BR112021002703A2 - composições compreendendo vesículas derivadas de células e usos das mesmas - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se, inter alia, a produtos extracelulares (por exemplo, vesículas tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) produzidas por células renais (tais como células renais bioativas, por exemplo, células renais selecionadas). Os métodos de alteração dos componentes (tais como miRNAs ou proteínas) de vesículas produzidas por células, assim como métodos de produção de vesículas compreendendo vários compostos também são incluídos. Também estão providos os métodos diagnósticos e de tratamento.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO VESÍCULAS DERIVADAS DE CÉLULAS E USOS DAS MESMAS".
ANTECEDENTES
[0001] O estudo de vesículas extracelulares, mais notadamente exossomas, tem crescido rapidamente. Múltiplos artigos foram publicados em relação à biogênese da exossoma (Kowal et al., 2014, Curr Opin Cell Biol. 29C:116-125), seu potencial diagnóstico e prognóstico (Revenfeld et al., 2014, Clin Ther. 36(6):830-846), e potencial aplicação terapêutica na medicina regenerativa e engenharia de tecidos (Lamichhane et al., 2014, Tissue Eng Part B Rev.). Esses vetores de mRNAs, miRNAs, proteínas, e mediadores lipídicos são capazes de agir em células alvo facilitando a comunicação célula-célula e a troca de informação genética funcional (Simons and Raposo, 2009, Curr Opin Cell Biol. 21(4):575‐581; Stoorvogel et al., 2002, Traffic 3(5):321‐330; Nieuwland and Sturk, 2010, Thrombosis Research 125(Supplement 1):S49‐S51).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0002] São providos no presente documento, inter alia, produtos extracelulares (por exemplo, vesículas tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) produzidas por células renais (tais como células renais bioativas, por exemplo, células renais selecionadas). Em certas modalidades, os referidos produtos são usados para tratar doenças renais tal como doença renal crônica. Métodos de alteração de componentes (tais como miRNAs ou proteínas) de vesículas produzidas por células, assim como métodos de produção de vesículas compreendendo vários compostos também estão incluídos. Também estão providos métodos diagnósticos e de tratamento.
[0003] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de tratamento uma doença renal em um indivíduo. Em certas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de vesículas de células renais secretadas isoladas, em que as vesículas são administradas por injeção intravenosa ou por liberação com transcateter.
[0004] Em um aspecto, é provido no presente documento um método para detectar pelo menos um composto em uma vesícula. Em certas modalidades, o método compreende obter a vesícula e detectar se pelo menos um composto está na vesícula, em que (i) pelo menos um composto é uma proteína, e a proteína é CD9, CD81, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44, CD49e, e/ou SSEA-4; (ii) pelo menos um composto compreende miRNAs, em que os miRNAs incluem pelo menos dois de miR-145, miR-22, miR-7, miR-10a, miR-143, e/ou let7b; e/ou (iii) pelo menos um composto não é expressado ou produzido por células renais em um rim nativo.
[0005] Em um aspecto, é provido no presente documento um método para monitorar o tratamento com uma população de células renais bioativas em um indivíduo que foi administrado a população de células renais bioativas. Em certas modalidades, o método compreende detectar se pelo menos um composto está presente em uma vesícula a partir do indivíduo de acordo com um método divulgado no presente documento.
[0006] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de identificar se uma vesícula é regenerativa. Em certas modalidades, o método compreende (i) detectar se uma proteína e/ou miRNAs estão na vesícula de acordo com um método divulgado no presente documento; e (ii) identificar a vesícula como regenerativa se a proteína e/ou miRNAs forem detectadas na vesícula.
[0007] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de detecção do nível de pelo menos um miRNA em vesículas a partir de uma população de células renais bioativas. Em certas modalidades, o método compreende (i) detectar se uma ou mais das seguintes moléculas de miRNA estão aumentadas nas vesículas comparado a um controle: miR-1248, miR-3168, miR-7113-5p, miR- 758-3p, miR-937-3p, miR-4455, miR-4521, miR-203a-3p, miR-22-3p, miR-574-3p, miR-181b-5p, miR-1260b, e/ou miR-181b-5p; e (ii) detectar se uma ou mais das seguintes moléculas de miRNA estão diminuídas nas vesículas comparado a um controle: miR-1-3p, miR-1-3p, miR-143- 3p, miR-150-5p, miR-509-3p, miR-653-5p, miR-204-5p, miR-192-5p, e/ou miR-363-3p. Em certas modalidades, o miRNA é miRNA de mamífero tal como miRNA humano.
[0008] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo. Em certas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de vesículas a partir de uma preparação de vesículas, em que uma vesícula a partir da preparação de vesículas foi identificada como regenerativa de acordo com um método divulgado no presente documento.
[0009] Em certas modalidades, é provido no presente documento um método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma população de células renais bioativas suplementada com vesículas de células renais que não foram secretadas pela população de células renais bioativas.
[0010] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de alteração do nível de pelo menos um miRNA e/ou proteína em vesículas produzidas por uma população de células renais bioativas, o método compreendendo cultivar a população sob condições hipóxicas.
[0011] Em um aspecto, é provida no presente documento uma vesícula compreendendo um composto que não é produzido por células renais em um rim nativo.
[0012] Em um aspecto, é provida no presente documento uma composição compreendendo a vesícula divulgada no presente documento e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0013] Em um aspecto, é provida no presente documento uma composição compreendendo uma vesícula de célula renal e uma vesícula de célula não renal.
[0014] Em um aspecto, é provida no presente documento uma composição compreendendo uma vesícula produzida por uma célula renal primária e uma vesícula produzida por uma célula renal selecionada.
[0015] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo. Em certas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição divulgada no presente documento.
[0016] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de produção de vesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas) a partir de células, em que as vesículas compreendem um composto que não é produzido pelas células. Em certas modalidades, o método compreende isolar as vesículas a partir de um sobrenadante de cultura celular, em que o sobrenadante de cultura celular é de uma cultura de células que foram colocadas em contato com (por exemplo, incubadas em meio contendo) o composto. Em certas modalidades, o método compreende isolar as vesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas) a partir de um sobrenadante de cultura celular, e depois incorporar o composto nas vesículas através da permeabilização das membranas de exossoma para facilitar a entrada do composto (por exemplo, através de sonicação, lipofecção, eletroporação etc.).
[0017] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de produção de um exossoma renal, em que o exossoma compreende um composto que não é produzido pelas células renais em um rim nativo. Em certas modalidades, o método compreende isolar uma vesícula a partir de um sobrenadante de cultura de células renais, em que o sobrenadante de cultura de células renais é de uma cultura de células renais compreendendo uma população de células renais bioativas que tiveram contato com o composto.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0018] FIGURA 1: Diagrama de fluxo de um exemplo não limitante de um processo de fabricação de NKA completo.
[0019] FIGs. 2A-D: Diagramas de fluxo provendo maiores detalhes do processo do exemplo não limitante apresentado na FIGURA 1.
[0020] FIGs. 3A-D: Diagramas de fluxo de um exemplo não limitante da produção de NKA que é suplementada com exossomas a partir de SRCs.
[0021] FIGs. 4A-D: são gráficos mostrando a análise da proteína superficial de exossomas secretados isolados a partir de ambos TCHK0012 e TCHK0013. A análise revelou que CD133, CD326 e CD49e são suprarregulados em expressão para SRC comparado com BRC. Embora a função que precisa de CD133 permaneça desconhecida, foi proposto que ela age como um organizador da topologia da membrana celular. A molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) (também conhecida como CD326) é uma glicoproteína de transmembrana mediando a adesão célula-célula homotípica Ca2+- independente no epitélio. EpCAM também está envolvida na sinalização, migração, proliferação e diferenciação celular. Além da adesão, as integrinas tais como CD49e são conhecidas por participar na sinalização mediada pela superfície celular. As setas foram adicionadas às FIGs. 4B-D para enfatizar comparações entre exossomas a partir de BRC-3A e SRC.
[0022] FIGURA 5: Gráficos a partir da análise FACs da fusão de exossomas às células. A marcação fluorescente de células, indicativa da transferência de corante lipofílico dos exossomas para a membrana celular, resulta em um deslocamento da linha do histograma da esquerda para a direita. Os exossomas não se ligarão e integrarão com as membranas celulares em 4 graus C. Este é um controle negativo. A incubação em 37 graus C permite a ligação e integração, sendo assim a marcação fluorescente das células, deslocando com isso o histograma da esquerda para a direita.
[0023] FIGURA 6: Gráfico mostrando a proliferação celular como contagem celular média (eixo y) em resposta à dose variável de exossomas originados de populações de células renais (dose/resposta com 1X = x ng/ml de exossoma).
[0024] FIGs. 7A-C: Imagens de células. As culturas foram incubadas por 9 h em seguida ao tratamento. A. Meio livre de fator de crescimento, livre de soro (controle negativo). B. Meio livre de fator de crescimento, livre de soro suplementado com exossomas 10E10 (artigo de teste). C. meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento (controle positivo).
[0025] FIGURA 8: grupos de miRNA que diferem significativamente entre os pares de condições experimentais E1 vs D1 são divulgados no gráfico do tipo vulcão. O gráfico do tipo vulcão mostra a distribuição de miRNAs diferencialmente expressados de acordo com a variação de dobra (eixo x) e significância (logaritmo negativo do valor P no eixo y). A linha pontilhada horizontal é o corte de valor P (0,05), e as linhas pontilhadas verticais são o corte da variação da dobra |Log2| ≥1). Vide também tabelas 11-13.
[0026] FIGURA 9: grupos de miRNA que diferem significativamente entre os pares de condições experimentais F1 vs A1 são divulgados no gráfico do tipo vulcão. Vide também as tabelas 14-16.
[0027] FIGURA 10: Diagrama de fluxo de um exemplo não limitante de um processo de fabricação de exossoma.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0028] São providos no presente documento, inter alia, produtos extracelulares (por exemplo, vesículas tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) produzidas pelas células renais (tais como células renais bioativas, por exemplo, células renais selecionadas).
[0029] Todas as referências citadas ao longo da divulgação são expressamente incorporadas a título de referência em sua totalidade. No evento de que um ou mais da literatura, patentes e materiais similares incorporados difiram de ou contradigam esse pedido, incluindo porém sem se limitar aos termos definidos, usagem de termos, técnicas descritas ou similares, este pedido prevalece. Definições
[0030] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como compreendido comumente por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Principles of Tissue Engineering, 3rd Ed. (Edited by R Lanza, R Langer, & J Vacanti), 2007 provê um versado na técnica com uma orientação geral a muitos dos termos usados no presente pedido. Um versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento, que poderiam ser usados na prática da presente invenção. De fato, a presente invenção não está de modo algum limitada aos métodos e materiais descritos.
[0031] Conforme usado no presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “a/o” pretendem incluir também as formas plurais, a menos que o contexto claramente indique o contrário. Conforme usado no presente documento, o termo “e/ou” inclui qualquer e todas as combinações de um ou mais dos itens associados listados.
[0032] Nesta divulgação, “compreende”, “compreendo”, “contendo” e “tendo” e similares podem ter o significado atribuído a eles na lei de Patentes Norte-americana e podem significar “inclui”, “incluindo” e similares. “Consistindo essencialmente de” ou “consiste essencialmente” da mesma forma tem o significado atribuído na lei de Patentes Norte-americana e o termo fica em aberto, permitindo a presença de mais do que aquela que é citada desde que características básicas ou novas do que sejam citadas não sejam alteradas pela presença de mais do que aquela que é citada, mas exclui modalidades da técnica anterior.
[0033] Conforme usado no presente documento, o termo “cerca de” no contexto de um valor ou faixa numérica significa ±10% do valor ou faixa numérica citada ou reivindicada, a menos que o contexto necessite de uma faixa mais limitada.
[0034] O termo “população celular” conforme usado no presente documento se refere a um número de células obtidas por isolamento diretamente a partir de uma fonte de tecido adequada, geralmente a partir de um mamífero. Em certas modalidades, a população celular isolada pode ser subsequentemente cultivada in vitro. Os versados na técnica entenderão que vários métodos para isolar e cultivar populações celulares para uso com a presente divulgação e vários números de células em uma população celular que é adequada para uso na presente divulgação. Em certas modalidades, uma população celular pode ser uma população celular heterogênea e não fracionada ou uma população celular homogênea enriquecida derivada de um órgão ou tecido, por exemplo, os rins. Em certas modalidades, uma população celular heterogênea pode ser isolada de uma biopsia de tecido ou do tecido do órgão total. Em certas modalidades, a população celular heterogênea pode ser derivada de culturas in vitro de células de mamíferos, estabelecidas a partir de biopsias de tecido ou tecido do órgão total.
Uma população celular heterogênea não fracionada também pode ser referida como uma população celular não enriquecida. Em certas modalidades, as populações celulares contêm células bioativas. As populações celulares homogêneas compreendem uma maior proporção de células do mesmo tipo celular, que compartilham um fenótipo comum ou têm propriedades físicas similares, quando se compara com uma população celular heterogênea não fracionada. Em certas modalidades, a população celular homogênea pode ser isolada, extraída ou enriquecida a partir da população de células renais heterogênea. Em certas modalidades, uma população celular enriquecida é obtida como uma fração celular usando a separação por centrifugação ao longo de um limite de densidade, barreira ou interface de uma suspensão celular heterogênea. Em certas modalidades, uma população celular enriquecida é obtida como uma fração celular usando separação do gradiente de densidade contínua ou descontínua (de etapa única ou múltiplas etapas) de uma suspensão celular heterogênea. Em certas modalidades, uma população celular pode compreender 1, 2, 3, 4 ou mais tipos de células renais. Em certas modalidades, uma população celular homogênea ou heterogênea obtida dos rins é combinada com uma população celular homogênea ou heterogênea obtida de um tecido ou órgão diferente dos rins, sem limitação adicional.
[0035] Conforme usado no presente documento, o termo “bioativo” significa “possuindo atividade biológica”, tais como uma atividade farmacológica ou terapêutica. Em certas modalidades, a bioatividade é o melhoramento da função renal e/ou efeito na homeostase renal. Em certas modalidades, a atividade biológica é, sem limitação, analgésica; antiviral; anti-inflamatória; antineoplásica; imunoestimulante; imunomoduladora; melhoramento da viabilidade celular, antioxidação, transportadora de oxigênio, recrutamento celular, ligação celular, imunossupressora, angiogênese, atividade de cicatrização e feridas,
mobilização de células-tronco ou células progenitoras de hospedeiro, proliferação celular, estimulação de migração celular para sítios de lesão, melhora de fibrose celular e tecido, interferência com a cascata de sinalização epitelial-mesenquimal, secreção de citocinas, fatores de crescimento, proteínas, ácidos nucleicos, exossomas, microvesículas ou qualquer combinação dos mesmos.
[0036] O termo “células renais bioativas” ou “BRCs” conforme usado no presente documento se refere às células renais tendo uma ou mais das seguintes propriedades quando administradas nos rins de um indivíduo: capacidade de reduzir (por exemplo, retardar ou parar) a piora ou progressão da doença renal crônica ou um sintoma da mesma, capacidade de melhorar a função renal, capacidade de afetar (melhorar) a homeostase renal, e capacidade de promover cicatrização, reparo e/ou regeneração do tecido renal ou dos rins. Em certas modalidades, as microvesículas a partir de BRCs e/ou BRCs podem ser administradas a um paciente, em que o hiplótipo das BRCs é diferente do haplótipo do paciente. Em certas modalidades, as BRCs são células capazes de melhorar a função renal, afetar (melhorar) a homeostase renal, e/ou promover cicatrização, reparo e/ou regeneração do tecido renal ou dos rins sem rejeição imunológica. Em certas modalidades, essas células podem incluir células tubulares funcionais (por exemplo, baseadas nas melhoras da excreção de creatinina e retenção de proteína), células glomerulares (por exemplo, baseadas na melhora na retenção de proteína), células vasculares, e/ou outras células da junção corticomedular. Em certas modalidades, as BRCs têm um efeito regenerativo nos rins. Em certas modalidades, as BRCs compreendem, consistem essencialmente de, ou consistem de células renais selecionadas (SRCs). Em certas modalidades, as BRCs são SRCs. Em certas modalidades, as BRCs são obtidas a partir do isolamento e expansão das células renais a partir do tecido renal. Em certas modalidades, as BRCs são obtidas a partir do isolamento e expansão das células renais a partir do tecido renal usando métodos que selecionam células bioativas (por exemplo, células com capacidade regenerativa).
[0037] Em certas modalidades, as SRCs são células obtidas a partir do isolamento e expansão das células renais a partir de uma fonte de tecido renal adequada, em que as SRCs contêm uma maior porcentagem de um ou mais tipos celulares e carecem ou têm uma menor porcentagem de um ou mais outros tipos celulares, quando se compara com uma população de células renais inicial. Em certas modalidades, as SRCs contêm uma proporção aumentada de BRCs comparada com uma população de células renais inicial. Em certas modalidades, uma população de SRC é uma população isolada de células renais enriquecida por componentes bioativos específicos e/ou tipos celulares e/ou depletadas de componentes inativos e/ou indesejados específicos ou tipos celulares para uso no tratamento de doença renal, isto é, prover estabilização e/ou melhora e/ou regeneração da função renal. Em certas modalidades, as microvesículas a partir de SRCs e/ou SRCs podem ser administradas a um paciente, em que o hiplótipo das SRCs é diferente do haplótipo do paciente. Em certas modalidades, as SRCs são capazes de prover estabilização e/ou melhora e/ou regeneração da função renal. As SRCs proveem os resultados terapêuticos e regenerativos superiores quando se compara com uma população inicial. Em certas modalidades, as SRCs são obtidas a partir do tecido cortical renal do paciente através de uma biopsia renal. Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas (por exemplo, por MACS ou FACS) com base na sua expressão de um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as SRCs são depletadas (por exemplo, por MACS ou FACS) de um ou mais tipos celulares com base na expressão de um ou mais marcadores nos tipos celulares. Em certas modalidades, a depleção ou seleção de células compreende acoplamento de esfera/anticorpo para tirar células com certas proteínas na sua superfície celular.
Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas a partir de uma população de células renais bioativas.
Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas pela separação do gradiente de densidade de células renais expandidas.
Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas pela separação de células renais expandidas através da centrifugação através de um limite de densidade, barreira, ou interface, ou separação de gradiente de etapa descontínua de etapa única.
Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas pela separação de gradiente de densidade contínua ou descontínua de células renais expandidas que foram cultivadas sob condições hipóxicas.
Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas por separação do gradiente de densidade de células renais expandidas que foram cultivadas sob condições hipóxicas por pelo menos cerca de 8, 12, 16, 20 ou 24 horas.
Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas através da separação por centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface de células renais expandidas que foram cultivadas sob condições hipóxicas.
Em certas modalidades, as SRCs são selecionadas pela separação das células renais expandidas que foram cultivadas sob condições hipóxicas por pelo menos cerca de 8, 12, 16, 20 ou 24 horas pela centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface (por exemplo, separação do gradiente de densidade descontínua de etapa única). Em certas modalidades, as SRCs são compostas primariamente de células tubulares renais.
Em certas modalidades, outras células parenquimais (por exemplo, vasculares) e estromais (por exemplo, duto coletor) podem estar presentes em SRCs.
Em certas modalidades, menos de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células em uma população de SRCs são células vasculares.
Em certas modalidades, menos de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células em uma população de SRCs são células de duto coletor. Em certas modalidades, menos de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% das células em uma população de SRCs são células vasculares ou células de duto coletor. Os métodos para obter SRCs são divulgados, por exemplo, no exemplo 1 no presente documento, Presnell et al. WO/2010/056328, Ilagan et al. PCT/US2011/036347, e Jain et al. PCT/US2016/044866.
[0038] O termo “órgão nativo” deve significar o órgão de um indivíduo vivo. O indivíduo pode ser saudável ou doente. Um indivíduo doente pode ter uma doença associada com aquele órgão específico.
[0039] O termo “rim nativo” deve significar o rim de um indivíduo vivo. O indivíduo pode ser saudável ou doente. Um indivíduo doente pode ter uma doença renal.
[0040] O termo “efeito regenerativo” deve significar um efeito que provê um benefício a um órgão nativo, tal como o rim. O efeito pode incluir, sem limitação, uma redução no grau de lesão a um órgão nativo ou uma melhora, restauração de, ou estabilização de uma função ou estrutura de um órgão nativo. A lesão renal pode ser na forma de fibrose, inflamação, hipertrofia glomerular, atrofia, etc. e ser relacionada a uma doença associada com o órgão nativo no indivíduo.
[0041] Uma população ou preparação celular “enriquecida” se refere a uma população celular derivada de uma população celular inicial (por exemplo, uma população celular heterogênea, não fracionada a partir de um órgão tal como um rim) que contém uma maior porcentagem de um tipo de célula específico do que a porcentagem daquele tipo celular na população inicial. Por exemplo, uma população celular renal inicial pode ser enriquecida por uma primeira, uma segunda, uma terceira, uma quarta, uma quinta, e assim por diante, população celular de interesse. Conforme usado no presente documento, os termos
“população celular”, “preparação celular” e “fenótipo celular” são usados de forma intercambiável.
[0042] O termo condições de cultura “hipóxicas” conforme usado no presente documento se refere a condições de cultura nas quais as células são submetidas a uma redução nos níveis disponíveis de oxigênio no sistema de cultura em relação às condições de cultura padronizadas nas quais as células são cultivadas em níveis de oxigênio atmosférico (cerca de 21%). Em certas modalidades, uma condição de cultura hipóxica na qual o nível de oxigênio no sistema de cultura é menor do que 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1%.
[0043] O termo “biomaterial” conforme usado no presente documento se refere a um material biocompatível natural ou sintético que é adequado para introdução no tecido vivo suportando as células bioativas selecionadas em um estado viável. Um biomaterial natural é um material que é feito por ou se origina a partir de um sistema vivo. Os biomateriais sintéticos são materiais que não são feitos por ou não se originam diretamente de um sistema vivo, mas que são de outra forma sintetizados ou compostos por procedimentos químicos específicos e protocolos bem conhecidos daqueles versados na técnica. Os biomateriais divulgados no presente documento podem ser uma combinação de materiais biocompatíveis naturais e sintéticos. Conforme usado no presente documento, os biomateriais incluem, por exemplo, matrizes e estruturas poliméricas. Aqueles versados na técnica compreenderão que o(s) biomaterial(ais) podem ser configurados de várias formas, por exemplo, como espuma porosa, géis, líquidos, esferas, sólidos e podem compreender um ou mais materiais biocompatíveis naturais ou sintéticos. Em certas modalidades, o biomaterial é a forma líquida de uma solução que é capaz de se tornar um hidrogel.
[0044] O termo “hidrogel” é usado no presente documento para se referir a uma substância formada quando um polímero orgânico (natural ou sintético) é reticulado através de ligações covalentes, iônicas ou ligações de hidrogênio para criar uma estrutura tridimensional (por exemplo, uma estrutura reticular aberta) que prende moléculas de água para formar um gel. Os exemplos de materiais que podem ser usados para formar um hidrogel incluem polissacarídeos tais como alginato, polifosfazinas e poliacrilatos, que são reticulados tonicamente, ou copolímeros em bloco tais como Pluronics™ ou Tetronics™, copolímeros em bloco de óxido de polietileno-polipropileno glicol que são reticulados por temperatura ou pH, respectivamente. Em certas modalidades, um hidrogel is a hidrogel baseado em gelatina biodegradável.
[0045] Em certas modalidades, os biomateriais incluem, por exemplo, matriz extracelular derivada de um rim existente de origem humana ou animal, em que a população celular nativa foi eliminada através da aplicação de detergentes e/ou outros agentes químicos conhecidos daqueles versados na técnica. Em certas modalidades, o biomaterial é uma forma líquida de uma solução que é capaz de se tornar um hidrogel e é estratificada com ou sem certas populações celulares através da aplicação de metodologias de bioimpressão tridimensional conhecidas daqueles versados na técnica. Em certas modalidades, o biomaterial é configurado para mimetizar a organização fractal dimensional do rim descelularizado.
[0046] O termo “liberação modificada” ou os termos equivalentes “liberação controlada”, “liberação retardada” ou “liberação lenta” se referem a formulações que liberam um agente ativo, tais como células bioativas, com o tempo ou em mais de um momento em seguida à administração a um indivíduo. A liberação modificada de um agente ativo, que pode ocorrer durante uma faixa de tempos desejados, por exemplo, minutos, horas, dias, semanas ou mais, dependendo da formulação, está em contraste com formulações nas quais substancialmente a unidade farmacêutica de dosagem inteira está disponível imediatamente depois da administração. Em certas modalidades, para aplicações de medicina regenerativa e engenharia de tecido, as formulações de liberação modificada proveem a liberação de um agente ativo em múltiplos momentos em seguida à administração local (por exemplo, administração de um agente ativo diretamente em um órgão sólido). Por exemplo, a formulação de liberação modificada de células bioativas pode prover uma liberação inicial de células imediatamente no momento da administração e uma segunda liberação de células, mais tarde, em um momento posterior. Em certas modalidades, o intervalo de tempo para a segunda liberação de um agente ativo pode ser de minutos, horas ou dias depois da administração inicial. Em geral, o período de tempo para o intervalo da liberação corresponde ao período de tempo que leva para um veículo biomaterial do agente ativo perder a sua integridade estrutural. A liberação retardada de um agente ativo inicia tão logo quanto a referida integridade começa a se degradar e é completada no momento em que a integridade falha completamente. Aqueles versados na técnica apreciarão outros mecanismos de liberação adequados.
[0047] O termo “temperatura ambiente” se refere à temperatura na qual as formulações da presente divulgação serão administradas a um indivíduo. Em geral, a temperatura ambiente é a temperatura de um ambiente de temperatura controlada. A temperatura ambiente varia de cerca de 18°C até cerca de 30°C. Em certas modalidades, a temperatura ambiente é cerca de 18°C, cerca de 19°C, cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, ou de cerca de 30°C.
[0048] Os exemplos não limitantes de doenças renais incluem distúrbios associados com qualquer estágio ou grau de insuficiência renal aguda ou crônica que resulta em uma perda da capacidade do rim em realizar a função da filtração do sangue e eliminação de fluidos em excesso, eletrólitos, e resíduos do sangue. Em certas modalidades, a doença renal também pode incluir disfunções endócrinas tais como anemia (deficiência de eritropoietina) e desiquilíbrio mineral (deficiência de vitamina D). A doença renal pode se originar nos rins ou pode ser secundária a uma variedade de condições, incluindo (mas não limitado a) insuficiência cardíaca, hipertensão, diabetes, doença autoimune ou doença hepática. A doença renal pode ser uma condição de insuficiência renal crônica que se desenvolve depois de uma lesão aguda nos rins. Por exemplo, a lesão nos rins por isquemia e/ou exposição a tóxicos pode causar insuficiência renal aguda; a recuperação incompleta depois da lesão renal aguda pode levar ao desenvolvimento de insuficiência renal crônica.
[0049] O termo “tratamento” se refere a ambos o tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas para doença renal, anemia, deficiência no transporte tubular ou deficiência na filtração glomerular em que o objetivo é para reverter, prevenir ou retardar (por exemplo, reduzir a piora do) distúrbio direcionado. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já têm uma doença renal, anemia, deficiência no transporte tubular ou deficiência na filtração glomerular assim como aqueles estão sujeitos a ou em risco de ter uma doença renal, anemia, deficiência no transporte tubular ou deficiência na filtração glomerular ou aqueles em que a doença renal, anemia, tubular deficiência no transporte tubular ou deficiência na filtração glomerular deve ser prevenida. O termo “tratamento” conforme usado no presente documento inclui a estabilização e/ou melhora da função renal.
[0050] Em certas modalidades, “contatar in vivo” um órgão nativo com um agente ativo (tais como uma população enriquecida de células e/ou um produto da mesma) se refere ao contato direto in vivo entre o agente ativo e o órgão nativo. Por exemplo, os produtos secretados por uma população enriquecida de células renais pode contatar in vivo um rim nativo (sozinho ou junto com as células, por exemplo, em um construto). Em certas modalidades, o contato direto in vivo pode ser parácrino, endócrino ou juxtácrino na natureza. Em certas modalidades, os produtos secretados podem ser uma população heterogênea de produtos diferentes descrita no presente documento.
[0051] Em certas modalidades, é provido no presente documento um “construto” ou “formulação” compreendendo uma ou mais populações celulares, e/ou um ou mais produtos celulares (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) depositados sobre ou em uma superfície de um biomaterial (tais como uma estrutura ou matriz feita de um ou mais materiais biocompatíveis sintéticos ou que ocorrem naturalmente). Em certas modalidades, uma ou mais populações celulares podem ser revestidas com, depositadas sobre, embutidas em, ligadas a, semeadas ou presas em um biomaterial feito de um ou mais materiais biocompatíveis sintéticos ou que ocorrem naturalmente, polímeros, proteínas ou peptídeos. Em certas modalidades, o biomaterial que ocorre naturalmente é rim descelularizado de origem humana ou animal. Em certas modalidades, o biomaterial foi estruturalmente engenheirado através da bioimpressão tridimensional. Em certas modalidades, uma ou mais populações celulares e/ou produtos celulares podem ser combinados com um biomaterial ou estrutura ou matriz in vitro ou in vivo. Em certas modalidades, um ou mais biomateriais usados para gerar o construto ou formulação podem ser selecionados para direcionar, facilitar ou permitir a dispersão e/ou integração dos componentes celulares do construto com o tecido hospedeiro endógeno, ou para direcionar, facilitar ou permitir a sobrevivência, enxerto, tolerância ou desempenho funcional performance dos componentes celulares do construto ou formulação. Em certas modalidades, um ou mais materiais biocompatíveis usados para formar a estrutura/biomaterial são selecionados para direcionar, facilitar ou permitir a formação da organização multicelular, tridimensional de pelo menos uma das populações celulares depositadas nela. Em certas modalidades, os biomateriais direcionam, promovem ou facilitam a configuração de agregados ou organoides celulares tridimensionais definidos que recapitulam aspectos do tecido renal nativo, incluindo porém sem se limitar à polaridade organizacional. Em certas modalidades, os biomateriais direcionam a configuração de estruturas tubulares definidas que recapitulam aspectos do tecido renal nativo, incluindo lúmens. Em certas modalidades, os biomateriais promovem ou facilitam a secreção de proteínas, ácidos nucleicos e microvesículas a partir das populações celulares. Em certas modalidades, um ou mais biomateriais usados para gerar o construto também podem ser selecionados para mimetizar ou recapitular aspectos da organização tridimensional ou nicho ambiental específico dentro de um rim nativo ou parênquima renal representando o ambiente biológico original a partir do qual uma população celular foi derivada. Sem se ater a qualquer teoria científica, acredita-se que a recriação do nicho biológico original a partir do qual essas populações celulares foram obtidas promova ou facilite de forma adicional a viabilidade celular e potência.
[0052] O termo “agregado celular” ou “esferoide” se refere a um agregado ou conjunto de células cultivadas para permitir crescimento 3D conforme oposto ao crescimento como uma monocamada. Nota-se que o termo “esferoide” não implica que o agregado é uma esfera geométrica. Em certas modalidades, o agregado pode ser altamente organizado com uma morfologia e polaridade bem definidas ou ele pode ser uma massa desorganizada; ele pode incluir um tipo de célula única ou mais do que um tipo celular. Em certas modalidades, as células podem ser isolados primários, ou uma linhagem celular permanente, ou uma combinação dos dois. Estão incluídos nesta definição os organoides e culturas organotípicas. Em certas modalidades, os esferoides (por exemplo, agregados celulares ou organoides) são formados em um frasco giratório. Em certas modalidades, os esferoides (por exemplo, agregados celulares ou organoides) são formados em uma matriz tridimensional.
[0053] O termo “Aumento neo-renal (NKA)” se refere a uma formulação de células bioativas que é um produto injetável composto de SRCs formuladas em um biomaterial compreendido de um hidrogel à base de gelatina. O termo “Terapia celular avançada (ACT)” também é usado em referência ao tratamento com NKA. Em certas modalidades, NKA é um produto injetável compreendendo uma população celular renal imunocompatível (por exemplo, SRCs imunocompatíveis) formuladas em um biomaterial compreendido de um hidrogel à base de gelatina. Em certas modalidades, NKA é um produto injetável composto de SRCs homólogas, imunoprivilegiadas, genomicamente modificadas que são incapazes de rejeição imune formulada em um biomaterial compreendido de um hidrogel à base de gelatina.
[0054] O termo “indivíduo” deve significar qualquer indivíduo humano único, incluindo um paciente, elegível para tratamento, que está experimentando ou experimentou um ou mais sinais, sintomas, ou outros indicadores de uma doença renal. Os referidos indivíduos incluem sem limitação indivíduos que são recém diagnosticados ou anteriormente diagnosticados e estão agora experimentando uma recorrência ou recaída, ou estão em risco para uma doença renal, qualquer que seja a causa. O indivíduo pode ter sido anteriormente tratado para uma doença renal, ou não tão tratado.
[0055] O termo “paciente” se refere a qualquer animal, mais preferivelmente um mamífero (incluindo os referidos animais não humanos como, por exemplo, cães, gatos, cavalos, coelhos, animais de zoológico, vacas, porcos, ovelhas e primatas não humanos) para os quais o tratamento é desejado. Muito mais preferivelmente, o paciente é um humano.
[0056] O termo “amostra” ou “amostra do paciente” ou “amostra biológica” deve em geral significar qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo ou paciente, fluido corporal, tecido corporal, linhagem celular, cultura de tecido ou outra fonte. O termo inclui biopsias de tecido tais como, por exemplo, biopsias renais. O termo inclui células cultivadas tais como, por exemplo, células renais de mamífero cultivadas. Os métodos para obter biopsias de tecido e células cultivadas a partir de mamíferos são bem conhecidos na técnica. Dependendo do contexto, se o termo “amostra” for usado sozinho, ele deve ainda significar que a “amostra” é uma “amostra biológica” ou “amostra do paciente”, isto é, os termos são usados de forma intercambiável.
[0057] O termo “amostra de teste” se refere a uma amostra a partir de um indivíduo que foi tratado por um método da presente divulgação. A amostra de teste pode se originar de várias fontes no indivíduo mamífero incluindo, sem limitação, sangue, sêmen, soro, urina, medula óssea, mucosa, tecido, etc.
[0058] O termo “controle” ou “amostra de controle” se refere ao controle negativo ou positivo no qual espera-se que um resultado negativo ou positivo ajude a correlacionar um resultado na amostra de teste. Os controles que são adequados para a presente divulgação incluem, sem limitação, a amostra conhecida por exibir indicadores característicos da função renal normal, a amostra obtida a partir de um indivíduo conhecido por não ter doença renal, e a amostra obtida a partir de um indivíduo conhecido por ter doença renal. Em certas modalidades, o controle pode ser uma amostra obtida a partir de um indivíduo antes de ser tratado por um método da presente divulgação. Em certas modalidades, um controle adequado pode ser uma amostra de teste obtida a partir de um indivíduo conhecido por ter algum tipo ou estágio de doença renal, e uma amostra a partir de um indivíduo conhecido por não ter nenhum tipo ou estágio de doença renal. Um controle pode ser um controle pareado saudável normal. Aqueles versados na técnica apreciarão outros controles adequados para uso na presente divulgação.
[0059] O “prognóstico de regeneração”, “prognóstico regenerativo” ou “prognóstico para regeneração” em geral se refere a uma previsão ou predição do curso ou resultado regenerativo provável da administração ou implante de uma população celular, produto celular ou construto descrito no presente documento. Para um prognóstico de regeneração, a previsão ou predição pode ser informada por um ou mais dos seguintes: melhora de um órgão funcional (por exemplo, os rins) depois do implante ou administração, o desenvolvimento de um rim funcional depois do implante ou administração, o desenvolvimento da função ou capacidade renal melhorada depois do implante ou administração, e a expressão de certos marcadores pelo rim nativo em seguida ao implante ou administração.
[0060] “Órgão regenerado” se refere a um órgão nativo depois do implante ou administração de uma população celular, produto celular ou construto conforme descrito no presente documento. Em certas modalidades, o órgão regenerado é caracterizado por vários indicadores incluindo, sem limitação, o desenvolvimento da função ou capacidade no órgão nativo, melhora da função ou capacidade no órgão nativo, a melhora de certos marcadores e índices fisiológicos associados com a doença e/ou a expressão de certos marcadores no órgão nativo. Aqueles versados na técnica compreenderão que outros indicadores podem ser adequados por caracterizar um órgão regenerado.
[0061] “Rim regenerado” se refere a um rim nativo depois do implante ou administração de uma população celular, mistura ou construto conforme descrito no presente documento. Em certas modalidades, o rim regenerado é caracterizado por vários indicadores incluindo, sem limitação, o desenvolvimento da função ou capacidade no rim nativo, melhora da função ou capacidade rim nativo, a melhora de certos marcadores e índices fisiológicos associados com a doença e/ou a expressão de certos marcadores no rim nativo. Aqueles versados na técnica compreenderão que outros indicadores podem ser adequados para caracterizar um rim regenerado.
[0062] A “molécula pequena” é um composto que é menor do que 2000 daltons em massa. A massa molecular da molécula pequena é preferivelmente menor do que 1000 daltons, mais preferivelmente menor do que 600 daltons, por exemplo, o composto é menor do que 500 daltons, 400 daltons, 300 daltons, 200 daltons ou 100 daltons. Em certas modalidades, a molécula pequena é um composto orgânico.
[0063] Uma “microvesícula” é uma vesícula extracelular membranosa derivada de célula entre 30 e 1,000 nanômetros (nm) de diâmetro. Um “exossoma” é uma microvesícula membranosa derivada de célula que tem cerca de 30-150nm de diâmetro. Em certas modalidades, um exossoma é uma microvesícula membranosa derivada de célula que tem cerca de 50-100nm de diâmetro. As características adicionais tipicamente compartilhadas por exossomas são conhecidas na técnica. As descrições não limitantes relacionadas a microvesículas e exossomas são providas em Zhang et al. (2016) Am J Physiol Renal Physiol. 311(5):F844-F851, cujo teor total é incorporado no presente documento a título de referência.
[0064] Conforme usado no presente documento, “eficaz” quando se refere a uma quantidade de um agente terapêutico (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas, sozinhas ou em combinação com células renais bioativas) se refere à quantidade do agente que é suficiente para render uma resposta terapêutica desejada sem efeitos colaterais adversos indevidos (tais como toxicidade, irritação ou resposta alérgica) proporcionais com uma razão de risco/benefício razoável quando usado nesta divulgação. Produtos secretados
[0065] São providos no presente documento produtos secretados por células renais bioativas (por exemplo, SRCs) tais como vesículas. Em certas modalidades, as vesículas compreendem microvesículas.
[0066] Em certas modalidades, as microvesículas são de cerca de 30-150, 30-200, 30-500, 30-1000, 500-1000, 50-1000, 50-200, 50-150, 50-100, 100-150, 100-200 ou 100-300nm de diâmetro.
[0067] Em certas modalidades, as vesículas compreendem, consistem essencialmente de ou consistem de exossomas. Em certas modalidades, os exossomas são de cerca de 50-100nm de diâmetro. Em certas modalidades, os exossomas são de 30-100, 50-150, 50-100, 100-150 ou 30-150nm de diâmetro. Em certas modalidades, os exossomas são de cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60nm até cerca de 100, 110, 120, 130, 140 ou 150nm de diâmetro.
[0068] Em certas modalidades, uma vesícula compreende um agente ativo (tal como um composto) na superfície externa do mesmo, na bicamada lipídica do mesmo, e/ou no lúmen do mesmo. Em certas modalidades, o composto atenua uma ou mais vias celulares. Em certas modalidades, o composto é uma proteína, uma molécula pequena ou polinucleotídeo. Em certas modalidades, a proteína é uma proteína de transmembrana que está na membrana das vesículas. Em certas modalidades, o composto é lipofílico e está na bicamada lipídica do exossoma. Em certas modalidades, o polinucleotídeo é uma molécula de miRNA.
[0069] Em certas modalidades, o composto é expressado ou produzido por células renais bioativas. Em certas modalidades, o composto não é expressado ou produzido por células renais bioativas. Em certas modalidades, o composto foi adicionado ao meio de células que produziram as vesículas (por exemplo, as células foram incubadas em meio contendo o composto). Em certas modalidades, o composto entrou nas células e foi incluído nas vesículas que foram criadas pelas células. Em certas modalidades, as vesículas são purificadas ou isoladas das células e depois incubadas em uma solução (por exemplo, meio) contendo o composto. Em certas modalidades, as vesículas são isoladas ou purificadas das células e depois um composto é incorporado nas vesículas por uma técnica para permeabilizar as membranas de vesícula para facilitar a entrada do composto (tal como através de sonicação, lipofecção, eletroporação etc.).
[0070] Em certas modalidades, o composto não é produzido por células renais de ocorrência natural. Em certas modalidades, o composto é uma citoquina. Em certas modalidades, o composto é um composto artificial. Em certas modalidades, o composto artificial é um fármaco. Em certas modalidades, o composto artificial é uma molécula pequena. Em certas modalidades, o composto artificial é um biológico. Em certas modalidades, o composto artificial não é expressado ou produzido por células renais em um rim nativo. Em certas modalidades, o composto é um agente de viabilidade celular. Em certas modalidades, o composto é um composto que é usado para tratar uma doença (tal como uma doença renal ou alguma outra doença). Em certas modalidades, o composto é tolerogênico ou anti-inflamatório.
[0071] Em certas modalidades, o composto está aprovado para administração a um humano para o tratamento de uma doença pelo
United States Food and Drug Administration. Em certas modalidades, o composto é usado na cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doença. Em certas modalidades, o composto é usado para alterar a estrutura ou função de uma célula ou organismo mamífero.
[0072] Em certas modalidades, as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização do inibidor-1 de ativação do plasminogênio (PAI-1) e/ou a sinalização do fator beta de crescimento transformador (TGFβ). Em certas modalidades, as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização de Wnt canônica. Em certas modalidades, as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização de Wnt não canônica. Em certas modalidades, as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização mediada por CXCR4. Em certas modalidades, as vesículas compreendem um composto que infrarregula uma citoquina inflamatória. Em certas modalidades, a citoquina inflamatória é IL8. Em certas modalidades, as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização Notch.
[0073] Em certas modalidades, o composto é uma molécula de superfície celular usada para a imunofenotipagem de células. Em certas modalidades, o composto é CD9, CD63, CD81, CD133, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44 ou CD49e.
[0074] Em certas modalidades, o composto é um receptor de proteína. Em certas modalidades, o receptor de proteína é o receptor relacionado ao retinoide (ROR4).
[0075] Em certas modalidades, o composto é um marcador do estágio de desenvolvimento. Em certas modalidades, o marcador do estágio de desenvolvimento é antígeno 4 embrionário específico do estágio (SSEA-4).
[0076] Em certas modalidades, o composto é uma proteína protetora do estresse. Em certas modalidades, a proteína protetora do estresse é a proteína de choque térmico (HSP) 70 ou HSP90.
[0077] Em certas modalidades, o composto é uma proteína estrutural. Em certas modalidades, a proteína estrutural é TST101.
[0078] Em certas modalidades, o composto é um miRNA e está no lúmen de uma vesícula.
[0079] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de regulação do ciclo celular. Em certas modalidades, o miRNA de regulação do ciclo celular é let7a, miR-143 ou miR22.
[0080] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de modulação da senescência celular. Em certas modalidades, o miRNA de modulação da senescência celular é miR-34.
[0081] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de modulação da migração celular. Em certas modalidades, o miRNA de modulação da migração celular é miR30-C.
[0082] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de regulação do crescimento celular. Em certas modalidades, o miRNA de regulação do crescimento celular é miR194-2.
[0083] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de modulação da via do sinal celular. Em certas modalidades, o miRNA de modulação da via do sinal celular é miR-142.
[0084] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de modulação inflamatória. Em certas modalidades, o miRNA de modulação inflamatória é miR-10a.
[0085] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de modulação da angiogênese. Em certas modalidades, o miRNA de modulação da angiogênese é miR-296 e/ou miR-146a.
[0086] Em certas modalidades, o miRNA é um miRNA de modulação da atividade da quinase. Em certas modalidades, o miRNA de modulação da atividade da quinase é miR-83.
[0087] Em certas modalidades, o composto é um miRNA que inibe
PAI-1, TGFβ, a sinalização de Wnt canônica, a sinalização de Wnt não canônica, a sinalização mediada por CXCR4, e/ou a sinalização Notch.
[0088] Em certas modalidades, fibrose renal é reduzida ou prevenida pela inibição da transição epitelial para mesenquimal (EMT).
[0089] Em certas modalidades, as vesículas providas no presente documento compreendem miR-145, miR-22, miR-7, miR-10a, miR-143, e/ou let7b.
[0090] Em certas modalidades, as vesículas providas no presente documento compreendem miR-1248, miR-3168, miR-7113-5p, miR- 758-3p, miR-937-3p, miR-4455, miR-4521, miR-203a-3p, miR-22-3p, miR-574-3p, miR-181b-5p, miR-1260b, e/ou miR-181b-5p.
[0091] Em certas modalidades, as vesículas providas no presente documento compreendem CD9, CD63, CD81, CD133, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44, CD49e, e/ou SSEA-4.
[0092] Em certas modalidades, as vesículas providas no presente documento compreendem CD63, CD9, e/ou CD81, e o CD63, CD9, e/ou CD81 ou uma porção do mesmo na superfície externa das vesículas. Em certas modalidades, uma porção de uma ou mais dessas proteínas está na parte interna de uma vesícula.
[0093] Em certas modalidades, as vesículas providas no presente documento compreendem CD133, CD326, e/ou CD49e, e o CD133, CD326, e/ou CD49e está na superfície externa das vesículas.
[0094] Em certas modalidades, a proliferação de células renais contactadas pelas vesículas aumenta quando se compara com células renais que não entram em contato com as vesículas. Em certas modalidades, a formação de vasos pelas células endoteliais contactadas pelas vesículas aumenta quando comparado com as células endoteliais que não entram em contato comas vesículas. Em certas modalidades, formação de túbulo néfrico das células renais contactadas pelas vesículas aumenta quando comparado com as células renais que não entram em contato com as vesículas.
[0095] Em certas modalidades, as vesículas compreendem um fosfolipídio, um esfingolipídio, colesterol, uma cerimida, e/ou fosfatidil colina.
[0096] Em certas modalidades, as vesículas estão em uma composição que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende uma solução aquosa. Em certas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável é sensível à temperatura. Em certas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável é um hidrogel. Em certas modalidades, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende gelatina.
[0097] Em certas modalidades, as vesículas foram produzidas por BRCs tais como células renais primárias. Em certas modalidades, as vesículas foram produzidas por SRCs. São incluídas no presente documento composições compreendendo vesículas a partir de células renais primárias assim como vesículas a partir de SRCs. Também são providas composições que ainda compreendem vesículas secretadas pelas células endoteliais ou células-tronco mesenquimais. Em certas modalidades, uma composição provida no presente documento compreende vesículas de célula não renal. Em certas modalidades, uma vesícula de célula não renal foi secretada por uma célula progenitora endotelial não renal, uma célula-tronco mesenquimal não renal, ou uma progenitora derivada de adipose não renal.
[0098] Em um aspecto, é provido no presente documento um método para detectar pelo menos um composto em uma vesícula. Em certas modalidades, o método compreende obter uma vesícula e detectar se pelo menos um composto está na vesícula, em que (i) pelo menos um composto é uma proteína, e a proteína é CD9, CD81, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44, CD49e, e/ou SSEA-4; (ii) pelo menos um composto compreende miRNAs, em que os miRNAs incluem pelo menos dois de miR-145, miR-22, miR-7, miR-10a, miR-143, e/ou let7b; e/ou (iii) pelo menos um composto não é expressado ou produzido por células renais em um rim nativo.
[0099] Em certas modalidades, a vesícula é obtida em ou a partir de uma amostra biológica a partir de um indivíduo. Em certas modalidades, a amostra biológica é urina. Em certas modalidades, a vesícula é obtida em ou partir de um sobrenadante de uma cultura de células renais. Em certas modalidades, a vesícula foi secretada por uma célula renal. Em certas modalidades, a célula renal é célula renal bioativa. Em certas modalidades, a célula renal é célula renal selecionada.
[0100] Em certas modalidades, detectar se a proteína está na vesícula compreende um imunoensaio. Em certas modalidades, detectar se a proteína está na vesícula compreende um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), imunoprecipitação de proteína, imunoeletroforese, Western blot ou imunomarcação da proteína. Em certas modalidades, detectar se a proteína está na vesícula compreende um método de espectrometria. Em certas modalidades, detectar se a proteína está na vesícula compreende cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia líquida – espectrometria de massa (LC/MS).
[0101] Em certas modalidades, detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende uma reação em cadeia polimerase (PCR). Em certas modalidades, detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende PCT de transcriptase reversa. Em certas modalidades, detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende análise de microarranjo. Em certas modalidades, detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende sequenciamento de RNA. Em certas modalidades, detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende contactar uma vesícula, ou uma amostra processada suspeita de compreender ácidos nucleicos a partir de uma vesícula, com sondas ou iniciadores que são complementares aos miRNAs. Em certas modalidades, detectar se os miRNAs estão na vesícula não compreende análise de microarranjo. Em certas modalidades, detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende análise de microarranjo com um microarrajo, em que o microarranjo compreende sondas para menos do que 1000, 500 ou 100 miRNAs diferentes.
[0102] Em certas modalidades, o composto é uma molécula pequena.
[0103] Em certas modalidades, o composto é expressado ou produzido por células renais bioativas. Em certas modalidades, o composto não é expressado ou produzido por células renais bioativas. Em certas modalidades, o composto é expressado ou produzido por células renais bioativas. Em certas modalidades, o composto não é expressado ou produzido por células renais bioativas. Em certas modalidades, o composto foi adicionado ao meio de células que produziram as vesículas (por exemplo, as células foram incubadas em meio contendo o composto). Em certas modalidades, o composto entrou nas células e foi incluído nas vesículas que foram criadas pelas células. Em certas modalidades, as vesículas são purificadas ou isoladas das células e depois incubadas em uma solução (por exemplo, meio) contendo o composto. Em certas modalidades, as vesículas são isoladas ou purificadas a partir das células e depois um composto é incorporado nas vesículas por uma técnica para permeabilizar as membranas de exossoma para facilitar a entrada do composto (tais como por sonicação, lipofecção, eletroporação etc.).
[0104] Em certas modalidades, o composto não é produzido por células renais de ocorrência natural. Em certas modalidades, o composto é uma citoquina. Em certas modalidades, o composto é um composto artificial. Em certas modalidades, o composto é um fármaco.
Em certas modalidades, o composto artificial não é expressado ou produzido por células renais em um rim nativo. Em certas modalidades, o composto é um agente de viabilidade celular. Em certas modalidades, o composto é um composto que é usado para tratar uma doença (tal como uma doença renal ou alguma outra doença). Em certas modalidades, o composto é tolerogênico ou anti-inflamatório. Em certas modalidades, o composto é aprovado para administração a um humano para o tratamento de uma doença pelo United States Food and Drug Administration. Em certas modalidades, o composto é usado na cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doença. Em certas modalidades, o composto é usado para alterar a estrutura ou função de uma célula ou organismo mamífero.
[0105] Em um aspecto, é provido no presente documento um método para monitorar o tratamento com uma população de células renais bioativas em um indivíduo que foi administrado uma população de células renais bioativas. Em certas modalidades, o método compreende detectar se pelo menos um composto está presente em uma vesícula a partir do indivíduo de acordo com um método divulgado no presente documento.
[0106] Em certas modalidades, o método compreende detectar se pelo menos um composto está presente em uma vesícula a partir do indivíduo de acordo com um método divulgado no presente documento em um primeiro momento e um segundo momento. Em certas modalidades, o primeiro momento é antes do indivíduo ter sido administrado com uma população de células renais bioativas e o segundo momento é depois do indivíduo ter sido administrado com uma população de células renais bioativas. Em certas modalidades, o primeiro momento e o segundo momento são depois do indivíduo ter sido administrado com uma a população de células renais bioativas. Em certas modalidades, o método ainda compreende identificar um efeito regenerativo no indivíduo se o nível do composto for maior no primeiro momento quando comparado com o segundo momento.
[0107] Em certas modalidades, o método ainda compreende identificar um efeito regenerativo no indivíduo se o nível do composto for maior do que um controle. Em certas modalidades, o método ainda compreende que o controle é o nível em um indivíduo correspondente que não foi administrado com uma população de células renais bioativas.
[0108] Também está incluído no presente documento um método para identificar se uma vesícula é regenerativa. Em certas modalidades, o método compreende (i) detectar se uma proteína e/ou miRNAs estão na vesícula de acordo com um método divulgado no presente documento; e (ii) identificar a vesícula como regenerativa se a proteína e/ou miRNAs forem detectadas na vesícula.
[0109] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de detecção do nível de pelo menos um miRNA em vesículas a partir de uma população de células renais bioativas. Em certas modalidades, o método compreende (i) detectar se uma ou mais das seguintes moléculas de miRNA estão aumentadas nas vesículas comparado a um controle: miR-1248, miR-3168, miR-7113-5p, miR- 758-3p, miR-937-3p, miR-4455, miR-4521, miR-203a-3p, miR-22-3p, miR-574-3p, miR-181b-5p, miR-1260b, e/ou miR-181b-5p; e/ou (ii) detectar se uma ou mais das seguintes moléculas de miRNA estão diminuídas nas vesículas comparado a um controle: miR-1-3p, miR-1- 3p, miR-143-3p, miR-150-5p, miR-509-3p, miR-653-5p, miR-204-5p, miR-192-5p, e/ou miR-363-3p. Em certas modalidades, a célula renal bioativa é a célula renal selecionada. Em certas modalidades, o controle é o nível de uma ou mais vesículas de moléculas de miRNA a partir de uma população celular renal primária. Em certas modalidades, o controle é o nível de uma ou mais vesículas de moléculas de miRNA a partir de uma outra população de células renais bioativas.
[0110] A presente matéria também provê um método de alteração do nível de pelo menos um miRNA e/ou proteína em vesículas produzidas por uma população de células renais bioativas, o método compreendendo cultivar a população sob condições hipóxicas. Em certas modalidades, cultivar a população sob condições hipóxicas compreende cultivar a população na presença de menos de cerca de 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de oxigênio, por, por exemplo, 8-72 horas. Em certas modalidades, cultivar a população sob condições hipóxicas compreende cultivar a população na presença de cerca de 1-5%, 2-5%, 2-4%, 1-3%, ou 1,5-2,5% de oxigênio por, por exemplo, 8-72 horas. Em certas modalidades, cultivar a população sob condições hipóxicas compreende cultivar a população na presença de menos do que 5% de oxigênio por pelo menos cerca de 8, 12, 16, 20, 24 ou 48 horas. Em certas modalidades, cultivar a população sob condições hipóxicas compreende cultivar a população na presença de cerca de 1%; 1,5%; 2%; 2,5%; 3%; 3,5%; 4%; 4,5% ou 5% de oxigênio por de cerca de 8, 12, 16, 20, 24 ou 48 horas.
[0111] Em certas modalidades, o método ainda compreende passar as células renais bioativas pelo menos cerca de 1, 2 ou 3 vezes antes cultivar a população sob condições hipóxicas.
[0112] Em certas modalidades, (a) pelo menos um miRNA é miR- 145, miR-22, miR-7, miR-10a, miR-143, let7b, miR-1248, miR-3168, miR-7113-5p, miR-758-3p, miR-937-3p, miR-4455, miR-4521, miR- 203a-3p, miR-22-3p, miR-574-3p, miR-181b-5p, miR-1260b, e/ou miR- 181b-5p; e/ou (b) pelo menos uma proteína é CD9, CD63, CD81, CD133, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44, CD49e, SSEA-4, TST101, HSP70, HSP90, e/ou ROR4.
[0113] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de produzir um exossoma a partir de células, em que o exossoma compreende um composto que não é produzido pelas células. Em certas modalidades, o método compreende isolar o exossoma a partir de um sobrenadante de cultura celular, em que o sobrenadante de cultura celular é de uma cultura de células que foram colocadas em contato com o composto. Em um aspecto, é provido no presente documento um método de produzir um exossoma renal, em que o exossoma compreende um composto que não é produzido pelas células renais em um rim nativo. Em certas modalidades, o método compreende isolar uma vesícula a partir de um sobrenadante de cultura de células renais, em que o sobrenadante de cultura de células renais é de uma cultura de células renais compreendendo uma população de células renais bioativas que tiveram contato com o composto. Em certas modalidades, o composto é um composto artificial. Em certas modalidades, o composto é uma molécula pequena. Em certas modalidades, o composto é um agente de viabilidade celular. Em certas modalidades, o composto é um fármaco.
[0114] Em um aspecto, está incluída no presente documento uma vesícula (tal como uma microvesícula, por exemplo, um exossoma) compreendendo um composto que não é produzido por células renais em um rim nativo.
[0115] Em certas modalidades, o composto é uma proteína, uma molécula pequena ou polinucleotídeo. Em certas modalidades, o composto não é expressado ou produzido por células renais primárias que são cultivadas na ausência do composto. Em certas modalidades, o composto é um composto artificial.
[0116] Em certas modalidades, um composto (tal como uma proteína ou fármaco de molécula pequena) “carregado de forma passiva” em vesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas), por exemplo através da incubação de células com meio contendo o composto ou através da incubação de vesículas purificadas
(por exemplo, microvesículas tais como exossomas) com meio contendo o composto. Em certas modalidades, um composto (tal como uma proteína ou fármaco de molécula pequena) é “carregado de forma ativa” em vesículas purificadas ou isoladas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas) através da permeabilização (tais como por sonicação, lipofecção, eletroporação, etc.) da membrana da vesícula para facilitar a entrada do composto.
[0117] Em certas modalidades, a vesícula está em uma composição que compreende células que produziram a vesícula. Em certas modalidades, a vesícula foi isolada das células que a produziram. Em certas modalidades, a vesícula é uma vesícula renal. Em certas modalidades, a vesícula foi produzida pela célula renal bioativa.
[0118] Em certas modalidades, uma composição provida no presente documento compreende uma vesícula de célula renal e uma vesícula de célula não renal. Em certas modalidades, a vesícula de célula renal foi secretada pela célula renal bioativa. Em certas modalidades, a vesícula de célula não renal foi secretada por uma célula progenitora endotelial não renal, uma célula-tronco mesenquimal não renal, ou uma progenitora derivada de adipose não renal.
[0119] Em certas modalidades, uma composição provida no presente documento compreende uma vesícula produzida por uma célula renal primária e uma vesícula produzida por uma célula renal selecionada.
[0120] Em certas modalidades, a vesícula ainda compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0121] Em certas modalidades, um efeito regenerativo pode ser provido por células e/ou por produtos secretados a partir de células renais bioativas (tais como vesículas). Em certas modalidades, o efeito regenerativo pode ser caracterizado por um ou mais dos que seguem: uma redução na transição epitelial-mesenquimal (que pode ser através de atenuação da sinalização de TGF-β); uma redução na fibrose renal; uma redução na inflamação renal; expressão diferencial de um marcador de célula-tronco no rim nativo; migração de células implantadas e/ou células nativas para um sítio de lesão renal, por exemplo, lesão tubular; enxerto de células implantadas em um sítio de lesão renal, por exemplo, lesão tubular; estabilização de um ou mais indicadores da função renal (conforme descrito no presente documento); formação de novo de corpos em forma de S/corpos em forma de vírgula associados com a nefrogênese, formação de novo de túbulos ou néfrons renais, restauração da homeostase eritroide (conforme descrito no presente documento); e qualquer combinação dos mesmos (vide também, Basu et al., 2011. Functional evaluation of primary renal cell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissue engineering. Cell Transplantation 20: 1771-90; Bruce et al., 2015. Selected renal cells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney disease via NF-κB and TGF-β1 pathways. Regenerative Medicine 10: 815-839, cujo conteúdo total é incorporado no presente documento a título de referência).
[0122] Em certas modalidades, como uma alternativa a uma biopsia do tecido, um resultado regenerativo no indivíduo recebendo tratamento pode ser avaliada a partir do exame de um fluido corporal, por exemplo, urina. Verificou-se que as microvesículas (por exemplo, exossomas) obtidas a partir de fontes de urina derivadas de um indivíduo contêm certos componentes incluindo, sem limitação, proteínas específicas e miRNAs que são por fim derivados das populações celulares renais impactadas pelo tratamento. Esses componentes podem incluir, sem limitação, fatores envolvidos na replicação e diferenciação das células- tronco, apoptose, inflamação, e imunomodulação, fibrose, transição epitelial-mesenquimal, sinalização de TGF-β e/ou sinalização de PAI-1. Em certas modalidades, uma análise temporal da microvesícula (por exemplo, exossoma) associou padrões de expressão de miRNA/proteína que permitem monitoração contínua dos resultados regenerativos dentro do rim de indivíduos recebendo as populações celulares, produtos celulares ou construtos da presente divulgação.
[0123] Em certas modalidades, a presente divulgação provê métodos para avaliar se um paciente com doença renal (KD) é responsivo ao tratamento com uma formulação terapêutica. Em certas modalidades, o método pode incluir a etapa de determinação ou detecção da quantidade de microvesículas (ou seus conteúdos luminais), por exemplo, exossomas, em uma amostra de teste obtida a partir de um paciente com KD tratado com um produto terapêutico, quando comparado com ou relativo à quantidade de microvesículas (tais como exossomas) em uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra derivada do mesmo paciente antes do tratamento com o produto terapêutico), em que uma quantidade maior ou menor das microvesículas (por exemplo, exossomas) ou seus conteúdos luminais na amostra de teste conforme comparado com a quantidade das microvesículas (por exemplo, exossomas) ou seus conteúdos luminais na amostra de controle amostra é indicativa da responsividade do paciente tratado ao tratamento com o produto terapêutico.
[0124] Em certas modalidades, as microvesículas derivadas dos rins (por exemplo, exossomas) e/ou os conteúdos luminais das microvesículas derivadas dos rins (por exemplo, exossomas) podem ser vertidas na urina de um indivíduo e podem ser analisadas quanto aos biomarcadores indicativos do resultado regenerativo ou eficácia do tratamento. Em certas modalidades, os métodos prognósticos não invasivos providos no presente documento podem incluir a etapa de obtenção de uma amostra de urina do indivíduo antes e/ou depois da administração ou implante de uma população de células renais bioativas, produto celular ou construto descrito no presente documento.
As microvesículas e outros produtos secretados podem ser isolados a partir das amostras de urina usando técnicas padrão incluindo sem limitação, centrifugação para remover resíduos indesejados (Zhou et al.
2008. Kidney Int. 74(5):613-621; Skog et al. Pedido de Patente Norte- americano publicado No. 20110053157, cada um é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade) precipitação para separar as microvesículas (por exemplo, exossomas) da urina, reação em cadeia polimerase e sequenciamento de ácido nucleico para identificar ácidos nucleicos específicos e espectroscopia de massa e/ou eletroforese em gel 2D para identificar as proteínas específicas associadas com os resultados regenerativos. Populações celulares
[0125] Estão incluídas no presente documento composições e formulações compreendendo vesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas) produzidas por uma população de células renais (por exemplo, BRCs tais como células primárias e/ou SRCs). Em certas modalidades, as vesículas podem ser, por exemplo, isoladas a partir de células ou combinadas com células que não produziram as mesmas. Os exemplos não limitantes e características das BRCs úteis para a produção de vesículas são providos no presente documento.
[0126] Em certas modalidades, uma composição ou formulação terapêutica provida no presente documento contém as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas por uma população heterogênea isolada de células renais que é enriquecida por componentes ou tipos celulares bioativos específicos e/ou depletada de componentes ou tipos celulares inativos ou indesejados específicos. Em certas modalidades, a composição ou formulação terapêutica provida no presente documento contém ou ainda contém uma população heterogênea isolada de células renais que é enriquecida por componentes ou tipos celulares bioativos específicos e/ou depletada de componentes ou tipos celulares inativos ou indesejados específicos. Em certas modalidades, as referidas composições e formulações são usadas no tratamento de doença renal, por exemplo, provendo estabilização e/ou melhora e/ou regeneração da função e/ou estrutura renal. Em certas modalidades, as composições contêm as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas por frações celulares renais isoladas que carecem de componentes celulares quando se compara com um indivíduo saudável ainda retêm as propriedades terapêuticas, por exemplo, proveem estabilização e/ou melhora e/ou regeneração da função renal. Em certas modalidades, as composições contêm frações celulares renais isoladas que carecem de componentes celulares quando se compara com um indivíduo saudável ainda retêm propriedades terapêuticas, por exemplo, proveem estabilização e/ou melhora e/ou regeneração da função renal. Em certas modalidades, as populações celulares descritas no presente documento podem ser derivadas a partir de indivíduos saudáveis, indivíduos com uma doença renal, ou indivíduos conforme descrito no presente documento.
[0127] São incluídas no presente documento composições terapêuticas das microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou populações celulares renais isoladas que são administradas a um órgão ou tecido em um indivíduo. Em certas modalidades, é provida no presente documento uma composição compreendendo as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas por BRCs (por exemplo, SRCs). Em certas modalidades, a composição ainda compreende BRCs (por exemplo, SRCs) que não secretaram as microvesículas (por exemplo, exossomas). Em certas modalidades, a composição compreende NKA que é “cravado” com as microvesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas são adicionados ao NKA para produzir NKA melhorado pela vesícula). Em certas modalidades, as BRCs (por exemplo, SRCs) a partir das quais as microvesículas (por exemplo, exossomas) podem ser obtidas incluem, por exemplo, quaisquer BRCs (por exemplo, SRCs) divulgadas no presente documento. Em certas modalidades, as vesículas são obtidas a partir das SRCs produzidas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. Em certas modalidades, uma formulação provida no presente documento é NKA no qual vesículas isoladas (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) foram adicionadas (o NKA foi “cravado” ou suplementado com as vesículas).
[0128] Em certas modalidades, uma população celular renal bioativa selecionada em geral se refere a uma população celular potencialmente tendo propriedades terapêuticas mediante administração a um indivíduo. Em certas modalidades, mediante administração a um indivíduo que necessita, uma população de células renais bioativas pode prover estabilização e/ou melhora e/ou reparo e/ou regeneração da função renal no indivíduo. Em certas modalidades, as propriedades terapêuticas podem incluir um reparo ou efeito regenerativo.
[0129] Em certas modalidades, a população celular renal é uma população celular heterogênea não fracionada ou uma população celular homogênea enriquecida derivada de um rim. Em certas modalidades, a população celular heterogênea é isolada a partir de uma biopsia de tecido ou do tecido completo do órgão. Em certas modalidades, a população celular renal é derivada a partir de uma cultura in vitro de células de mamíferos, estabelecidas a partir de biopsias de tecido ou tecido completo do órgão. Em certas modalidades, uma população celular renal compreende subfrações ou subpopulações da população heterogênea de células renais, enriquecidas por componentes bioativos (por exemplo, células renais bioativas) e depletadas de componentes ou células inativos ou indesejados.
[0130] Em certas modalidades, a população celular renal expressa GGT e uma citoqueratina. Em certas modalidades, o GGT tem um nível de expressão maior do que cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 18%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, ou de cerca de 60%. Em certas modalidades, o GGT é GGT-1. Em certas modalidades, as células da população celular renal expressam GGT-1, uma citoqueratina, VEGF e KIM-1. Em certas modalidades, mais do que 18% das células na população celular renal expressam GGT-1. Em certas modalidades, mais do que 80% das células na população celular renal expressam a citoqueratina. Em certas modalidades, a citoqueratina é selecionada a partir de CK8, CK18, CK19 e combinações das mesmas. Em certas modalidades, a citoqueratina é CK8, CK18, CK19, CK8/CK18, CK8/CK19, CK18/CK19 ou CK8/CK18/CK19, em que o “/” se refere a uma combinação das citoqueratinas adjacentes a elas. Em certas modalidades, a citoqueratina tem um nível de expressão maior do que cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, ou de cerca de 95%. Em certas modalidades, mais do que 80% das células na população celular renal expressam a citoqueratina. Em certas modalidades, a população celular renal expressa AQP2. Em certas modalidades, menos do que 40% das células expressam AQP2. Em certas modalidades, pelo menos 3% das células na população celular renal expressa AQP2.
[0131] Em certas modalidades, mais do que 18% das células dentro da população celular expressam GGT-1 e mais do que 80% das células dentro da população celular expressam uma citoqueratina. Em certas modalidades, a citoqueratina é CK18. Em certas modalidades, 4,5% a 81,2% das células na população celular expressam GGT-1; 3,0% a 53,7% das células dentro da população celular expressam AQP2, e 81,1% a 99,7% das células dentro da população celular expressam CK18.
[0132] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende células que expressam um ou mais de qualquer combinação dos biomarcadores selecionados a partir de AQP1, AQP2, AQP4, Calbindina, Calponina, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8, CK18, CK19, combinações de CK8, CK18 e CK19, Connexina 43, Cubilina, CXCR4 (Fusina), DBA, E-caderina (CD324), EPO (eritropoeitina) GGT1, GLEPP1 (proteína epitelial glomerular 1) , Haptoglobulina, Itgbl (Integrina 01), KIM-1 (molécula-1 de lesão renal), T1M-1 (imunoglobulina de células T e molécula contendo mucina), MAP-2 (proteína 2 associada a microtúbulo), Megalina, N-caderina, Nefrina, NKCC (cotransportadores de Na-K-Cl), OAT-1 (transportador 1 de ânion orgânico), Osteopontina, Pan-caderina, PCLP1 (molécula 1 do tipo podocalixina), Podocina, SMA (alfa-actina de músculo liso), Sinaptopodina, THP (proteína de tamm-horsfall), Vinientina e αGST-1 (alfa glutationa S-transferase).
[0133] Em certas modalidades, a população celular renal é enriquecida por células epiteliais comparado com uma população inicial, tais como uma população de células em uma biopsia de tecido renal ou uma cultura primária da mesma (por exemplo, uma população de células renais compreende pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% mais células epiteliais do que a população inicial). Em certas modalidades, a população celular renal é enriquecida por células tubulares comparado com uma população inicial, tais como uma população de células em uma biopsia de tecido renal ou uma cultura primária da mesma (por exemplo, uma população de células renais compreende pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% mais células tubulares do que a população inicial). Em certas modalidades, as células tubulares compreendem células tubulares proximais. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma proporção menor de células tubulares distais, células de duto coletor, células endócrinas, células vasculares ou células do tipo progenitoras comparado com a população inicial. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma proporção menor de células tubulares distais comparado com a população inicial. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma proporção menor de células de duto coletor comparado com a população inicial. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma proporção menor de células endócrinas comparado com a população inicial. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma proporção menor de células vasculares comparado com a população inicial. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma proporção menor de células do tipo progenitoras comparado com a população inicial. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma maior proporção de células tubulares e proporções menores de células produtoras de EPO, células glomerulares e células vasculares quando comparado com a população não enriquecida (por exemplo, uma população celular renal inicial). Em certas modalidades, a população celular renal tem uma maior proporção de células tubulares e proporções menores de células produtoras de EPO e células vasculares quando comparado com a população não enriquecida. Em certas modalidades, a população celular renal tem uma maior proporção de células tubulares e proporções menores de células glomerulares e células vasculares quando comparado com a população não enriquecida.
[0134] Em certas modalidades, as células de uma população celular renal, expressam ácido hialurônico (HA). Em certas modalidades, a faixa de tamanho do HA é de cerca de 5 kDa até cerca de 20000 kDa. Em certas modalidades, o HA tem um peso molecular de 5 kDa, 60 kDa, 800 kDa, e/ou 3000 kDa. Em certas modalidades, a população celular renal sintetiza e/ou estimula a síntese de HA de alto peso molecular através da expressão de ácido hialurônico sintase-2 (HAS-2),
especialmente depois do implante intra-renal.
Em certas modalidades, as células da população celular renal expressam espécies de HA de peso molecular maior in vitro e/ou in vivo, através das ações de HAS-2. Em certas modalidades, as células da população celular renal expressam espécies de HA de peso molecular maior tanto in vitro e in vivo, através das ações de HAS-2. Em certas modalidades, uma espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 100 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 800 kDa até cerca de 3500 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 800 kDa até cerca de 3000 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 800 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 3,000 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 800 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 3000 kDa.
Em certas modalidades, HAS-2 sintetiza HA com um peso molecular de 2x105 a 2x106 Da.
Em certas modalidades, as espécies de HA menores são formadas através da ação de hialuronidases degradativas.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 200 kDa até cerca de 2000 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 200 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 2000 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 200 kDa.
Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 2000 kDa. Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 5000 kDa. Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 10000 kDa. Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de pelo menos 15000 kDa. Em certas modalidades, a espécie de HA de peso molecular maior é HA tendo um peso molecular de cerca de 20000 kDa.
[0135] Em certas modalidades, a população compreende células que são capazes do transporte de albumina mediada pelo receptor.
[0136] Em certas modalidades, as células da população celular renal são resistentes à hipoxia.
[0137] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: megalina, cubilina, N-caderina, E-caderina, Aquaporina-1 e Aquaporina-2.
[0138] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: megalina, cubilina, sintase 2 de ácido hialuroônico (HAS2), Vitamina D3 25-Hidroxilase (CYP2D25), N- caderina (Ncad), E-caderina (Ecad), Aquaporina-1 (Aqp1), Aquaporina- 2 (Aqp2), RAB17, família do oncogene membro RAS (Rab17), proteína 3 de ligação a GATA (Gata3), regulador 4 do íon contendo domínio FXYD (Fxyd4), família do carreador de soluto 9 (trocador de sódio/hidrogênio), membro 4 (Slc9a4), família do aldeído desidrogenase 3, membro B1 (Aldh3b1), família do aldeído desidrogenase 1, membro A3 (Aldh1a3) e Calpaina-8 (Capn8).
[0139] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: megalina, cubilina, sintase 2 de ácido hialurônico (HAS2), Vitamina D3 25-Hidroxilase (CYP2D25), N-caderina (Ncad), E-caderina (Ecad), Aquaporina-1 (Aqp1), Aquaporina-2 (Aqp2), RAB17, família do oncogene membro RAS (Rab17), proteína 3 de ligação a GATA (Gata3), regulador 4 do íon contendo domínio FXYD (Fxyd4), família do carreador de soluto 9 (trocador de sódio/hidrogênio), membro 4 (Slc9a4), família do aldeído desidrogenase 3, membro 81 (Aldh3b1), família do aldeído desidrogenase 1, membro A3 (Aldh1a3), e Calpaina-8 (Capn8) e Aquaporina-4 (Aqp4).
[0140] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: aquaporina 7 (Aqp7), regulador 2 do transporte iônico contendo regulador FXYD (Fxyd2), família carreadora de soluto 17 (fosfato de sódio), membro 3 (Slc17a3), família carreadora de soluto 3, membro 1 (Slc3a1), claudina 2 (Cldn2), napsina A peptidase aspártica (Napsa), família carreadora de soluto 2 (transportador de glicose facilitado), membro 2 (Slc2a2), alanil (membrana) aminopeptidase (Anpep), proteína de transmembrana 27 (Tmem27), membro 2 da família de cadeia média acil-CoA sintetase (Acsm2), glutationa peroxidase 3 (Gpx3), frutose-1,6-bifosfatase 1 (Fbp1), alanina-glioxilato aminotransferase 2 (Agxt2), molécula de adesão celular endotelial das plaquetas (Pecam) e podocina (Podn).
[0141] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: PECAM, VEGF, KDR, HIF1a, CD31, CD146, Podocina (Podn), e Nefrina (Neph), receptor 4 de quimiocina (motivo C- X-C) (Cxcr4), receptor do tipo B de endotelina (Ednrb), colágeno, tipo V, alfa 2 (Col5a2), Caderina 5 (Cdh5), ativador de plasminogênio, tecido (Plat), angiopoietina 2 (Angpt2), receptor de proteína de inserção de quinase (Kdr), proteína secretada, acídica, rica em cisteína (osteonectina) (Sparc), serglicina (Srgn), inibidor 3 da metalopeptidase
TIMP (Timp3), tumor 1 de Wilms (Wt1), membro 4 da família do sítio MMTV wingless, membro 4 (Wnt4), regulador 4 da sinalização da proteína G (Rgs4), Eritropoietina (EPO).
[0142] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, podocina, nefrina, EPO, CK7, CK8/18/19.
[0143] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a, CD31 e CD146.
[0144] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: Podocina (Podn) e Nefrina (Neph).
[0145] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende um ou mais tipos celulares que expressam um ou mais de qualquer combinação de: PECAM, vEGF, KDR, HIF1a e EPO.
[0146] Em certas modalidades, a presença (por exemplo, expressão) e/ou nível/quantidade de vários biomarcadores na amostra ou população celular pode ser analisada por várias metodologias, muitas das quais são conhecidas na técnica e compreendidas pelo versado na técnica, incluindo, porém sem se limitar a, imuno- histoquímica (“IHC”), análise Western blot, imunoprecipitação, ensaios de ligação molecular, ELISA, ELIFA, classificação celular ativada por fluorescência (“FACS”), MassARRAY, proteômica, ensaios de atividade enzimática bioquímica, hibridização in situ, análise Southern, análise Northern, sequenciamento do genoma total, reação em cadeia polimerase (“PCR”) incluindo PCT quantitativo em tempo real (“qRT- PCR”) e outros métodos de detecção do tipo amplificação, tais como, por exemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA e similar), RNA-Seq, FISH, análise de microarranjo, perfil de expressão gênica, e/ou análise serial de expressão gênica (“SAGE”), assim como qualquer um de uma ampla variedade de ensaios que podem ser realizados por análise de proteína, gene, e/ou arranjo de tecido. Os exemplos não limitantes de protocolos para avaliar o estado dos genes e produtos genéticos incluem Northern Blotting, Southern Blotting, Western Blotting, Immunoblotting, e análise com PCR. Em certas modalidades, imunoensaios multiplexados tais como aqueles disponíveis a partir de Rules Based Medicine ou Meso Scale Discovery também podem ser usados. Em certas modalidades, a presença (por exemplo, expressão) e/ou nível/quantidade de vários biomarcadores na amostra ou população celular pode ser analisada por várias metodologias, muitas das quais são conhecidas na técnica e compreendidas pelo versado na técnica, incluindo, mas sem se limitar a, plataformas “-ômicas” tais como transcriptômicas amplas do genoma, proteômicas, secretômicas, lipidômicas, fosfatômicas, exossômicas etc., em que as metodologias de alto desempenho são acopladas com técnicas de biologia computacional e bioinformática para elucidar uma assinatura biológica completa de genes, miRNA, proteínas, proteínas secretadas, lipídios, microvesículas etc. que são expressadas e/ou não expressadas pela população celular sob consideração.
[0147] Em certas modalidades, um método de detecção da presença de dois ou mais biomarcadores em uma população celular renal compreende contactar a amostra compreendendo a população com um anticorpo direcionado a um biomarcador sob condições permissivas para ligação do anticorpo ao seu ligante cognato (isto é, biomarcador), e detectar a presença do anticorpo ligado, por exemplo, ao detectar se um complexo está formado entre o anticorpo e o biomarcador. Em certas modalidades, a detecção da presença de um ou mais biomarcadores é através da imuno-histoquímica. Em certas modalidades, um método de detecção da presença de biomarcadores em ou sobre uma microvesícula (tal como um exossoma) compreende contactar a amostra (por exemplo, a amostra suspeita de compreender ou que parece compreender) a microvesícula com um anticorpo direcionado a um biomarcador sob condições permissivas para ligação do anticorpo ao seu ligante cognato (isto é, biomarcador), e detectar a presença do anticorpo ligado, por exemplo, ao detectar se um complexo é formado entre o anticorpo e o biomarcador.
[0148] O termo “detectar” conforme usado no presente documento abrange detecção quantitativa e/ou qualitativa.
[0149] Em certas modalidades, um biomarcador é detectado por um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.
[0150] Em certas modalidades, uma população celular renal é identificada com um ou mais reagentes que permitem a detecção de um biomarcador divulgado no presente documento, tais como AQP1, AQP2, AQP4, Calbindina, Calponina, CD117, CD133, CD146, CD24, CD31 (PECAM-1), CD54 (ICAM-1), CD73, CK18, CK19, CK7, CK8, CK8/18, CK8/18/19, Connexina 43, Cubilina, CXCR4 (Fusina), DBA, E- caderina (CD324), EPO (eritropoeitina), GGT1, GLEPP1 (proteína 1 epitelial glomerular), Haptoglobulina, Itgbl (Integrina p), KIM-1 (molécula 1 de lesão renal), T1M-1 (molécula contendo mucirs e imunoglobulina de célula T), MAP-2 (proteína 2 associadoa ao microtúbulo), Megalina, N-caderina, Nefrina, NKCC (cotransportadores de Na-K-Cl), OAT-1 (transportador de ânion orgânico 1), Osteopontina, Pan-caderina, PCLP1 (molécula 1 do tipo podocalixina), Podocina, SMA (alfa-actina de músculo liso), Sinaptopodina, THP (proteína tamm-horsfall), Vimentina, e/ou αGST-1 (alfa glutationa 5-transferase).
[0151] Em certas modalidades, a fonte de células é a mesma que o órgão ou tecido alvo pretendido. Em certas modalidades, as BRCs ou SRCs podem ser retiradas dos rins a serem usadas em uma formulação a ser administrada no rim. Em certas modalidades, a população celular é derivada a partir de uma biopsia renal. Em certas modalidades, uma população celular é derivada do tecido renal total. Em certas modalidades, uma população celular é derivada de culturas in vitro de células renais de mamíferos, estabelecidas a partir de biopsias renais ou tecido renal total.
[0152] Em certas modalidades, as BRCs ou SRCs compreendem misturas heterogêneas ou frações de células renais bioativas. Em certas modalidades, as BRCs ou SRCs podem ser derivadas de ou serem elas próprias as frações de células renais a partir de indivíduos saudáveis. Em certas modalidades, está incluída no presente documento uma população celular renal ou fração obtida a partir de um indivíduo doente que pode carecer de certos tipos celulares quando comparado com a população celular renal de um indivíduo saudável (por exemplo, em um rim ou biópsia do mesmo). Em certas modalidades, está provida no presente documento uma população celular terapeuticamente ativa que carece de tipos celulares comparado com um indivíduo saudável, assim como as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas pela população. Os métodos de detecção das referidas células e das microvesículas (por exemplo, exossomas) também são providos. Em certas modalidades, uma população celular é isolada e expandida a partir de uma população celular autóloga.
[0153] Em certas modalidades, as SRCs são obtidas a partir do isolamento e expansão de células renais a partir de um tecido cortical renal de um paciente através de uma biopsia renal. Em certas modalidades, as células renais são isoladas a partir do tecido renal através de digestão enzimática, expandidas usando técnicas de cultura celular padrão, e selecionadas pela centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface a partir das células renais expandidas. Em certas modalidades, as células renais são isoladas a partir do tecido renal através da digestão enzimática, expandidas usando técnicas de cultura celular padrão, e selecionadas por centrifugação do gradiente de densidade de etapa única ou múltiplas etapas contínua ou descontínua a partir das células renais expandidas. Em certas modalidades, as SRCs são compostas primariamente de células epiteliais renais que são conhecidas pelo seu potencial regenerativo. Em certas modalidades, outras células parenquimais (vasculares) e estromais podem estar presentes na população de SRC autóloga.
[0154] Em certas modalidades, as BRCs são uma população isolada de células renais regenerativas naturalmente envolvidas no reparo e regeneração renal. Em certas modalidades, as BRCs são obtidas a partir de células renais isoladas a partir de tecido renal através da digestão enzimática e expandidas usando técnicas de cultura celular padrão. Em certas modalidades, o meio de cultura celular pode ser designado para expandir células renais bioativas com capacidade regenerativa. Em certas modalidades, o meio de cultura celular não contém nenhum fator de diferenciação. Em certas modalidades, uma população celular renal heterogênea expandida é cultivada em condições hipóxicas para adicionalmente enriquecer a composição de células com capacidade regenerativa. Sem se ater a teoria, isto pode ser devido a um ou mais dos seguintes fenômenos: 1) sobrevivência seletiva, morte ou proliferação de componentes celulares específicos durante o período de cultura hipóxica; 2) alterações na granularidade e/ou tamanho celular em resposta à cultura hipóxica, efetuando assim alterações na densidade flutuante e subsequente localização durante a separação por gradiente de densidade; e 3) alterações na expressão do gene/proteína da célula em resposta ao período de cultura hipóxica, resultando assim em características diferenciais das células dentro da população isolada e expandida.
[0155] Em certas modalidades, uma população de células renais bioativas é obtida a partir do isolamento e expansão de células renais a partir de tecido renal (tais como tecido obtido de uma biopsia) sob condições de cultura que enriquecem as células capazes de regeneração renal.
[0156] Em certas modalidades, as células renais a partir de tecido renal (tais como tecido obtido de uma biopsia) são passadas 1, 2, 3, 4, 5, ou mais vezes para produzir células renais bioativas expandidas (tais como uma população celular enriquecida para células capazes de regeneração renal). Em certas modalidades, as células renais a partir de tecido renal (tais como tecido obtido de uma biopsia) são passadas 1 vez para produzir células renais bioativas expandidas. Em certas modalidades, as células renais a partir de tecido renal (tais como tecido obtido de uma biopsia) são passadas 2 vezes para produzir células renais bioativas expandidas. Em certas modalidades, as células renais a partir de tecido renal (tais como tecido obtido de uma biopsia) são passadas 3 vezes para produzir células renais bioativas expandidas. Em certas modalidades, as células renais a partir de tecido renal (tais como tecido obtido de uma biopsia) são passadas 4 vezes para produzir células renais bioativas expandidas. Em certas modalidades, as células renais a partir de tecido renal (tais como tecido obtido de uma biopsia) são passadas 5 vezes para produzir células renais bioativas expandidas. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de células não renais bioativas. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de pelo menos um tipo celular. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de células tendo uma densidade de mais do que 1,095 g/ml. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de células pequenas de baixa granularidade. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de células que são menores do que eritrócitos. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de células com um diâmetro menor do que 6 µm. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de células com um diâmetro menor do que 2 µm. Em certas modalidades, passar as células depleta a população celular de células com granularidade inferior a dos eritrócitos. Em certas modalidades, a viabilidade da população celular aumenta depois de 1 ou mais passagens. Em certas modalidades, as descrições de células pequenas e baixa granularidade são usadas quando se analisam as células através da classificação celular ativada por fluorescência (FACs), por exemplo, usando o eixo X-Y de um gráfico de dispersão de onde as células aparecem.
[0157] Em certas modalidades, as células renais bioativas expandidas são desenvolvidas sob condições hipóxicas por pelo menos cerca de 6, 9, 10, 12 ou 24 horas, mas menos do que 48 horas, ou de 6 a 9 horas, ou de 6 a 48 horas, ou de cerca de 12 até cerca de 15 horas, ou de cerca de 8 horas, ou de cerca de 12 horas, ou de cerca de 24 horas, ou de cerca de 36 horas, ou de cerca de 48 horas. Em certas modalidades, as células desenvolvidas sob condições hipóxicas são selecionadas com base em densidade. Em certas modalidades, a população de células renais bioativas é uma população de SRC obtida depois da separação de gradiente de densidade contínua ou descontínua (etapa única ou múltiplas etapas) das células renais expandidas (por exemplo, depois da passagem e/ou cultura sob condições hipóxicas). Em certas modalidades, a população de células renais bioativas é uma população de SRC obtida depois da separação das células renais expandidas pela centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface (por exemplo, depois da passagem e/ou cultura sob condições hipóxicas). Em certas modalidades, uma condição de cultura hipóxica é uma condição de cultura na qual as células são submetidas a uma redução em níveis de oxigênio disponíveis no sistema de cultura relativo às condições de cultura padrão nas quais as células são cultivadas em níveis de oxigênio atmosféricos (cerca de 21%). Em certas modalidades, as células cultivadas sob condições hipóxicas de cultura são cultivadas em um nível de oxigênio de cerca de 5% até cerca de 15%, ou de cerca de 5% até cerca de 10%, ou de cerca de 2% até cerca de 5%, ou de cerca de 2% até cerca de 7%, ou de cerca de 2% ou de cerca de 3%, ou de cerca de 4%, ou de cerca de 5%. Em certas modalidades, as SRCs exibem uma densidade flutuante maior do que 1,0419 g/mL. Em certas modalidades, as SRCs exibem uma densidade flutuante maior do que 1,04 g/mL. Em certas modalidades, as SRCs exibem uma densidade flutuante maior do que 1,045 g/mL. Em certas modalidades, as BRCs ou SRCs contêm uma maior porcentagem de uma ou mais populações celulares e carecem ou são deficientes em uma ou mais outras populações celulares, conforme comparado com uma população celular renal inicial.
[0158] Em certas modalidades, as células renais bioativas expandidas podem ser submetidas à separação do gradiente de densidade para obter SRCs. Em certas modalidades, BRCs são submetidas a ambas as condições hipóxicas de cultura e separação do gradiente de densidade para obter SRCs. Em certas modalidades, a centrifugação do gradiente de densidade de etapa única ou múltiplas etapas contínua ou descontínua é usada para separar populações celulares renais coletadas com base na densidade celular flutuante. Em certas modalidades, as células renais bioativas expandidas podem ser separadas por centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface para obter SRCs. Em certas modalidades, a centrifugação através de um limite de densidade ou interface é usada para separar populações celulares renais coletadas com base na densidade celular flutuante. Em certas modalidades, as SRCs são geradas usando, em parte, meio OPTIPREP (Axis-Shield), compreendendo uma solução de
60% (p/v) do composto iodado não iônico iodixanol em água. Um versado na técnica, no entanto, reconhecerá que outros meios, gradientes de densidade (contínuos ou descontínuos), limites de densidade, barreiras, interfaces ou outros meios, por exemplo, separação imunológica usando marcadores de superfície celular conhecidos na técnica, compreendendo características necessárias para isolar populações celulares descritas no presente documento podem ser usadas para obter células renais bioativas. Em certas modalidades, uma fração celular exibindo densidade flutuante maior do que 1,04 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,04 g/mL são excluídas e descartadas. Em certas modalidades, uma fração celular exibindo densidade flutuante maior do que 1,0419 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,0419 g/mL são excluídas e descartadas. Em certas modalidades, uma fração celular exibindo densidade flutuante maior do que 1,045 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,045 g/mL são excluídas e descartadas.
[0159] Em certas modalidades, a densidade celular flutuante é usada para obter uma população de SRC e/ou para determinar se uma população celular renal é uma população de células renais bioativas. Em certas modalidades, a densidade celular flutuante é usada para isolar células renais bioativas. Em certas modalidades, a densidade celular flutuante é determinada pela centrifugação através de um OptiPrep de etapa única (7% iodixanol; 60% (p/v) em interface de densidade (OptiMEM) (gradiente de densidade descontínua de etapa única). Optiprep é uma solução 60% p/v de iodixanol em água. Quando usado em uma interface de densidade exemplificadora ou gradiente de densidade descontínua de etapa única, o Optiprep é diluído com OptiMEM (um meio basal de cultura celular) para formar uma solução final de 7% iodixanol (em água e OptiMEM). A formulação de OptiMEM é uma modificação de meio essencial mínimo Eagle, tamponado com HEPES e bicarbonato de sódio e suplementado com hipoxantina, timidina, piruvato de sódio, L-glutamina ou GLUTAMAX, oligoelementos e fatores de crescimento. O nível de proteína é mínimo (15 µg/mL), com insulina e transferrina sendo os únicos suplementos de proteína. O fenol vermelho é incluído em uma concentração reduzida como um indicador de pH. Em certas modalidades, OptiMEM pode ser suplementado com 2-mercaptoetanol antes do uso.
[0160] Em certas modalidades, a solução de OptiPrep é preparada e o índice refratário indicativo da densidade desejada é medido (R.I.
1.3456 +/- 0.0004) antes do uso. Em certas modalidades, as células renais são estratificadas na parte superior da solução. Em certas modalidades, a interface de densidade ou gradiente de densidade descontínuo de etapa única é centrifugada em 800 g por 20 min em temperatura ambiente (sem interrupção) tanto em um tubo centrífugo (por exemplo, um tubo cônico de 50ml) ou um processador celular (por exemplo COBE 2991). Em certas modalidades, a fração celular exibindo densidade flutuante maior do que cerca de 1,04 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,04 g/mL são excluídas e descartadas. Em certas modalidades, a fração celular exibindo densidade flutuante maior do que cerca de 1,0419 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,0419 g/mL são excluídas e descartadas. Em certas modalidades, a fração celular exibindo densidade flutuante maior do que cerca de
1,045 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,045 g/mL são excluídas e descartadas. Em certas modalidades, antes da avaliação da densidade celular ou seleção baseada em densidade, as células são cultivadas até que elas sejam pelo menos 50% confluentes e incubadas de um dia para o outro (por exemplo, pelo menos cerca de 8 ou 12 horas) em uma incubadora hipóxica ajustada para 2% de oxigênio em um ambiente com 5% de CO2 em 37ºC.
[0161] Em certas modalidades, as células obtidas a partir de uma amostra renal são expandidas e depois processadas (por exemplo, através de hipóxia e separação por centrifugação) para prover uma população de SRC. Em certas modalidades, uma população de SRC é produzida usando reagentes e procedimentos descritos no presente documento. Em certas modalidades, a amostra de células a partir de uma população de SRC é testada quanto à viabilidade antes da administração das células da população a um indivíduo. Em certas modalidades, uma amostra de células de uma população de SRC é testada para a expressão de um ou mais dos marcadores divulgados no presente documento antes da administração das células da população a um indivíduo.
[0162] Em certas modalidades, as SRCs são produzidas por um processo compreendendo expandir as células renais primárias (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, ou mais passagens), cultivar as células renais expandidas sob condições hipóxicas, e depois colocar as células em contato com uma nefrotoxina (tal como iodixanol, por exemplo, 7% de iodixanol). Em certas modalidades, as SRCs são produzidas por um processo compreendendo expandir as células renais primárias (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, ou mais passagens), cultivar as células renais expandidas sob condições hipóxicas, e depois selecionar as células com um gradiente de densidade conforme divulgado no presente documento. Em certas modalidades, as SRCs são produzidas por um processo compreendendo expandir as células renais primárias (por exemplo, por 1, 2, 3, 4, 5, ou mais passagens), cultivar as células renais expandidas sob condições hipóxicas, e depois enriquecer as células tubulares a partir das células e/ou depletar células vasculares ou células de duto coletor a partir das células expandidas que foram cultivadas sob condições hipóxicas.
[0163] Os exemplos não limitantes de composições e métodos para preparar SRCs são divulgados na Publicação do pedido de patente Norte-americano No. 2017/0281684 A1, cujo teor total é incorporado no presente documento a título de referência.
[0164] Em certas modalidades, as BRCs ou SRCs são derivadas de uma amostra renal nativa autóloga ou alogeneica. Em certas modalidades, as BRCs ou SRCs são derivadas de uma amostra renal não autóloga. Em certas modalidades, a amostra pode ser obtida através da biopsia renal.
[0165] Em certas modalidades, o isolamento e a expansão de células renais provê uma mistura de tipos de células renais incluindo células epiteliais renais e células estromais. Em certas modalidades, as SRCs são obtidas por separação do gradiente de densidade contínuo ou descontínuo das células renais expandidas. Em certas modalidades, o tipo celular primário na população de SCR separada pelo gradiente de densidade é de fenótipo epitelial tubular. Em certas modalidades, as SRCs são obtidas pela separação das células renais expandidas por centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface. Em certas modalidades, o tipo celular primário na população de SCR separada através de um limite de densidade, barreira ou interface é de fenótipo epitelial tubular. Em certas modalidades, as características de SRCs obtidas a partir de células renais expandidas são avaliadas usando uma abordagem multifacetada. Em certas modalidades, a morfologia celular, a cinética de crescimento e a viabilidade celular são monitoradas durante um processo de expansão da célula renal. Em certas modalidades, a densidade flutuante e a viabilidade da SRC é caracterizada pela centrifugação ou através de um meio de gradiente de densidade e exclusão com azul de tripano. Em certas modalidades, o fenótipo de SRC é caracterizado por citometria de fluxo e a função de SRC é demonstrada pela expressão de VEGF e KIM-1. Em certas modalidades, a função celular de SRC, a pré-formulação, também podem ser avaliadas pela medição da atividade de duas enzimas específicas; GGT (γ-glutamil transpeptidase) e LAP (leucina aminopeptidase), encontradas nos túbulos proximais renais.
[0166] Em certas modalidades, as características celulares que contribuem para a separação de subpopulações celulares através de um meio de densidade (tamanho e granularidade) podem ser exploradas para separar subpopulações celulares através da citometria de fluxo (dispersão direta= uma reflexão de tamanho através da citometria de fluxo, e dispersão lateral=uma reflexão de granularidade). Em certas modalidades, um meio de gradiente de densidade ou de separação deve ter baixa toxicidade em relação às específicas células de interesse. Em certas modalidades, embora o meio de densidade deva ter baixa toxicidade em relação às células específicas de interesse, a presente divulgação contempla o uso de meios que têm um papel no processo de seleção das células de interesse. Em certas modalidades, e sem se ater a nenhuma teoria, parece que as populações celulares divulgadas no presente documento recuperadas pelo meio compreendendo iodixanol são resistentes ao iodixanol, já que há uma perda apreciável de células entre as etapas de carregamento e recuperação, sugerindo que a exposição ao iodixanol sob as condições do gradiente de densidade ou limite de densidade, densidade, barreira ou interface de densidade leve à eliminação de certas células. Em certas modalidades, as células que aparecem depois de uma separação por gradiente de densidade ou interface de densidade do iodixanol são resistentes a qualquer efeito desagradável de iodixanol e/ou gradiente de densidade ou exposição de interface. Em certas modalidades, um meio de contraste compreendendo uma nefrotoxina leve a moderada é usado no isolamento e/ou seleção de uma população celular, por exemplo, uma população de SRC. Em certas modalidades, uma nefrotoxina “leve” é uma nefrotoxina que mata não mais do que 10% das células renais primárias quando as células são incubadas em uma formulação de meio padrão suplementada com 7% p/v da nefrotoxina por 12 horas conforme avaliado por um ensaio de viabilidade celular por exclusão de corante viva/morta padrão. Em certas modalidades, as SRCs são resistentes ao iodixanol. Em certas modalidades, o meio de densidade não deve se ligar a proteínas em plasma humano ou adversamente afetar as funções principais das células de interesse.
[0167] Em certas modalidades, uma população celular foi enriquecida e/ou depletada de um ou mais tipos de células renais usando classificação celular ativada por fluorescente (FACS). Em certas modalidades, os tipos de células renais podem ser enriquecidos e/ou depletados usando BD FACSAriaTM ou equivalente. Em certas modalidades, os tipos de células renais podem ser enriquecidos e/ou depletados usando FACSAria IIITM ou equivalente.
[0168] Em certas modalidades, uma população celular foi enriquecida e/ou depletada de um ou mais os tipos de células renais usando classificação celular magnética. Em certas modalidades, um ou mais dos tipos de células renais podem ser enriquecidos e/ou depletados usando o sistema Miltenyi autoMACS® ou equivalente.
[0169] Em certas modalidades, uma população celular renal foi submetida à cultura tridimensional. Em certas modalidades, os métodos de cultura das populações celulares são através da perfusão contínua. Em certas modalidades, as populações celulares cultivadas através da cultura tridimensional e perfusão contínua demonstram maior celularidade e interconectividade quando comparado com as populações celulares cultivadas estaticamente. Em certas modalidades, as populações celulares cultivadas através da cultura tridimensional e perfusão contínua demonstram maior expressão de EPO, assim como expressão aumentada de genes associados ao túbulo renal tais como E-caderina quando comparado com culturas estáticas das referidas populações celulares. Em certas modalidades, uma população celular cultivada através de perfusão contínua demonstra um maior nível de consumo de glucose e glutamina quando comparado com uma população celular cultivada estaticamente.
[0170] Em certas modalidades, as condições de oxigênio baixas ou hipóxicas podem ser usadas nos métodos para preparar uma população celular provida no presente documento. Em certas modalidades, um método de preparação de uma população celular pode ser usado sem a etapa de condicionamento ao baixo oxigênio. Em certas modalidades, as condições normóxicas podem ser usadas.
[0171] Em certas modalidades, uma população celular renal foi isolada e/ou cultivada a partir de tecido renal. Os exemplos não limitantes de métodos são divulgados no presente documento para separar e isolar os componentes de células renais, por exemplo, populações celulares enriquecidas que serão usadas nas formulações para o uso terapêutico, incluindo o tratamento de doença renal, anemia, deficiência de EPO, deficiência no transporte tubular e deficiência na filtração glomerular. Em certas modalidades, uma população celular é isolada a partir de tecido renal recém digerido, isto é, mecanicamente ou enzimaticamente digerido ou de uma cultura heterogênea in vitro de células renais de mamíferos.
[0172] Em certas modalidades, uma população de células renais compreende células renais que produzem EPO.
Em certas modalidades, um indivíduo tem anemia e/ou deficiência de EPO.
Em certas modalidades, as populações de células renais que produzem EPO que são caracterizadas pela expressão de EPO e bio- responsividade ao oxigênio, de forma que uma redução na tensão do oxigênio do sistema de cultura resulta em uma indução na expressão de EPO.
Em certas modalidades, as populações celulares que produzem EPO são enriquecidas pelas células que produzem EPO.
Em certas modalidades, a expressão de EPO é induzida quando a população celular é cultivada sob condições em que as células são submetidas a uma redução nos níveis disponíveis de oxigênio no sistema de cultura conforme comparado com uma população celular cultivada em níveis atmosféricos normais (cerca de 21%) de oxigênio disponível.
Em certas modalidades, as células que produzem EPO cultivadas em condições inferiores de oxigênio expressam maiores níveis de EPO em relação às células que produzem EPO cultivadas em condições normais de oxigênio.
Em geral, a cultura das células em níveis reduzidos de oxigênio disponível (também referida como condições hipóxicas de cultura) significa que o nível de oxigênio reduzido é reduzido em relação à cultura de células em níveis atmosféricos normais de oxigênio disponível (também referido como condições normais ou normóxicas de cultura). Em certas modalidades, as condições hipóxicas de cultura celular incluem cultivar as células em cerca de menos do que 1% de oxigênio, cerca de menos do que 2% de oxigênio, cerca de menos do que 3% de oxigênio, cerca de menos do que 4% de oxigênio, ou de cerca de menos do que 5% de oxigênio.
Em certas modalidades, as condições de cultura incluem cultivar as células em cerca de 10% de oxigênio, cerca de 12% de oxigênio, cerca de 13% de oxigênio, cerca de 14% de oxigênio, cerca de 15% de oxigênio, cerca de 16% de oxigênio, cerca de 17% de oxigênio, cerca de 18% de oxigênio, cerca de 19% de oxigênio, cerca de 20% de oxigênio, ou de cerca de 21% de oxigênio.
[0173] Em certas modalidades, a indução ou expressão aumentada de EPO é obtida e pode ser observada através da cultura de células em cerca de menos do que 5% de oxigênio disponível e através da comparação dos níveis de expressão de EPO com as células cultivadas em oxigênio atmosférico (cerca de 21%). Em certas modalidades, a indução de EPO é obtida em uma cultura de células capazes de expressar EPO por um método que inclui a primeira fase de cultura na qual a cultura de células é cultivada em oxigênio atmosférico (cerca de 21%) por algum período de tempo e a segunda fase de cultura na qual os níveis de oxigênio disponíveis são reduzidos e as mesmas células são cultivadas em cerca de menos do que 5% de oxigênio disponível. Em certas modalidades, a expressão de EPO que é responsiva a condições hipóxicas é regulada por HIF1α. Em certas modalidades, outras condições de cultura de manipulação de oxigênio conhecidas na técnica podem ser usadas para as células descritas no presente documento.
[0174] Em certas modalidades, a formulação contém populações enriquecidas de células de mamífero que produzem EPO caracterizadas pela bio-responsividade (por exemplo, expressão de EPO) para condições de perfusão. Em certas modalidades, as condições de perfusão incluem vazão de fluido transitório, intermitente ou contínuo (perfusão). Em certas modalidades, a expressão de EPO é mecanicamente induzida quando o meio no qual as células são cultivadas é circulado ou agitado de forma intermitente ou contínua de tal maneira que forças dinâmicas sejam transferidas para as células através da vazão. Em certas modalidades, as células submetidas à vazão de fluido transitório, intermitente ou contínuo são cultivadas de uma tal maneira que elas estão presentes como estruturas tridimensionais em ou sobre um material que provê estrutura e/ou espaço para as estruturas tridimensionais se formarem. Em certas modalidades, as células são cultivadas em esferas porosas e submetidas à vazão de fluido intermitente ou contínua por meio de uma plataforma vibratória, plataforma orbital ou frasco giratório. Em certas modalidades, as células são cultivadas em estruturação tridimensional e colocadas em um dispositivo pelo qual a estrutura fica estacionária e o fluido flui direcionalmente ao longo de ou através da estrutura. Aqueles versados na técnica compreenderão que outras condições de perfusão de cultura conhecidas na técnica podem ser usadas para as células descritas no presente documento.
[0175] Em certas modalidades, uma população celular é derivada a partir de uma biopsia renal. Em certas modalidades, uma população celular é derivada a partir de tecido renal total. Em certas modalidades, uma população celular é derivada de uma cultura in vitro de células renais de mamífero, estabelecidas a partir de biopsias renais ou tecido renal total. Em certas modalidades, a população celular renal é uma população de SRC. Em certas modalidades, uma população celular é uma população celular não fracionada, também referida no presente documento como uma população celular não enriquecida.
[0176] As composições contendo uma variedade de agentes ativos (por exemplo, diferentes das células renais ou microvesículas) são incluídas no presente documento. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) providas no presente documento compreendem um composto que estava presente no meio de cultura da população celular renal que secretou as microvesículas (por exemplo, exossomas). Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) providas no presente documento compreendem um composto que estava presente na população celular renal que secretou as microvesículas (por exemplo, exossomas).
[0177] Os exemplos não limitantes de agentes ativos adequados incluem, sem limitação, agregados celulares, biomateriais acelulares, produtos secretados a partir de células bioativas, produtos terapêuticos de moléculas grandes e pequenas, assim como combinações dos mesmos. Por exemplo, um tipo de células bioativas pode ser combinado com microvesículas baseadas em biomaterial com ou sem moléculas terapêuticas ou um outro tipo de células bioativas. Em certas modalidades, as células não ligadas podem ser combinadas com partículas acelulares.
[0178] Em certas modalidades, as células da população celular renal estão dentro de esferoides. Em certas modalidades, a população celular renal está na forma de esferoides. Em certas modalidades, os esferoides compreendendo células renais bioativas são administrados a um indivíduo. Em certas modalidades, os esferoides compreendem pelo menos um tipo celular não renal ou população de células. Em certas modalidades, os esferoides são produzidos em um método compreendendo (i) combinar uma população de células renais bioativas e uma população celular não renal, e (ii) cultivar a população de células renais bioativas e a população celular não renal em um sistema de cultura tridimensional compreendendo um frasco giratório até que os esferoides se formem.
[0179] Em certas modalidades, a população celular não renal compreende uma população celular endotelial ou uma população celular progenitora endotelial. Em certas modalidades, a população celular bioativa é uma população celular endotelial. Em certas modalidades, a população celular endotelial é uma linhagem celular. Em certas modalidades, a população celular endotelial compreende células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Em certas modalidades, a população celular não renal é uma população de células-tronco mesenquimais. Em certas modalidades, a população celular não renal é uma população de células-tronco de origem hematopoietica, mamária, intestinal, placentária, pulmonar, de medula óssea, sangue, cordão umbilical, endotelial, polpa dental, adipose, neural, olfatória, crista neural ou testicular. Em certas modalidades, a população celular não renal é uma população celular progenitora derivada de adipose. Em certas modalidades, as populações celulares são xenogeneicas, singeneicas, alogeneicas, autólogas ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, a população de células renais bioativas e a população celular não renal são cultivadas em uma razão de 0,1:9,9 para 9,9:0,1. Em certas modalidades, a população de células renais bioativas e a população celular não renal são cultivadas em uma razão de cerca de 1:1. Em certas modalidades, a população celular renal e a população celular bioativa são suspensas em meio de crescimento.
[0180] As células renais bioativas expandidas podem ser adicionalmente submetidas à separação de meio de densidade contínuo ou descontínuo para obter as SRCs. Especificamente, a centrifugação do gradiente de densidade de etapa única ou múltiplas etapas contínua ou descontínua é usada para separar populações celulares renais coletadas com base na densidade celular flutuante. Em certas modalidades, as células renais bioativas expandidas podem ser adicionalmente submetidas à separação pela centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface para obter as SRCs. Especificamente, a centrifugação através de um limite de densidade, barreira ou interface é usada para separar populações celulares renais coletadas com base na densidade celular flutuante. Em certas modalidades, as SRCs são geradas usando, em parte, o meio OPTIPREP (Axis-Shield), compreendendo uma solução 60% do composto iodado não iônico iodixanol em água. Um versado na técnica,
no entanto, reconhecerá que qualquer meio do gradiente de densidade sem limitação de meio específico ou outro meio, por exemplo, separação imunológica usando marcadores de superfície celular conhecidos na técnica, compreendendo características necessárias para isolar as populações celulares da presente divulgação podem ser usadas de acordo com a divulgação. Por exemplo, Percoll® [partículas de sílica coloidal de 15-30 nm de diâmetro (23% p/p em água) que foram revestidas com polivinilpirrolidona (PVP)] ou sacarose podem ser usadas para formar um gradiente de densidade ou limite de densidade. Em certas modalidades, a fração celular exibindo densidade flutuante maior do que cerca de 1,04 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,04 g/mL são excluídas e descartadas. Em certas modalidades, a fração celular exibindo densidade flutuante maior do que cerca de 1,0419 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,0419 g/mL são excluídas e descartadas. Em certas modalidades, a fração celular exibindo densidade flutuante maior do que cerca de 1,045 g/mL é coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. Em certas modalidades, as células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,045 g/mL são excluídas e descartadas.
[0181] Em certas modalidades, as composições terapêuticas, e formulações das mesmas, da presente divulgação podem conter (i) populações heterogêneas, isoladas de células renais, enriquecidas para componentes bioativos específicos ou tipos celulares e/ou depletadas de componentes ou tipos celulares inativos ou indesejados específicos, e/ou (ii) as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas pelas referidas células, para uso no tratamento de doença renal, isto é, provendo estabilização e/ou melhora e/ou regeneração da função e/ou estrutura renal. Os exemplos não limitantes de células para prover a referida estabilização e/ou melhora foram anteriormente descritas em Presnell et al. U.S. 8,318,484 e Ilagan et al. PCT/US2011/036347 e Jain et al. PCT/US2016/044866, cujos teores são incorporados no presente documento a título de referência. Em certas modalidades, as composições providas no presente documento podem conter frações celulares renais isoladas que carecem de componentes celulares quando comparado com um indivíduo saudável que ainda retém propriedades terapêuticas, isto é, proveem estabilização e/ou melhora e/ou regeneração da função renal. Em certas modalidades, as populações celulares, frações celulares e/ou produtos secretados de células descritos no presente documento podem ser derivados de indivíduos saudáveis, indivíduos com uma doença renal, ou indivíduos conforme descritos no presente documento.
[0182] Em certas modalidades, a fonte de células é a mesma que o órgão ou tecido alvo pretendido. Por exemplo, as BRCs e/ou SRCs podem ser retiradas dos rins para serem usadas em uma formulação a ser administrada no rim. Em certas modalidades, as populações celulares são derivadas a partir de uma biopsia renal. Em certas modalidades, as populações celulares são derivadas de tecido renal total. Em certas modalidades, as populações celulares são derivadas de culturas in vitro de células renais de mamíferos, estabelecidas a partir de biopsias renais ou tecido renal total. Em certas modalidades, as BRCs e/ou SRCs compreendem misturas heterogêneas ou frações de células renais bioativas. As BRCs e/ou SRCs podem ser derivadas de ou serem elas mesmas as frações de células renais a partir de indivíduos saudáveis. Além disso, a presente divulgação provê frações de células renais obtidas de um indivíduo doente que pode carecer de certos componentes celulares quando comparado com as frações de células renais correspondentes de um indivíduo saudável, ainda assim reter propriedades terapêuticas. A presente divulgação também provê populações celulares terapeuticamente ativas que carecem de componentes celulares comparado com um indivíduo saudável, cujas populações celulares podem ser, em certas modalidades, isoladas e expandidas a partir de fontes autólogas em vários estados de doença.
[0183] Em certas modalidades, as SRCs são obtidas a partir de isolamento e expansão de células renais a partir de um tecido cortical renal de um paciente através de uma biopsia renal. As células renais são isoladas a partir de um tecido renal pela digestão enzimática, expandidas usando técnicas de cultura celular padrão, e selecionadas por centrifugação das células renais expandidas através de um limite de densidade, barreira ou interface. Nesta modalidade, as SRCs são compostas primariamente de células epiteliais renais tubulares que são conhecidas pelo seu potencial regenerativo (Bonventre JV. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am Soc Nephrol. 2003;14(Suppl. 1):S55–61; Humphreys BD, Czerniak S, DiRocco DP, et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. PNAS. 2011;108:9226–31; Humphreys BD, Valerius MT, Kobayashi A, et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2008;2:284–91). Outras células parenquimais (vasculares) e células estromais podem estar presentes na população de SRC autóloga. Em certas modalidades, as células renais são selecionadas através de centrifugação em um gradiente de etapa única ou múltiplas etapas contínuo ou descontínuo.
[0184] São incluídas no presente documento composições terapêuticas compreendendo ambas as vesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas) e células renais selecionadas. Em certas modalidades, a combinação de vesículas e células provê a estabilização e/ou melhora e/ou reparo e/ou regeneração da função renal no indivíduo. As propriedades terapêuticas podem incluir um reparo ou efeito regenerativo.
[0185] Em certas modalidades, as células são BRCs imunoprivilegiadas geneticamente modificadas (por exemplo, genomicamente modificadas e/ou modificadas através de RNAi) BRCs (tais como SRCs).
[0186] Em certas modalidades, as vesículas são obtidas a partir de BRCs imunoprivilegiadas geneticamente modificadas (por exemplo, genomicamente modificadas e/ou modificadas através de RNAi) (tais como SRCs).
[0187] Em certas modalidades, as BRCs geneticamente modificadas são BRCs genomicamente modificadas (isto é, BRCs com uma modificação genética nos genomas das mesmas). Em certas modalidades, as BRCs geneticamente modificadas compreendem um polinucleotídeo exógeno (tal como um plasmídeo ou um vetor viral) que expressa uma molécula de interferência no RNA (RNAi) que reduz a expressão de um gene de imunogenicidade genômico em uma BRC. Em certas modalidades, a molécula de RNAi é uma molécula de RNA grampo de cabelo curta ou de interferência curta. Em certas modalidades, o método inclui modificar geneticamente um gene de imunogenicidade genômico em uma BRC.
[0188] Em certas modalidades, o gene codifica uma proteína dentro de uma molécula de classe I ou molécula de classe II do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). Em certas modalidades, o gene é uma beta-2 microglobulina (B2M também conhecido como β2M), antígeno de leucócito humano (HLA)-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA- DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1 ou gene HLA-DQB1.
[0189] Em certas modalidades, o gene codifica um antígeno de menor histocompatibilidade (MiHA ou mHA). Em certas modalidades, o gene é um gene HA-1, HA-2, HA-8, HB-1, HY-A1, HY-A2, HY-B7, HY-
B8, HY-B60 ou HY-DQ5.
[0190] Em certas modalidades, qualquer variante alélica de um gene HLA, B2M ou um gene mHA mencionado no presente documento pode ser modificado (por exemplo, deletado) ou direcionado com a interferência de RNA.
[0191] Em certas modalidades, modificar geneticamente o gene compreende mutar o gene. Em certas modalidades, mutar o gene compreende deletar o gene ou uma porção do mesmo.
[0192] Em certas modalidades, modificar geneticamente uma célula inclui mutar qualquer combinação de dois ou mais de um gene B2M, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPA2, HLA-DQA1, e/ou HLA-DQB1.
[0193] Em certas modalidades, as BRCs geneticamente modificadas são células renais primárias geneticamente modificadas. Em certas modalidades, as células renais primárias geneticamente modificadas foram passadas pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5 ou mais vezes antes ou depois da modificação genética. Em certas modalidades, o método ainda inclui obter SRCs a partir das BRCs geneticamente modificadas. Em certas modalidades, SRCs são obtidas, e depois geneticamente modificadas.
[0194] Em certas modalidades, as BRCs são SRCs. Vários dos exemplos não limitantes de SRCs são divulgados no presente documento.
[0195] Em certas modalidades, uma BRC é geneticamente modificada enquanto dentro de uma população de BRCs, em que menos do que todas as células na população de BRCs se torna geneticamente modificada. Em certas modalidades, o método ainda compreende isolar ou enriquecer uma BRC geneticamente modificada a partir de uma população de BRCs. Em certas modalidades, o método ainda compreende isolar ou enriquecer uma SRC geneticamente modificada a partir de uma população de SRCs.
Em certas modalidades, a população de BRCs (por exemplo SRCs) é submetida à modificação genética para render uma população de BRCs na qual algumas células são geneticamente modificadas e outras células não são.
Em certas modalidades, algumas das células geneticamente modificadas são homozigóticas para a modificação.
Em certas modalidades, algumas das células geneticamente modificadas são heterozigóticas para a modificação.
Em certas modalidades, as células que são homozigóticas para a modificação são enriquecidas ou selecionadas.
Em certas modalidades, as células que são heterozigóticas para a modificação são enriquecidas ou selecionadas.
Em certas modalidades, as células que são homozigóticas ou heterozigóticas para a modificação são enriquecidas ou selecionadas.
Em certas modalidades, a modificação é uma mutação que reduz a expressão de uma proteína codificada pelo gene.
Em certas modalidades, a mutação reduz o nível da proteína na superfície das células modificadas.
Em certas modalidades, as células que expressam a proteína são depletadas ou excluídas.
Em certas modalidades, a mutação reduz o nível de uma molécula de classe I MHC e/ou uma molécula de classe II MHC na superfície de uma célula.
Em certas modalidades, as células com a mutação não têm uma molécula de classe I MHC e/ou uma molécula de classe II MHC na superfície da mesma.
Em certas modalidades, as células que expressam uma molécula de classe I MHC nas superfícies das mesmas são depletadas ou excluídas.
Em certas modalidades, as células que expressam uma molécula de classe II MHC nas superfícies das mesmas são depletadas ou excluídas.
Em certas modalidades, um método de classificação celular é usado para remover as células que expressam a proteína, uma molécula de classe I MHC, e/ou uma molécula de classe II MHC a partir da população.
Em certas modalidades, o método de classificação celular compreende um agente (tal como um anticorpo) que se liga à proteína, uma molécula de classe I MHC, e/ou uma molécula de classe II MHC. Em certas modalidades, a depleção ou seleção de células compreende acoplamento esfera/anticorpo para retirar as células com certas proteínas na sua superfície celular. Em certas modalidades, o método de classificação celular é classificação celular ativada magnética (MACS) ou classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Em certas modalidades, o gene escolhido para modificação genética é um cuja proteína é expressada na superfície celular, de modo que a tecnologia FACS e/ou MACS possam diferenciar (por exemplo, com base na ligação do anticorpo na superfície) da célula viva. Em certas modalidades, MACs é usada para remover as células que expressam uma molécula MHC (tal como uma molécula de classe I MHC ou uma molécula de classe II MHC) de células que não expressam. Em certas modalidades, um vetor integrante ou não integrante pode ser usado para expressar um outro polipeptídeo componente de HLA para adicionalmente modificar ou modular o sistema imune adaptivo ou inato como por exemplo, para prevenir direcionamento e lise pelas células exterminadoras naturais (NK).
[0196] Em certas modalidades, modificar geneticamente (por exemplo, mutar) o gene compreende (i) expressar uma proteína de edição genética na BRC; ou (ii) liberar uma proteína de edição genética pela membrana celular da BRC. Em certas modalidades, a proteína de edição genética é uma nuclease dedo de zinco (ZFN), uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma megaTAL, ou uma endonuclease orientada por RNA. Em certas modalidades, a endonuclease orientada por RNA é uma proteína Cas. Em certas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9. Em certas modalidades, modificar geneticamente o gene ainda compreende (i) expressar um RNA de orientação única (gRNA) na BRC; ou (ii) liberar um RNA de orientação única (gRNA) pela membrana celular da BRC.
Em certas modalidades, a proteína Cas9 e o gRNA são parte de um complexo de ribonucleoproteína.
[0197] Em certas modalidades, modificar geneticamente o gene reduz a quantidade de MHC classe I na superfície da célula. Em certas modalidades, modificar geneticamente o gene reduz a quantidade de MHC classe II na superfície da célula. Em certas modalidades, o método compreende modificar geneticamente pelo menos dois ou mais genes, em que pelo menos um dos genes codifica uma proteína dentro de uma molécula de classe I MHC e pelo menos um dos genes codifica uma proteína dentro de uma molécula de classe II MHC. Em certas modalidades, pelo menos um dos genes é um gene HLA.
[0198] As descrições não limitantes em relação às BRCs geneticamente modificadas, incluindo métodos de produção, são descritas no pedido PCT No. PCT/US18/38801, depositado em 21 de junho de 2018.
[0199] Em certas modalidades, a fonte de células é a mesma que o órgão ou tecido alvo pretendido a partir das mesmas fontes ou fontes diferentes. Por exemplo, as BRCs e/ou SRCs podem ser retiradas dos rins para serem usadas em uma formulação a ser administrada no rim (junto com ou separadamente das vesículas). Em certas modalidades, as BRCs e/ou SRCs podem ser retiradas dos rins para serem usadas para produzir vesículas a serem administradas no rim. Em certas modalidades, as populações celulares são derivadas a partir de uma biopsia renal. Em certas modalidades, as populações celulares são derivadas de tecido renal total. Em certas modalidades, as populações celulares são derivadas de culturas in vitro de células renais de mamífero, estabelecidas a partir de biopsias renais ou tecido renal total. Em certas modalidades, a BRC e/ou SRC compreendem misturas ou frações heterogêneas de células renais bioativas imunoprivilegiadas geneticamente modificadas (por exemplo, genomicamente modificadas e/ou modificadas através de RNAi). A BRC e/ou SRC podem ser derivadas de ou serem elas próprias frações de células renais de indivíduos saudáveis. Além disso, a presente invenção provê frações de células renais obtidas de um indivíduo doente que pode carecer de certos componentes celulares quando comparado com as frações de células renais correspondentes de um indivíduo saudável, ainda assim reter as propriedades terapêuticas. A presente invenção provê populações celulares terapeuticamente ativas que carecem de componentes celulares comparado com um indivíduo saudável, cujas populações celulares podem ser, em uma modalidade, isoladas e expandidas a partir de rins retirados de vários mamíferos.
[0200] Em certas modalidades, as SRCs são obtidas a partir de isolamento e expansão de células renais a partir de um tecido cortical renal de um paciente diferente através de uma biopsia renal. Em certas modalidades, as células renais são isoladas a partir do tecido renal por digestão enzimática, expandidas usando técnicas de cultura celular padrão, e selecionadas por centrifugação do gradiente de densidade a partir das células renais expandidas. Em certas modalidades, as SRC são compostas primariamente de células epiteliais renais que são conhecidas pelo seu potencial imunoprivilegiado e regenerativo. Outras células parenquimais (vasculares) e estromais podem estar escassamente presentes na população de SRC.
[0201] Conforme descrito no presente documento, a presente invenção é baseada, em parte, no achado surpreendente de que certas subfrações da população heterogênea de células renais, enriquecidas por componentes bioativos e depletadas de componentes inativos ou indesejados, proveem resultados terapêuticos e regenerativos superiores do que a população inicial.
[0202] Em certas modalidades, o isolamento e expansão de células renais provê uma mistura de tipos de células renais incluindo células epiteliais renais e células estromais. Em certas modalidades, as SRCs são obtidas por separação do gradiente de densidade das células renais expandidas. Em certas modalidades, o tipo celular primário na população de SCR separada pelo gradiente de densidade é de fenótipo epitelial tubular. Em certas modalidades, o fenótipo de SRC é caracterizado por citometria de fluxo e a função de SRC é demonstrada pela expressão de VEGF e KIM-1.
[0203] Aqueles versados na técnica compreenderão que outros métodos de isolamento e cultura conhecidos na técnica podem ser usados para as células descritas no presente documento. Aqueles versados na técnica também apreciarão que populações celulares bioativas podem ser derivadas de fontes diferentes daquelas especificamente listadas acima, incluindo, sem limitação, tecidos e órgãos diferentes do rim, fluidos corporais e adipose. Fenótipo de SRC
[0204] Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas por SRCs e/ou SRCs são administradas a um indivíduo que tem ou está sob risco de uma doença renal.
[0205] Em certas modalidades, o fenótipo celular é monitorado pela análise de expressão dos marcadores de células renais usando citometria de fluxo. A análise fenotípica de células é baseada no uso de marcadores antigênicos específicos para o tipo de célula sendo analisado. A análise citométrica de fluxo provê uma medida quantitativa de células na população de amostra que expressa o marcador antigênico sendo analisado.
[0206] Uma variedade de marcadores foi reportada na literatura como sendo úteis para caracterização fenotípica de células epiteliais tubulares renais: (i) citoqueratinas; (ii) proteínas da membrana de transporte (aquaporinas e cubilina); (iii) moléculas de ligação celular (aderinas e grupamento de diferenciação e lectinas); e (iv) enzimas metabólicas (glutationa e gamma-glutamil transpeptidase (GGT)). (Tabela 1). Uma vez que a maioria das células encontradas nas culturas derivadas de digeridos totais dos rins são células epiteliais e células endoteliais, os marcadores examinados focam na expressão de proteínas específicas para esses dois grupos. Tabela 1. Marcadores fenotípicos para caracterização de SRC Marcador antigênico Reatividade CK8/18/19 Células epiteliais, túbulos proximais e distais CK8 Células epiteliais, túbulos proximais CK18 Células epiteliais, túbulos proximais CK19 Células epiteliais, dutos coletores, túbulos distais CK7 Células epiteliais, dutos coletores, túbulos distais CXCR4 Células epiteliais, túbulos distais e proximais E-caderina Células epiteliais, túbulos distais Cubilina Células epiteliais, túbulos proximais Células epiteliais, túbulos proximais, membro fino Aquaporina1 descendente GGT1 Células renais fetais e de adulto, túbulos proximais Aquaporina2 Células renais de duto coletor, túbulos distais DBA células renais de duto coletor, túbulos distais CD31 Células endoteliais dos rins (rato) CD146 Células endoteliais dos rins (canino, humano) MHC//antígeno HC menor Reduzidas para tornar as células imunoprivilegiadas
[0207] A tabela 2 provê marcadores selecionados, faixa e valores de porcentagem médios de fenotípicos na população de SRC e a justificativa para a sua seleção.
[0208] Tabela 2. Marcador selecionado para análise fenotípica de
SRC
Marcador Nível de Faixa de expressão Média Justificativa fenotípico expressão CK18 81,1 a 99,7% (n=87) 96,7% Marcador epitelial Alto 4,5 a 81,2% Marcador tubular GGT1 50,7% Moderado (n=63) funcional Reduzida para tornar MHC//antígeno as células >90% Imunoprivilégio Baixo HC menor imunoprivilegiadas Função celular
[0209] SRC ativamente secreta proteínas que podem ser detectadas através da análise de meio condicionado. A função celular é avaliada pela capacidade das células em metabolizar PrestoBlue e secretar VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) e KIM-1 (molécula de lesão renal-1).
[0210] A Tabela 3 apresenta quantidades de VEGF e KIM-1 presentes em meio condicionado a partir de células renais e culturas de SRC. As células renais foram cultivadas até próximo da confluência. O meio condicionado a partir da exposição durante a noite à culturas de célula renal foi testado quanto a VEGF e KIM-1. TABELA 3. Produção de VEGF e KIM-1 por células renais humanas e SRC VEGF KIM-1 Meio condicionado ng/milhão de ng/mL ng/mL ng/milhão de células células Cultura de células renais 0,50 a 2,42 2,98 a 14,6 0,20 a 3,41 1,14 a 15,2 (n=15)
SRC 0,80 a 3,85 4,83 a 23,07 0,32 a 2,10 1,93 a 12,59 (n=14) Atividade enzimática de SRC
[0211] A função celular de SRC, a pré-formulação, também podem ser avaliadas pela medição da atividade de duas enzimas específicas; GGT (γ-glutamil transpeptidase) e LAP (leucina aminopeptidase), encontradas em túbulos proximais renais.
[0212] Embora a microvesícula (por exemplo, exossoma) e composições celulares renais selecionadas sejam descritas no presente documento, a presente invenção contempla composições contendo uma variedade de outros agentes ativos. Outros agentes ativos adequados incluem, sem limitação, agregados celulares, biomateriais acelulares, terapêuticos de moléculas grandes e pequenas, assim como combinações dos mesmos. Por exemplo, um tipo de células bioativas pode ser combinado com microveículos baseados em biomaterial com ou sem moléculas terapêuticas ou um outro tipo de células bioativas, as células não ligadas podem ser combinadas com partículas acelulares. Agregados celulares
[0213] Em um aspecto, as formulações da presente divulgação contêm agregados celulares ou esferoides e/ou as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas pelos referidos agregados ou esferoides e/ou as microvesículas (por exemplo, exossomas) secretadas pelas células bioativas que não estão em agregados ou esferoides.
[0214] Em certas modalidades, um agregado celular compreende a população celular bioativa descrita no presente documento. Em certas modalidades, o agregado celular compreende células renais bioativas tais como, por exemplo, misturas de células renais, populações celulares renais enriquecidas e combinações de frações de células renais e misturas de células renais com células-tronco mesenquimais, células endoteliais progenitoras, células derivadas da fração estromal vascular de adipose, ou qualquer outra população celular não renal sem limitação.
[0215] Em certas modalidades, as células renais bioativas da divulgação podem ser cultivadas em formatos 3D conforme descrito adicionalmente no presente documento. Em certas modalidades, o termo "organoide" se refere a um acúmulo de células, com um fenótipo e/ou função, que recapitula aspectos do rim nativo. Em certas modalidades, os organoides compreendem populações mistas de células, de uma variedade de linhagens, que são tipicamente encontradas in vivo em um dado tecido. Em certas modalidades, os organoides desta divulgação são formados in vitro, através de qualquer meio, pelo qual as células da divulgação formam agregados, que por sua vez podem formar esferoides, organoides, ou uma combinação dos mesmos. Os referidos agregados, esferoides ou organoides, em certas modalidades, assumem uma estrutura consistente com um órgão específico. Em certas modalidades, os referidos agregados, esferoides ou organoides, expressam marcadores de superfície, que são tipicamente expressados por células do órgão específico. Em certas modalidades, os referidos agregados, esferoides ou organoides, produzem compostos ou materiais, que são tipicamente expressados por células do órgão específico. Em certas modalidades, as células da divulgação podem ser cultivadas em substratos naturais, por exemplo, gelatina. Em certas modalidades, as células da divulgação podem ser cultivadas em substratos sintéticos, por exemplo, PLGA. Biomateriais
[0216] Uma variedade de biomateriais pode ser combinada com um agente ativo para prover as formulações terapêuticas da presente divulgação. Em certas modalidades, os biomateriais podem ser de qualquer formato adequado (por exemplo, esferas) ou formas (por exemplo, líquida, gel, etc.). Os biomateriais adequados na forma de matrizes poliméricas são descritos em Bertram et al. Pedido publicado Norte-americano 20070276507 (incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade). Em certas modalidades, as matrizes ou estruturas poliméricas podem ser formatadas em qualquer número de configurações desejáveis para satisfazer qualquer número de restrições do sistema, geometria ou espaço. Em certas modalidades, um biomaterial está na forma de uma suspensão líquida. Em certas modalidades, as matrizes ou estruturas da presente divulgação podem ser tridimensionais e formatadas para se conformarem às dimensões e formatos de uma estrutura de órgão ou estrutura de tecido. Por exemplo, no uso de estrutura polimérica para tratar doença renal, deficiência no transporte tubular ou deficiência na filtração glomerular, uma matriz tridimensional (3-D) pode ser usada a qual recapitula aspectos ou a totalidade da estrutura e organização do tecido renal nativo assim como do parênquima renal.
[0217] Uma variedade de estruturas 3-D diferentemente formatadas pode ser usada. Naturalmente, a matriz polimérica pode ser formatada em diferentes tamanhos e formatos para se conformarem a pacientes com diferentes tamanhos. A matriz polimérica também pode ser formatada de outras formas para acomodar as necessidades especiais do paciente. Em certas modalidades, a matriz ou estrutura polimérica pode ser um material biocompatível (tal como uma estrutura polimérica porosa). As estruturas podem ser formadas a partir de uma variedade de materiais sintéticos ou de ocorrência natural incluindo, porém sem se limitar a, ácido polilático de célula aberta (OPLA®), éter de celulose, celulose, éster de celulose, polietileno fluorado, fenólico, poli-4- metilpenteno, poliacrilonitrila, poliamida, poliamideimida, poliacrilato, polibenzoxazol, policarbonato, policianoariléter, poliéster, poliestercarbonato, poliéter, polieteretercetona, polieterimida, polietercetona, polietersulfona, polietileno, polifluoroolefina, poliimida, poliolefina, polioxadiazol, óxido de polifenileno, sulfeto de polifenileno, polipropileno, poliestireno, polissulfeto, polissulfona, politetrafluoroetileno, politioéter, politriazol, poliuretano, polivinila, fluoreto de polivinilideno, celulose regenerada, silicone, urea- formaldeído, colágenos, gelatina, alginato, lamininas, fibronectina, seda, elastina, alginato, ácido hialurônico, agarose ou copolímeros ou misturas físicas dos mesmos. As configurações de estrutura podem variar de estruturas macias porosas para estruturas porosas de formato rígido. Em certas modalidades, uma estrutura é configurada como uma solução líquida que é capaz de se tornar um hidrogel, por exemplo, hidrogel que está acima de uma temperatura de fusão.
[0218] Em certas modalidades, a estrutura é derivada de um rim existente ou outro órgão de origem humana ou animal, onde a população celular nativa foi eliminada através da aplicação de detergente e/ou outros agentes químicos e/ou outras metodologias enzimáticas e/ou físicas conhecidas daqueles versados na técnica. Nesta modalidade, a estrutura nativa tridimensional do órgão retirado é retida junto com todos os componentes de matriz extracelular associados em seu contexto biologicamente ativo, nativo. Em certas modalidades, a estrutura é matriz extracelular derivada de rim ou outro órgão de humano ou animal. Em certas modalidades, a configuração é organizada em uma estrutura do tipo tecido através da aplicação de metodologias de bioimpressão tridimensional. Em certas modalidades, a configuração é a forma líquida de uma solução que é capaz de se tornar um hidrogel.
[0219] Em certas modalidades, o biomaterial é um hidrogel. Os hidrogéis podem ser formados a partir de uma variedade de materiais poliméricos e são úteis em uma variedade de aplicações biomédicas. Os hidrogéis podem ser descritos fisicamente como redes tridimensionais de polímeros hidrofílicos. Dependendo do tipo de hidrogel, eles contêm porcentagens variáveis de água, mas em geral não se dissolvem em água. Apesar de seu alto teor de água, os hidrogéis são capazes de adicionalmente ligar grandes volumes de líquido devido à presença de resíduos hidrofílicos. Os hidrogéis incham extensivamente sem mudar a sua estrutura gelatinosa. As características físicas básicas de um hidrogel podem ser especificamente modificadas, de acordo com as propriedades dos polímeros usados e um dispositivo usado para administrar o hidrogel.
[0220] O material hidrogel preferivelmente não induz uma resposta inflamatória. Exemplos de outros materiais que podem ser usados para formar um hidrogel incluem (a) alginatos modificados, (b) polissacarídeos (por exemplo goma gellan e carragenanas) que gelatinizam através da exposição aos cátions monovalentes, (c) polissacarídeos (por exemplo, ácido hialurônico) que são líquidos muito viscosos ou são tixotrópicos e formam um gel com o tempo pela lenta evolução da estrutura, (d) gelatina ou colágeno, e (e) precursores de hidrogel polimérico (por exemplo, copolímeros em bloco de óxido de polietileno-polipropileno glicol e proteínas). A Patente Norte-americana No. 6,224,893 B1 provê uma descrição detalhada dos vários polímeros, e as propriedades químicas dos referidos polímeros, que são adequadas para preparar os hidrogéis de acordo com a presente divulgação.
[0221] Em certas modalidades, o hidrogel usado para formular os biomateriais da presente divulgação são baseados em gelatina. A gelatina é uma proteína derivada de colágeno não tóxica, biodegradável e hidrossolúvel, que é um componente principal da matriz extracelular de tecido mesenquimal (ECM). O colágeno é a principal proteína estrutural no espaço extracelular em vários tecidos conectivos nos corpos animais. Como o principal componente do tecido conectivo, ela é a proteína mais abundante em mamíferos, totalizando de 25% a 35% de todo o teor de proteína do corpo. Dependendo do grau de mineralização, os tecidos de colágeno podem ser rígidos (ossos), complacentes (tendão), ou ter um gradiente do rígido ao complacente (cartilagem). O colágeno, na forma de fibrilas alongadas, é encontrado principalmente em tecidos fibrosos tais como tendões, ligamentos e pele. Ele é também abundante nas córneas, cartilagem, ossos, vasos sanguíneos, o intestino, discos intervertebrais e a dentina nos dentes.
No tecido muscular, ele serve como um principal componente do endomísio. O colágeno constitui um a dois por cento do tecido muscular, e responde por 6% do peso dos músculos tendinosos, fortes. O colágeno ocorre em muitos locais ao longo do corpo. Mais de 90% do colágeno no corpo humano, no entanto, é do tipo I.
[0222] Até hoje, 28 tipos de colágeno foram identificados e descritos. Eles podem ser divididos em vários grupos de acordo com a estrutura que eles formam: Fibrilar (Tipo I, II, III, V, XI), Não fibrilar FACIT (Colágenos associados à fibrila com hélices triplas interrompidas) (Tipo IX, XII, XIV, XVI, XIX), Cadeia curta (Tipo VIII, X), membrana de base (Tipo IV), multiplexina (domínios de hélice tripla múltipla com interrupções) (Tipo XV, XVIII), MACIT (Colágenos associados à membrana com hélices triplas interrompidas) (Tipo XIII, XVII), outros (Tipo VI, VII). Os cinco tipos mais comuns são: Tipo I: pele, tendão, ligamento vascular, órgãos, ossos (principal componente da parte orgânica do osso), Tipo II: cartilagem (principal componente cartilaginoso da cartilagem) Tipo III: retículo (principal componente das fibras reticulares), comumente encontrado junto com o tipo I, Tipo IV: formas de lâmina forma, a camada secretada pelo epitélio da membrana de base, Tipo V: superfícies celulares, cabelo e placenta.
[0223] A gelatina retém sinais informacionais incluindo uma sequência de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), que promove a adesão celular, proliferação e diferenciação de células-tronco. Uma propriedade característica da gelatina é que ela exibe comportamento de temperatura em solução supercrítico (UCST). Em certas modalidades, acima de um limite específico de temperatura de 40ºC, a gelatina pode ser dissolvida em água com a formação de espirais únicas aleatórias flexíveis. Mediante o resfriamento, a ligação ao hidrogênio e as interações Van der Waals ocorrem, resultando na formação de hélices triplas. Essas hélices triplas do tipo colágeno agem como zonas de junção e desencadeiam assim a transição sol-gel. A gelatina é amplamente usada nas aplicações farmacêuticas e médicas.
[0224] Em certas modalidades, o hidrogel usado para formular as composições celulares injetáveis no presente documento é baseado em gelatina de porcinos, que pode ser retirada da pele de porcinos e está comercialmente disponível, por exemplo da Nitta Gelatin NA Inc (NC, USA) ou Gelita USA Inc. (IA, USA). A gelatina pode ser dissolvida, por exemplo, em solução fisiológica tamponada com fosfato Dulbecco (DPBS) para formar um hidrogel termicamente responsivo, que pode gelatinizar e liquefazer em diferentes temperaturas. Em certas modalidades, o hidrogel usado para formular as composições celulares injetáveis no presente documento é baseado em gelatina humana ou animal recombinante expressada e purificada usando metodologias conhecidas daqueles versados na técnica. Em certas modalidades, um vetor de expressão contendo todo ou parte do cDNA para Tipo I, colágeno alfa I humano é expressado na levedura Pichia pastoris. Outros sistemas e organismos do vetor de expressão serão conhecidos daqueles versados na técnica. Em uma modalidade específica, o hidrogel baseado em gelatina da presente divulgação é líquido em e acima da temperatura ambiente (22-28°C) e gelatiniza quando resfriado até temperaturas refrigeradas (2-8°C).
[0225] Aqueles versados na técnica compreenderão que outros tipos de materiais sintéticos ou de ocorrência natural conhecidos na técnica podem ser usados para formar estruturas conforme descrito no presente documento.
[0226] Em certas modalidades, o biomaterial usado de acordo com a presente divulgação é compreendido de ácido hialurônico (HA) na forma de hidrogel, contendo moléculas de HÁ que variam em tamanho de 5,1 kDA a > 2x105 kDa. HA pode promover morfogênese ramificadora e auto-organização tridimensional de populações celulares bioativas associadas. Em certas modalidades, o biomaterial usado de acordo com a presente divulgação é compreendido de ácido hialurônico na forma de espuma porosa, também contendo moléculas de HÁ que variam em tamanho de 5,1 kDA a >2x105 kDa. Em certas modalidades, o hidrogel é derivado de ou contém matriz extracelular retirada dos rins ou qualquer outro tecido ou órgão sem limitação. Em ainda uma outra modalidade, o biomaterial usado de acordo com a presente divulgação é compreendido de uma espuma baseada em ácido polilático (PLA), tendo uma estrutura de célula aberta e tamanho de poro de cerca de 50 mícrons até cerca de 300 mícrons. Biomateriais sensíveis à temperatura
[0227] Os biomateriais descritos no presente documento também podem ser designados ou adaptados para responder a certas condições externas, por exemplo, in vitro ou in vivo. Em certas modalidades, os biomateriais são sensíveis à temperatura (por exemplo, seja in vitro ou in vivo). Em certas modalidades, os biomateriais são adaptados para responder à exposição à degradação enzimática (por exemplo, seja in vitro ou in vivo). A resposta dos biomateriais a condições externas podem ser ajustadas conforme descrito no presente documento. A sensibilidade à temperatura da formulação descrita pode ser variada ao se ajustar a porcentagem de um biomaterial na formulação. Por exemplo, a porcentagem de gelatina em uma solução pode ser ajustada para modular a sensibilidade à temperatura da gelatina na formulação final (por exemplo, líquido, gel, esferas, etc.). Alternativamente, os biomateriais podem ser quimicamente reticulados para prover resistência à degradação enzimática. Por exemplo, um reticulador de carbodiimida pode ser usado para reticular quimicamente as esferas de gelatina provendo assim uma suscetibilidade reduzida a enzimas endógenas.
[0228] Em um aspecto, as formulações descritas no presente documento incorporam biomateriais tendo propriedades que criam um ambiente favorável para o agente ativo, tais como as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células renais bioativas, a serem administradas a um indivíduo. Em certas modalidades, a formulação contém um primeiro biomaterial que provê um ambiente favorável a partir do momento que o agente ativo é formulado com o biomaterial até o ponto de administração ao indivíduo. Em certas modalidades, o ambiente favorável diz respeito às vantagens de ter células bioativas suspensas em um estado substancialmente sólido versus células em um fluido (conforme descrito no presente documento) antes da administração a um indivíduo. Em certas modalidades, o primeiro biomaterial é um biomaterial sensível à temperatura. O biomaterial sensível à temperatura pode ter (i) um estado substancialmente sólido em cerca de 8°C ou abaixo, e (ii) um estado substancialmente líquido em temperatura ambiente ou acima. Em certas modalidades, a temperatura ambiente está cerca da temperatura ambiental.
[0229] Em certas modalidades, o biomaterial é um biomaterial sensível à temperatura que pode manter pelo menos duas fases ou estados diferentes dependendo da temperatura. O biomaterial é capaz de manter um primeiro estado em uma primeira temperatura, um segundo estado em uma segunda temperatura, e/ou um terceiro estado em uma terceira temperatura. O primeiro, segundo ou terceiro estado podem ser um estado substancialmente sólido, substancialmente líquido, ou um estado substancialmente semissólido ou substancialmente semilíquido. Em certas modalidades, o biomaterial tem um primeiro estado em uma primeira temperatura e um segundo estado em uma segunda temperatura, em que a primeira temperatura é menor do que a segunda temperatura.
[0230] Em certas modalidades, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente sólido em uma temperatura de cerca de 8°C ou abaixo. Em certas modalidades, o estado substancialmente sólido é mantido em cerca de 1°C, cerca de 2°C, cerca de 3°C, cerca de 4°C, cerca de 5°C, cerca de 6°C, cerca de 7°C, ou de cerca de 8°C. Em certas modalidades, o estado substancialmente sólido tem a forma de um gel. Em certas modalidades, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente líquido em temperatura ambiente ou acima. Em certas modalidades, o estado substancialmente líquido é mantido em cerca de 25°C, cerca de 25,5°C, cerca de 26°C, cerca de 26,5°C, cerca de 27°C, cerca de 27,5°C, cerca de 28°C, cerca de 28,5°C, cerca de 29°C, cerca de 29,5°C, cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, ou de cerca de 37°C. Em certas modalidades, a temperatura ambiente está cerca da temperatura ambiental.
[0231] Em certas modalidades, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente sólido em uma temperatura de cerca de temperatura ambiente ou abaixo. Em certas modalidades, a temperatura ambiente está cerca da temperatura ambiental. Em certas modalidades, o estado substancialmente sólido é mantido em cerca de 17°C, cerca de 16°C, cerca de 15°C, cerca de 14°C, cerca de 13°C, cerca de 12°C, cerca de 11°C, cerca de 10°C, cerca de 9°C, cerca de 8°C, cerca de 7°C, cerca de 6°C, cerca de 5°C, cerca de 4°C, cerca de 3°C, cerca de 2°C, ou de cerca de 1°C. Em certas modalidades, o estado substancialmente sólido tem a forma de uma esfera. Em certas modalidades, o estado do biomaterial sensível à temperatura é um estado substancialmente líquido em uma temperatura de cerca de 37°C ou acima. Em certas modalidades, o estado substancialmente sólido é mantido em cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, ou de cerca de 40°C.
[0232] Os biomateriais sensíveis à temperatura podem ser providos na forma de uma solução, na forma de um sólido, na forma de esferas, ou em outras formas adequadas descritas no presente documento e/ou conhecidas daqueles versados na técnica. As microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou populações celulares e preparações descritas no presente documento podem ser revestidas com, depositadas sobre, embutidas em, presas a, semeadas, suspensas em ou presas em um biomaterial sensível à temperatura. Em certas modalidades, as populações celulares descritas no presente documento podem ser configuradas como agregados celulares ou organoides tridimensionais ou estruturas tubulares tridimensionais antes da complexação com o biomaterial sensível à temperatura ou podem ser configuradas como a referida complexação com o biomaterial sensível à temperatura. Em certas modalidades, o biomaterial sensível à temperatura pode ser provido sem nenhuma célula, tal como, por exemplo na forma de esferas espaçadoras. Nesta modalidade, o biomaterial sensível à temperatura funciona em um papel puramente passivo para criar espaço dentro do órgão alvo para bioatividade regenerativa, por exemplo, angiogênese ou infiltração e migração das populações celulares hospedeiras.
[0233] Em certas modalidades, o biomaterial sensível à temperatura tem um estado transicional entre um primeiro estado e um segundo estado. Em certas modalidades, o estado transicional é um estado transicional sólido-para-líquido entre uma temperatura de cerca de 8°C e cerca da temperatura ambiente. Em certas modalidades, a temperatura ambiente está cerca da temperatura ambiental. Em certas modalidades, o estado transicional de sólido-para-líquido ocorre em uma ou mais temperaturas de cerca de 8°C, cerca de 9°C, cerca de 10°C, cerca de 11°C, cerca de 12°C, cerca de 13°C, cerca de 14°C, cerca de 15°C, cerca de 16°C, cerca de 17°C, e cerca de 18°C.
[0234] Os biomateriais sensíveis à temperatura têm uma certa viscosidade em uma dada temperatura medida em centipoise (cP). Em certas modalidades, o biomaterial tem uma viscosidade em 25°C de cerca de 1 cP até cerca de 5 cP, cerca de 1,1 cP até cerca de 4,5 cP, cerca de 1,2 cP até cerca de 4 cP, cerca de 1,3 cP até cerca de 3,5 cP, cerca de 1,4 cP até cerca de 3,5 cP, cerca de 1,5 cP até cerca de 3 cP, cerca de 1,55 cP até cerca de 2,5 cP, ou de cerca de 1,6 cP até cerca de 2 cP. Em certas modalidades, o biomaterial tem uma viscosidade em 37°C de cerca de 1,0 cP até cerca de 1,15 cP. A viscosidade em 37°C pode ser de cerca de 1,0 cP, cerca de 1,01 cP, cerca de 1,02 cP, cerca de 1,03 cP, cerca de 1,04 cP, cerca de 1,05 cP, cerca de 1,06 cP, cerca de 1,07 cP, cerca de 1,08 cP, cerca de 1,09 cP, cerca de 1,10 cP, cerca de 1,11 cP, cerca de 1,12 cP, cerca de 1,13 cP, cerca de 1,14 cP, ou de cerca de 1.15 cP. Em certas modalidades, o biomaterial é uma solução de gelatina. A gelatina está presente em cerca de 0,5%, cerca de 0,55%, cerca de 0,6%, cerca de 0,65%, cerca de 0,7%, cerca de 0,75%, cerca de 0,8%, cerca de 0,85%, cerca de 0,9%, cerca de 0,95% ou de cerca de 1%, (p/v) na solução. Em um exemplo, o biomaterial é uma solução de gelatina 0,75% (p/v) em PBS. Em certas modalidades, a solução 0,75% (p/v) tem uma viscosidade em 25°C de cerca de 1,6 cP até cerca de 2 cP. Em certas modalidades, a solução 0,75% (p/v) tem uma viscosidade em 37°C de cerca de 1,07 cP até cerca de 1,08 cP. A solução de gelatina pode ser provida em PBS, DMEM, ou um outro solvente adequado.
[0235] Em um aspecto, a formulação contém as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células bioativas combinadas com um segundo biomaterial que provê um ambiente favorável para as microvesículas combinadas (por exemplo, exossomas) e/ou células a partir do momento da formulação até o ponto de administração ao indivíduo. Em certas modalidades, o ambiente favorável provido pelo segundo biomaterial diz respeito às vantagens de administrar as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células em um biomaterial que retenha a integridade estrutural até o ponto de administração a um indivíduo e por um período de tempo depois da administração. Em certas modalidades, a integridade estrutural do segundo biomaterial em seguida ao implante é de minutos, horas, dias ou semanas. Em certas modalidades, a integridade estrutural é menor do que um mês, menor do que uma semana, menor do que um dia ou menor do que uma hora. A integridade estrutural relativamente curta provê uma formulação que pode liberar o agente ativo e biomaterial a um local alvo em um tecido ou órgão com manuseio controlado, colocação ou dispersão sem ser um impedimento ou barreira à interação dos elementos incorporados com o tecido ou órgão no qual ele foi colocado.
[0236] Em certas modalidades, o segundo biomaterial é um biomaterial sensível à temperatura que tem uma sensibilidade diferente do que o primeiro biomaterial. O segundo biomaterial pode ter (i) um estado substancialmente sólido em cerca da temperatura ambiente ou abaixo, e (ii) um estado substancialmente líquido em cerca de 37°C ou acima. Em certas modalidades, a temperatura ambiente está cerca da temperatura ambiental.
[0237] Em certas modalidades, o segundo biomaterial é de esferas reticuladas. As esferas reticuladas podem ter tempos de residência in vivo ajustáveis dependendo do grau de reticulação, conforme descrito no presente documento. Em certas modalidades, as esferas reticuladas compreendem as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células bioativas e são resistentes à degradação enzimática conforme descrito no presente documento. Em certas modalidades, as formulações da presente divulgação podem incluir o primeiro biomaterial combinado com um agente ativo, por exemplo, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células bioativas, com ou sem um segundo biomaterial combinado com um agente ativo, por exemplo, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células bioativas. Em certas modalidades, onde uma formulação inclui um segundo biomaterial, ele pode ser uma esfera sensível à temperatura e/ou uma esfera reticulada.
[0238] Em um aspecto, a presente divulgação provê formulações que contêm biomateriais que se degradam com um período de tempo na ordem de minutos, horas ou dias. Isto em contraste com um grande corpo de trabalho que foca no implante de materiais sólidos que se degradam lentamente com dias, semanas ou meses. Em certas modalidades, o biomaterial tem uma ou mais das seguintes características: biocompatibilidade, biodegradabilidade/bioabsorvidade, um estado substancialmente sólido antes e durante o implante em um indivíduo, perda da integridade estrutural (estado substancialmente sólido) depois do implante, e ambiente citocompatível para suportar viabilidade celular e a proliferação. A capacidade do biomaterial em manter partículas implantadas de forma espaçada durante o implante aumenta o crescimento de tecido nativo. Em certas modalidades, o biomaterial também facilita o implante de formulações sólidas. Em certas modalidades, o biomaterial provê a localização da formulação descrita no presente documento uma vez que a inserção de uma unidade sólida ajuda a impedir que os materiais liberados se dispersem dentro do tecido durante o implante. Para formulações à base de célula, um biomaterial sólido também melhora a estabilidade e a viabilidade de células dependentes de ancoragem comparado com as células suspensas em um fluido. No entanto, a curta duração da integridade estrutural significa que logo depois do implante, o biomaterial não provê uma barreira significativa ao crescimento de tecido ou integração das células/materiais liberados com o tecido hospedeiro.
[0239] Em um aspecto, a presente divulgação provê formulações que contêm biomateriais que são implantados em uma forma substancialmente sólida e depois se liquefazem/derretem ou de uma outra forma perdem a sua integridade estrutural em seguida ao implante no corpo. Isto é em contraste ao significativo corpo de trabalho que foca no uso de materiais que podem ser injetados como um líquido, que depois se solidificam no corpo. Esferas biocompatíveis
[0240] Em um aspecto, a formulação inclui um biomaterial sensível à temperatura descrito no presente documento e uma população de esferas biocompatíveis contendo um biomaterial. Em certas modalidades, as esferas são reticuladas. A reticulação pode ser alcançada usando qualquer agente reticulador adequado conhecido daqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, carbodiimidas; aldeídos (por exemplo furfural, acroleína, formaldeído, glutaraldeído, gliceril aldeído), reticuladores à base de succinimida {Bis(sulfosuccinimidil) suberato (BS3), Disuccinimidil glutarato (DSG), Disuccinimidil suberato (DSS), Ditiobis(succinimidil propionato), Etileno glicolbis(sulfosuccinimidilsuccinato), Etileno glicolbis(succinimidilsuccinato) (EGS), Bis(Sulfosuccinimidil) glutarato (BS2G), Disuccinimidil tartarato (DST); epóxidos (Etileno glicol diglicidil éter , 1,4 Butanodiol diglicidil éter); sacarídeos (açúcares de glicose e aldose); ácidos sulfônicos e ácido p-toluenossulfônico; carbonildiimidazol; genipin; iminas; cetonas; difenilfosforilazida (DDPA); cloreto de tereftaloíla; nitrato de cério (III) hexaidratado; transglutaminase microbiana; e peróxido de hidrogênio. Aqueles versados na técnica apreciarão outros agentes reticuladores adequados e métodos de reticulação para uso de acordo com a presente divulgação.
[0241] Em certas modalidades, as esferas são esferas reticuladas por carbodiimida. Em certas modalidades, as esferas reticuladas por carbodiimida podem ser reticuladas com uma carbodiimida selecionada a partir do grupo consistindo de cloridrato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC), DCC - N,N'- dicicloexilcarbodiimida (DCC) e N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPC). Espera-se que as esferas tratadas com menor concentração de EDC tenham um maior número de aminas primárias livres, enquanto as amostras tratadas com altas concentrações de reticulador teriam a maioria das aminas primárias ligadas em ligações amida. A intensidade da cor laranja desenvolvida pela ligação covalente entre a amina primária e ácido picrilsulfônico, detectável espectrofotometricamente em 335 nm, é proporcional ao número de aminas primárias presentes na amostra. Quando normalizada por miligrama de proteína presente na amostra, uma correlação inversa entre o número de aminas livres e a concentração inicial de EDC usada para reticulação pode ser observada. Este resultado é indicativo de reticulação de esferas diferencial, ditado pela quantidade de carbodiimida usada na reação. Em geral, as esferas reticuladas exibem um número reduzido de aminas primárias livres quando comparado com as esferas não reticuladas.
[0242] Em certas modalidades, as esferas reticuladas têm uma suscetibilidade reduzida à degradação enzimática quando comparado com esferas biocompatíveis não reticuladas, provendo assim esferas com tempos de residência in vivo ajustáveis. Em certas modalidades, as esferas reticuladas são resistentes a enzimas endógenas, tais como colagenases. Em certas modalidades, a provisão de esferas reticuladas é parte de um sistema de liberação que facilita um ou mais de: (a) liberação de células ligadas aos sítios desejados e criação de espaço para regeneração e crescimento de tecidos nativos e suprimento vascular; (b) capacidade de persistir no sítio tempo suficiente para permitir que as células se estabeleçam, funcionem, remodelem o seu microambiente e secretem a sua própria matriz extracelular (ECM); (c)
promoção de integração das células transplantadas com o tecido circundante; (d) capacidade de implantar células em uma forma substancialmente sólida; (e) integridade estrutural a curto prazo que não provê uma barreira significativa ao crescimento de tecido, angiogênese de novo ou integração de células/materiais liberados com o tecido hospedeiro; (f) liberação localizada in vivo em uma forma substancialmente sólida impedindo assim a dispersão de células dentro do tecido durante o implante; (g) estabilidade e viabilidade de células dependentes de ancoragem melhoradas comparado com células suspensas em um fluido; e (h) perfil de liberação bifásico quando as células são liberadas 1) em uma forma substancialmente sólida (por exemplo, ligada às esferas), e 2) em uma forma substancialmente líquida (por exemplo, suspensa em um fluido); i) recapitulação e mimetismo do nicho biológico tridimensional ou parênquima renal a partir do qual as populações celulares bioativas foram derivadas.
[0243] Em certas modalidades, a presente divulgação provê esferas reticuladas contendo gelatina. Em certas modalidades, as esferas de gelatina não reticuladas não são adequadas para a formulação de células bioativas já que elas perdem rapidamente a sua integridade e as células se dissipam do sítio de injeção. Em certas modalidades, as esferas de gelatina altamente reticuladas podem persistir muito tempo no sítio de injeção e podem impedir a secreção de ECM de-novo, integração celular, angiogênese e regeneração do tecido. A presente divulgação permite que o tempo de residência in vivo das esferas reticuladas seja ajustado. De modo a acertar a biodegradabilidade dos biomateriais, diferentes concentrações de reticulador de carbodiimida são usadas enquanto as condições totais de reação foram mantidas constantes para todas as amostras. Por exemplo, a suscetibilidade enzimática das esferas reticuladas por carbodiimida pode ser ajustada ao se variar a concentração do agente reticulador de cerca de zero até cerca de 1M. Em certas modalidades, a concentração é de cerca de 5 mM, cerca de 6 mM, cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de 11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM, cerca de 25 mM, cerca de 26 mM, cerca de 27 mM, cerca de 28 mM, cerca de 29 mM, cerca de 30 mM, cerca de 31 mM, cerca de 32 mM, cerca de 33 mM, cerca de 34 mM, cerca de 35 mM, cerca de 36 mM, cerca de 37 mM, cerca de 38 mM, cerca de 39 mM, cerca de 40 mM, cerca de 41 mM, cerca de 42 mM, cerca de 43 mM, cerca de 44 mM, cerca de 45 mM, cerca de 46 mM, cerca de 47 mM, cerca de 48 mM, cerca de 49 mM, cerca de 50 mM, cerca de 55 mM, cerca de 60 mM, cerca de 65 mM, cerca de 70 mM, cerca de 75 mM, cerca de 80 mM, cerca de 85 mM, cerca de 90 mM, cerca de 95 mM, ou de cerca de 100 mM. A concentração do reticulador também pode ser de cerca de 0,15 M; cerca de 0,2 M; cerca de 0,25 M; cerca de 0,3 M; cerca de 0,35 M; cerca de 0,4 M; cerca de 0,45 M; cerca de 0,5 M; cerca de 0,55 M; cerca de 0,6 M; cerca de 0,65 M; cerca de 0,7 M; cerca de 0,75 M; cerca de 0,8 M; cerca de 0,85 M; cerca de 0,9 M; cerca de 0,95 M; ou de cerca de 1 M. Em certas modalidades, o agente reticulador é cloridrato de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC). Em certas modalidades, as EDC-esferas reticuladas são esferas de gelatina. A % de degradação das esferas pode ser ajustada dependendo da concentração do agente reticulador. Em certas modalidades, as esferas de gelatina podem ser misturadas com esferas ou micropartículas diferentes da gelatina (por exemplo, sem limitação, alginato ou HA) para adicionalmente facilitar a potência da população celular bioativa sendo liberada.
[0244] As esferas reticuladas podem ter certas características que favorecem a semeadura, a ligação ou encapsulamento das populações celulares bioativas e/ou das microvesículas (por exemplo, exossomas). Por exemplo, as esferas podem ter uma superfície porosa e/ou podem ser substancialmente ocas. Em certas modalidades, a presença de poros provê uma superfície de ligação celular aumentada permitindo que um número maior de células se ligue quando comparado com uma superfície não porosa ou lisa. Além disso, a estrutura do poro pode suportar a integração do tecido hospedeiro com as esferas porosas suportando a formação do tecido de novo. Em certas modalidades, as esferas têm uma distribuição de tamanho que pode ser ajustada a um gráfico Weibull correspondendo ao padrão de distribuição de partículas em geral. Em certas modalidades, as esferas reticuladas têm um diâmetro médio de menos de cerca de 120 μm, cerca de 115 μm, cerca de 110 μm, cerca de 109 μm, cerca de 108 μm, cerca de 107 μm, cerca de 106 μm, cerca de 105 μm, cerca de 104 μm, cerca de 103 μm, cerca de 102 μm, cerca de 101 μm, cerca de 100 μm, cerca de 99 μm, cerca de 98 μm, cerca de 97 μm, cerca de 96 μm, cerca de 95 μm, cerca de 94 μm, cerca de 93 μm, cerca de 92 μm, cerca de 91 μm, ou de cerca de 90 μm. Em certas modalidades, as características das esferas reticuladas variam dependendo do processo de moldagem. Em certas modalidades, um processo no qual uma corrente de ar é usada para aerossolizar uma solução de gelatina líquida e pulverizá-la em nitrogênio líquido com um pulverizador do reagente de cromatografia em camada fina (ACE Glassware) é usado para prover esferas tendo as características mencionadas acima. Aqueles versados na técnica apreciarão que modular os parâmetros do processo de moldagem provê a oportunidade de ajustar diferentes características das esferas, por exemplo, diferentes distribuições de tamanho. Em certas modalidades, a microtopografia, superfície e características internas das esferas podem ser adicionalmente modificadas para facilitar a ligação celular.
[0245] Em certas modalidades, a citocompatibilidade das esferas reticuladas é avaliada in vitro antes da formulação usando técnicas de cultura celular nas quais as esferas são cultivadas com células que correspondem à formulação celular bioativa final. Em certas modalidades, as esferas são cultivadas com células renais primárias antes da preparação da formulação da célula renal bioativa e ensaios de células vivas/mortas são usados para confirmar a citocompatibilidade. Além da viabilidade celular, testes funcionais específicos para medir a atividade metabólica celular, secreção de certas citoquinas chave e fatores de crescimento e exossomas e a expressão de certos marcadores de proteína e ácido nucleico chave incluindo miRNAs associados com a população de células renais funcionalmente bioativas são bem conhecidos daqueles versados na técnica e são adicionalmente usados para confirmar a potência celular mediante a formulação com esferas reticuladas.
[0246] Em certas formulações, as esferas reticuladas biocompatíveis são combinadas com um biomaterial sensível à temperatura em solução em cerca de 5% (p/p) até cerca de 15% (p/p) do volume da solução. As esferas reticuladas podem estar presentes em cerca de 5% (p/p), cerca de 5,5% (p/p), cerca de 6% (p/p), cerca de 6,5% (p/p), cerca de 7% (p/p), cerca de 7,5% (p/p), cerca de 8% (p/p), cerca de 8,5% (p/p), cerca de 9% (p/p), cerca de 9,5% (p/p), cerca de 10% (p/p), cerca de 10,5% (p/p), cerca de 11% (p/p), cerca de 11,5% (p/p), cerca de 12% (p/p), cerca de 12,5% (p/p), cerca de 13% (p/p), cerca de 13,5% (p/p), cerca de 14% (p/p), cerca de 14,5% (p/p), ou de cerca de 15% (p/p) do volume da solução.
[0247] Em um aspecto, a presente divulgação provê formulações que contêm biomateriais que se degradam por um período de tempo na ordem de minutos, horas ou dias. Isto é em contraste com um grande corpo de trabalho que foca no implante de materiais sólidos que lentamente se degradam por dias, semanas ou meses.
[0248] Em um aspecto, a presente divulgação provê formulações tendo esferas reticuladas biocompatíveis semeadas com células bioativas junto com a matriz de liberação.
Em certas modalidades, a matriz de liberação tem uma ou mais das seguintes características: biocompatibilidade, biodegradabilidade/bioabsorbilidade, um estado substancialmente sólido antes e durante o implante em um indivíduo, perda de integridade estrutural (estado substancialmente sólido) depois do implante, e um ambiente citocompatível para suportar a viabilidade celular.
Em certas modalidades, a capacidade da matriz de liberação em manter partículas implantadas (por exemplo, esferas reticuladas) espaçadas durante o implante aumenta o crescimento de tecido nativo.
Em certas modalidades, se a matriz de liberação está ausente, então a compactação de esferas celularizadas durante o implante pode levar ao espaço inadequado para crescimento suficiente de tecido.
Em certas modalidades, a matriz de liberação facilita o implante de formulações sólidas.
Em certas modalidades, a curta duração da integridade estrutural que logo depois do implante, a matriz não provê uma barreira significativa para o crescimento de tecido, angiogênese de novo ou integração das células/materiais liberados com o tecido hospedeiro.
Em certas modalidades, a matriz de liberação provê a localização da formulação descrita no presente documento uma vez que a inserção de um sólido ajuda a prevenir que os materiais liberados se dispersem dentro do tecido durante o implante.
Em certas modalidades, a aplicação de uma matriz de liberação conforme descrito no presente documento ajuda a prevenir a rápida perda de células implantadas através da urinação mediante a liberação ao parênquima renal.
Em certas modalidades, para as formulações baseadas em células, uma matriz de liberação sólida melhora a estabilidade e a viabilidade de células dependentes de ancoragem comparado com as células suspensas em um fluido.
[0249] Em certas modalidades, a matriz de liberação é uma população de esferas biocompatíveis que não é semeada com células. Em certas modalidades, as esferas não semeadas são dispersadas ao longo de e no meio das esferas semeadas em células individuais. Em certas modalidades, as esferas não semeadas agem com “esferas espaçadoras” entre as esferas semeadas em células antes e imediatamente depois do transplante. Em certas modalidades, as esferas espaçadoras contêm um biomaterial sensível à temperatura tendo a estado substancialmente sólido em uma primeira temperatura e um estado substancialmente líquido em uma segunda temperatura, em que a primeira temperatura é menor do que a segunda temperatura. Por exemplo, as esferas espaçadoras contêm um biomaterial tendo um estado substancialmente sólido em cerca da temperatura ambiente ou abaixo e um estado substancialmente líquido em cerca de 37°C, tal como aquele descrito no presente documento. Em certas modalidades, a temperatura ambiente está cerca da temperatura ambiental. Em certas modalidades, o biomaterial é uma solução de gelatina. Em certas modalidades, a solução de gelatina está presente em cerca de 4%, cerca de 4,5%, cerca de 5%, cerca de 5,5%, cerca de 6%, cerca de 6,5%, cerca de 7%, cerca de 7,5%, cerca de 8%, cerca de 8,5%, cerca de 9%, cerca de 9,5%, cerca de 10%, cerca de 10,5%, ou de cerca de 11%, (p/v). Em certas modalidades, a solução de gelatina pode ser provida em PBS, meio de cultura celular (por exemplo, DMEM), ou um outro solvente adequado. Em certas modalidades, o biomaterial é ácido hialurônico. Em certas modalidades, o biomaterial é matriz extracelular descelularizada retirada do rim humano ou animal que pode ser adicionalmente reconstituído como um hidrogel.
[0250] Em um aspecto, a presente divulgação provê formulações que contêm biomateriais que são implantados em uma forma substancialmente sólida (por exemplo, esferas espaçadoras) e depois liquefazer/derreter ou de outra forma perder a integridade estrutural em seguida ao implante no corpo. Isto é em contraste com o corpo de trabalho significativo que foca no uso de materiais que podem ser injetados como um líquido, os quais depois se solidificam no corpo.
[0251] A sensibilidade à temperatura das esferas espaçadoras pode ser avaliada in vitro antes da formulação. Por exemplo, em certas modalidades, as esferas espaçadoras podem ser marcadas e misturadas com esferas não marcadas não sensíveis à temperatura. A mistura é então incubada a 37°C para observar mudanças na transição física. A perda de formato das esferas marcadas sensíveis à temperatura na maior temperatura é observada com o tempo. Por exemplo, as esferas de gelatina sensíveis à temperatura podem ser feitas com corante azul de alcian para servir como um marcador de transição física. As esferas de gelatina azuis são misturadas com esferas reticuladas (brancas), carregadas em um cateter, depois extrusadas e incubadas em 1X PBS, pH 7.4, em 37C. A perda de formato das esferas de gelatina azuis é seguida microscopicamente em diferentes momentos. As mudanças no estado físico das esferas de gelatina azuis são visíveis depois de 30 min se tornando mais pronunciado com os tempos de incubação prolongados. As esferas não se dissipam completamente devido à viscosidade do material. Formulações de liberação modificada
[0252] Em um aspecto, as formulações da presente divulgação são providas como formulações de liberação modificada. Em geral, a liberação modificada é caracterizada por uma liberação inicial de um primeiro agente ativo mediante a administração seguida por pelo menos uma liberação adicional, subsequente de um segundo agente ativo. O primeiro e o segundo agentes ativos podem ser os mesmos ou eles podem ser diferentes. Em certas modalidades, as formulações proveem liberação modificada através de múltiplos componentes na mesma formulação. Em certas modalidades, a formulação de liberação modificada contém um agente ativo como parte de um primeiro componente que permite que o agente ativo se mova livremente ao longo do volume da formulação, permitindo assim a liberação imediata no sítio alvo mediante a administração. O primeiro componente pode ser um biomaterial sensível à temperatura tendo uma fase substancialmente líquida e uma fase substancialmente sólida, em que o primeiro componente está em uma fase substancialmente líquida no momento da administração. Em certas modalidades, o agente ativo está na fase substancialmente líquida de forma que ele esteja substancialmente livre para se mover ao longo do volume da formulação, e deste modo seja imediatamente liberado no sítio alvo mediante a administração.
[0253] Em certas modalidades, a formulação de liberação modificada tem um agente ativo como parte de um segundo componente no qual o agente ativo é ligado a, depositado sobre, revestido com, embutido em, semeado ou preso no segundo componente, que persiste antes e depois da administração ao sítio alvo. O segundo componente contém elementos estruturais com os quais o agente ativo é capaz de se associar com, prevenindo assim a liberação imediata do agente ativo a partir do segundo componente no momento da administração. Por exemplo, o segundo componente é provido em uma forma substancialmente sólida, por exemplo, esferas biocompatíveis, que podem ser reticuladas para prevenir ou retardar a degradação enzimática in vivo. Em certas modalidades, o agente ativo na fase substancialmente sólida retém a sua integridade estrutural dentro da formulação antes e depois da administração e deste modo ele não libera imediatamente o agente ativo no sítio alvo mediante a administração. Os veículos adequados para as formulações de liberação modificada foram descritos no presente documento porém aqueles versados na técnica apreciarão outros veículos que são apropriados para uso na presente divulgação.
[0254] Em certas modalidades, a formulação provê uma entrega/liberação inicial rápida de elementos liberados, incluindo células, como microvesículas (por exemplo, exossomas), nanopartículas, moléculas terapêuticas, etc, seguido por uma posterior liberação retardada de elementos. Em certas modalidades, a formulação provê uma entrega/liberação inicial rápida das microvesículas (por exemplo, exossomas), miRNA e outras moléculas de ácido nucleico ou proteína bioativas que são solúveis e são secretadas, produtos bioativos retirados de populações renais ou outras populações celulares. Outras moléculas ou agentes terapêuticos associados com bioatividade regenerativa serão apreciadas por aqueles versados na técnica. As formulações da presente divulgação podem ser designadas para o referido perfil de liberação bifásico onde o agente a ser liberado é provido tanto na forma não ligada (por exemplo, microvesículas e/ou células em uma solução) e uma forma ligada (por exemplo, microvesículas e/ou células junto com esferas ou um outro veículo adequado). Mediante a administração inicial, o agente desimpedido é provido imediatamente no sítio de liberação enquanto a liberação do agente impedido é retardada até que a integridade estrutural do veículo (por exemplo, esferas) falhe em cujo ponto o agente anteriormente ligado seja liberado. Conforme discutido abaixo, outros mecanismos adequados de liberação serão apreciados por aqueles versados na técnica.
[0255] Em certas modalidades, o intervalo de tempo para a liberação pode ser ajustado com base na natureza do agente ativo. Por exemplo, o intervalo de tempo para a liberação em uma microvesícula (por exemplo, exossoma) e/ou formulação de células bioativas podem ser na ordem de segundos, minutos, horas ou dias. Em certas modalidades, um intervalo na ordem de semanas pode ser apropriado. Em certas modalidades, para outros agentes ativos, tais como moléculas pequenas ou grandes, o intervalo de tempo para a liberação em uma formulação pode ser na ordem de segundos, minutos, horas, dias, semanas ou meses. Também é possível para a formulação conter diferentes biomateriais que provejam diferentes perfis de liberação em intervalos de tempo. Por exemplo, um primeiro biomaterial com um primeiro agente ativo podem ter um primeiro tempo de liberação e um segundo biomaterial com um segundo agente ativo podem ter um segundo tempo de liberação. O primeiro e segundo agente ativo podem ser os mesmos ou diferentes.
[0256] Em certas modalidades, o período de tempo de liberação retardada pode em geral corresponder ao período de tempo para a perda da integridade estrutural de um biomaterial. No entanto, aqueles versados na técnica apreciarão outros mecanismos de liberação retardada. Por exemplo, um agente ativo pode ser continuamente liberado com o tempo independente do tempo de degradação de algum biomaterial específico, por exemplo, difusão de um fármaco a partir de uma matriz polimérica. Além disso, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células bioativas podem migrar a partir de uma formulação contendo um biomaterial e as células bioativas para o tecido nativo. Em certas modalidades, as células bioativas migram de um biomaterial, por exemplo, uma esfera, para o tecido nativo. Em certas modalidades, as células bioativas migram de um biomaterial para o tecido nativo e induzem a secreção de fatores de crescimento, citoquinas, exossomas, miRNA e outros ácidos nucleicos e proteínas associados com a bioatividade regenerativa. Em certas modalidades, as exossomas e outras microvesículas extracelulares, assim como miRNA, outros ácidos nucleicos e proteínas bioativas migram de um biomaterial. Em certas modalidades, as células bioativas migram de um biomaterial para o tecido nativo e mediam a mobilização das células-tronco do hospedeiro e células progenitoras que depois migram ou se autodirecionam ao local de lesão ou doença.
[0257] Em certas modalidades, os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. A absorção prolongada de formulações injetáveis pode ser provocada pela inclusão em uma formulação de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Muitos métodos para a preparação das referidas formulações são patenteados ou geralmente conhecidos daqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Sustained and controlled delivery of a drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Os métodos adicionais aplicáveis para a liberação controlada ou estendida de agentes polipeptídicos são descritos, por exemplo, em Patentes Norte- americanas Nos. 6,306,406 e 6,346,274, assim como, por exemplo, nos Pedidos de Patente Norte-americanos Nos. US20020182254 e US20020051808, todos os quais são incorporados no presente documento a título de referência. Formulações celulares bioativas exemplificadoras
[0258] Em certas modalidades, as vesículas (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) são providas no presente documento incluídas em uma formulação celular bioativa. Alternativamente ou além disso, as vesículas podem ser administradas antes, de forma concomitante com ou depois de uma formulação celular bioativa.
[0259] Em certas modalidades, as formulações descritas no presente documento contêm construtos implantáveis feitos dos biomateriais referidos acima tendo células renais bioativas descritas no presente documento para o tratamento de doença renal em um indivíduo que necessita. Em certas modalidades, as formulações celulares bioativas providas no presente documento adicionalmente compreendem vesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas secretadas por células renais bioativas).
[0260] Em certas modalidades, o construto é feito de um material biocompatível ou biomaterial, estrutura ou matriz composto de um ou mais materiais biocompatíveis sintéticos ou de ocorrência natural e uma ou mais populações celulares ou microvesículas (por exemplo, exossomas) descritas no presente documento depositadas em ou embutidas em uma superfície da estrutura através de ligação e/ou aprisionamento. Em certas modalidades, o construto é feito de um biomaterial e uma ou mais populações celulares ou produtos dos mesmos (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) descritas no presente documento revestidas com, depositadas sobre, depositadas em, ligadas a, presas em, embutidas em, semeadas ou combinadas com o(s) componente(s) biomaterial(ais). Qualquer uma das microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou populações celulares descritas no presente documento podem ser usadas em combinação com uma matriz para formar um construto.
[0261] Em certas modalidades, a formulação de células bioativas é um produto injetável composto de SRCs geneticamente modificadas para reduzir a imunogenicidade e formuladas em um biomaterial (por exemplo, hidrogel à base de gelatina). Em um aspecto, SRCs alogeneicas são obtidas a partir do isolamento e expansão de células renais a partir de um tecido cortical renal de um paciente doador através de uma biopsia renal, modificação genética da SRC usando técnicas de edição genética e seleção através da centrifugação do gradiente de densidade a partir das células renais expandidas. Em certas modalidades, as SRCs são compostas primariamente de células epiteliais renais que são bem conhecidas pelo seu potencial regenerativo (Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91). Em certas modalidades, outras células parenquimais (vasculares) e estromais (dutos coletores) podem estar escassamente presentes na população de SRC. A injeção de SRC nos rins do recipiente resultaram na melhora significativa na sobrevivência animal, concentração da urina e funções de filtração em estudos não clínicos. No entanto, SRC tem meia-vida e estabilidade limitadas. A formulação de SRC em um biomaterial de hidrogel à base de gelatina provê estabilidade aumentada das células, estendendo assim a meia-vida do produto, estabilidade melhorada durante o transporte e liberação no córtex renal para utilidade clínica.
[0262] Em um aspecto, as formulações celulares bioativas são fabricadas ao primeiro se obter tecido cortical renal do doador usando um procedimento de biopsia renal padrão de cuidado clínico. As células renais são isoladas a partir do tecido renal por digestão enzimática e expandidas usando técnicas de cultura celular padrão. O meio de cultura celular é designado para expandir as células renais primárias e não contêm qualquer fator de diferenciação. As células renais coletadas são submetidas à separação do gradiente de densidade para obter SRC. O uso de técnicas de edição genética para modificar a imunogenicidade da SRC pode ser realizado tanto antes quanto depois da separação do gradiente de densidade.
[0263] Em certas modalidades, a população celular formulada e/ou as microvesículas (por exemplo, exossomas) são substancialmente livres para se moverem ao longo do volume do biomaterial em cerca da temperatura ambiente ou acima. Ter a população celular suspensa na fase substancialmente sólida em uma temperatura inferior provê vantagens de estabilidade para as células, tais como para células dependentes de ancoragem, conforme comparado com as células em um fluido. Além do mais, ter as microvesículas (por exemplo,
exossomas) e/ou células suspensas no estado substancialmente sólido provê um ou mais dos seguintes benefícios: i) previne o assentamento das microvesículas e/ou células, ii) permite que as células permaneçam ancoradas ao biomaterial em um estado suspenso; iii) permite que as microvesículas e/ou células permaneçam mais uniformemente dispersas ao longo do volume do biomaterial; iv) previne a formação de microvesícula e/ou agregados celulares; e v) provê melhor proteção para as microvesículas e/ou células durante o armazenamento e transporte da formulação. Uma formulação que pode reter as referidas características levando à administração a um indivíduo é vantajosa pelo menos devido que a saúde global das células em uma formulação será melhor e uma dosagem mais uniforme e consistente de células será administrada.
[0264] Em certas modalidades, o biomaterial de hidrogel à base de gelatina usado para formular SRC é uma gelatina de porcinos dissolvida em tampão para formar um hidrogel termicamente responsivo. Em certas modalidades, este hidrogel é fluido em temperatura ambiente, mas gelatiniza quando resfriado até a temperatura refrigerada (2-8ºC). Em certas modalidades, as SRCs são formuladas com o hidrogel, gelatinizadas com o resfriamento e enviadas para a clínica sob temperatura refrigerada (2-8ºC). Em certas modalidades, no sítio clínico, o produto é aquecido até a temperatura ambiente antes de injetá-lo nos rins do paciente. Em certas modalidades, a formulação de células bioativas (por exemplo, suplementada com as microvesículas, tais como exossomas, a partir de células renais bioativas) é implantada no córtex renal usando uma agulha e seringa adequadas para a liberação através de um procedimento percutâneo ou laparoscópico. Descrição e composição da composição de aumento neo-renal exemplificadora
[0265] Em certas modalidades, a formulação de células bioativas é um aumento neo-renal (NKA), que é um produto injetável composto de células renais autólogas selecionadas (SRC) formuladas em um biomaterial (hidrogel à base de gelatina). Em certas modalidades, o NKA é aumentado ou suplementado com vesículas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas secretadas por células renais bioativas).
[0266] Em um aspecto, as SRCs autólogas são obtidas a partir do isolamento e expansão de células renais a partir do tecido cortical renal do paciente através de uma biopsia renal e seleção por centrifugação das células renais expandidas através de um limite de densidade, barreira ou interface. Em certas modalidades, as SRCs autólogas são obtidas a partir do isolamento e expansão de células renais a partir do tecido cortical renal do paciente através de uma biopsia renal e a seleção das células renais expandidas durante um gradiente de densidade de etapa única ou múltiplas etapas contínuo ou descontínuo. As SRCs são compostas primariamente de células epiteliais tubulares renais que são bem conhecidas pelo seu potencial regenerativo (Humphreys et al. (2008) Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2(3):284-91). Outras células parenquimais (vasculares) e estromais podem estar escassamente presentes na população autóloga de SRC.
[0267] Em certas modalidades, NKA é suplementado com as microvesículas (por exemplo, exossomas) produzidas e isoladas a partir de uma população de SRC.
[0268] A injeção de SRC nos rins do recipiente resultou na melhora significativa na sobrevivência animal, concentração da urina e funções de filtração em estudos pré-clínicos. No entanto, SRC limitou a meia- vida e estabilidade. A formulação de SRC em um biomaterial de hidrogel à base de gelatina provê estabilidade aumentada das células, estendendo assim a meia-vida do produto, estabilidade melhorada de
NKA durante o transporte e liberação de NKA no córtex renal para utilidade clínica.
[0269] Em um aspecto, NKA é fabricado ao primeiro se obter tecido cortical renal do doador/recipiente usando um procedimento de biopsia renal padrão de cuidado clínico. Em certas modalidades, as células renais são isoladas a partir do tecido renal através de digestão enzimática e expandidas usando técnicas de cultura celular padrão. Em certas modalidades, um meio de cultura celular é designado para expandir as células renais primárias e não conter nenhum fator de diferenciação. Em certas modalidades, as células renais coletadas são submetidas à separação através de um limite de densidade ou interface ou gradiente de densidade para obter SRCs. Em certas modalidades, as SRCs são geneticamente modificadas de acordo com a presente divulgação.
[0270] Está incluída no presente documento uma formulação feita de biomateriais designados ou adaptados para responder a condições externas conforme descrito no presente documento. Como um resultado, a natureza da associação da população celular bioativa e outros agentes ativos tais como as microvesículas (por exemplo, exossomas) com o biomaterial em um construto modificarão dependendo das condições externas. Por exemplo, uma associação da população celular com um biomaterial sensível à temperatura varia com a temperatura. Em certas modalidades, o construto contém uma população de células renais bioativas e biomaterial tendo um estado substancialmente sólido em cerca de 8°C ou menos e um estado substancialmente líquido em cerca de temperatura ambiente ou acima, em que a população celular é suspensa no biomaterial em cerca de 8°C ou menos. No entanto, a população celular é substancialmente livre para se mover ao longo do volume do biomaterial em cerca de temperatura ambiente ou acima. Ter a população celular suspensa na fase substancialmente sólida em uma temperatura inferior provê vantagens da estabilidade para as células, tais como para as células dependentes de ancoragem, quando comparado com as células em um fluido. Além do mais, ter as microvesículas (por exemplo, exossomas) e as células suspensas no estado substancialmente sólido provê um ou mais dos seguintes benefícios: i) previne o assentamento das microvesículas e células, ii) permite que as células permaneçam ancoradas ao biomaterial em um estado suspenso; iii) permite que as microvesículas e células permaneçam mais uniformemente dispersadas ao longo do volume do biomaterial; iv) previne a formação de microvesícula ou agregados celulares; e v) provê melhor proteção para as microvesículas e células durante o armazenamento e transporte da formulação. Em certas modalidades, uma formulação que pode reter as referidas características levando à administração a um indivíduo é vantajosa ao menos porque a saúde global das células em uma formulação será melhor e uma dosagem mais uniforme e consistente de células será administrada.
[0271] Em certas modalidades, o biomaterial de hidrogel à base de gelatina usado para formular SRC em NKA é uma gelatina de porcino dissolvida em tampão para formar um hidrogel termicamente responsivo. Este hidrogel é fluido em temperatura ambiente, porém gelatiniza quando resfriado até temperatura refrigerada (2-8ºC). As SRCs são formuladas com o hidrogel para obter NKA. NKA é gelatinizado através de resfriamento e é enviado para a clínica sob temperatura refrigerada (2-8ºC). NKA tem uma meia-vida de 3 dias. No sítio clínico, o produto é aquecido até a temperatura ambiente antes de injetá-lo nos rins do paciente. NKA é implantado no córtex renal usando uma agulha e seringa adequadas para a liberação de NKA através de um procedimento percutâneo ou laparoscópico. Em certas modalidades, o hidrogel é derivado de gelatina ou uma outra proteína de matriz extracelular de origem recombinante. Em certas modalidades, o hidrogel é derivado da matriz extracelular retirada dos rins ou um outro tecido ou órgão. Em certas modalidades, o hidrogel é derivado de uma proteína de matriz extracelular recombinante. Em certas modalidades, o hidrogel compreende gelatina derivada do colágeno recombinante (isto é, gelatina recombinante). Agentes de viabilidade celular
[0272] Em um aspecto, a formulação de células bioativas também inclui um agente de viabilidade celular. Em certas modalidades, as vesículas providas no presente documento compreendem agentes de viabilidade celular. Em certas modalidades, o agente de viabilidade celular é selecionado a partir do grupo consistindo de um antioxidante, um transportador de oxigênio, um fator imunomodulador, um fator de recrutamento celular, um fator de ligação celular, um agente anti- inflamatório, um fator angiogênico, uma metaloprotease de matriz, um fator de cicatrização de feridas, e produtos secretados a partir de células bioativas.
[0273] Em um aspecto, uma microvesícula (tal como um exossoma) compreende (por exemplo, dentro do lúmen do mesmo, na bicamada lipídica do mesmo, ou na superfície da mesma) um agente de viabilidade celular. Em certas modalidades, a microvesícula foi secretada por células que foram cultivadas na presença do agente de viabilidade celular.
[0274] Em certas modalidades, o agente de viabilidade celular é selecionado a partir do grupo consistindo de um antioxidante, um transportador de oxigênio, um fator imunomodulador, um fator de recrutamento celular, um fator de ligação celular, um agente anti- inflamatório, um fator angiogênico, uma metaloprotease de matriz, um fator de cicatri-zação de feridas, e produtos secretados a partir de células bioativas.
[0275] Os antioxidantes são caracterizados pela capacidade de inibir a oxidação de outras moléculas. Os antioxidantes incluem, sem limitação, um ou mais de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico (Trolox®), carotenoides, flavonoides, isoflavonas, ubiquinona, glutationa, ácido lipoico, superóxido dismutase, ácido ascórbico, vitamina E, vitamina A, carotenoides mistos (por exemplo, beta caroteno, alfa caroteno, gama caroteno, luteína, licopeno, fitopeno, fitoflueno e astaxantina), selênio, Coenzima Q10, indol-3-carbinol, proantocianidinas, resveratrol, quercetina, catequinas, ácido salicílico, curcumina, bilirrubina, ácido oxálico, ácido fítico, ácido lipoico, ácido vanílico, polifenois, ácido ferúlico, teaflavinas e derivados dos mesmos. Aqueles versados na técnica apreciarão que outros antioxidantes adequados podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0276] Os transportadores de oxigênio são agentes caracterizados pela capacidade de carregar e liberar oxigênio. Eles incluem, sem limitação, perfluorocarbonos e farmacêuticos contendo perfluorocarbonos. Os transportadores de oxigênio baseados em perfluorocarbono adequados incluem, sem limitação, brometo de perfluorooctila (C8F17Br); perfluorodicorotano (C8F16C12); brometo de perfluorodecila; perfluobron; perfluorodecalina; perfluorotripopilamina; perfluorometilciclopiperidina; Fluosol® (perfluorodecalina & perfluorotripopilamina); Perftoran® (perfluorodecalina & perfluorometilciclopiperidina); Oxygent® (brometo de perfluorodecila & perfluobron); Ocycyte™ (perfluoro (terc-butilcicloexano)). Aqueles versados na técnica apreciarão que outros transportadores de oxigênio baseados em perfluorocarbono adequados podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0277] Os fatores imunomoduladores incluem, sem limitação, osteopontina, fatores ligantes FAS, interleucinas, fator beta do crescimento transformador, fator de crescimento derivado de plaquetas, clusterina, transferrina, proteína secretada, expressada por célula T normal, regulada mediante ação (RANTES), inibidor 1 ativador de plasminogênio (Pai-1), fator alfa de necrose tumoral (TNF-alpha), interleucina 6 (IL-6), alfa-1 microglobulina e beta-2-microglobulina. Aqueles versados na técnica apreciarão que outros fatores imunomoduladores adequados podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0278] Os agentes anti-inflamatórios ou agentes imunossupressores (descritos abaixo) também podem fazer parte da formulação. Aqueles versados na técnica apreciarão que outros antioxidantes adequados podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0279] Os fatores de recrutamento celular incluem, sem limitação, proteína 1 quimiotática de monócito (MCP-1) e CXCL-1. Aqueles versados na técnica apreciarão que outros fatores de recrutamento celular adequados podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0280] Os fatores de ligação celular incluem, sem limitação, fibronectina, procolágeno, colágeno, ICAM-1, fator de crescimento do tecido conectivo, lamininas, proteoglicanas, peptídeos de adesão celular específicos tais como RGD e YSIGR. Aqueles versados na técnica apreciarão que outros fatores de ligação celular podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0281] Os fatores angiogênicos incluem, sem limitação, fator F de crescimento endotelial vascular (VEGF) e angiopoietina-2 (ANG-2). Aqueles versados na técnica apreciarão que outros fatores angiogênicos adequados podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0282] As metaloproteases de matriz incluem, sem limitação,
metaloprotease de matriz 1 (MMP1), metaloprotease de matriz 2 (MMP2), metaloprotease de matriz 9 (MMP-9), e inibidor de tecido e mataloproteases - 1 (TIMP-1).
[0283] Os fatores de cicatrização de feridas incluem, sem limitação, fator 1 de crescimento de queratinócito (KGF-1), ativador do plasminogênio de tecido (tPA), calbindina, clusterina, cistatina C, fator trefoil 3. Aqueles versados na técnica apreciarão que outros fatores de cicatrização de feridas podem ser usados em certas modalidades da presente divulgação.
[0284] Os produtos secretados de células bioativas descritos no presente documento também podem ser adicionados à formulação de células bioativas como um agente de viabilidade celular.
[0285] As composições retiradas de fluidos corporais, tecido ou órgãos de fontes humanas ou animais, incluindo, sem limitação, plasma humano, lisado da plaqueta humana, plasma fetal bovino ou extrato pituitário bovino, também podem ser adicionados às formulações celulares bioativas como um agente de viabilidade celular.
[0286] Aqueles versados na técnica apreciarão que existem vários métodos adequados para depositar ou de outra forma combinar populações celulares com biomateriais para formar um construto.
[0287] Em certas modalidades, as BRCs (tais como SRCs) cultivadas em meio compreendendo um agente de viabilidade celular produzem vesículas que compreendem o agente de viabilidade celular. Métodos de uso
[0288] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo. Em certas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de vesículas de células renais secretadas isoladas (por exemplo, microvesículas tais como exossomas). Em certas modalidades, as vesículas compreendem um composto que não é produzido pelas células que criaram as vesículas. Em certas modalidades, as vesículas estão dentro de uma composição ou formulação divulgadas no presente documento.
[0289] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo. Em certas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de vesículas a partir de uma preparação de vesículas, em que uma vesícula a partir da preparação de vesículas foi identificada como regenerativa de acordo com um método divulgado no presente documento.
[0290] Em um aspecto, é provido no presente documento um método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo. Em certas modalidades, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma população de células renais bioativas suplementada com vesículas de células renais que não foram secretadas pela população de células renais bioativas.
[0291] Em certas modalidades, a composição é administrada por injeção intravenosa. Em certas modalidades, a composição é administrada por liberação em transcateter. Em certas modalidades, as vesículas são injetadas de forma intravenosa em um vaso periférico. Em certas modalidades, a liberação em transcateter é na artéria renal esquerda ou artéria renal direita do indivíduo.
[0292] Em certas modalidades, o indivíduo tem doença renal crônica. Em certas modalidades, a doença renal crônica está no estágio I, II, III, IV ou V da doença renal.
[0293] Em certas modalidades, tratar a doença renal compreende reduzir ou prevenir a fibrose renal no indivíduo.
[0294] Em certas modalidades, o indivíduo recebeu diálise pelo menos 1, 2 ou 3 vezes por semana por pelo menos 1 ou 2 semanas.
[0295] Em certas modalidades, o indivíduo tem diabetes do tipo II.
[0296] Em certas modalidades, o indivíduo tem anomalias congênitas dos rins e do trato urinário (CAKUT).
[0297] Em certas modalidades, o indivíduo tem uma taxa de filtração glomerular (GFR) de menos do que 90 mL/min/1,73 m 2, microalbuminúria ou macroalbuminúria.
[0298] Em certas modalidades, as células não são administradas ao indivíduo. Em certas modalidades, as células (por exemplo, BRCs tais como SRCs) são administradas ao indivíduo. Em certas modalidades, as vesículas são administradas separadamente das células. Em certas modalidades, as vesículas são administradas antes, de forma concomitante com, ou depois das células. Em certas modalidades, as vesículas isoladas são administradas em uma composição que ainda compreende células (por exemplo, células diferentes das células a partir das quais as vesículas foram isoladas). Em certas modalidades, as vesículas de célula renal foram secretadas por uma população de células renais bioativas que têm a mesma origem e/ou contêm os mesmos tipos celulares que a população de células renais bioativas na composição.
[0299] Em certas modalidades, as vesículas foram produzidas por uma população de BRC. Em certas modalidades, a população de BRC é uma população de SRC.
[0300] Em certas modalidades, as vesículas secretadas por células renais primárias são administradas ao indivíduo. Em certas modalidades, as vesículas secretadas por células renais primárias e vesículas secretadas por SRCs são administradas ao indivíduo.
[0301] Em certas modalidades, as vesículas secretadas por células endoteliais ou células-tronco mesenquimais são também administradas ao indivíduo.
[0302] Em certas modalidades, uma vesícula de célula não renal é também administrada ao indivíduo. Em certas modalidades, a vesícula de célula não renal foi secretada por uma célula progenitora endotelial não renal, uma célula-tronco mesenquimal não renal ou uma progenitora derivada de adipose não renal.
[0303] Em certas modalidades, uma quantidade eficaz de vesículas é uma quantidade que é eficaz na ausência de administração de células renais bioativas (por exemplo, uma quantidade que é suficiente para tratamento sem a administração de células renais bioativas). Em certas modalidades, uma quantidade eficaz de células renais bioativas é uma quantidade que é eficaz na ausência da administração de vesículas (por exemplo, uma quantidade que é suficiente para tratamento sem a administração de vesículas). Em certas modalidades, uma quantidade eficaz das vesículas é uma quantidade que é menor do que seria eficaz sem a coadministração de células renais bioativas. Em certas modalidades, uma quantidade eficaz das células renais bioativas é uma quantidade que é menor do que seria eficaz sem a coadministração de vesículas.
[0304] As microvesículas (por exemplo, exossomas), células e formulações da presente invenção são adequadas para uso nos métodos de uso descritos no presente documento. Em certas modalidades, as formulações da presente invenção podem ser administradas para o tratamento de doença renal. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células bioativas podem ser administradas a um órgão nativo como parte de uma formulação descrita no presente documento. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células bioativas podem ser retiradas do órgão nativo que é objeto da administração ou a partir de uma fonte que não é o órgão nativo alvo.
[0305] Em certas modalidades, a presente divulgação provê métodos para o tratamento de uma doença renal, em um indivíduo que necessita do mesmo com as formulações contendo as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou população de células renais bioativas conforme descrito no presente documento. Em certas modalidades, as formulações são adequadas para a administração a um indivíduo que necessita da função renal melhorada.
[0306] Em um aspecto, o tratamento eficaz de uma doença renal em um indivíduo pelos métodos da presente divulgação pode ser observado através de vários indicadores da função renal. Em certas modalidades, os indicadores da função renal incluem, sem limitação, albumina do soro, ração de albumina para globulina (razão A/G), fósforo no soro, sódio no soro, tamanho dos rins (mensurável por ultrassom), cálcio no soro, razão de fósforo:cálcio, potássio no soro, proteinúria, creatinina na urina, creatinina no soro, ureia nitrogenada no sangue (BUN), níveis de colesterol, níveis de trigligerídeo e taxa de filtração glomerular (GFR). Além disso, vários indicadores da saúde e bem-estar gerais incluem, sem limitação, ganho e perda de peso, sobrevivência, pressão sanguínea (pressão sanguínea sistêmica média, pressão sanguínea diastólica ou pressão sanguínea sistólica) e desempenho da resistência física.
[0307] Em um aspecto, um tratamento eficaz com uma formulação é evidenciado pela estabilização de um ou mais indicadores da função renal. Em certas modalidades, a estabilização da função renal é demonstrada pela observação de uma mudança em um indicador em um indivíduo tratado por um método da presente divulgação conforme comparado com o mesmo indicador em um indivíduo que não foi tratado por um método da presente divulgação. Em certas modalidades, a estabilização da função renal pode ser demonstrada pela observação de uma mudança em um indicador em um indivíduo tratado por um método da presente divulgação conforme comparado com o mesmo indicador no mesmo indivíduo antes do tratamento. A mudança no primeiro indicador pode ser um aumento ou uma redução no valor. Em certas modalidades, o tratamento provido pela presente divulgação pode incluir a estabilização dos níveis de creatinina no soro e/ou ureia nitrogenada no sangue (BUN) em um indivíduo em que os níveis de BUN observados no indivíduo são menores conforme comparado com um indivíduo com estado de doença similar que não foi tratado pelos métodos da presente divulgação. Em certas modalidades, o tratamento pode incluir a estabilização dos níveis de creatinina no soro em um indivíduo em que os níveis de creatinina no soro observados no indivíduo são menores conforme comparado com um indivíduo com estado de doença similar que não foi tratado pelos métodos da presente divulgação.
[0308] Aqueles versados na técnica compreenderão que um ou mais indicadores adicionais descritos no presente documento ou conhecidos na técnica podem ser medidos para determinar o tratamento eficaz de uma doença renal no indivíduo.
[0309] Em certas modalidades, um tratamento eficaz com uma formulação é evidenciado pela melhora de um ou mais indicadores da estrutura e/ou função renal. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células renais bioativas proveem um nível melhorado de creatinina no soro e/ou ureia nitrogenada no sangue (BUN). Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou células renais bioativas proveem uma retenção melhorada de proteína no soro. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e as células renais bioativas enriquecidas proveem níveis melhorados de albumina no soro conforme comparado com uma população celular não enriquecida ou células sem as microvesículas adicionadas (por exemplo, exossomas). Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) proveem níveis melhorados de albumina no soro conforme comparado com as células renais bioativas. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou população de células renais bioativas enriquecidas proveem razão A:G melhorada conforme comparado com uma população celular não enriquecida. Em certas modalidades, a população de células renais bioativas provê níveis melhorados de colesterol no soro e/ou triglicerídeos. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou uma população de células renais bioativas provê um nível melhorado de vitamina D. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou uma população de células renais bioativas enriquecidas provê uma razão melhorada de fósforo:cálcio conforme comparado com uma população celular não enriquecida. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou uma população de células renais bioativas provê um nível melhorado de hemoglobina conforme comparado com uma população celular não enriquecida. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou uma população de células renais bioativas proveem um nível melhorado de creatinina no soro conforme comparado com uma população celular não enriquecida. Em certas modalidades, as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou uma população de células renais bioativas enriquecidas proveem um nível melhorado de hematócritos conforme comparado com uma população celular não enriquecida. Em certas modalidades, a melhora de um ou mais dos indicadores acima da função renal é o resultado do tratamento com as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou formulação de células renais selecionadas. Em uma modalidade, a melhora de um ou mais dos indicadores acima da função renal é o resultado do tratamento com as microvesículas (por exemplo, exossomas) e/ou formulação de células renais selecionadas.
[0310] Em um aspecto, a presente divulgação provê formulações para uso em métodos para a regeneração de um rim nativo em um indivíduo que necessita do mesmo. Em certas modalidades, o método inclui a etapa de administração ou implante de uma população celular bioativa, produto celular ou construto descrito no presente documento no indivíduo. Um rim nativo regenerado pode ser caracterizado por vários indicadores incluindo, sem limitação, desenvolvimento da função ou capacidade no rim nativo, melhora da função ou capacidade no rim nativo, e a expressão de certos marcadores no rim nativo. Em certas modalidades, a função ou capacidade desenvolvida ou melhorada podem ser observadas com base nos vários indicadores da função renal descritos acima. Em certas modalidades, o rim regenerado é caracterizado pela expressão diferencial de um ou mais marcadores de células-tronco. O marcador de célula-tronco pode ser um ou mais dos seguintes: SRY (região determinante do sexo Y)-box 2 (Sox2); fator de transcrição celular embrionária não diferenciado (UTF1); homólogo nodal a partir de camundongo (NODAL); Prominina 1 (PROM1) ou CD133 (CD133); CD24; e qualquer combinação dos mesmos (vide Ilagan et al. PCT/US2011/036347 incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade), vide também Genheimer et al.,
2012. Molecular characterization of the regenerative response induced by intrarenal transplantation of selected kidney cells in a rodent model of chronic kidney disease. Cells Tissue Organs 196: 374-384, incorporado a título de referência em sua totalidade. Em certas modalidades, a expressão de marcador(es) de células-tronco é suprarregulada comparado a um controle.
[0311] Em um aspecto, está provido no presente documento um método de tratamento de doença renal em um indivíduo, o método compreendendo injetar uma formulação, composição, população celular ou as microvesículas (por exemplo, exossomas) divulgados no presente documento no indivíduo. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha de 18 a 30 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 20 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 21 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 22 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 23 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 24 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 25 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 26 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 27 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 28 gauge.
Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é menor do que 29 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 20 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 21 gauge.
[0312] Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 22 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 23 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 24 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 25 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 26 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 27 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 28 gauge. Em certas modalidades, a formulação, composição, população celular ou produto celular (tais como microvesículas, por exemplo, exossomas) é injetado através de uma agulha que é de cerca de 29 gauge.
[0313] Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,84 mm. Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,61 mm. Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,51 mm. Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,41 mm. Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,33 mm. Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,25 mm. Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,20 mm. Em certas modalidades, o diâmetro interno da agulha é menor do que 0,15 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 1,27 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 0,91 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 0,81 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 0,71 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 0,64 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 0,51 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 0,41 mm. Em certas modalidades, o diâmetro externo da agulha é menor do que 0,30 mm. Em certas modalidades, uma agulha tem um dos tamanhos como na tabela a seguir: tamanho ID tamanho OD Gauge in mm in mm 14 0,060 1,55 0,072 1,83 15 0,054 1,37 0,065 1,65 16 0,047 1,19 n/a n/a 18 0,033 0,84 0,050 1,27 20 0,023 0,61 0,036 0,91 21 0,020 0,51 0,032 0,81 22 0,016 0,41 0,028 0,71 23 0,013 0,33 0,025 0,64 25 0,010 0,25 0,020 0,51 27 0,008 0,20 0,016 0,41 30 0,006 0,15 0,012 0,30 32 0,004 0,10 0,009 0,23
Métodos e formas de administração
[0314] Em certas modalidades, as vesículas (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas renais) são administradas na ausência de células (por exemplo, BRCs, tais como SRCs). Em certas modalidades, as vesículas são administradas junto com as células. Em certas modalidades, as vesículas são administradas na mesma composição que as células, assim como separadamente das células. Em certas modalidades, as vesículas e as células são administradas por diferentes formas de administração. Em certas modalidades, as vesículas e as células são administradas por uma forma de administração, e as vesículas também são administradas separadamente por uma outra forma de administração. Em certas modalidades, as vesículas são administradas mais frequentemente do que as células.
[0315] Em certas modalidades, as vesículas são administradas de forma intravenosa. Em certas modalidades, as vesículas são administradas de forma intravenosa em um vaso periférico. Em certas modalidades, as vesículas são administradas por liberação em transcateter. Em certas modalidades, a liberação em transcateter é na artéria renal esquerda ou artéria renal direita do indivíduo.
[0316] As formulações da presente invenção podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros componentes bioativos. Em certas modalidades, as formulações são adequadas para injeção ou implante de elementos de engenharia de tecido incorporados no interior de órgãos sólidos para regenerar tecido. Em certas modalidades, as formulações são usadas para a injeção ou implante de elementos de engenharia de tecido na parede de órgãos ocos para regenerar tecido. Em certas modalidades, as referidas formulações são administradas em combinação com formulações adicionais adequadas para liberação sistêmica ou em transcateter.
[0317] Em um aspecto, a presente invenção provê métodos de provisão de uma formulação de células bioativas descrita no presente documento a um indivíduo que necessita. Em certas modalidades, a formulação de células bioativas é suplementada com vesículas. Em certas modalidades, a formulação de células bioativas não é suplementada com vesículas, mas o indivíduo ainda recebe uma formulação separada compreendendo vesículas. Em certas modalidades, a fonte das células bioativas e/ou vesículas pode ser alogeneica ou singeneica, e qualquer combinação das mesmas. Em certas modalidades, os métodos podem incluir a administração de um agente imunossupressor. (vide, por exemplo, Patente Norte-americana No. 7,563,822).
[0318] Em certas modalidades, os métodos de tratamento da presente invenção envolvem a liberação da formulação de células bioativas descrita no presente documento. Em certas modalidades, a administração direta de células e/ou vesículas no sítio do benefício pretendido é realizada. Um indivíduo que necessita da mesma também pode ser tratado através do contato in vivo de um rim nativo com a formulação de células bioativas descrita no presente documento junto com os produtos secretados a partir de uma ou mais populações celulares renais enriquecidas, e/ou uma mistura ou construto contendo as mesmas. A etapa de contato in vivo provê um efeito regenerativo no rim nativo. Em certas modalidades, as vesículas isoladas (por exemplo, vesículas na ausência de células) são administradas antes, de forma concomitante com ou depois da formulação de células bioativas (por exemplo, através da mesma ou uma diferente forma de administração).
[0319] Uma variedade de meios para administrar as composições de células renais selecionadas aos indivíduos ficará, em vista deste relatório descritivo, aparente aos versados na técnica. Os referidos métodos incluem injeção das células em um sítio alvo em um indivíduo.
Veículos de liberação
[0320] Em certas modalidades, as células e/ou produtos secretados podem ser inseridos em um dispositivo de liberação ou veículo, que facilita a introdução por injeção ou implante nos indivíduos. Em certas modalidades, o veículo de liberação pode incluir materiais naturais. Em certas modalidades, o veículo de liberação pode incluir materiais sintéticos. Em certas modalidades, o veículo de liberação provê uma estrutura para mimetizar ou apropriadamente se ajustar na arquitetura do órgão. Em certas modalidades, o veículo de liberação é do tipo fluido na natureza. Os referidos dispositivos de liberação podem incluir tubos, por exemplo, cateteres, para injetar células e fluidos no corpo de um indivíduo recipiente. Em certas modalidades, os tubos adicionalmente têm uma agulha, por exemplo, uma seringa, através da qual as células da invenção podem ser introduzidas no indivíduo em um local desejado. Em certas modalidades, as populações celulares derivadas de rins de mamíferos são formuladas for administração em um vaso sanguíneo através de um cateter (em que o termo "cateter" pretende incluir qualquer um dos vários sistemas do tipo tubo para liberação de substâncias a um vaso sanguíneo). Em certas modalidades, as células podem ser inseridas em ou sobre um biomaterial ou estrutura, incluindo, porém sem se limitar aos têxteis, tais como tramas, malhas, tranças, redes e não tecidos, películas perfuradas, esponjas e espumas, e esferas, tais como esferas sólidas ou porosas, micropartículas, nanopartículas e similar (por exemplo, esferas de gelatina Cultispher-S - Sigma). As células podem ser preparadas para liberação em uma variedade de diferentes formas. Em certas modalidades, as células podem ser suspensas em uma solução ou gel. Em certas modalidades, as células podem ser misturadas com um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente no qual as células da invenção permanecem viáveis.
[0321] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis e diluentes incluem solução fisiológica, soluções de tampão aquoso, solventes e/ou meios de dispersão. O uso dos referidos veículos e diluentes é bem conhecido na técnica. A solução é preferivelmente estéril e fluida, e será frequentemente isotônica. Preferivelmente, a solução é estável sob as condições de fabricação e armazenagem e conservadas contra a ação contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos através do uso de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e similar. Um versado na técnica apreciará que o veículo de liberação usado na liberação das populações celulares e misturas das mesmas da presente invenção podem incluir combinações das características mencionadas acima.
[0322] Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com (i) uma formulação compreendendo vesículas, (ii) uma formulação compreendendo células renais bioativas, e/ou (iii) uma formulação compreendendo ambas as células renais bioativas e vesículas.
[0323] Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com células renais bioativas (tais como células renais selecionadas), 1-3 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com células renais bioativas (tais como células renais selecionadas), 1 vez. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com células renais bioativas (tais como células renais selecionadas), 2 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com células renais bioativas (tais como células renais selecionadas), 3 vezes.
[0324] Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 1-10 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 1 vez. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 2 vezes.
Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 3 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 4 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 5 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 6 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 7 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 8 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 9 vezes. Em certas modalidades, um indivíduo é administrado com vesículas renais (por exemplo, microvesículas, tais como exossomas) 10 vezes. Modos de Administração
[0325] Os modos de administração das formulações incluem, porém não se limitam a, injeção sistêmica, intra-renal (por exemplo, parenquimal), intravenosa ou intra-arterial, liberação em transcateter, e injeção diretamente no tecido no sítio de atividade pretendido. Em certas modalidades, os modos de administração a serem usados de acordo com a presente invenção incluem injeção(ões) única(s) ou múltipla(s) através de laparotomia direta, através de laparoscopia direta, transabdominal ou percutânea. Em certas modalidades, os modos de administração a serem usados de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, infusão retrógrada e ureteropélvica. Os meios de administração cirúrgicos incluem procedimentos de uma etapa tais como, porém sem se limitar a, nefrectomia parcial e implante de construto, nefrectomia parcial, pielectomia parcial, vascularização com omento ± peritôneo, linhas de agulha de biópsia multifocais, cone ou piramidal, no cilindro, e substituição do tipo de pólo renal, bem como procedimentos de duas etapas incluindo, por exemplo, biorreator organoide-interno para reimplante. Em certas modalidades, as formulações contendo misturas de células e vesículas são liberadas através da mesma forma ao mesmo tempo. Em certas modalidades, as composições celulares e composições de vesículas são liberadas de forma separada a locais específicos ou através de metodologias específicas, seja de forma simultânea ou em um modo controlado temporalmente, por um ou mais dos métodos descritos no presente documento. Em certas modalidades, as células renais selecionadas são injetadas de forma percutânea no córtex renal de um rim. Em certas modalidades, um cânula de orientação é inserida percutaneamente e usada para perfurar a cápsula renal antes da injeção da composição no rim. Em certas modalidades, as vesículas são administradas por injeção intravenosa ou liberação em transcateter.
[0326] Uma técnica laparoscópica ou percutânea pode ser usada para acessar o rim para injeção da população formulada de BRC ou SRC (por exemplo, junto com separadamente das vesículas). O uso de técnicas cirúrgicas laparoscópicas permite a direta visualização do rim de modo que qualquer sangramento ou outro evento adverso possa ser notado durante a injeção e atendido imediatamente. O uso de uma abordagem percutânea no rim esteve em uso por mais de uma década, primariamente para ablação de massas intra-renais. Esses procedimentos inserem um eletrodo ou agulha criogênica em uma massa definida no rim, e fica em contato por (tipicamente) 10 a 20 minutos enquanto a lesão é ablacionada. Para injeção da formulação terapêutica, a instrumentalização percutânea não é maior nem mais complexa, e esta abordagem oferece as vantagens de segurança da não cirurgia (evitando feridas da perfuração abdominal e inflação com gás) e tempo de imobilização mínimo. Além disso, a linha de acesso pode ter material hemostático biodegradável deixado no lugar, para reduzir ainda mais a chance de sangramento significativo.
[0327] Em certas modalidades da liberação por injeção, a formulação terapêutica de células bioativas (que pode ou não ser suplementada com vesículas) é injetada no córtex renal. Em certas modalidades, é importante distribuir a formulação terapêutica no córtex renal de forma mais ampla possível, o que pode ser alcançado, por exemplo, ao se entrar no córtex renal em um ângulo que permita a deposição da formulação terapêutica no córtex renal, distribuída de forma mais ampla possível. Isto necessitaria de imagens dos rins de uma forma longitudinal ou transversa usando orientação com ultrassom ou com imagens axiais feitas por tomografia computadorizada (TC), dependendo das características individuais do paciente. Idealmente, a injeção envolveria múltiplos depósitos já que a agulha/cânula de injeção é retirada gradualmente. O volume total da formulação terapêutica pode ser depositado em um único ou múltiplos pontos de entrada. Em certas modalidades, até dois pontos de entrada podem ser usados para depositar o volume total da formulação terapêutica no rim. Em certas modalidades, a injeção pode ser administrada a um único rim, usando um ou mais pontos de entrada, por exemplo um ou dois pontos de entrada. Em certas modalidades, a injeção é aplicada em ambos os rins, em cada rim usando um ou mais pontos de entrada, por exemplo, um ou dois pontos de entrada.
[0328] A descrição escrita acima é considerada como sendo suficiente para permitir que alguém versado na técnica pratique a invenção. Deve-se entender que, embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades preferidas e características opcionais, a modificação e variação dos conceitos aqui apresentados podem ser recorridas pelos versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas. Os seguintes Exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição antecedente e abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.
[0329] Todas as patentes, pedidos de patente e referências na literatura citadas no presente relatório descritivo são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
EXEMPLOS Exemplo 1: Os exemplos não limitantes de métodos e composições para produzir SRCs Exemplo 1.1 – Preparação de soluções
[0330] Esta seção de exemplo provê as composições das várias formulações e soluções do meio usadas para o isolamento e caracterização da população celular renal heterogênea, e a fabricação do produto da terapia regenerativa, neste exemplo. Tabela 6: Meio de cultura e soluções
Solução fisiológica tamponada em fosfato Dulbecco (DPBS) foi usada para todas as lavagens celulares. Exemplo 1.2 – Isolamento da população celular renal heterogênea não fracionada
[0331] Esta seção de exemplo ilustra o isolamento de uma população celular renal heterogênea não fracionada (UNFX) a partir de humanos. A dissociação inicial de tecido foi realizada para gerar suspensões celulares heterogêneas a partir de tecido renal humano.
[0332] O tecido renal através da biopsia renal proveu o material de base para uma população celular renal heterogênea. O tecido renal compreendendo um ou mais do tecido cortical, de junção corticomedular ou tecido medular pode ser usado. Prefere-se que o tecido de junção corticomedular seja usado. Múltiplos núcleos de biopsia (mínimo 2), evitando tecido cicatricial, foram necessários a partir de um rim com CKD. O tecido renal foi obtido pelo investigador clínico a partir do paciente no sítio clínico aproximadamente 4 semanas antes do implante planejado do NKA final. O tecido foi transportado no meio de transporte de tecudo do exemplo 1.1.
[0333] O tecido foi então lavado com a solução de lavagem de tecido do exemplo 1.1 de modo a reduzir a biocarga antes do processamento do tecido para extrações celulares.
[0334] O tecido renal foi picado, pesado e dissociado na solução de digestão do exemplo 1.1. A suspensão celular resultante foi neutralizada em meio Eagle modificado Dulbecco (D-MEM)+10% soro bovino fetal (FBS) (Invitrogen, Carlsbad Calif.), lavado e ressuspenso em meio de queratinócitos livre de soro, livre de suplemento (KSFM) (Invitrogen). As suspensões celulares foram então centrifugadas sobre um limite de densidade de 15% (p/v) de iodixanol (OptiPrepTM, Sigma) para remover as células de glóbulos vermelhos e resíduos antes do início da cultura em frascos ou placas de poliestireno tratados com cultura de tecido em uma densidade de 25,000 células por cm2 em meio de crescimento celular renal do exemplo 1.1. Por exemplo, as células podem ser colocadas em placas no frasco T500 Nunc em 25x106 células/frasco em 150 ml de meio 50:50. Exemplo 1.3 – Expansão celular da população celular renal isolada
[0335] A expansão celular renal é dependente da quantidade de tecido recebido e do sucesso do isolamento de células renais do tecido inicial. As células isoladas podem ser criopreservadas, caso necessário (vide infra). A cinética do crescimento de célula renal pode variar de amostra para amostra devido à inerente variabilidade de células isoladas de pacientes individuais.
[0336] Um processo de expansão celular definido foi desenvolvido o qual acomoda a faixa de recuperações celulares resultando da variabilidade do tecido inicial, Tabela 7. Expansão de células renais envolve as passagens seriais em recipientes de cultura fechados (por exemplo, frascos T, Cell Factories, HyperStacks®) em meio de cultura celular renal da tabela 6 usando procedimentos de cultura celular definidos.
[0337] Um meio livre de BPE foi desenvolvido para testes clínicos humanos para eliminar os riscos inerentes associados com o uso de BPE. O crescimento celular, fenótipo (CK18) e função celular (atividade enzimática de GGT e LAP) foram avaliados em meio livre de BPE e comparados cm meio contendo BPE usado em estudos animais. O crescimento celular renal, fenótipo e função ficaram equivalentes nos dois meios. (dados não mostrados).
[0338] Tabela 7 Recuperação celular a partir de biopsias renais humanas
[0339] Uma vez que o crescimento celular foi observado nos frascos T iniciais (passagem 0) e não havia sinais visuais de contaminação, o meio de cultura foi substituído e modificado depois a cada 2-4 dias (FIGURA 2B). As células foram avaliadas para verificar a morfologia celular renal através de observação visual de culturas sob o microscópio. As culturas caracteristicamente demonstraram um pavimento apertado ou aparência de paralelepípedo, devido ao agrupamento de células. Essas características morfológicas variam durante a expansão e podem não estar presentes em cada passagem. A confluência da cultura celular foi estimada em vários níveis de confluência nos recipientes de cultura empregados ao longo das expansões celulares.
[0340] As células renais foram passadas através de tripsinização quando os recipientes de cultura são pelo menos 50% confluentes
(FIGURA 2B). As células destacadas foram coletadas nos recipientes contendo meio de crescimento celular renal, contadas e a viabilidade celular calculada. Em cada passagem celular, as células foram semeadas em 500-4000 células/cm2 em um número suficiente de recipientes de cultura de modo a expandir o número de células que são necessárias para a formulação de NKA (FIGURA 2B). Os recipientes de cultura foram colocados em uma incubadora a 37ºC em um ambiente de 5% de CO2. Conforme descrito acima, a morfologia e a confluência celular foi monitorada e o meio de cultura de tecido foi substituído a cada 2-4 dias. A tabela 8 lista a viabilidade das células renais humanas observadas durante o isolamento celular e expansão de seis biopsias renais de doadores humanos. Tabela 8 Viabilidade celular de células renais humanas em cultura Passagem (n=6) Viabilidade celular (média %) faixa(%) P0 88 84-93 P1 91 80-98 P2 94 92-99 P3 98 97-99
[0341] A viabilidade inerente do tecido a partir de diferentes pacientes resultou em diferente rendimento celular em cultura. Deste modo, não é prático definir estritamente o cronograma das passagens celulares ou número e tipo de recipientes de cultura necessários em cada passagem para alcançar números celulares alvo. Tipicamente, as células renais sofrem 2 ou 3 passagens; no entanto, a duração da cultura e rendimento celular pode variar dependendo da taxa de crescimento celular.
[0342] As células foram destacadas para coleta ou passagem com 0,25% de tripsina com EDTA (Invitrogen). A viabilidade foi avaliada através da exclusão com azul tripano e a enumeração foi realizada de forma manual usando um hemacitômetro ou usando o sistema de contagem automatizado Cellometer.RTM. (Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.). Exemplo 1.4 Criopreservação de células cultivadas
[0343] As células renais expandidas foram rotineiramente criopreservadas para acomodar a viabilidade inerente do crescimento celular a partir de pacientes individuais e para liberar produto em uma programação clínica predeterminada. As células criopreservadas também proveem uma fonte extra de células caso um outro NKA seja necessário (por exemplo, atraso devido à doença do paciente, eventos imprevistos do processo, etc.). As condições foram estabelecidas as quais foram usadas para criopreservar as células e recuperar células viáveis, funcionais mediante o descongelamento.
[0344] Para criopreservação, as células foram suspensas até uma concentração final de cerca de 50x106 células/mL em solução de criopreservação (vide exemplo 1.1) e dispensadas em frascos. Os frascos de um ml contendo cerca de 50x106 células/mL foram colocados na câmara de congelamento de um freezer com taxa controlada e congelados em uma taxa pré-programada. Depois do congelamento, as células foram transferidas a um freezer com nitrogênio líquido para armazenamento em processo. Exemplo 1.5 Preparação de população celular SRC
[0345] As células renais selecionadas (SRC) podem ser preparadas a partir de recipientes de cultura final que são desenvolvidas a partir de células criopreservadas ou diretamente de culturas de expansão dependendo da programação (FIGURA 2B).
[0346] Se estiver usando células criopreservadas, as células foram descongeladas e colocadas em placas nos recipientes de cultura de tecido para uma etapa de expansão final. Quando os recipientes de cultura finais foram de aproximadamente 50 -100% de células confluentes estavam prontos para processamento para a separação de
SRC. Trocas de meios e lavagens finais de NKA diluem qualquer solução de criopreservação Residual No produto Final.
[0347] Uma vez que os recipientes de cultura celular final alcançaram pelo menos 50% de confluência, os recipientes de cultura foram transferidos a uma incubadora hipóxica configurada para 2% de oxigênio em um ambiente com 5% de CO2 a 37ºC (FIGURA 2C) e cultivados de um dia para o outro. As células podem ser mantidas na incubadora com oxigênio controlado configurada para 2% de oxigênio por tanto quanto 48 horas. A exposição ao ambiente de baixo oxigênio (2%) mais fisiologicamente relevante melhorou a eficiência da separação celular e permitiu maior detecção de marcadores induzidos por hipoxia tal como VEGF.
[0348] Depois que as células foram expostas às condições hipóxicas por um tempo suficiente (por exemplo, de um dia para o outro até 48 horas), as células foram destacadas com 0,25% de tripsina com EDTA (Invitrogen). A viabilidade foi avaliada através da exclusão com azul de tripano e a enumeração foi realizada de forma manual usando um hemacitômetro ou usando o sistema de contagem automatizado Cellometer® (Nexcelom Bioscience, Lawrence Mass.). As células foram lavadas uma vez com DPBS e ressuspensas até cerca de 850x106 cells/mL em DPBS.
[0349] A centrifugação através de um limite de densidade/interface foi usada para separar populações celulares renais coletadas com base na densidade celular flutuante. As suspensões celulares renais foram separadas por centrifugação sobre uma solução de 7% de iodixanol (OptiPrep; 60% (p/v) em OptiMEM; vide Exemplo 1.1).
[0350] A solução de interface de densidade 7% OptiPrep foi preparada e o indicativo do índice refrativo da densidade desejada foi medido (R.I. 1.3456+/-0.0004) antes do uso. As células renais coletadas foram colocadas na parte superior da solução. A interface de densidade foi centrifugada em 800 g por 20 min em temperatura ambiente (sem interrupção) tanto em tubos centrífugos quanto em um processador celular (por exemplo, COBE 2991). A fração celular exibindo densidade flutuante de mais do que aproximadamente 1,045 g/mL foi coletada depois da centrifugação como um pélete distinto. As células mantendo uma densidade flutuante menor do que 1,045 g/mL foram excluídas e descartadas.
[0351] O pélete de SRC foi ressuspenso em DPBS (FIGURA 2C). A transferência de OptiPrep residual, FBS, meio de cultura e materiais ancilares no produto final é minimizado por 4 etapas de lavagem com DPBS e 1 etapa de solução de gelatina. Exemplo 2: Composições de exossoma e uso das mesmas para tratamento da doença renal e função Exemplo 2.1 – campo técnico
[0352] Este exemplo se refere às composições de exossoma de célula renal, e a preparação das mesmas, para usos incluindo aplicação de tecido engenheirado e medicina regenerativa para reparo e função renal. Exemplo 2.2 – comentários gerais
[0353] Considerável pesquisa continua a focar na exploração de exossomas em fluidos biológicos para biomarcadores de doença. O potencial terapêutico de exossomas está sendo recentemente mais abordado, a maior parte centrada na imunoterapia para o câncer, desenvolvimento de vacinas, tratamento de doenças autoimunes, e liberação de agentes terapêuticos (compostos, siRNA). Os exossomas como um potencial terapêutico para modular a neovascularização, um componente chave na regeneração de tecido, tem ganhado atenção nos últimos 7 anos (7, 8).
[0354] As vesículas extracelulares secretadas (EVs), tais como exossomas, são preenchidas com potentes proteínas pró-reparo e cargas de RNA que são tanto específicas de tipo celular, assim como, produzidas e secretadas diferencialmente de acordo com o ambiente celular. Uma excelente revisão neste assunto conforme diretamente relevante para a doença renal foi publicada por Zhang at al. (Am J Physiol Renal Physiol. 2016 Nov 1;311 (5):F844-F851. doi:
10.1152/ajprenal.00429.2016. Epub 2016 Aug 31. Extracellular vesicles in diagnosis and therapy of kidney diseases. Zhang W, Zhou X, Zhang H, Yao Q, Liu Y, Dong Z.).
[0355] A doença renal crônica (CKD) é um problema de saúde global; o intervalo de crescimento entre o número de pacientes aguardando transplante e órgãos realmente transplantados elicita a necessidade por novos tratamentos para restaurar a função renal. A medicina regenerativa é uma abordagem promissora a partir da qual tratamentos para distúrbios à nível de órgão tenham surgido e sejam repassados para a abordagem clínica. Os modelos regenerativos, compostos de material biodegradável e células autólogas, isoladas e expandidas ex vivo, estimulam a regeneração do tecido no órgão como um órgão nativo depois do implante.
[0356] Pesquisa recente demonstrou um papel emergente de EVs na mediação célula-célula ou comunicação intercelular (9, 10). A principal atividade biológica de EVs exibiu potencial benefício para a correção de disfunção celular, e, por sua vez, a terapia de doenças (11). EVs também foram considerados nanovetores ideais para bioliberação, especificamente para a liberação de fármacos na aplicação clínica (12). Nos rins, EVs renais são produzidos e secretados por células renais e foram implicados na função renal e doenças (10).
[0357] Mecanicamente, vários estudos atribuíram o efeito protetor de EVs nas doenças renais principalmente devido ao seu teor de RNA, especialmente microRNAs (13, 14).
[0358] Há uma intensiva pesquisa no potencial de EVs como biomarcadores para CKD. Em contraste, muito pouco se sabe sobre o efeito terapêutico de EVs em CKD. Sem se limitar por nenhuma teoria científica, nós concluímos que o sucesso no tratamento de CKD com a nossa SRC é devido, pelo menos em parte, ao tratamento hipóxico da SRC resultando em EVs “sintonizadas” sendo secretadas a partir de células implantadas, o que por sua vez ‘resgata’ as células doentes assim melhorando a sua função.
[0359] Em certas modalidades, a sintonização hipóxica das células renais selecionadas em seguida ao recurso do gradiente antes do isolamento de exossomas provê EVs com propriedades regenerativas melhoradas. Exemplo 2.3 – Isolamento de exossomas – Quantificação e determinação do tamanho
[0360] Com base nos métodos de purificação usados (15), os exossomas foram descritos como sendo de 30–150 nm em faixa (16, 17) com uma densidade aproximada de 1,10-1,20 g/mL (18, 19), dependendo do material do gradiente de densidade (sacarose ou OptiPrep) usado para análise. As microvesículas foram descritas como sendo maiores do que exossomas, e são frequentemente descritas como tendo 100-300nm de diâmetro. O grau de sobreposição nos tamanhos para essas classes de EVs varia dependendo da publicação e a tecnologia usada para fazer a medição. Conforme usado no presente documento, o termo “microvesícula” significa uma vesícula extracelular membranosa derivada de célula entre 30 e 1,000 nanômetros (nm) de diâmetro. Conforme usado no presente documento o termo “exossoma” significa uma microvesícula membranosa derivada de célula que tem cerca de 30-150nm de diâmetro. Sendo assim, conforme usado no presente documento, o termo “microvesícula” abrange exossomas, assim como vesículas maiores. Embora uma declaração de posição (20) tenha sido publicada por líderes de opinião principais com a International Society of Extracellular Vesicles (ISEV) no fim de 2014 e 2015, não há ainda consenso uniforme sobre como melhor isolar, dimensionar e caracterizar exossomas. Espera-se que à medida que os estudos no campo avancem, particularmente na área de função biológica, técnicas para melhor isolar, dimensionar e caracterizar partículas serão dirigidas por cujo método que forneça o efeito biológico desejado. Em certas modalidades, EVs compreendendo exossomas são obtidas pelo processo de centrifugação de meio de cultura contendo EV em 3000xg por 20min para peletizar os resíduos celulares, seguido pela ultracentrifugação do sobrenadante clarificado em 100,000xg para peletizar EVs. Essas preparações atualmente demonstram atividade biológica (vide ensaios de proliferação e tubulogênese abaixo).
[0361] As células são desenvolvidas por 24h em meio de cultura livre de soro. O meio é coletado. Para isolar os exossomas, o meio condicionado livre de soro coletado é submetido à centrifugação em duas etapas: 1) 3000 x g, 20 minutos para remover resíduos celulares; 2) 100,000 x g, 2 horas, para peletizar exossomas. Os exossomas são ressuspensos em DPBS e armazenados em -80oC até o uso.
[0362] Para determinar a distribuição de tamanho e a concentração dos exossomas, analisamos amostras pelo sensor de pulso resistivo sintonizável (TRPS; (qNano, Izon Science Ltd) usando uma membrana NP150 nanopore em um filamento de 47 mm. A concentração de partículas foi padronizada usando calibração de multipressão com esferas de poliestireno carboxilado de 114 nm em uma concentração de 1,0 x 1013 partículas/mL. As amostras foram diluídas 1:100 em DPBS imediatamente antes da análise. Os resultados e rendimentos são mostrados na tabela abaixo (Tabela 9) para 4 lotes diferentes. Embora haja variabilidade de tamanho e concentração ao longo dos lotes, o tamanho de partícula para todos os lotes está bem dentro da definição operacional de exossomas (30-150nm).
[0363] Tabela 9: Resultados e rendimentos do isolamento, quantificação e determinação de tamanho dos exossomas
[0364] Neste e em outros exemplos, “BRC-0” são células renais bioativas que não são células primárias não passadas. “BRC-1” são células renais bioativas que foram passadas uma vez. “BRC-2” são células renais bioativas que foram passadas duas vezes. “BRC-3” são células renais bioativas que foram passadas três vezes. “BRC-3A” são células renais bioativas que foram passadas três vezes e depois cultivadas sob condições de hipoxia (denota as células depois que a cultura hipóxica está completada). “SRC” denota células renais selecionadas. Exemplo 2.4 – caracterização de micro RNA (miRNA) de exossoma de
SRC
[0365] Uma vez que os conteúdos de carga de exossoma podem incluir vários analitos incluindo proteínas, metabólitos e RNA, caracterizadmos o microRNA encontrado associado com exossomas derivados de SRC. Os microRNAs (miRNAs) são RNAs pequenos não codificadores, compreendendo aproximadamente 18–23 nucleotídeos, que se ligam à região não traduzida 3’ dos RNAs mensageiros para reprimir a tradução ou promover a degradação. Os perfis de miRNA refletem várias condições fisiológicas e patológicas. Eles são expressados de uma maneira específica para um tecido ou célula. Os níveis de expressão de miRNAs mudam de acordo com os vários processos fisiológicos, e acredita-se que a maior parte dos genes codificadores de proteína humana seja direcionada por miRNAs.
[0366] Com a sua função sendo essencialmente negativa; isto é: reprimindo a tradução de RNA, talvez por ligação competitiva ou promoção da degradação, miRNA tem uma função global de regulação do crescimento e proliferação celular. Por exemplo, a promoção da proliferação celular pode envolver o funcionamento de miRNA para inibir a tradução da proteína supressiva do crescimento, e portanto a expressão. Alternativamente, a inibição da tradução/expressão da proteína promotora do crescimento pode inibir a proliferação celular.
[0367] Deve ser reconhecido que as funções desses miRNAs foram amplamente determinadas pelo estudo do crescimento anormal da célula, como seria encontrado em células cancerosas e outros estados da doença. Como tal, a extrapolação de sua função em células normais precisa ser avaliada cuidadosamente. Por exemplo, apenas porque foi verificado que um miRNA é elevado, ou reprimido, em uma célula cancerosa não implica necessariamente que eles funcionam unicamente para promover a transformação celular; o equilíbrio entre proliferação celular e supressão de crescimento foi deslocado para proliferação celular em uma célula cancerosa. Com isto em mente, não é surpreendente que a maioria dos miRNAs acima tenham sido identificadas nestas células renais. Perfil experimental:
[0368] miRNA a partir de cada amostra foi isolado usando miRNeasy Mini Kit, que permite a purificação de RNA total, o qual inclui RNA de aproximadamente 18 nucleotídeos (nt) para cima. O miRNA foi quantificado usando espectrofotômetro NanoDrop.
[0369] Serviço de sequenciamento provido: Small RNA‐Seq. Plataforma de sequenciamento: Illumina NextSeq 500. Reagente da plataforma de sequenciamento: NextSeq Mid Output Kit v2. Produto usado para a preparação da biblioteca: Norgen Biotek Small RNA Library Prep Kit. Fluxo de análise de dados de seq. RNA pequena usado: exceRpt small RNA‐seq Pipeline (v4.6.2). (Weblink: genboree.org/theCommons/projects/exrnatools‐ may2014/wiki/Small_RNA‐seq_Pipeline). Fontes de sequências de referência de RNA pequeno: miRNAs miRBase version 21; tRNAs gtRNAdb, piRNAs, RNAdb, Genome Gencode version 21 (hg38). Resultados:
[0370] A análise computacional das sequências resultantes divulga os seguintes miRNAs diferencialmente expressados em exossomas secretadas por SRCs:
[0371] miR-145 -hipotetizado para ser um supressor tumoral
[0372] mir-22- pode funcionar como um supressor tumoral
[0373] miR-7 - um miRNA altamente conservado que exibe expressão espaciotemporal restrita durante o desenvolvimento e na maturidade. Também pode funcionar como um supressor de crescimento celular/tumoral.
[0374] miR-10a – Regula fenótipo pró-inflamatório, marcador para lesão renal. Verificou-se experimentalmente que miR-10a infrarregula os genes HOXA1 e HOXA3 humanos. O controle dos genes Hox por miR-10 sugere que este microRNA pode ter um papel importante no desenvolvimento.
[0375] miR-143 – supressor tumoral, inibidor de crescimento
[0376] let7b – dado que os níveis de expressão dos membros let-7 são significativamente baixos em cânceres humanos e células-tronco de câncer, a principal função dos genes let-7 pode ser promover a diferenciação terminal em desenvolvimento e supressão tumoral. Exemplo 2.5 – Marcação de superfície de MACSplex de exossoma
[0377] A caracterização de superfície do exossoma foi realizada usando um ensaio multiplex compreendido de análise FACS para 39 marcadores de superfície relatados para estarem presentes em EVs. Perfil experimental:
[0378] Os exossomas isolados da célula cultivada (BRC-0, BRC-3, BRC-3A, SRC) condicionaram o meio através de ultracentrifugação.
[0379] O diâmetro da partícula e a concentração foram avaliados pelo sensor de pulso resistivo sintonizável (TRPS; (qNano, Izon Science Ltd) usando uma membrana NP150 nanopore em um filamento de 47 mm. A concentração de partículas foi padronizada usando calibração de multipressão com esferas de poliestireno carboxilado de 110 nm em uma concentração de 1,1 x 10E13 partículas/mL.
[0380] 1 x 10E10 partículas foram usadas para cada amostra.
[0381] Os exossomas são imunoisolados usando um coquetel de CD63, CD9 e CD81.
[0382] Esta população é então rastreada para expressão de 37 diferentes marcadores. Resultados: vide FIGURA 4
[0383] Em exossomas isolados de ambos TCHK0012 e TCHK0013, os seguintes são suprarregulados em expressão para SRC comparado com BRC
[0384] CD133 – Embora a função precisa permaneça desconhecida, foi proposto que ele age como um organizador da topologia da membrana celular.
[0385] CD326 – Molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM) é uma glicoproteína de transmembrana mediando a adesão celular de célula homotípica Ca2+-independente no epitélio. EpCAM também está envolvido na sinalização celular, migração, proliferação e diferenciação.
[0386] CD49e – Além da adesão, as integrinas são conhecidas por participar em sinalização mediada pela superfície celular. Exemplo 2.6 – Transferência de corante lipofílico mediado por exossomas às células renais
[0387] De modo que os exossomas liberem a sua carga de proteína ou ácido nucleico, assumiu-se que os exossomas devem se ligar e fundir com a membrana celular recipiente para assim fazê-lo. A liberação mediada por exossomas de um corante lipofílico à membrana celular é uma forma de demonstrar a fusão de exossomas à célula recipiente (21). Perfil experimental:
[0388] Transferência de corantes. Para avaliar a capacidade dos exossomas em liberar a sua carga, monitoramos a capacidade dos exossomas em transferir um corante lipofílico às células renais em cultura através da citometria de fluxo.
[0389] Uma aliquota de exossomas (BRC-0, BRC-3, SRC) foi marcada com solução de marcação celular Vybrant DiI por 20 minutos a 37 °C.
[0390] Em seguida à remoção do corante em excesso através de untracentrifugação, os exossomas marcados 5 x E09 foram adicionados a cada poço de uma placa de 6 poços, cada uma contendo aproximadamente 250,000 células/poço.
[0391] Depois de 4 h de incubação tanto em 4 graus C ou 37 graus C, as culturas foram lavadas para remover algum exossoma marcado, não incorporado.
[0392] As células recuperadas foram então recuperadas e analisadas por FACs.
[0393] As células marcadas de forma fluorescente, indicativas de transferência de corante lipofílico a partir dos exossomas para a membrana celular, resultam em um deslocamento da linha de histograma da esquerda para a direita. Resultados: vide FIGURA 5
[0394] Conforme esperado, nenhuma ligação ao exossoma, conforme indicado por uma falta de transferência do corante lipofílico foi observada em 4 graus. Isto sustenta a noção de que a célula precisa ser biologicamente ativa para que os exossomas sejam retirados.
[0395] Também conforme esperado, no histograma de controle de exossomas, não há deslocamento para a direita comparado com o histograma de 4 graus.
[0396] A área entre os histogramas, conforme indicado pelas setas, indicou a população de células que absorveu o corante.
[0397] Baseado neste experimento, parece que um diferencial na ligação ao exossoma entre BRC-0 (o maior) e BRC-3 e SRC (aproximadamente o mesmo grau de ligação). Exemplo 2.7 – Ensaio de proliferação celular
[0398] Para os exossomas terem um papel no reparo e regeneração do tecido renal, pode ser argumentado que ter a capacidade de estimular a proliferação de células renais seria uma função desejável. Perfil experimental:
[0399] As células renais humanas foram estratificadas em 50,000 células/poço em uma placa de 12 poços.
[0400] Os exossomas foram isolados a partir dos sobrenadantes celulares indicados.
[0401] Os volumes de exossomas de 25, 50, 100uL (1X, 2X, 4X) foram adicionados aos respectivos poços.
[0402] As amostras foram testadas em duplicata.
[0403] As placas foram enumeradas 3 dias depois do tratamento usando o ArrayScan.
[0404] SF= meio livre de soro (controle negativo).
[0405] Meio de crescimento = meio contendo soro (controle positivo). Resultados: vide FIGURA 6
[0406] Todas as diluições de tratamento de TCHK006 BRC-3 e SRC aumentaram a proliferação celular, quase até o mesmo nível, acima daquele do controle negativo.
[0407] As diluições de tratamento de TCHK004 BRC-3 e SRC demonstraram um efeito do tipo dose na proliferação; apenas o volume de 4X de SRC aumentou a proliferação acima daquela do controle negativo. Exemplo 2.7 – Ensaio de formação de túbulo/angiogênese
[0408] Também se entende que a capacidade para estimular a angiogênese sejam uma função desejável para um produto de tecido engenheirado/medicina regenerativa. Um dos ensaios in vitro mais amplamente usado para modelar o estágio de reorganização da angiogênese é o ensaio de formação de tubos. O ensaio mede a capacidade das células endoteliais, organizadas em densidades subconfluentes com o suporte de matriz extracelular apropriado, para formar estruturas do tipo capilar (também conhecidos tubos). Os cientistas tipicamente empregam este ensaio para determinar a capacidade de vários compostos promoverem ou inibirem a formação de tubos. Mediante a colocação nas placas, as células endoteliais se prendem e geram forças mecânicas na matriz suporte extracelular circundante para criar trajetos ou vias de orientação que facilitam a migração celular. Os cordões de células resultantes eventualmente formarão lúmens ocos.
[0409] Os compostos que são capazes de inibir a formação de tubos poderiam ser úteis em várias doenças, tais como câncer, onde os tumores estimulam nova formação de vasos sanguíneos para receber oxigênio e nutrientes de modo a crescer além de um tamanho relativamente pequeno. Em contraste, os compostos ou biológicos (isto é: exossomas) que podem estimular a formação de tubos pode ser útil nas aplicações de engenharia de tecido/medicina regenerativa. Perfil experimental:
[0410] 50,000 células endoteliais vasculares foram colocadas em placas em uma matriz extracelular (GelTrex) em uma placa de 48 poços.
[0411] As células incubadas em meio de crescimento livre de soro suplementado com fatores de crescimento como o controle positivo.
[0412] As células foram incubadas em meio livre de fator de crescimento livre de soro como o controle negativo.
[0413] As células incubadas em meio livre de fator de crescimento e livre de soro suplementadas com exossomas (partículas TCHK004, SRC, 10E10) são o artigo de teste. Resultados: vide FIGURA 7
[0414] Embora a formação de túbulos tenha ocorrido mais rapidamente no controle positivo (túbulos se tornando visíveis em T=2h), em T=9 h, a robusta formação de túbulos foi observada para as células tratadas com o exossoma.
[0415] Os exossomas substituíram de forma bem sucedida um coquetel de fator de crescimento definido, contendo hEGF, bFGF, IGF- 1 e VEGF, no suporte da formação de túbulos.
[0416] As culturas foram incubadas por 9 h em seguida ao tratamento. A. meio livre de fator de crescimento, livre de soro (controle negativo). B. meio livre de fator de crescimento, livre de soro suplementado com exossomas 10E10 (artigo de teste). C. meio livre de soro suplementado com fatores de crescimento (controle positivo). Exemplo 2.8 - Referências
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[0439] A análise bioinformática de proteínas secretadas por SRC e miRNA exossomal identifica vias de sinalização específicas que, mediante a ativação ou desativação por fatores derivados de SRC, pode modular a progressão de CKD. Essas vias de sinalização podem ser alavancadas in vitro como ensaios de potência quantitativa ligados diretamente a SRC MOA putativo e/ou as proteínas/miRNA identificados podem ser aplicados como representantes para potência e avaliadas por metodologias baseadas em ELISA/PCR a partir dos meios condicionados. Esta abordagem leva à identificação das vias de sinalização envolvidas na progressão da doença renal e função de SRC MOA através dos mecanismos parácrinos que alavancam a atividade de ligantes biologicamente ativos, secretados e miRNAs transferidos do doador para a célula hospedeira através da atividade de exossomas e outros elementos microvesiculares secretados.
[0440] O miRNA foi isolado a partir de exossomas purificados a partir de meios secretados ou a partir do nicho intracelular. Usando n=6 doadores independentes, comparações estatisticamente rigorosas poderiam ser feitas para os seguintes: BRC3/3A e BRC0/SRC. miRNAs que discriminam esses intermediários de fabricação foram identificados. Abordagem
1. Aplicação de abordagens computacionais/bioinformática ao secretoma celular
[0441] Nós caracterizamos o secretoma e os perfis de miRNA (intracelular e exossomal) a partir dos intermediários de fabricação de SRC e SRC (n=6). Os conjuntos de dados estão continuamente sendo analisados pelas metodologias de bioinformática para computacionalmente identificar redes de sinalização associadas à regeneração e relevantes à doença que são diretamente impactados pelas proteínas secretadas ou miRNA gerado por SRC.
[0442] Até hoje, esses dados demonstram que a transição de
BRC3-BRC3A (a etapa hipóxica) induz mudanças principais na bio- assinatura da população celular de BRC de forma que o produto final de fabricação (SRC) seja claramente distinguível a partir do material de partida (BRC0).
2. Perfil de miRNA presente em exossomas secretados e vesículas intracelulares de SRC humana, BRC3/3A e BRC0
[0443] miRNA foi isolado a partir de exossomas purificados a partir de meio secretado ou do nicho intracelular. Usando n=6 doadores independentes, comparações estatisticamente rigorosas poderiam ser feitas para os seguintes: BRC3/3A e BRC0/SRC.
[0444] miRNAs que discriminam esses intermediários de fabricação foram identificados.
[0445] Diferente da descrição fenotípica padrão e análise funcional, a abordagem de caracterização do secretoma celular de SRC e BRC-0 e miRNA provê profundidade aumentada de compreensão de como SRC não difere apenas de BRC-0, mas também provê uma abordagem única e útil para os ensaios de potência. Os dados que coletamos claramente distinguiram SRC de BRC-0. Sem se ater a nenhuma teoria específica, muitas das diferenças são mais provavelmente devido à etapa de hipoxia, já que existem também diferenças entre BRC-3, BRC- 3A e SRC. Exemplo 3.1: Desenho experimental Item Treatmento versus Controle 1 F1 -> A1 2 E1 -> D1
[0446] n=6, TCHK007-TCHK012
[0447] A1 Exossomas produzidos por células BRC0.
[0448] D1 Exossomas produzidos por células BRC3.
[0449] E1 Exossomas produzidos por células BRC3A.
[0450] F1 Exossomas produzidos por SRCs.
Exemplo 3.2 – miRNA diferencialmente expressado
[0451] Com base no desenho experimental, o número de miRNA diferencialmente expressado para cada comparação é mostrado na tabela abaixo. Os critérios de seleção padrão para identificar miRNA diferencialmente expressado são como a seguir: | variação de dobra Loge | ≥ 1 e valor P < 0,05.
[0452] Tabela 10: Número de miRNA diferencialmente expressado # miRNA superregulado # miRNA Comparação DE superregulado DE E1-D1 7 3 F1-A1 55 26
[0453] Nas tabelas abaixo, “hsa-” denota um miRNA humano.
[0454] Tabela 11: 10 principais miRNAs diferencialmente expressados em E1 vs. D1 (na ordem de valores p crescentes) BRC3A / BRC3 EXO
[0455] Tabela 12: principais miRNAs suprarregulados em E1 vs. D1 (na ordem de valores de variação de dobra decrescentes)
[0456] BRC3A / BRC3 EXO
[0457] Tabela 13: principais 10 miRNAs infrarregulados em E1 vs. D1 (na ordem de valores de variação de dobra crescentes)
[0458] BRC3A / BRC3 EXO
[0459] tabela 14: principais 10 miRNAs diferencialmente expressados em F1 vs. A1 (na ordem de valores p crescentes)
SRC / BRC0 EXO
[0460] Tabela 15: principais 10 miRNAs suprarregulados em F1 vs. A1 (na ordem de valores de variação de dobra decrescentes)
[0461] SRC / BRC0 EXO
[0462] Tabela 16: principais 10 miRNAs infrarregulados em F1 vs. A1 (na ordem de valores de variação de dobra crescentes)
[0463] SRC / BRC0 EXO
[0464] Os grupos de miRNA que diferem significativamente entre os pares de condições experimentais E1 vs D1 são divulgados no gráfico de vulcão na FIGURA 8. Os grupos de miRNA que diferem significativamente entre os pares de condições experimentais F1 vs A1 são divulgados no gráfico de vulcão na FIGURA 9.

Claims (142)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de vesículas de células renais secretadas isoladas, em que as vesículas são administradas por injeção intravenosa ou por liberação com transcateter.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as vesículas são injetadas de forma intravenosa em um vaso periférico.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a liberação em transcateter é na artéria renal esquerda ou artéria renal direita do indivíduo.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem doença renal crônica.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a doença renal crônica está no estágio I, II, III, IV ou V da doença renal.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tratar a doença renal compreende reduzir ou prevenir a fibrose renal no indivíduo.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem recebido diálise pelo menos 1, 2 ou 3 vezes por semana por pelo menos 1 ou 2 semanas.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem diabetes tipo II.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem anomalias congênitas dos rins e trato urinário (CAKUT).
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma taxa de filtração glomerular (GFR) de menos do que 90 mL/min/1,73 m2, microalbuminúria ou macroalbuminúria.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as células não são administradas ao indivíduo.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem microvesículas.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem exossomas que são de cerca de 30-150nm de diâmetro.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um composto na superfície externa da mesma, na bicamada lipídica do mesmo, e/ou no lúmen do mesmo.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o composto atenua uma ou mais vias celulares.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o composto é uma proteína, uma molécula pequena ou polinucleotídeo.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é uma molécula de miRNA.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o composto não é produzido por células renais de ocorrência natural.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o composto é uma citoquina.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto artificial.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto que é usado para tratar uma doença renal.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização do inibidor-1 de ativação do plasminogênio (PAI-1) e/ou a sinalização do fator beta de crescimento transformador (TGFβ).
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização de Wnt canônica.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização de Wnt não canônica.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização mediada por CXCR4.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um composto que infrarregula uma citoquina inflamatória.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a citoquina inflamatória é IL8.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um composto que atenua a sinalização Notch.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o composto é uma molécula de superfície celular usada para imunofenotipagem de células.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o composto é CD9, CD63, CD81, CD133, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44 ou CD49e.
31. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o composto é um receptor de proteína.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o receptor de proteína é receptor relacionado ao retinoide (ROR4).
33. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o composto é um marcador do estágio de desenvolvimento.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o marcador do estágio de desenvolvimento é antígeno 4 embrionário estágio-específico (SSEA- 4).
35. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o composto é a proteína protetora do estresse.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a proteína protetora do estresse é a proteína de choque térmico (HSP) 70 ou HSP90.
37. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o composto é a proteína estrutural.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a proteína estrutural é TST101.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o composto é um miRNA e está nos lúmens das vesículas.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de regulação do ciclo celular.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o miRNA de regulação do ciclo celular é let7a, miR-143 ou miR22.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de modulação da senescência celular.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o miRNA de modulação da senescência celular é miR-34.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de modulação da migração celular.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o miRNA de modulação da migração celular é miR30-C.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de regulação do crescimento celular.
47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o miRNA de regulação do crescimento celular é miR194-2.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de modulação da via do sinal celular.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o miRNA de modulação da via do sinal celular é miR-142.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de modulação inflamatória.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o miRNA de modulação inflamatória é miR-10a.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de modulação da angiogênese.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o miRNA de modulação da angiogênese é miR-296 e/ou miR-146a.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o miRNA é um miRNA de modulação da atividade da quinase.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que o miRNA de modulação da atividade da quinase é miR-83.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17 ou 39, caracterizado pelo fato de que o composto é um miRNA que inibe PAI-1, TGFβ, a sinalização de Wnt canônica, a sinalização de Wnt não canônica, a sinalização mediada por CXCR4 e/ou a sinalização Notch.
57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 56, caracterizado pelo fato de que a fibrose renal é reduzida ou prevenida pela inibição da transição epitelial-para- mesenquimal (EMT).
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem miR-145, miR-22, miR-7, miR-10a, miR-143, e/ou let7b.
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem miR-1248, miR-3168, miR-7113-5p, miR-758-3p, miR- 937-3p, miR-4455, miR-4521, miR-203a-3p, miR-22-3p, miR-574-3p, miR-181b-5p, miR-1260b, e/ou miR-181b-5p.
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem CD9, CD63, CD81, CD133, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44, CD49e, e/ou SSEA-4.
61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem CD63, CD9, e/ou CD81, e os CD63, CD9, e/ou CD81 estão na superfície externa das vesículas.
62. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem CD133, CD326, e/ou CD49e, e os CD133, CD326, e/ou CD49e estão na superfície externa das vesículas.
63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, caracterizado pelo fato de que a proliferação de células renais contactadas pelas vesículas aumenta quando comparado com as células renais que não entram em contato com as vesículas.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizado pelo fato de que a formação de vasos pelas células endoteliais contactadas pelas vesículas aumenta quando comparado com as células endoteliais que não entram em contato com as vesículas.
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, caracterizado pelo fato de que a formação de túbulo néfrico das células renais contactadas pelas vesículas aumenta quando comparado com as células renais que não entram em contato com as vesículas.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, caracterizado pelo fato de que as vesículas compreendem um fosfolipídio, um esfingolipídio, colesterol, uma cerimida, e/ou fosfatidil colina.
67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que as vesículas estão em uma composição que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.
68. Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o veículo farmaceuticamente aceitável compreende uma solução aquosa.
69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizado pelo fato de que as vesículas foram secretadas por uma população celular renal primária.
70. Método de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que as células foram passadas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes.
71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 70, caracterizado pelo fato de que as vesículas foram secretadas por uma população celular renal enriquecida, em que a população celular renal enriquecida compreende células renais bioativas.
72. Método de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a população compreende: (a) uma população enriquecida de células tubulares; ou (b) uma população enriquecida de células tubulares e uma ou mais de células glomerulares e células vasculares.
73. Método de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizado pelo fato de que a população é derivada de uma população celular renal inicial e contém uma maior porcentagem de células tubulares as comparado com a população inicial.
74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a população compreende células glomerulares.
75. Método de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a população compreende células vasculares.
76. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 75, caracterizado pelo fato de que a população é não autóloga ao indivíduo.
77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 75, caracterizado pelo fato de que a população é autóloga ao indivíduo.
78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 75, caracterizado pelo fato de que a população é alogeneica.
79. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 78, caracterizado pelo fato de que as células da população são resistentes à hipoxia e/ou iodixanol.
80. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 79, caracterizado pelo fato de que as células na população expressam CK18 e/ou GGT1.
81. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 80, caracterizado pelo fato de que a população tem atividade enzimática de LAP e/ou GGT.
82. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 81, caracterizado pelo fato de que pelo menos 80% das células na população expressa GGT-1.
83. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 82, caracterizado pelo fato de que a população expressa VEGF e/ou KIM-1.
84. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 83, caracterizado pelo fato de que 4,5% a 81,2% das células na população expressam GGT-1, 3,0% a 53,7% das células dentro da população expressam AQP2, e 81,1% a 99,7% das células dentro da população expressam CK18.
85. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 84, caracterizado pelo fato de que a população é enriquecida por células renais tubulares comparado com uma cultura primária de células renais a partir de uma biopsia renal, e as células tubulares expressam espécies de peso molecular maior de ácido hialurônico (HA) tanto in vitro e in vivo, através das ações de ácido hialurônico sintase-2 (HAS-2).
86. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 85, caracterizado pelo fato de que a população de células renais bioativas tem uma proporção menor de células tubulares distais, células de duto coletor, células endócrinas, células vasculares, e/ou células do tipo progenitoras comparado com uma cultura primária de células renais a partir de uma biopsia renal.
87. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68 ou 70 a 86, caracterizado pelo fato de que ainda compreendem administrar vesículas secretadas por células renais primárias ao indivíduo.
88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 87, caracterizado pelo fato de que ainda compreendem administrar vesículas secretadas por células endoteliais ou células-tronco mesenquimais ao indivíduo.
89. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 88, caracterizado pelo fato de que ainda compreendem administrar vesículas de células não renais ao indivíduo.
90. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a vesícula de célula não renal foi secretada por uma célula progenitora endotelial não renal, uma célula- tronco mesenquimal não renal, ou uma progenitora derivada de adipose não renal.
91. Método para detectar pelo menos um composto em uma vesícula, caracterizado pelo fato de compreender obter a vesícula e detectar se pelo menos um composto está na vesícula, em que (i) pelo menos um composto é uma proteína, e a proteína é CD9, CD81, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44, CD49e, e/ou SSEA-4; (ii) pelo menos um composto compreende miRNAs, em que os miRNAs incluem pelo menos dois de miR-145, miR-22, miR-7, miR-10a, miR-143, e/ou let7b; e/ou (iii) pelo menos um composto não é expressado ou produzido por células renais em um rim nativo.
92. Método de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a vesícula é obtida em ou a partir de uma amostra biológica a partir de um indivíduo.
93. Método de acordo com a reivindicação 92,
caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é urina.
94. Método de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a vesícula é obtida em ou a partir de um sobrenadante de uma cultura de células renais.
95. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 94, caracterizado pelo fato de que a vesícula foi secretada por uma célula renal.
96. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 95, caracterizado pelo fato de que detectar se a proteína está na vesícula compreende um imunoensaio.
97. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 96, caracterizado pelo fato de que detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende contactar a vesícula, ou uma amostra processada suspeita de compreender ácidos nucleicos da vesícula, com sondas ou iniciadores que são complementares aos miRNAs.
98. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 97, caracterizado pelo fato de que detectar se os miRNAs estão na vesícula não compreende a análise de microarranjo.
99. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 97, caracterizado pelo fato de que detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende a análise de microarranjo com um microarrajo, em que o microarranjo compreende sondas para menor do que 1000, 500 ou 100 diferentes miRNAs.
100. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 99, caracterizado pelo fato de que detectar se os miRNAs estão na vesícula compreende uma reação em cadeia polimerase.
101. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 100, caracterizado pelo fato de que o composto é uma molécula pequena.
102. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 91 a 101, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto que é usado para tratar uma doença renal.
103. Método para monitorar o tratamento com uma população de células renais bioativas em um indivíduo que foi administrado com uma população de células renais bioativas, caracterizado pelo fato de que compreende detectar se pelo menos um composto está presente em uma vesícula a partir do indivíduo de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 91 a 102.
104. Método de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo fato de que compreende detectar se pelo menos um composto está presente em uma vesícula a partir do indivíduo de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 91 a 102 em um primeiro momento e um segundo momento.
105. Método de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato de que o primeiro momento é antes do indivíduo ter sido administrado com uma população de células renais bioativas e o segundo momento é depois do indivíduo ter sido administrado com uma população de células renais bioativas.
106. Método de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato de que o primeiro momento e o segundo momento serem depois do indivíduo ter sido administrado com uma população de células renais bioativas.
107. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 104 a 106, caracterizado pelo fato de que ainda compreende identificar um efeito regenerativo no indivíduo se o nível do composto for maior no primeiro momento comparado com o segundo momento.
108. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 104 a 106, caracterizado pelo fato de que ainda compreende identificar um efeito regenerativo no indivíduo se o nível do composto for maior do que um controle.
109. Método de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que o controle é o nível em um indivíduo correspondente que não foi administrado com uma população de células renais bioativas.
110. Método para identificar se uma vesícula é regenerativa, caracterizado pelo fato de que compreende (i) detectar se uma proteína e/ou miRNAs estão na vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 49-58; e (ii) identificar a vesícula como regenerativa se a proteína e/ou miRNAs forem detectadas na vesícula.
111. Método de detecção do nível de pelo menos um miRNA em vesículas a partir de uma população de células renais bioativas, caracterizado pelo fato de que compreende (i) detectar se uma ou mais das seguintes moléculas de miRNA está aumentada nas vesículas comparado a um controle: miR-1248, miR-3168, miR-362-5p, miR-7113-5p, miR-758-3p, miR- 937-3p, miR-4455, miR-4521, miR-203a-3p, miR-22-3p, miR-574-3p, miR-181b-5p, miR-1260b, e/ou miR-181b-5p; e (ii) detectar se uma ou mais das seguintes moléculas de miRNA está diminuída nas vesículas comparado a um controle: miR- 1-3p, miR-1-3p, miR-143-3p, miR-150-5p, miR-509-3p, miR-653-5p, miR-204-5p, miR-192-5p, e/ou miR-363-3p.
112. Método de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo fato de que a célula renal bioativa é célula renal selecionada.
113. Método de acordo com a reivindicação 111 ou 112, caracterizado pelo fato de que o controle é o nível de uma ou mais vesículas de moléculas de miRNA a partir de uma população celular renal primária.
114. Método de acordo com a reivindicação 111 ou 112, caracterizado pelo fato de que o controle é o nível de uma ou mais vesículas de moléculas de miRNA a partir de uma outra população de células renais bioativas.
115. Método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de vesículas a partir de uma preparação de vesículas, em que uma vesícula a partir da preparação de vesículas foi identificada como regenerativa de acordo com o método como definido na reivindicação 110.
116. Método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo uma população de células renais bioativas suplementada com vesículas de células renais que não foram secretadas pela população de células renais bioativas.
117. Método de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a população de células renais bioativas é a população de células renais selecionada.
118. Método de acordo com a reivindicação 116 ou 117, caracterizado pelo fato de que as vesículas da célula renal foram secretadas por uma população de células renais bioativas que tem a mesma origem e/ou contém os mesmos tipos celulares que a população de células renais bioativas na composição.
119. Método de alteração do nível de pelo menos um miRNA e/ou proteína em vesículas produzidas por uma população de células renais bioativas, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a população sob condições hipóxicas.
120. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que cultivar a população sob condições hipóxicas compreende cultivar a população na presença de menos do que 5% de oxigênio por pelo menos cerca de 8, 12, 16, 20, 24 ou 48 horas.
121. Método de acordo com a reivindicação 119 ou 120, caracterizado pelo fato de que ainda compreende passar as células renais bioativas pelo menos cerca de 1, 2 ou 3 vezes antes de cultivar a população sob condições hipóxicas.
122. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 119 a 120, caracterizado pelo fato de que (a) pelo menos um miRNA é miR-145, miR-22, miR-7, miR- 10a, miR-143, let7b, miR-1248, miR-3168, miR-7113-5p, miR-758-3p, miR-937-3p, miR-4455, miR-4521, miR-203a-3p, miR-22-3p, miR-574- 3p, miR-181b-5p, miR-1260b, e/ou miR-181b-5p; e/ou (b) pelo menos uma proteína é CD9, CD63, CD81, CD133, CD146, CD326, CD40, CD42a, CD44, CD49e, SSEA-4, TST101, HSP70, HSP90, e/ou ROR4.
123. Vesícula, caracterizada pelo fato de que compreende um composto que não é produzido por células renais em um rim nativo.
124. Vesícula de acordo com a reivindicação 123, caracterizada pelo fato de que o composto é uma proteína, uma molécula pequena ou polinucleotídeo.
125. Vesícula de acordo com a reivindicação 123 ou 124, caracterizada pelo fato de que o composto não é expressado ou produzido por células renais primárias que são cultivadas na ausência do composto.
126. Vesícula de acordo com a reivindicação 125,
caracterizada pelo fato de que o composto é um composto artificial.
127. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 126, caracterizada pelo fato de que o composto é um composto que é usado para tratar uma doença renal.
128. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 127, caracterizada pelo fato de que é uma microvesícula.
129. Vesícula de acordo com a reivindicação 128, caracterizada pelo fato de que é um exossoma.
130. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 129, caracterizada pelo fato de que está em uma composição que compreende células que produziram uma vesícula.
131. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 129, caracterizada pelo fato de que foi isolada a partir das células que a produziram.
132. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 131, caracterizada pelo fato de que é uma vesícula renal.
133. Vesícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 123 a 132, caracterizada pelo fato de que ela foi produzida pela célula renal bioativa.
134. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a vesícula como definida em qualquer uma das reivindicações 123 a 133 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
135. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma vesícula de célula renal e uma vesícula de célula não renal.
136. Composição de acordo com a reivindicação 135, caracterizada pelo fato de que a vesícula de célula renal foi secretada pela célula renal bioativa.
137. Composição de acordo com a reivindicação 135 ou 136, caracterizada pelo fato de que a vesícula de célula não renal foi secretada por uma célula progenitora endotelial não renal, uma célula- tronco mesenquimal não renal, ou uma progenitora derivada de adipose não renal.
138. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma vesícula produzida por uma célula renal primária e uma vesícula produzida por uma célula renal selecionada.
139. Método de tratamento de uma doença renal em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da composição como definido em qualquer uma das reivindicações 134 a 138.
140. Método de produção de um exossoma a partir de células, caracterizado pelo fato de que o exossoma compreende um composto que não é produzido pelas células, o método compreendendo isolar o exossoma de um sobrenadante de cultura celular, em que o sobrenadante de cultura celular é de uma cultura de células que foram colocadas em contato com o composto.
141. Método de produção de um exossoma renal, caracterizada pelo fato de que o exossoma compreende um composto que não é produzido pelas células renais em um rim nativo, o método compreendendo isolar uma vesícula de um sobrenadante de cultura de células renais, em que o sobrenadante de cultura de células renais é de uma cultura de células renais compreendendo uma população de células renais bioativas que foi contactada com o composto.
142. Método de acordo com a reivindicação 140 ou 141, caracterizado pelo fato de que o composto é um composto artificial.
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