendo, pelo menos, uma das células produtoras de eritropoietina (EPO), células vasculares, e células glomerulares com uma densidade entre 1,063 g/mL e 1,091 g/mL. Em uma modalidade, a população de células B4' é caracterizada pela expressão de um marcador vascular. Em certas modalidades, a população de células B4' não é caracterizada pela expressão de um marcador glomerular. O marcador glomerular que não é expresso pode ser podocina. Em algumas modalidades, a população de células B4' é capaz de expressão de eritropoietina (EPO) sintonizável por oxigênio.
[0087] Em uma modalidade, a formulação contendo população de células B4' não inclui uma população de células B2 compreendendo as células tubulares tendo uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL Em outra modalidade, a formulação de população celular B4' não inclui uma população de células B1 compreendendo as células granulares grandes do sistema de ducto de coleta de tubulares e tendo uma densidade de < 1,045 g/mL. Em ainda outra modalidade, a formulação população de células B4' não inclui uma população de células B5 compreendendo detritos e células pequenas de baixa granularidade e viabilidade com uma densidade de > 1,091 g/mL.
[0088] Em uma modalidade, a formulação contendo população de células B4' não inclui uma população de células B2 compreendendo as células tubulares tendo uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL; uma população de células B1 compreendendo grandes células granulares do sistema de ducto de coleta de tubulares e tendo uma densidade de <1,045 g/mL; e uma população de células B5 compreendendo detritos e pequenas células de granularidade baixa e viabilidade com uma densidade de > 1,091 g/mL. Em algumas modalidades, a população de células B4' pode ser derivada a partir de um indivíduo com doença renal.
[0089] Em um aspecto, a presente invenção proporciona formulações contendo uma mistura de células renais humanas compreendendo uma primeira população celular, B2, compreendendo, uma população isolada de células tubulares enriquecidas com uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL, e uma segunda população de células, B4', compreendendo células produtoras de eritropoietina (EPO) e células vasculares, mas sem células glomerulares com uma densidade entre cerca de 1,063 g/mL e 1,091 g/mL, em que a mistura não inclui uma população de células B1 compreendendo células grandes granulares do sistema de ducto de coleta e tubular e tendo uma densidade de < 1,045 g/mL, ou uma população de células B5 compreendendo detritos e pequenas células de baixa granularidade e viabilidade com uma densidade de > 1,091 g/mL. Em certas modalidades, a população de células B4' é caracterizada pela expressão de um marcador vascular. Em uma modalidade, a população de células B4' não é caracterizada pela expressão de um marcador glomerular. Em certas modalidades, B2 compreende ainda células epiteliais de duto coletor. Em uma modalidade, a mistura de células é capaz de absorção de albumina mediada pelo receptor. Em outra modalidade, a mistura de células é capaz de expressão de eritropoietina (EPO) sintonizável por oxigênio. Em uma modalidade, a mistura contém células capazes de expressar HAS-2 de produzir e/ou estimular a produção de espécies de elevado peso molecular de ácido hialurônico (HA) in vitro e in vivo. Em todas as modalidades, a primeira e segunda populações de células podem ser derivadas a partir de tecido de rim ou de células de rim cultivadas.
[0090] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona formulações contendo uma população heterogênea de células renais que compreende uma combinação de frações de células ou populações de células enriquecidas (por exemplo, B1, B2, B3, B4 (ou B4'), e B5). Em uma modalidade, a combinação tem uma densidade de flutuação entre cerca de 1,045 g/mL e cerca de 1,091 g/mL. Em outra modalidade, a combinação tem uma densidade de flutuação entre menos do que cerca de 1,045 g/mL e cerca de 1,099 g/mL ou cerca de 1,100 g/mL. Em outra modalidade, a combinação tem uma densidade de flutuação tal como determinado por separação em um gradiente de densidade, por exemplo, por centrifugação. Em ainda outra modalidade, a combinação de frações de células contém B2, B3, B4 e (ou B4') esgotada de B1 e/ou B5. Em algumas modalidades, a combinação de frações de células contém B2, B3, B4 (ou B4') e B5, mas está esgotado de B1. Uma vez esgotada de B1 e/ou B5, a combinação pode ser subsequentemente cultivada in vitro antes para a preparação de uma formulação que compreende a combinação de B2, B3, B4 e (B4') ou frações de células.
[0091] Os inventores da presente invenção descobriram surpreendentemente que a cultura in vitro de uma combinação de B2, B3, B4, e B5 esgotado em B1 resulta na depleção de B5. Em uma modalidade, B5 está esgotada depois de pelo menos uma, duas, três, quatro, ou cinco passagens. Em outra modalidade, a combinação de fração de células B2, B3, B4 e B5 que é passada sob as condições aqui descritas proporciona uma população de células passadas tendo B5 em uma percentagem que é menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1%, ou menos do que cerca de 0,5% da população de células passadas.
[0092] Em outra modalidade, B4' é parte da combinação de frações de células. Em outra modalidade, a depleção de cultura in vitro de B5 é sob condições hipóxicas.
[0093] Em uma modalidade, a formulação contém um aditivo que é capaz de proporcionar um estímulo regenerativo sobre a liberação in vivo. Em outras modalidades, a mistura é capaz de reduzir o declínio de, estabilizar, ou melhorar filtração glomerular, reabsorção tubular, produção de urina, e/ou função endócrina sobre a liberação in vivo. Em uma modalidade, a população de células B4' é derivada de um indivíduo que tem doença renal.
[0094] Em uma modalidade preferencial, a formulação contém uma mistura que compreende B2 em combinação com B3 e/ou B4. Em outra modalidade preferencial, a mistura compreende B2, em combinação com B3 e/ou B4'. Em outras modalidades preferenciais, a mistura consiste em ou consiste essencialmente em (i) B2 em combinação com B3 e/ou B4; ou (ii) B2 em combinação com B3 e/ou B4'.
[0095] As misturas que contêm uma população celular B4' podem conter populações de células B2 e/ou B3 que são também obtidas a partir de um indivíduo não saudável. O indivíduo não saudável pode ser o mesmo indivíduo a partir da qual a fração B4' foi obtida. Em contraste com a população de célula B4', as populações celulares B2 e B3 obtidas a partir de indivíduos não saudáveis são tipicamente não deficientes em um ou mais tipos celulares em comparação com uma população de células derivadas a partir do rim de um indivíduo saudável.
[0096] Conforme descrito em Presnell et al. WO/2010/056328, verificou-se que as preparações de células B2 e B4 são capazes de expressar as espécies de peso molecular mais elevados de ácido hialurônico (HA) in vitro e in vivo, através das ações de ácido hialurônico sintetase-2 (HAS-2), um marcador que é enriquecido mais especificamente na população de células B2. O tratamento com B2 em um modelo 5/6 Nx demonstrou reduzir a fibrose, concomitante com forte expressão de HAS-2 in vivo e a produção esperada de HA de elevado peso molecular dentro do tecido tratado. Notavelmente, o modelo 5/6 Nx deixado sem tratamento resultou em fibrose com detecção limitada de HAS-2 e pouca produção de HA de alto peso molecular. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, é uma hipótese de que esta espécie anti-inflamatória de alto peso molecular de HA produzida predominantemente por B2 (e, até certo ponto por B4) atua sinergicamente com as preparações de células na redução da fibrose renal e no auxílio de regeneração renal. Por conseguinte, a presente descrição inclui formulações que contêm as células renais bioativas aqui descritas, juntamente com um biomaterial compreendendo ácido hialurônico. Também contemplado pela presente descrição é o fornecimento de um componente do biomaterial do estímulo de regeneração através de produção direta ou a estimulação da produção pelas células implantadas.
[0097] Em um aspecto, a presente invenção proporciona formulações que contêm populações heterogêneas de células renais isoladas produtoras de EPO para o uso no tratamento da doença renal, anemia e/ou deficiência de EPO em um indivíduo com essa necessidade. Em uma modalidade, as populações de células são derivadas de uma biopsia renal. Em outra modalidade, as populações celulares são derivadas a partir de tecido de rim todo. Em outra modalidade, as populações de células são derivadas a partir de culturas in vitro de células renais de mamíferos, estabelecidas a partir de biópsias de rim ou tecido de rim todo. Em todas as modalidades, estas populações são populações de células não fracionadas, também aqui referidas como populações celulares não enriquecidas.
[0098] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona formulações que contêm populações isoladas de células renais produtoras de eritropoietina (EPO) que são ainda mais enriquecidas de tal modo que a proporção de células produtoras de EPO na subpopulação enriquecida é maior em relação à proporção de células produtoras de EPO na população de células de partida ou inicial. Em uma modalidade, a fração de células produtoras de EPO enriquecida contém uma maior proporção de fibroblastos intersticiais e uma menor proporção de células tubulares em relação aos fibroblastos intersticiais e células tubulares contidas na população inicial não enriquecida. Em certas modalidades, a fração de células produtoras de EPO enriquecidas contém uma maior proporção de células glomerulares e células vasculares e uma menor proporção de células do ducto coletor relativos às células glomerulares, células vasculares e células de duto de coleta contido na população inicial não enriquecidas. Em tais modalidades, estas populações são aqui referidas como a população de células "B4".
[0099] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona formulações que contêm uma população de células renais produtoras de EPO que é misturada com um ou mais populações de células renais. Em uma modalidade, a população de células produtoras de EPO é uma primeira população celular enriquecida em células produtoras de EPO, por exemplo, B4. Em outra modalidade, a população de células produtoras de EPO é uma primeira população de células que não é enriquecida para células produtoras de EPO, por exemplo, B2. Em outra modalidade, a primeira população de células é misturada com uma segunda população de células renais. Em algumas modalidades, a segunda população celular é enriquecida para células tubulares, que podem ser demonstradas pela presença de um fenótipo de células tubulares. Em outra modalidade, o fenótipo celular tubular pode ser indicado pela presença de um marcador de células tubulares. Em outra modalidade, o fenótipo celular tubular pode ser indicado pela presença de um ou mais marcadores de células tubulares. Os marcadores de células tubulares incluem, entre outros, megalina, cubilina, sintase de ácido hialurônico 2 (HAS2), vitamina D3 25-Hidroxilase (CYP2D2S), N- caderina (Ncad), E-caderina (Ecad), Aquaporina-1 (Aqp1), Aquaporina- 2 (Aqp2), RAB17, família de oncogene membro RAS (Rab17), proteína de ligação GATA 3 (Gata3), regulador de transporte de íon contendo domínio FXYD 4 (Fxyd4), família portadora de soluto 9 (troca de hidrogênio/sódio), membro 4 (Slc9a4), família aldeído desidrogenase 3, membro B1 (Aldh3b1), família aldeído desidrogenase 1, membro A3 (Aldh1a3), e Calpaina-8 (Capn8). Em outra modalidade, a primeira população de células é misturada com pelo menos um de vários tipos de células renais incluindo, entre outros, as células derivadas do interstício, células tubulares, células derivadas de ducto coletor, as células derivadas do glomérulo, e/ou células derivadas do sangue ou vasculatura.
[00100] As formulações da presente invenção podem incluir populações de células renais produtoras de EPO contendo B4 ou B4' sob a forma de uma mistura com B2 e/ou B3, ou sob a forma de uma população de célula enriquecidas, por exemplo, B2 + B3 + B4/B4'.
[00101] Em um aspecto, a formulação contém populações de células renais produtoras de EPO, que são caracterizadas por expressão de EPO e bioresponsivas ao oxigênio, de tal modo que uma redução da tensão de oxigênio dos resultados do sistema de cultura em uma indução da expressão de EPO. Em uma modalidade, as populações de células produtoras de EPO são enriquecidas para as células produtoras de EPO. Em uma modalidade, a expressão de EPO é induzida quando a população de células é cultivada sob condições em que as células são sujeitas a uma redução nos níveis de oxigênio disponíveis no sistema de cultura em comparação com uma população de células cultivadas em níveis atmosféricos normais (~ 21%) de oxigênio disponível. Em uma modalidade, células produtoras de EPO cultivadas em condições de níveis de oxigênio inferiores expressam maiores níveis de EPO em relação às células produtoras de EPO cultivadas em condições normais de oxigênio. Em geral, a cultura de células com níveis reduzidos de oxigênio disponível (também referido como condições de cultura hipóxicas) significa que o nível de redução de oxigênio é reduzido em relação à cultura de células em níveis atmosféricos normais de oxigênio disponíveis (também referido como condições de cultura normais ou normóxicas). Em uma modalidade, as condições de cultura de células hipóxicas incluem a cultura de células em cerca de 1% de oxigênio, menos do que cerca de 2% de oxigênio, menos do que cerca de 3% de oxigênio, menos do que cerca de 4% de oxigênio, ou cerca de menos de 5% de oxigênio. Em outra modalidade, as condições de cultura normais ou normóxicas incluem a cultura de células em cerca de 10% de oxigênio, de cerca de 12% de oxigênio, de cerca de 13% de oxigênio, de cerca de 14% de oxigênio, de cerca de 15% de oxigênio, cerca de 16% de oxigênio, de cerca de 17% de oxigênio, de cerca de 18 % de oxigênio, de cerca de 19% de oxigênio, de cerca de 20% de oxigênio, ou cerca de 21% de oxigênio.
[00102] Em outra modalidade, a indução ou o aumento da expressão de EPO é obtido e pode ser observado através da cultura de células em cerca de menos de 5% de oxigênio disponível e comparando os níveis de expressão de EPO para células cultivadas em oxigênio atmosférico (cerca de 21%). Em outra modalidade, a indução de EPO é obtida em uma cultura de células capazes de expressar EPO por um método que inclui uma primeira fase de cultura na qual a cultura de células é cultivada em oxigênio atmosférico (cerca de 21%) durante um certo período de tempo e uma segunda fase de cultura em que os níveis de oxigênio disponíveis são reduzidos e as mesmas células são cultivadas a cerca de menos de 5% de oxigênio disponível. Em outra modalidade, a expressão de EPO que é sensível às condições de hipóxia é regulada por HIF1α. Os especialistas na técnica irão apreciar que outras condições de cultura de manipulação de oxigênio conhecidas na técnica podem ser utilizadas para as células aqui descritas.
[00103] Em um aspecto, a formulação contém populações enriquecidas de células de mamíferos produtoras de EPO, caracterizada pela bio-resposta (por exemplo, expressão de EPO) para condições de perfusão. Em uma modalidade, as condições de perfusão incluem condições transientes, intermitentes, ou de fluxo de fluido contínuo (perfusão). Em uma modalidade, a expressão de EPO é mecanicamente induzida quando o meio em que as células são cultivadas é intermitentemente ou continuamente circulado ou agitado de tal forma que as forças dinâmicas são transferidas para as células através do fluxo. Em uma modalidade, as células submetidas à fluxo transiente, intermitente, ou fluido contínuo são cultivadas de modo que estão presentes como estruturas tridimensionais em ou sobre um material que proporciona estrutura e/ou o espaço de tais estruturas tridimensionais para formar. Em uma modalidade, as células são cultivadas em grânulos porosos e submetido a fluxo de fluido intermitente ou contínuo por meio de uma plataforma de agitação, plataforma orbital, ou frasco com agitação. Em outra modalidade, as células são cultivadas em estruturas tridimensionais e colocadas em um dispositivo em que a estrutura é estacionária e fluido flui direcionalmente através da estrutura. Os especialistas na técnica irão apreciar que outras condições de cultura de perfusão conhecidas na técnica podem ser utilizadas para as células aqui descritas.
Agregados celulares
[00104] Em outro aspecto, as formulações da presente invenção contêm agregados celulares ou esferoides. Em uma modalidade, o agregado celular compreende uma população de células bioativas aqui descrito. Em outra modalidade, o agregado celular compreende células renais bioativas, tais como, por exemplo, misturas de células renais, populações enriquecidas de células renais, e combinações de frações de células renais.
[00105] Em certas modalidades, as células renais bioativas da divulgação podem ser cultivadas em formatos 3D, como descrito adicionalmente aqui. Em algumas modalidades, o termo "organoide" refere-se a uma acumulação de células com um fenótipo e/ou função, consistente com um rim nativo. Em algumas modalidades, organoides compreendem populações mistas de células, de uma variedade de linhagens, que são encontrados tipicamente no in vivo em um dado tecido, em algumas modalidades, os organoides da presente divulgação são formados in vitro, através de qualquer meio, através do qual as células dos agregados formam agregados, que por sua vez podem formar esferoides, organoides, ou uma combinação dos mesmos. Tais agregados, esferoides ou organoides, em algumas modalidades, assume uma estrutura consistente com um órgão em particular. Em algumas modalidades, tais agregados, esferoides ou organoides, marcadores de superfície expressas, que são normalmente expressas pelas células do órgão particular. Em algumas modalidades, tais agregados esferoides, ou organoides, produzem compostos ou materiais, que são normalmente expressos pelas células do órgão em particular. Em certas modalidades, as células da divulgação podem ser cultivadas em substratos naturais, por exemplo, gelatina. Em outras modalidades, as células da divulgação podem ser cultivadas em substratos sintéticos, por exemplo, PGLA.
Populações de células inativas
[00106] Tal como aqui descrito, determinadas subfrações de uma população heterogênea de células renais enriquecidas em componentes bioativos e esgotadas de componentes inativos ou indesejados, fornecem resultados terapêuticos e regenerativos superiores do que a população de partida. Em modalidades preferenciais, as formulações fornecidas pela presente revelação contêm populações celulares que são desprovidas de populações de células B1 e/ou B5. Por exemplo, o seguinte pode ser esgotado de B1 e/ou B5: misturas de dois ou mais de B2, B3 e B4 (ou B4'); uma população de células enriquecidas em B2, B3, e B4 (ou B4').
[00107] A população de células B1 compreende células grandes, granulares, do sistema de ducto de coleta e tubular, com as células da população tendo uma densidade flutuante inferior a cerca de 1,045 g/m. A população de células B5 é composta de detritos e células pequenas de baixa granularidade e viabilidade e tendo uma densidade flutuante superior a cerca de 1,091 g/mL. Métodos de isolamento e cultura de populações de células
[00108] Em um aspecto, as formulações da presente invenção contêm populações de células que foram isoladas e/ou em cultura de tecido de rim. Métodos são aqui proporcionados para separar e isolar os componentes celulares renais, por exemplo, populações celulares enriquecidas que serão utilizadas nas formulações para uso terapêutico, incluindo o tratamento da doença renal, anemia, deficiência de EPO, deficiência de transporte tubular, e deficiência de filtração glomerular. Em uma modalidade, as populações celulares são isoladas a partir de tecido renal recém-digeridos, isto é, mecanicamente ou enzimaticamente digeridos, ou a partir de culturas heterogêneas in vitro de células renais de mamífero.
[00109] As formulações podem conter misturas heterogêneas de células renais que foram cultivadas em condições de cultura de hipóxia antes da separação em gradiente de densidade fornece maior distribuição e composição de células em ambas frações B4, incluindo B4', e B2 e/ou B3. O enriquecimento de células dependentes de oxigênio em B4 de B2 foi observado para células renais isoladas a partir de ambos os rins de doentes e não doentes. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, isto pode ser devido a um ou mais dos seguintes fenômenos: 1) a sobrevivência seletiva, morte, ou a proliferação de componentes celulares específicos durante o período de cultura hipóxica; 2) alterações na granularidade celular e/ou do tamanho em resposta à cultura hipóxica, efetuando assim alterações na densidade flutuante e localização posterior durante a separação por gradiente de densidade; e 3) alterações na expressão de gene de células/proteína em resposta ao período de cultura em hipóxia, resultando assim em características diferenciais das células dentro de qualquer dada fração do gradiente. Assim, em uma modalidade, as formulações contêm populações de células enriquecidas em células tubulares, por exemplo, B2, são resistentes à hipóxia.
[00110] Exemplos de técnicas para separar e isolar as populações de células incluem a separação em um gradiente de densidade com base na gravidade específica diferencial de diferentes tipos de células contidas dentro da população de interesse. A gravidade específica de um determinado tipo celular pode ser influenciada pelo grau de granularidade dentro das células, o volume de água intracelular, e outros fatores. Em um aspecto, a presente invenção proporciona condições ideais para o isolamento de gradiente das preparações de células, por exemplo, B2 e B4, incluindo B4', em várias espécies, incluindo, entre outras, humano, canino e roedores. Em uma modalidade preferencial, um gradiente de densidade é usado para obter uma nova população enriquecida de fração de células tubulares, isto é, população de células B2, derivadas a partir de uma população heterogênea de células renais. Em uma modalidade, um gradiente de densidade é usado para obter uma nova população enriquecida de fração de células produtoras de EPO, ou seja, população de células B4, derivadas a partir de uma população heterogênea de células renais. Em outras modalidades, um gradiente de densidade é usado para obter subpopulações enriquecidas de células tubulares, células glomerulares, e células endoteliais de rim. Em uma modalidade, ambas células produtoras de EPO e tubulares são separadas dos glóbulos vermelhos e os detritos celulares. Em uma modalidade, as células produtoras de EPO, glomerulares, e vasculares são separadas a partir de outros tipos de células e de células vermelhas do sangue e dos detritos celulares, ao passo que uma subpopulação de células tubulares e células do ducto coletor são concomitantemente separadas de outros tipos de células e de células vermelhas do sangue e os detritos celulares. Em outra modalidade, as células endócrinas, glomerulares e/ou vasculares são separadas a partir de outros tipos de células e de células vermelhas do sangue e dos detritos celulares, enquanto que uma subpopulação de células tubulares e células do ducto coletor são concomitantemente separadas de outros tipos de células e de células vermelhas do sangue e os detritos celulares.
[00111] Em um aspecto, as formulações da presente invenção contêm populações celulares geradas usando, em parte, o meio de gradiente de densidade OPTIPREP® (Axis-Shield), compreendendo 60% de composto iodixanol iodado não iônico em água, com base em determinadas características principais descritas abaixo. Um perito na técnica, no entanto, irá reconhecer que qualquer gradiente de densidade ou por outros meios, por exemplo, a separação imunológica utilizando marcadores de superfície celular conhecidos na técnica, que compreendem as características necessárias para isolar populações de células da presente descrição podem ser usadas. Deve também ser reconhecido por um especialista na técnica que as mesmas características celulares que contribuem para a separação de subpopulações celulares através de gradientes de densidade (tamanho e granulosidade) podem ser exploradas para separar subpopulações celulares através de citometria de fluxo (dispersão para frente = reflexo de tamanho através de citometria de fluxo e dispersão lateral = um reflexo de granularidade). Mais importante, o meio de gradiente de densidade deve ter uma reduzida toxicidade para as células específicas de interesse. Enquanto o meio de gradiente de densidade deve ter uma reduzida toxicidade para as células específicas de interesse, a presente descrição contempla a utilização de meios de gradiente que desempenham um papel no processo de seleção das células de interesse. Sem se pretender ficar limitado pela teoria, parece que as populações de células divulgadas aqui recuperadas pelo gradiente de iodixanol compreendendo iodixanol são resistentes, como há uma perda significativa de células entre as etapas de carregamento e de recuperação, o que sugere que a exposição ao iodixanol sob as condições de gradiente leva a eliminação de certas células. As células que aparecem nas bandas específicas após o gradiente de iodixanol são resistentes a todos os efeitos indesejáveis de iodixanol e/ou exposição de gradiente de densidade.
[00112] Consequentemente, a utilização de meios de contraste adicional que são suaves para nefrotoxinas no isolamento e/ou a seleção das populações de células para as formulações aqui descritas moderada é também contemplada, além disso, o meio de gradiente de densidade também não deve ligar-se às proteínas no plasma humano ou prejudicar funções chave das células de interesse.
[00113] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona formulações contendo populações de células que foram enriquecidas e/ou esgotados de tipos de células renais usando classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Em uma modalidade, os tipos de células renais podem ser enriquecidos e/ou esgotados usando BD FACSAria ™ ou equivalente.
[00114] Em outro aspecto, as formulações contêm populações de células que tenham sido enriquecidas e/ou esgotadas em tipos de células renais, utilizando separação de células magnéticas. Em uma modalidade, os tipos de células renais podem ser enriquecidos e/ou esgotados usando o sistema Miltenyi autoMACS® ou equivalente.
[00115] Em outro aspecto, as formulações podem incluir populações de células renais que tenham sido objeto de cultura tridimensional. Em um aspecto, os métodos de cultura das populações de células são por perfusão contínua. Em uma modalidade, as populações de células cultivadas por meio de cultura tridimensional e a perfusão contínua demonstram maior celularidade e interconectividade quando em comparação com populações de células cultivadas estaticamente. Em outra modalidade, as populações de células cultivadas por meio de cultura de três dimensões e a perfusão contínua demonstram uma maior expressão de EPO, bem como um aumento da expressão de genes de túbulos renais associados, tais como e-caderina, quando comparado às culturas estáticas de tais populações de células. Em ainda outra modalidade, as populações de células cultivadas por meio de perfusão contínua, demonstram maiores níveis de glicose e o consumo de glutamina quando comparados com populações de células em cultura estática.
[00116] Tal como aqui descrito, condições de baixa ou hipóxicas de oxigênio podem ser utilizadas nos métodos para preparar as populações de células para as formulações aqui previstas. No entanto, os métodos de preparação de populações de células podem ser utilizados sem a etapa de condicionamento de baixo teor de oxigênio. Em uma modalidade, podem ser utilizadas condições de normóxia.
[00117] Os especialistas na técnica apreciarão que outros métodos de isolamento e cultura conhecidos na técnica podem ser utilizados para as células aqui descritas.
3. Biomateriais
[00118] Uma variedade de biomateriais pode ser combinada com um agente ativo para fornecer as formulações terapêuticas da presente divulgação. Os materiais biológicos podem ser em qualquer forma adequada (por exemplo, grânulos) ou forma (por exemplo, líquido, gel, etc.). Tal como descrito em Bertram et al. Pedido Publicado US 20070276507 (aqui incorporada por referência na sua totalidade), matrizes poliméricas ou estruturas podem ser moldadas em qualquer número de configurações desejáveis para satisfazer qualquer número de restrições do sistema global, de geometria ou espaço. Em uma modalidade, as matrizes ou suportes da presente divulgação podem ser tridimensionais e moldadas para estar de acordo com as dimensões e formas de uma estrutura de órgão ou tecido. Por exemplo, na utilização da estrutura polimérica para tratamento de doença renal, anemia, deficiência de EPO, a deficiência de transporte tubular, ou deficiência de filtração glomerular, uma matriz tridimensional (3-D) pode ser utilizada. Pode ser utilizada uma variedade de diferentes formatos de suportes 3-D. Naturalmente, a matriz polimérica pode ser moldada em diferentes tamanhos e formas para estar em conformidade com os pacientes de diferentes tamanhos. A matriz polimérica também pode ser moldada em outras formas de acomodar as necessidades especiais do paciente. Em outra modalidade, a matriz polimérica ou estrutura pode ser um biocompatível, estrutura porosa polimérica. Os suportes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais sintéticos ou que ocorrem naturalmente, incluindo, entre outros, ácido poliláctico de células abertas (OPLA®), éter de celulose, celulose, éster de celulose, polietileno fluorado, fenólicos, poli-4-metilpenteno, poliacrilonitrila, poliamida, poliamidaimida, poliacrilato, polibenzoxazol, policarbonato, policianoariléter, poliéster, poliestercarbonato, poliéter, polieteretercetona, polieterimida, polietercetona, polietersulfona, polietileno, polifluorolefina, poliimida, polioiefina, polioxadiazol, polifenileno óxido, sulfureto de polifenileno, polipropileno, poliestireno, polissulfureto, polissulfona, politetrafluoretileno, politioéter, politriazol, poliuretano, polivinil, fluoreto de polivinilideno, celulose regenerada, de silicone, ureia-formaldeído, colágeno, gelatina, alginato, lamininas, fibronectina, seda, elastina, alginato, ácido hialurônico, agarose, ou copolímeros ou misturas físicas destes. As configurações de estruturas podem variar de suspensões líquidas a estruturas porosas macias a rígidos, estruturas porosas de retenção de forma. Em uma modalidade, a configuração é a forma líquida de uma solução que é capaz de se tornar um hidrogel.
[00119] Hidrogeis podem ser formados a partir de uma variedade de materiais poliméricos e são úteis em uma variedade de aplicações biomédicas. Hidrogeis podem ser descritos como redes fisicamente tridimensionais de polímeros hidrofílicos. Dependendo do tipo de hidrogel, estes contêm várias percentagens de água, mas não se dissolvem completamente na água. Apesar do seu elevado teor de água, hidrogeis são capazes de ligar adicionalmente grandes volumes de líquido devido à presença de resíduos hidrofílicos. Hidrogeis incham extensivamente sem alterar sua estrutura gelatinosa. As características físicas de base de hidrogel podem ser especificamente modificadas, de acordo com as propriedades dos polímeros utilizados e os equipamentos especiais adicionais dos produtos.
[00120] Preferencialmente, o hidrogel é feito de um polímero, um material biologicamente derivado, um material ou combinações dos mesmos derivados sinteticamente, que é biologicamente inerte e fisiologicamente compatíveis com os tecidos de mamíferos. O material de hidrogel preferencialmente não induz uma resposta inflamatória. Exemplos de outros materiais que podem ser utilizados para formar um hidrogel incluem (a) alginatos modificados, (b) polissacarídeos (por exemplo, de goma de gelano e carragenanos) que gelificam por exposição a cátions monovalentes, (c) polissacarídeos (por exemplo, ácido hialurônico) que são líquidos muito viscosos ou são tixotrópicos e formam um gel ao longo do tempo pela evolução lenta da estrutura, (d) gelatina ou colágeno, e (e) precursores de hidrogel poliméricos (por exemplo, copolímeros de blocos óxido de polietileno-polipropileno glicol e proteínas). Pat. US No. 6.224.893 B1 fornece uma descrição detalhada dos vários polímeros, e as propriedades químicas destes polímeros, que são apropriados para fazer hidrogeis.
[00121] Características de estruturas ou biomaterial podem permitir que as células sejam anexadas e interajam com o material de estruturas ou biomaterial, e/ou pode proporcionar espaços porosos dentro dos quais as células podem ser aprisionadas. Em uma modalidade, as matrizes porosas ou de biomateriais permitem a adição ou a deposição de uma ou mais populações ou misturas de células em um biomaterial configurado como uma estrutura porosa (por exemplo, por fixação das células) e/ou dentro dos poros da estrutura (por exemplo, por aprisionamento das células). Em outra modalidade, os suportes ou biomateriais permitem ou promovem as interações de célula:célula e/ou célula:biomateriais dentro da estrutura para formar construções, tal como aqui descrito.
[00122] Em uma modalidade, o biomaterial é constituído por ácido hialurônico (HA) na forma de hidrogel, contendo moléculas de HA que variam em tamanho de 5,1 kDA a > 2 x 106 kDa. Em outra modalidade, o biomaterial é composto de ácido hialurônico na forma de espuma porosa, contendo também moléculas de HA que variam em tamanho de 5,1 kDA a > 2 x 106 kDa. Em ainda outra modalidade, o biomaterial é composto de uma espuma a base de ácido poli-láctico (PLA), tendo uma estrutura de células abertas e tamanho de poro de cerca de 50 microns a cerca de 300 microns. Em ainda outra modalidade, as populações de células específicas, preferencialmente B2, mas também B4, fornecem diretamente e/ou estimulam a síntese de ácido hialurônico de alto peso molecular através de ácido hialurônico sintase-2 (TEM-2), especialmente após a implantação intrarrenal.
[00123] Os biomateriais aqui descritos podem também ser concebidos ou adaptados para responder a certas condições externas, por exemplo, in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, os biomateriais são sensíveis à temperatura (por exemplo, in vitro ou in vivo). Em outra modalidade, os biomateriais estão adaptados para responder a exposição à degradação enzimática (por exemplo, in vitro ou in vivo). A resposta dos biomateriais a condições externas pode ser afinada como aqui descrito. Sensibilidade à temperatura da formulação descrita pode ser variada através do ajuste da percentagem de um biomaterial na formulação. Por exemplo, a percentagem de gelatina em uma solução pode ser ajustada para modular a sensibilidade à temperatura da gelatina na formulação final (por exemplo, líquido, gel, grânulos, etc). Alternativamente, biomateriais podem ser quimicamente reticulados para proporcionar uma maior resistência à degradação enzimática. Por exemplo, um agente de reticulação de carbodi-imida pode ser utilizado para os grânulos de gelatina quimicamente reticulados proporcionando assim uma susceptibilidade reduzida para enzimas endógenas.
[00124] Em um aspecto, a resposta pelo biomaterial às condições externas diz respeito à perda de integridade estrutural do biomaterial. Embora a sensibilidade à temperatura e a resistência à degradação enzimática sejam fornecidos acima, existem outros mecanismos pelos quais a perda de integridade de material pode ocorrer em diferentes biomateriais. Estes mecanismos podem incluir, entre outros, termodinâmica (por exemplo, uma transição de fase, tal como fusão, difusão (por exemplo, a difusão de um agente de reticulação iônico a partir de um biomaterial para o tecido circundante)), química, enzimática, pH (por exemplo, lipossomas sensíveis a pH), ultrassom, e fotolábeis (penetração de luz). O mecanismo exato pelo qual o biomaterial perde integridade estrutural pode variar, mas tipicamente o mecanismo é acionado, no momento da implantação ou pós- implantação.
[00125] Os especialistas na técnica irão apreciar que outros tipos de materiais sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos na técnica podem ser utilizados para formar suportes, tal como aqui descrito.
[00126] Em um aspecto, as construções conforme aqui descrito são feitas a partir dos suportes poliméricos ou biomateriais acima referenciados.
4. Construções
[00127] Em um aspecto, a invenção proporciona formulações que contêm construções implantáveis que possuam uma ou mais das populações de células aqui descritas para o tratamento da doença renal, anemia ou deficiência de EPO em um indivíduo com essa necessidade. Em uma modalidade, a construção é feito de um material biocompatível ou biomaterial, estrutura ou matriz composta de um ou mais materiais biocompatíveis sintéticos ou de ocorrência natural e uma ou mais populações de células ou misturas de células aqui descritas depositadas sobre ou incorporadas em uma superfície da estrutura por ligação e/ou aprisionamento. Em certas modalidades, a construção é feito de um biomaterial e uma ou mais populações de células ou misturas de células aqui descritas revestidas com, depositadas sobre, depositadas em, ligadas a, aprisionados em, incorporadas em, semeadas, ou combinadas com os componentes biomateriais. Quaisquer das populações de células aqui descritas, incluindo populações de células enriquecidas ou misturas das mesmas, podem ser utilizadas em combinação com uma matriz para formar uma construção.
[00128] Em um aspecto, a formulação contém construções que são constituídas de biomateriais concebidos ou adaptados para responder a condições externas, tal como aqui descrito. Como resultado, a natureza da associação da população de células com o biomaterial em uma construção irá mudar, dependendo das condições externas. Por exemplo, a associação de uma população de células com um biomaterial sensível à temperatura varia com a temperatura. Em uma modalidade, a construção contém uma população celular e biomaterial tendo um estado substancialmente sólido a cerca de 8°C ou inferior e um estado substancialmente líquido a cerca da temperatura ambiente ou acima, em que a população de células é suspensa no biomaterial a cerca de 8°C ou inferior.
[00129] No entanto, a população de células é substancialmente livre para mover-se em todo o volume do biomaterial a cerca da temperatura ambiente ou acima. Tendo a população de células em suspensão na fase praticamente sólida a uma temperatura inferior fornece vantagens de estabilidade para as células, tais como por células dependentes de ancoragem, em comparação com células em um fluido. Além disso, com células em suspensão no estado sólido substancialmente fornece uma ou mais das seguintes vantagens: i) impede a sedimentação das células, ii) permite que as células permanecem ancoradas ao biomaterial em um estado suspenso; iii) permite que as células permaneçam mais uniformemente dispersas por todo o volume do biomaterial; iv) previne a formação de agregados celulares; e v) fornece melhor proteção para as células durante a armazenagem e transporte da formulação. Uma formulação que podem manter tais características que conduzem para a administração a um indivíduo é vantajosa porque, pelo menos, a saúde geral das células na formulação será melhor e uma dosagem mais uniforme e consistente de células será administrada.
[00130] Em outra modalidade, a população de células depositada ou componente celular da construção é uma primeira população de células renais enriquecidas para células produtoras de EPO sintonizáveis por oxigênio. Em outra modalidade, a primeira população de células renais contém células glomerulares e vasculares em adição às células produtoras de EPO sintonizáveis por oxigênio. Em uma modalidade, a primeira população de células renais é uma população de células B4'. Em outra modalidade, a população de células depositada ou componentes celulares da construção inclui ambas a primeira população de células renais enriquecida e a segunda população de células renais. Em algumas modalidades, a segunda população de células não é enriquecida para células produtoras de EPO de sintonizável por oxigênio. Em outra modalidade, a segunda população de células é enriquecida para células tubulares renais. Em outra modalidade, a segunda população celular é enriquecida para células tubulares renais e contém células epiteliais do ducto coletor. Em outras modalidades, as células tubulares renais são caracterizadas pela expressão de um ou mais marcadores de células tubulares que podem incluir, entre outros, megalina, cubina, ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), Vitamina D3 25-hidroxilase (CYP2D25), N-caderina (cad), E- caderina (Ecad), Aquaporina-1 (Aqp1), Aquaporina-2 (Aqp2), RAB17, família de oncogene membro RAS (Rabl7), proteína de ligação GATA 3 (Gata3), regulador de transporte de íon contendo domínio FXYD 4 (Fxyd4), família portadora de soluto 9 (troca de hidrogênio/sódio), membro 4 (Slc9a4), família aldeído desidrogenase 3, membro B1 (AldhSbl), família aldeído desidrogenase 1, membro A3 (Aldhla3), e Calpain-8 (Capn8).
[00131] Em uma modalidade, as populações de células depositadas sobre ou combinadas com biomateriais ou estruturas para formar construções são derivadas de uma variedade de fontes, tais como fontes autólogas. Fontes não autólogas também são adequadas para utilização, incluindo, entre outros, fontes alogênicas, ou singeneicas (autogeneicas ou isogeneicas).
[00132] Os especialistas na técnica irão apreciar que existem vários métodos adequados para a deposição ou de outra forma combinando as populações de células com biomateriais para formar uma construção.
[00133] Em um aspecto, as construções são adequados para utilização nos métodos de utilização aqui descritos. Em uma modalidade, as construções são adequados para administração a um indivíduo em necessidade de tratamento para uma doença renal de qualquer etiologia, anemia ou deficiência de EPO de qualquer etiologia. Em outras modalidades, as construções são a para administração a um indivíduo em necessidade de uma melhoria ou restauração da homeostase de eritroide. Em outra modalidade, as construções são adequadas para administração a um indivíduo em necessidade de melhoria da função renal.
[00134] Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona uma construção para implantação em um indivíduo com necessidade de uma melhor função renal, que compreende; a) um biomaterial que compreende um ou mais polímeros sintéticos biocompatíveis, ou proteínas ou peptídeos de ocorrência natural; e b) uma mistura de células de mamíferos renais derivadas de um indivíduo com doença renal, compreendendo uma primeira população celular, B2, compreendendo, uma população enriquecida de células tubulares isoladas tendo uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL e uma segunda população de células, B4', compreendendo células produtoras de eritropoietina (EPO) e células vasculares, mas esgotada em células glomerulares com uma densidade entre 1,063 g/mL e 1,091 g/mL, revestidas com, depositadas sobre ou dentro, aprisionadas em, suspensas em, incorporadas em e/ou associadas de outra forma com o biomaterial. Em certas modalidades, a mistura não inclui uma população celular B1 compreendendo grandes células granulares do sistema de ducto coletor e tubular com uma densidade de < 1,045 g/mL, ou uma população de células B5 compreendendo detritos e células pequenas e de baixa granularidade e viabilidade com uma densidade de > 1,091 g/mL.
[00135] Em uma modalidade, a construção inclui uma população de células B4' que se caracteriza pela expressão de um marcador vascular. Em algumas modalidades, a população de células B4' não é caracterizada pela expressão de um marcador glomerular. Em certas modalidades, a mistura é capaz de expressão de eritropoietina (EPO) sintonizável por oxigênio. Em todas as modalidades, a mistura pode ser derivada de tecido de rim de mamífero ou células renais em cultura.
[00136] Em uma modalidade, a construção inclui um biomaterial configurado como um biomaterial poroso tridimensional (3-D) adequado para aprisionamento e/ou fixação da mistura. Em outra modalidade, a construção inclui um biomaterial configurado como um líquido ou gel semi-líquido adequado para a aprisionar, anexar, suspender, ou revestir células de mamíferos. Em ainda outra modalidade, a construção inclui um biomaterial configurado composto de uma espécie de peso molecular elevado predominantemente de ácido hialurônico (HA) na forma de hidrogel. Em outra modalidade, a construção inclui um biomaterial formado por uma espécie de elevado peso molecular predominantemente de ácido hialurônico na forma de espuma porosa. Em ainda outra modalidade, a construção inclui um biomaterial composto de uma espuma a base de ácido poli-láctico com poros de entre cerca de 50 microns a cerca de 300 microns. Em ainda outra modalidade, a construção inclui uma ou mais populações de células que podem ser derivadas a partir de uma amostra de rim que é autóloga para o indivíduo em necessidade de melhoria da função renal. Em certas modalidades, a amostra é uma biopsia renal. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença renal. Em ainda outras modalidades, a população de células é derivada a partir de uma amostra de rim não autólogo. Em uma modalidade, a construção proporciona homeostase de eritroide.
5. Caracterização de fenótipo de células renais
[00137] As células isoladas em qualquer fase do processo podem ser caracterizadas pelo seu fenótipo. Em uma modalidade, as células são uma população heterogênea de células renais que foram enriquecidas. Em outra modalidade, a população heterogênea de células renais enriquecidas foi cultivada sob condições hipóxicas durante pelo menos 24 horas. Em uma ainda outra modalidade, a população heterogênea de células renais enriquecidas foi submetida a um gradiente de densidade.
[00138] A presença (por exemplo, a expressão) e/ou do nível/quantidade de diversos biomarcadores em uma amostra pode ser analisada por uma série de metodologias, muitas das quais são conhecidas na técnica e compreendidas pelos especialistas na técnica, incluindo, entre outras, imunohistoquímica ("IHC"), análise Western Blot, imunoprecipitação, ensaios de ligação molecular, ELISA, ELIFA, classificação de células ativada por fluorescência ("FACS"), MassARRAY, proteômica, ensaios de atividade bioquímica enzimática, hibridação in situ, análise Southern, análise Northern, sequenciamento de genoma completo, reação em cadeia da polimerase ("PGR") incluindo PCR quantitativo em tempo real ("qRT- PCR") e outros métodos de detecção de amplificação, tais como, por exemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA e semelhantes), RNA -Seq, FISH, análise de microarranjo, perfis de expressão de gene, e/ou análise em série da expressão genética ("SAGE"), bem como qualquer um da ampla variedade de ensaios que podem ser realizados por proteína, gene, e/ou análise de arranjos de tecidos. Protocolos típicos para avaliar o estado de genes e produtos de genes são encontrados, por exemplo, em Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) e 18 (Análise PGR). Imunoensaios multiplexados, tais como as disponíveis de Rules Bases Medicine ou Meso Scale Discovery também podem ser usados.
[00139] Em um aspecto, um método de detectar a presença de dois ou mais biomarcadores em uma amostra de células renais heterogênea é fornecido, o método compreendendo o contato da amostra com um anticorpo dirigido para um biomarcador sob condições permissivas para a ligação do anticorpo ao seu ligante cognato (ou seja, biomarcador), e detectar a presença do anticorpo ligado, por exemplo, através da detecção se um complexo é formado entre o anticorpo e o biomarcador. Em algumas modalidades, a detecção da presença de um ou mais biomarcadores é por imunohistoquímica.
[00140] Em certas modalidades, qualquer um dos anticorpos aqui proporcionados é útil para detectar a presença de um biomarcador em uma amostra de células renais heterogênea. O termo "detecção" tal como aqui utilizado, engloba a detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma amostra de SRC.
[00141] Em certas modalidades, as células renais heterogêneas são identificadas com um ou mais reagentes que permitem a detecção de um biomarcador selecionado a partir AQP1, AQP2, AQP4, Calbindina, calponina, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, C40 a 67, CK7, CK8, CK8/18, CK8/18/19, conexina 43, cubilina, CXCR4 (Fusina), DBA, E-caderina (CD324), EPO (eritropoietina), GGT1, GLEPP1 (proteína epitelial glomerular 1), Haptoglobulina, ItgB1 (Integrin β1), KIM-1/TIM-1 (molécula de lesão renal-1/ imunoglobulina de célula T e molécula contendo mucina), MAP-2 (proteína associada a microtúbulos 2), megalina, N-caderina, Nefrina, NKCC (Na-K-Cl-cotransportadores), OAT-1 (transportador aniônico orgânico 1), Osteopontina, Pan- caderina, PCLP1 (molécula tipo podocalixina 1), Podocina, SMA (alfa- actina de músculo liso), Sinaptopodina, THP (proteína de tamm- horsfall), Vimentina e αGST-1 (alfa glutationa S-transferase). Em certas modalidades, um biomarcador é detectado pelos anticorpos monoclonais ou policlonais.
[00142] Em uma modalidade, um marcador detectável compreende um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem 211At, 131l, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é utilizado para a detecção, este pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo, 99Tc-m (isômero nuclear metastável) ou 123I, ou um marcador de spin para imagiologia de ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecido como magnética ressonância, mri), tal como iodo-123, iodo- 131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[00143] No caso de mais do que um marcador detectável (incluindo um corante) é usado em um teste, é preferencial que os marcadores detectáveis sejam selecionados de tal modo que cada marcador pode ser detectado de forma independente, sem interferência substancial de quaisquer outros sinais detectáveis presentes na amostra. Por exemplo, os marcadores detectáveis (incluindo um corante) podem ser moléculas fluorescentes diferentes mostrando cores diferentes, na condição de detecção.
[00144] A detecção pode ser realizada por qualquer método adequado, por exemplo, aqueles com base em microscopia de imunofluorescência, citometria de fluxo, citometria de varredura por fibra óptica, ou citometria de varredura a laser.
[00145] Em algumas modalidades, a expressão de um biomarcador em uma célula é determinada através da avaliação de mRNA em uma célula. Métodos para a avaliação da mRNA em células são bem conhecidos e incluem, por exemplo, ensaios de hibridização usando sondas de DNA complementares (tais como hibridização in situ utilizando ribossondas marcadas específicas para os um ou mais genes, Northern blot e técnicas relacionadas) e vários ensaios de amplificação de ácido nucleico (tais como RT-PCR utilizando iniciadores complementares específicos para um ou mais dos genes e outros métodos de detecção de tipo de amplificação, tais como, por exemplo, DNA ramificado, SISBA, TA e semelhantes). Em algumas modalidades, a expressão de um biomarcador em uma amostra de teste é comparada com uma amostra de referência. Por exemplo, a amostra de teste pode ser uma amostra de tecido de paciente e a amostra de referência pode ser a partir de tecido normal.
[00146] As amostras provenientes de mamíferos pode ser convenientemente ensaiada para o mRNAs usando Northern, dot blot ou análise PGR. Além disso, tais métodos podem incluir uma ou mais etapas que permitem determinar os níveis de mRNA alvo em uma amostra biológica (por exemplo, por simultaneamente avaliando os níveis de controle em comparação com a sequência de mRNA de controle de um gene "housekeeping", tais como um membro da família de actina). Opcionalmente, a sequência do cDNA alvo amplificado pode ser determinada.
[00147] Métodos opcionais incluem protocolos que analisam ou detectam mRNA, tal como mRNA alvo, em uma amostra de tecido ou de células através de tecnologias de microarranjo. Utilizando microarranjos de ácidos nucleicos, as amostras de teste e mRNA de controle a partir de amostras de teste e de controle são objeto de transcrição reversa e marcadas para gerar sondas de cDNA. As sondas são então hibridizadas com um arranjo de ácidos nucleicos imobilizado em um suporte sólido. O arranjo é configurado de tal modo que a sequência e posição de cada membro do arranjo sejam conhecidos. Por exemplo, uma seleção de genes cuja expressão está correlacionada com uma população de células capazes de desencadear uma resposta regenerativa pode ser disposta em um suporte sólido. A hibridização de uma sonda marcada com um membro da matriz particular indica que a amostra a partir da qual a sonda foi derivada expressa esse gene.
[00148] De acordo com algumas modalidades, a presença e/ou do nível/quantidade é medida por meio da observação dos níveis de expressão de um gene de proteína acima mencionada. Em certas modalidades, o método compreende o contato da amostra biológica com anticorpos a um biomarcador aqui descrito sob condições permissivas para a ligação do biomarcador, e detectando se é formado um complexo entre os anticorpos e biomarcador.
[00149] Em certas modalidades, a presença e/ou nível/quantidade de proteínas em uma amostra de biomarcadores são examinados usando IHC e protocolos de coloração. A coloração IHC de células demonstrou ser um método fiável para determinar ou detectar a presença de proteínas em uma amostra. Em um aspecto, o nível de biomarcador é determinado usando um método compreendendo: (a) realizar a análise IHC de uma amostra (tal como uma amostra de células renais) com um anticorpo; e b) determinar o nível de um biomarcador na amostra. Em algumas modalidades, a intensidade da coloração IHC é determinada em relação a um valor de referência.
[00150] IHC pode ser realizada em combinação com técnicas adicionais tais como coloração morfológica e/ou fluorescência de hibridação in situ. Dois métodos gerais de IHC estão disponíveis; ensaios diretos e indiretos. De acordo com o primeiro ensaio, a ligação do anticorpo para o antígeno alvo é determinada diretamente. Este ensaio direto utiliza um reagente marcado, tal como um marcador fluorescente ou um anticorpo primário marcado com enzima, que pode ser visualizado sem interação adicional de anticorpo. Em um típico ensaio indireto, o anticorpo primário não conjugado se liga ao antígeno e, em seguida, um anticorpo secundário marcado liga-se ao anticorpo primário. Quando o anticorpo secundário é conjugado com um marcador enzimático, um substrato cromogênico ou fluorgênico é adicionado para proporcionar a visualização do antígeno. Amplificação de sinal ocorre porque vários anticorpos secundários podem reagir com diferentes epítopos no anticorpo primário.
[00151] O anticorpo primário e/ou secundário utilizado para a IHC serão tipicamente marcados com uma porção detectável. Numerosos marcadores estão disponíveis, que podem ser geralmente agrupados nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 12SI, 3H, e 131I; (b) partículas de ouro coloidal; (c) marcadores fluorescentes, incluindo, entre outros, quelatos de terras raras (quelatos de európio), vermelho do Texas, rodamina, fluoresceína, dansil, Lissamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina, ou fluoróforos disponíveis comercialmente como SPECTRUM ORANGE7 e SPECTRUM GREEN7 e/ou derivados de qualquer um ou mais dos acima; (v) vários marcadores de enzima-substrato são disponíveis e Patente US 4.275.149 proporciona uma revisão de alguns destes. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases enzimáticas (por exemplo, luciferase de vaga-lume e fuciferase bacteriana; Patente US 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidropbtalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina, β- galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glicose-oxidase, galactose-oxidase, e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina-oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes.
[00152] Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre (HRP) com peroxidase de hidrogênio como um substrato; fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenil como substrato cromogênico; e β-D-galactosidase (β-D- Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D- galactosidase) ou o substrato fluorgênico (por exemplo, 4- metilumbeliferil-β-D-galactosidase). Para uma revisão geral destas, ver Patente US 4.275.149 e 4.318.980.
[00153] Em um método exemplificativo, a amostra pode ser contatada com um anticorpo específico para o biomarcador sob condições suficientes para um complexo anticorpo-biomarcador para formar, em seguida, detectar o complexo. A presença do biomarcador pode ser detectada em um certo número de maneiras, tais como por Western blotting e procedimentos de ELISA para ensaiar uma grande variedade de tecidos e amostras, incluindo plasma ou soro. Uma ampla faixa de técnicas de imunoensaio que utilizam tal formato de ensaio está disponível, ver, por exemplo, Patentes US 4.016.043, 4.424.279 e 4.018.653. Estes incluem ambos ensaios de local único e de dois locais ou de "sanduíche" dos tipos não competitivos, assim como nos ensaios de ligação competitivos tradicionais. Estes ensaios incluem a ligação direta de um anticorpo marcado a um biomarcador alvo.
[00154] A presença e/ou nível/quantidade de um biomarcador selecionado em uma amostra de tecido ou de célula pode também ser examinada por meio de ensaios funcionais ou baseados em atividade. Por exemplo, se o marcador biológico é uma enzima, pode-se conduzir ensaios conhecidos na técnica para determinar ou detectar a presença da atividade enzimática determinada na amostra de tecido ou célula.
[00155] Em certas modalidades, as amostras são normalizadas para ambas as diferenças na quantidade de biomarcador ensaiado e a variabilidade na qualidade das amostras utilizadas, e a variabilidade entre as etapas do ensaio. Esta normalização pode ser realizada através da detecção e incorporando o nível de certos biomarcadores de normalização, incluindo genes de manutenção bem conhecidos, tais como ACTB. Alternativamente, a normalização pode ser baseada na média ou mediana de sinal de todos os genes ensaiados ou um grande subconjunto destes (abordagem de normalização global). Em uma base de gene a gene, a quantidade normalizada medida de um mRNA do tumor do indivíduo ou proteína é comparada com a quantidade encontrada em um conjunto de referência. Níveis de expressão normalizados para cada mRNA ou proteína por tumor testado por indivíduo podem ser expressos como uma percentagem do nível de expressão medido no conjunto de referência. A presença e/ou expressão de nível/quantidade medida em uma amostra de indivíduo particular a ser analisada irá falhar em algum percentil dentro desta faixa, o que pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica.
[00156] Em modalidades, a citoqueratina é selecionada a partir de CK8, CK18, CK19 e suas combinações. Em certas modalidades, a citoqueratina é CK8, CK18, CK19, CK8/CK18, CK8/CK19, CK18/CK19 ou CK8/CK18/CK19, em que o "/" refere-se a uma combinação das citoqueratinas adjacentes ao mesmo. Em todas as modalidades, a citoqueratina tem um nível de expressão superior a cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou cerca de 95%.
[00157] Em modalidades, o GGT é GGT-1. Em todas as modalidades o GGT tem um nível de expressão superior a cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 18%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50 %, cerca de 55%, ou cerca de 60%.
6. Métodos de uso
[00158] Em outro aspecto, as formulações da presente invenção podem ser administradas para o tratamento da doença. Por exemplo, as células bioativas podem ser administradas a um órgão nativo como parte de uma formulação aqui descrita. Em uma modalidade, as células bioativas podem ser originadas a partir do órgão nativo que é o objeto da administração ou a partir de uma fonte que não é o órgão alvo nativo.
[00159] Em um aspecto, a presente invenção proporciona métodos para o tratamento de uma doença renal, anemia ou deficiência de EPO em um indivíduo com essa necessidade, com as formulações contendo populações de células renais e misturas de células renais, tal como aqui descrito. Em uma modalidade, o método compreende a administração ao indivíduo de uma formulação que contém uma composição que inclui uma primeira população celular enriquecida em células renais produtoras de EPO. Em outra modalidade, a primeira população de células é enriquecida para células produtoras de EPO, as células glomerulares, e células vasculares. Em uma modalidade, a primeira população de células renais é uma população de células B4'. Em outra modalidade, a composição pode ainda incluir uma ou mais populações de células renais. Em uma modalidade, a população de células adicional é uma segunda população de células não enriquecidas em células produtoras de EPO. Em outra modalidade, a população de células adicional é uma segunda população de células não enriquecidas em células produtoras de EPO, células glomerulares, ou células vasculares. Em outra modalidade, a composição também inclui uma população de células renais ou da mistura de células renais depositada em, depositada sobre, incorporada em, revestida com, suspensa em, ou aprisionada em um biomaterial para formar uma construção implantável, tal como aqui descrito, para o tratamento de uma doença ou distúrbio aqui descritos. Em uma modalidade, as populações celulares são utilizadas isoladamente ou em combinação com outras células ou biomateriais, por exemplo, hidrogeis, matrizes porosas, ou peptídeos ou proteínas nativas ou sintéticas, para estimular a regeneração de estados de doença agudos ou crônicos.
[00160] Em outro aspecto, o tratamento eficaz de uma doença renal em um indivíduo através dos métodos aqui revelados pode ser observado através de vários indicadores de eritropoiese e/ou função renal. Em uma modalidade, os indicadores de homeostase de eritroide incluem, entre outros, hematócrito (HCT), hemoglobina (HB), média corpuscular de hemoglobina (MCH), contagem de células vermelhas do sangue (RBC), número de reticulócitos, % de reticulócitos, volume corpuscular médio (MCV) e largura de distribuição de glóbulos vermelhos (RDW). Em outra modalidade, os indicadores da função renal incluem, entre outros, albumina do soro, albumina de globulina (relação A/G), fósforo no soro, sódio no soro, tamanho dos rins (mensurável por ultrassom), cálcio no soro, relação de fósforo:cálcio, potássio no soro, proteinuria, creatinina na urina, creatinina no soro, nitrogênio de ureia no sangue (BUN), níveis de colesterol, níveis de triglicerídeos e taxa de filtração glomerular (GFR). Além disso, vários indicadores de saúde geral e bem-estar incluem, entre outros, o ganho ou perda de peso, sobrevivência, pressão arterial (pressão arterial sistêmica média, pressão arterial diastólica, ou pressão arterial sistólica), e desempenho resistência física.
[00161] Em outra modalidade, um tratamento eficaz com uma formulação de células renais bioativas é evidenciado por estabilização de um ou mais indicadores da função renal. A estabilização da função renal é demonstrada pela observação de uma mudança em um indicador em um objeto indivíduo tratado por um método previsto neste documento, em comparação com o mesmo indicador em um indivíduo que não foi tratado pelo método aqui. Alternativamente, a estabilização da função renal pode ser demonstrada pela observação de uma alteração no indicador em um indivíduo tratado por um método aqui em comparação com o mesmo indicador no mesmo indivíduo antes do tratamento. A mudança no primeiro indicador pode ser um aumento ou uma diminuição do valor. Em uma modalidade, o tratamento proporcionado pela presente revelação pode incluir a estabilização de níveis de nitrogênio da ureia no sangue (BUN) em um indivíduo onde os níveis de BUN observados no indivíduo são mais baixos quando comparados com um indivíduo com um estado de doença semelhante que não foi tratado pelos métodos da presente revelação. Em outra modalidade, o tratamento pode incluir a estabilização dos níveis de creatinina no soro de um indivíduo, onde os níveis de creatinina no soro observados no indivíduo são mais baixos quando comparados com um indivíduo com um estado de doença semelhante que não foi tratado pelos métodos da presente divulgação. Em outra modalidade, o tratamento pode incluir a estabilização de níveis de hematócrito (HCT) em um indivíduo onde os níveis observados no HCT no indivíduo são mais elevados, em comparação com um indivíduo com um estado de doença semelhante que não foi tratado pelos métodos da presente invenção. Em outra modalidade, o tratamento pode incluir a estabilização de níveis de células vermelhas do sangue (RBC) em um indivíduo em que os níveis de RBC observados no indivíduo são mais elevados, em comparação com um indivíduo com um estado de doença semelhante que não foi tratado pelos métodos da presente revelação. Os especialistas na técnica irão apreciar que um ou mais indicadores aqui descritos ou conhecidos na técnica podem ser medidos para determinar a eficácia do tratamento de uma doença renal no indivíduo.
[00162] Em outro aspecto, a presente divulgação refere-se às formulações para utilização em métodos de fornecer homeostase de eritroide em um indivíduo. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de (a) administrar ao indivíduo de uma formulação que contém uma população de células renais, por exemplo, B2 ou B4', ou mistura de células renais, por exemplo, B2/B4' e/ou B2/B3, ou uma população de células renais enriquecidas, tal como aqui descrito; e (b) determinação, em uma amostra biológica do indivíduo, que o nível de um indicador de eritropoiese é diferente em relação ao nível de um indicador no controle, em que a diferença de nível indicador (i) indica o indivíduo é responsivo à etapa de administrar (a), ou (ii) é indicativa da homeostase de eritroide no indivíduo. Em outra modalidade, o método inclui a etapa de (a) administração ao indivíduo de uma formulação que compreende uma população de células renais ou mistura de células renais, tal como aqui descrito; e (b) determinação, em uma amostra biológica do indivíduo, que o nível de um indicador de eritropoiese é diferente em relação ao nível de um indicador no controle, em que a diferença de nível indicador (i) indica que o indivíduo é responsivo às etapas de administrar, ou (ii) é indicativo da homeostase de eritroide no indivíduo. Em outra modalidade, o método inclui a etapa de (a) fornecimento de um biomaterial ou estrutura polimérica biocompatível; (b) depósito de uma população de células renais ou mistura células renais da presente invenção sobre ou no interior do biomaterial ou uma estrutura de um modo aqui descrito, para formar uma construção implantável; (c) preparação de uma formulação contendo a construção; (d) implantação da construção no indivíduo; e (e) determinar, em uma amostra biológica do indivíduo, que o nível de um indicador de eritropoiese é diferente em relação ao nível de um indicador no controle, em que a diferença de nível de indicador (i) indica o indivíduo é responsivo à etapa de administrar (a), ou (ii) é indicativo da homeostase de eritroide no indivíduo.
[00163] Em outro aspecto, a presente divulgação refere-se às formulações para uso em métodos para fornecer estabilização da função renal e restauração da homeostase de eritroide a um indivíduo com essa necessidade, o referido indivíduo tendo ambos um déficit na função renal e uma anemia e/ou deficiência de EPO. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de administrar uma formulação contendo uma população de células renais ou mistura de células renais aqui descritas que contêm, pelo menos, um dos seguintes tipos de células: as células derivadas tubulares, células derivadas de glomérulos, células derivadas intersticiais, células derivadas do ducto coletor, células derivadas de tecido estromal, ou células derivadas a partir da vasculatura. Em outra modalidade, a população ou mistura contém ambas células produtoras de EPO e as células epiteliais tubulares, as células tubulares foram identificadas por pelo menos um dos seguintes marcadores: megalina, cubilina, ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), vitamina D3 25-hidroxilase (CYP2D25), N-caderina (Ncad), E-caderina (Ecad), Aquaporina-1 (Aqp1), Aquaporina-2 (Aqp2), RAB17, família de oncogene membro RAS (Rabl7), proteína de ligação GATA 3 (Gatas), regulador de transporte de íon contendo domínio FXYD 4 (Fxyd4), família portadora de soluto 9 (troca de sódio/hidrogênio), membro 4 (Slc9a4), família aldeído desidrogenase 3, membro B1 (Aldh3bl), família aldeído desidrogenase 1, membro A3 (Aldhla3), e Calpain-8 (Capn8). Nesta modalidade, o tratamento do indivíduo seria demonstrado por uma melhoria em pelo menos um indicador da função renal com concomitante melhoria em pelo menos um indicador da eritropoiese, quando comparado com qualquer um indivíduo não tratado ou para indicadores de pré-tratamento do indivíduo.
[00164] Em um aspecto, a presente invenção proporciona formulações para utilização em métodos de (i) tratamento de uma doença renal, anemia, ou uma deficiência EPO; (ii) estabilização da função renal, (iii) restaurar a homeostase de eritroide, ou (iv) qualquer combinação dos mesmos através da administração de uma população de células enriquecidas em células renais ou mistura de células renais contendo uma população de células enriquecida para células produtoras de EPO como aqui descrito, em que os efeitos benéficos da administração são maiores do que os efeitos da administração de uma população de células enriquecidas em células não produtoras de EPO. Em outra modalidade, a população enriquecida de células fornece um maior nível de nitrogênio de ureia no soro sanguíneo (BUN). Em outra modalidade, a população de células enriquecida proporciona uma melhor retenção da proteína no soro. Em outra modalidade, a população de células enriquecida fornece melhores níveis de colesterol e/ou triglicerídeos no soro. Em outra modalidade, a população de células enriquecida proporciona um nível melhorado de vitamina D. Em uma modalidade, a população celular enriquecida fornece uma relação fósforo:cálcio melhorada, em comparação com uma população de células não enriquecida. Em outra modalidade, a população de células enriquecida proporciona um nível melhorado de hemoglobina, em comparação com uma população de células não enriquecida. Em outra modalidade, a população de células enriquecida fornece um maior nível de creatinina no soro, em comparação com uma população de células não enriquecida. Em ainda outra modalidade, a população de células enriquecida proporciona um nível melhorado de hematócrito em comparação com uma população de células não enriquecida. Em outra modalidade, a população de células enriquecida proporciona um melhor nível do número de glóbulos vermelhos (RBC#) em comparação com uma população de células não enriquecida. Em uma modalidade, a melhoria do nível de hematócrito é restaurada até 95% do nível saudável normal. Em outra modalidade, a população de células enriquecida fornece um número de reticulócitos melhorado, em comparação com uma população de células não enriquecida. Em outras modalidades, a população de células enriquecida proporciona uma percentagem de reticulócitos melhorada, em comparação com uma população de células não enriquecida. Ainda em outras modalidades, a população de células enriquecida proporciona um nível melhorado de largura de distribuição de volume da célula vermelha do sangue (RDW), em comparação com um população de células não enriquecida. Em ainda outra modalidade, a população de células enriquecida fornece um maior nível de hemoglobina, em comparação com uma população de células não enriquecida. Em ainda outra modalidade, a população de células enriquecida fornece uma resposta eritropoietica na medula óssea, de modo a que o celularidade de medula é quase normal e a razão mieloide:eritroide é quase normal.
[00165] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona formulações para utilização em métodos de (i) tratamento de uma doença renal, anemia, ou uma deficiência de EPO; (ii) estabilização da função renal, (iii) restauração da homeostase eritroide, ou (iv) qualquer combinação das mesmos por administração de uma população de células enriquecida, em que os efeitos benéficos da administração de uma população de células renais ou mistura de populações de células renais aqui descritas são caracterizadas por melhoria da homeostase de eritroides quando comparado com os efeitos benéficos proporcionados pela administração de EPO recombinante (rEPO). Em uma modalidade, a população ou mistura, quando administrada a um indivíduo em necessidade proporciona uma melhor homeostase de eritroide (como determinado pelo hematócrito, hemoglobina ou RBC#) quando comparado com a administração da proteína EPO recombinante. Em uma modalidade, a população ou mistura, quando administrada fornece um maior nível de hematócrito, RBC, ou hemoglobina em comparação com EPO recombinante, não sendo superior a cerca de 10% maior ou menor do hematócrito em um controle. Em outra modalidade, uma dose única ou liberação da população ou da mistura, quando administrada proporciona uma melhoria na homeostase de eritroide (tal como determinado por um aumento no hematócrito, hemoglobina, ou RBC#) no indivíduo tratado, durante um período de tempo que excede significativamente o período de tempo em que uma única dose ou liberação da proteína EPO recombinante proporciona melhoria na homeostase de eritroide. Em outra modalidade, a população ou da mistura, quando administrada a uma dose aqui descrita não resulta em hematócrito, hemoglobina ou RBC# maior do que cerca de 110% de níveis normais em controles saudáveis correspondentes. Em outra modalidade, a população ou mistura, quando administrada a uma dose aqui descrita fornece a homeostase de eritroide superior (tal como determinado por hematócrito, hemoglobina ou RBC#) em comparação com a proteína EPO recombinante administrada a uma dose aqui descrita. Em outra modalidade, a EPO recombinante é administrada com uma dose de cerca de 100 IU/kg, cerca de 200IU/kg, cerca de 300 IU/kg, cerca de 400 IU/kg, ou cerca de 500 IU/kg. Os especialistas na técnica irão apreciar que outras dosagens de EPO recombinante conhecidas na técnica podem ser adequadas.
[00166] Outra modalidade da presente invenção é dirigida à utilização de formulações contendo pelo menos uma população de células, incluindo populações de células enriquecidas e misturas destas, aqui descritas, ou uma construção implantável aqui descrita, ou produtos secretados tal como aqui descrito, para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença renal, anemia ou deficiência de EPO em um indivíduo com essa necessidade, o fornecimento de homeostase de eritroide em um indivíduo com essa necessidade, a melhoria da função renal em um indivíduo com essa necessidade, ou proporcionar um efeito regenerativo para um rim nativo.
[00167] Outra modalidade da presente invenção é dirigida a formulações contendo população específica de células enriquecidas (aqui descritas) para o tratamento de uma doença renal de uma etiologia específica, com base na seleção de subpopulação de células específicas com base em atributos terapêuticos específicos verificados.
[00168] Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona formulações para utilização em métodos de tratamento de uma doença renal em um indivíduo com essa necessidade, compreendendo: a administração ao indivíduo de uma formulação compreendendo uma mistura de células renais de mamíferos, compreendendo uma primeira população celular, B2, compreendendo uma população de células tubulares isoladas enriquecidas com uma densidade entre 1,045 g/mL e 1,052 g/mL, e uma segunda população de células, B4', que compreende células produtoras de eritropoietina (EPO) e células vasculares, mas sem células glomerulares com uma densidade entre 1,063 g/mL e 1,091 g/mL, em que a mistura não inclui uma população de células B1 compreendendo grandes células granulares do sistema de ducto coletor e tubular e tendo uma densidade de < 1,045 g/mL, ou uma população de células B5 compreendendo pequenos detritos e células pequenas de baixa granularidade e viabilidade com uma densidade de > 1,091 g/mL. Em certas modalidades, o método inclui a determinação em uma amostra de teste a partir do indivíduo que o nível de um indicador da função renal é diferente em relação ao nível de um indicador no controle, em que a diferença no nível indicador é indicativa de uma redução em declínio, estabilização, ou uma melhoria de uma ou mais funções renais do indivíduo. Em uma modalidade, a população de células B4' utilizada no método é caracterizado pela expressão de um marcador vascular. Em certas modalidades, a população de células B4' utilizada no método não é caracterizada pela expressão de um marcador glomerular. Em uma modalidade, a mistura de células utilizado no método é capaz de expressão de eritropoietina (EPO) sintonizável por oxigênio. Em certas modalidades, a doença renal a ser tratada pelos métodos da presente descrição é acompanhada por uma deficiência de eritropoietina (EPO). Em certas modalidades, a deficiência de EPO é a anemia. Em algumas modalidades, a deficiência de EPO ou anemia ocorre secundária a insuficiência renal no indivíduo. Em algumas outras modalidades, a deficiência de EPO ou anemia ocorre secundária a uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em insuficiência renal crônica, a deficiência primária de EPO, a quimioterapia ou a terapia antiviral, câncer não mieloide, infecção por HIV, doença hepática, insuficiência cardíaca, artrite reumatoide, ou falha do sistema de múltiplos órgãos. Em certas modalidades, a composição usada no método compreende, ainda, um biomaterial que compreende um ou mais polímeros sintéticos biocompatíveis e/ou proteínas de ocorrência natural ou peptídeos, em que a mistura é revestida com, depositada sobre ou em, aprisionada em, suspensa em, incorporada em e/ou associada de outra forma com o biomaterial. Em certas modalidades, a mistura utilizada nas formulações da revelação é derivada de tecido de rim de mamífero ou células renais de mamífero em cultura. Em outras modalidades, a mistura é derivada a partir de uma amostra de rim que é autólogo para o indivíduo com essa necessidade. Em uma modalidade, a amostra é uma biopsia renal. Em outras modalidades, a formulação contém uma mistura derivada de uma amostra de rim não autólogo.
[00169] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona uma utilização de uma formulação contendo as preparações de células e as misturas descritas aqui ou uma construção implantável da presente descrição para a preparação de um medicamento útil no tratamento de uma doença renal, anemia ou deficiência de EPO em um indivíduo com essa necessidade.
[00170] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona formulações para utilização em métodos para a regeneração de um rim nativo em um indivíduo com necessidade do mesmo. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de administração ou a implantação de uma população de células, mistura, ou construção aqui descrita para o indivíduo. Um rim nativo regenerado pode ser caracterizado por certo número de indicadores, incluindo, entre outros, desenvolvimento da função ou capacidade no rim nativo, melhoria da função ou capacidade no rim nativo, e a expressão de certos marcadores no rim nativo. Em uma modalidade, a função ou capacidade desenvolvida ou melhorada pode ser observada a partir dos diversos indicadores de homeostase de eritroide e função renal descrito acima. Em outra modalidade, o rim regenerado é caracterizado por expressão diferencial de um ou mais marcadores de células-tronco. O marcador de célula-tronco pode ser um ou mais dos seguintes: SRY (região determinante de sexo Y)-box 2 (Sox2); Fator De células de Transcrição Embrionário indiferenciado (UTF1); Nodal homólogo de camundongo (NODAL); Prominina 1 (PROM1) ou CD133 (CD133); CD24; e qualquer combinação dos mesmos (ver llagan et al. PCT/US2011/036347 aqui incorporado por referência na sua totalidade). Em outra modalidade, a expressão de marcadores de células-tronco é regulada para cima em comparação com um controle.
[00171] As populações de células aqui descritas, incluindo as populações enriquecidas de células e as misturas das mesmas, bem como construções que contêm o mesmo podem ser utilizados para proporcionar um efeito regenerativo para um rim nativo. O efeito pode ser fornecido pelas próprias células e/ou por produtos de secreção a partir das células. O efeito regenerativo pode ser caracterizado por um ou mais dos seguintes: uma redução em transição epitelial- mesenquimal (que pode ser por meio de atenuação de sinalização de TGF-β); uma redução na fibrose renal; uma redução na inflamação renal; a expressão diferencial de um marcador de células-tronco no rim nativo; migração de células implantadas e/ou células nativas para um local da lesão renal, por exemplo, lesão tubular, o enxerto das células implantadas em um local de lesão renal, por exemplo, lesão tubular; estabilização de um ou mais indicadores da função renal (como aqui descrito); restauração da homeostase de eritroide (como aqui descrito); e qualquer combinação dos mesmos.
7. Métodos para monitorar a regeneração
[00172] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de prognóstico para o monitoramento de regeneração de um rim nativo após a administração ou a implantação de uma formulação que contém uma população de células, mistura, ou a construção aqui descrito para o indivíduo. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de detectar o nível de expressão do marcador em uma amostra de teste obtida a partir do indivíduo e na amostra de controle, em que um nível mais elevado de expressão do marcador na amostra de teste, em comparação com a amostra de controle, é um prognóstico para a regeneração do rim nativo no indivíduo. Em outra modalidade, o método inclui a detecção da expressão de um ou mais marcadores de células-tronco na amostra. O marcador de células-tronco pode ser selecionado a partir de Sox2; UTF1; NODAL; CD133; CD24; e qualquer combinação dos mesmos (ver Exemplo 11 de um Ilagan et al. PCT/US2011/036347). A etapa de detecção pode incluir a determinação de que a expressão dos marcadores de células-tronco é regulada para cima ou mais elevada na amostra de teste em relação a uma amostra de controle, em que o nível mais elevado de expressão é um prognóstico para a regeneração do rim nativo do indivíduo. Em outra modalidade, a expressão do mRNA dos marcadores de células-tronco é detectada. Em outras modalidades, a detecção da expressão de mRNA pode ser através de um método baseado em PCR, por exemplo, de qRT-PCR. A hibridização in situ também pode ser usada para a detecção da expressão de mRNA. Em outra modalidade, a expressão do polipeptídeo do marcador de células- tronco também pode ser detectada utilizando um agente antimarcador de células-tronco. Em outra modalidade, o agente é um anticorpo contra o marcador. Em outra modalidade, a expressão do polipeptídeo de marcador de células-tronco é detectada usando imuno-histoquímica ou um Western Blot. Os especialistas na técnica irão apreciar outros métodos para a detecção de mRNA e/ou a expressão do polipeptídeo de marcadores.
[00173] Em outro aspecto, a invenção fornece métodos para avaliação de prognóstico de um paciente após a implantação ou administração de uma formulação que contém uma população de células, mistura, ou a construção aqui descrita. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de detectar o nível de expressão do marcador em uma amostra de teste obtida a partir do dito indivíduo; (b) determinar o nível de expressão na amostra de teste em relação ao nível de expressão do marcador em relação a uma amostra de controle (ou um valor de referência de controle); e c) predizer o prognóstico regenerativo do paciente, com base na determinação dos níveis de expressão do marcador, em que um nível mais elevado de expressão do marcador na amostra de teste, em comparação com a amostra de controle (ou um valor de referência de controle), é de prognóstico para a regeneração no indivíduo.
[00174] Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de prognóstico para o controle de regeneração de um rim nativo após a administração ou a implantação de uma formulação que contém uma população de células, mistura, ou a construção aqui descrito para o indivíduo, em que um método não invasivo é utilizado. Como uma alternativa a uma biopsia de tecido, um resultado regenerativo no indivíduo que recebe o tratamento pode ser avaliado a partir de análise de um fluido corporal, por exemplo, urina. Foi descoberto que microvesículas obtidas a partir de fontes de urina derivadas de indivíduos contem certos componentes, incluindo, entre outros, proteínas e miRNAs que são em última instância derivadas das populações de células renais afetadas por tratamento com as populações de células da presente invenção específicas. Estes componentes podem incluir fatores envolvidos na replicação de células- tronco e diferenciação, apoptose, inflamação e de imunomodulação. Uma análise temporal de padrões de expressão de miRNA/proteína associada à microvesícula permite o monitoramento contínuo dos resultados regenerativos dentro do rim de voluntários que recebem as populações de células, misturas, ou construções da presente divulgação.
[00175] Estas vesículas derivadas de rim e/ou o conteúdo luminal de vesículas derivadas de rim jogadas na urina de um indivíduo podem ser analisada para biomarcadores indicativos de resultados de regeneração.
[00176] Em uma modalidade, a presente divulgação fornece métodos para avaliar se um paciente de doença renal (KD) é sensível ao tratamento com uma formulação terapêutica. O método pode incluir a etapa de determinar ou detectar a quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal em uma amostra de teste obtida a partir de um paciente KD tratado com o medicamento, em comparação com ou em relação à quantidade de vesículas em uma amostra de controle, em que uma maior ou menor quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal na amostra de teste, em comparação com a quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal na amostra de controle é indicativo da capacidade de resposta do paciente tratado com o tratamento com o agente terapêutico.
[00177] A presente invenção também fornece um método para monitorar a eficácia do tratamento com um agente terapêutico em um paciente KD. Em uma modalidade, o método inclui a etapa de determinar ou detectar a quantidade de vesículas em uma amostra de teste obtida a partir de um paciente KD tratado com o medicamento, em comparação com ou em relação à quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal em uma amostra de controle, em que uma quantidade maior ou menor de vesículas ou seu conteúdo luminal na amostra de teste, em comparação com a quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal na amostra de controle é indicativo da eficácia do tratamento com o agente terapêutico no paciente KD.
[00178] A presente invenção fornece um método para identificar uma subpopulação de pacientes para os quais é um agente eficaz para o tratamento de doença renal (KD). Em uma modalidade, o método inclui a etapa de determinar uma correlação entre a eficácia do agente e a presença de uma quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal em amostras da subpopulação de pacientes em comparação com a quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal em uma amostra obtida a partir de uma amostra de controle, em que uma quantidade maior ou menor de vesículas nas amostras da subpopulação de pacientes em comparação com a quantidade de vesículas ou seu conteúdo luminal na amostra de controle é indicativo de que o agente é eficaz para tratar KD na subpopulação de pacientes.
[00179] A etapa de determinar ou detectar pode incluir análise da quantidade de miRNA ou outros produtos de secreção que possam existir na amostra de teste, por exemplo, urina.
[00180] Os métodos de prognóstico não invasivos podem incluir a etapa de obtenção de uma amostra de urina a partir do indivíduo, antes e/ou após a administração ou a implantação uma população de células, mistura, ou a construção aqui descrita. As vesículas e outros produtos segregados podem ser isolados a partir das amostras de urina utilizando técnicas padrão, incluindo, entre outros, centrifugação, para remover detritos indesejados (Zhou et al. 2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al. Pedido de Patente Publicado U.S., No. 20110053157, cada um dos quais é aqui incorporado como referência em sua totalidade).
[00181] A presente divulgação refere-se a métodos não invasivos para detectar resultado regenerativo em um indivíduo após o tratamento. Os métodos envolvem a detecção de vesículas ou seu conteúdo luminal na urina de um indivíduo tratado. O conteúdo luminal pode ser um ou mais miRNAs. A detecção de combinações ou painéis dos miRNAs individuais podem ser adequados para esses métodos de prognóstico. Combinações exemplares incluem dois ou mais dos seguintes; miR-24; miR-195; miR-871; miR-30b-5p; miR-19b; miR-99a; miR-429; let-7f; miR-200a; miR-324-5p; miR-10a-5p; e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a combinação de miRNA pode incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou mais miRNAs individuais. Os especialistas na técnica apreciarão que outros miRNAs e combinações de miRNAs podem ser adequados para uso nesses métodos de prognóstico. Fontes de miRNAs adicionais incluem miRBase em http://mirbase.org, que está hospedado e mantido em Faculty of Life Sciences at the University of Manchester.
[00182] Os especialistas na técnica apreciarão que os métodos de prognóstico para a detecção de regeneração podem ser adequados para os indivíduos tratados com outros agentes terapêuticos conhecidos na técnica, além das populações de células e as construções aqui descritas.
[00183] Em algumas modalidades, a etapa de determinação compreende o uso de um programa de software executado por um processador adequado para o objetivo de (i) medir o nível de expressão diferencial de marcador (ou vesículas /conteúdos de vesículas) de uma amostra de teste e um controle; e/ou (ii) analisar os dados obtidos a partir da medição do nível de expressão diferencial de marcador em uma amostra de teste e um controle. Software adequado e processadores são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente. O programa pode ser incorporado em software armazenado em um suporte material, como CD-ROM, um disquete, um disco rígido, um DVD, ou uma memória associada com o processador, mas os especialistas na técnica compreenderão facilmente que o programa ou partes do mesmo, poderia alternativamente ser executado por um dispositivo diferente de um processador, e/ou incorporados em firmware e/ou hardware dedicado de um modo bem conhecido.
[00184] Após a etapa de determinação, os resultados da medição, os achados, diagnósticos, prognósticos e/ou recomendações de tratamento são tipicamente gravados e comunicado aos técnicos, médicos, e/ou pacientes, por exemplo. Em certas modalidades, os computadores serão usados para comunicar essas informações às partes interessadas, como, os pacientes e/ou os médicos assistentes. Em algumas modalidades, os ensaios serão realizados ou os resultados do ensaio analisados em um país ou jurisdição que difere do país ou jurisdição em que os resultados ou diagnósticos são comunicados.
[00185] Em uma modalidade preferencial, um prognóstico, predição e/ou a recomendação de tratamento com base no nível de expressão do marcador medido em um indivíduo de teste tendo um nível diferencial de expressão de marcador é comunicada ao indivíduo, o mais rapidamente possível após o ensaio ser concluído e o prognóstico e/ou previsão é gerado. Os resultados e/ou informações relacionadas podem ser comunicadas ao indivíduo pelo médico responsável pelo tratamento do indivíduo. Alternativamente, os resultados podem ser comunicados diretamente para um indivíduo de teste, por qualquer meio de comunicação, incluindo a escrita, formulários eletrônicos de comunicação, como e-mail ou telefone. A comunicação pode ser facilitada pela utilização de um computador, como no caso de comunicações por e-mail. Em certas modalidades, a comunicação com os resultados de um ensaio e/ou prognóstico conclusões tiradas e/ou recomendações de tratamento com base no teste, pode ser gerada e emitida automaticamente para o indivíduo utilizando uma combinação de hardware e software de computador que seja familiar para especialistas em telecomunicação. Um exemplo de um sistema de comunicações orientada para cuidados de saúde está descrito na Patente US 6.283.761; no entanto, a presente revelação não está limitada a métodos que utilizam este sistema de comunicações em particular. Em certas modalidades dos métodos da divulgação, a totalidade ou algumas das etapas do processo, incluindo o ensaio de amostras, prognóstico e/ou previsão de regeneração, e comunicação dos resultados do ensaio ou prognóstico, pode ser realizada em diversas jurisdições (por exemplo, estrangeira).
[00186] Em outro aspecto, os métodos de prognóstico aqui descritos fornecem informações para uma parte interessada a respeito do sucesso da implantação ou administração.
[00187] Em todas as modalidades, os métodos para fornecer um rim regenerado a um indivíduo em necessidade desse tratamento, como aqui descrito pode incluir a etapa de pós-implantação de avaliação do prognóstico da regeneração, como descrito acima.
8. Formulações de Células Bioativas
[00188] As formulações aqui descritas incorporam biomateriais que têm propriedades que criam um ambiente favorável para o agente ativo, como células renais bioativas, a ser administrada a um indivíduo. Em uma modalidade, a formulação contém um primeiro biomaterial que fornece um ambiente favorável a partir do momento em que o agente ativo é formulado com o biomaterial até ao ponto de administração ao indivíduo. Em outra modalidade, o ambiente favorável diz respeito às vantagens de ter células bioativas em suspensão em um estado substancialmente sólido contra as células em um fluido (como aqui descrito) antes da administração a um indivíduo. Em outra modalidade, o primeiro biomaterial é um biomaterial sensível à temperatura. O biomaterial sensível à temperatura pode ter (i) um estado substancialmente sólido a cerca de 8°C ou inferior, e (ii) um estado substancialmente líquido à temperatura ambiente ou acima. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é de cerca da temperatura da sala.
[00189] Em outro aspecto, a formulação contém células bioativas combinadas com um segundo biomaterial que fornece um ambiente favorável para as células combinadas a partir do momento da formulação, até um ponto após a administração ao indivíduo. Em uma modalidade, o ambiente favorável fornecido pelo segundo biomaterial refere-se às vantagens da administração de células de um biomaterial que retém a integridade estrutural até ao ponto de administração a um indivíduo e durante um período de tempo após a administração. Em uma modalidade, a integridade estrutural do segundo biomaterial após a implantação é minutos, horas, dias ou semanas. Em uma modalidade, a integridade estrutural é menos de um mês, menos de uma semana, menos de um dia, ou menos de uma hora. A integridade estrutural de relativamente curta duração fornece uma formulação que pode liberar o agente ativo e biomaterial para um local alvo em um tecido ou órgão com a manipulação, posicionamento ou dispersão controlada sem ser um obstáculo ou barreira para a interação dos elementos incorporados com o tecido ou órgão em que foi posicionado.
[00190] Em outra modalidade, o segundo biomaterial é um biomaterial sensível à temperatura que tem uma sensibilidade diferente do primeiro biomaterial. O segundo biomaterial pode ter (i) um estado substancialmente sólido em cerca da temperatura ambiente ou inferior, e (ii) um estado substancialmente líquido em cerca de 37°C ou acima. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é cerca da temperatura da sala.
[00191] Em uma modalidade, o segundo biomaterial é grânulo reticulado. Os grânulos reticulados podem ter tempos de residência in vivo finamente ajustáveis dependendo do grau de reticulação, como aqui descrito. Em outra modalidade, os grânulos reticulados compreendem células bioativas e são resistentes à degradação enzimática como aqui descrito.
[00192] As formulações da presente invenção podem incluir o primeiro biomaterial combinado com um agente ativo, por exemplo, células bioativas, com ou sem um segundo biomaterial combinado com um agente ativo, por exemplo, células bioativas. Quando uma formulação inclui um segundo biomaterial, pode ser um grânulo sensível à temperatura e/ou grânulo reticulado. Várias formulações representativas são fornecidas nos exemplos abaixo (ver também as Figuras 3-7).
[00193] As preparações de células bioativas, adições, e/ou construções aqui descritos podem ser administradas como formulações de células bioativas. Em um aspecto, as formulações incluem as células e um ou mais biomateriais que fornecem estabilidade às preparações de células bioativas, misturas, e/ou construções aqui descritas. Em uma modalidade, o biomaterial é um biomaterial sensível à temperatura que pode manter pelo menos duas fases ou estados diferentes dependendo da temperatura. O biomaterial é capaz de manter um primeiro estado em uma primeira temperatura, um segundo estado em uma segunda temperatura, e/ou um terceiro estado em uma terceira temperatura. O primeiro, segundo ou terceiro estado pode ser um estado substancialmente sólido, substancialmente líquido, ou substancialmente semissólida ou semilíquido. Em uma modalidade, o biomaterial tem um primeiro estado, a uma primeira temperatura e um segundo estado a uma segunda temperatura, em que a primeira temperatura é mais baixa do que a segunda temperatura.
[00194] Em outra modalidade, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente sólido, a uma temperatura de cerca de 8°C ou abaixo. Em outras modalidades, o estado substancialmente sólido é mantido a cerca de 1°C, cerca de 2°C, cerca de 3°C, cerca de 4°C, cerca de 5°C, cerca de 6°C, cerca de 7°C, ou cerca de 8°C. Em uma modalidade, o estado substancialmente sólido tem a forma de um gel. Em outras modalidades, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente líquido à temperatura ambiente ou acima. Em uma modalidade, o estado substancialmente líquido é mantida a cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, ou cerca de 37°C. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é de cerca da temperatura da sala.
[00195] Em outra modalidade, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente sólido, a uma temperatura de cerca da temperatura ambiente ou abaixo. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é de cerca da temperatura da sala. Em outra modalidade, o estado substancialmente sólido é mantido a cerca de 17°C, cerca de 16°C, cerca de 15°C, cerca de 14°C, cerca de 13°C, cerca de 12°C, cerca de 11°C, cerca de 10°C, cerca de 9°C, cerca de 8°C, cerca de 7°C, cerca de 6°C, cerca de 5°C, cerca de 4°C, cerca de 3°C, cerca de 2°C, ou cerca de 1°C. Em uma modalidade, o estado substancialmente sólido tem a forma de um grânulo. Em outra modalidade, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente líquido a uma temperatura de cerca de 37°C ou acima. Em outra modalidade, o estado substancialmente sólido é mantido a cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, ou cerca de 40°C.
[00196] Os biomateriais sensíveis à temperatura podem ser fornecidos sob a forma de uma solução, sob a forma de grânulos, ou sob outras formas adequadas aqui descrita e/ou conhecidas dos especialistas na técnica. As populações e preparações de células aqui descritas podem ser revestidos com, depositadas em, incorporadas em, ligadas a, propagadas, suspensa em, ou aprisionadas em um biomaterial sensível à temperatura. Alternativamente, o biomaterial sensível à temperatura pode ser fornecido sem quaisquer células, como, por exemplo sob a forma de grânulos espaçadores.
[00197] Em outras modalidades, o biomaterial sensível à temperatura tem um estado de transição entre um primeiro estado e um segundo estado. Em uma modalidade, o estado de transição é um estado de transição sólido-para-líquido entre uma temperatura de cerca de 8°C e cerca da temperatura ambiente. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é de cerca da temperatura da sala. Em outra modalidade, o estado de transição sólido-para-líquido ocorre em uma ou mais temperaturas de cerca de 8°C, a cerca de 9°C, sobre 10°C, de cerca de 11°C, a cerca de 12°C, cerca de 13°C, cerca de 14°C, cerca de 15°C, cerca de 16°C, cerca de 17°C, e cerca de 18°C.
[00198] Os biomateriais sensíveis à temperatura têm certa viscosidade a uma dada temperatura medida em centipoise (cP). Em uma modalidade, o biomaterial tem uma viscosidade a 25°C de cerca de 1 cP a cerca de 5 cP, de cerca de 1,1 cP a cerca de 4,5 cP, cerca de 1,2 cP a cerca de 4 cP, cerca de 1,3 cP a cerca de 3,5 cP, cerca de 1,4 cP a cerca de 3,5 cP, cerca de 1,5 cP a cerca de 3 cP, cerca de 1,55 cP a cerca de 2,5 cP, ou cerca de 1,6 cP a cerca de 2 cP. Em outra modalidade, a solução 0,75% (p/v) de tem uma viscosidade a 37°C de cerca de 1,0 cP a cerca de 1,15 cP. A viscosidade a 37°C pode ser cerca de 1,0 cP, cerca de 1,01 cP, cerca de 1,02 cP, cerca de 1,03 cP, cerca de 1,04 cP, cerca de 1,05 cP, cerca de 1,06 cP, cerca de 1,07 cP, cerca de 1,08 cP, cerca de 1,09 cP, cerca de 1,10 cP, cerca de 1,11 cP, cerca de 1,12 cP, cerca de 1,13 cP, cerca de 1,14 cP, ou cerca de 1,15 cP. Em outra modalidade, o biomaterial é uma solução de gelatina. A gelatina está presente em cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95% ou cerca de 1%, (p/v) na solução. Em um exemplo, o biomaterial é uma solução 0,75% (p/v) de gelatina em PBS. Em uma modalidade, a solução 0,75% (p/v) tem uma viscosidade a 25°C de cerca de 1,6 cP a cerca de 2 cP. Em uma modalidade, a solução 0,75% (p/v) tem uma viscosidade a 37°C de cerca de 1,07 a cerca de 1,08 cP. A solução de gelatina pode ser fornecida em PBS, DMEM, ou outro solvente adequado.
[00199] Em um aspecto, a formulação de célula bioativa também inclui um agente de viabilidade celular. Em uma modalidade, o agente de viabilidade celular é selecionado do grupo que consiste em um antioxidante, um carreador de oxigênio, um fator imunomodulador, um fator de recrutamento célula, um fator de fixação celular, um agente anti- inflamatório, um fator angiogênico, um fator de cicatrização de feridas, e produtos secretados a partir células bioativas.
[00200] Os antioxidantes são caracterizados pela capacidade para inibir a oxidação de outras moléculas. Os antioxidantes incluem, entre outros, um ou mais de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico (Trolox®), carotenoides, flavonoides, isoflavonas, ubiquinona, glutationa, ácido lipoico, superóxido dismutase, ácido ascórbico, vitamina E, vitamina A, carotenoides mistos (por exemplo, beta-caroteno, alfa-caroteno, gama-caroteno, licopeno, fitofeno, fitoflueno, e astaxantina), selênio, coenzima Q10, indol-3-carbinol, proantocianidinas, resveratrol, quercetina, catequinas, ácido salicílico, curcumina, bilirrubina, ácido oxálico, ácido fítico, ácido lipoico, ácido vanílico, polifenóis, ácido ferúlico, teaflavinas, e derivados dos mesmos. Os especialistas na técnica irão apreciar outros antioxidantes adequados para utilização na presente divulgação.
[00201] Carreadores de oxigênio são agentes caracterizados pela capacidade de transportar e libertar oxigênio. Esses incluem, entre outros, perfluorcarbonos e produtos farmacêuticos que contenham perfluorcarbonos. Carreadores de oxigênio à base de perfluorcarbonos adequados incluem, entre outros, brometo perfluorctil (C8F17Br); perfluordicorotano (C8F16C12); brometo perfluordecil; perfluobron; perfluordecalina; perfluortripopilamina; perfluormetilciclopiperidina; Fluosol® (perfluordecalina & perfluortripopilamina); Perftoran® (perfluordecalina & perfluormetilciclopiperidina); Oxygent® (brometo perfluordecil & perfluobron); Ocycyte™ (perfluor (terc-butilciclohexano)). Os especialistas na técnica irão apreciar outros carreadores de oxigênio à base de perfluorcarbonos adequados para utilização na presente divulgação. Os fatores imunomoduladores incluem, entre outros, fatores osteopontina, fatores de ligação de FAS, interleucinas, fator de crescimento transformante beta, fator de crescimento derivado de plaqueta, clusterina, transferrina, célula T expressa normal, regulada após ação, proteína secretada (RANTES), inibidor da ativação de plasminogênio - 1 (Pai-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), interleucina 6 (IL-6), alfa-1 microglobulina, e beta-2-microglobulina. Os especialistas na técnica irão apreciar outros fatores imunomoduladores adequados para utilização na presente divulgação.
[00202] Os agentes anti-inflamatórios ou imunossupressores (descritos abaixo) podem também fazer parte da formulação. Os especialistas na técnica irão apreciar outros antioxidantes adequados para uso nas presentes formulações e/ou tratamentos.
[00203] Fatores de recrutamento celular incluem, entre outros, a proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1), e CXCL-1. Os especialistas na técnica irão apreciar outros fatores de recrutamento celular adequados para uso nas presentes formulações e/ou tratamentos.
[00204] Fatores de fixação de células incluem, entre outros, fibronectina, procolágeno, colágeno, ICAM-1, fator de crescimento do tecido conjuntivo, lamininas, proteoglicanos, peptídeos de adesão de células específicos como RGD e YSIGR. Os especialistas na técnica irão apreciar outros fatores de fixação de células adequados para o uso nas presentes formulações e/ou tratamentos.
[00205] Fatores angiogênicos incluem, entre outros, uma metaloprotease de matriz 1 (MMP1), metaloprotease de matriz 2 (MMP2), fator de crescimento endotelial vascular F (VEGF), metaloprotease de matriz 9 (MMP-9), inibidor de tecido ou mataloproteases - 1 (TIMP- 1), fator de crescimento endotelial vascular F (VEGF), a angiopoietina-2 (ANG-2). Os especialistas na técnica irão apreciar outros fatores angiogênicos adequados para o uso nas presentes formulações e/ou tratamentos.
[00206] Fatores de cura de feridas incluem, entre outros, o fator de crescimento de queratinócitos 1 (KGF-1), ativador do plasminogênio tecidular (tPA), calbindina, clusterina, cistatina C, fator trevo 3. Os especialistas na técnica irão apreciar outros fatores de cura de ferida adequados para uso nas presentes formulações e/ou tratamentos.
[00207] Produtos segregados a partir de células bioativas aqui descritas também podem ser adicionados à formulação de célula bioativa como um agente de viabilidade celular.
[00208] Em outro aspecto, a formulação inclui um biomaterial sensível à temperatura aqui descrito e uma população de grânulos biocompatíveis contendo um biomaterial. Em uma modalidade, os grânulos são reticulados. A reticulação pode ser realizada usando qualquer agente de reticulação adequado conhecido pelos especialistas na técnica, como, por exemplo, carbodi-imidas; aldeídos (por exemplo, furfural, acroleína, formaldeído, glutaraldeído, aldeído de gliceril), agentes de ligação cruzada à base de succinimida {Bis(sulfosuccinimidil) suberato (BS3), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil suberato (DSS), Ditiobis(succinimidil propionato), Etileno glicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato), Etileno glicolbis(succinimidilsuccinato) (EGS), Bis(Sulfosuccinimidil) glutarato (BS2G), Disuccinimidil tartarato (DST)}; epóxidos (éter diglicidil de etileno glicol, éter diglicidil de 1,4 Butanodiol); sacarídeos (açúcares glicose e aldose); ácidos sulfônicos e ácido p-tolueno sulfônico; carbonildiimidazol; genipina; iminas; cetonas; difenilfosforilazida (DDPA); cloreto de tereftaloil; hexaidrato de nitrato de cério (III); transglutaminase microbiana; e peróxido de hidrogênio. Os especialistas na técnica apreciarão outros agentes de reticulação e métodos de reticulação adequados para utilização nos métodos, formulações e/ou tratamentos presentes.
[00209] Em uma modalidade, os grânulos são grânulos reticulados com carbodi-imida. Os grânulos reticulados com carbodi-imida podem ser reticulado com uma carbodi-imida selecionada do grupo que consiste em cloridrato de 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodi-imida (EDC), DCC - N,N'-diciclohexilcarbodi-imida (DCC), e N,N'-Di- isopropilcarbodi-imida (DIPC). Grânulos tratados com uma concentração mais baixa de EDC foram esperados para ter um maior número de aminas primárias livres, enquanto que as amostras tratadas com concentrações elevadas de agente de reticulação teria a maior parte das aminas primárias envolvidas em ligações amida. A intensidade da cor laranja desenvolvida por a ligação covalente entre a amina primária e ácido picrilsulfônico, detectável espectrofotometricamente a 335 nm, é proporcional ao número de aminas primárias presentes na amostra. Quando normalizado por miligrama de proteína presente na amostra, uma correlação inversa entre o número de aminas livres presentes e a concentração inicial de EDC utilizada para a reticulação pode ser observada. Este resultado é indicativo de reticulação de grânulo diferencial, ditada pela quantidade de carbodi-imida utilizada na reação. Em geral, grânulos reticulados apresentam um número reduzido de aminas primárias livres em comparação com grânulos não reticulados. O número de aminas primárias livres pode ser detectado espectrofotometricamente em cerca de 335 nm.
[00210] Os grânulos reticulados têm uma susceptibilidade reduzida à degradação enzimática em comparação com grânulos não biocompatíveis reticulados, fornecendo desse modo grânulos com tempos de residência in vivo finamente sintonizáveis. Por exemplo, os grânulos reticulados são resistentes às enzimas endógenas, como colagenases. A disposição de grânulos reticulados é parte de um sistema de liberação focado no desenvolvimento e produção de biomateriais que facilitam um ou mais de: (a) liberação de células fixadas aos locais desejados e criação de espaço para a regeneração e crescimento interno de tecido nativo e fornecimento vascular; (b) capacidade de persistir no local tempo suficiente para permitir que células se estabeleçam, funcionem, remodelem o seu microambiente, e secretem a sua própria matriz extracelular (ECM); (c) promoção da integração das células transplantadas com o tecido circundante; (d) capacidade para implantar células em uma forma substancialmente sólida; (e) integração estrutural de curto prazo que não fornece uma barreira significativa para o crescimento interno ou a integração de células/materiais liberados com o tecido hospedeiro; (f) liberação in vivo localizada em uma forma substancialmente sólida impedindo assim a dispersão de células dentro do tecido durante a implantação; (g) estabilidade melhorada e viabilidade de células dependentes de ancoragem em comparação com as células em suspensão em um fluido; e (h) perfil de liberação bifásico, quando as células são liberadas i) em uma forma substancialmente sólida (por exemplo, fixada aos grânulos), e ii) em uma forma substancialmente líquida (por exemplo, suspensa em um fluido).
[00211] Em uma modalidade, a presente invenção fornece grânulos reticulados contendo gelatina. Grânulos de gelatina não reticulados não são adequados para uma formulação de células bioativas porque rapidamente perdem a integridade e as células dissipam do local da injeção. Em contraste, os grânulos de gelatina altamente reticulados podem persistir por muito tempo no local da injeção e podem dificultar a secreção ECM de novo, integração de células e regeneração tecidual. A presente divulgação permite que o tempo de residência in vivo dos grânulos reticulados seja finamente ajustado. A fim de adaptar a biodegradabilidade de biomateriais, diferentes concentrações do agente reticulante de carbodi-imida são usadas enquanto as condições gerais da reação foram mantidas constantes para todas as amostras. Por exemplo, a susceptibilidade enzimática dos grânulos reticulados com carbodi-imida pode ser finamente afinada através da variação da concentração de agente de reticulação de cerca de zero a cerca de 1M. Em algumas modalidades, a concentração é cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 26 mM, cerca de 27 mM, cerca de 28 mM, cerca de 29 mM, cerca de 30 mM, cerca de 31 mM, cerca de 35 mM, cerca de 39 mM, cerca de 43 mM, cerca de 47 mM, cerca de 55 mM, cerca de 75 mM, cerca de 32 mM, cerca de 36 mM, cerca de 40 mM, cerca de 44 mM, cerca de 48 mM, cerca de 60 mM, cerca de 80 mM, cerca de 33 mM, cerca de 37 mM, cerca de 41 mM, cerca de 45 mM, cerca de 49 mM, cerca de 65 mM, cerca de 85 mM, cerca de 34 mM cerca de 38 mM cerca de 42 mM cerca de 46 mM cerca de 50 mM cerca de 70 mM cerca de 90 mM cerca de 95 mM, ou cerca de 100 mM. A concentração de agente reticulante também pode ser de cerca de 0,15 M, cerca de 0,2 M, cerca de 0,25 M, cerca de 0,3 M, cerca de 0,35 M, cerca de 0,4 M, cerca de 0,45 M, cerca de 0,5 M, cerca de 0,55 M, cerca de 0,6 M, cerca de 0,65 M, cerca de 0,7 M, cerca de 0,75 M, cerca de 0,8 M, cerca de 0,85 M, cerca de 0,9 M, cerca de 0,95 M, ou cerca de 1 M. Em um outra modalidade, o agente é cloridrato de 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodi-imida (EDC). Em uma modalidade, os grânulos reticulados com EDC são grânulos de gelatina.
[00212] Grânulos reticulados podem ter certas características que favorecem a propagação, fixação ou encapsulamento. Por exemplo, os grânulos podem ter uma superfície porosa e/ou podem ser substancialmente ocos. A presença de poros fornece uma superfície de fixação celular aumentada permitindo que um maior número de células se fixe, em comparação com uma superfície não porosa ou lisa. Além disso, a estrutura de poros pode suportar a integração do tecido hospedeiro com os grânulos porosos suportando a formação de tecido de novo. Os grânulos têm uma distribuição de tamanho de distribuição que pode ser ajustado em um gráfico Weibull correspondente ao padrão geral de distribuição de partículas. Em uma modalidade, as grânulos reticulados têm um diâmetro médio menor de cerca de 120 μm, cerca de 115 μm, cerca de 110 μm, cerca de 109 μm, cerca de 108 μm, cerca de 107 μm, cerca de 106 μm, cerca de 105 μm, cerca de 104 μm, cerca de 103 μm, cerca de 102 μm, cerca de 101 μm, cerca de 100 μm, cerca de 99 μm, cerca de 98 μm, cerca de 97 μm, cerca de 96 μm, cerca de 95 μm, cerca de 94 μm, cerca de 93 μm, cerca de 92 μm, cerca de 91 μm, ou cerca de 90 μm. As características dos grânulos reticulados variam dependendo do processo de fundição. Por exemplo, um processo no qual um jato de ar é utilizado para atomizar uma solução de gelatina líquida e pulverizá-la em nitrogênio líquido com um pulverizador de reagente de cromatografia em camada fina (ACE Glassware) é utilizado para fornecer grânulos possuindo as características acima mencionadas. Os especialistas na técnica apreciarão que os parâmetros de modulação do processo de fundição fornece a oportunidade de adaptar as diferentes características dos grânulos, por exemplo, diferentes distribuições de tamanho.
[00213] A citocompatibilidade dos grânulos com ligação cruzada é avaliada in vitro, antes da formulação, utilizando técnicas de cultura de células em que os grânulos são cultivados com as células que correspondem à formulação de célula bioativa final. Por exemplo, os grânulos são cultivados com células primárias renais antes da preparação de uma formulação de células renais bioativas e ensaios de células vivas/mortas são usados para confirmar citocompatibilidade. Em certas formulações, os grânulos reticulados biocompatíveis são combinados com um biomaterial sensível à temperatura em solução a cerca de 5% (p/p) a cerca de 15% (p/p) do volume da solução. Os grânulos reticulados podem estar presentes em cerca de 5% (p/p), cerca de 5,5% (p/p), cerca de 6% (p/p), cerca de 6,5% (p/p), cerca de 7% (p/p), cerca de 7,5% (p/p), cerca de 8% (p/p), cerca de 8,5% (p/p), cerca de 9% (p/p), cerca de 9,5% (p/p), cerca de 10% (p/p), cerca de 10,5% (p/p), cerca de 11% (p/p), cerca de 11,5% (p/p), cerca de 12% (p/p), cerca de 12,5% (p/p), cerca de 13% (p/p), cerca de 13,5% (p/p), cerca de 14% (p/p), cerca de 14,5% (p/p), ou cerca de 15% (p/p) do volume da solução.
[00214] Em outro aspecto, a presente invenção fornece formulações que contêm biomateriais que se degradam ao longo de um período de tempo da ordem de minutos, horas ou dias. Isto está em contraste com um grande corpo ou trabalho com foco no implante de materiais sólidos que, em seguida, se degradam lentamente, durante dias, semanas ou meses.
[00215] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece formulações possuindo grânulos reticulados biocompatíveis com células bioativas em conjunto com uma matriz de liberação. Em uma modalidade, a matriz de liberação tem uma ou mais das seguintes características: biocompatibilidade, biodegradável/bioabsorvível, um estado substancialmente sólido antes e durante o implante em um indivíduo, perda de integridade estrutural (estado substancialmente sólido) após o implante, e ambiente citocompatível para suportar a viabilidade celular. A capacidade da matriz de liberação para manter as partículas implantadas (por exemplo, grânulos reticulados) espaçadas durante o implante aumenta o crescimento interno de tecido nativo. Se a matriz de liberação está ausente, então a compactação de grânulos celularizados durante o implante pode levar ao espaço inadequada para crescimento interno de tecido suficiente. A matriz de liberação facilita o implante de formulações sólidas. Além disso, a curta duração da integridade estrutural significa que logo após a implantação, a matriz não fornece uma barreira significativa para crescimento interno de tecido ou integração das células/materiais liberados com tecido hospedeiro. A matriz de liberação fornece localização da formulação aqui descrita, uma vez que a inserção de uma unidade sólida ajuda a impedir que os materiais dispersos dentro do tecido durante a implantação. Para as formulações à base de células, uma matriz sólida de liberação melhora a estabilidade e a viabilidade de células dependentes de ancoragem em relação a células em suspensão em um fluido.
[00216] Em uma modalidade, a matriz de liberação é uma população de grânulos biocompatíveis que não é propagada com células. Em outra modalidade, os grânulos não propagados estão dispersos por todo e entre os grânulos propagados de células individuais. Os grânulos não propagados atuam como "grânulos espaçadores" entre os grânulos propagados de células antes e imediatamente após o transplante. Os grânulos espaçadores contêm um biomaterial sensível à temperatura tendi um estado substancialmente sólido a uma primeira temperatura e um estado substancialmente líquido a uma segunda temperatura, em que a primeira temperatura é mais baixa do que a segunda temperatura. Por exemplo, os grânulos espaçadores contêm um biomaterial tendo um estado substancialmente sólido em cerca da temperatura ambiente ou abaixo, e um estado substancialmente líquido a cerca de 37°C, como o aqui descrito. Em uma modalidade, a temperatura ambiente é de cerca da temperatura da sala. Em outra modalidade, o biomaterial é uma solução de gelatina. A solução de gelatina está presente em cerca de 4%, cerca de 4,5%, cerca de 5%, cerca de 5,5%, cerca de 6%, cerca de 6,5%, cerca de 7%, cerca de 7,5%, cerca de 8%, cerca de 8,5%, cerca de 9%, cerca de 9,5%, cerca de 10%, cerca de 10,5%, ou cerca de 11%, (p/v). A solução de gelatina pode ser fornecida em PBS, meios de cultura de células (por exemplo, DMEM), ou outro solvente adequado.
[00217] Em um aspecto, a presente invenção fornece formulações que contêm biomateriais que são implantados em uma forma substancialmente sólida (por exemplo, grânulos espaçadores) e, em seguida, se liquefazem/derretem ou, de outro modo, perdem a integridade estrutural após implante no corpo. Isto está em contraste com o corpo significativo de trabalho com ênfase no uso de materiais que pode ser injetado na forma de um líquido, que em seguida, solidifica no corpo.
[00218] A sensibilidade à temperatura dos grânulos espaçadores pode ser avaliada in vitro antes da formulação. Grânulos espaçadores podem ser marcados e misturados com os grânulos não sensíveis à temperatura não marcados. A mistura é, em seguida, incubada a 37°C para se observar as alterações na transição física. A perda de forma dos grânulos sensíveis à temperatura marcados em temperatura mais elevada é observada ao longo do tempo. Por exemplo, grânulos de gelatina sensíveis à temperatura podem ser preparados com o corante azul Alcian para servir como um marcador de transição física. Os grânulos de gelatina azul são misturados com os grânulos Cuitispher S (branco), carregados em um cateter, em seguida, extrudidos e incubados em 1X PBS, pH 7,4, a 37°C. A perda de forma dos grânulos de gelatina azul é seguida microscopicamente em diferentes pontos de tempo. Alterações no estado físico dos grânulos de gelatina azul são visíveis após 30 min a se tornam mais pronunciadas com tempos de incubação prolongados. Os grânulos não se dissipam completamente devido à viscosidade do material.
[00219] As formulações de células bioativas aqui descritas podem ser utilizadas para preparar formulações à base de células renais para injeção no rim. No entanto, os especialistas na técnica apreciarão que as formulações serão adequados para muitos outros tipos de populações de célula bioativa. Por exemplo, a presente divulgação contempla formulações para células bioativas para injeção em qualquer órgão ou tecido sólido.
[00220] Em um aspecto, as formulações de células bioativas aqui descritas irão conter um determinado número de células. Em uma modalidade, o número total de células para a formulação é de cerca de 104, cerca de 105, cerca de 106, cerca de 107, cerca de 108, ou cerca de 109. Em uma modalidade, a dosagem de células de uma formulação descrita aqui pode ser calculada com base na massa estimada ou massa funcional do órgão ou tecido alvo. Em certas modalidades, as formulações de células bioativas contêm uma dosagem que corresponde a um número de células com base no peso do órgão hospedeiro que será o indivíduo de tratamento por formulação. Por exemplo, uma formulação de células renais bioativas se baseia em um peso médio de cerca de 150 gramas de um rim humano. Em uma modalidade, o número de células por grama (g) de rim é cerca de 600 células/g a cerca de 7,0 x 107 células/g. Em algumas modalidades, o número de células por grama de rim é cerca de 600 células/g, cerca de 1000 células/g, cerca de 1500 células/g, cerca de 2000 células/g, cerca de 2500 células/g, cerca de 3000 células/g, cerca de 3500 células/g, cerca de 4000 células/g, cerca de 4500 células/g, cerca de 5000 células/g, cerca de 5500 células/g, cerca de 6000 células/g, cerca de 6500 células/g, cerca de 7000 células/g, cerca de 7500 células/g, cerca de 8000 células/g, cerca de 8500 células/g, cerca de 9000 células/g, cerca de 9500 células/g, ou cerca de 10.000 células/g.
[00221] Em outras modalidades, o número de células por grama de rim é 1,5 x 104 células/g, cerca de 2,0 x 104 células/g, cerca de 2,5 x 104 células/g, cerca de 3,0 x 104 células/g, cerca de 3,5 x 104 células/g, cerca de 4,0 x 104 células/g, cerca de 4,5 x 104 células/g, cerca de 5,0 x 104 células/g, cerca de 5,5 x 104 células/g, cerca de 6,0 x 104 células/g, cerca de 6,5 x 104 células/g, cerca de 7,0 x 104 células/g, cerca de 7,5 x 104 células/g, cerca de 8,0 x 104 células/g, cerca de 9,5 x 104 células/g.
[00222] Em outras modalidades, o número de células por grama de rim é cerca de 1,0 x 105 células/g, cerca de 1,5 x 105 células/g, cerca de 2,0 x 105 células/g, cerca de 2,5 x 105 células/g, cerca de 3,0 x 105 células/g, cerca de 3,5 x 105 células/g, cerca de 4,0 x 105 células/g, cerca de 4,5 x 105 células/g, cerca de 5,0 x 105 células/g, cerca de 5,5 x 105 células/g, cerca de 6,0 x 105 células/g, cerca de 6,5 x 105 células/g, cerca de 7,0 x 105 células/g, cerca de 7,5 x 105 células/g, cerca de 8,0 x 105 células/g, cerca de 8,5 x 105 células/g, cerca de 9,0 x 105 células/g, ou cerca de 9,5 x 105 células/g.
[00223] Em outras modalidades, o número de células por grama de rim é cerca de 1,0 x 106 células/g, cerca de 1,5 x 106 células/g, cerca de 2,0 x 106 células/g, cerca de 2,5 x 106 células/g, cerca de 3,0 x 106 células/g, cerca de 3,5 x 106 células/g, cerca de 4,0 x 106 células/g, cerca de 4,5 x 106 células/g, cerca de 5,0 x 106 células/g, cerca de 5,5 x 106 células/g, cerca de 6,0 x 106 células/g, cerca de 6,5 x 106 células/g, cerca de 7,0 x 106 células/g, cerca de 7,5 x 106 células/g, cerca de 8,0 x 106 células/g, cerca de 8,5 x 106 células/g, cerca de 9,0 x 106 células/g, cerca de 9,5 x 106células/g, 1,0 x 107células/g, ou cerca de 1,5 x 107 células/g.
[00224] Um número total de células pode ser selecionado para a formulação e o volume da formulação pode ser ajustado para alcançar a dosagem adequada.
[00225] Em algumas modalidades, a formulação pode conter uma dosagem de células de um indivíduo que é uma dosagem única ou uma dose única mais dosagens adicionais. Em outras modalidades, as dosagens podem ser fornecidas por meio de uma construção, como aqui descrito. A quantidade terapeuticamente eficaz das populações de células renais ou misturas de populações de células renais aqui descritas pode variar entre o número máximo de células que é recebido de forma segura pelo indivíduo ao número mínimo de células necessárias para o tratamento de doença do rim, por exemplo, estabilização, reduzida taxa de queda, ou melhoria de uma ou mais funções renais.
[00226] A quantidade terapeuticamente eficaz das populações de células renais ou misturas das mesmas aqui descritas podem ser suspensas em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Esse veículo inclui, entre outros, a meio de cultura basal mais 1% de albumina de soro, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, colágeno, alginato, ácido hialurônico, cola de fibrina, polietilenoglicol, polivinilálcool, carboximetilcelulose e combinações dos mesmos. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.
[00227] Por conseguinte, a divulgação fornece uma utilização de uma formulação contendo populações de células renais ou misturas das mesmas, por exemplo, a população de células B2 sozinhas ou misturadas com as populações de células B3 e/ou B4 ou B4', para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doença renal em um indivíduo. Em algumas modalidades, o medicamento compreende ainda polipeptídeos recombinantes, como fatores de crescimento ou citocinas, quimiocinas. Em outras modalidades, os medicamentos compreendem uma população de células derivadas de rim humano. As células utilizadas para a fabricação dos medicamentos podem ser isoladas, derivadas, ou enriquecidas com qualquer das variações previstas para os métodos aqui descritos.
[00228] As preparações de células renais, ou misturas das mesmas, ou as composições são formuladas em conformidade com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa, administração intra-arterial ou administração no interior da cápsula renal, por exemplo, são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Sempre que necessário, a composição pode também incluir um anestésico local para aliviar qualquer dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos quer separadamente ou misturados em conjunto na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um concentrado criopreservado em um recipiente hermeticamente selado como uma ampola, indicando a quantidade do agente ativo. Quando a composição é administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água ou soluça salina estéril de grau farmacêutico. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril ou solução salina para injeção pode ser fornecida de modo que os ingredientes podem ser misturados antes da administração.
[00229] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular utilizado para administrar a composição. Por conseguinte, há uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (ver, por exemplo, Alfonso R Gennaro (ed), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, anteriormente Remington's Pharmaceutical Sciences 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2003, aqui incorporado como referência em sua totalidade). As composições farmacêuticas são geralmente formuladas como estéreis, substancialmente isotônicas e em plena conformidade com todos os regulamentos de Boas Práticas de Fabricação (GMP) da U.S. Food and Drug Administration.
[00230] Um aspecto ainda fornece uma formulação farmacêutica, que compreende uma preparação de células renais, por exemplo, preparação de células B2 sozinhas ou em combinação com a preparação de células B3 e/ou B4 ou B4', e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a formulação compreende de 10 4 a 10 9 células derivadas de rim de mamífero. Formulações de Liberação Modificada
[00231] Em um aspecto, as formulações da presente divulgação são fornecidas como formulações de liberação modificada. Em geral, a liberação modificada é caracterizada por uma liberação inicial de um primeiro agente ativo após administração seguida de pelo menos uma liberação adicional, subsequente de um segundo agente ativo. Os primeiro e segundo agentes ativos podem ser o mesmo ou podem ser diferentes. Em uma modalidade, as formulações fornecem liberação modificada através de múltiplos componentes na mesma formulação. Em outra modalidade, a formulação de liberação modificada contém um agente ativo como parte de um primeiro componente que permite que o agente ativo se mova livremente em todo o volume da formulação, permitindo assim liberação imediata no local alvo após administração. O primeiro componente pode ser um biomaterial sensível à temperatura tendo uma fase substancialmente líquida e uma fase substancialmente sólida, em que o primeiro componente está na fase substancialmente líquida no momento da administração. Em uma modalidade, o agente ativo na fase substancialmente líquida é substancialmente livre para se mover ao longo do volume da formulação, e por isso é imediatamente liberado para o local alvo após administração.
[00232] Em outra modalidade, a formulação de liberação modificada tem um agente ativo como parte de um segundo componente em que o agente ativo está ligado a, depositado em, revestido com, incorporado em, propagado sobre, ou aprisionado no segundo componente, o qual persiste antes e após administração ao local alvo. O segundo componente contém elementos estruturais com os quais o agente ativo é capaz de se associar com, impedindo assim a liberação imediata do agente ativo a partir do segundo componente no momento da administração. Por exemplo, o segundo componente é fornecido em uma forma substancialmente sólida, por exemplo, grânulos biocompatíveis, que podem ser reticulados para prevenir ou retardar a degradação enzimática in vivo. Em uma modalidade, o agente ativo na fase substancialmente sólida mantém a sua integridade estrutural no interior da formulação antes e depois da administração e, por conseguinte, não libera imediatamente o agente ativo para o local alvo após administração. Carreadores adequados para as formulações de liberação modificada foram aqui descritos, mas os especialistas na técnica apreciarão que outros carreadores são apropriados para utilização aqui.
[00233] Em uma modalidade, a formulação fornece uma liberação rápida inicial de elementos liberados, incluindo células, nanopartículas, moléculas terapêuticas, etc., seguido de uma liberação retardada depois de elementos. As formulações da presente invenção podem ser concebida para esse perfil de liberação bifásico onde o agente a ser liberado é fornecido em uma forma não fixada (por exemplo, células em uma solução) e uma forma fixada (por exemplo, células em conjunto com os grânulos ou outro carreador adequado). Após a administração inicial, o agente desimpedido é fornecido imediatamente para o local de liberação, enquanto a liberação do agente sobrecarregado é retardada até que a integridade estrutural do carreador (por exemplo, grânulos) falhe, ponto em que o agente previamente ligado é liberado. Como discutido abaixo, outros mecanismos adequados de liberação serão ser apreciados pelos especialistas na técnica.
[00234] O atraso de tempo para a liberação pode ser ajustado com base na natureza do agente ativo. Por exemplo, o atraso de tempo para a liberação de uma formulação de células bioativas pode ser da ordem de segundos, minutos, horas ou dias. Em algumas circunstâncias, um atraso na ordem de semanas, pode ser apropriado. Para outros agentes ativos, como moléculas pequenas ou grandes, o atraso de tempo para a liberação de uma formulação pode ser da ordem de segundos, minutos, horas, dias, semanas ou meses. É também possível que a formulação contenha diferentes biomateriais que fornecem diferentes perfis de liberação de atraso de tempo. Por exemplo, um primeiro biomaterial com um primeiro agente ativo pode ter um primeiro tempo de liberação, e um segundo biomaterial com um segundo agente ativo pode ter um segundo tempo de liberação. O primeiro e segundo agente ativo pode ser o mesmo ou diferente.
[00235] Como aqui discutido, o período de tempo de liberação retardada pode geralmente corresponder ao período de tempo para a perda da integridade estrutural de um biomaterial. No entanto, os especialistas na técnica irão apreciar outros mecanismos de liberação retardada. Por exemplo, um agente ativo pode ser liberado continuamente ao longo do tempo independente do tempo de degradação de qualquer biomaterial em particular, por exemplo, a difusão de uma fármaco a partir de uma matriz polimérica. Além disso, células bioativas podem migrar de uma formulação contendo um biomaterial e as células bioativas para o tecido nativo. Em uma modalidade, as células bioativas migram fora de um biomaterial, por exemplo, um grânulo, para o tecido nativo.
[00236] Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, como acetato de vinil de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. A absorção prolongada de formulações injetáveis pode ser provocada pela inclusão na formulação de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Muitos métodos para a preparação dessas formulações estão patenteadas ou são geralmente conhecidas pelos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Métodos adicionais aplicáveis para a liberação controlada ou prolongada dos agentes polipeptídicos são descritos, por exemplo, em Pedido de Patente U.S. Nos. 6.306.406 e 6.346.274, bem como, por exemplo, Pedido de Patente U.S. Nos. US20020182254 e US20020051808, todos os quais são aqui incorporados como referência. 9. Métodos e Vias de Administração
[00237] As formulações de células bioativas da presente invenção podem ser administradas isoladamente ou em combinação com outros componentes bioativos. As formulações são adequadas para injeção ou implante de elementos projetados de tecidos incorporados para o interior de órgãos sólidos para regenerar tecido. Além disso, as formulações são usadas para a injeção ou implantação de elementos projetados de tecidos para a parede de órgãos ocos para regenerar tecido.
[00238] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para fornecer uma formulação de células bioativa aqui descritas para um indivíduo em necessidade. Em uma modalidade, a fonte da célula bioativa pode ser autóloga ou alogênica, singênica (autogênica ou isogênica), e qualquer combinação das mesmas. Nos casos em que a fonte é não autóloga, os métodos podem incluir a administração de um agente imunossupressor. Fármacos imunossupressoras adequadas incluem, entre outras, azatioprina, ciclofosfamida, mizoribina, ciclosporina, hidrato de tacrolimus, clorambucil, lobenzarit dissódico, auranofina, alprostadil, cloridrato de gusperimus, biosinsorb, muromonab, alefacept, pentostatina, dadizumab, sirolimus, micofenolato de mofetil, leflonomida, basiliximab, dornase α, bindarid, cladribina, pimecrolimus, ilodecacina, cedelizumab, efalizumab, everolimus, anisperimus, gavilimomab, faralimomab, clofarabina, rapamicina siplizumab, saireito, LDP-03, CD4, SR-43551, SK&F- 106615, IDEC-114, IDEC-131, FTY-720, TSK-204, LF-080299, A- 86281, A-802715, GVH-313, HMR-1279, ZD-7349, IPL-423323, CBP- 1011, MT-1345, CNI-1493, CBP-2011, J-695, LJP-920, L-732531, ABX- RB2, AP-1903, IDPS, BMS-205820, BMS-224818, CTLA4-1g, ER- 49890, ER-38925, ISAtx-247, RDP-58, PNU-156804, LJP-1082, TMC- 95A, TV-4710, PTR-262-MG, e AGI-1096 (ver Patente 7.563.822). Os especialistas na técnica irão apreciar outras fármacos imunossupressoras adequadas.
[00239] Os métodos de tratamento da presente divulgação envolvem a liberação de uma formulação de células bioativas aqui descrita. Em uma modalidade, a administração direta de células para o local do benefício pretendido é preferencial. Um indivíduo em necessidade também pode ser tratado por contato in vivo de um rim nativo com uma formulação de células bioativas aqui descrita em conjunto com produtos de secreção a partir de uma ou mais populações enriquecidas de células renais, e/ou uma mistura ou construção contendo as mesmas.
[00240] A etapa de contato de um rim nativo in vivo com produtos secretados pode ser conseguida através do uso/administração de uma formulação contendo uma população de produtos segregados a partir de meios de cultura de células, por exemplo, meio condicionado, ou por implantação de uma população de células enriquecidas, e misturas, ou uma construção capaz de segregar os produtos in vivo. A etapa de contato in vivo fornece um efeito regenerativo para o rim nativo.
[00241] Uma variedade de meios para a administração de células e/ou produtos segregados para indivíduos será, em vista desta especificação, evidente para os especialistas na técnica. Esses métodos incluem injeção das células em um sítio alvo em um indivíduo.
[00242] As células e/ou produtos de secreção podem ser inseridos em um dispositivo ou veículo de liberação, o que facilita a introdução por injeção ou implante em todos os indivíduos. Em certas modalidades, o veículo de liberação pode incluir materiais naturais. Em certas outras modalidades, o veículo de liberação pode incluir materiais sintéticos. Em uma modalidade, o veículo de liberação fornece uma estrutura para imitar ou encaixar de forma adequada na arquitetura do órgão. Em outras modalidades, o veículo de liberação é tipo fluido por natureza. Esses dispositivos de administração podem incluir tubos, por exemplo, cateteres, para a injeção de células e fluidos dentro do corpo de um indivíduo receptor. Em uma modalidade preferencial, os tubos têm adicionalmente uma agulha, por exemplo, uma seringa, através da qual as células podem ser introduzidas no indivíduo em um local desejado. Em algumas modalidades, as populações de célula derivadas de rim de mamífero são formuladas para administração em um vaso sanguíneo através de um cateter (onde o termo "cateter" destina-se a incluir qualquer um dos vários sistemas tipo de tubo para a liberação de substâncias a um vaso sanguíneo). Alternativamente, as células podem ser inseridas dentro ou sobre um biomaterial ou estrutura, incluindo, entre outros a têxteis, como tecidos, tricôs, tranças, malhas e não tecidos, filmes perfurados, esponjas e espumas, e grânulos, como grânulos sólidos ou porosos, micropartículas, nanopartículas e afins (por exemplo, grânulos de gelatina Cultispher-S - Sigma). As células podem ser preparadas para a liberação de uma variedade de diferentes formas. Por exemplo, as células podem ser suspensas em uma solução ou gel. As células podem ser misturadas com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, em que as células permaneçam viáveis. Veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. A utilização desses veículos e diluentes é bem conhecida na técnica. A solução é, preferencialmente estéril e fluida, e, muitas vezes, será isotônica. Preferencialmente, a solução é estável sob as condições de fabricação e armazenamento e preservada contra a ação contaminante de micro-organismos como bactérias e fungos através da utilização de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e afins. Um especialista na técnica irá apreciar que o veículo de liberação usado na liberação das populações de células e misturas das mesmas podem incluir combinações das características acima mencionadas.
[00243] Os modos de administração das formulações contendo populações de isolados de células renais, por exemplo, a população de células B2 sozinho ou misturada com B4 'e/ou B3, incluem, entre outros, sistêmica, intrarrenal (por exemplo, parenquimatosa), e injeção intravenosa ou intra-arterial diretamente para o tecido no local pretendido da atividade. Modos adicionais de administração a ser utilizados incluem injeção única ou múltipla através de laparotomia direta, através de laparoscopia direta, transabdominal ou percutânea. Modos adicionais de administração a serem utilizados ainda incluem, por exemplo, perfusão retrógrada e ureteropélvica. Meios cirúrgicos de administração incluem procedimentos de uma etapa, como, entre outros, nefrectomia parcial e implante de construção, nefrectomia parcial, pielectomia parcial, vascularização com omento ± peritônio, faixas de agulha de biópsia multifocais, cone ou piramidal, para cilindro e substituição tipo pólo renal, bem como os procedimentos em duas etapas, incluindo, por exemplo, biorreator organoide-interno para replantio. Em uma modalidade, as formulações contendo misturas de células são liberadas pela mesma via, ao mesmo tempo. Em outra modalidade, cada uma das composições celulares que compreendem a mistura controlada são liberadas separadamente, ou para locais específicos através de métodos específicos, quer simultaneamente, quer de uma forma controlada temporalmente, por um ou mais dos métodos aqui descritos.
[00244] A dosagem de implante de células apropriada em humanos pode ser determinada a partir da informação relativa à atividade das células existentes, por exemplo, a produção de EPO, ou extrapolada a partir de estudos de dosagem realizados em estudos pré-clínicos. A partir de cultura in vitro e em experimentos em animais in vivo, a quantidade de células pode ser quantificada e utilizada para calcular uma dose adequada de material implantado. Além disso, o paciente pode ser monitorado para determinar se o implante adicional pode ser feita ou material implantado reduzido em conformidade.
[00245] Um ou mais outros componentes podem ser adicionados para as populações de células e misturas das mesmas, incluindo os componentes de matriz extracelular, como um ou mais tipos de colágeno selecionados ou ácido hialurônico conhecidos na técnica, e/ou fatores de crescimento, plasma rico em plaquetas e fármacos.
[00246] Os especialistas na técnica irão apreciar as várias formulações e métodos de administração adequadas para os produtos secretados aqui descritos. 10. Artigos de Fabricação e Kits
[00247] A presente descrição inclui ainda kits compreendendo as matrizes poliméricas e estruturas, como aqui revelado e materiais relacionados, e/ou meios de cultura de células e as instruções para uso. As instruções para utilização podem conter, por exemplo, instruções para a cultura das células ou a administração das células e/ou produtos de células. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit compreendendo uma estrutura, como aqui descrito e instruções. Ainda em outra modalidade, o kit inclui um agente para a detecção da expressão do marcador, os reagentes para uso do agente, e instruções para uso. Este kit pode ser utilizado para a finalidade de determinar o prognóstico de regeneração de um rim nativo em um indivíduo após o implante ou administração de uma população de células, uma mistura, ou uma construção aqui descrita. O kit também pode ser utilizado para determinar a eficácia bioterapêutica de uma população de células, mistura, ou a construção aqui descrita.
[00248] Outra modalidade é um artigo de fabricação contendo células bioativas úteis para o tratamento de indivíduos em necessidade. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo em ou associado com o recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar uma condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução ou um frasco possuindo uma rolha furável por uma agulha de injeção). Pelo menos um agente ativo na formulação é uma população de células bioativas, como fornecido aqui. O rótulo ou folheto informativo indica que a formulação é usada para tratar a condição em particular. O rótulo ou folheto informativo ainda irá compreender instruções para a administração da formulação ao paciente. Artigos de fabricação e kits que compreendem terapias combinatórias aqui descritas são também contemplados. Folheto informativo se refere a instruções habitualmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências sobre o uso desses produtos terapêuticos. Em uma modalidade, o folheto informativo indica que a formulação é utilizada para o tratamento de uma doença ou distúrbio, como, por exemplo, uma doença ou distúrbio renal. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. Os kits também são fornecidos que são úteis para vários fins, por exemplo, para a avaliação do resultado regenerativo. Os kits podem ser fornecidos, que contêm agentes de detecção de vesículas derivadas de urina e/ou o seu conteúdo, por exemplo, ácidos nucleicos (como miRNA), vesículas, exossomas, etc., como aqui descrito. Agentes de detecção incluem, entre outros, os iniciadores e sondas de ácidos nucleicos, bem como anticorpos para a detecção in vitro do alvo desejado. Como acontece com o artigo de manufatura, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo em ou associado com o recipiente. O recipiente contém uma composição compreendendo pelo menos um agente de detecção. Recipientes adicionais podem ser incluídos que contêm, por exemplo, diluentes e tampões ou agentes de detecção de controle. O rótulo ou folheto informativo pode fornecer uma descrição da composição, bem como instruções para o uso, prognóstico, ou diagnóstico pretendido in vitro. 11. Relatórios
[00249] Os métodos desta divulgação, quando praticados para fins comerciais geralmente produzem um relatório ou resumo do prognóstico regenerativo. Os métodos desta descrição irão produzir um relatório compreendendo uma previsão do provável curso ou o resultado de regeneração antes e depois de qualquer outra administração ou implante de uma formulação que contém uma população de células, uma mistura, ou uma construção aqui descrita. O relatório pode incluir informações sobre qualquer indicador pertinente para o prognóstico. Os métodos e os relatórios da presente divulgação podem ainda incluir armazenar o relatório em uma base de dados. Alternativamente, o método pode ainda criar um registro em um banco de dados para o indivíduo e preencher a ficha com os dados. Em uma modalidade, o relatório é um relatório de papel, em outra modalidade o relatório é um relatório auditivo, em outra modalidade o relatório é um registro eletrônico. É contemplado que o relatório é fornecido a um médico e/ou paciente. O recebimento do relatório pode incluir ainda estabelecer uma conexão de rede para um computador servidor que inclui os dados e informar e solicitar os dados e relatório a partir do computador servidor. Os métodos fornecidos aqui também podem ser automatizados, no todo ou em parte.
[00250] A invenção ilustrativamente descrita aqui pode ser adequadamente praticado na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não são especificamente aqui divulgadas. Assim, por exemplo, em cada caso aqui, qualquer dos termos "compreendendo", "que consiste essencialmente em" e "que consiste em" podem ser substituídos com qualquer um dos outros dois termos. Assim, para uma modalidade da invenção utilizando um dos termos, a invenção também inclui outra modalidade, em que um destes termos é substituído com outro destes termos. Em cada modalidade, os termos têm o significado estabelecido. Deste modo, por exemplo, uma modalidade pode incluir uma formulação "compreendendo" um número de componentes, outra modalidade pode incluir uma formulação "que consiste essencialmente em" os mesmos componentes, e uma terceira modalidade pode incluir uma formulação "que consiste em" os mesmos componentes. Os termos e expressões que foram empregados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção que no uso desses termos e expressões se exclua quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas ou porções das mesmas, mas é reconhecido que são possíveis várias modificações dentro do escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulgada por modalidades preferencial e características opcionais, a modificação e variação dos conceitos aqui revelados podem ser invocados pelos especialistas na técnica, e que essas modificações e variações são consideradas estando dentro do escopo desta invenção como definido pelas reivindicações anexas.
[00251] A descrição escrita anterior é considerada suficiente para permitir que um especialista na técnica pratique a invenção. Os Exemplos que se seguem são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de qualquer forma. De fato, várias modificações da invenção além das apresentadas e descritas aqui serão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição anterior e estão dentro do escopo das reivindicações anexas.
[00252] Todas as patentes, pedidos de patentes, e referências da literatura citadas na presente especificação são aqui incorporadas como referência em sua totalidade.
EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de Soluções
[00253] Esse exemplo fornece composições das várias formulações de meio e soluções usadas nos Exemplos a seguir para isolamento e caracterização da população de célula renal heterogênea, e fabricação do produto de terapia regenerativa. Tabela 1.1 Meio de Cultura e Soluções
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[00254] Solução Salina Tamponada de Dulbecco (DPBS) foi usada para todas as lavagens de célula.
Exemplo 2 Isolamento de população de célula renal não fracionada heterogênea
[00255] Esse exemplo ilustra o isolamento de população de célula renal heterogênea não fracionada (UNFX) de humano. A dissociação de tecido foi realizada para gerar suspensões de célula heterogêneas de tecido de rim humano.
[00256] Tecido renal através da biópsia de rim forneceu um material fonte para a população de célula renal heterogênea. O tecido renal compreendendo uma ou mais tecido cortical, junção corticomedular ou medular pode ser usado. É preferencial que o tecido de junção corticomedular seja usado. Vários núcleos de bióspia (mínimo 2), evitando cicatrizes, foram necessários de um rim CKD. O tecido renal foi obtido pelo investigador clínico do paciente no local da clínica aproximadamente 4 semanas antes da implantação prevista da NKA final. O tecido foi transportado no Meio de Transporte de Tecido do Exemplo 1.
[00257] O tecido foi então lavado com Solução de Lavagem de Tecido do Exemplo 1 a fim de reduzir a carga microbiana de entrada antes de processar o tecido para extrações de células.
[00258] O tecido renal foi picado, pesado, e dissociado na Solução de Digestão do Exemplo 1. A suspensão de células resultante foi neutralizada em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (D-MEM) + 10% de soro fetal bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad CA), lavada e ressuspensa em Meio Queratinócido livre de soro, livre de suplemento (KSFM) (Invitrogen). As suspensões de células foram então submetidas a um gradiente 15% (p/v) iodixanol (OptiPrep™, Sigma) para remover os glóbulos vermelhos e os detritos antes do início da cultura para frascos ou placas de poliestireno tratadas com cultura de tecidos a uma densidade de 25.000 células por cm2 em Meio de Crescimento de Célula Renal do Exemplo 1. Por exemplo, as células podem ser plaqueadas em frascos T500 Nunc em 25x106 células/frasco em 150 ml de meio 50:50.
Exemplo 3 Expansão de células da população de células renais isoladas
[00259] A expansão de células renais é dependente da quantidade de tecido recebido e o sucesso de isolar células renais do tecido recebido. Células isoladas podem ser criopreservadas, se necessário (ver infra). A cinética de crescimento de células renais pode variar de amostra para amostra devido à variabilidade inerente das células isoladas de pacientes individuais.
[00260] Um processo de expansão de célula definido foi desenvolvido que acomoda a faixa de recuperações de célula resultante da variabilidade do tecido recebido Tabela 3.1. A expansão de células renais envolve passagens seriais em frascos de cultura fechados (por exemplo, frascos em T, Cell Factories, HyperStacks®) no Meio de Crescimento de Célula Renal Tabela 1.1 usando procedimentos de cultura de célula definidos.
[00261] Um meio livre de BPE foi desenvolvido para testes clínicos humanos para eliminar os riscos inerentes associados ao uso de BPE. O crescimento, fenótipo (CK18) da célula e função da célula (atividade enzimática GGT e LAP) foram avaliados em meio livre de BPE e comparados ao meio contendo BPE utilizado nos estudos de animais. Função, o fenótipo e o crescimento de células renais foram equivalentes nos dois meios. (dados não mostrados) Tabela 3.1 Recuperação Celular de Biópsias de Rim
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[00262] Uma vez que o crescimento celular foi observado nos frascos T iniciais (passagem 0) e não havia nenhum sinal visual de contaminação, o meio de cultura foi substituído e mudou depois disso todos os dias 2-4 Figura 2B. As células foram avaliadas para verificar a morfologia de células renais por observação visual das culturas sob o microscópio. Culturas caracteristicamente demonstraram um pavimento apertado ou aparência de paralelepípedos, devido às células se agrupando juntas. Estas características morfológicas variam durante a expansão e podem não estar presentes em cada passagem. A confluência de cultura de células foi estimada usando uma Biblioteca de Imagens de células em vários níveis de confluência os frascos de cultura empregados durante expansões de célula.
[00263] As células renais foram passadas por tripsinização quando os frascos de cultura são pelo menos 50% confluentes Figura 2B. Células não fixadas foram coletadas em frascos contendo o Meio de Crescimento de Célula Renal, contadas e a viabilidade celular calculada. Em cada passagem de células, as células foram propagadas a 500-4000 células/cm2 em um número suficiente de frascos de cultura para ampliar o número de células ao exigido para a formulação de NKA Figura 2B. Frascos de cultura foram colocados em uma incubadora de 37°C em um ambiente de 5% CO2. Conforme descrito acima, confluência e morfologia celular foram monitorados e meios de cultura de tecido foram substituídos a cada 2-4 dias.
[00264] Tabela 3.2 lista a viabilidade de células renais humanas observadas durante o isolamento e expansão celular de seis biópsias de rim de doadores humanos. Tabela 3.2 Viabilidade Celular de Células Renais Humanas em Cultura
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[00265] A variabilidade inerente de tecido de diferentes pacientes resultou em rendimento de células diferente em cultura. Portanto, não é prático definir estritamente a programação de passagens de célula ou o número e o tipo de frascos de cultura necessários em cada passagem para atingir o número de células alvo. Normalmente as células renais passam por 2 ou 3 passagens; no entanto, a duração de cultura e rendimento de célula pode variar dependendo da taxa de crescimento celular. Isto é exemplificado na Figura 3, onde a duração da cultura e rendimentos de célula (cálculo) de 6 pacientes são mostrados.
[00266] As células foram desfixadas para colheita ou passagem com 0,25% Tripsina com EDTA (Invitrogen). A viabilidade foi avaliada através de exclusão de Tripan azul e a enumeração foi realizada manualmente usando um hemacitômetro ou usando o sistema de contagem Cellometer® automatizado, (Nexcelom Bioscience, Lawrence MA).
Exemplo 4 Criopreservação de Células Cultivadas
[00267] Células renais expandidas foram rotineiramente criopreservadas para acomodar variabilidade inerente de crescimento de células de pacientes individuais e para liberar o produto em uma programação clínica pré-determinada (Figura 2B). Células criopreservadas também fornecem uma fonte backup das células no evento de outro NKA ser necessário (por exemplo, atraso devido à doença do paciente, eventos imprevistos do processo, etc.). As condições foram estabelecidas que foram utilizadas para criopreservar células e recuperar células viáveis, funcionais após o descongelamento.
[00268] Para criopreservação, as células foram suspensas para uma concentração final de cerca de 50 x 106 células/mL em Solução de Criopreservação (ver Exemplo 1) e dispensadas em frascos. Frascos de um mL contendo cerca de 50 x 106 células/mL foram colocada na câmara de congelamento de um congelador de taxa controlada e congelados em ritmo pré-programado. Após congelamento, as células foram transferidas para um congelador de nitrogênio líquido para armazenamento em processo.
Exemplo 5 Preparação da população de célula SRC
[00269] Células Renais Selecionadas (SRC) podem ser preparadas dos frascos de cultura finais que são crescidos de células criopreservadas ou diretamente a partir de culturas de expansão dependendo da programação da Figura 2B.
[00270] Se usando células criopreservadas, as células foram descongeladas e plaqueadas em frascos de cultura de tecidos para uma etapa de expansão final. Quando os frascos de cultura finais foram aproximadamente 50-100% confluentes, as células estavam prontas para processamento para separação de SRC. Trocas de meio e lavagens finais de NKA diluíram qualquer Solução de Criopreservação residual no produto final.
[00271] Uma vez que os frascos de cultura celular finais chegaram a pelo menos 50% de confluência, os frascos de cultura foram transferidos para uma incubadora hipóxica definida para 2% de oxigênio em um ambiente 5% CO2 a 37oC e cultivados durante a noite. Ver Figura 2C. As células podem ser mantidas na incubadora controlada por oxigênio definida como 2% de oxigênio por tanto tempo quanto 48 horas. A exposição ao ambiente pobre em oxigênio (2%) mais fisiologicamente relevante melhorou a eficiência de separação de células e permitiu maior detecção de marcadores induzidos por hipóxia como VEGF.
[00272] Depois que as células foram expostas às condições hipóxicas por um tempo suficiente (por exemplo, durante a noite por 48 horas), as células foram desfixadas com 0,25% Tripsina com EDTA (Invitrogen). A viabilidade foi avaliada através de exclusão de Tripan azul e a enumeração foi realizada manualmente usando um hemacitômetro ou usando o sistema de contagem Cellometer® automatizado, (Nexcelom Bioscience, Lawrence MA). As células foram lavadas uma vez com DPBS e ressuspensas a cerca de 850x106 células/mL em DPBS.
[00273] A centrifugação de gradiente de densidade foi usada para separar populações de células renais colhidas com base na densidade flutuante de célula. Suspensões de células renais foram separadas em etapa única de 7% iodixanol Solução de Gradiente de Densidade (OptiPrep; 60% (p/v) em OptiMEM; ver Exemplo 1).
[00274] A solução de gradiente 7% OptiPrep foi preparada e o índice de refração indicativo da densidade desejada foi medido (R.I. 1,3456 +/-0,0004) antes do uso. Células renais colhidas foram empilhadas em cima da solução de gradiente. O gradiente de densidade foi centrifugado a 800 g por 20 min em temperatura ambiente (sem freio) em tubos de centrifugação ou um processador celular (por exemplo, COBE 2991). A fração celular apresentando densidade flutuante maior do que aproximadamente 1,045 g/mL foi coletada após centrifugação como um pélete distinto Figura 4. Células mantendo uma densidade flutuante de menos de 1,045 g/mL foram excluídas e descartadas.
[00275] O pélete SRC foi ressuspenso em DPBS (Figura 2C). A transferência de OptiPrep, FBS, meio de cultura e materiais auxiliares residuais no produto final é minimizada pelas etapas de lavagem 4 DPBS e 1 Solução de Gelatina.
Exemplo 6 Células com potencial terapêutico podem ser isoladas e propagadas de tecido renal normal e cronicamente doente
[00276] O objetivo do presente estudo foi determinar a caracterização funcional de células NKA humanas através da análise de alto teor (HCA). Imagens de alto teor (HCI) fornecem imagem simultânea de múltiplos eventos subcelulares usando duas ou mais sondas fluorescentes (multiplexação) através de um número de amostras. Análise de Alto Teor (HCA) fornece medida quantitativa simultânea de múltiplos parâmetros celulares capturadas em Imagens de Alto Teor. De forma breve, culturas não fracionadas (UNFX) foram geradas (Aboushwareb et al., World J Urol 26, 295, 2008) e mantidas independentemente de biópsias retiradas de cinco rins humanos com doença renal crônica avançada (CKD) e três rins humanos não CKD usando procedimentos de biópsia padrão. Após (2) passagens de UNFX ex vivo, as células foram colhidas e submetidas a métodos de gradiente de densidade (como descrito no Exemplo 2 de Basu et al., WO 2012/064369) para gerar subfrações, incluindo subfrações B2, B3 e/ou B4.
[00277] Tecidos de rim humano foram procurados de doadores humanos não CKD e CKD como resumido na Tabela 10.1 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347. A Figura 4 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347 mostra características histopatológicas das amostras HK17 e HK19. Culturas ex vivo foram estabelecidas de todos os rins não CKD (3/3) e CKD (5/5). Análise de alto teor (HCA) de transporte de albumina em células NKA humanas definindo regiões de interesse (ROI) é mostrada na Figura 5 (HCA de transporte de albumina em células NKA humanas) de Ilagan et al. PCT/US2011/036347. Comparação quantitativa do transporte de albumina em células NKA derivadas de rim não CKD e CKD é mostrada na Figura 6 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347. Conforme mostrado na Figura 6 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347, o transporte de albumina não é comprometido em culturas NKA derivadas de CKD. A análise comparativa da expressão de marcador entre subfrações B2 tubular enriquecidas e B4 esgotadas com célula tubular é mostrada na Figura 7 (CK8/18/19) de Ilagan et al. PCT/US2011/036347.
[00278] A análise funcional comparativa de transporte de albumina entre subfrações B2 tubular enriquecidas e B4 esgotadas com célula tubular é mostrada na Figura 8 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347. A subfração B2 é enriquecida em células do túbulo proximal e, portanto, apresenta a função de transporte de albumina aumentada.
[00279] Captação de albumina: Os meios de cultura de células cultivados para confluência em placas de 24 poços, colágeno IV (BD Biocoat™) foram substituídos por 18-24 horas com DMEM livre de vermelho de fenol, livre de soro, baixa glicose (pr-/s-/lg DMEM) contendo 1X antimicótico/antibiótico e 2mM glutamina. Imediatamente antes do ensaio, as células foram lavadas e incubadas por 30 minutos com pr-/s-/lg DMEM + 10mM HEPES, 2mM glutamina,1,8mM CaCl2, e 1mM MgCl2. As células foram expostas a 25μg/mL albumina bovina conjugada com rodamina (Invitrogen) por 30 min, lavadas com PBS gelado para parar a endocitose e fixadas imediatamente com 2% paraformaldeído contendo 25 μg/mL corante nuclear Hoechst. Para experimentos de inibição, 1μM proteína associada ao receptor (RAP) (Ray Biotech, Inc., Norcross GA) foi adicionado 10 minutos antes da adição de albumina. Imagem microscópica e a análise foi realizada com um BD Pathway™ 855 High-Content BioImager (Becton Dickinson) (ver Kelley et al. Am J Physiol Renal Physiol 2010 Nov;299(5):F1026-39. Epub Sep 8, 2010).
[00280] Em conclusão, o HCA produz dados de nível celular e pode revelar a dinâmica de populações que são indetectáveis por outros ensaios, ou seja, expressão de gene ou proteína. Um ensaio HCA ex vivo quantificável para medir a função de transporte de albumina (HCA- AT) pode ser utilizado para caracterizar as células tubulares renais humanas como componentes de protótipos NKA humanos. HCA-AT permitiu a avaliação comparativa da função celular, mostrando que células competentes em transporte de albumina foram retidas em culturas NKA derivadas de rins CKD humanos. Foi também demonstrado que subfrações específicas das culturas NKA, B2 e B4, foram distintas em fenótipo e função, com B2 representando uma fração enriquecida com célula tubular com atividade de transporte de albumina aumentada. A subpopulação de célula B2 de CKD humano é fenotipicamente e funcionalmente análoga às células B2 de roedores que demonstraram a eficácia in vivo (como mostrado acima).
Exemplo 7 Cultura de baixo oxigênio antes do gradiente afeta a distribuição de banda, composição, & expressão de gene
[00281] Para determinar o efeito das condições de oxigênio na distribuição e composição de protótipos B2 e B4, preparações de células neo-rim de diferentes espécies foram expostas a condições diferentes de oxigênio antes da etapa de gradiente. Uma preparação de célula de aumento de neo-rim de roedor (NKA) (RK069) foi estabelecida usando os procedimentos padrão para isolamento de célula de rato e iniciação de cultura, conforme descrito em Kelley et al, 2010, supra. Todos os frascos foram cultivados por 2-3 dias em condições de oxigênio 21% (atmosférica). O meio foi alterado e metade dos frascos foram então transferidos para uma incubadora controlada de oxigênio definida como 2% de oxigênio, enquanto os frascos restantes foram mantidos nas condições de oxigênio de 21%, por um adicional de 24 horas. As células foram então colhidas de cada conjunto de condições utilizando procedimentos de colheita enzimáticos padrão descritos supra. Gradientes de etapa foram preparados de acordo com os procedimentos padrão e as culturas "normóxicas" (21% de oxigênio) e "hipóxicas" (2% de oxigênio) foram colhidas separadamente e aplicadas lado a lado aos gradientes de etapa idênticos. Enquanto 4 bandas e um pélete foram gerados em ambas as condições, a distribuição das células ao longo do gradiente foi diferente em lotes cultivados de 21% e 2% de oxigênio (Tabela 7.1). Especificamente, o rendimento de B2 foi aumentado com hipóxia, com uma diminuição concomitante em B3. Além disso, a expressão de genes específicos de B4 (como eritropoietina) foi aumentada no gradiente resultante gerado a partir das células cultivadas em hipóxia (Figura 73 de Presnell et al. WO/2010/056328).
[00282] Uma preparação de célula NKA canina (DK008) foi estabelecida usando os procedimentos padrão para isolamento de célula de cão e cultura (análoga aos procedimentos de isolamento de roedores e cultura), conforme descrito em Basu et al., WO 2012/064369. Todos os frascos foram cultivados por 4 dias em condições de 21% de oxigênio (atmosférica), então um subconjunto de frascos foi transferido para hipóxia (2%) por 24 horas enquanto um subconjunto dos frascos foi mantido em 21%. Posteriormente, cada conjunto de frascos foi colhido e submetido a gradientes de etapa idênticos. Semelhante aos resultados de rato, as células de cão cultivadas em hipóxia distribuídas por todo o gradiente diferentemente do que as células de cão cultivadas em oxigênio atmosférico (Tabela 7.1). Novamente, o rendimento de B2 foi aumentado com a exposição hipóxica antes do gradiente, juntamente com uma diminuição concomitante na distribuição em B3. Tabela 7.1.
Figure img0005
[00283] Os dados acima mostram que exposição pré gradiente para hipóxia aumenta a composição do B2, bem como a distribuição das células especializadas específicas (células produtoras de eritropoietina, células vasculares, e células glomerulares) em B4. Assim, a cultura hipóxica, seguida por separação por gradiente de densidade, conforme descrito em Brum et al., supra, é uma maneira eficaz de gerar populações de células 'B2' e 'B4', entre espécies. Exemplo 8 Caracterização de uma mistura não fracionada de células renais isoladas de uma amostra de paciente de glomerulonefrite autoimune
[00284] Uma mistura não fracionada de células renais foi isolada, como descrito acima, de uma amostra de paciente de glomerulonefrite autoimune. Para determinar a composição genotípica imparcial das subpopulações específicas de células renais isoladas e expandidas de tecido renal, análise PCR quantitativa em tempo real (qRTPCR) (Brunskill et al., Dev. Cell. 2008 November; 15(5):781-791) foi empregada para identificar padrões de expressão de gene específica de tipo celular diferencial e específica de via entre as subfrações da célula. Como mostrado na Tabela 6.1 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347, HK20 é uma amostra de paciente de glomerulonefrite autoimune. Como mostrado na Tabela 6.2 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347, as células geradas a partir de HK20 são desprovidas de células glomerulares, conforme determinado por qRTPCR.
Exemplo 9 Caracterização genética das populações de células bioativas renais terapeuticamente relevantes isoladas de um caso de glomeruloesclerose segmentar focal
[00285] Para determinar a composição genotípica imparcial das subpopulações específicas de células renais isoladas e expandidas de tecido renal, análise PCR quantitativa em tempo real (qRTPCR) (Brunskill et al., supra 2008) foi empregada para identificar padrões de expressão de gene específica de tipo celular diferencial e específica de via entre as subfrações da célula. Preparação humana HK023, derivada de um caso de glomeruloesclerose segmentar focal (FSGS) em que uma grande porção de glomérulos foi destruída, foi avaliada a presença de células glomerulares na fração B4 no momento da colheita. De forma breve, culturas não fracionadas (UNFX) foram geradas (Aboushwareb et al., World J Urol 26, 295, 2008) e mantidas independentemente de cada uma das (4) biópsias de núcleo retiradas do rim usando procedimentos de biópsia padrão. Depois de (2) passagens de UNFX ex vivo, as células foram colhidas e submetidas a métodos de gradiente de densidade de acordo com o Exemplo 6 de Basu et al., WO2012/064369 para gerar subfrações, incluindo subfração B4, que é sabida para ser enriquecida por células endócrinas, vasculares e glomerulares com base no trabalho realizado em roedores, cães e outros espécimes humanos.
[00286] As frações B4 foram coletadas separadamente de cada amostra UNFX independente de HK023, aparecendo como bandas distintas de células com densidade flutuante entre 1,063 - 1,091 g/mL. RNA foi isolado de cada amostra e examinado para a expressão de Podocina (marcador de células glomerulares) e PECAM (marcador de células endoteliais) por PCR quantitativo em tempo real. Como esperado de uma amostra gerada em biopsia de um caso de FSGS grave, a presença de células glomerulares podocina(+) em frações B4 foi inconsistente, com podocina indetectável em 2/4 das amostras. Em contraste, células vasculares PECAM+ foram consistentemente presentes nas frações B4 de 4/4 das culturas iniciadas por biópsia. Assim, a fração B4 pode ser isolada na faixa de densidade de 1,0631,091 g/mL, até mesmo de rins humanos com estados graves de doença. Tabela 9.1 Expressão de Podocina e PECAM para a detecção de células glomerulares e vasculares em subfração B4 isolada de um caso de FSGS.
Figure img0006
[00287] Além disso, conforme mostrado na Tabela 7.2 de Ilagan et al. PCT/US2011/036347, amostra humana (HK018) apresentou Podocina não detectada (marcador glomerular) por qRTPCR após centrifugação de gradiente de densidade.
Exemplo 10 Enriquecimento/Depleção de Tipos de Células de Rim Viável Usando Separação de Célula Ativada por Fluorescência (FACS)
[00288] Uma ou mais células de rim isoladas podem ser enriquecidas, e/ou um ou mais tipos de células de rim específicas podem ser depletadas do tecido renal primário isolado usando separação de célula ativada por fluorescência (FACS).
[00289] REAGENTES: 70 % etanol; Tampão de lavagem (PBS); 50:50 Meio de célula renal (50% DMEM alta glicose): 50% Queratinócito-SFM; azul de Tripan 0,4%; Anticorpos primários direcionados para população de célula renal como CD31 para células endoteliais do rim e Nefrina para células glomerulares do rim. Anticorpos secundários fluorescentes específicos de isotipos correspondentes; Tampão de coloração (0,05% BSA em PBS).
[00290] PROCEDIMENTO: Seguindo os procedimentos padrão para limpeza da câmara de segurança biológica (BSC), uma suspensão de célula única de células do rim de isolamento primário ou células cultivadas podem ser obtidas de um frasco tratado T500 T/C e ressuspensas no meio de células de rim e colocadas em gelo. A contagem de células e viabilidade é determinada usando o método de exclusão azul de tripan. Para enriquecimento/depleção de célula de rim, por exemplo, células glomerulares ou células endoteliais de uma população heterogênea, entre 10 e 50 x 106 células vivas com uma viabilidade de pelo menos 70% são obtidas. A população heterogênea de células de rim então é corada com o anticorpo primário específico para tipo de célula alvo em uma concentração inicial de 1μg/0,1 ml de tampão de coloração/1 x 106 células (título se necessário). Anticorpo alvo pode ser conjugado como CD31 PE (específico para células endoteliais do rim) ou não conjugados como Nefrina (específico para células glomerulares nos rins).
[00291] Células são então coradas por 30 minutos em gelo ou 4oC protegidas da luz. Após 30 minutos de incubação, as células são lavadas por centrifugação a 300xg por 5 min. O pélete é então ressuspenso em PBS ou tampão de coloração dependendo se um anticorpo secundário específico de isotipo conjugado é necessário. Se as células são marcadas com um anticorpo primário conjugado com fluorcromo, as células são ressuspensas em 2mls de PBS por 107 células e continuam para FACS Aria ou seleção de células equivalente. Se as células não são marcadas com um anticorpo conjugado com fluorcromo, em seguida as células são marcadas com um anticorpo secundário conjugado com fluorcromo específico de isotipo em uma concentração inicial de 1ug/0,1ml/106 células.
[00292] As células são então coradas por 30 minutos em gelo ou 4oC protegidas da luz. Após 30 minutos de incubação, as células são lavadas por centrifugação a 300xg por 5 min. Após a centrifugação, o pélete é ressuspenso em PBS em uma concentração de 5x106/mL de PBS e então 4mls por 12x75mm são transferidos para um tubo estéril.
[00293] FACs Aria é preparado para seleção estéril de célula de acordo com as instruções do fabricante (BD FACs Aria User Manual). O tubo de amostra é carregado no FACs Aria e tensões de PMT são ajustadas após a aquisição começar. As portas são projetadas para selecionar os tipos de células específicas do rim usando intensidade fluorescente usando um comprimento de onda específico. Outra porta é projetada para selecionar a população negativa. Uma vez que os portões desejados foram projetados para encapsular a população-alvo positiva e a população negativa, as células são selecionadas usando as instruções do fabricante.
[00294] A população alvo positiva é coletada em um tubo cônico de 15ml e a população negativa em outro tubo cônico de 15 ml preenchido com 1 ml de meio de célula renal. Após a coleta, uma amostra de cada tubo é analisada por citometria de fluxo para determinar a pureza. As células coletadas são lavadas por centrifugação a 300xg por 5 min. e o pélete é resusspenso no meio de células de rim para análise e experimentação adicional.
Exemplo 11 Enriquecimento/Depleção de Tipos de Células de Rim Usando Seleção de Célula Magnética
[00295] Uma ou mais células de rim isoladas podem ser enriquecidas e/ou um ou mais tipos de células de rim específicas podem ser depletadas do tecido renal primário isolado.
[00296] REAGENTES: 70 % etanol, Tampão de lavagem (PBS), 50:50 Meio de célula renal (50% DMEM alta glicose): 50% Queratinócito-SFM, Azul de Tripan 0,4%, Tampão de Corrida (PBS, 2mM EDTA,0,5% BSA), Tampão de Lavagem (PBS,2mM EDTA), Solução de Limpeza (70% v/v etanol), Reagente de bloqueio Miltenyi FCR, microgrânulos Miltenyi específicos para isotipo IgG, anticorpo alvo como CD31(PECAM) ou Nefrina, ou anticorpo secundário.
[00297] PROCEDIMENTO: Seguindo os procedimentos padrão para limpeza da câmara de segurança biológica (BSC), uma suspensão de célula única de células do rim de isolamento primário ou cultura é obtida e ressuspensa no meio de células de rim. A contagem de células e viabilidade é determinada usando o método de exclusão tripan azul. Para enriquecimento/depleção de, por exemplo, células glomerulares ou células endoteliais de uma população heterogênea, pelo menos 106 até 4x109 células vivas com uma viabilidade de pelo menos 70% são obtidas.
[00298] A melhor separação para abordagem de enriquecimento/depleção é determinada com base na célula-alvo de interesse. Para o enriquecimento de uma frequência alvo de menos de 10%, por exemplo, células glomerulares usando anticorpo Nefrina, o Miltenyi autoMACS, ou equivalente, programa de instrumento POSSELDS (dupla positiva seleção no modo sensível) é usado. Para a depleção de uma frequência alvo maior que 10%, a Miltenyi autoMACS, ou equivalente, programa de instrumento DEPLETES (depleção em modo sensível) é usado.
[00299] Células vivas são marcadas com o anticorpo primário específico de alvo, por exemplo, anticorpo policlonal rb Nefrina para células glomerulares, adicionando 1μg/106 células/0,1ml de PBS com 0,05% BSA em um tubo de centrifuga cônico de 15 ml, seguido de incubação por 15 minutos a 4°C.
[00300] Após marcação, as células são lavadas para remover o anticorpo primário não ligado adicionando 1-2ml de tampão por 107 células seguidas por centrifugação a 300xg por 5min. Após a lavagem, o anticorpo secundário específico de isotipo, como PE anti-coelho de frango em 1ug/106/0,1ml de PBS com 0,05% BSA, é adicionado, seguido de incubação por 15 minutos a 4°C.
[00301] Após a incubação, as células são lavadas para remover o anticorpo secundário não ligado adicionando 1-2ml de tampão por 107 células seguido por centrifugação a 300xg por 5 min. O sobrenadante é removido e o pélete de célula é ressuspenso em 60μl de tampão por 107 células totais, seguido pela adição de 20μl de reagente de bloqueio FCR por 107 células totais, que é então misturado bem.
[00302] Adicionar 20 μl de microgrânulos MACS diretos (como microgrânulos anti-PE) e misturar e então incubar por 15 min a 4°C.
[00303] Após a incubação, as células são lavadas pela adição de 1020x o volume de tampão de marcação e centrifugação da suspensão de célula 300xg 5 min. e ressuspensão do pélete de célula em 500 μl-2mls de tampão por 108 células.
[00304] Pelas instruções do fabricante, o sistema autoMACS é limpo e iniciado em preparação para a separação de célula magnética usando autoMACS. Novos tubos de coleção estéreis são colocados sob as portas de saída. O programa de separação de células autoMACS é escolhido. Para seleção, o programa POSSELDS é escolhido. Para depleção, o programa DEPLETES é escolhido.
[00305] As células marcadas são inseridas na porta de captação, então, começa o programa. Após a seleção ou depleção de células, as amostras são coletadas e colocadas no gelo até o uso. A pureza da amostra selecionada ou depletada é verificada por citometria de fluxo. Exemplo 12 Caracterização Fenotípica da População de Célula Renal Heterogênea
Enriquecida
[00306] O exemplo a seguir detalha o uso de citometria de fluxo para caracterizar as células renais humanas heterogêneas selecionadas do Exemplo 5. A população de células renais heterogêneas foi composta principalmente de células epiteliais renais que são bem conhecidas por seu potencial regenerativo. Outras células parenquimatosas (vasculares) e do estroma (duto coletor) podem ser escassamente presentes na população de células autólogas.
[00307] O fenótipo celular é monitorado pela análise da expressão de marcadores de células renais usando citometria de fluxo. Análise fenotípica de células se baseia na utilização de marcadores antigênicos específicos para o tipo de célula sendo analisado. Análise de citometria de fluxo fornece uma medida quantitativa de células na população de amostra que expressam o marcador antigênico sendo analisado.
[00308] Uma variedade de marcadores é relatada na literatura como sendo útil para caracterização fenotípica de células renais: (i) citoqueratinas; (ii) proteínas de membrana de transporte (aquaporinas e cubilina); (iii) moléculas de ligação de célula (aderinas, aglomerado de diferenciação e lectinas); e (iv) enzimas metabólicas (glutationa). Uma vez que a maioria das células encontradas em culturas derivadas de digeridos de rim inteiro são células epiteliais e endoteliais, os marcadores examinaram foco na expressão de proteínas específicas para estes dois grupos.
[00309] Citoqueratinas é uma família de proteínas de filamento intermediário expressa por muitos tipos de células epiteliais em diferentes graus. O subconjunto de citoqueratinas expresso por uma célula epitelial depende do tipo de epitélio. Por exemplo, citoqueratinas 7, 8, 18 e 19 são todas expressas por epitélios simples normais do rim e do trato urogenital restante, bem como o trato respiratório e digestivo. Essas citoqueratinas em combinação são responsáveis pela integridade estrutural das células epiteliais. Essa combinação representa ambas as famílias de queratina ácidas (tipo I) e básicas (tipo II) e se encontra abundantemente expressa em células renais (Oosterwijk et al., J Histochem Cytochem, 38(3):385-392, 1990). Citoqueratinas preferenciais para uso aqui são CK8, CK18, CK19 e combinações das mesmas.
[00310] Aquaporinas são proteínas de membrana de transporte que permitem a passagem de água para dentro e fora da célula, evitando a passagem de íons e outros solutos. Existem treze aquaporinas descritas na literatura, com seis destas sendo encontradas no rim (Nielsen et al., J Histochem Cytochem, 38(3):385-392, 2002). Aquaporina2, exercendo um controle estreito na regulação do fluxo de água, é responsável pelas membranas de plasma de células epiteliais do ducto de coleta renal, tendo uma alta permeabilidade à água, permitindo assim que a água flua na direção de um gradiente osmótico (Bedford et al., J Am Soc Nephrol, 14(10):2581-2587, 2003; Takata et al., Histochem Cell Biol, 130(2):197-209, 2008; Tamma et al., Endocrinology, 148(3):1118-1130, 2007). Aquaporina1 é característica dos túbulos proximais (Baer et al., Cells Tissues Organs:184(1), 16-22, 2006; Nielsen et al., 2002, supra).
[00311] Cubilina é uma proteína de receptor de membrana de transporte. Quando a mesma se colocaliza com a proteína megalina, juntas, as mesmas promovem a internalização de ligantes ligados à cubilina como albumina. Cubilina está localizado dentro do epitélio do intestino e o rim (Christensen, Am J Physiol Renal Physiol, 280(4):F562- 573, 2001).
[00312] CXCR4 é uma proteína de membrana de transporte que serve como um receptor de quimiocina para SDF1. Após a ligação do ligante, o aumento dos níveis de cálcio intracelular e ativação de MAPK1/MAPK3 é aumentado. CXCR4 é constitutivamente expresso no rim e desempenha um papel importante no desenvolvimento do rim e tubulogênese (Ueland et al., Dev Dyn, 238(5):1083-1091, 2009).
[00313] As caderinas são proteínas de adesão celular dependentes de cálcio. As mesmas são classificadas em quatro grupos, com as E- caderinas sendo encontradas no tecido epitelial, e estando envolvidas na regulação da mobilidade e proliferação. E-caderina é uma glicoproteína transmembrana que foi encontrada como estando localizada nas junções de caderinas de células epiteliais que formam os túbulos distais no rim (Prozialeck et al., BMC Physiol, 4:10, 2004; Shen et al., Mod Pathol, 18(7):933-940, 2005).
[00314] DBA (aglutinina de Dolichos biflorus) é uma lectina ligante de α-N-acetilgalactosamina (proteína de ligação celular) realizada na superfície das estruturas do ducto de coleta renal, e é considerada e usada como um marcador geral de desenvolvimento de ductos de coleta renais e túbulos distais (Michael et al., J Anat 210(1):89-97, 2007; Lazzeri et al., J Am Soc Nephrol 18 (12):3128-3138, 2007).
[00315] Aglomerado de diferenciação 31 (CD31, também conhecida como molécula de adesão celular endotelial de plaquetas, PECAM-1) é uma proteína de adesão celular que é expressa por populações selecionadas de células imunes, bem como células endoteliais. Em células endoteliais, esta proteína está concentrada nas fronteiras da célula (DeLisser, 1997). O aglomerado de diferenciação 146 (CD146) está envolvido na adesão e coesão celular das células endoteliais em junções intercelulares associadas com o citoesqueleto de actina. Fortemente expressa pelo endotélio do vaso sanguíneo e músculo liso, CD146 é atualmente usada como um marcador para a linhagem de células endoteliais (Malyszko et al., J Clin Endocrinol Metab, 89(9):4620- 4627, 2004), e é o equivalente canino de CD31.
[00316] Gama-glutamil transpeptidase (GGT) é uma enzima metabólica que catalisa a transferência da fração de gama-glutamil de glutationa para um aceptor que pode ser um aminoácido, um peptídeo ou água, para formar glutamato. Esta enzima também desempenha um papel na síntese e degradação de glutationa e a transferência de aminoácidos através da membrana celular. GGT está presente nas membranas celulares de vários tecidos, incluindo as células do túbulo proximal dos rins (Horiuchi et al., Eur J Biochem, 87(3):429-437, 1978; Pretlow et al., J Histochem Cytochem, 35(4):483-487, 1987; Welbourne et al., Am J Physiol, 277(4 Pt 2):F501-505, 1999). A Tabela 12.1 fornece uma lista dos tipos específicos de células renais expressando esses marcadores como detectado por citometria de fluxo. Tabela 12.1 Marcadores Fenotípicos para Caracterização SRC
Figure img0007
[00317] As células SRC do Exemplo 5 foram investigadas para fenótipo de biomarcadores específicos.
[00318] Para imunofenotipagem: O anticorpo específico foi adicionado a 100 microlitros de suspensão de células e a mistura foi incubada no escuro por 30-45 minutos a 4°C. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover o excesso de anticorpo. As células foram ressuspensa para células/microlitros PBS e analisadas por citometria de fluxo. A análise de citometria de fluxo foi realizada com um citômetro de fluxo FACSAria (Becton Dickinson) e o software FlowJo (Treestar, Inc.). Os anticorpos usados para caracterizar o fenótipo de marcador de superfície são mostrados nas Tabelas 12.2 e 12.3. Controles negativos de anticorpo primário específicos de isotipo foram utilizados em todos os experimentos. Controles combinados de isotipo adequados foram usados para porta de populações negativas. Tabela 12.2. Painel de fenótipo para SRC Humana em NKA Relatado em IND
Figure img0008
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[00319] Abreviaturas: Gt, cabra; Ms, camundongo; mAb, anticorpo monoclonal; pAb, anticorpo policlonal; Rb, coelho. Tabela 12.3. Marcadores Fenotípicos Adicionais para Avaliação de SRC Humana
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[00320] Suspensões celulares foram geradas a partir de dissociação de tecido inicial ou tripsinização das culturas aderentes e analisadas por citometria de fluxo para identificar componentes celulares. Os anticorpos empregados estão listados nas Tabelas 12.2 e 12.3 (acima). Controles negativos de anticorpo primário específicos de isotipo foram utilizados em todos os experimentos. As células marcadas foram analisadas com um citômetro de fluxo FACSAria (Becton Dickinson) e o software FlowJo (Treestar, Inc.). Controles combinados de isotipo adequados foram usados para porta de populações negativas. Após uma incubação durante a noite a 4° C, as células foram peletizadas, lavadas duas vezes com Tampão Triton (0,2% Triton X-100 em PBS), ressuspensas em 1 mL de DBPS contendo anticorpo secundário IgG2A anticamundongo de cabra conjugado com o fluorcromo Alexa A647 (Invitrogen), e incubada por 30 minutos adicionais. As células foram então lavadas e ressuspensas em 1 mL de PBS para análise conforme as instruções do fabricante usando o software FACSAria e FlowJo. Como um controle negativo, as células foram incubadas em paralelo com anticorpos monoclonais combinados de isotipo conjugados com o mesmo fluorcromo.
[00321] A Figura 5 (Distribuição de Fenótipo) mostra expressão quantificada destes marcadores em populações de SRC plotadas como valores percentuais de cada fenótipo na população.
[00322] CK8/18/19 são as proteínas de células renais mais consistentemente expressas detectadas entre as espécies. GGT1 e Aquaporina 1 (AQP1) são expressas constantemente, mas em diferentes níveis. DBA, Aquaporina2 (AQP2), E-caderina (CAD), CK7 e CXCR4 também são observados em níveis modestos, embora com mais variabilidade, e CD31/146 e Cubilina foram menores na expressão. A Tabela 12.4 fornece os marcadores selecionados, faixa e valores de porcentagem média de fenotípicos em SRC e a lógica para sua seleção. Tabela 12.4 Marcador Selecionado para Análise Fenotípica de SRC
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Ducto Coletor Baixo* * Células epiteliais do ducto coletor são esperadas para serem baixas em SRC com base na sua densidade flutuante Expressão do Gene SRC
[00323] O perfil de expressão do gene SRC isolado de culturas de células renais humanas por reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR), incluindo o de aquaporina2, E-caderina, cubulina, VEGF e CD31 que também foram testados para a produção de proteína. Marcadores genotípicos na Tabela 12.5 são representativos de populações de células que podem ser esperadas para serem encontradas nas culturas de células renais. NCAD, Cubilina e CYP2R1 são marcadores de células epiteliais tubulares, AQP2 e ECAD são marcadores de ducto coletor e túbulos distais. Podocina e Nefrina são marcadores de podócitos. VEGF e CD31 são marcadores endoteliais. VEGF e EPO são genes responsivos de oxigênio com mRNA relacionado presente em uma variedade de diferentes tecidos e tipos de células.
[00324] Sondas de gene utilizadas foram obtidas de TaqMan. Células renais humanas de passagem 2 foram colhidas em 70-90% de confluência. RNA foi purificado a partir das células usando Qiagen's RNeasy Plus Mini Kit seguindo o protocolo para purificação de RNA Total de Animal Cells. cDNA foi gerado a partir de um volume de RNA igual a 1,4μg usando Kit de Síntese de cDNA Invitrogen SuperScript® VILO™ seguindo as instruções do fabricante. A média dos dados de qPCR para populações SRC (n=3) é mostrada na Tabela 12.5.
[00325] Os resultados sugerem que uma população de células epiteliais tubulares está presente, como evidenciado pelo nível de expressão relativamente mais elevado de NCAD, Cubilina e CYP2R1. Marcadores do Túbulo do Ducto Coletor Distal e Túbulo Distal AQP2 e ECAD são relativamente baixos e CD31, um marcador endotelial é ainda menor (Tabela 12.5). Tabela 12.5 Análise de Expressão de Gene de SRC humana
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[00326] Marcadores fenotípicos e funcionais foram escolhidos com base na avaliação genotípica inicial. Níveis de expressão de gene VEGF foram elevados e os níveis de expressão de gene aquaporina2 foram baixos, o que é consistente com os dados de análise de proteínas (Tabela 12.4 e Tabela 12.6).
Atividade Enzimática de SRC
[00327] A presença de células viáveis e função de SRC foi demonstrada pelo metabolismo do PrestoBlue e produção de VEGF e KIM-1.
[00328] SRC ativamente secreta proteínas que podem ser detectadas através da análise do meio condicionado. A função celular é avaliada pela capacidade das células de metabolizar PrestoBlue e secretar VEGF (Fator de Crescimento Endotelial Vascular) e KIM-1 (Molécula de Lesão Renal-1).
[00329] Células em funcionamento viáveis podem ser monitoradas em NKA por sua capacidade para metabolizar PrestoBlue. O Reagente de Viabilidade Celular PrestoBlue é um reagente de ensaio modificado baseado em resazurina que é um corante azul não fluorescente permeável na célula. Com a entrada em células que são suficientemente viáveis a proliferar, o corante é reduzido, através de processos celulares naturais envolvendo enzimas desidrogenase, para um fluoróforo vermelho brilhante que pode ser medido por fluorescência ou absorbância.
[00330] Biomoléculas VEGF e KIM-1 representam uma seleção de moléculas daqueles propostos como biomarcadores não clínicos analíticos sensíveis e específicos de lesão e função renal (Sistare, 2010; Warnock, 2010). In vivo, ambos estes marcadores são indicativos de função, lesão e/ou reparação tubular e in vitro são características reconhecidas de culturas de células epiteliais tubulares. KIM-1 é uma proteína extracelular ancorada na membrana das células do túbulo renal proximal que serve para reconhecer e fagocitar células apoptóticas que são perdidas durante a lesão e a renovação celular. VEGF, constitutivamente expresso por células renais, é um fator angiogênico pivô e pró-sobrevivência que promove a divisão celular, migração, sobrevivência da célula endotelial e brotação vascular. SRC foi caracterizado como constitutivamente expressando RNAm de VEGF (Tabela 12.5) e produzir ativamente a proteína (Tabela 12.6). Estas proteínas podem ser detectadas em meio de cultura exposto às células renais e SRC. A Tabela 12.6 apresenta quantidades de VEGF e KIM-1 presentes em meio condicionado de células renais e culturas SRC. Células renais foram cultivadas próximas da confluência. Meio condicionado da exposição durante a noite para as culturas de células renais e SRC foi testado para VEGF e KIM-1. Tabela 12.6 Produção de VEGF e KIM-1 por Células Renais Humanas e SRC
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[00331] A função celular de SRC, pré-formulação, também foi avaliada pela medição da atividade de duas enzimas específicas; GGT (Y-glutamil transpeptidase) e LAP (leucina aminopeptidase) (Chung, 1982, J Cell Biol 95(1):118-126), encontradas nos túbulos proximais renais. Métodos para medir a atividade destas enzimas nas células utilizam um substrato específico da enzima em solução que, quando adicionado às células que expressam a enzima ativa, são clivados, liberando um produto cromogênico (Nachlas, 1960 J Biophys Biochem Cytol 7:261-264; Tate, 1974 Proc Natl Acad Sci USA 71(9):3329-3333). A absorbância da solução exposta para célula- é medida e é relativa à quantidade de produto de clivagem resultante da enzima ativa. O substrato utilizado para GGT é cloridrato de ácido L-glutâmico Y—P— nitroanalida e para LAP é L-leucina p-nitroanalida. A Figura 6 mostra a atividade de LAP e GGT em seis amostras SRC produzidas a partir de doadores humanos (BP1-BP4).
Sumário de Caracterização de SRC
[00332] A morfologia celular foi monitorada durante a expansão da célula pela comparação das observações de cultura com imagens em uma Biblioteca de Imagens. A cinética de crescimento celular foi monitorada a cada passagem de célula. O crescimento celular é esperado para ser variável de paciente para paciente. Contagens de SRC e viabilidade foram monitorados pela exclusão do corante azul de Tripan e/ou metabolismo de PrestoBlue. SRC são caracterizados pela expressão fenotípica de CK18, GGT1. Além disso, a expressão de AQP2 pode ser monitorada. O metabolismo de PrestoBlue e produção de VEGF e KIM-1 são utilizados como marcadores para a presença de SRC viável e funcional. Função SRC pode ser elucidada ainda mais com o perfil de expressão de gene e medida da atividade enzimática com LAP e GGT. Exemplo 13 Preparação de BioMaterial
[00333] O Biomaterial usado em NKA (Solução de Gelatina) é caracterizado através de dois parâmetros principais:
[00334] Concentração - Concentração da Solução de Gelatina é medida por absorbância a 280nm usando um espectrofotômetro. A concentração de gelatina é determinada a partir de uma curva de calibração de absorbância versus concentração.
[00335] Teste de Inversão - O teste de inversão fornece uma avaliação visual da capacidade da Solução de Gelatina para formar e manter um gel a uma temperatura de 2-8°C e para o gel se liquefazer em temperatura ambiente. Elucidação das outras Características de Biomateriais
[00336] Biomateriais utilizados em NKA podem ser ainda caracterizados pelas propriedades reológicas e viscosidade. Teste de reologia e viscosidade serão realizados para fins de verificação apenas e são destinados a ser utilizados para caracterização expandida de biomateriais, obtidos de outros fornecedores.
[00337] As propriedades reológicas do Biomaterial podem ser medidas primeiramente em 4°C, então a 25°C com o uso de um reômetro estilo Couette Cell. A amostra é equilibrada por pelo menos 30 minutos a cada temperatura. Um módulo de armazenamento aceitável (G' >10) à temperatura mais baixa reflete a capacidade de a solução formar e manter um gel no transporte NKA e temperatura de transporte de 2-8°C. Um módulo de perda aceitável (G"<10) à temperatura mais elevada reflete a capacidade do gel para se liquefazer em temperatura ambiente como necessário para a liberação e implantação de NKA.
[00338] Viscosidade do Biomaterial é medida usando um viscosímetro de cone e placa a 37°C e uma taxa de cisalhamento de 200-300 s-1. As soluções com viscosidades na faixa de 1,05-1,35 cP podem ser liberadas eficientemente através de agulhas de calibre 1827.
[00339] Em preparação para a formulação de NKA, gelatina é dissolvida em DPBS a uma concentração especificada (0,88% ± 0,12% p/v) para formar uma Solução de Gelatina (Figura 2D). Solução de Gelatina foi esterilizada em filtro através de um filtro de 0,1 μm e aliquotada em tubos. As amostras foram tomadas para liberação da Solução de Gelatina antes do congelamento ou formulação de NKA. O hidrogel gelificado é armazenado refrigerado ou congelado, como um material a granel ou pronto para formulação (Figura 2D).
Exemplo 14 Formulação NKA
[00340] SRC lavados do Exemplo 5 foram contados usando a exclusão do corante azul de Tripan. A Solução de Gelatina foi removida do armazenamento frio e liquefeita por aquecimento a 26-30°C. Um volume de suspensão SRC contendo o número necessário de células foi centrifugado e ressuspenso em Solução de Gelatina liquefeita para uma etapa de lavagem final. Esta suspensão foi centrifugada e o pélete SRC é ressuspenso em Solução de Gelatina suficiente para atingir uma concentração de SRC resultante de 100x106 células/mL no NKA formulado (Figura 2D).
[00341] NKA é apresentado em uma seringa de 10ml estéril de uso único. O volume final foi calculado a partir da concentração de 100x106 SRC/mL de NKA e a dose alvo de 3,0x106 SRC/g de peso de rim (estimado por MRI).
Exemplo 15 Gelificação e Preenchimento NKA
[00342] O produto NKA foi assepticamente preenchido para a seringa no pacote NKA em um BSC para processamento de tecido e operações de cultura de célula (Figura 2D). Amostragem de ar dinâmico foi realizada para a duração do processo de preenchimento, incluindo amostragem de viável e não viável.
[00343] NKA formulado foi contido em um tubo de centrífuga estéril de 50mL. Uma cânula estéril foi fixada a uma seringa de transferência de 10mL. NKA foi retirado manualmente para a seringa de transferência do tubo de 50mL através da cânula. A cânula foi removida e a seringa de transferência foi ligada ao conector de encaixe luer-lock na extremidade do tubo do pacote NKA. NKA foi transferido para a seringa no pacote NKA despressionando o êmbolo da seringa de transferência. Um mínimo de 8,5 mL de produto foi transferido para a seringa no pacote NKA. O ar aprisionado na seringa foi removido invertendo a seringa e liberando lentamente o êmbolo. Após o preenchimento estar completo, a tubulação do pacote NKA foi selada com um Selador RF. O produto remanescente na seringa de transferência foi retornado para o tubo de 50mL. Amostras de controle de qualidade (teste de liberação) foram tomadas do tubo de 50mL. O pacote NKA foi girado por um mínimo de 2 horas para manter as células em suspensão, enquanto resfriando a 2-8°C para formar o NKA gelificado final (Figura 2D).
[00344] Refrigeração rápida foi necessária para a gelificação acontecer para que as células não sedimentem na Solução de Gelatina. A temperatura da Solução de Gelatina em uma seringa foi monitorada à medida que foi colocada em condições refrigeradas. Queda rápida de temperatura foi observada. Depois de 1 hora, a temperatura tinha caído para dentro de 0,3°C da temperatura final 4,4°C.
[00345] O resfriamento da Solução de Gelatina inicia o processo de gelificação, mas uma quantidade finita de tempo foi necessária para o gel formado se estabilizar de forma que o SRC permanecerá suspenso no gel no armazenamento. As seringas contendo NKA formulado foram giradas durante a noite ou por 1,25 horas e então mantidas na posição vertical durante a noite. Posteriormente, os conteúdos foram removidos, e a concentração de células foi medida em quatro diferentes segmentos do produto. A análise indica que não houve diferença entre os quatro segmentos, assim nenhuma sedimentação mensurável de célula ocorre, uma vez que NKA girou em temperatura fria por um mínimo de 1,25 horas (dados não mostrados).
Exemplo 16 Empacotamento e Transporte NKA
[00346] NKA foi embalado juntamente com a documentação apropriada para o transportador NKA. O Transportador é projetado para manter uma faixa de temperatura de 2-8oC durante o transporte para o local clínico. O produto formulado resfriado (gelificado) tem uma vida de prateleira de 3 dias.
[00347] Um registrador de temperatura foi incluído com o pacote NKA para monitorar a temperatura durante o transporte. O número de lote de NKA foi verificado contra o ID exclusivo do paciente registrado no livro de registro de envio/recebimento pelo grupo de Qualidade. O transportador NKA foi transportado ao local clínico através de correio ou transporte seguro semelhante.
Exemplo 17 Implantação do NKA (População de Células SRC)
[00348] Este exemplo demonstra as propriedades regenerativas das células renais humanas heterogêneas selecionadas. Sistema de Liberação NKA
[00349] O sistema de liberação NKA foi composto de uma cânula (agulha) compatível com a liberação celular e uma seringa. Fornecedores diferentes usam os termos cânula ou agulha para descrever produtos de liberação celular. Para esta descrição, os termos cânula e agulha são usados de modo intercambiável. O ensaio clínico proposto utilizou o mesmo sistema de liberação (cânula e seringa) utilizado nos estudos animais adaptados ao tamanho e anatomia humana. Um procedimento de cirurgia laparoscópica foi usado.
[00350] O principal componente do sistema de liberação NKA foi a cânula. Uma cânula que fosse compatível com NKA foi usada. Implante NKA
[00351] Na preparação para o implante, NKA se aqueceu para temperatura ambiente antes da injeção para o rim para liquefazer o produto.
[00352] NKA foi direcionado para injeção no córtex renal através de uma agulha ou cânula e seringa compatível com a liberação celular. O uso de uma agulha perfurante (cânula) para penetrar a cápsula renal permitiu a introdução da cânula/agulha de liberação no córtex renal. A seringa contendo NKA foi fixada para a agulha de liberação e NKA foi injetado em vários locais no córtex renal. O esquema da Figura 7 ilustra o conceito de injetar NKA em um rim usando uma agulha compatível com liberação celular e distribuição em um órgão sólido.
[00353] NKA foi liberado diretamente no córtex renal. A liberação NKA em pacientes usou um procedimento laparoscópico padronizado.
[00354] Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz das mesmas serão sugeridas para pessoas especialistas na técnica e devem ser incluídos dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados aqui são aqui incorporados como referência em suas totalidades para todos os efeitos.

Claims (25)

1. Método de preparação de uma composição terapêutica adequada para gerar uma resposta regenerativa em um rim de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: determinar uma população de células renais heterogênea como tendo um potencial regenerativo, em que a determinação compreende estabelecer que: (i) mais de 4,5% das células da população expressam GGT-1; (ii) mais de 80% das células da população expressam uma citoqueratina (CK); e (iii) as células da população secretam VEGF e KIM-1, e em que a população de células renais heterogênea é preparada a partir de uma amostra de rim do indivíduo; e formular a população de células renais heterogênea, determinada como tendo um potencial regenerativo, em uma composição terapêutica.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de células renais heterogênea é preparada a partir da amostra de rim do indivíduo por um método que compreende uma etapa de centrifugação em gradiente de densidade.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a população heterogênea de células renais é enriquecida em células epiteliais renais.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a CK compreende uma ou mais dentre CK8, CK18 e CK19.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que CK é CK18.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa de caracterização compreende a determinação de que mais de 10% das células da população expressam GGT-1.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende estabelecer que mais de 18% das células da população expressam GGT-1.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende ainda estabelecer que entre 3% e 53,7% das células da população expressam AQP2.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação compreende ainda estabelecer que as células da população metabolizam PrestoBlue.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende suspender a população heterogênea de células renais em um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável compreende um ou mais dentre solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, colágeno, alginato, ácido hialurônico, polietilenoglicol, álcool polivinílico e carboximetilcelulose.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende combinar a população heterogênea de células renais com um biomaterial.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o biomaterial é um líquido ou um hidrogel.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o hidrogel compreende gelatina ou colágeno.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende ainda vesículas.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem microvesículas ou exossomos.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem RNA.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o RNA compreende microRNA.
19. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que é preparada de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
20. Uso de uma composição terapêutica, como definida na reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um paciente com doença renal.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a população heterogênea de células renais é isolada de uma amostra de rim do paciente.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a doença renal compreende insuficiência renal crônica.
23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que a formulação compreende ainda um hidrogel.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o hidrogel compreende um biomaterial à base de gelatina.
25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que o paciente é um ser humano.
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