CN111182921A - 用于治疗肾疾病的免疫豁免的生物活性肾细胞 - Google Patents

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Abstract

本文尤其提供了使用经遗传修饰的生物活性肾细胞群体为天然肾提供再生效果以治疗慢性肾疾病的组合物和方法。在某些实施方案中，目的是有效提供“通用供体”免疫豁免的肾细胞群体，其中将基因编辑用于产生经修饰的同种异体肾细胞群体以在无免疫抑制的情况下施用于患者。

Description

用于治疗肾疾病的免疫豁免的生物活性肾细胞
对相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月21日提交的美国临时申请No.62/523,241的优先权权益，其全部内容通过引用完整并入本文。
通过引用并入序列表
于2018年6月21日创建的大小为88,654字节的命名为“050400-516001WO_SEQUENCE_LISTING.txt”的序列表文本文件的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明尤其涉及用于治疗肾疾病的细胞、组合物和方法。某些方面涉及开发用于治疗患有肾疾病的受试者的遗传工程化的，优选非同种反应性(non-alloreactive)的生物活性肾细胞群体的组合物和方法，以及使用选定的肾细胞群体为天然肾脏提供再生效果的方法。
发明背景
由于组织和器官的再生现在处于现代医学的技术范围内，基于肾细胞的疗法吸引了近期的兴趣(Ludlow等人The Future of Regenerative Medicine：UrinarySystem.Tissue Engineering.2012；18：218-24)。已经描述了涉及组织工程和基于细胞的应用的新治疗范例，它们提供了实质性和持久性的肾功能增强，减慢疾病进程并改善此患者群体中的生活质量。这些下一代再生医学技术提供了分离的肾细胞作为慢性肾疾病(CKD)的治疗选择。Presnell等人WO/2010/056328和Ilagan等人PCT/US2011/036347描述了分离的生物活性肾细胞，及其分离和培养方法，以及周细胞群体治疗的方法。在非临床研究中，将这些生物活性肾细胞注射入接受体肾脏中已导致动物存活和肾功能的显著改善，如例如通过尿液浓度和过滤功能证明的。
当前使用选定肾细胞治疗患者的方案基于自体细胞转移。在这种方法中，从患者中回收生物活性肾细胞，进行离体选择，体外培养，以便在必要时扩增细胞数目，并最终输注入患者中。每个患者使用患者自己的肾细胞接受个别制作的治疗(即自体疗法)。自体疗法在实际应用中面临着巨大的技术和后勤障碍，其产生需要昂贵的专用设施和专家人员，它们必须在患者诊断后的短时间内产生，并且在某些情况下，根据疾病进展的程度，患者的细胞可能功能不佳和/或以极少数目存在。由于这些障碍，自体细胞制备可在功效和安全性方面有实质性差异。
发明概述
本文尤其提供了用于治疗患有肾疾病的受试者的具有降低的免疫原性的细胞。在某些实施方案中，将通常不会对患者施用(例如由于可能的炎症和免疫系统排斥)的源自供体的细胞遗传修饰为在患者中有用(例如，使得细胞将持续存在并促进改善的肾功能)。本文还包括产生此类细胞的方法。
一方面，本文提供了产生经遗传修饰的生物活性肾细胞(BRC)的方法。在某些实施方案中，经遗传修饰的BRC是经基因组修饰的BRC(即，其基因组中具有遗传修饰的BRC)。在某些实施方案中，经遗传修饰的BRC包含表达降低BRC中基因组免疫原性基因表达的RNA干扰(RNAi)分子的外源多核苷酸(例如质粒或病毒载体)。在某些实施方案中，RNAi分子是短干扰RNA分子或短发夹RNA分子。在某些实施方案中，方法包括遗传修饰BRC中的基因组免疫原性基因。
在某些实施方案中，基因编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质。在某些实施方案中，基因是β-2微球蛋白(B2M，也称为β2M)、人白细胞抗原(HLA)-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1或HLA-DQB1基因。
在某些实施方案中，基因编码次要组织相容性抗原(MiHA或mHA)。在某些实施方案中，基因是HA-1、HA-2、HA-8、HB-1、HY-A1、HY-A2、HY-B7、HY-B8、HY-B60或HY-DQ5基因。
在实施方案中，可以修饰(例如，删除)或用RNA干扰靶向本文提及的基因(例如，HLA基因，B2M或mHA基因)的任何等位变体。
在某些实施方案中，遗传修饰基因包括突变基因。在某些实施方案中，突变基因包括删除基因或其一部分。
在某些实施方案中，遗传修饰细胞包括突变B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1和/或HLA-DQB1基因中的两种或更多种的任何组合。
在某些实施方案中，经遗传修饰的BRC是经遗传修饰的原代肾细胞。在某些实施方案中，在遗传修饰之前或之后，经遗传修饰的原代肾细胞已经传代至少约1、2、3、4、5或更多次。在某些实施方案中，方法还包括从经遗传修饰的BRC获得SRC。在某些实施方案中，获得SRC，然后进行遗传修饰。
在某些实施方案中，BRC在BRC群体中。在某些实施方案中，BRC是选定的肾细胞(SRC)。在某些实施方案中，SRC在SRC群体中。本文公开了SRC的各种非限制性实例。在某些实施方案中，SRC是小管细胞(tubule cell)。在某些实施方案中，小管细胞是近端小管细胞。在某些实施方案中，SRC是内分泌细胞、血管细胞或肾小球细胞(glomerular cell)。在某些实施方案中，SRC的群体包含低氧(hypoxia)耐受性和碘克沙醇(iodixanol)耐受性的细胞。在某些实施方案中，SRC群体包含表达透明质酸合酶-2(hyaluronic synthase-2)的细胞。在某些实施方案中，SRC群体包含能够进行受体介导的白蛋白转运(receptor-mediated albumin transport)的细胞。在某些实施方案中，SRC的特征在于表达CK18和GGT1。在某些实施方案中，PrestoBlue的代谢以及VEGF和KIM-1的产生用作存活且具有功能的后代的存在的标志物。在某些实施方案中，通过肾活组织检查获得BRC。
在某些实施方案中，在BRC群体内遗传修饰BRC，其中BRC群体中的少于全部的细胞被遗传修饰。在某些实施方案中，方法还包括从BRC群体中分离或富集经遗传修饰的BRC。在某些实施方案中，方法还包括从SRC群体中分离或富集经遗传修饰的SRC。在某些实施方案中，对BRC(例如SRC)群体进行遗传修饰以产生BRC群体，其中一些细胞被遗传修饰，并且其他细胞未被修饰。在某些实施方案中，一些经遗传修饰的细胞对于修饰是纯合的。在某些实施方案中，一些经遗传修饰的细胞对于修饰是杂合的。在某些实施方案中，富集或选择对于修饰而言纯合的细胞。在某些实施方案中，富集或选择对于修饰而言杂合的细胞。在某些实施方案中，富集或选择对于修饰而言纯合或杂合的细胞。在某些实施方案中，修饰是减少由基因编码的蛋白质表达的突变。在某些实施方案中，突变降低经修饰的细胞表面上蛋白质的水平。在某些实施方案中，消减或排除表达蛋白质的细胞。在某些实施方案中，突变降低细胞表面上的MHC I类分子和/或MHC II类分子的水平。在某些实施方案中，具有突变的细胞在细胞表面上没有I类MHC分子和/或II类MHC分子。在某些实施方案中，消减或排除在细胞表面上表达MHC I类分子的细胞。在某些实施方案中，消减或排除在细胞表面上表达II类MHC分子的细胞。在某些实施方案中，使用细胞分选方法从群体中除去表达蛋白质、MHC I类分子和/或MHC II类分子的细胞。在某些实施方案中，细胞分选方法包括与蛋白质、MHC I类分子和/或MHC II类分子结合的试剂(例如抗体)。在某些实施方案中，细胞的消减或选择包括珠/抗体偶联，以拉出细胞表面上具有某些蛋白质的细胞。在某些实施方案中，细胞分选方法是磁激活细胞分选(MACS)或荧光激活细胞分选(FACS)。在某些实施方案中，选择用于遗传修饰的基因是如下的基因，其蛋白质在细胞表面上表达，因此FACS和/或MACS技术可以区分(例如，基于结合到表面上的抗体)活细胞。在实施方案中，使用MAC从不表达MHC分子(例如，I类MHC分子或II类MHC分子)的细胞除去表达MHC分子的细胞。在某些实施方案中，整合或非整合载体可用于表达另一种HLA组分多肽，以进一步修饰或调节适应性或先天性免疫系统，例如，以防止天然杀伤(NK)细胞的靶向和裂解。
在某些实施方案中，遗传修饰(例如，突变)基因包括(i)在BRC中表达基因编辑蛋白；或者(ii)递送基因编辑蛋白穿过BRC的细胞膜。在某些实施方案中，基因编辑蛋白是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(transcription activator-like effectornuclease)(TALEN)，megaTAL或RNA引导的内切核酸酶。在某些实施方案中，RNA引导的内切核酸酶是Cas蛋白。在某些实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白。在某些实施方案中，遗传修饰基因还包括(i)在BRC中表达引导RNA(gRNA)；或(ii)将引导RNA(gRNA)递送穿过BRC的细胞膜。在某些实施方案中，Cas9蛋白和gRNA是核糖核蛋白复合体(ribonucleoproteincomplex)的一部分。
在某些实施方案中，产生经基因组修饰的BRC的方法包括遗传修饰BRC中的基因组免疫原性基因以产生经基因组修饰的BRC，然后培养经修饰的BRC以产生在基因中具有遗传修饰的后代。在某些实施方案中，与在基因中不含遗传修饰的相应细胞相比，后代具有降低的免疫排斥潜力。在某些实施方案中，方法包括扩增后代。在某些实施方案中，扩增后代包括使后代传代至少1、2、3、4或5次。在某些实施方案中，在每次细胞传代时监测细胞生长动力学和/或存活力。在某些实施方案中，测定扩增后代的存活力。在某些实施方案中，测定扩增细胞的数目。在某些实施方案中，通过锥虫蓝染料排除和PrestoBlue代谢来监测后代的细胞计数和存活力。在某些实施方案中，通过基因表达概况分析(profiling)或酶促活性的测量来评估BRC或SRC功能性。在某些实施方案中，测量LAP和/或GGT的酶促活性。
在某些实施方案中，从转染的mRNA表达基因编辑蛋白。在某些实施方案中，从转染的mRNA表达Cas蛋白，并且从质粒DNA表达gRNA。在某些实施方案中，通过包括经修饰的核酸碱基或聚腺苷酸化序列来稳定转染的mRNA。在某些实施方案中，转染的mRNA与至少一种细胞穿透肽偶联。在某些实施方案中，从DNA载体表达Cas蛋白。在某些实施方案中，在细胞中表达gRNA的至少部分时间期间诱导Cas蛋白的表达。在某些实施方案中，DNA载体不整合在基因组中。在某些实施方案中，DNA载体是附加型载体(episomal vector)。在某些实施方案中，DNA载体是转座子。在某些实施方案中，gRNA是来自DNA载体的转录物。在某些实施方案中，基因编辑蛋白是重组蛋白，并与gRNA离体复合。在某些实施方案中，基因编辑蛋白是重组蛋白，并与gRNA离体复合，并且通过转染、脂质转染(1ipofection)、电穿孔、显微注射或本领域技术人员已知的其他方法将蛋白质/gRNA复合物递送至细胞。在某些实施方案中，将编码选择标志物和/或针对靶定基因的特异性突变的其他核酸元件与Cas9蛋白/gRNA复合物一起导入细胞中。
在某些实施方案中，遗传修饰基因减少所述细胞表面上的MHC I类的量。在某些实施方案中，遗传修饰基因减少所述细胞表面上的MHC II类的量。在某些实施方案中，方法包括遗传修饰两种或更多种基因，其中基因中的至少一种编码MHC I类分子内的蛋白质，并且基因中的至少一种编码MHC II类分子内的蛋白质。在某些实施方案中，基因中的至少一种是HLA基因。
一方面，本文提供了可通过本文公开的方法获得的工程化(例如，经遗传修饰的)BRC群体。在某些实施方案中，经遗传修饰的BRC群体是经基因组修饰的BRC群体。在某些实施方案中，群体包括遗传未修饰的细胞和经遗传修饰的细胞两者。在某些实施方案中，对群体富集工程化BRC。在某些实施方案中，工程化BRC对于遗传修饰是纯合的。
一方面，本文提供了工程化的(例如，经遗传修饰的)BRC，其在编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质的基因中包含突变。在某些实施方案中，已经删除基因的至少一部分，其中基因是B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1或HLA-DQB1基因。在某些实施方案中，工程化BRC在BRC群体中。在某些实施方案中，经遗传修饰的BRC群体是经基因组修饰的BRC群体。在某些实施方案中，群体包含遗传未修饰的细胞和经遗传修饰的细胞两者。在某些实施方案中，对群体富集工程化BRC。在某些实施方案中，工程化BRC对于遗传修饰是纯合的。
一方面，本文提供了用于治疗患者中的肾疾病的方法，所述方法包括向患者施用BRC群体，其中BRC群体包含工程化BRC，其中工程化BRC在编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质的基因中包含突变。
在某些实施方案中，肾疾病是慢性肾疾病。
在某些实施方案中，BRC群体是SRC群体。在某些实施方案中，SRC群体衍生自患者。在某些实施方案中，SRC群体源自一个或多个供体。在某些实施方案中，在暴露于低氧培养条件后获得SRC群体。在某些实施方案中，在扩增的肾细胞的密度梯度分离后获得SRC群体。在某些实施方案中，SRC群体表现出大于约1.04、1.0419或1.045g/mL的浮力密度(buoyantdensity)。在某些实施方案中，与起始肾细胞群体相比，SRC群体含有更大百分比的一种或多种细胞类型并且缺少或缺乏一种或多种其他细胞类型。
一方面，本文提供了可注射配制剂。在某些实施方案中，配制剂包含a)温度敏感性细胞稳定化生物材料，和b)BRC群体，其中所述BRC群体包括工程化BRC，其中所述工程化BRC在编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质的基因中包含突变。在某些实施方案中，温度敏感性细胞稳定化生物材料是水凝胶，所述水凝胶(i)在约8℃以下维持基本上固体状态，其中所述基本上固体状态是凝胶状态，(ii)在约环境温度以上维持基本上液体状态，并且(iii)在约8℃和约环境温度以上之间具有固体至液体过渡状态。
在某些实施方案中，水凝胶包含重组起源的胞外基质蛋白，衍生自源自肾脏或另一种组织或器官的胞外基质，或包含明胶。在某些实施方案中，水凝胶包含明胶。在某些实施方案中，明胶衍生自I型，αI胶原。在某些实施方案中，明胶衍生自猪I型，αI胶原或重组人I型，αI胶原。在某些实施方案中，BRC群体是选定的肾细胞(SRC)群体，并且工程化BRC是工程化SRC。
一方面，本文提供了治疗患者中的肾疾病的方法，该方法包括将包含本文公开的工程化BRC的配制剂注射入患者中，其中通过18至30号针注射配制剂。在某些实施方案中，针具有约27号、约26号、约25号、约24号、约23号、约22号、约21号或约20号的直径。
本发明公开了通过使用RNA引导的内切核酸酶，例如Cas9/聚簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)，将BRC遗传工程化为可从供体获得的免疫原性透明的同种异体BRC，使它们适合于治疗目的的方法。本文提供的方法更具体地允许通过失活和/或替换参与BRC免疫识别的基因(例如MHC识别和/或免疫检查点蛋白)来精确修饰与肾组织再生相关的BRC基因组，从而允许在无免疫清除的情况下以同种异体植入物掺入这些细胞。
一方面，本文提供了制备经基因组修饰的免疫豁免(immunoprivileged)的生物活性肾细胞群体的方法，其包括以下步骤：(a)遗传修饰BRC或SRC，包括在细胞内导入和/或表达RNA引导的内切核酸酶；以及特异性引导RNA，其将内切核酸酶引导至BRC或SRC基因组中的至少一个靶定的免疫原性基因；并且(b)扩增具有低或降低的免疫排斥潜力的所得的免疫豁免的细胞。在某些实施方案中，RNA引导的内切核酸酶是Cas9。可以从转染的mRNA表达RNA引导的内切核酸酶，或者可以从转染的mRNA表达RNA引导的内切核酸酶，并且从质粒DNA表达gRNA。在某些实施方案中，通过包括经修饰的核酸碱基或聚腺苷酸化序列来稳定化转染的mRNA。在某些实施方案中，转染的mRNA与至少一种细胞穿透肽偶联。在方法的某些实施方案中，从DNA载体表达内切核酸酶。可以在将引导RNA产生到细胞中时诱导内切核酸酶的表达。在某些实施方案中，DNA载体不整合在基因组中。DNA载体可以是附加型载体、人工染色体或转座子。在某些实施方案中，引导RNA是来自DNA载体的转录物。在某些实施方案中，Cas蛋白是与含有限定突变的引导RNA和/或DNA靶向构建体离体复合的纯化的重组蛋白。在某些实施方案中，通过电穿孔将Cas/gRNA复合物或质粒导入细胞中。
在某些实施方案中，至少一种靶定的免疫原性基因编码一种或多种控制I类MHC的基因。在某些实施方案中，至少一种靶定的免疫原性基因编码一种或多种控制MHC II类的基因。在某些实施方案中，至少一种靶定的免疫原性基因编码一种或多种控制I类MHC和II类MHC的基因。在某些实施方案中，至少一种靶定的基因座可以编码HLA基因。在某些实施方案中，HLA基因选自下组：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3/4/5、HLA-DQ家族基因(例如，HLA-DQA1和/或HLA-DQB1)和HLA-DP家族基因(例如HLA-DPA1和/或HLA-DPA2)。
在某些实施方案中，在BRC(例如，SRC)中抑制MHC使得能够开发用于慢性肾疾病(RD)的现成的同种异体组织工程化/再生药物产品。在某些实施方案中，通过敲低SRC的表面中I类MHC创建经修饰的BRC(例如，经修饰的SRC，例如通用供体SRC)。在某些实施方案中，使用基因编辑(例如CRISPR/Cas-9基因编辑)靶向(例如突变，例如通过删除其部分或全部或通过编辑碱基对或通过引入外源DNA，例如选择标志物和/或经修饰的基因组片段)MHC I类复合物的B2M或HLA-A(α亚基)成分。
在方法的某些实施方案中，在体外扩增经遗传修饰的BRC。在某些实施方案中，方法用于制备要用作药物的BRC或SRC。在某些实施方案中，方法用于制备BRC或SRC以治疗有此需要的患者中的慢性肾疾病。
一方面，提供了可通过本文公开的方法获得的工程化BRC或SRC群体。
一方面，本文包括用于治疗患者的方法，该方法包括：(a)根据上述方法制备经遗传修饰的BRC或SRC群体；并且(b)向患者施用经遗传修饰的BRC或SRC。在某些实施方案中，患者诊断患有慢性肾疾病。在某些实施方案中，BRC或SRC源自待治疗的患者。在某些实施方案中，BRC或SRC源自一个或多个供体。
一方面，在富集能够肾再生的细胞的培养条件下从肾组织中分离和扩增肾细胞来获得生物活性肾细胞群体。在某些实施方案中，在暴露于低氧培养条件后获得生物活性肾细胞群体。在某些实施方案中，BRC群体是在扩增的肾细胞的密度梯度分离后获得的SRC群体。在某些实施方案中，SRC表现出大于约1.04、1.0419或1.045g/mL的浮力密度。在某些实施方案中，与起始肾细胞群体相比，BRC或SRC群体含有更大百分比的一种或多种细胞群体，并且缺少或缺乏一种或多种其他细胞群体。在某些实施方案中，可以在每次细胞传代时监测BRC或SRC群体的细胞生长动力学。例如，可通过锥虫蓝染料排除(Trypan Blue dyeexclusion)和PrestoBlue代谢来监测BRC或SRC计数和存活力。在某些实施方案中，BRC或SRC可以通过特异性存活力和功能性标志物例如CK18和GGT1的表型表达来表征。在某些实施方案中，VEGF和KIM-1的产生可以用作存活且具有功能的BRC或SRC的存在的标志物。在某些实施方案中，可以通过基因表达概况分析(gene expression profiling)或酶促活性的测量来建立存活力和功能性。在某些实施方案中，通过测量针对LAP和/或GGT的酶促活性来表征BRC或SRC。
本发明包括但不限于分离的细胞或细胞群体，其包含本文(例如，在发明概述、发明详述、实施例和附图)阐述的遗传修饰，以及任何蛋白质、多肽或载体，它们可用于实施肾细胞的基因组修饰以使它们具有较小的免疫原性(例如免疫豁免)。本文中提供的经修饰的肾细胞可以在用于治疗或预防慢性肾疾病的方法中用作治疗产品，理想地用作“现成的”产品(例如，可用于在许多患者中使用，若不是大多数或所有患者的话)。
附图简述
图1：用于产生工程化的人同种异体肾细胞的生产计划的流程图表示，所述细胞要用于治疗慢性肾疾病。
图2：总体NKA制造过程的非限制性实例的流程图。
图3A-D：提供图2中描绘的非限制性示例过程的进一步细节的流程图。
图4：MHC I类复合物的草图。
图5：在B2M基因处的基因组支架，其显示了引导RNA结合的位点。
图6：FACS显示了CRISPR/Cas9介导的人原代肾细胞中B2M(MHC-1的不变亚基)的敲低。
图7：FACS显示了CRISPR/Cas9介导的人原代肾细胞中B2M(MHC-1的不变亚基)的敲低。
图8：来自基因组切割测定法的图像，证明了B2M基因座处成功的基因编辑。显示的印迹是溴化乙啶染色的DNA凝胶，为了清楚起见白色/黑色颠倒。在非限制性实例中，基因组切割测定法或靶定基因座的直接测序可用于确认靶向基因组修饰。
图9：FACS输出，证明了CRISPR介导的SRC中B2M基因座的编辑。注意不同的供体ABO单倍型，显示了进行MHC-1基因编辑的能力不依赖于ABO单倍型：
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图10：来自淋巴细胞增殖测定法的图，证明了相对于未修饰的对照SRC，经B2MCRISPR修饰的SRC降低了淋巴细胞增值，提供了B2M的CRISPR靶向降低了经CRISPR修饰的SRC的免疫原性的证据。
图11：来自经B2M CRISPR修饰的SRC的效力测定法测试的图，显示经修饰的和未修饰的SRC之间VEGF和KIM1的分泌没有显著差异。CRISPR修饰不影响SRC的功能性。
图12：显示人类6号染色体上的HLAMHC复合物的草图。
图13：显示培养中的示例性人肾细胞形态的草图。
图14：显示通过穿过密度边界离心进行的示例性SRC显带的图像。
图15：显示用于胶凝的示例性明胶溶液温度概况的图。
图16：显示在NKA胶凝过程中作为旋转时间的函数的示例性细胞分布的图。
发明详述
本文尤其提供用于获得可用于许多患者的肾细胞群体的配制剂和方法。在某些实施方案中，群体的免疫原性低于其来源的群体。在某些实施方案中，使用基因编辑产生要在无免疫抑制的情况下对患者施用的同种异体肾细胞群体。本文包括来自不同组织类型或供体的合适供体细胞，无论免疫原性基因单倍型差异如何，它们都可以成功移植到接受体受试者中。
理想地，想要使用标准化疗法，其中可以预先制备同种异体治疗细胞，进行详细表征，并且可用于立即向患者施用。不幸的是，由于人群体中的单倍型异质性，在一个或多个免疫原性基因基因座处具有匹配等位基因的合适供体细胞的可用性受到限制。例如，HLA是在早期骨髓造血干/祖细胞移植(HSCT)临床治疗期间首先鉴定的免疫原性基因。供体和接受体受试者之间的HLA错配可以引起免疫反应，其中接受体T细胞可以通过识别在同种异体供体细胞表面上表达或呈现的HLA蛋白或供体特异性抗原，将进入的供体同种异体组织识别为外来物，最终导致移植排斥。(Bhatia S.Expert Rev Hematol.2011；4(4)：437-452；Garnett C等人TherAdv Hematol.4(6)：366-78(2013))。尽管在医学领域中抑制对同种异体移植的供体细胞的免疫应答取得了进步，但是仍然需要可以减少排斥和/或改善供体细胞的免疫相容性的其他方法和组合物。最值得注意的是，仍然需要改善合适的供体细胞的可用性，无论免疫原性基因单倍型的差异如何，所述供体细胞可以成功移植到接受体受试者中。
克服细胞移植的免疫学障碍的一种方法是HLA分子的遗传操作。通过使用锌指核酸酶，Torikai及同事选择性消除胚胎干细胞(ESC)中的人白细胞抗原(HLA)I类，并证明HLA-A细胞可以逃脱来自HLA限制的细胞毒性T淋巴细胞的裂解。(Oberg L等人，Eur JImmunol.，2004，34(6)：1646-1653)。在另一项研究中，Riolobos及同事破坏B2M，其编码MHCI类分子的辅助链，并且是其表面表达所需要的(Laura Riolobos等人，2013，21(6)：1232-1241)。B2M基因的纯合删除阻止I类人白细胞抗原(HLA)分子的表面移位并降低免疫原性。最近，已显示了哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9系统的发现和应用导致靶基因的有效且精确的编辑，例如通过非同源末端连接途径(NHEJ)、同源性指导的修复(HDR)或其他DNA修复途径。(Gasiunas，Barrangou等人2012；Jinek，Chylinski等人2012)。Cas9分子与靶标特异性引导RNA(gRNA)分子的共递送有助于基因组中靶序列的基因编辑。因此，使用CRISPR/Cas9系统修饰细胞中的基因也是增加供体细胞的免疫相容性以移植到接受体受试者的有希望的策略。(WO2016201047 A1)。
与一种细胞类型(例如胚胎干细胞)的免疫原性有关的实验无法预测地应用于或转化到另一种细胞类型(例如肾细胞)。令人惊讶地，敲除一些B2M表达也敲低肾细胞群体的免疫原性。此外，尽管在经修饰的细胞群体中保留了一些B2M表达，但仍观察到免疫原性降低。本文包括基因编辑技术以修饰BRC(例如SRC)的适应性免疫系统，以创建通用的供体细胞来治疗肾疾病。在某些实施方案中，免疫原性是触发适应性(例如T细胞介导的)免疫应答的能力。
本发明的方面至少部分涉及以下发现：可以遗传修饰来自具有一种单倍型的供体的SRC，以使它们在具有不同单倍型的受试者中具有较小的免疫原性。本文包括无论免疫原性基因单倍型差异如何，都可以成功移植到接受体受试者中的经遗传修饰的SRC，以及用此类经修饰的SRC治疗肾疾病的方法和配制剂。
现在将详细提及本发明的某些实施方案。尽管将结合示例性实施方案描述本发明，但是应当理解，它们并不旨在将本发明限制于那些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可以包括在由权利要求书限定的本发明的范围内的所有替代、修改和等同方案。本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料，它们可用于实施本发明。本发明决不限于所描述的方法和材料。
整个公开内容中引用的所有参考文献均通过引用明确地完整并入本文。若并入的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则应以本申请为准。
定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Principles of Tissue Engineering，第3版(R Lanza，RLanger，&J Vacanti编)，2007为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指南。本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料，其可用于实施本发明。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
如本文中所用，单数形式“一个/种”和“该/所述”意图也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。如本文中所用，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项的任何和所有组合。
当在本说明书和权利要求书中使用时，词语“包含”和“包括”旨在规定所陈述的特征、整数、组分或步骤的存在，但它们不排除一个或多个其它特征、整数、组分、步骤或它们的组的存在或添加。
如本文中所用，术语“约”在数值或范围的上下文中指叙述或要求保护的数值或范围的±10％，除非上下文要求更有限的范围。
如本文所用，术语“细胞群体”是指通过直接从合适的组织来源(通常从哺乳动物)中分离获得的许多细胞。例如，细胞群体可以包括肾细胞群体及其混合物。分离的细胞群体可随后在体外培养。本领域普通技术人员将理解用于分离和培养供本公开内容使用的细胞群体的各种方法以及适合于本公开内容使用的细胞群体中的各种细胞。细胞群体可以是从器官或组织，例如肾衍生的未分级的异质细胞群体或富集的同质的细胞群体。例如，异质细胞群体可以从组织活组织检查或整个器官组织中分离。或者，异源细胞群体可以衍生自哺乳动物细胞的体外培养物，从组织活组织检查或整个器官组织建立。未分级的异质细胞群体也可以称为非富集的细胞群体。在某些实施方案中，细胞群体包含生物活性细胞。与未分级的异质细胞群体相比，同质细胞群体包含更大比例的相同类型的细胞，它们共享共同表型或具有相似物理特性。例如，可以从异质肾细胞群体中分离，提取或富集同质细胞群体。在某些实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面离心分离异质细胞悬浮液来以细胞级分形式获得同质细胞群体。在某些实施方案中，使用异质细胞悬浮液的连续或不连续(单步或多步)密度梯度分离以细胞级份形式获得同质细胞群体。在某些实施方案中，将源自肾的同质或异质细胞群体与源自肾以外的组织或器官(没有进一步限制)的同质或异质细胞群体混合。
如本文所用，术语“生物活性的”是指“拥有生物学活性”，例如药理或治疗活性。在某些实施方案中，生物活性是增强肾功能和/或对肾稳态的影响。在某些实施方案中，生物学活性是但不限于止痛；抗病毒；抗炎；抗肿瘤；免疫刺激；免疫调节；增强细胞存活力、抗氧化、氧载体、细胞募集、细胞附着、免疫抑制、血管生成、伤口愈合活性、宿主干细胞或祖细胞动员、细胞增殖、刺激细胞迁移至损伤部位、改善细胞和组织纤维化、干扰上皮-间充质信号传导级联、细胞因子、生长因子、蛋白质、核酸、外来体、微泡或其任何组合的分泌。
如本文所用，术语“生物活性肾细胞”或“BRC”是指当施用于受试者的肾中时具有以下一种或多种性质的肾细胞：减轻(例如减慢或停止)慢性肾疾病或其症状的恶化或进展的能力、增强肾功能的能力、影响(改善)肾稳态的能力和促进肾组织或肾的愈合、修复和/或再生的能力。在某些实施方案中，遗传修饰BRC(例如基因组修饰和/或经由RNAi修饰)，使得它们在患者中的免疫原性小于它们在没有遗传修饰的情况下的免疫原性。在某些实施方案中，不管患者的单倍型如何，可以对患者施用BRC。在某些实施方案中，BRC是经遗传修饰的(例如经基因组修饰和/或经由RNAi修饰)免疫豁免的细胞，其能够增强肾功能，影响(改善)肾稳态，和/或促进肾组织或肾的治愈、修复和/或再生而无免疫排斥。在某些实施方案中，这些细胞可以包括功能性肾小管细胞(例如，基于肌酸酐排泄和蛋白质保留的改善)、肾小球细胞(例如，基于蛋白质保留的改善)、血管细胞和皮质肾小管交界的其它细胞。在某些实施方案中，从来自肾组织的肾细胞的分离和扩增获得BRC。在某些实施方案中，使用选择生物活性细胞(例如具有再生能力的细胞)的方法从来自肾组织的肾细胞的分离和扩增获得BRC。在某些实施方案中，BRC对肾具有再生作用。在某些实施方案中，BRC包含选定的肾细胞(SRC)，基本上由选定的肾细胞(SRC)组成或由选定的肾细胞(SRC)组成。在某些实施方案中，BRC是SRC。例如，在Presnell等人WO/2010/056328、Ilagan等人PCT/US2011/036347和Jain等人PCT/US2016/044866中公开了获得生物活性肾细胞(BRC)的方法。
在某些实施方案中，SRC是从来自合适的肾组织来源的肾细胞的分离和扩增获得的细胞，其中与起始肾细胞群体相比，SRC包含更高百分比的一种或多种细胞类型并且缺乏一种或多种其它细胞类型或具有更低百分比的一种或多种其它细胞类型。在某些实施方案中，与起始肾细胞群体相比，SRC含有增加比例的BRC。在某些实施方案中，SRC群体是富集了特定生物活性成分和/或细胞类型和/或消减了特定的非活性和/或不希望的成分或细胞类型的肾细胞的分离群体，用于治疗肾疾病，即提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。在某些实施方案中，遗传修饰SRC(例如基因组修饰和/或经由RNAi修饰)，使得它们在患者中的免疫原性小于它们在没有遗传修饰的情况下的免疫原性。在某些实施方案中，不管患者的单倍型如何，可以对患者施用SRC。在某些实施方案中，SRC已经是经遗传修饰的(例如经基因组修饰和/或经由RNAi修饰)以使它们变得免疫豁免或不能排斥并且能够提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。与起始群体相比，SRC提供卓越的治疗和再生结果。在某些实施方案中，经由肾活组织检查从患者的肾皮质组织获得SRC。在某些实施方案中，SRC基于它们的一种或多种标志物的表达来选择(例如，通过MACS或FACS)。在某些实施方案中，基于细胞类型上的一种或多种标志物的表达来对SRC消减(例如，通过MACS或FACS)一种或多种细胞类型。在某些实施方案中，细胞的消减或选择包括珠/抗体偶联以拉出在细胞表面上具有某些蛋白质的细胞。在某些实施方案中，从生物活性肾细胞群体选择SRC。在某些实施方案中，通过扩增的肾细胞的密度梯度分离来选择SRC。在某些实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面的离心或单步不连续步骤梯度分离分离扩增的肾细胞来选择SRC。在某些实施方案中，通过对已经在低氧条件下培养的扩增肾细胞进行连续或不连续密度梯度分离来选择SRC。在某些实施方案中，通过已经在低氧条件下培养至少约8、12、16、20或24小时的扩增肾细胞的密度梯度分离来选择SRC。在某些实施方案中，通过已经在低氧条件下培养的扩增肾细胞的跨越密度边界、屏障或界面的离心分离来选择SRC。在某些实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面(例如单步不连续密度梯度分离)的离心分离已经在低氧条件下培养至少约8、12、16、20或24小时的扩增肾细胞来选择SRC。在某些实施方案中，SRC主要由肾小管细胞组成。在某些实施方案中，SRC中可以存在其它实质细胞(例如，血管)和基质细胞(例如，收集导管)。在某些实施方案中，SRC群体中小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是血管细胞。在某些实施方案中，SRC群体中小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是收集导管细胞。在某些实施方案中，SRC群体中小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是血管或收集导管细胞。例如，在本文的实施例1、Presnell等人WO/2010/056328、Ilagan等人PCT/US2011/036347和Jain等人PCT/US2016/044866中公开了获得SRC的方法。
术语“天然器官”应指活体受试者的器官。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可以患有与该特定器官相关的疾病。
术语“天然肾”应指活体受试者的肾。受试者可以是健康的或不健康的。不健康的受试者可以患有肾疾病。
术语“再生效果”应指为诸如肾的天然器官提供益处的效果。效果可包括但不限于对天然器官或结构的损失程度降低或天然器官功能的改善、恢复或稳定化。肾损伤可以是纤维化、炎症、肾小球肥大、萎缩等形式，并且与受试者的天然器官有关的疾病有关。
如本文在细胞群体的背景中所用，术语“混合物”是指自未分级的异质细胞群体衍生的两个或更多个分离的富集的细胞群体表型的组合。根据某些实施方案，本发明的细胞群体是肾细胞群体。
“富集的”细胞群体或制品是指自起始器官细胞群体(例如，未分离的异质细胞群体)衍生的细胞群体，其包含的特定细胞类型的百分比大于起始群体中该细胞类型的百分比。例如，起始肾细胞群体可以富集感兴趣的第一、第二、第三、第四、第五等细胞群体。如本文所用，术语“细胞群体”、“细胞制备”和“细胞表型”可互换使用。
如本文所用，术语“低氧”培养条件是指相对于细胞在大气氧水平下(约21％)进行培养的标准培养条件，使细胞在培养系统中的可用氧水平降低的培养条件。非低氧条件在本文中称为正常或常氧培养条件。
本文提供了“经遗传修饰”或“经遗传工程化改造”或已接受“基因组修饰”的BRC(例如，SRC)。在某些实施方案中，可以通过使用基因编辑技术从SRC/BRC供体群体除去一种或多种特定细胞表面抗原，例如主要组织相容性抗原来获得此类细胞。可以使用多种技术来工程化改造此类细胞。例如，可以通过使用工程化核酸酶的基因组编辑方法来插入，替换或除去克隆的或合成工程化的DNA以产生工程化SRC/BRC，所述工程化核酸酶例如：a)CRISPR/Cas系统；b)转录激活物样效应物核酸酶(TALENs)；c)锌指核酸酶(ZFN)；d)和工程化的大范围核酸酶归巢内切核酸酶。本领域已知的各种其他多核苷酸递送方法可以适合于SRC/BRC的工程化改造，例如转染、电穿孔、转导、脂质转染、纳米工程化物质，例如有机改性的二氧化硅或有机改性的硅酸盐(例如Ormosil)，病毒递送方法，包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒或另一种合适的方法。
“RNA引导的内切核酸酶”指如下的多肽，该多肽的内切核酸酶活性和特异性取决于其与RNA分子的缔合。此RNA分子的全序列或更一般地此RNA分子的片段(其是优选长于8个核酸碱基，更优选长于10个核酸碱基，甚至更优选长于12个核酸碱基的序列)具有规定基因组中的靶序列的能力。通常，此RNA分子具有杂交靶序列并介导此类内切核酸酶的内切核酸酶活性的能力。RNA引导的内切核酸酶的一个实例是Cas9(CRISPR相关蛋白9)，作为Cas9/CRISPR系统的一部分。关于更多详细信息，参见例如Sanders and Joung，NatureBiotechnology 32，347-355(2014)。
如本文中所用，“免疫原性”是指当引入受试者(例如人受试者)中时允许物质诱导可检测的免疫应答(体液或细胞)的性质。
术语“免疫原性基因”包括编码主要组织相容性抗原复合蛋白或次要组织相容性抗原的基因。在某些实施方案中，免疫原性基因是B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、和/或HLA-DQB1基因中的任一种或其任何组合。在某些实施方案中，免疫原性基因是编码选自下组的蛋白质的基因：B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR家族基因(例如HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、和/或HLA-DRB5)、HLA-DP家族基因(例如HLA-DPA1和/或HLA-DPA2)和HLA-DQ家族基因(例如HLA-DQA1和/或HLA-DQB1)。
术语“免疫相容性肾细胞”或“免疫相容性肾细胞群体”包括缺少编码使细胞被免疫学识别的主要组织相容性抗原复合蛋白和/或次要组织相容性抗原的基因的一种或多种等位基因的肾细胞或群体。在某些实施方案中，免疫相容性肾细胞或免疫相容性肾细胞群体是缺少编码B2M的基因的一种或多种等位基因的肾细胞或群体。在某些实施方案中，免疫相容性肾细胞或免疫相容性肾细胞群体是缺少B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、和/或HLA-DQB1基因中任一种或任何组合的一种或多种等位基因的肾细胞或群体。在某些实施方案中，免疫相容性肾细胞对接受体受试者的施用是免疫豁免的，并且在接受体受试者中不诱导免疫应答。
如本文所用，术语“生物材料”是指天然或合成的生物相容性材料，其适合于引入到支持处于存活状态的选定生物活性细胞的活组织中。天然生物材料是由活系统制备或源自活系统的材料。合成生物材料是不由活系统制备或不直接源自活系统的材料，而是通过本领域普通技术人员公知的特定化学程序和方案合成或构成。本文公开的生物材料可以是天然和合成生物相容性材料的组合。如本文所用，生物材料包括例如聚合物基质和支架。本领域普通技术人员将理解，生物材料可以配置成各种形式，例如，作为多孔泡沫、凝胶、液体、珠、固体，并且可以包括一种或多种天然或合成的生物相容性材料。在某些实施方案中，生物材料是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
术语“水凝胶”在本文中用于指当经由共价、离子或氢键交联有机聚合物(天然或合成的)以创建俘获水分子以形成凝胶的三维开放网格结构时形成的物质。可以用于形成水凝胶的材料的实例包括多糖，例如藻酸盐，聚磷嗪，和聚丙烯酸酯(它们强直交联)，或嵌段共聚物如PluronicsTM或TetronicsTM，通过温度或pH交联的聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物。本文所用的水凝胶优选是可生物降解的基于明胶的水凝胶。
如本文所用，生物材料包括例如衍生自人或动物起源的现有肾的胞外基质，其中天然细胞群体已经经由施加洗涤剂和/或本领域普通技术人员已知的其它化学试剂而消除。在某些实施方案中，生物材料是溶液的液体形式，其能够变成水凝胶，并且通过应用本领域技术人员已知的三维生物打印方法而在具有或不具有某些细胞群体的情况下分层。在某些实施方案中，生物材料配置为模拟脱细胞化肾的三维分形构造。
术语“改良释放”或等同术语“受控释放”、“延迟释放”或“缓慢释放”是指在对个体施用后随时间或超过一个时间点释放活性剂如生物活性细胞的配制剂。可以根据配制剂在期望的时间范围内(例如几分钟、几小时、几天、几周或更长时间)发生的活性剂的改良释放与标准配制剂形成对比，在标准配制剂中基本上整个剂量单位在施用后立即可用。对于组织工程和再生医学应用，优选的改良释放配制剂在局部施用(例如，将活性剂直接施用于实体器官)后的多个时间点提供活性剂的释放。例如，生物活性细胞的改良释放配制剂将在施用时立即提供细胞的初始释放，并在稍后的时间提供细胞的第二次释放。活性剂的第二次释放的时间延迟可以是初始施用后的几分钟、几小时或几天。通常，延迟释放的时间段对应于活性剂的生物材料载体失去其结构完整性所花费的时间段。活性剂的延迟释放一旦此类完整性开始降解就开始，并到完整性完全失效时完成。本领域普通技术人员将理解其它合适的释放机制。
术语“环境温度”是指本公开内容的配制剂将被施用于受试者的温度。通常，环境温度是温度受控环境的温度。环境温度范围为约18℃至约30℃。在某些实施方案中，环境温度为约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃。
如本文所用，术语“肾疾病”是指与急性或慢性肾衰竭的任何阶段或程度有关的疾病，所述肾衰竭导致肾进行血液过滤功能以及从血液中消除过多的液体、电解质和废物的能力丧失。肾疾病还可以包括内分泌功能障碍，例如贫血(促红细胞生成素缺乏)和矿物质失衡(维生素D缺乏)。肾疾病可以起源于肾或可以继发于多种病况，包括(但不限于)心力衰竭、高血压、糖尿病、自身免疫性疾病或肝病。肾疾病可以是对肾的急性损伤后发展的慢性肾衰竭的状况。例如，缺血和/或暴露于有毒物质对肾的伤害可以导致急性肾衰竭；急性肾损伤后恢复不完全可以导致慢性肾衰竭的发展。
术语“治疗”是指针对肾疾病、贫血、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的治疗以及预防或防范措施两者，其中目的是逆转，预防或减慢(减轻)目标病症。需要治疗的对象包括已经患有肾疾病、贫血、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的对象，以及容易患有肾疾病、贫血、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的对象或要预防肾疾病、贫血、肾小管运输缺陷或肾小球过滤缺陷的对象。如本文所用，术语“治疗”包括肾功能的稳定化和/或改善。
如本文所用，术语“体内接触”是指由富集的细胞群体分泌的产物与天然器官之间的体内直接接触。例如，由富集的肾细胞群体(或含有肾细胞/肾细胞级份的混合物或构建体)分泌的产物可以在体内接触天然肾。体内直接接触可以是自然界中的旁分泌、内分泌或邻分泌。分泌的产物可以是本文所述的不同产物的异质群体。
术语“构建体”或“配制剂”是指沉积在由一种或多种合成或天然存在的生物相容性材料构成的支架或基质表面上或表面中的一种或多种细胞群体。一种或多种细胞群体可以用生物材料包被，在生物材料上沉积，在生物材料中包埋，附着于生物材料，在生物材料中接种或俘获，所述生物材料由一种或多种合成或天然存在的生物相容性生物材料、聚合物、蛋白质或肽构成。在某些实施方案中，天然存在的生物材料是人或动物起源的脱细胞化的肾。在某些实施方案中，已经通过三维生物打印对生物材料进行了结构工程化改造。一种或多种细胞群体可以在体外或体内与生物材料或支架或基质组合。可以选择用于产生构建体或配制剂的一种或多种生物材料以指导，有利于或允许构建体的细胞组分的分散和/或与内源宿主组织的整合，或指导，有利于或允许构建体或配制剂的细胞组分的存活、植入、耐受性或功能性能。在某些实施方案中，选择用于形成支架/生物材料的一种或多种生物相容性材料以引导，有利于或允许其上沉积的至少一种细胞群体的多细胞三维构造的形成。在某些实施方案中，生物材料指导限定的三维细胞聚集体或类器官的组装，所述三维细胞聚集体或类器官重演天然肾组织的各个方面，包括但不限于构造极性。在某些实施方案中，生物材料指导限定的管状结构的组装，该管状结构重演包括腔在内的天然肾组织的各个方面。在某些实施方案中，生物材料促进或有利于蛋白质、核酸和膜结合囊泡从其中沉积的细胞群体中的分泌。通常，还可以选择用于产生构建体的一种或多种生物材料，以模拟或重演代表这些细胞群体来源的初始生物环境的天然肾或肾实质内特定三维构造或环境生态位的各方面。认为这些细胞群体来源的初始生物生态位的再创建进一步促进或有利于细胞存活力和效力。
术语“细胞聚集体”或“球状体”指与作为单层生长相反经培养以允许3D生长的细胞的聚集体或装配体。注意术语“球状体”并不意味着聚集体是几何球体。聚集体可以是高度构造的，具有良好限定的形态和极性，或者它可以是未构造的块；它可以包括单一细胞类型或超过一种细胞类型。细胞可以是原代隔离群，或永久细胞系，或两者的组合。此定义中包括类器官和器官型培养物。在某些实施方案中，球状体(例如，细胞聚集体或类器官)在旋转瓶中形成。在某些实施方案中，球状体(例如，细胞聚集体或类器官)在3维基质中形成。
术语“新肾增强剂(NKA)”是指生物活性细胞配制剂，其是由在基于明胶的水凝胶组成的生物材料中配制的选定的肾细胞(SRC)组成的可注射产品。术语“先进细胞疗法(Advance Cell Therapy，ACT)”也提及用NKA的治疗使用。在某些实施方案中，NKA是可注射产品，其包含由基于明胶的水凝胶构成的生物材料中配制的免疫相容性肾细胞群体(例如免疫相容性SRC)。在某些实施方案中，NKA是由生物材料中配制的不能免疫排斥的经基因组修饰的免疫豁免的同源SRC构成的可注射产品，所述生物材料由基于明胶的水凝胶构成。
术语“受试者”应指正在经历或已经经历了肾疾病的一种或多种体征、症状或其它适应症的任何单一个人受试者，包括符合治疗条件的患者。此类受试者包括但不限于新诊断或先前诊断并且现在正经历复现或复发或有肾疾病的风险(无论原因)的受试者。该受试者可以先前已经接受过肾疾病的治疗，或者未如此治疗。
术语“患者”是指期望得到治疗的任何单一动物，更优选地是哺乳动物(包括非人动物，诸如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊和非人灵长类)。最优选地，本文的患者是人。
术语“样品”或“患者样品”或“生物样品”通常应指从受试者或患者、体液、身体组织、细胞系、组织培养物或其它来源获得的任何生物样品。该术语包括组织活组织检查，诸如例如肾活组织检查。该术语包括培养的细胞，诸如例如培养的哺乳动物肾细胞。从哺乳动物获得组织活组织检查和培养细胞的方法是本领域中公知的。若单独使用术语“样品”，则它仍应意味着“样品”是“生物样品”或“患者样品”，即术语可以互换使用。术语“测试样品”是指来自已经通过本公开内容的方法治疗的受试者。测试样品可以源自哺乳动物受试者中的各种来源，包括但不限于血液、精液、血清、尿液、骨髓、粘膜、组织等。
术语“对照”或“对照样品”是指阴性或阳性对照，其中预期阴性或阳性结果有助于关联测试样品中的结果。适用于本公开内容的对照包括但不限于已知表现出正常肾功能的特征性指标的样品、获自已知未患有肾疾病的受试者的样品和获自已知患有肾疾病的受试者的样品。另外，对照可以是在通过本公开内容的方法治疗之前从受试者获得的样品。另外的合适的对照可以是从已知患有任何类型或阶段的肾疾病的受试者获得的测试样品，以及从已知没有任何类型或阶段的肾疾病的受试者获得的样品。对照可以是正常健康匹配的对照。本领域技术人员将理解适用于本公开内容的其它对照。
“再生预后”、“再生性预后”或“再生的预后”通常是指对本文所述的细胞群体、混合物或构建体的施用或植入的可能的再生过程或结果的预期或预测。对于再生预后，可以通过以下一种或多种告知预期或预测：植入或施用后功能器官(例如肾)的改善、植入或施用后功能性肾的形成、植入或施用后改善的肾功能或能力的形成和植入或施用后天然肾的某些标志物表达。
“再生器官”是指植入或施用如本文所述的细胞群体、混合物或构建体后的天然器官。再生器官通过各种指标表征，包括但不限于天然器官中的功能或能力的形成、天然器官中的功能或能力的改善、与疾病有关的某些标志物和生理指标的改善和/或天然器官中的某些标志物的表达。本领域普通技术人员将理解，其它指标可适用于表征再生器官。
“再生肾”是指植入或施用如本文所述的细胞群体、混合物或构建体后的天然肾。再生肾通过各种指标表征，包括但不限于天然肾中的功能或能力的形成、天然肾中的功能或能力的改善、与肾疾病有关的某些标志物和生理指标的改善和天然肾中的某些标志物的表达。本领域普通技术人员将理解，其它指标可适用于表征再生肾。
细胞群体
在某些实施方案中，本文提供的治疗组合物或配制剂包含富集特定生物活性组分或细胞类型和/或消减特定无活性或不期望的组分或细胞类型的分离的异质肾细胞群体。在某些实施方案中，此类组合物和配制剂用于治疗肾疾病，例如，提供肾功能和/或结构的稳定化和/或改善和/或再生。在某些实施方案中，组合物含有分离的肾细胞级分，其与健康个体相比缺乏细胞成分但仍保留治疗性质，例如提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。在某些实施方案中，本文所述的细胞群体可衍生自健康个体、患有肾疾病的个体或本文所述的受试者。
本文包括选定的肾细胞群体的治疗组合物，其要施用于受试者的靶器官或组织。在某些实施方案中，生物活性选定的肾细胞群体通常是指在施用于受试者时潜在具有治疗特性的细胞群体。在某些实施方案中，在对有需要的受试者施用后，生物活性肾细胞群体可以在受试者中提供肾功能的稳定化和/或改善和/或修复和/或再生。在某些实施方案中，治疗性质可包括修复或再生效果。
在某些实施方案中，肾细胞群体是衍生自肾的未分级的异质细胞群体或富集的同质细胞群体。在某些实施方案中，异质细胞群体是从组织活组织检查或整个器官组织分离的。在某些实施方案中，肾细胞群体衍生自哺乳动物细胞的体外培养物，从组织活组织检查或整个器官组织建立。在某些实施方案中，肾细胞群体包含异质肾细胞群体的亚级份或亚群，富集了生物活性成分(例如，生物活性肾细胞)并且消减了无活性或不期望的成分或细胞。
在某些实施方案中，肾细胞群体表达GGT和细胞角蛋白。在某些实施方案中，GGT具有大于约10％、约15％、约18％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％的表达水平。在某些实施方案中，GGT是GGT-1。在某些实施方案中，肾细胞群体的细胞表达GGT-1、细胞角蛋白、VEGF和KIM-1。在某些实施方案中，肾细胞群体中大于18％的细胞表达GGT-1。在某些实施方案中，肾细胞群体中大于80％的细胞表达细胞角蛋白。在某些实施方案中，细胞角蛋白选自CK8、CK18、CK19及其组合。在某些实施方案中，细胞角蛋白是CK8、CK18、CK19、CK8/CK18、CK8/CK19、CK18/CK19或CK8/CK18/CKl9，其中“/”是指与其相邻的细胞角蛋白的组合。在某些实施方案中，细胞角蛋白具有大于约80％、约85％、约90％或约95％的表达水平。在某些实施方案中，肾细胞群体中大于80％的细胞表达细胞角蛋白。在某些实施方案中，肾细胞群体表达AQP2。在某些实施方案中，小于40％的细胞表达AQP2。在某些实施方案中，肾细胞群体中至少3％的细胞表达AQP2。
在某些实施方案中，细胞群体内大于18％的细胞表达GGT-1，并且细胞群体内大于80％的细胞表达细胞角蛋白。在某些实施方案中，细胞角蛋白是CK18。在某些实施方案中，细胞群体中4.5％至81.2％的细胞表达GGT-1，细胞群体中3.0％至53.7％的细胞表达AQP2，并且细胞群体内81.1％至99.7％的细胞表达CK18。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含表达选自下组的生物标志物的任何组合的一种或多种的细胞：AQP1、AQP2、AQP4、钙结合蛋白、钙调理蛋白、CD117、CDl33、CDl46、CD24、CD31(PECAM-1)、CD54(ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8、CK18、CK19，CK8、CK18和CK19的组合、连接蛋白43、吞饮受体(Cubilin)、CXCR4(融合素)、DBA、E-钙粘蛋白(CD324)、EPO(促红细胞生成素)GGT1、GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)、肝球蛋白、Itgbl(整联蛋白01)、KIM-1(肾损伤分子-1)、T1M-1(含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白的分子)、MAP-2(微管相关蛋白2)、兆蛋白(Megalin)、N-钙粘蛋白、肾病蛋白(肾病蛋白)、NKCC(Na-K-Cl-共转运蛋白)、OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、泛钙粘蛋白、PCLP1(足糖萼蛋白样1分子)、Podocin、SMA(平滑肌alpha-肌动蛋白)、Synaptopodin、THP(tamm-horsfall蛋白)、Vinientin和alpha GST-1(alpha谷胱甘肽S-转移酶)。
在某些实施方案中，与起始群体，例如肾组织活组织检查或其原代培养中的细胞群体相比，肾细胞群体是上皮细胞富集的(例如，肾细胞群体包含比起始群体多至少约5％、10％、15％、20％或25％的上皮细胞)。在某些实施方案中，与起始群体，例如肾组织活组织检查或其原代培养物中的细胞群体相比，肾细胞群体是肾小管细胞富集的(例如，肾细胞群体包括比起始群体多至少约5％、10％、15％、20％或25％的肾小管细胞)。在某些实施方案中，肾小管细胞包含近端肾小管细胞。在某些实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更小比例的远端肾小管细胞、收集导管细胞、内分泌细胞、血管细胞或祖细胞样细胞。在某些实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更小比例的远端肾小管细胞。在某些实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的收集导管细胞。在某些实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的内分泌细胞。在某些实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的血管细胞。在某些实施方案中，与起始群体相比，肾细胞群体具有更少比例的祖细胞样细胞。在某些实施方案中，当与非富集的群体(例如起始肾细胞群体)相比时，肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的产生EPO的细胞、肾小球细胞和血管细胞。在某些实施方案中，当与非富集的群体相比时，肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的产生EPO的细胞和血管细胞。在某些实施方案中，当与非富集的群体相比时，肾细胞群体具有更大比例的肾小管细胞和更少比例的肾小球细胞和血管细胞。
在某些实施方案中，肾细胞群体的细胞表达透明质酸(HA)。在某些实施方案中，HA的大小范围为约5kDa至约20000kDa。在某些实施方案中，HA具有5kDa、60kDa、800kDa和/或3000kDa的分子量。在某些实施方案中，肾细胞群体通过透明质酸合酶-2(HAS-2)的表达来合成高分子量HA和/或刺激高分子量HA的合成，特别在肾内植入后。在某些实施方案中，通过HAS-2的作用，肾细胞群体的细胞在体外和/或体内表达HA的更高分子量。在某些实施方案中，通过HAS-2的作用，肾细胞群体的细胞在体外和体内表达HA的更高分子量。在某些实施方案中，HA的更高分子量是具有至少100kDa的分子量的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约800kDa至约3500kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约800kDa至约3000kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少800kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少3,000kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有约800kDa的分子量的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约3000kDa的HA。在某些实施方案中，HAS-2合成分子量为2x105至2x106Da的HA。在某些实施方案中，较小的HA种类是通过降解透明质酸酶的作用形成的。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是分子量范围为约200kDa至约2000kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是分子量范围为约200kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约2000kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少200kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少2000kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少5000kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量至少10000kDa的HA。HA的较高分子量种类是具有分子量至少15000kDa的HA。在某些实施方案中，HA的较高分子量种类是具有分子量约20000kDa的HA。
在某些实施方案中，群体包含能够受体介导的白蛋白转运的细胞。
在某些实施方案中，肾细胞群体的细胞是低氧耐受的。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合的一种或多种的细胞类型：兆蛋白、cubicin、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、水通道蛋白-1和水通道蛋白-2。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：兆蛋白、cubicin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D3 25-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节蛋白4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换蛋白)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)，醛脱氢酶1家族成员A3(Aldhla3)和卡配因(Calpain)-8(Capn8)。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：兆蛋白、cubicin、透明质酸合酶2(HAS2)、维生素D325-羟化酶(CYP2D25)、N-钙粘蛋白(Ncad)、E-钙粘蛋白(Ecad)、水通道蛋白-1(Aqp1)、水通道蛋白-2(Aqp2)、RAB17、RAS癌基因家族成员(Rab17)、GATA结合蛋白3(Gata3)、含FXYD域的离子转运调节蛋白4(Fxyd4)、溶质载体家族9(钠/氢交换蛋白)成员4(Slc9a4)、醛脱氢酶3家族成员B1(Aldh3b1)，醛脱氢酶1家族成员A3(Aldhla3)和卡配因(Calpain)-8(Capn8)和水通道蛋白-4(Aqp4)。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下组合的一种或多种的细胞类型：水通道蛋白7(Aqp7)、含FXYD域的离子转运调节蛋白2(Fxyd2)、溶质载体家族17(磷酸钠)成员3(Slc17a3)、溶质载体家族3成员1(Slc3a1)、紧密连接蛋白(claudin)2(Cldn2)，NapsinA天冬氨酸肽酶(Napsa)、溶质载体家族2(易化葡萄糖转运蛋白)成员2(Slc2a2)、丙氨酰(膜)氨肽酶(Anpep)、跨膜蛋白27(Tmem27)、酰基CoA合成酶中链家族成员2(Acsm2)/谷胱甘肽过氧化物酶3(Gpx3)、果糖-1，6-双磷酸酶1(Fbp1)、丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(Agxt2)、血小板内皮细胞粘附分子(Pecam)和Podocin(Podn)。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、VEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146、Podocin(Podn)和肾病蛋白(Neph)、趋化因子(CXC基序)受体4(Cxcr4)、内皮素受体B型(Ednrb)、胶原V型alpha 2(Col5a2)、钙粘蛋白5(Cdh5)、纤溶酶原激活剂，组织(Plat)、血管生成素2(Angpt2)、激酶插入域蛋白受体(Kdr)、分泌蛋白、酸性富含半胱氨酸(ostectectin)(Sparc)、丝甘蛋白聚糖(serglycin)(Srgn)、TIMP金属肽酶抑制剂3(Timp3)、Wilms肿瘤1(Wt1)、无翼型MMTV整合位点家族成员4(Wnt4)、G蛋白信号传导调节剂4(Rgs4)、促红细胞生成素(EPO)。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、Podocin、肾病蛋白、EPO、CK7、CK8/18/19。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a、CD31、CD146。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：Podocin(Podn)和肾病蛋白(Neph)。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含一种或多种表达以下任何组合中的一种或多种的细胞类型：PECAM、vEGF、KDR、HIF1a和EPO。
在某些实施方案中，可以通过多种方法来分析样品或细胞群体中各种生物标志物的存在(例如表达)和/或水平/量，所述方法中的许多是本领域已知的并且是熟练技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、Western印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、生化酶促活性测定法、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应(“PCR”)，包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其它扩增类型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达序型分析和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可以通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的极其多种测定法中的任何一种。评估基因和基因产物状态的方案的非限制性实例包括Northern印迹法、Southern印迹法、免疫印迹法和PCR分析。在某些实施方案中，也可以使用多路复用的免疫测定法，例如可从Rules BasedMedicine或Meso Scale Discovery获得的免疫测定法。在某些实施方案中，可以通过多种方法来分析样品或细胞群体中各种生物标志物的存在(例如表达)和/或水平/量，所述方法中的许多是本领域已知的并且是熟练术人员理解的，包括但不限于“组学(-omics)”平台，例如全基因组转录组学、蛋白质组学、分泌组学、脂质组学、phospatomics、外来体组学等，其中高通量方法与计算生物学和生物信息学技术偶联以阐明由所考虑的细胞群体表达或不表达的基因、miRNA、蛋白质、分泌性蛋白质、脂质等的完整生物学签名。
在某些实施方案中，检测肾细胞群体中两种或更多种生物标志物的存在的方法包括在允许抗体与其关联配体(即生物标志物)结合的条件下将样品与针对生物标志物的抗体接触，并检测结合抗体的存在，例如，通过检测抗体与生物标志物之间是否形成复合物。在某些实施方案中，一种或多种生物标志物的存在的检测通过免疫组织化学进行。如本文所用，术语“检测”涵盖定量和/或定性检测。
在某些实施方案中，用一种或多种允许检测本文中公开的生物标志物的试剂鉴定肾细胞群体，所述生物标志物诸如AQP1、AQP2、AQP4、钙结合蛋白、钙调理蛋白、CD117、CD133、CD146、CD24、CD31(PECAM-1)、CD54(ICAM-1)、CD73、CK18、CK19、CK7、CK8、CK8/18、CK8/18/19、连接蛋白43、吞饮受体、CXCR4(融合素)、DBA、E-钙粘蛋白(CD324)、EPO(促红细胞生成素)、GGT1、GLEPP1(肾小球上皮蛋白1)、肝球蛋白、Itgb1(整联蛋白01)、KIM-1(肾损伤分子-1)、T1M-1(含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白的分子)、MAP-2(微管相关蛋白2)、兆蛋白、N-钙粘蛋白、肾病蛋白(肾病蛋白)、NKCC(Na-K-C1-共转运蛋白)、OAT-1(有机阴离子转运蛋白1)、骨桥蛋白、泛钙粘蛋白、PCLP1(足糖萼蛋白样1分子)、Podocin、SMA(平滑肌alpha-肌动蛋白)、Synaptopodin、THP(tamm-horsfall蛋白)、Vinientin和αGST-1(alpha谷胱甘肽S-转移酶)。在某些实施方案中，通过单克隆或多克隆抗体检测生物标志物。
在某些实施方案中，细胞来源与意图的靶器官或组织相同。在某些实施方案中，BRC或SRC可以源自肾，以用于要向肾施用的配制剂中。在某些实施方案中，细胞群体衍生自肾活组织检查。在某些实施方案中，细胞群体衍生自整个肾组织。在某些实施方案中，细胞群体衍生自哺乳动物肾细胞的体外培养物，从肾活组织检查或整个肾组织建立。
在某些实施方案中，BRC或SRC包含生物活性肾细胞的异质混合物或级分。在某些实施方案中，BRC或SRC可以衍生自来自健康个体的肾细胞级分或本身是来自健康个体的肾细胞级分。在某些实施方案中，本文包括从非健康个体获得的肾细胞群体或级分，其当与健康个体的肾细胞群体相比时(例如，在肾或其活组织检查中)可以缺乏某些细胞类型。在某些实施方案中，本文提供了与健康个体相比缺乏细胞类型的治疗活性细胞群体。在某些实施方案中，从自体细胞群体分离并扩增细胞群体。
在某些实施方案中，经由肾活组织检查从患者肾皮质组织中分离和扩增肾细胞获得SRC。在某些实施方案中，通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，使用标准细胞培养技术扩增，并且通过跨越密度边界、屏障或界面的离心从扩增的肾细胞中选择。在某些实施方案中，通过酶促消化从肾组织分离肾细胞，使用标准细胞培养技术扩增，并通过连续或不连续的单步或多步密度梯度离心从扩增的肾细胞中选择。在某些实施方案中，SRC主要由在其再生潜能上已知的肾上皮细胞构成。在某些实施方案中，其它实质细胞(血管)和基质细胞可存在于自体SRC群体中。
如上文所述，BRC是天然参与肾修复和再生的再生肾细胞的分离的群体。在某些实施方案中，从通过酶促消化从肾组织分离的肾细胞获得生物活性肾细胞，并使用标准细胞培养技术扩增。细胞培养基可以设计为扩增具有再生能力的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，BRC从通过酶促消化从肾组织分离的肾细胞获得，已经经过遗传修饰(例如基因组修饰和/或经由RNAi修饰)以使它们变得免疫豁免或不能排斥，并且使用标准细胞培养技术扩增。细胞培养基可以设计为扩增具有再生能力的免疫豁免的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，细胞培养基不含任何分化因子。在某些实施方案中，在低氧条件下培养肾细胞的扩增异质混合物，以进一步富集具有再生能力的细胞组合物。不希望受到理论的束缚，这可能是由于以下一种或多种现象引起的：1)低氧培养期间特定细胞成分的选择性存活、死亡或增殖；2)响应低氧培养的细胞粒度和/或大小的变化，从而在密度梯度分离期间实现浮力密度和随后定位的变化；和3)响应低氧培养期，细胞基因/蛋白质表达的变化，从而导致分离和扩增群体内细胞的差异特征。
在某些实施方案中，在富集能够进行肾再生的细胞的培养条件下，从肾组织(例如，从活组织检查组织获得的组织)中分离和扩增肾细胞获得生物活性肾细胞群体。
在某些实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查组织获得的组织)的肾细胞传代1、2、3、4、5或更多次，以产生扩增的生物活性肾细胞(例如，富集能够肾再生的细胞的细胞群体)。在某些实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代1次以产生扩增的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代2次以产生扩增的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代3次以产生扩增的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代4次以产生扩增的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，将来自肾组织(例如，从活组织检查获得的组织)的肾细胞传代5次以产生扩增的生物活性肾细胞。在某些实施方案中，传代细胞消减了非生物活性肾细胞的细胞群体。在某些实施方案中，传代细胞消减了至少一种细胞类型的细胞群体。在某些实施方案中，传代细胞消减了具有大于1.095g/ml密度的细胞的细胞群体。在某些实施方案中，传代细胞消减了低粒度的小细胞的细胞群体。在某些实施方案中，传代细胞消减了比红细胞小的细胞的细胞群体。在某些实施方案中，传代细胞消减了具有小于6μm的直径的细胞的细胞群体。在某些实施方案中，传代细胞消减了具有小于2μm的直径的细胞的细胞群体。在某些实施方案中，传代细胞消减了具有比红细胞低的粒度的细胞的细胞群体。在某些实施方案中，在1次或多次传代后，细胞群体的存活力增加。在某些实施方案中，当通过荧光激活细胞分选(FAC)，例如使用细胞出现的散点图的X-Y轴分析细胞时，使用小细胞和低粒度的描述。
在某些实施方案中，扩增的生物活性肾细胞在低氧条件下培养至少约6、9、10、12或24小时但小于48小时，或6至9小时，或6至48小时，或约12至约15小时，或约8小时，或约12小时，或约24小时，或约36小时，或约48小时。在某些实施方案中，基于密度选择在低氧条件下培养的细胞。在某些实施方案中，生物活性肾细胞群体是在扩增的肾细胞的连续或不连续(单步或多步)密度梯度分离之后(例如，在低氧条件下传代和/或培养之后)获得的选定的肾细胞(SRC)群体。在某些实施方案中，生物活性肾细胞群体是通过跨越密度边界、屏障或界面的离心分离扩增的肾细胞后(例如，在低氧条件下传代和/或培养后)获得的选定的肾细胞(SRC)群体。在某些实施方案中，低氧培养条件是下述的培养条件，其中相对于细胞在大气氧水平(约21％)下培养的标准培养条件，使细胞经受培养系统中的可用氧水平降低。在某些实施方案中，在低氧培养条件下培养的细胞在约5％至约15％、或约5％至约10％、或约2％至约5％、或约2％至约7％、或约2％或约3％、或约4％、或约5％的氧水平培养。在某些实施方案中，SRC表现出大于约1.0419g/mL的浮力密度。在某些实施方案中，SRC表现出大于约1.04g/mL的浮力密度。在某些实施方案中，SRC表现出大于约1.045g/mL的浮力密度。在某些实施方案中，与起始肾细胞群体相比，BRC或SRC含有更大百分比的一个或多个细胞群体，并且缺乏或缺少一个或多个其它细胞群体。
在某些实施方案中，可以对扩增的生物活性肾细胞进行密度梯度分离以获得SRC。在某些实施方案中，然后对SRC进行遗传修饰。在某些实施方案中，经遗传修饰的(例如经基因组修饰的和/或经由RNAi修饰的)BRC经受密度梯度分离以获得经遗传修饰的SRC。在某些实施方案中，经遗传修饰的(例如经基因组修饰的和/或经由RNAi修饰的)BRC经受低氧培养条件和密度梯度分离两者以获得经遗传修饰的SRC。在某些实施方案中，使用连续或不连续的单步或多步密度梯度离心，基于细胞浮力密度来分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中，可以通过跨越密度边界、屏障或界面的离心来分离扩增的生物活性肾细胞以获得SRC。在某些实施方案中，使用跨越密度边界或界面的离心来基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中，通过部分使用OPTIPREP(Axis-Shield)介质产生SRC，所述介质包含60％(w/v)的非离子碘化化合物碘克沙醇的水溶液。然而，本领域技术人员将认识到其它介质、密度梯度(连续或不连续)、密度边界、屏障、界面或其它手段，例如，使用本领域已知的细胞表面标志物进行免疫分离，包括用于分离本文所述的细胞群体的必要特征可用于获得生物活性肾细胞。在某些实施方案中，离心后收集表现出大于约1.04g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1.04g/mL的细胞。在某些实施方案中，离心后收集表现出浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持小于1.0419g/mL的浮力密度的细胞。在某些实施方案中，离心后收集表现出大于约1.045g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持小于1.045g/mL的浮力密度的细胞。
在某些实施方案中，细胞浮力密度用于获得SRC群体和/或确定肾细胞群体是否为生物活性肾细胞群体。在某些实施方案中，细胞浮力密度用于分离生物活性肾细胞。在某些实施方案中，通过跨越单步OptiPrep(7％碘克沙醇；OptiMEM中60％(w/v))密度界面(单步不连续密度梯度)的离心确定细胞浮力密度。Optiprep是水中的碘克沙醇的60％w/v溶液。当在示例性密度界面或单步不连续密度梯度中使用时，将Optiprep用OptiMEM(细胞培养基础培养基)稀释以形成7％碘克沙醇的终溶液(在水和OptiMEM中)。OptiMEM的配方是Eagle基本必需培养基的改良，用HEPES和碳酸氢钠缓冲，并补充有次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺或GLUTAMAX、微量元素和生长因子。蛋白质水平是最小的(15μg/mL)，胰岛素和转铁蛋白是唯一的蛋白质补充剂。以降低的浓度包含酚红作为pH指标。在某些实施方案中，在使用之前可以用2-巯基乙醇补充OptiMEM。
在某些实施方案中，制备OptiPrep溶液并在使用前测量指示期望密度的折射率(R.I.1.3456+/-0.0004)。在某些实施方案中，肾细胞在溶液的顶部上分层。在某些实施方案中，将密度界面或单步不连续密度梯度在室温在离心管(例如50ml锥形管)或细胞处理器(例如COBE 2991)中以800g离心20分钟(无制动)。在某些实施方案中，离心后收集表现出大于约1.04g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1.04g/mL的细胞。在某些实施方案中，离心后收集表现出大于约1.0419g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持小于1.0419g/mL的浮力密度的细胞。在某些实施方案中，离心后收集表现出大于约1.045g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持小于1.045g/mL的浮力密度的细胞。在某些实施方案中，在评估细胞密度或基于密度的选择之前，将细胞培养直至它们至少融合50％，并在37℃的5％CO2环境中在设置2％氧气的低氧培养箱中温育过夜(例如，至少约8或12小时)。
在某些实施方案中，将从肾样品获得的细胞扩增，然后进行处理(例如通过低氧和离心分离)以提供SRC群体。在某些实施方案中，使用本文所述的试剂和程序产生SRC群体。在某些实施方案中，测试来自SRC群体的细胞样品的存活力，之后将群体的细胞施用于受试者。在某些实施方案中，测试来自SRC群体的细胞样品的本文公开的一种或多种标志物的表达，之后将群体的细胞施用于受试者。
用于制备SRC的组合物和方法的非限制性实例在美国专利申请公开号2017/0281684 A1中公开，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，BRC或SRC衍生自天然自体或同种异体肾样品。在某些实施方案中，BRC或SRC衍生自非自体肾样品。在某些实施方案中，可以通过肾活组织检查获得样品。
在某些实施方案中，肾细胞分离和扩增提供了包含肾上皮细胞和基质细胞的肾细胞类型的混合物。在某些实施方案中，通过对扩增的肾细胞进行连续或不连续的密度梯度分离获得SRC。在某些实施方案中，在密度梯度分离的SRC群体中的原代细胞类型是肾小管上皮表型的。在某些实施方案中，通过跨越密度边界、屏障或界面的离心分离扩增的肾细胞来获得SRC。在某些实施方案中，SRC群体中跨越密度边界/屏障/界面分离的原代细胞类型是肾小管上皮表型的。在某些实施方案中，使用多管法(multi-pronged approach)评估获自扩增的肾细胞的SRC的特征。在某些实施方案中，在肾细胞扩增过程期间监测细胞形态、生长动力学和细胞存活力。在某些实施方案中，SRC浮力密度和存活力以在密度梯度介质上或通过密度梯度介质离心和锥虫蓝排除法表征。在某些实施方案中，通过流式细胞术表征SRC表型，并且通过VEGF和KIM-1的表达证明SRC功能。在某些实施方案中，还可以通过测量肾近端小管中发现的两种特异性酶GGT(γ-谷氨酰转肽酶)和LAP(亮氨酸氨肽酶)的活性来评估SRC(预配制剂)的细胞功能。
在某些实施方案中，可以利用有助于经由密度介质(大小和粒度)分离细胞亚群的细胞特征，经由流式细胞术分离细胞亚群(前向散射＝经由流式细胞术反映大小，而侧向散射＝粒度的反映)。在某些实施方案中，密度梯度或分离介质应对目的特定细胞具有低毒性。在某些实施方案中，尽管密度介质对目标特定细胞应具有低毒性，但本发明涵盖了在目标细胞的选择过程中起作用的介质的使用。在某些实施方案中，并且不希望受到理论束缚，似乎由包含碘克沙醇的介质回收的本文公开的细胞群体是碘克沙醇抗性的，因为在加载和回收步骤之间存在可察觉的细胞损失，提示了在密度梯度或密度边界、密度、屏障或密度界面的条件下对碘克沙醇的暴露导致某些细胞的消除。在某些实施方案中，在碘克沙醇密度梯度或密度界面分离之后出现的细胞对碘克沙醇和/或密度梯度或界面暴露的任何不利影响是有抗性的。在某些实施方案中，将包含轻度至中度肾毒素的造影剂用于分离和/或选择细胞群体，例如SRC群体。在某些实施方案中，SRC是碘克沙醇抗性的。在某些实施方案中，密度介质不应与人血浆中的蛋白质结合或不利地影响目的细胞的关键功能。
在某些实施方案中，已经使用荧光激活细胞分选(FACS)使细胞群体富集和/或消减了一种或多种肾细胞类型。在某些实施方案中，可以使用BD FACSAriaTM或等同物富集和/或消减了肾细胞类型。在某些实施方案中，可以使用FACSAria IIITM或等同物富集和/或消减肾细胞类型。
在某些实施方案中，已经使用磁性细胞分选对细胞群体富集和/或消除了一种或多种肾细胞类型。在某些实施方案中，可以使用Miltenyi
Figure BDA0002382941840000331
系统或等同物富集和/或消减了一种或多种肾细胞类型。
在某些实施方案中，肾细胞群体已经进行了三维培养。在某些实施方案中，培养细胞群体的方法是经由连续灌注。在某些实施方案中，当与静态培养的细胞群体相比时，经由三维培养和连续灌注培养的细胞群体表明更大的细胞性和互连性。在某些实施方案中，当与此类细胞群体的静态培养物相比时，经由三维培养和连续灌注培养的细胞群体表明更大的EPO表达，以及肾小管相关基因例如E-钙粘蛋白的增强表达。在某些实施方案中，当与静态培养的细胞群体相比时，经由连续灌注培养的细胞群体表明更高水平的葡萄糖和谷氨酰胺消耗。
在某些实施方案中，可以使用低的或低氧的氧条件制备本文提供的细胞群体的方法中。在某些实施方案中，可以在无需低氧条件化的步骤的情况下使用制备细胞群体的方法。在某些实施方案中，可以使用常氧条件。
在某些实施方案中，已经从肾组织分离和/或培养肾细胞群体。本文公开了用于分开和分离肾细胞组分的方法的非限制性实例，例如将用于治疗用途的配制剂中的富集细胞群体，包括治疗肾疾病、贫血、EPO缺乏、肾小管运输缺乏和肾小球过滤缺陷。在某些实施方案中，从新鲜消化的，即机械或酶促消化的肾组织，或从哺乳动物肾细胞的异质体外培养物中分离细胞群体。
在某些实施方案中，肾细胞群体包含产生EPO的肾细胞。在某些实施方案中，受试者患有贫血和/或EPO缺乏。在某些实施方案中，产生EPO的肾细胞群体以EPO表达和对氧气的生物响应性为特征，使得培养系统的氧张力降低导致EPO表达的诱导。在某些实施方案中，产生EPO的细胞群体是产生EPO的细胞富集的。在某些实施方案中，与在可用氧的正常大气(约21％)水平下培养的细胞群体相比，在细胞经受培养系统中的可用氧水平降低的条件下培养细胞群体时，诱导EPO表达。在某些实施方案中，相对于在正常氧气条件下培养的产生EPO的细胞，在较低氧气条件下培养的产生EPO的细胞表达更高水平的EPO。通常，在可用氧气水平降低的细胞培养(也称为低氧培养条件)意味着相对于在可用氧的正常大气水平(也称为正常或常氧培养条件)的细胞培养，氧气减少的水平降低。在某些实施方案中，低氧细胞培养条件包括在约小于1％的氧气，约小于2％的氧气，约小于3％的氧气，约小于4％的氧气或约小于5％的氧气下培养细胞。在某些实施方案中，正常或常氧培养条件包括在约10％氧气，约12％氧气，约13％氧气，约14％氧气，约15％氧气，约16％氧气，约17％氧气，约18％氧气，约19％氧气，约20％氧气或约21％氧气下培养细胞。
在某些实施方案中，获得EPO的诱导或表达增加，并且可以通过在约小于5％的可用氧下培养细胞并将EPO表达水平与在大气(约21％)的氧气下培养的细胞进行比较来观察。在某些实施方案中，通过包括第一培养阶段和第二培养阶段的方法在能够表达EPO的细胞培养物中获得EPO的诱导，在所述第一培养阶段中将细胞培养物在大气氧(约21％)下培养一段时间，在所述第二培养阶段中可用氧降低并且在约小于5％可用氧下培养相同细胞。在某些实施方案中，响应于低氧条件的EPO表达由HIF1α调节。在某些实施方案中，本领域已知的其它氧气操作培养条件可以用于本文所述的细胞。
在某些实施方案中，配制剂含有以对灌注条件的生物响应性(例如，EPO表达)为特征的产生EPO的哺乳动物细胞的富集群体。在某些实施方案中，灌注条件包括瞬时、间歇或连续的流体流动(灌注)。在某些实施方案中，当以下述方式将培养细胞的培养基间歇地或连续地循环或搅动，使得动力通过流动传递给细胞时，EPO的表达是机械诱导的。在某些实施方案中，以如下方式培养经受瞬时、间歇或连续流体流动的细胞，使得它们以三维结构存在于材料中或之上，该材料为此类三维结构形成提供构架和/或空间。在某些实施方案中，将细胞培养在多孔珠上，并通过摇动平台、轨道运行平台或旋转瓶进行间歇或连续的流体流动。在某些实施方案中，将细胞在三维支架上培养并置于装置中，通过所述装置，支架是固定的，并且流体有方向地流过或穿过支架。本领域普通技术人员将理解，本领域已知的其它灌注培养条件可以用于本文所述的细胞。
在某些实施方案中，细胞群体衍生自肾活组织检查。在某些实施方案中，细胞群体衍生自整个肾组织。在某些实施方案中，细胞群体衍生自哺乳动物肾细胞的体外培养物，自肾活组织检查或整个肾组织建立。在某些实施方案中，肾细胞群体是SRC群体。在某些实施方案中，细胞群体是未分级的细胞群体，在本文中也称为非富集的细胞群体。
本文包括包含多种活性剂(例如，除了肾细胞之外)的组合物。合适的活性剂的非限制性实例包括但不限于细胞聚集体、无细胞生物材料、来自生物活性细胞的分泌产物、大分子和小分子治疗剂及其组合。例如，一种类型的生物活性细胞可以与具有或不具有治疗分子或另一种类型的生物活性细胞的基于生物材料的微载体组合。在某些实施方案中，未附着的细胞可以与无细胞颗粒组合。
在某些实施方案中，肾细胞群体的细胞在球状体内。在某些实施方案中，肾细胞群体为球状体形式。在某些实施方案中，将包含生物活性肾细胞的球状体施用于受试者。在某些实施方案中，球状体包含至少一种非肾细胞类型或细胞群体。在某些实施方案中，在方法中生成球状体，所述方法包括：(i)组合生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体，并且(ii)在包含旋转瓶的3维培养系统中培养生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体，直到形成球状体。
在某些实施方案中，非肾细胞群体包括内皮细胞群体或内皮祖细胞群体。在某些实施方案中，生物活性细胞群体是内皮细胞群体。在某些实施方案中，内皮细胞群体是细胞系。在某些实施方案中，内皮细胞群体包括人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。在某些实施方案中，非肾细胞群体是间充质干细胞群体。在某些实施方案中，非肾细胞群体是造血、乳腺、肠、胎盘、肺、骨髓、血液、脐带、内皮、牙髓、脂肪、神经、嗅觉、神经嵴或睾丸起源的干细胞群体。在某些实施方案中，非肾细胞群体是脂肪来源的祖细胞群体。在某些实施方案中，细胞群体是异种的、同基因的、同种异体的、自体的或其组合。在某些实施方案中，以0.1∶9.9至9.9∶0.1的比率培养生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体。在某些实施方案中，以约1∶1的比率培养生物活性肾细胞群体和非肾细胞群体。在某些实施方案中，将肾细胞群体和生物活性细胞群体悬浮于生长培养基中。
扩增的生物活性肾细胞可以进一步经受连续或不连续的密度介质分离以获得SRC。具体而言，连续或不连续的单步或多步密度梯度离心用于基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中，可以通过跨越密度边界、屏障或界面的离心使扩增的生物活性肾细胞进一步分离以获得SRC。具体而言，基于细胞浮力密度，使用跨越密度边界、屏障或界面的离心来分离收获的肾细胞群体。在某些实施方案中，通过部分使用OPTIPREP(Axis-Shield)介质产生SRC，所述介质包含水中的非离子碘化化合物碘克沙醇的60％溶液。然而，本领域技术人员将认识到，可以根据本公开内容使用任何密度梯度介质，不限于特定介质或其它手段，例如使用本领域已知的细胞表面标志物进行免疫学分离，包括用于分离本公开内容的细胞群体的必要特征。例如，Percoll或蔗糖可用于形成密度梯度或密度边界。在某些实施方案中，离心后收集表现出大于约1.04g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1.04g/mL的细胞。在某些实施方案中，在离心分离后收集表现出浮力密度大于约1.0419g/mL的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并弃去维持浮力密度小于1，0419g/mL的细胞。在某些实施方案中，在离心分离后收集表现出浮力密度大于约1.045g/mL的细胞级分作为独特的团粒。在某些实施方案中，排除并丢弃维持浮力密度小于1.045g/mL的细胞。
本公开内容的治疗性组合物及其配制剂可包含分离的异质肾细胞群体和/或其混合物，其富集了特定的生物活性组分或细胞类型和/或消减了特定的无活性或不期望的组分或细胞类型，用于肾疾病的治疗，它们已经通过除去编码负责接受者中的免疫排斥的细胞表面抗原的遗传组分而遗传修饰，即提供肾功能和/或结构的稳定化和/或改善和/或再生。提供此类稳定化和/或改善的细胞的非限制性实例先前记载于Presnell等人U.S.8,318,484和Ilagan等人PCT/US2011/036347和Jain等人PCT/US2016/044866，每篇的全部内容通过引用并入本文。组合物可以含有分离的肾细胞部分，其与健康个体相比缺乏细胞成分但仍保留治疗性质，即提供肾功能的稳定化和/或改善和/或再生。本文所述的细胞群体、细胞级分和/或细胞混合物可衍生自健康个体、患有肾疾病的个体或本文所述的受试者。
本公开内容考虑了要施用至有需要的受试者中的靶器官或组织的经遗传修饰的(例如经基因组修饰的和/或经由RNAi修饰的)免疫豁免的选定肾细胞群体的治疗组合物。生物活性选定的肾细胞群体通常是指在施用于有需要的受试者时潜在地具有治疗特性的细胞群体。例如，在施用于有需要的受试者时，生物活性肾细胞群体可以在受试者中提供肾功能的稳定化和/或改善和/或修复和/或再生。治疗性质可包括修复或再生效应。
在某些实施方案中，细胞的来源与意图的靶器官或组织相同。例如，BRC和/或SRC可以源自肾，以用于要向肾施用的配制剂中。在某些实施方案中，细胞群体衍生自肾活组织检查。在某些实施方案中，细胞群体衍生自整个肾组织。在某些实施方案中，细胞群体衍生自哺乳动物肾细胞的体外培养物，从肾活组织检查或整个肾组织建立。在某些实施方案中，BRC和/或SRC包括生物活性肾细胞的异质混合物或级分。BRC和/或SRC可以衍生自来自健康个体的肾细胞级份，或者本身是来自健康个体的肾细胞级份。另外，本公开内容提供了从不健康个体获得的肾细胞级分，当与健康个体的相应肾细胞级分相比时，所述肾细胞级分可缺乏某些细胞成分，但仍保留治疗特性。本公开内容还提供了与健康个体相比缺乏细胞成分的治疗活性细胞群体，在某些实施方案中，所述细胞群体可以从各种疾病状态的自体来源分离并扩增。
在某些实施方案中，通过肾活组织检查从患者肾皮质组织中分离和扩增肾细胞获得SRC。通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，使用标准细胞培养技术进行扩增，并且通过跨越密度边界、屏障或界面离心扩增的肾细胞进行选择。在该实施方案中，SRC主要由肾小管上皮细胞组成，所述肾小管上皮细胞在其再生潜力上是已知的(BonventreJV.Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acuterenal failure.J Am Soc Nephrol.2003；14(Supp1.1)：S55-61；Humphreys BD，CzerniakS，DiRocco DP，等人Repair of injured proximal tubule does not involvespecialized progenitors.PNAS.2011；108：9226-31；Humphreys BD，Valerius MT，Kobayashi A，等人Intrinsic epithelial cells repair the kidney afterinjury.Cell Stem Cell.2008；2：284-91)。自体SRC群体中可存在其它实质(血管)和基质细胞。在某些实施方案中，通过连续或不连续的单步或多步梯度离心来选择肾细胞。
本文包括经遗传修饰的(例如经基因组修饰的和/或经由RNAi修饰的)免疫豁免的选定的肾细胞群体的治疗组合物，其要对有需要的受试者的靶器官或组织施用。生物活性的选定的肾细胞群体通常是指在施用于受试者后潜在具有治疗特性的细胞群体。例如，在施用于有需要的受试者后，生物活性肾细胞群体可以在受试者中提供肾功能的稳定化和/或改善和/或修复和/或再生。治疗性质可包括修复或再生效果。
在某些实施方案中，细胞来源与来自相同或不同来源的意图靶器官或组织相同。例如，BRC和/或SRC可以源自肾，以用于要向肾施用的配制剂中。在某些实施方案中，细胞群体衍生自肾活组织检查。在某些实施方案中，细胞群体衍生自整个肾组织。在某些实施方案中，细胞群体衍生自哺乳动物肾细胞的体外培养物，建立自肾脏活组织检查或整个肾脏组织。在某些实施方案中，BRC和/或SRC包含经遗传修饰的(例如，经基因组修饰的和/或经由RNAi修饰的)免疫豁免的生物活性肾细胞的异质混合物或级分。BRC和/或SRC可以衍生自来自健康个体的肾细胞级分或者自身是来自健康个体的肾细胞级分。另外，本发明提供了从不健康的个体获得的肾细胞级分，当与健康个体的相应肾细胞级分相比时，其可能缺乏某些细胞成分，但仍保留治疗特性。本发明还提供了与健康个体相比缺乏细胞成分的治疗活性细胞群体，在一个实施方案中，所述细胞群体可以从源自各种哺乳动物的肾分离并扩增。
在某些实施方案中，通过肾活组织检查从不同患者的肾皮质组织中分离和扩增肾细胞获得SRC。在某些实施方案中，通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，进行遗传修饰(例如，基因组修饰和/或经由RNAi修饰)以使它们变得免疫豁免或不能排斥，使用标准细胞培养技术扩增，并通过密度梯度离心从扩增的肾细胞选择。在某些实施方案中，SRC主要由肾上皮细胞构成，所述肾上皮细胞在其免疫豁免和再生潜力方面是已知的。SRC群体中可能稀疏存在其他实质(血管)和基质细胞。
如本文所述，本发明部分基于令人惊讶的发现，即异质肾细胞群体的某些亚级份(富集了生物活性成分并且消减了无活性或不期望的成分)提供了优于起始群体的治疗和再生结果。
肾细胞的分离和扩增提供了包括肾上皮细胞和基质细胞的肾细胞类型的混合物。如上所述，通过密度梯度分离扩增的肾细胞获得SRC。密度梯度分离的SRC群体中的主要细胞类型为肾小管上皮表型的。使用多管法评估从扩增的肾细胞获得的SRC的特征。在肾细胞扩增过程期间监测细胞形态、生长动力学和细胞活力。通过梯度界面和锥虫蓝排除表征SRC的浮力密度和存活力。通过流式细胞术表征SRC表型，并通过VEGF和KIM-1的表达证明SRC功能。
本领域普通技术人员将理解，本领域已知的其它分离和培养方法可以用于本文所述的细胞。本领域普通技术人员还将理解，生物活性细胞群体可以衍生自除上文具体列出的那些来源以外的来源，包括但不限于除肾以外的组织和器官、体液和脂肪。
SRC表型
在某些实施方案中，通过使用流式细胞术对肾细胞标志物的表达分析来监测细胞表型。细胞的表型分析基于对所分析细胞类型具有特异性的抗原性标志物的使用。流式细胞术分析提供了样品群体中表达分析的抗原性标志物的细胞的定量测量。
文献中已经报道了多种标志物可用于肾小管上皮细胞的表型表征：(i)细胞角蛋白；(ii)转运膜蛋白(水通道蛋白和吞饮受体)；(iii)细胞结合分子(粘附蛋白和分化簇和凝集素)；(iv)代谢酶(谷胱甘肽和γ-谷氨酰转肽酶(GGT))。(表1)由于在衍生自全肾消化液的培养物中发现的大多数细胞是上皮和内皮细胞，所检查的标志物集中于通常对这两组特异性的蛋白质的表达。
用于SRC表征的表型标志物
Figure BDA0002382941840000391
表2提供了SRC群体中表型的选定的标志物、范围和均值百分比数值和其选择的原理。
选择用于SRC的表型分析的标志物
Figure BDA0002382941840000401
细胞功能
SRC主动分泌可以通过条件化培养基分析检测的蛋白质。通过细胞代谢PrestoBlue以及分泌VEGF(血管内皮生长因子)和KIM-1(肾损伤分子-1)的能力来评估细胞功能。
表3显示了来自肾细胞和SRC培养物的条件培养基中存在的VEGF和KIM-1的量。将肾细胞培养至接近汇合。测试过夜暴露于肾细胞培养物的条件化培养基的VEGF和KIM-1。
表3.人肾细胞和SRC的VEGF和KIM-1产生
Figure BDA0002382941840000402
SRC酶促活性
也可以通过测量肾近端小管中发现的两种特异性酶GGT(γ-谷氨酰转肽酶)和LAP(亮氨酸氨肽酶)的活性来评估SRC(预配制)的细胞功能。
尽管本文描述了选定的肾细胞组合物，但是本发明考虑了含有多种其它活性剂的组合物。其它合适的活性剂包括但不限于细胞聚集体、无细胞生物材料、来自生物活性细胞的分泌产物、大分子和小分子治疗剂及其组合。例如，一种类型的生物活性细胞可以与具有或不具有治疗性分子或另一种类型的生物活性细胞的基于生物材料的微载体组合，未附着的细胞可以与无细胞颗粒组合。
示例性的遗传修饰方法
在某些实施方案中，遗传修饰细胞，例如BRC(例如，SRC)包括将基因编辑蛋白和/或核酸引入(例如，通过表达或通过跨细胞膜递送)到BRC中。
在某些实施方案中，基因编辑蛋白是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)、megaTAL或Cas蛋白。在某些实施方案中，蛋白质是单链稀疏切割(rarecleaving)核酸酶结构(“megaTAL”)。在某些实施方案中，可以将基因编辑蛋白例如ZFN、megaTAL或Cas蛋白(例如Cas9)作为蛋白质或者备选作为编码该蛋白质的多核苷酸(例如mRNA或载体)递送至细胞。
在某些实施方案中，将Cas9蛋白作为蛋白质递送。在某些实施方案中，将编码Cas9蛋白的多核苷酸(例如mRNA或载体)递送至细胞。在某些实施方案中，将基因编辑多核苷酸例如gRNA递送入细胞中。在CRISPR/Cas9系统的背景下，单引导RNA(“gRNA”或“引导RNA”)含有靶向序列(crRNA序列)和Cas9核酸酶募集序列(tracrRNA)两者。在某些实施方案中，将crRNA和/或tracrRNA递送到细胞中。在某些实施方案中，在细胞中从例如mRNA或载体表达基因编辑多核苷酸。在某些实施方案中，将包含Cas9蛋白和gRNA或crRNA和tracrRNA的基因编辑复合物，即CRISPR核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complex)(RNP)，递送至细胞中或在细胞内表达。
在某些实施方案中，Cas蛋白(例如，作为RNP的部分表达或递送)用于遗传修饰细胞。在某些实施方案中，Cas蛋白是Cas9蛋白或其突变体。本文描述了Cas蛋白的非限制性实例(包括Cas9和Cas9突变体的非限制性实例)。
在某些实施方案中，第一和第二gRNA或第一和第二crRNA分子一起包含与基因或其部分(例如，启动子和/或一个或多个其外显子和/或内含子)侧翼的靶序列互补的核酸序列，其中所述基因或其部分的长度为约1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100千碱基或长度至少约1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100千碱基。在某些实施方案中，将包含第一和第二gRNA或第一和第二crRNA分子的RNP对表达或递送到细胞中。在某些实施方案中，在细胞中表达RNP的一种组分(例如Cas蛋白或gRNA)，并且将另一种组分(例如gRNA或Cas蛋白)递送穿过细胞的细胞膜。
在某些实施方案中，gRNA或crRNA的靶序列长约12至约25，或约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、17-23或18-22个核苷酸。在某些实施方案中，靶序列长20个核苷酸或长约20个核苷酸。
在某些实施方案中，在靶定的基因组基因座处的表观基因组修饰可以修饰靶定的DNA位点对cas蛋白的可及性。在某些实施方案中，gRNA靶向其转录起始位点附近和/或以核小体的H3K4(或其他)残基的广泛甲基化为特征的开放染色质区域中的基因。在某些实施方案中，靶序列在靶定基因的转录起始位点的约5000、2500、2000、1500、1250、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50或25个碱基内(例如，在靶基因的5′端或3′端)。在某些实施方案中，靶序列与基因的转录起始位点的至少一部分重叠或互补。在某些实施方案中，可使用公开可获得的软件(CHOPCHOP，WU-CRISPR)来设计CRISPR靶向构建体(结合限定的DNA序列的gRNA)。表4和表5中显示了B2M和HLA-A基因的潜在gRNA靶位点的非限制性实例。
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在某些实施方案中，细胞(如BRC，例如SRC)群体的至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％，1-99％或更多在细胞经受递送Cas蛋白、gRNA分子、RNP和/或表达Cas蛋白和/或gRNA的一种或多种载体穿过其细胞膜的程序(例如，通过电穿孔或一些其他程序)后是存活的。
CRISPR-Cas系统的各个方面是本领域已知的。此系统的非限制性方面记载于例如2015年5月5日公告的美国专利号9,023,649；2015年7月7日公告的美国专利号9,074,199；2014年4月15日公告的美国专利号8,697,359；2015年1月13日公告的美国专利号8,932,814；2016年10月13日公布的美国申请公开号2016/0298096；Cho等人，(2013)NatureBiotechnology Vol 31 No 3 pp 230-232(包括增补信息)；和Jinek等人，(2012)ScienceVol 337 No 6096 pp 816-821，每篇的全部内容通过引用并入本文。
在CRISPR/Cas核酸酶系统中，CRISPR基因座编码该系统的RNA成分，并且Cas(CRISPR相关)基因座编码蛋白质。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相关(Cas)基因以及能够编程CRISPR介导的多核苷酸切割特异性的非编码RNA元件的组合。
II型CRISPR是最佳表征的系统之一，并且在四个连续的步骤中进行靶向性的双链断裂。第一，从CRISPR基因座转录两个非编码RNA，即pre-crRNA阵列和tracrRNA。第二，tracrRNA与pre-crRNA的重复区域杂交，并介导pre-crRNA的加工为成熟的含有个别间隔物序列的crRNA。第三，成熟的crRNA：tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔物和靶DNA上与原间隔物相邻基序(PAM)(靶物识别的另外的要求)相邻的原间隔物之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9引导至靶DNA。在工程化的CRISPR/Cas9系统中，gRNA也称为单引导RNA(“gRNA”)可以用包含原间隔物元件和接头环序列的单个RNA构建体替换crRNA和tracrRNA。使用gRNA可以简化使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑所需要的组分。不同生物体的Cas9种类具有不同的PAM序列。例如，酿脓链球菌(Sp)具有5′-NGG-3′的PAM序列，金黄色葡萄球菌(Sa)具有5′-NGRRT-3′或5′-NGRRN-3′的PAM序列，脑膜炎奈瑟氏球菌(NM)具有5’-NNNNGATT-3′的PAM序列，嗜热链球菌(St)具有5′-NNAGAAW-3′的PAM序列，齿垢密螺旋体(Treponema denticola，Td)具有5′-NAAAAC-3′的PAM序列。Cas9介导靶DNA的切割，从而在原间隔物内创建DSB。自然界中CRISPR/Cas系统的活性包括三个步骤：(i)在称为“适应”的过程中将外源DNA序列插入CRISPR阵列中，以防止将来的攻击，(ii)相关蛋白的表达，以及阵列的表达和加工，然后(iii)RNA介导的对外来多核苷酸的干扰。外来多核苷酸来自附着细菌细胞的病毒。因此，在细菌细胞中，所谓的“Cas”蛋白中的几种与CRISPR/Cas系统的天然功能有关，并在诸如插入外源DNA等功能中起作用。CRISPR也可以与除Cas9外的核酸酶一起发挥功能。来自Cpf1家族的两种基因含有RuvC样内切核酸酶域，但是它们缺少Cas9的第二个HNH内切核酸酶域。Cpf1以交错模式切割DNA，并且仅需要一个RNA，而非Cas9进行切割所需要的两个RNA(tracrRNA和crRNA)。Cpf1的优选PAM是5′-TTN，在基因组位置和GC含量两者上与Cas9(3′-NGG)不同。Cpfl介导的切割的成熟crRNA长度为42-44个核苷酸，与Cas9的大小大致相同，但直接重复位于间隔物之前而不是间隔子之后。Cpf1 crRNA的结构也比Cas9的简单得多；在直接重复区域中仅短的茎环结构对于切割靶标是必需的。Cpf1也不需要其他tracrRNA。Cas9在PAM位点上游3nt处产生平端，而Cpf1以交错方式切割，在距PAM的18-23nt处形成5个核苷酸5′突出端。除了Cas9之外，可以使用其他CRISPR相关的蛋白质代替Cas9。例如，CRISPR相关蛋白1(Cas1)是在CRISPR原核免疫防御系统中发现的两个普遍保守的蛋白之一。Cas1是一种金属依赖性DNA特异性内切核酸酶，其产生双链DNA片段。Cas1与其他普遍保守的CRISPR相关蛋白Cas2形成稳定的复合物，所述Cas2是CRISPR系统间隔物获取的部分。
也有不使用PAM序列的CRISPR/Cas9变体，例如NgAgo。NgAgo在24个核苷酸的ssDNA引导的情况下发挥功能，并且认为从此序列的开始切割8-11个核苷酸。ssDNA随蛋白质折叠而加载，并且不能交换至不同引导，除非温度升高至非生理性的55℃。靶DNA中的几个核苷酸在切割位点附近除去。使用NgAgo的技术记载于Gao，F.等人，DNA-guided GenomeEditing Using the Natronobacterium Gregoryi Argonaute，34 Nature Biotechnology768(2016)，其全部内容通过引用并入本文。DSB可以通过在不同位置处产生两个单链断裂，创建带有粘性末端的切割DNA分子来形成。单链断裂或“切口”可由仅含一个活性催化域的Cas9酶的修饰形式(称为“Cas9切口酶”)形成。Cas9切口酶仍然基于gRNA特异性结合DNA，但是切口酶只能切割DNA链之一。需要两个靶向相反链的切口酶以在靶DNA内产生DSB(通常称为“双切口”或“双切口酶”CRISPR系统)。此要求大大提高了靶物特异性，因为不太可能在足够接近的范围内产生两个脱靶切口以引起DSB。使用双切口酶CRISPR系统创建DSB的技术记载于Ran，等人，Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced GenomeEditing Specificity，154 Cell 6：1380(2013)，其全部内容通过引用并入本文。
Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及其同源物和修改形式。这些酶是已知的；例如，酿脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2(SEQ ID NO：1)和在NCBI数据库中以登录号Q99ZW2.1找到。UniProt数据库登录号A0A0G4DEU5和CDJ55032提供了Cas9蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的另一个实例。另一个非限制性实例是嗜热链球菌Cas9蛋白，其氨基酸序列可以在UniProt数据库中以登录号Q03JI6.1(SEQ ID NO：3)找到。在某些实施方案中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，例如Cas9。在某些实施方案中，CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自酿脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9。在某些实施方案中，CRISPR酶在靶序列的位置处指导一条或两条链的切割，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内。在某些实施方案中，CRISPR酶在距靶序列的第一个或最后一个核苷酸的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个碱基对内指导一条或两条链的切割。在某些实施方案中，载体编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，酿脓链球菌Cas9的RuvC I催化域中的天冬氨酸至丙氨酸取代(D10A，其中氨基酸编号如SEQ ID NO：1所示)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单链)。使Cas9成为切口酶的突变的其他实例包括但不限于H840A、N854A和N863A(其中氨基酸编号如SEQ ID NO：1所示)。在某些实施方案中，切口酶可通过同源重组用于基因组编辑。
在某些实施方案中，Cas9切口酶可以与引导序列，例如两个引导序列结合使用，所述引导序列分别靶向DNA靶物的有义和反义链。此种组合允许对两条链产生切口并用于诱导NHEJ。
在某些实施方案中，使用碱基编辑蛋白实现遗传操作。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白是经修饰的蛋白(例如Cas蛋白或另一种蛋白)，其在不引入(初始或在其他情况下)双链DNA断裂的情况下催化一种碱基向另一种碱基的转变和颠换(例如，A至T，C至G等)。包含碱基编辑器Cas蛋白的CRISPR/Cas系统代表下一代CRISPR系统。在Gaudelli等人(2017)Programmable base editing of A·T to G·C in genomic DNA without DNAcleavage，Nature volume 551，pages 464-471；和Gehrke等人(2018)High-precisionCRISPR-Cas9 base editors with minimized bystander and off-target mutations，bioRxiv 273938；doi：https：//doi.org/10.1101/273938(每篇的全部内容通过引用并入本文)中提供了此类系统的非限制性描述。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，其在基因组DNA中介导A·T向G·C的转化。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白包含与催化受损的CRISPR-Cas突变体(例如CRISPR-Cas9突变体)融合的腺苷脱氨酶(例如，经修饰以在DNA上操作的RNA腺苷脱氨酶)。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白是胞苷碱基编辑器(ABE)，其介导基因组DNA中C·G向T·A的转化。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白包含与载脂蛋白B编辑复合物(APOBEC)(例如，大鼠APOBEC1或人APOBEC3A(A3A)胞苷脱氨酶)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合的带有将其转化为切口酶(nCas9)的突变的Cas9核酸酶。在某些实施方案中，RNA或DNA碱基编辑器包含除Cas9变体以外的Cas变体，例如Cas13变体。各种基因编辑蛋白和Cas变体可用于碱基编辑。
在某些实施方案中，递送的基因编辑蛋白(例如ZFN、megaTAL或Cas蛋白)可包含或融合至亚细胞定位信号以包含基因编辑融合蛋白。根据上下文，包含例如Cas9和核定位信号的融合蛋白在本文中可以称为“Cas9”，而没有规定包括核定位信号。在某些实施方案中，融合蛋白可包含核定位信号。在某些实施方案中，Cas蛋白可包含超过一个定位信号，例如2、3、4、5或更多个核定位信号。在某些实施方案中，定位信号在Cas蛋白的N-末端，并且在其他实施方案中，定位信号在Cas蛋白的C-末端。
核定位信号的非限制性实例包括GGSGPPKKKRKV(SEQ ID NO：4)，PKKKRKV(SEQ IDNO：5)，KR[PAATKKAGQA]KKKK(SEQ ID NO：6)，KR[XXXXXXXXXX]KKKK(SEQ ID NO：7)，KKXK(SEQ ID NO：8)，KRXK(SEQ ID NO：9)，KKXR(SEQ ID NO：10)，KRXR(SEQ ID NO：11)，AVKRPAATKKAGQAKKKKLD(SEQ ID NO：12)，MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN(SEQ ID NO：13)，PAAKRVKLD(SEQ ID NO：14)，PPKKKRKV(SEQ ID NO：15)，和KLKIKRPVK(SEQ ID NO：16)。
在某些实施方案中，对编码CRISPR酶的酶编码序列进行密码子优化以在特定细胞，如哺乳动物细胞，例如人细胞中表达。
通常，引导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在某些实施方案中，当使用合适的比对算法最佳比对时，引导序列与其相应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约90％，95％，97.5％，98％，99％或更多。在某些实施方案中，互补性程度为100％。可以使用任何合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对，所述算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(NovocraftTechnologies，ELAND(Illumina，San Diego，Calif.)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在某些实施方案中，引导序列的长度为约或大于约15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸。在某些实施方案中，引导序列的长度小于约30、25、20、15或更少的核苷酸。可以通过任何合适的测定法评估引导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统组分(包括要测试的引导序列)可以提供给具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过用编码CRISPR序列组分的载体转染，然后评估靶序列内的优先切割。类似地，可以通过提供靶序列，CRISPR复合物的组分，包括要测试的引导序列和不同于测试引导序列的对照引导序列，并且比较测试和对照引导序列反应之间在靶序列处的结合或切割速率在试管中评估靶多核苷酸序列的切割。
可以选择引导序列以靶向任何靶序列。在某些实施方案中，靶序列是细胞基因组内的序列。在某些实施方案中，靶序列在靶基因组中是独特的。
在某些实施方案中，使用ZFN来遗传修饰细胞。ZFN是通过将锌指DNA结合域融合到DNA切割域而产生的人工限制性酶。锌指域可以被工程化改造以靶向特定的期望DNA序列，并且这使锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的独特序列。通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可用于精确地改变高等生物体的基因组。除Cas9和TALEN蛋白外，ZFN正在成为基因组编辑领域的重要工具。锌指核酸酶是一种位点特异性内切核酸酶，其设计为结合并切割特定位置处的DNA。有两个蛋白质域。第一域是DNA结合域，其含有真核转录因子和锌指。第二域是核酸酶域，其包含限制酶(例如FokI限制酶)，并负责DNA的催化切割。个别ZFN的DNA结合域通常含有3-6个个别的锌指重复序列，并且各自可识别9-18个碱基对。在某些实施方案中，若锌指域对其意图的靶位点是完全特异性的，则即使识别总共18个碱基对的一对3指ZFN也可以靶向哺乳动物(例如人)基因组中的单个基因座。在某些实施方案中，将已知特异性的较小的锌指“模块”组合。在某些实施方案中，模块组装过程涉及组合三个分开的锌指，它们各自可识别3个碱基对的DNA序列，以产生可识别9个碱基对的靶位点的3指阵列。在某些实施方案中，将来自II型限制性内切核酸酶FokI的非特异性切割域用作ZFN中的切割域。此切割域必须二聚化以切割DNA。在某些实施方案中，使用一对ZFN靶向非回文DNA位点。在某些实施方案中，将切割域与每个锌指域的C末端融合。在某些实施方案中，两个个别的ZFN以其C末端相隔一定距离结合DNA的相反链。
TALEN是可以工程化改造以切割DNA的特定序列的限制酶。它们是通过将TAL效应物DNA结合域与DNA切割域(即切割DNA链的核酸酶)融合而制备的。可以工程化改造转录激活物样效应物(TALE)，以结合实际上任何期望的DNA序列，因此当与核酸酶组合时，可以在特定位置处切割DNA。可以将限制酶引入细胞中，用于基因编辑或原位基因组编辑。DNA结合域含有重复的高度保守的33-34个氨基酸序列，具有趋异的第12和13个氨基酸。这两个位置(称为重复可变残基(RVD))是高度可变的，并显示出与特异性核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列与DNA识别之间的此种直接关系允许通过选择包含适当RVD的重复片段的组合来工程化改造特定的DNA结合域。值得注意的是，RVD的细微变化和“非常规”RVD序列的参与可改善靶向特异性。本领域普通技术人员将知道如何设计和使用TALEN在期望的靶位点处在dsDNA中创建DSB。一些合适的方案可在Hermann，M.等人，Mouse Genome EngineeringUsing Designer Nucleases，86 J.Vis.Exp.50930(2014)和Sakuma，T.等人，EfficientTALEN Construction and Evaluation Methods for Human Cell and AnimalApplications，18(4)Genes Cells 315(2013)中得到。
megaTAL源自两种不同类别的DNA靶向酶的组合。大范围核酸酶(也称为归巢内切核酸酶)是单肽链，其具有在同一域中DNA识别和核酸酶功能两者的优势。然而，大范围核酸酶靶物识别难以修改，并且它们经常比其他基因组靶向内切核酸酶具有降低的特异性和更低的中靶切割效率。转录激活物样(TAL)效应物是DNA识别蛋白，其已连接到单独的DNA内切核酸酶域以实现靶向性DNA双链断裂。与大范围核酸酶相比，TAL易于工程化改造以靶向特定的DNA序列。megaTAL是TAL效应物与大范围核酸酶的统一，其中TAL效应物的DNA结合区域用于“寻址”与单个期望基因组靶位点相邻的位点特异性大范围核酸酶。关于megaTAL的非限制性记载于Boissel等人(2014)Nucleic Acids Research 42(4)：2591-2601，其全部内容通过引用并入本文。
本公开内容的方面涉及例如通过突变(例如，插入、删除或点突变)对基因组免疫原性基因的修饰。在某些实施方案中，基因编码MHC-1的组分。在某些实施方案中，基因编码MHC-II的组分。基因组免疫原性基因的非限制性实例包括B2M，HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRA，HLA-DRB1，HLA-DRB3，HLA-DRB4，HLA-DRB5，HLA-DPA1，HLA-DPA2，HLA-DQA1和/或HLA-DQB1。此类基因的许多变体天然存在于例如人类中。
在某些实施方案中，遗传修饰不是基因组的。在某些实施方案中，使用短干扰RNA和短发夹RNA介导基因沉默。在某些实施方案中，天然基因组是未修饰的，并且RNAi在RNA水平上起作用以减少或关闭诸如B2M或HLA-A的靶定基因的表达，从而潜在地实现与基因编辑相似的最终结果。
遗传工程化肾细胞群体
本发明的一个主要目的是在工程化改造非自体反应性肾细胞，特别是BRC(例如，SRC群体)的方法中使用如先前所述的基因编辑技术(例如CRISPR/Cas9)，用于治疗慢性肾疾病。本文所述的方法和组合物增加供体细胞(例如BRC，例如SRC)的免疫相容性(免疫豁免)，用于移植至接受体受试者，从而建立使用“通用供体”肾细胞群体并允许在无免疫抑制的情况下对患者施用“同种异体”肾细胞群体的能力。这可以通过细胞的一种或多种免疫原性基因(例如，HLA基因)的靶物特异性失活或修饰，从而产生适合移植入接受体受试者中的供体细胞来实现。
证明了哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9系统的发现和应用是编辑靶基因的有效且精确的手段，例如通过非同源末端连接途径(NHEJ)、同源性指导的修复(HDR)或其他DNA修复途径。Cas9分子和靶物特异性引导RNA(gRNA)分子的共递送(可选地与供体DNA修复模板分子一起)有助于基因组中靶序列的基因编辑。因此，使用CRISPR/Cas9系统修饰细胞中的基因是治疗多种遗传疾病的有希望的策略。关于更多详细信息，参见Sanders and Joung，Nature Biotechnology 32，347-355(2014)。
在某些实施方案中，通过使本文所述的细胞与Cas9分子和至少一种靶向内源免疫原性基因的靶物特异性引导RNA(gRNA)接触来改变特定HLA等位基因以产生免疫相容性细胞群体(例如，免疫相容性肾细胞群)。使用本文所述的方法和组合物产生的细胞在移植到接受体受试者中时不太可能诱导免疫应答和/或不太可能被接受体受试者的免疫系统排斥。不管供体的免疫原性基因单倍型如何，改善可定制化以移植到任何供体受试者中的供体细胞的免疫相容性的能力特别有利，因为它导致可在多种临床应用的细胞疗法领域中使用的供体细胞池的显著增加。
通过使基因失活，意欲目的基因不以功能蛋白形式表达。在某些实施方案中，方法的遗传修饰依赖于工程化改造的所提供的细胞中表达RNA引导的内切核酸酶，使得其催化一个靶定基因中的切割，从而使靶定基因失活。内切核酸酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同机制修复。然而，NHEJ是一个不完善的修复过程，其通常导致切割位点处的DNA序列发生变化。机制牵涉通过直接重新连接(Critchlow和Jackson 1998)或通过所谓的微同源性介导的末端连接(Betts，Brenchley等人2003；Ma，Kim等人2003)重新连接两个DNA末端的残留物。通过非同源末端连接(NHEJ)进行的修复通常会导致小的插入或删除，并可用于创建特定的基因敲除。所述修饰可以是至少一个核苷酸的取代、删除或添加。可以通过本领域公知的方法来鉴定和/或选择发生切割诱导的诱变事件，即与NHEJ事件连续的诱变事件的细胞。在某些实施方案中，使用不引入DNA断裂(例如，双链DNA断裂)的碱基编辑CRISPR蛋白。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白是经修饰的Cas蛋白，其催化一个碱基向另一个碱基(例如，A至T，C至G等)的转化和颠换，而不引入(初始或在其他情况下)双链。DNA断裂。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白包含与催化受损的CRISPR-Cas突变体(例如CRISPR-Cas9突变体)融合的腺苷脱氨酶。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白包含与载脂蛋白B编辑复合物(APOBEC)(例如，大鼠APOBEC1或人APOBEC3A(A3A)胞苷脱氨酶)和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合的带有将其转化为切口酶(nCas9)的突变的Cas9核酸酶。在某些实施方案中，碱基编辑蛋白是特异性作用于RNA的Cas13突变体。
在某些实施方案中，提供了用于减少肾细胞中内源免疫原性基因的第一等位基因的细胞表面表达的方法，其包括使肾细胞与第一等位基因特异性gRNA分子和Cas9分子接触，其中等位基因特异性gRNA分子和Cas9分子与内源免疫原性基因的第一等位基因缔合，从而降低内源免疫原性基因的第一等位基因的细胞表面表达。在某些实施方案中，提供了产生经修饰的免疫相容性肾细胞群体的方法，其通过使肾细胞群体与第一等位基因特异性修饰的gRNA分子和Cas9分子接触进行，其中第一等位基因特异性修饰的gRNA分子和Cas9分子与内源免疫原性基因的第一等位基因缔合，从而修饰内源免疫原性基因的第一等位基因并产生免疫相容性肾细胞群体。在某些实施方案中，如通过混合淋巴细胞或自细胞反应测定法测定的，基于供体和接受体细胞之间的增加的匹配和降低的免疫原性，经遗传修饰的肾细胞具有降低的被接受体受试者排斥的可能性。在某些实施方案中，可以使用本文描述的方法，使用一个或多个等位基因特异性gRNA分子和Cas9分子来改变第一、第二、第三、第四、第五、第六、第二、第八、第九、第十或更多等位基因。在某些实施方案中，使用本文描述的方法改变的等位基因可导致改变的等位基因失活。在某些实施方案中，该方法可以还包括使细胞或细胞群体与第二Cas9分子接触。
在某些实施方案中，提供了用于制备包含针对特定基因修饰富集的细胞群体的组合物的离体方法，其通过使细胞群体与至少一个靶物特异性gRNA分子和Cas9分子接触进行，其中所述靶物特异性gRNA分子和Cas9分子与编码可鉴定基因产物的基因缔合；并富集缺乏可鉴定基因产物表达的细胞。在某些实施方案中，在本文描述的方法中富集表达基因产物的细胞的步骤可以包括使用例如FACS或MACS对细胞进行分选。在某些实施方案中，离体方法包括富集具有等位基因特异性基因修饰的细胞群体，其中等位基因特异性gRNA分子和Cas9分子与编码可鉴定基因产物的基因的单一等位基因缔合；并且富集表达可鉴定基因产物但不表达第一等位基因的细胞。在某些实施方案中，富集表达基因但不表达第一等位基因的细胞的步骤可包括使多个细胞中的每个与第一抗体和第二抗体接触，所述第一抗体特异性结合由基因的第一等位基因编码的可鉴定基因产物的第一变体，所述第二抗体结合可鉴定基因产物的第二变体。在某些实施方案中，富集表达基因但不表达第一等位基因的细胞的步骤可包括在多个细胞的每个细胞中检测与可鉴定基因产物的功能变体相关的物质或信号。细胞群体可以是生物活性肾细胞群体。
本文所述的方法可以任选地还包括通过使用等位基因特异性抗体对细胞群进行分选来选择表达基因的特定等位基因的细胞。在某些实施方案中，可以通过荧光激活细胞分选(FACS)或免疫磁微珠介导的细胞分选来分选细胞群体。在某些实施方案中，方法还包括获取细胞序列以确认修饰。
在某些实施方案中，基因可以是免疫原性基因。在某些实施方案中，可鉴定的基因产物可以是细胞表面标志物。在某些实施方案中，可鉴定的基因产物可以是人白细胞抗原(HLA)。在某些实施方案中，可鉴定的基因产物可以是主要组织相容性抗原复合物蛋白或次要组织相容性抗原(MiHA或mHA)(例如趋化因子受体)。mHA的非限制性示例包括：
Figure BDA0002382941840000891
尽管任何遗传多态性都可引起次要组织不相容性，但编码次要抗原的基因数目有限。在约100种存在抗原中，已经鉴定出位于常染色体上的约10种次要抗原。Y染色体也带有一些编码mHA的基因。鉴定的第一次要组织相容性肽是HA-2，移植物抗宿主病相关的mHA。所有mHA中研究最多的是HY抗原。在某些实施方案中，gRNA分子可包含与mHA基因中的靶域互补的靶向域。在某些实施方案中，gRNA分子可包含与HA-1，HA-2，HA-8，HB-1，HY-A1，HY-A2，HY-B7，HY-B8，HY-B60，或HY-DQ5基因中的靶域互补的靶向域。
在某些实施方案中，gRNA分子可包含与HLA基因中的靶域互补的靶向域。HLA基因可以选自HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DRB1，HLA-DRB3/4/5，HLA-DQ家族基因(例如，HLA-DQA1和/或HLA-DQB1)和HLA-DP家族基因(例如HLA-DPA1和/或HLA-DPA2)。
在某些实施方案中，细胞或细胞群体可以是原代肾细胞或选定的肾细胞群体。在某些实施方案中，细胞群体可以是异质细胞群体或同质细胞群体。
在某些实施方案中，为了验证一种或多种靶定的HLA等位基因已被CRISPR/Cas9活性失活，可以使用常规方法(例如，等位基因特异性PCR，qRT-PCR或流式细胞仪中的一种或多种)测定靶向之前和之后的供体细胞的等位基因序列的改变或等位基因的表达。在某些实施方案中，可以将具有或不具有基因组编辑的供体细胞与NK细胞共培养，并且将针对供体细胞的溶细胞活性进行定量以测定HLA表达的下调。验证后，可以通过常规分选方法从未修饰的细胞中富集，分离或纯化一种或多种错配的供体HLA等位基因被失活和/或引入一种或多种匹配的接受体HLA等位基因的细胞。
细胞聚集体
一方面，本公开内容的配制剂含有细胞聚集体或球状体。在某些实施方案中，细胞聚集体包含本文所述的生物活性细胞群体。在某些实施方案中，细胞聚集体包含生物活性肾细胞，诸如例如肾细胞混合物、富集的肾细胞群体和肾细胞级分的组合和肾细胞与间充质干细胞、内皮祖细胞、衍生自脂肪的基质血管级份的细胞或其它任何非肾细胞群体(非限制性)的混合物。
在某些实施方案中，本公开内容的生物活性肾细胞可以以3D形式培养，如本文进一步描述。在某些实施方案中，术语“类器官”是指具有重演天然肾的各方面的表型和/或功能的细胞积累。在某些实施方案中，类器官包括通常在体内在给定组织中发现的多种谱系的混合细胞群体。在某些实施方案中，本公开内容的类器官通过任何手段在体外形成，由此本公开内容的细胞形成聚集体，其继而可以形成球状体、类器官或其组合。在某些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官具有与特定器官一致的结构。在某些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官体表达表面标志物，其通常由特定器官的细胞表达。在某些实施方案中，此类聚集体、球状体或类器官产生典型由特定器官的细胞表达的化合物或材料。在某些实施方案中，本公开内容的细胞可以在天然基底，例如明胶上培养。在某些实施方案中，本公开内容的细胞可以在合成基底，例如PLGA上培养。
生物材料
多种生物材料可以与活性剂组合以提供本公开内容的治疗配制剂。在某些实施方案中，生物材料可以为任何合适的形状(例如，珠)或形式(例如，液体，凝胶等)。聚合物基质形式的合适的生物材料记载于Bertram等人美国公开申请20070276507(通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，可以将聚合物基体或支架成形为任意数目的期望构造，以满足任意数目的整体系统、几何形状或空间限制。在某些实施方案中，生物材料为液体悬浮液的形式。在某些实施方案中，本公开内容的基质或支架可以是三维的并且成形为符合器官或组织结构的尺寸和形状。例如，在聚合物支架用于治疗肾疾病、肾小管转运缺陷或肾小球过滤缺陷的用途中，可以使用三维(3-D)基质来重演天然肾组织结构和组织的各个方面或全部以及肾实质的。
可以使用多种不同形状的3-D支架。自然地，可以将聚合物基质成形为不同的尺寸和形状，以适应不同体格的患者。聚合物基质还可以以其它方式成形以适应患者的特殊需要。在某些实施方案中，聚合物基质或支架可以是生物相容的材料(如多孔聚合物支架)。支架可由多种合成或天然存在的材料形成，包括但不限于开孔聚乳酸(open-cellpolylactic acid)
Figure BDA0002382941840000911
、纤维素醚、纤维素、纤维素酯、氟化聚乙烯、酚醛(phenolic)、聚-4-甲基戊烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰胺酰亚胺、聚丙烯酸酯、聚苯并恶唑、聚碳酸酯，聚氰基芳基醚，聚酯，聚酯碳酸酯，聚醚，聚醚醚酮，聚醚酰亚胺，聚醚酮，聚醚砜，聚乙烯，聚氟烯烃，聚酰亚胺，聚烯烃，聚恶二唑，聚苯醚，聚苯硫醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚硫化物，聚砜，聚四氟乙烯，聚硫醚、聚三唑、聚氨酯、聚乙烯基、聚偏二氟乙烯、再生纤维素、硅酮、尿素甲醛(urea-formaldehyde)、胶原、明胶、藻酸盐、层粘连蛋白、纤连蛋白、丝、弹性蛋白、藻酸盐、透明质酸、琼脂糖或共聚物或物理物质其混合物。支架构造的范围可以为软的多孔支架至刚性形状保持的多孔支架。在某些实施方案中，支架配置为能够成为水凝胶的液体溶液，例如高于熔化温度的水凝胶。
在某些实施方案中，支架衍生自人或动物起源的现有肾或其它器官，其中通过应用对本领域普通技术人员已知的洗涤剂和/或其它化学试剂和/或其它已知的酶促和/或物理方法消除了天然细胞群体。在该实施方案中，来源器官的天然三维结构与所有相关的胞外基质组分一起保留在其天然的生物活性背景中。在某些实施方案中，支架是衍生自人或动物肾或其它器官的胞外基质。在某些实施方案中，通过应用三维生物打印方法将配置组装成组织样结构。在某些实施方案中，该构造是能够变成水凝胶的溶液的液体形式。
在某些实施方案中，生物材料是水凝胶。水凝胶可以由多种聚合物材料形成，并且可用于多种生物医学应用中。水凝胶在物理上可以描述为亲水性聚合物的三维网络。根据水凝胶的类型，它们包含不同百分比的水，但完全不溶于水。尽管水含量高，但由于存在亲水性残基，水凝胶仍能够额外结合大量液体。水凝胶在不改变其凝胶状结构的情况下广泛膨胀。水凝胶的基本物理特征可以根据所使用的聚合物的性质和用于施用水凝胶的装置进行具体修改。
水凝胶材料优选不引起炎症应答。可用于形成水凝胶的其它材料的例子包括(a)改性藻酸盐，(b)通过暴露于单价阳离子而胶凝的多糖(例如结冷胶和角叉菜胶)，(c)多糖(例如透明质酸)，其是很粘的液体，或者是触变的，并通过缓慢的结构演变形成凝胶，(d)明胶或胶原，以及(e)聚合水凝胶前体(例如，聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物和蛋白质)。美国专利US 6,224,893 B1提供了适用于生产根据本发明的水凝胶的各种聚合物以及此类聚合物的化学性质的详细描述。
在一个具体的实施方案中，用于配制本公开内容的生物材料的水凝胶是基于明胶的。明胶是一种衍生自胶原的无毒、可生物降解且水溶性的蛋白质，所述胶原是间充质组织胞外基质(ECM)的主要成分。胶原是动物体内各种结缔组织中细胞外空间的主要结构蛋白。作为结缔组织的主要成分，它是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占全身蛋白质含量的25％至35％。取决于矿化的程度，胶原组织可以是刚性的(骨)，顺应性的(肌腱)，或具有从刚性至顺应性的梯度(软骨)。伸长的原纤维形式的胶原主要存在于肌腱、韧带和皮肤等纤维组织中。它在角膜、软骨、骨骼、血管、肠、椎间盘和牙齿中的牙本质中也是丰富的。在肌肉组织中，它充当肌内膜的主要成分。胶原占肌肉组织的1-2％，并且占强壮的腱肌肉重量的6％。胶原遍布人体的许多地方存在。但是，人体中超过90％的胶原是I型。
迄今为止，已经鉴定和描述了28种胶原。根据它们形成的结构，它们可以分为几类：原纤维(I、II、III、V、XI型)。非原纤维FACIT(具有中断三重螺旋的原纤维相关胶原)(IX、XII、XIV、XVI、XIX型)。短链(VIII，X型)。基底膜(IV型)。Multiplexin(具有中断的多个三重螺旋域)(XV、XVIII型)。MACIT(具有中断三重螺旋的膜相关胶原)(XIII，XVII型)。其它(VI，VII型)。五个最常见的类型是：I型：皮肤、腱、血管连接、器官、骨(骨有机部分的主要组分)。II型：软骨(软骨的主要胶原成分)III型：网状(网状纤维的主要成分)，通常与I型一起发现。IV型：形成基底层，基底膜的上皮分泌层。V型：细胞表面。毛发和胎盘。
明胶保留包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列在内的信息信号，其促进细胞粘附、增殖和干细胞分化。明胶的特征性质是它表现出上临界溶液温度行为(UpperCritical Solution Temperature behavior，UCST)。高于40℃的特定温度阈值，明胶可通过形成柔性随机的单个卷而溶于水中。冷却后，发生氢键键合和范德华相互作用，从而形成三重螺旋。这些胶原样的三重螺旋作用为连接区，因此触发了溶胶-凝胶转变(sol-geltransition)。明胶广泛用于制药和医疗应用。
在某些实施方案中，用于配制本文中的可注射细胞组合物的水凝胶基于猪明胶，其可源自猪皮并且可购自例如Nitta Gelatin NA Inc(NC，USA)或Gelita USA Inc.(IA，USA)。明胶可以溶解在例如Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中以形成热响应性水凝胶，该凝胶可以在不同的温度下胶凝和液化。在某些实施方案中，用于配制本文的可注射细胞组合物的水凝胶基于使用本领域普通技术人员已知的方法表达和纯化的重组人或动物明胶。在某些实施方案中，在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达包含I型alpha I人胶原的全部或部分cDNA的表达载体。其它表达载体系统和生物体是本领域普通技术人员已知的。在一个具体的实施方案中，本公开内容的基于明胶的水凝胶在室温(22-28℃)及以上为液体，并且当冷却至冷藏温度(2-8℃)时为凝胶。
本领域普通技术人员将理解，本领域已知的其它类型的合成或天然存在的材料可以用于形成如本文所述的支架。
在某些实施方案中，根据本发明使用的生物材料包括水凝胶形式的透明质酸(HA)，其包含大小范围为5.1kDA-＞2 x 105kDa的HA分子。HA可促进相关生物活性细胞群体的分支形态发生和三维自构造。在某些实施方案中，根据本公开使用的生物材料包含多孔泡沫形式的透明质酸，还含有大小范围为5.1kDA-＞2 x 105kDa的HA分子。在某些实施方案中，水凝胶衍生自肾或包含源自肾或任何其它组织或器官(非限制性)的胞外基质。在又一个实施方案中，根据本发明使用的生物材料包括基于聚乳酸(PLA)的泡沫，其具有开孔结构且约50微米至约300微米的孔径。
温度敏感性生物材料
本文所述的生物材料还可以设计或适应于响应某些外部条件，例如在体外或体内。在某些实施方案中，生物材料是温度敏感性(例如，体外或体内)。在某些实施方案中，生物材料适合于响应对酶促降解的暴露(例如，体外或体内)。如本文所述，可以微调生物材料对外部条件的响应。可以通过调节配制剂中生物材料的百分比来改变配制剂的温度敏感性。例如，可以调节溶液中明胶的百分比以调节最终配制剂(例如，液体，凝胶，珠等)中明胶的温度敏感性。或者，可以将生物材料化学交联以提供对酶促降解的更大抗性。例如，碳二亚胺交联剂可用于使明胶珠化学交联，从而提供降低的对内源酶的易感性。
一方面，本文所述的配制剂掺入了生物材料，所述生物材料具有为要施用于受试者的活性剂(例如生物活性肾细胞)创造有利环境的特性。在某些实施方案中，配制剂包含第一生物材料，该第一生物材料从活性剂与生物材料一起配制的时间到施用于受试者的时间点提供了有利的环境。在某些实施方案中，有利的环境涉及在施用于受试者之前相对于液体中的细胞在基本上固体状态中悬浮生物活性细胞的优点(如本文所述)。在某些实施方案中，第一生物材料是温度敏感性生物材料。温度敏感性生物材料可具有(i)在约8℃以下为基本上固体状态，和(ii)在环境温度以上为基本上液体状态。在某些实施方案申，环境温度为约室温。
在某些实施方案中，生物材料是温度敏感性生物材料，其可以根据温度维持至少两个不同的相或状态。生物材料能够在第一温度下维持第一状态，在第二温度下维持第二状态，和/或在第三温度下维持第三状态。第一、第二或第三状态可以是基本上固体状态、基本上液体状态或基本上半固体状态或半液体状态。在某些实施方案中，生物材料在第一温度下具有第一状态并且在第二温度下具有第二状态，其中第一温度低于第二温度。
在某些实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约8℃以下为基本上固体状态。在某些实施方案中，于1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、或约8℃维持基本上固体状态。在某些实施方案中，基本上固体状态具有凝胶形式。在某些实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在环境温度以上温度为基本上液体状态。在某些实施方案中，于约25℃、约25.5℃，约26℃、约26.5℃，约27℃，约27.5℃，约28℃，约28.5℃，约29℃、约29.5℃、约30℃，约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃维持基本上液体状态。在某些实施方案中，环境温度约为室温。
在某些实施方案中，温度敏感生物材料的状态在约环境温度或以下的温度下为基本上固体状态。在某些实施方案中，环境温度为约室温。在某些实施方案中，于约17℃、约16℃、约15℃、约14℃、约13℃、约12℃、约11℃、约10℃、约9℃、约8℃、约7℃、约6℃、约5℃、约4℃、约3℃、约2℃、或约1℃维持基本上固体状态。在某些实施方案中，基本上固体状态具有珠的形式。在某些实施方案中，温度敏感性生物材料的状态在约37℃以上为基本上液体状态。在某些实施方案中，在约37℃、约38℃、约39℃或约40℃维持基本上固体状态。
温度敏感性生物材料可以以溶液的形式，以固体的形式，以珠的形式或以本文所述和/或本领域普通技术人员已知的其它合适形式提供。本文所述的细胞群体和配制剂可以用温度敏感性生物材料包被，在温度敏感性生物材料上沉积，在温度敏感性生物材料中包埋，附着于温度敏感性生物材料，在温度敏感性生物材料中接种，悬浮或俘获。在某些实施方案中，本文所述的细胞群体可以在与温度敏感性生物材料复合之前组装为三维细胞聚集体或类器官或三维管状结构，或者可以在与温度敏感性生物材料复合时照这样组装。或者，温度敏感性生物材料可以在没有任何细胞的情况下提供，诸如例如以间隔珠的形式提供。在该实施方案中，温度敏感生物材料以纯粹的被动作用发挥功能，以在靶器官内创建用于再生生物活性的空间，例如，血管生成或宿主细胞群体的浸润和迁移。
在某些实施方案中，温度敏感性生物材料具有在第一状态和第二状态之间的过渡状态。在某些实施方案中，过渡状态是在约8℃的温度和约环境温度之间的固体至液体过渡状态。在某些实施方案中，环境温度为约室温。在某些实施方案中，固体至液体过渡状态在约8℃、约9℃、约10℃、约11℃、约12℃、约13℃、约14℃、约15℃、约16℃、约17℃、和约18℃的一个或多个温度发生。
温度敏感性生物材料在给定温度具有某种粘度，以厘泊(cP)测量。在某些实施方案中，生物材料在25℃具有约1cP至约5cP、约1.1cP至约4.5cP、约1.2cP至约4cP、约1.3cP至约3.5cP、约1.4cP至约3.5eP、约1.5cP至约3cP、约1.55cP至约2.5cP、或约1.6cP至约2cP的粘度。在某些实施方案中，生物材料在37℃具有约1.0cP至约1.15cP的粘度。在37℃的粘度可以为约1.0cP、约1.01cP、约1.02cP、约1.03cP、约1.04cP、约1.05cP、约1.06cP、约1.07cP、约1.08cP、约1.09cP、约1.10cP、约1.11cP、约1.12cP、约1.13cP、约1.14cP、或约1.15cP。在某些实施方案中，生物材料是明胶溶液。明胶在溶液中以约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％或约1％(w/v)存在。在一个实例中，生物材料是PBS中的0.75％(w/v)明胶溶液。在某些实施方案中，0.75％(w/v)溶液在25℃具有约1.6cP至约2cP的粘度。在某些实施方案中，0.75％(w/v)溶液在37℃下具有约2cP的粘度。在某些实施方案中，0.75％(w/v)溶液在37℃下具有约1.07cP至约1.08cP的粘度。明胶溶液可以在PBS、DMEM或其它合适的溶剂中提供。
在一方面，配制剂含有与第二生物材料组合的生物活性细胞，所述第二生物材料从配制时间到施用于受试者后的时间点为组合的细胞提供有利的环境。在某些实施方案中，由第二生物材料提供的有利环境涉及在生物材料中施用细胞的优点，该生物材料保持结构完整性，直至对受试者施用的点以及在施用之后持续一段时间。在某些实施方案中，植入后第二生物材料的结构完整性为数分钟、数小时、数天或数周。在某些实施方案中，结构完整性小于1个月、小于1周、小于1天或小于1小时。相对短期的结构完整性提供了配制剂，该配制剂可以在受控处理、放置或分散的情况下将活性剂和生物材料递送到组织或器官中的目标位置，而不是掺入元件与接受其放置的组织或器官的相互作用的阻碍或屏障。
在某些实施方案中，第二生物材料是温度敏感性生物材料，其与第一生物材料具有不同的敏感性。第二生物材料可具有(i)在约环境温度以下为基本上固体状态，和(ii)在约37℃以上为基本上液体状态。在某些实施方案中，环境温度为约室温。
在某些实施方案中，第二生物材料是交联珠。如本文所述，取决于交联程度，交联珠可以具有可微调的体内停留时间。在某些实施方案中，交联珠包含生物活性细胞，并且如本文所述对酶促降解具有抗性。本公开内容的配制剂可包括与生物活性剂，例如生物活性细胞组合的第一生物材料，具有或不具有与生物活性剂，例如生物活性细胞组合的第二生物材料。在配制剂包括第二生物材料的情况下，它可以是温度敏感珠和/或交联珠。
一方面，本公开内容提供了含有生物材料的配制剂，所述生物材料在约几分钟、几小时或几天的一段时间内降解。这与大量专注于固体材料的植入的工作形成对比，所述固体材料然后在数天、数周或数月内缓慢降解。在某些实施方案中，生物材料具有以下特征中的一个或多个：生物相容性、生物降解性/生物可吸收性、在植入受试者之前和期间基本上固体状态、在植入之后结构完整性(基本上固体状态)的丧失和支持细胞存活力和增殖的细胞相容性环境。生物材料在植入期间保持植入颗粒间隔开的能力增强了天然组织的向内生长。生物材料还促进了固体配制剂的植入。由于固体单元的插入有助于防止递送的材料在植入期间分散在组织内，生物材料提供了本文描述的配制剂的定位。对于基于细胞的配制剂，与悬浮于流体中的细胞相比，固体生物材料还改善了贴壁依赖性细胞的稳定性和存活力。然而，结构完整性的短持续时间意味着植入后不久，生物材料不对组织向内生长或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供明显的障碍。
一方面，本公开内容提供了含有生物材料的配制剂，所述生物材料以基本上固体的形式植入，然后在植入体内后液化/融化或丧失结构完整性。这与大量专注于材料的用途的工作形成对比，所述材料可以以液体形式注射，然后在体内固化。
生物相容性珠
在另一方面，配制剂包括本文所述的温度敏感性生物材料和含有生物材料的生物相容性珠的群体。在某些实施方案中，珠是交联的。交联可使用本领域普通技术人员已知的任何合适的交联剂来实现，诸如例如碳二亚胺；醛(例如糠醛、丙烯醛、甲醛、戊二醛、甘油醛)，基于琥珀酰亚胺的交联剂{双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、戊二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS2G)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)}；环氧化物(乙二醇二缩水甘油醚，1，4丁二醇二缩水甘油醚)；糖类(葡萄糖和醛糖)；磺酸和对甲苯磺酸；羰基二咪唑；京尼平；亚胺；酮；叠氮膦酸二苯酯(DDPA)；对苯二酰氯；六水合硝酸铈(III)；微生物转谷氨酰胺酶；和过氧化氢。本领域普通技术人员将理解根据本公开内容使用的其它合适的交联剂和交联方法。
在某些实施方案中，珠是碳二亚胺交联珠。碳二亚胺交联珠可以与选自下组的碳二亚胺交联：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)，DCC-N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIPC)。预计用较低浓度的EDC处理的珠具有更多数目的游离伯胺，而用高浓度的交联剂处理的样品将使大多数伯胺参与酰胺键。在335nm处可通过分光光度法检测到的伯胺和苦基磺酸之间的共价键形成的橙色强度与样品中存在的伯胺数目成正比。将样品中存在的每毫克蛋白质标准化后，可以观察到存在的游离胺数目与用于交联的EDC初始浓度之间呈反相关。该结果指示不同的珠交联，这取决于反应中所用的碳二亚胺的量。通常，与未交联珠相比，交联珠表现出减少的游离伯胺数目。
与非交联的生物相容性珠相比，交联珠对酶促降解具有降低的易感性，从而为珠提供了可微调的体内停留时间。例如，交联珠对内源酶如胶原酶具有抗性。提供交联珠是递送系统的一部分，其促进以下一种或多种：(a)将附着的细胞递送至期望的部位，并为天然组织和血管供应的再生和向内生长创造空间；(b)能够在该部位持续足够长的时间，以使细胞能够建立，运行，重塑其微环境并分泌其自身的胞外基质(ECM)；(c)促进移植细胞与周围组织的整合；(d)以基本上固体状态形式植入细胞的能力；(e)短期结构完整性，其不对组织的向内生长、新生血管发生或递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供重大的障碍；(f)以基本上固体的形式定位体内递送，从而防止细胞在植入期间在组织内分散；(g)与悬浮于流体中的细胞相比贴壁依赖性细胞的稳定性和活力得到改善；(h)当1)以基本上固体的形式(例如，附着于珠)，和2)以基本上液体的形式(例如，悬浮于流体中)递送细胞时的双相释放概况；i)这些生物活性细胞群体来源的三维生物生态位或肾实质的重演或模仿。
在某些实施方案中，本公开内容提供了含有明胶的交联珠。非交联的明胶珠不适合生物活性细胞配制剂，因为它们迅速失去完整性并且细胞从注射部位消散。相反，高度交联的明胶珠可以在注射部位持续太长时间，并可以阻碍新生ECM分泌、细胞整合、血管生成和组织再生。本公开内容允许微调交联珠的体内停留时间。为了调整生物材料的生物降解性，使用了碳二亚胺的不同交联剂浓度，而所有样品的总反应条件保持恒定。例如，可以通过将交联剂的浓度从约0变化到约1M来微调碳二亚胺交联珠的酶促易感性。在某些实施方案中，浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、·约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约85mM、约90mM、约95mM、或约100mM。交联剂浓度也可以是约0.15M、约0.2M、约0.25M、约0.3M、约0.35M、约0.4M、约0.45M、约0.5M、约0.55M、约0.6M、约0.65M、约0.7M、约0.75M、约0.8M、约0.85M、约0.9M、约0.95M、或约1M。在某些实施方案中，交联剂为1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在某些实施方案中，EDC交联珠是明胶珠。可以根据交联剂的浓度微调珠的降解％。在某些实施方案中，可以将明胶珠与除明胶以外的珠或微粒(例如但不限于海藻酸盐或HA)混合以额外地促进被递送的生物活性细胞群体的效力。
交联珠可以具有有利于生物活性细胞群体的接种、附着或包囊的某些特征。例如，珠可以具有多孔表面和/或可以是基本上中空的。孔的存在提供了增加的细胞附着表面，与无孔或光滑的表面相比，允许附着更大数目的细胞。另外，孔结构可以支持宿主组织与多孔珠的整合，从而支持新生组织的形成。珠具有可以拟合到对应于一般颗粒分布模式的Weibull图的大小分布。在某些实施方案中，交联珠具有小于约120μm、约115μm、约110μm、约109μm、约108um、约107μm、约106μm、约105μm、约104μm、约103μm、约102μm、约101μm、约100μm、约99μm、约98μm、约97μm、约96μm、约95μm、约94μm、约93μm、约92μm、约91μm、或约90μm的平均直径。交联珠的特性根据铸造工艺而变化。例如，使用下述工艺来提供具有上述特征的珠，在所述工艺中使用空气流雾化液体明胶溶液并将其用薄层色谱试剂喷雾器(ACEGlassware)喷雾到液氮中的。本领域技术人员将认识到，调节铸造工艺的参数提供了调整珠的不同特性，例如不同大小分布的机会。在某些实施方案中，珠的微观形貌、表面和内部特性可以进一步修饰以促进细胞附着。
在配制之前，使用细胞培养技术在体外评估交联珠的细胞相容性，其中将珠与对应于最终生物活性细胞配制剂的细胞一起培养。例如，在制备生物活性肾细胞配制剂之前，先将珠与原代肾细胞一起培养，然后使用活/死细胞测定法来确认细胞相容性。除细胞存活力之外，用于测量细胞代谢活性、某些关键细胞因子、生长因子和外来体的分泌以及某些关键蛋白质和核酸标志物，包括与功能性生物活性肾细胞群体相关的miRNA的表达的特定功能测试是本领域普通技术人员公知的，并且在与交联珠一起配制时还可用于确认细胞效力。
在某些配制剂中，以溶液体积的约5％(w/w)至约15％(w/w)在溶液中将生物相容性交联珠与温度敏感生物材料组合。交联珠可以以溶液体积的约5％(w/w)、约5.5％(w/w)、约6％(w/w)、约6.5％(w/w)、约7％(w/w)、约7.5％(w/w)、约8％(w/w)、约8.5％(w/w)、约9％(w/w)、约9.5％(w/w)、约10％(w/w)、约10.5％(w/w)、约11％(w/w)、约11.5％(w/w)、约12％(w/w)、约12.5％(w/w)、约13％(w/w)、约13.5％(w/w)、约14％(w/w)、约14.5％(w/w)、或约15％(w/w)存在。
一方面，本公开内容提供了包含生物材料的配制剂，所述生物材料在约几分钟、几小时或几天的一段时间内降解。这与专注于植入固体材料的大量工作形成对比，所述固体材料然后在数天、数周或数月内缓慢降解。
一方面，本公开内容提供了具有生物相容性交联珠的配制剂，所述生物相容性的交联珠接种有与递送基质一起的生物活性细胞。在某些实施方案中，递送基质具有以下特征中的一个或多个：生物相容性、生物降解性/生物再吸收性、在植入受试者之前和期间的基本上固体状态、在植入之后结构完整性(基本上固体状态)的丧失以及支持细胞存活力的细胞相容性环境。递送基质在植入期间保持植入的颗粒(例如，交联珠)间隔开来的能力增强天然组织的向内生长。若不存在递送基质，则在植入期间细胞化珠的压实可以导致没有足够的空间供足够的组织向内生长。递送基质促进固体配制剂的植入。另外，结构完整性的短持续时间意味着植入后不久，基质不对组织向内生长、新生血管发生或所递送的细胞/材料与宿主组织的整合提供重大的屏障。由于固体单元的插入有助于防止递送的材料在植入期间分散在组织内，因此递送基质提供了本文所述配制剂的定位。在某些实施方案中，如本文所述的递送基质的应用有助于防止在递送至肾实质中时通过排尿而快速损失植入的细胞。对于基于细胞的配制剂，与悬浮于流体中的细胞相比，固体递送基质改善了贴壁依赖性细胞的稳定性和存活力。
在某些实施方案中，递送基质是未接种细胞的生物相容性珠的群体。在某些实施方案中，未接种的珠分散在各个细胞接种的珠之中和之间。未接种的珠在移植之前和之后立即作用为经细胞接种的珠之间的“间隔珠”。间隔珠含有在第一温度下具有基本上固体状态并且在第二温度下具有基本上液体状态的温度敏感生物材料，其中第一温度低于第二温度。例如，间隔珠含有在约环境温度以下基本上固体状态并且在约37℃基本上液体状态的生物材料，诸如本文所述的生物材料。在某些实施方案中，环境温度为约室温。在某些实施方案中，生物材料是明胶溶液。明胶溶液以约4％，约4.5％，约5％，约5.5％，约6％，约6.5％，约7％，约7.5％，约8％，约8.5％，约9％，约9.5％，约10％，约10.5％或约11％(w/v)存在。明胶溶液可以在PBS、细胞培养基(例如，DMEM)或另一种合适的溶剂中提供。在某些实施方案中，生物材料是透明质酸。在某些实施方案中，生物材料是衍生自人或动物肾的脱细胞化的胞外基质，其可以进一步重构为水凝胶。
一方面，本公开内容提供了包含生物材料的配制剂，所述生物材料以基本上固体的形式(例如间隔珠)植入，然后在植入体内后液化/熔化或以其它方式丧失结构完整性。这与专注于使用下述材料的大量工作形成对比，所述材料可以以液体注射，然后在体内固化。
间隔珠的温度敏感性可以在配制之前在体外评估。间隔珠可以标记并与未标记的非温度敏感珠混合。然后将该混合物在37℃下温育以观察物理转变的变化。随时间观察到标记的温度敏感性珠在较高温度下的形状损失。例如，温度敏感性明胶珠可以用阿尔辛蓝染料制成以充当物理转变的标志物。将蓝色明胶珠与交联珠(白色)混合，加载到导管中，然后挤出并在37℃的1XPBS(pH 7.4)中温育。在不同的时间点以显微镜观察蓝色明胶珠的形状损失。30分钟后可见蓝色明胶珠的物理状态变化，随着延长的温育时间变得更加明显。由于材料的粘性，珠不完全消散。
改良释放配制剂
一方面，本发明的配制剂以改良释放配制剂提供。通常，改良释放特征在于施用后第一活性剂的初始释放，然后第二活性剂的至少一个另外的随后释放。第一和第二活性剂可以相同或它们可以不同。在某些实施方案中，配制剂通过同一配制剂中的多种组分提供改良释放。在某些实施方案中，改良释放配制剂含有作为第一组分的一部分的活性剂，其允许活性剂在整个配制剂体积中自由移动，从而允许在施用后在靶部位处立即释放。第一组分可以是具有基本上液相和基本上固相的温度敏感性生物材料，其中在施用时第一组分处于基本上液相。在某些实施方案中，活性剂为基本上液相，使得其在配制剂的整个体积中基本上是自由移动的，因此在施用后立即释放至靶部位。
在某些实施方案中，改良释放配制剂具有作为第二组分的一部分的活性剂，其中活性剂附着于第二组分，在第二组分上沉积，用第二组分包被，在第二组分中包埋，接种于第二组分上或在第二组分中俘获，所述第二组分在施用于靶部位之前和之后持续存在。第二组分含有活性剂能够与之缔合的结构元件，从而在施用时防止活性剂立即从第二组分释放。例如，第二组分以基本上固体的形式提供，例如生物相容的珠，其可以被交联以防止或延迟体内酶促降解。在某些实施方案中，基本上固相的活性剂在施用之前和之后在配制剂内保持其结构完整性，因此在施用后它不会立即将活性剂释放到靶部位。本文已经描述了用于改良释放配制剂的合适载体，但是本领域普通技术人员将理解适合用于本公开内容的其它载体。
在某些实施方案中，配制剂提供递送的元件(包括细胞、纳米颗粒、治疗性分子等)的初始快速递送/释放，接着随后延迟释放元件。可溶的且作为源自肾或其它细胞群体的分泌性生物活性产物的外来体、miRNA和其它生物活性核酸或蛋白质分子的初始快速递送/释放。本领域普通技术人员理解与再生生物活性有关的其它分子或治疗剂。本公开内容的配制剂可以设计用于此类双相释放概况，其中要递送的药剂以未附着形式(例如，溶液中的细胞)和附着形式(例如，细胞与珠或另一种合适的载体一起)提供。初次施用时，未阻碍的药剂被立即提供到递送部位，而受阻碍的药剂的释放被延迟直到载体(例如珠)的结构完整性失效，此时先前附着的药剂被释放。如下所讨论，本领域普通技术人员将理解其它合适的释放机制。
释放的时间延迟可根据活性剂的性质进行调节。例如，在生物活性细胞配制剂中释放的时间延迟可以为约数秒、数分钟、数小时或数天。在某些情况下，约数周的延迟可以是合适的。对于其它活性剂，例如小分子或大分子，在配制剂中释放的时间延迟可以为约数秒、数分钟、数小时、数天、数周或数月。该配制剂还可能包含提供不同延时释放概况的不同生物材料。例如，具有第一活性剂的第一生物材料可以具有第一释放时间，并且具有第二活性剂的第二生物材料可以具有第二释放时间。第一和第二活性剂可以相同或不同。
如本文所讨论的，延迟释放的时间段通常可以对应于生物材料的结构完整性丧失的时间段。然而，本领域普通技术人员将理解延迟释放的其它机制。例如，活性剂可以随时间连续释放，而与任何特定生物材料的降解时间无关，例如药物从聚合物基质中的扩散。另外，生物活性细胞可以从含有生物材料和生物活性细胞的配制剂迁移到天然组织。在某些实施方案中，生物活性细胞从生物材料例如珠迁移到天然组织。在一个实施方案中，生物活性细胞从生物材料迁移到天然组织并诱导与再生生物活性有关的生长因子、细胞因子、外来体、miRNA和其它核酸和蛋白质的分泌。在某些实施方案中，外来体和其它胞外囊泡以及miRNA、其它生物活性核酸和蛋白质从生物材料中迁移出来。在又一个实施方案中，生物活性细胞从生物材料迁移至天然组织并介导宿主干细胞和祖细胞的动员，然后所述宿主干细胞和祖细胞向损伤或疾病位置迁移或归巢。
可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。通过在配制剂中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现可注射配制剂的延长吸收。制备此类配制剂的许多方法已获得专利或是本领域技术人员通常已知的。参见例如Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson编，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。适用于多肽剂的控释或延迟释放的其它方法描述于例如美国专利号6,306,406和6,346,274，以及例如美国专利申请号US20020182254和US20020051808。
生物活性细胞配制剂
本文所述的生物活性细胞配制剂包含由上述生物材料制成的可植入构建体，其具有本文所述的经遗传修饰的生物活性肾细胞，用于治疗有需要的受试者的肾疾病。在某些实施方案中，构建体由生物相容性材料或生物材料、支架或基质制成，所述生物相容性材料或生物材料、支架或基质包含一种或多种合成或天然存在的生物相容的材料和通过附着和/或俘获在支架表面上沉积或支架表面中包埋的本文中所述的一种或多种细胞群体或细胞混合物。在某些实施方案中，构建体由以下制成：生物材料和用生物材料组分包被，在生物材料组分上沉积，在生物材料组分中沉积，附着于生物材料组分，在生物材料组分中俘获，在生物材料组分中包埋，接种或与生物材料组分组合的本文中所述的一种或多种细胞群体或细胞混合物。本文所述的任何细胞群，包括富集的细胞群体或其混合物可以与基质结合使用以形成构建体。在某些实施方案中，生物活性细胞制剂由生物相容性材料或生物材料和本文所述的SRC群体制成。在某些实施方案中，生物活性细胞制剂由生物相容性材料或生物材料和本文所述的经遗传修饰的SRC群体制成。
在某些实施方案中，生物活性细胞配制剂是由SRC构成的可注射产品，所述SRC经遗传修饰以降低免疫原性并在生物材料(例如，基于明胶的水凝胶)中配制。一方面，通过肾活组织检查从供体患者肾皮质组织中分离和扩增肾细胞，使用基因编辑技术对SRC进行遗传修饰以及通过密度梯度离心从扩增的肾细胞中进行选择获得同种异体SRC。SRC主要由在其再生潜力方面公知的肾上皮细胞构成(Humphreys等人(2008)Intrinsic epithelialcells repair the kidney after injury.Cell Stem Cell.2(3)：284-91)。SRC群体中可稀疏存在其他实质细胞(血管)和基质细胞(收集管)。在非临床研究中，将SRC注射到接受体肾中已导致动物存活、尿液浓度和过滤功能显著改善。然而，SRC具有有限的货架期和稳定性。在基于明胶的水凝胶生物材料中的SRC配制剂提供增强的细胞稳定性，从而延长产品货架期，改善的运输期间的稳定性和对肾皮质的递送以用于临床效用。
一方面，通过首先使用临床护理标准肾活组织检查程序从供体获得肾皮质组织来制造生物活性细胞配制剂。通过酶促消化从肾组织中分离出肾细胞，并使用标准细胞培养技术进行扩增。细胞培养基设计为扩增原代肾细胞，并且不含任何分化因子。将收获的肾细胞进行密度梯度分离以获得SRC。在密度梯度分离之前或之后，可以使用基因编辑技术来修饰SRC的免疫原性。
在某些实施方案中，配制的细胞群体在约环境温度以上基本上自由地在整个生物材料的体积中移动。与流体中的细胞相比，使细胞群体在较低的温度下悬浮在基本上固相中为细胞提供了稳定性优势，例如对于锚定依赖性细胞。此外，使细胞悬浮于基本固态提供了以下一项或多项益处：i)防止细胞沉降，ii)允许细胞以悬浮状态保持锚定到生物材料；iii)允许细胞在整个生物材料的体积中保持更均匀分散；iv)防止细胞聚集体的形成；和v)在配制剂的贮存和运输期间为细胞提供更好的保护。可以保留导致对受试者施用的此类特征的配制剂是有利的，至少因为配制剂中细胞的整体健康将是较好的，并且将施用更加均匀且一致的细胞剂量。
在一个优选的实施方案中，用于配制SRC的基于明胶的水凝胶生物材料是溶于缓冲液中以形成热响应性水凝胶的猪明胶。此水凝胶在室温呈流体，但在冷却至冷藏温度(2-8℃)时胶凝。SRC用水凝胶配制，提供冷却胶凝，然后在冷藏温度(2-8℃)运送到诊所。在临床现场，将产品加热到室温，之后注入患者的肾中。使用适合于通过经皮或腹腔镜程序递送的针和注射器将生物活性细胞配制剂植入肾皮质中。
示例性新肾增强剂组合物的描述和组成
在某些实施方案中，生物活性细胞配制剂是新肾增强剂(NKA)，其是由在生物材料(基于明胶的水凝胶)中配制的自体选定的肾细胞(SRC)构成的可注射产品。一方面，如下获得自体SRC：通过肾活组织检查从患者的肾皮质组织中分离和扩增肾细胞，并通过跨越密度边界、屏障或界面的离心扩增的肾细胞进行选择。在某些实施方案中，如下获得自体SRC：通过肾活组织检查从患者的肾皮质组织中分离和扩增肾细胞，以及在连续或不连续的单步或多步密度梯度中选择扩增的肾细胞。SRC主要由肾小管上皮细胞组成，所述肾小管上皮细胞在其再生潜力上是公知的(Humphreys等人(2008)Intrinsic epithelial cells repairthe kidney after injury.Cell Stem Cell.2(3)：284-91)。其它实质(血管)和基质(收集管)细胞可以稀疏存在于自体SRC群体中。在临床前研究中，将SRC注射到受体肾中可显著改善动物存活率、尿液浓度和过滤功能。然而，SRC具有有限的货架期和稳定性。在基于明胶的水凝胶生物材料中的SRC配制剂可以提供增强的细胞稳定性，从而延长产品的货架期，在将NKA转运和递送至肾皮质用于临床效用期间改善NKA的稳定性。
一方面，通过首先使用临床护理标准肾活组织检查程序从供体/接受者获得肾皮质组织来生产NKA。在某些实施方案中，通过酶促消化从肾组织分离肾细胞，并且使用标准细胞培养技术扩增。在某些实施方案中，细胞培养基设计为扩增原代肾细胞，并且不含任何分化因子。在某些实施方案中，使收获的肾细胞跨越密度边界或界面或密度梯度进行分离以获得SRC。在某些实施方案中，根据本公开内容遗传修饰SRC。
本文中包括一种由生物材料制成的配制剂，该生物材料被设计或适于响应如本文所述的外部条件。因此，构建体中生物活性细胞群体与生物材料的关联的性质将根据外部条件而改变。例如，细胞群体与温度敏感性生物材料的关联会随温度而变化。在某些实施方案中，构建体包含生物活性肾细胞群体和生物材料，所述生物材料在约8℃以下具有基本上固体状态和在约环境温度以上具有基本上液体状态，其中细胞群体在约8℃以下悬浮于生物材料中。然而，细胞群体在约环境温度以上基本上可以在整个生物材料的体积中自由移动。与流体中的细胞相比，使细胞群体在较低的温度下悬浮于基本上固相中为细胞，例如贴壁依赖性细胞提供了稳定性优势。此外，使细胞悬浮于基本上固体状态中提供了以下一项或多项益处：i)防止细胞沉降，ii)允许细胞以悬浮状态维持锚定于生物材料；iii)使细胞在整个生物材料的体积中保持更均匀分散；iv)防止细胞聚集体的形成；和v)在配制剂的贮存和运输期间为细胞提供更好的保护。可以保留此类特征直至向受试者施用的配制剂是有利的，至少是因为配制剂中细胞的整体健康将是更好的并且将施用更均匀一致的细胞剂量。
在某些实施方案中，用于将SRC配制成NKA的基于明胶的水凝胶生物材料是溶于缓冲液中以形成热响应性水凝胶的猪明胶。此水凝胶在室温呈流体，但在冷却至冷藏温度(2-8℃)时胶凝。用水凝胶配制SRC，以获得NKA。NKA通过冷却胶凝，并在冷藏温度(2-8℃)下运送到诊所。NKA具有3天的货架期。在临床现场，将产品加热到室温后，之后注入患者的肾中。使用适合通过经皮或腹腔镜程序递送NKA的针和注射器将NKA植入肾皮质中。在某些实施方案中，水凝胶衍生自明胶或重组起源的另一种胞外基质蛋白。在某些实施方案中，水凝胶衍生自源自肾或另一组织或器官的胞外基质。在某些实施方案中，水凝胶衍生自重组胞外基质蛋白。在某些实施方案中，水凝胶包含衍生自重组胶原的明胶(即重组明胶)。
细胞存活力剂
一方面，生物活性细胞配制剂进一步包含细胞存活力剂。在某些实施方案中，细胞存活力剂选自下组：抗氧化剂、氧载体、免疫调节因子、细胞募集因子、细胞附着因子、抗炎剂、血管生成因子、基质金属蛋白酶、伤口愈合因子和从生物活性细胞分泌的产物。
抗氧化剂的特征在于抑制其它分子的氧化的能力。抗氧化剂包括但不限于以下一种或多种：6-羟基-2，5，7，8-四甲基色原烷-2-羧酸(
Figure BDA0002382941840001061
)、类胡萝卜素、类黄酮、异黄酮、泛醌、谷胱甘肽、硫辛酸、超氧化物歧化酶、抗坏血酸、维生素E、维生素A、混合类胡萝卜素(例如，beta胡萝卜素、alpha胡萝卜素、gamma胡萝卜素、叶黄素、八氩茄红素(Phytopene)，六氢番茄红素(phytofluene)和虾青素)、硒、辅酶Q10、吲哚-3-甲醇、原花色素、白藜芦醇、槲皮素、儿茶素、水杨酸、姜黄素、胆红素、草酸、植酸、硫辛酸、香草酸、多酚、阿魏酸、茶黄素及其衍生物。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的抗氧化剂。
氧载体是特征在于能够携带和释放氧气的试剂。它们包括但不限于全氟化碳和含有全氟化碳的药物。合适的基于全氟化碳的氧载体包括但不限于全氟辛基溴(C8F17Br)；perfluorodichorotane(C8F16C12)；全氟癸基溴；perfluobron；全氟萘烷；perfluorotripopylamine；全氟甲基环哌啶；
Figure BDA0002382941840001062
(全氟萘烷和perfluorotripopylamine)；
Figure BDA0002382941840001063
(全氟萘烷和全氟甲基环哌啶)；
Figure BDA0002382941840001064
(全氟癸基溴和perfluobron)；OcycyteTM(全氟(叔丁基环己烷))。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的基于全氟化碳的氧载体。
免疫调节因子包括但不限于骨桥蛋白、FAS配体因子、白介素、转化生长因子beta、血小板衍生生长因子、簇蛋白、转铁蛋白、作用后调节因子(regulated upon action)、正常T细胞表达因子(normal T-cell expressed)、分泌蛋白(RANTES)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(Pai-1)、肿瘤坏死因子alpha(TNF-alpha)、白介素6(IL-6)、alpha-1微球蛋白和beta-2-微球蛋白。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的免疫调节因子。
抗炎剂或免疫抑制剂(如下所述)也可以是配制剂的一部分。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的抗氧化剂。
细胞募集因子包括但不限于单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和CXCL-1。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的细胞募集因子。
细胞附着因子包括但不限于纤连蛋白、前胶原、胶原、ICAM-1、结缔组织生长因子、层粘连蛋白、蛋白聚糖、特定的细胞粘附肽，例如RGD和YSIGR。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的细胞附着因子。
血管生成因子包括但不限于血管内皮生长因子F(VEGF)和血管生成素2(ANG-2)。本领域普通技术人员将理解，在本公开内容的某些实施方案中可以使用其它合适的血管生成因子。
基质金属蛋白酶包括但不限于基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)以及组织抑制剂和金属蛋白酶-1(TIMP-1)。
伤口愈合因子包括但不限于角质形成细胞生长因子1(KGF-1)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、钙结合蛋白、簇蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)、三叶因子3(trefoilfactor 3)。本领域普通技术人员将理解可以在本公开内容的某些实施方案中使用其它合适的伤口愈合因子。
本文所述的生物活性细胞的分泌产物也可以作为细胞存活力剂添加到生物活性细胞配制剂中。
源自人或动物来源的体液、组织或器官的组合物(包括但不限于人血浆/人血小板裂解物、牛胎血浆或牛垂体提取物)也可以作为细胞存活力试剂添加到生物活性细胞配制剂中。
本领域普通技术人员将理解，存在沉积细胞群体或以其它方式组合细胞群体与生物材料以形成构建体的几种合适的方法。
使用方法
一方面，本发明的细胞和配制剂适用于本文所述的使用方法。在某些实施方案中，可以施用本发明的配制剂以治疗疾病。例如，可以将经遗传修饰的生物活性细胞作为本文所述配制剂的一部分施用于天然器官。在某些实施方案中，经遗传修饰的生物活性细胞可源自作为施用对象的天然器官或源自非靶天然器官的来源。
在某些实施方案中，本公开内容提供了用如本文所述的含有生物活性肾细胞群体的配制剂在有需要的受试者中治疗肾疾病的方法。在某些实施方案中，治疗配制剂含有通过基因编辑修饰以降低免疫原性的选定的肾细胞群体或其混合物。在某些实施方案中，配制剂适合于施用于需要改善的肾功能的受试者。
一方面，可以经由各种肾功能指标来观察通过本公开内容的方法对受试者的肾疾病的有效治疗。在某些实施方案中，肾功能的指标包括但不限于血清自蛋白、白蛋白与球蛋白比率(A/G比)、血清磷、血清钠、肾大小(可通过超声测量)、血清钙、磷：钙比率、血清钾、蛋白尿、尿肌酸酐、血清肌酸酐、血尿素氮(BUN)、胆固醇水平、甘油三酯水平和肾小球滤过率(GFR)。此外，一般健康状况的几个指标包括但不限于体重增加或减少、存活、血压(平均全身血压、舒张压或收缩压)和身体耐力表现。
一方面，通过肾功能的一种或多种指标的稳定化证明了用生物活性肾细胞配制剂的有效治疗。通过观察与尚未通过本公开内容的方法治疗的受试者中的相同指示相比通过本公开内容的方法治疗的受试者中的指标变化来证明肾功能的稳定化。或者，可以通过观察与治疗之前的相同受试者中的相同指标相比通过本公开内容的方法治疗的受试者中的指标变化来证明肾功能的稳定化。第一指标的变化可以是值的增加或减少。在某些实施方案中，本公开内容提供的治疗可以包括使受试者中的血清肌酸酐和/或血液尿素氮(BUNl水平稳定化，其中与尚未通过本公开内容的方法治疗的具有相似疾病状态的受试者相比，在受试者中观察到的BUN水平更低。在某些实施方案中，治疗可以包括使受试者中的血清肌酸酐水平稳定化，其中与尚未通过本公开内容的方法治疗的具有相似疾病状态的受试者相比，在受试者中观察到的血清肌酸酐水平更低。在某些实施方案中，一种或多种上述肾功能指标的稳定化是用通过基因编辑修饰以降低免疫原性的选定的肾细胞配制剂治疗的结果。
本领域普通技术人员将理解，可以测量本文所述或本领域已知的一种或多种其它指标以确定受试者中肾疾病的有效治疗。
在某些实施方案中，通过一种或多种肾结构和/或功能指标的改善证明了用经遗传修饰的生物活性肾细胞配制剂的有效治疗。在某些实施方案中，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善水平的血清肌酸酐和/或血尿素氮(BUN)。在某些实施方案中，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了血清中蛋白质的改善的保留。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善的血清白蛋白水平。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善的A∶G比率。在某些实施方案中，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善的血清胆固醇和/或甘油三酯水平。在某些实施方案中，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善水平的维生素D水平。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善的磷：钙比率。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善的血红蛋白水平。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善的血清肌酸酐水平。在某些实施方案中，与非富集的细胞群体相比，经遗传修饰的生物活性肾细胞群体提供了改善的血细胞比容水平。在某些实施方案中，一种或多种上述肾功能指标的改善是用选定的肾细胞配制剂治疗的结果。在一个实施方案中，肾功能的上述一种或多种指标的改善是用通过基因编辑修饰以降低免疫原性的选定肾细胞配制剂治疗的结果。
一方面，本公开内容提供了用于在有需要的受试者中再生天然肾的方法中的配制剂。在某些实施方案中，方法包括向受试者施用或植入本文所述的经遗传修饰的生物活性细胞群体、混合物或构建体的步骤。再生的天然肾可以通过许多指标来表征，包括但不限于天然肾中的功能或能力的形成、天然肾中的功能或能力的改善和天然肾中某些标志物的表达。在某些实施方案中，可以基于上文所述的肾功能的各种指标观察到形成或改善的功能或能力。在某些实施方案中，再生的肾通过一种或多种干细胞标志物的差异表达表征。干细胞标志物可以是以下一种或多种：SRY(性别决定区域Y)-框2(Sox2)；未分化的胚胎细胞转录因子(UTF1)；小鼠的结同源物(Nodal Homolog from Mouse)(NODAL)；Prominin 1(PROM1)或CD133(CD133)；CD24；及其任何组合(参见Ilagan等人的PCT/US2011/036347，其通过引用完整并入本文)，也参见Genheimer等人，2012.Molecular characterization ofthe regenerative response induced by intrarenal transplantation of selectedrenal cells in a rodent model of chronic kidney disease.Cells Tissue Organs196：374-384，通过引用完整并入。在某些实施方案中，与对照相比，干细胞标志物的表达是上调的。
一方面，本文提供了治疗受试者中的肾疾病的方法，该方法包括将本文公开的配制剂、组合物或细胞群体注射入受试者中。在某些实施方案中，通过18至30号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于20号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于21号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于22号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于23号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于24号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于25号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于26号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于27号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于28号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过小于29号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约20号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约21号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。
在某些实施方案中，通过约22号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约23号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约24号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约25号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约26号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约27号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约28号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。在某些实施方案中，通过约29号针注射用于细胞群体的配制剂、组合物。
在某些实施方案中，针的内径小于0.84mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.61mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.51mm。在一些实施例中，针的内径小于0.41mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.33mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.25mm。针的内径小于0.20mm。在某些实施方案中，针的内径小于0.15mm。在某些实施方案中，针的外径小于1.27mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.91mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.81mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.71mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.64mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.51mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.41mm。在某些实施方案中，针的外径小于0.30mm。在某些实施方案中，针具有下表中的大小之一：
Figure BDA0002382941840001111
分泌产物
在某些实施方案中，效果可以由细胞本身和/或由细胞分泌的产物提供。再生效果可以通过以下一种或多种表征：上皮-间质转化的减少(其可以经由TGF-β信号传导的减弱)；肾纤维化的减少；肾炎症的减少；天然肾中干细胞标志物的差异表达；移植的细胞和/或天然细胞向肾损伤，例如肾小管损伤的部位的迁移；移植的细胞在肾损伤的部位，例如肾小管损伤的植入；肾功能的一种或多种指标的稳定化(如本文所述)；与肾发生有关的S形状体/弧形形状体的从头形成，肾小管或肾单位的从头形成、红系稳态的恢复(如本文所述)；及其任何组合(还请参见Basu等人，2011.Functional evaluation of primary renalcell/biomaterial neo-kidney augment prototypes for renal tissueengineering.Cell Transplantation 20：1771-90；Bruce等人，2015.Selected renalcells modulate disease progression in rodent models of chronic kidney diseasevia NF-κB and TGF-β1 pathways.Regenerative Medicine 10：815-839，每篇的全部内容通过引用并入本文)。
作为组织活组织检查的替代方法，可以从体液，例如尿液的检查来评估接受治疗的受试者中的再生结果。已经发现获自受试者来源的尿源的微囊泡包含某些组分，包括但不限于特定蛋白质和miRNA，其最终衍生自通过用本公开的细胞群体治疗而受到影响的肾细胞群体。这些成分可以包括但不限于牵涉干细胞复制和分化、凋亡、炎症和免疫调节、纤维化、上皮-间质转化、TGF-β信号传导和PAI-1信号传导的因素。微囊泡相关miRNA/蛋白表达模式允许连续监测接受本公开内容的细胞群体、混合物或构建体的受试者的肾内的再生结果。
在某些实施方案中，本公开内容提供了评估肾疾病(KD)患者是否响应用治疗配制剂的治疗的方法。该方法可以包括以下步骤：相比于或相对于对照样品(例如衍生自用治疗剂治疗前的相同患者的样品)中的囊泡量，测定或检测从用治疗剂治疗的KD患者获得的测试样品中的囊泡或它们的腔内容物的量，其中与对照样品中的囊泡或它们的腔内容物的量相比测试样品中更高或更低的囊泡或它们的腔内容物的量指示治疗的患者对用治疗剂的治疗的响应性。
这些肾源性囊泡和/或肾源性囊泡的腔内容物也可以脱落到受试者的尿液中，并且可以分析指示再生结果或治疗功效的生物标志物。非侵入性预后方法可包括在施用或植入本文所述的经遗传修饰的生物活性肾细胞群体、混合物或构建体之前和/或之后从受试者获得尿液样品的步骤。可以使用标准技术从尿液样品中分离出囊泡和其它分泌产物，所述技术包括但不限于离心以除去不需要的碎片(Zhou等人2008.Kidney Int，74(5)：613-621；Skog等人美国公布专利申请号20110053157，每篇通过引用整体并入本文)，沉淀以从尿液中分离外来体，聚合酶链反应和核酸测序以鉴定特定核酸，以及质谱法和/或2D凝胶电泳以鉴定与再生结果相关的特定蛋白质。
施用方法和路径
本发明的生物活性细胞配制剂可以单独施用或与其他生物活性组分组合施用。制剂剂适合于将掺入的组织工程化元件注射或植入到实体器官内部中以再生组织。另外，使用制剂剂将组织工程化元件注射或植入中空器官壁以再生组织。
一方面，本发明提供了对有需要的受试者提供本文所述的生物活性细胞配制剂的方法。在某些实施方案中，生物活性细胞的来源可以是同种异体的或同基因的及其任何组合。在某些实施方案中，方法可以包括免疫抑制剂的施用。(例如参见美国专利号7,563,822)。
本发明的治疗方法涉及本文所述的生物活性细胞配制剂的递送。在某些实施方案中，将细胞直接施用至意图益处的部位是优选的。还可以通过使天然肾与本文所述的生物活性细胞配制剂以及从一种或多种富集的肾细胞群体分泌的产物，和/或包含其的混合物或构建体在体内接触来治疗有需要的受试者。体内接触的步骤为天然肾提供了再生效果。
鉴于本说明书，用于将选定的肾细胞的组合物施用于受试者的多种手段对于本领域技术人员而言是明显的。此类方法包括将细胞注射到受试者的靶部位中。
递送媒介物
可以将细胞和/或分泌性产物插入递送装置或媒介物中，其有助于通过注射或植入而引入受试者中。在某些实施方案中，递送媒介物可以包括天然材料。在某些其他实施方案中，递送媒介物可以包括合成材料。在某些实施方案中，递送媒介物提供了模仿或适当装配到器官构造中的结构。在某些实施方案中，递送媒介物本质上是流体状的。此类递送装置可以包括用于将细胞和流体注射到接受体受试者身体中的管，例如导管。在一个优选的实施方案中，管另外具有针，例如注射器，通过该针可以将本发明的细胞在期望的位置处导入受试者中。在某些实施方案中，将哺乳动物肾来源的细胞群体配制用于通过导管施用到血管中(其中术语“导管”意图包括用于将物质递送至血管的各种管状系统中的任一种)。或者，可将细胞插入生物材料或支架之中或之上，包括但不限于纺织品，例如织物(weaves)、编织物(knits)、编织物(braids)、网眼和无纺布(non-woven)、多孔膜、海绵和泡沫以及珠(例如固体)或多孔珠、微粒、纳米颗粒等(例如，Cultispher-S明胶珠-Sigma)。可以制备细胞以多种不同形式递送。例如，细胞可以悬浮在溶液或凝胶中。可以将细胞与药学上可接受的载体或稀释剂混合，其中本发明的细胞保持存活。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域中公知的。溶液优选是无菌的且流体的，并且通常会是等张的。优选地，溶液在制造和储存条件下是稳定的，并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等而保存，以抵抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。本领域技术人员将理解，本发明的细胞群体及其混合物的递送中使用的递送媒介物可包括上述特征的组合。
施用模式
配制剂的施用模式包括但不限于全身、肾内(例如实质)、静脉内或动脉内注射以及在意图的活性部位处直接注射到组织中。要根据本发明使用的其他施用模式包括通过直接剖腹术，通过直接腹腔镜检查，经腹或经皮的单次或多次注射。要根据本发明使用的其他施用模式包括例如逆行输注和输尿管肾盂输注。手术施用手段包括一步程序，例如但不限于部分肾切除术和构建体植入、部分肾切除术、部分肾盂切除术(pyelectomy)、具有网膜±腹膜的血管化、多焦点活组织检查针迹、圆锥或锥体、至圆柱体和肾极样替换，以及两步程序，包括例如用于再种的类器官内部生物反应器。在某些实施方案中，通过相同途径同时递送包含细胞混合物的配制剂。在某些实施方案中，通过本文所述的一种或多种方法，同时地或以时间上受控的方式，将包含受控混合物的每种细胞组合物分别递送至特定位置或经由特定方法递送。在某些实施方案中，将选定的肾细胞经皮注射到肾的肾皮质中。在某些实施方案中，在将组合物注射到肾中之前，将引导套管经皮插入并用于穿刺肾囊。
腹腔镜检查或经皮技术可用于进入肾以注射配制的BRC或SRC群体。腹腔镜检查手术技术的使用允许直接显现肾，以便在注射过程中发现任何出血或其他不良事件并立即解决。肾的经皮方法的使用已使用了十多年，主要用于消融肾内块。这些程序将电极或低温针插入肾中的限定块，并在消融病变时保持接触(通常)10至20分钟。对于注射治疗配制剂，经皮器械不更大也不更复杂，并且此方法提供了无手术的安全优势(避免了腹部穿刺伤口和气体充气)并且固定化时间最小。此外，进入轨道可原位留下止血的可生物降解材料，以进一步减少任何重大出血的机会。
根据注射递送的一个实施方案，将治疗性生物活性细胞配制剂注射到肾皮质中。重要的是，将治疗配制剂尽可能广泛地分布在肾皮质中，这可以例如通过以允许治疗配制剂沉积在肾皮质中的角度进入肾皮质来实现，该角度应尽可能宽分布。这可以需要使用超声引导或轴向计算机断层摄影术(CT)成像以纵向或横向方式对肾脏成像，取决于患者的个人特征。理想地，随着注射针/套管逐渐抽出，注射将涉及多个沉积物。治疗配制剂的全部体积可以沉积在单个或多个进入点处。在某些实施方案中，可以使用多达两个进入点将全部体积的治疗配制剂沉积到肾中。在某些实施方案中，可以使用一个或多个进入点，例如一个或两个进入点，将注射剂施用于单个肾。在某些实施方案中，在每个肾中使用一个或多个进入点，例如一个或两个进入点，对两个肾注射。
认为前述书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。应当理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变型，并且认为此类修改和变型在如所附权利要求书限定的本发明的范围内。提供以下实施例仅用于说明性目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。实际上，除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得明显，并且落入所附权利要求书的范围内。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和文献参考文献均通过引用完整并入本文。
实施例
实施例1：生产SRC的方法和组合物的非限制性实施例
例1.1-溶液的制备
本实施例节提供了用于分离和表征异质肾细胞群体以及生产再生疗法产品的各种培养基配制剂和溶液的组成。
表6：培养基和溶液
Figure BDA0002382941840001151
Figure BDA0002382941840001161
对于所有细胞洗涤使用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)。
实施例1.2-分离异质未分级的肾细胞群体
本实施例节显示了从人中分离未分级的(UNFX)异质肾细胞群体。进行初始组织离解以从人肾组织产生异质细胞悬浮液。
通过肾活组织检查得到的肾组织为异质肾细胞群体提供了来源。可以使用包括皮质、皮质髓质连接或髓质组织中的一种或多种的肾组织。优选使用皮质髓质连接组织。从CKD肾需要多次活组织检查核心(最小2个)，以避免疤痕组织。在计划植入最终的NKA之前约4周，临床研究者会在临床部位从患者获取肾组织。组织在实施例1.1的组织运输培养基中运输。
然后在处理用于细胞提取的组织之前，用实施例1.1的组织洗涤溶液洗涤组织以减少进入的生物负荷。
将肾组织切碎，称重并在实施例1.1的消化液中解离。将所得的细胞悬浮液在Dulbecco改良的Eagle培养基(D-MEM)+10％胎牛血清(FBS)(Invitrogen，CarlsbadCalif.)中中和，洗涤，然后重悬于无血清，无补充剂的角质形成细胞培养基(KSFM)(Invitrogen)中。然后将细胞悬浮液在15％(w/v)的碘克沙醇(OptiPrepTM，Sigma)密度边界上离心以除去红细胞和碎片，然后在实施例1.1的肾细胞生长培养基中以每cm225,000个细胞的密度开始培养到组织培养处理过的聚苯乙烯烧瓶或培养皿。例如，可以在150ml 50∶50的培养基中将细胞以25x106个细胞/瓶接种在T500 Nunc烧瓶中。
实施例1.3-分离的肾细胞群体的细胞扩增
肾细胞的扩增取决于所接受的组织量以及从进入组织中分离肾细胞的成功程度。若需要的话，可以冷冻保存分离的细胞(见下文)。肾细胞生长动力学因样品而异，这是由于从各个患者中分离出细胞固有的变异性。
开发出限定的细胞扩增过程，其适应源自进入组织表7的可变性的细胞恢复范围。肾细胞的扩增涉及使用限定细胞培养程序在肾细胞生长培养基表6中的密闭培养容器(例如，T瓶、Cell Factories、Hyper
Figure BDA0002382941840001171
)中的连续传代。
开发出一种不合BPE的培养基用于人体临床试验，以消除与使用BPE相关的固有风险。在不含BPE的培养基中评估细胞生长、表型(CK18)和细胞功能(GGT和LAP酶促活性)，并与动物研究中使用的含BPE培养基进行比较。两种培养基中肾细胞的生长、表型和功能是相当的。(数据未显示)
表7 从人肾活组织检查中的细胞回收
Figure BDA0002382941840001172
一旦在最初的T烧瓶中观察到细胞生长(第0代)，并且没有可见的污染迹象，就更换培养基并此后每2-4天更换一次(图3B)。通过在显微镜下视觉观察培养物来评估细胞以验证肾细胞形态。由于细胞聚集在一起，培养物在特征上表现出紧密的底板或鹅卵石外观。这些形态特征在扩展期间有所变化，并且可以不在每次传代时存在。在整个细胞扩增中使用的培养容器中以各种汇合水平估计细胞培养汇合。
当培养容器是至少50％汇合时，通过胰蛋白酶处理使肾细胞传代(图3B)。将分离的细胞收集到含有肾细胞生长培养基的容器中，计数并计算细胞存活力。在每次细胞传代时，将细胞以500-4000个细胞/cm2接种于足够数目的培养容器中，以便将细胞数目扩展至配制NKA所需的数目(图3B)。将培养容器置在5％CO2环境中37℃培养箱中。如上所述，监测细胞形态和汇合，并且每2-4天更换组织培养基。表8列出了在从人供体的六次肾活组织检查的细胞分离和扩增期间观察到的人肾细胞的存活力。
表8 培养的人肾细胞的细胞存活力
传代(n＝6) 细胞存活力(平均值％) 范围(％)
P0 88 84-93
P1 91 80-98
P2 94 92-99
P3 98 97-99
来自不同患者的组织的固有可变性导致培养物中不同的细胞产率。因此，严格定义细胞传代的时机或每次传代得到目标细胞数目所需的培养容器的数目和类型是不切实际的。通常，肾细胞经历2或3次传代；然而，培养的持续时间和细胞产率可以随细胞生长速率而变化。
用具有EDTA的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)分离细胞以收获或传代。通过锥虫蓝排除法评估存活力，并使用血细胞计数器手动或自动Cellometer.RTM计数系统(NexcelomBioscience，Lawrence Mass.)进行计数。
实施例1.4培养细胞的冷冻保存
常规冷冻保存扩增的肾细胞，以适应各个患者的细胞生长的内在变异性，并按照预定的临床日常表递送产品。在需要另一个NKA(例如，由于患者疾病，不可预见的过程事件等导致的延迟)的情况下，冷冻保存的细胞还提供细胞的备用来源。建立了已被用于冷冻保存细胞并在融化后恢复存活的功能细胞的条件。
为了冷冻保存，将细胞悬浮于冷冻保存溶液中至终浓度约50x106个细胞/mL(参见实施例1.1)，并分配至小瓶中。将包含约50x106个细胞/mL的1ml小瓶放在控制速率冷冻器的冷冻室中，并以预先设定的速率冷冻。冷冻后，将细胞转移到液氮冷冻器中进行过程中贮存。
实施例1.5 SRC细胞群体的制备
选定的肾细胞(SRC)可以从最终培养容器制备，所述最终培养容器从冷冻保存的细胞中生长或直接从扩增培养物中生长，取决于日程表(图3B)。
若使用冷冻保存的细胞，则将细胞融化并铺在组织培养皿上进行最后的扩增步骤。在最终的培养皿约为50-100％的情况下，汇合细胞已准备好加工以进行SRC分离。培养基更换和NKA的最终洗涤稀释最终产品中任何残留的冷冻保存液。
一旦最终的细胞培养容器达到了至少50％汇合，就将培养容器转移到在5％CO2环境中37℃的设定为2％氧气的低氧培养箱(图3C)并培养过夜。细胞可以在设置为2％氧气的氧气控制培养箱中保存长达48小时。暴露于更具生理相关性的低氧(2％)环境中改善细胞分离效率，并能够更好地检测低氧诱导的标志物，例如VEGF。
将细胞暴露于低氧条件足够的时间(例如过夜至48小时)后，将细胞用含EDTA的0.25％胰蛋白酶(Invitrogen)分离。通过锥虫蓝排除法评估存活力，并使用血细胞计数器手动或使用自动
Figure BDA0002382941840001191
计数系统(Nexcelom Bioscience，Lawrence Mass.)进行计数。用DPBS洗涤细胞一次，并在DPBS中重悬至约850x106个细胞/mL。
使用跨越密度边界/界面的离心，基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群体。通过在7％碘克沙醇溶液(OptiMEM中的OptiPrep；60％(w/v)；参见实施例1.1)上离心分离肾细胞悬浮液。
制备7％的OptiPrep密度界面溶液，并在使用前测量指示期望密度的折射率(R.I.1.3456+/-0.0004)。将收获的肾细胞分层在溶液的顶部。在室温(在不制动的情况下)在离心管或细胞处理器(例如COBE 2991)中将密度界面以800g离心20分钟。离心后以独特的团粒收集表现出大于约1.045g/mL的浮力密度的细胞级分。排除并弃去浮力密度小于1.045g/mL的细胞。
将SRC团粒重悬于DPBS中(图3C)。通过4次DPBS洗涤和1次明胶溶液步骤使最终产品中残留的OptiPrep、FBS、培养基和辅助材料的残留最小化。
实施例2：选定的肾细胞的制备
简言之，在含有4.0单位/mL分散酶(Stem Cell Technologies，Inc.，Vancouver，BC，Canada)和300单位/mL胶原酶IV(Worthington Biochemical，Lakewood，NJ，USA)的缓冲液中酶促解离肾活组织检查。通过离心经过15％碘克沙醇(
Figure BDA0002382941840001201
Axis Shield，Norton，MA，USA)除去红细胞和碎片。将原代肾细胞接种到经组织培养处理的聚苯乙烯平板(NUNC，Rochester，NY，USA)上，并在50∶50培养基中培养，该培养基为高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)∶角蛋白形成细胞无血清培养基(KSFM))的1∶1混合物，含5％胎牛血清(FBS)，1X ITS(胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充剂)和抗生素/抗真菌药(均来自Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。在培养后细胞分离之前，将原代肾细胞培养物从大气氧条件(21％)转移到更生理相关的低氧(2％)环境中24小时，以改善细胞分离效率。通过经由15mL锥形聚丙烯管中的四步碘克沙醇(OptiPrep；uKSFM中60％w/v)密度梯度(16％、13％、11％和7％)离心分离原代肾细胞培养物(制备为2mL未补充KSFM(uKSFM)中的75 x 106个细胞)，并在室温以800g离心20分钟。离心后，所有条带在使用前用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次。
在某些实施方案中，对细胞进行基因组修饰以除去编码免疫活性细胞表面抗原的基因，从而以减少接受体排斥的方式使SRC变为基因组修饰和免疫豁免。在某些实施方案中，对细胞进行遗传修饰以减少编码免疫活性细胞表面抗原的基因的表达(例如，使用RNAi)，从而以减少接受体(recipient)排斥的方式使SRC变为遗传修饰和免疫豁免。
组合来自密度梯度离心步骤的表现出浮力密度大于约1.0419g/mL的生物活性肾细胞用于生产治疗生物活性SRC。选定的肾细胞的制备也记载于例如Kelley等人(Am JPhysiol Renal Physiol 2010；299：F1026-39)、Kelley等人(Cell Transplant 2013；22：1023-39)、Bruce等人(Methods Mol Biol.2013；1001：53-64)和Basu等人(CellTransplant.2011；20：1171-901)。将细胞悬浮液(100μL)加载入与基于明胶的水凝胶生物材料混合的10cc注射器中，以配制治开产品。
在每次培养传代时和配制期间测量细胞存活力(锥虫蓝排除)。如前所述(Basuand LudloW.RegenMed 2014；9：497-512)，对终产物进行细胞表型和效力的测定法。在FDA和MPA QP的指导下，所有程序均按照现行的良好生产规范(cGMP)进行。
实施例3：工程化改造人同种异体肾细胞以治疗慢性肾疾病的一般方法
使用根据本发明的选定肾细胞对患者的治疗基于使用缺乏表面抗原的经基因组修饰的免疫豁免细胞，所述表面抗原使细胞能够排斥。在某些实施方案中，从患者或供体中回收生物活性肾细胞，离体选择，体外培养，以在必要时扩增细胞数目，并最终输注入患者中。每个患者接受使用经基因组修饰的免疫豁免的生物活性肾细胞制备的治疗(即免疫豁免的生物活性肾细胞疗法)，该肾细胞缺乏导致排斥肾细胞的表面抗原。为了更好地理解本发明，图1中显示了免疫豁免的NKA产品的制造工艺步骤的示意图。
为了提高具有不合适水平的HLA匹配的潜在供体与接受体之间的匹配水平，使用Cas9和特异性鉴定的gRNA进行靶定的等位基因特异性基因编辑。因此，通过基因破坏使来自错配供体的细胞之间的HLA匹配水平变得合适(通过减少HLA错配)以转移至潜在的接受者患者。来自潜在同种异体供体和接受体对的原代人肾细胞或富集SRC的多重HLA(I类和II类MHC)基因编辑可用于增加供体SRC与接受体的匹配。
为了减少移植的HLA错配的同种异体细胞(例如生物活性肾细胞)排斥的可能性，需要移植的接受体受试者必须在6种HLA等位基因(HLA-A，HLA-B和HLA-DRB1处的各2种等位基因)处进行HLA分型(例如，确定HLA-A，HLA-B和HLA-DRB 1多态性)。理想地，接受体基因型与具有相同6/6HLA等位基因的供体匹配，因为6/6HLA等位基因匹配与移植后降低的免疫排斥风险相关。若不可用具有6/6等位基因匹配的供体(例如，来自骨髓或脐带血HSC供体登记处或相关家庭成员)，但具有5/6、4/6、3/6或2/6HLA等位基因匹配的部分匹配的供体是可用的，本文描述的方法可用于减少部分匹配的供体和受体之间的错配。必要时，可使用本文所述的基因编辑方法破坏单个等位基因或多个等位基因(2、3、4、5或6种等位基因)，以减少移植接受者中形成免疫抑制的风险和/或疾病的严重程度。
本文所述的方法可用于修饰供体肾细胞(例如，BRC和/或SRC)以产生免疫豁免的肾细胞。例如，该方法可用于破坏(例如敲除)供体SRC中的1、2或3种HLA等位基因，以产生与特定群体中最频繁存在的HLA基因型匹配的细胞。例如，可以在例如国家骨髓捐赠者项目HLA单倍频率数据中找到北美四个种族最常见的10种单倍型，在https：//bioinformatics.bethematchclinical.org/hla-resources/haplotype-frequencies/可获得；Burdett等人，Hum.Immunol.64(10Suppl)：S6(2003))。
对于每种gRNA，设计并获得单个寡核苷酸。U6启动子和gRNA支架(例如包括除靶向域外的每种物质，例如包括衍生自crRNA和tracrRNA的序列，例如包括第一互补域；连接域；第二互补域；近端域；和尾域)分别进行PCR扩增并纯化为dsDNA分子。在PCR反应中使用gRNA特异性寡核苷酸将U6和gRNA支架缝合在一起，并通过寡核苷酸中规定的靶向域进行连接。纯化所得的dsDNA分子用于转染。可以使用备选启动子驱动体内转录或体外转录。可以使用任何gRNA支架创建与来自任何细菌物种的Cas9s相容的gRNA。
将每种要测试的gRNA以及表达Cas9的质粒和少量表达GFP的质粒转染到人细胞中。在初步实验中，这些细胞可以是永生化的人细胞系，例如293T、K562或U20S。或者，可以使用原代人细胞。在此种情况下，细胞可能与最终的治疗性细胞靶物(例如，红系细胞)有关。在内源染色质和基因表达的背景下，类似于潜在治疗靶细胞群体的原代细胞的使用可提供有关基因靶向率的重要信息。
可以使用脂质转染(如Lipofectamine或Fugene)或电穿孔(如LonzaNucleofectionTM)进行转染。转染后，可以通过荧光显微术或通过流式细胞术测定GFP表达，以确认一致且高水平的转染。这些初步转染可以包含不同的gRNA和不同的靶向方法(17聚体、20聚体、核酸酶，双切口酶等)，以确定哪些gRNA/gRNA组合给出最大的活性。
可以通过T7E1型测定法或通过测序来测量靶位点处的NHEJ诱导的插入/缺失形成来评估用每种gRNA的切割效率。或者，也可以使用其他错配敏感性酶，例如Cell/Surveyor核酸酶。
对于T7E1测定法，PCR扩增子为约500-700bp，意图的切割位点不对称地置于扩增子中。在PCR产物的扩增、纯化和大小验证后，将DNA变性并通过加热至95℃，然后缓慢冷却进行重新杂交。然后，用识别并切割非完全匹配的DNA的T7内切核酸酶I(或其他错配敏感性酶)消化杂交的PCR产物。若在原始模板DNA中存在插入/缺失，则当将扩增子变性并重新退火时，这导致含有不同插入/缺失的DNA链发生杂交，因此导致不完全匹配的双链DNA。消化产物可以通过凝胶电泳或毛细管电泳显现。可以使用以下等式使用切割的DNA的分数(切割产物的密度除以切割和未切割的密度)来估计NHEJ的百分比：％NHEJ＝(1-(1-切割的分数)’72)。T7E1测定法灵敏性降至约2％至5％NHEJ。
可以使用测序来代替T7E1测定法或在T7E1测定法外使用测序。对于Sanger测序，将纯化的PCR扩增子克隆到质粒主链中，进行转化，微量制备并用单一引物测序。在通过T7E1测定NHEJ率后，可使用Sanger测序测定插入/缺失的确切性质。测序也可以使用下一代测序技术来进行。当使用下一代测序时，扩增子可以为300-500bp，意图的切割位点不对称放置。PCR后，可以将下一代测序衔接头和条形码(例如Illumina多重衔接头和索引)添加至扩增子的末端，例如用于高通量测序(例如在Illumina MiSeq上)。此方法允许检测非常低的NHEJ率。
虽然举例说明用于鉴定与CRISPR/Cas9分子一起使用的gRNA的本文描述的方法，但是对于本领域技术人员而言容易明显的是，本文描述的gRNA鉴定方法可以用于鉴定和选择可以与其他核酸酶(例如TALEN、Cpfl和锌指核酸酶)一起使用的序列。对示例性实施方案的各种修改对于本领域技术人员将是容易显而易见的，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可以应用于其他实施方案和应用。此外，在以下描述中，出于解释的目的而阐述了许多细节。然而，本领域普通技术人员将意识到，可以在不使用这些特定细节的情况下实施本发明。
实施例4：用经基因组修饰的免疫豁免SRC的免疫原性和效力研究
在第一项动物研究中，将来自野生型大鼠的经基因组修饰的免疫豁免SRC注射到患有多囊肾病(PCK)的突变Sprague Dawley(SD)大鼠的肾中。要评估的主要终点是保留在突变的肾单位(kidney nephron)中的野生型经基因组修饰的免疫豁免SRC的数目。使用组织的原位杂交和PCR、用于定位的定性表征的组织学方法并且在分子水平上对患有慢性肾疾病(CKD)并注射有野生型同基因SD大鼠SRC的PCK SD大鼠进行评估以量化野生型对患病肾单位的整合和保留的程度。
在第二项研究中，通过使用4种效力测定法体外分析评估除去控制I类、II类或I类和II类MHC的基因时的SRC功能来评估人SRC基因编辑。通过电穿孔导入CRISPR/Cas9，并研究SRC的趋化性效果、小管形成、细胞因子释放和趋化性效果。
实施例5：SRC中MHC的抑制
CRISPR/Cas9允许在灵活且简单的系统中进行特异性基因组破坏和替换，从而导致高特异性和低细胞毒性。CRISPR/Cas9基因组编辑系统需要将Cas9蛋白与从人U6聚合酶III启动子表达的引导RNA载体共表达。通过在3’端存在原间隔物相邻基序(PAM-序列NGG)，Cas9将解开DNA双链体，并在引导RNA识别靶序列后切割两条链。然后可以将在救援供体载体中合成的功能盒插入解链的DNA中。现在，修复的基因组表达带有或不带有标签的期望序列。最初采用CRISPR“敲除”各种细胞类型和生物体中的靶基因，但是对Cas9酶的修饰已扩展了CRISPR的应用，以选择性激活或抑制靶基因，纯化DNA的特定区域，甚至使用荧光显微术对活细胞中的DNA成像。
我们选择使用CRISPR/Cas-9基因编辑来靶向MHC-1的B2M或HLA-A(一个亚基)组分。在靶定基因组位点处的表观基因组修饰可以修饰靶定的DNA位点对cas蛋白的可及性。我们已经发现，引导RNA成功敲低了以核小体H3K4残基的广泛甲基化为特征的开放染色质区域中基因转录起始位点附近的B2M基因靶物的表达。利用公开可获得的软件(CHOPCHOP，WU-CRISPR)设计CRISPR靶向构建体(结合限定的DNA序列的引导RNA)，并使用电穿孔转染肾细胞。成功靶向以创建FACS数据的B2M基因的靶DNA序列如下：
靶DNA序列
GAGTAGCGCGAGCACAGCTA(SEQ ID NO：346)
PAM序列
AGG
靶基因座
GRCh38上的Chr.15：44711563-44711585(参见NM_004048.2于chr15：45003685-45010357在加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器基因组装配GRCh37/hg19上)
链
相反
使用电穿孔将CRISPR/Cas-9构建体导入原代人肾细胞。可以应用本领域技术人员已知的其他方法，包括脂质转染、转染、显微注射等，以递送CRISPR/Cas-9构建体。尽管下面呈现的结果聚焦于B2M亚基，但相似的方法可以应用于靶向多肽(HLA-A)。
用CRISPR/Cas9构建体电穿孔人原代肾细胞(1x106)，该构建体特异性靶向MHC-1复合物的B2M组分。使用肾组织酶促消化后培养的人原代肾细胞进行图6-8的所有工作。这些细胞未经处理以获得SRC。电穿孔后48小时使细胞恢复。通过FACS评估B2M的表达。使用Gene Pulser XcellTM电穿孔系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，California，USA)，预设程序#1：方波脉冲类型，在0.2cm皿中以160伏，100μL总体积进行电穿孔5毫秒。
分别地，将人原代肾细胞(1x106)用特异性靶向MHC-1复合物的B2M组分的CRISPR/Cas9构建体进行电穿孔。电穿孔后5天使细胞恢复。通过FACS评估B2M的表达。
如图6所示，如通过电穿孔后48小时的FAC测定，我们能够使B2M表达降低47％。电穿孔后5天观察到类似的减少，表明转染是稳定的。见图7。
就位置而言，分子分析指示B2M敲除发生在正确的B2M基因座上。见图8。这对于细胞产品的安全性是重要的。
不管SRC供体细胞ABO单倍型如何，此方法成功敲除B2M，而不影响SRC功能，如通过VEGF和KIM1分泌测定的，这是SRC的效力测定法。见图9和11。
混合淋巴细胞反应(MLR)是制药和生物技术组织用于显示药物或可植入材料安全性的一项测试。它通常用作美国食品药品管理局(FDA)清关过程的部分。在技术上，它是一种离体细胞免疫测定法，其发生在两个同种异体淋巴细胞群体(相同物种，但遗传上不同)之间。在单向MLR中，仅一个淋巴细胞群体可以应答或增殖。在双向MLR中，两个群体可增殖。进行MLR以评估T细胞对外部刺激物如何起反应。T细胞是白细胞类型，其扫描细胞异常和感染。它们对人免疫力是必需的。
我们使用对照和CRISPER基因编辑的细胞作为刺激物群体进行单向MLR。若成功敲除或敲低B2M表达，则我们预测淋巴细胞增殖应当减少。如图10所示，测试3种不同的SRC制剂(每种制剂具有基于FACS的不同水平的B2M下调)，我们观察到淋巴细胞增殖的同时减少。
我们具有一种系统，通过该系统，我们可以证明基因敲除的程度和与体外免疫应答的相关性。这样，对于此种治疗的接受体，对身体具有其自身有害效果的免疫抑制药物的最小使用或不使用将是需要的。
实施例6：示例性的NKA配制剂组分
1.细胞组分和材料
SRC构成NKA的生物活性成分。SRC主要由肾小管上皮细胞构成，所述肾小管上皮细胞在其再生潜力方面是公知的。自体SRC群体中可以存在其他实质(血管)细胞、间充质细胞、内皮细胞和基质(收集管)细胞。
从使用临床护理标准肾活组织检查程序收集肾组织核心获得的肾皮质组织制备SRC。通过酶促消化从肾组织中分离肾细胞，并使用标准细胞培养技术进行扩增。通过在显微镜下肉眼观察培养物来评估细胞以验证肾细胞形态。由于细胞聚簇在一起，培养物特征性表明紧密的底板或鹅卵石外观(图13)。通过跨越密度边界或密度界面或单步不连续密度梯度分开分离且扩增的细胞来获得SRC。
使用跨越密度边界或界面的离心基于细胞浮力密度分离收获的肾细胞群。在OptiPrep(7％碘克沙醇；OptiMEM中60％(w/v))介质溶液上分离肾细胞悬浮液。离心后收集表现出大于约1.0419g/mL的浮力密度的细胞级分作为独特的团粒(图14)。将维持小于1.0419g/mL的浮力密度的细胞排除并弃去。
将SRC团粒重新悬浮在DPBS中。可以通过洗涤步骤最小化最终产品中残留的OptiPrep、FBS、培养基和辅助材料的残留。
2.生物材料组分和辅助材料
使用以下生物材料组分和辅助材料将SRC配制为NKA：
1.猪明胶-用于制备热响应性水凝胶。
2.Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)-用于溶解猪明胶。缓冲液可以用人血浆或人血小板裂解物替换或与它混合。
生物材料制备
生物材料是DPBS中由猪明胶构成的明胶溶液。将明胶溶于DPBS或人血浆/人血小板裂解物或两者的混合物中至规定浓度，以形成热响应性水凝胶的明胶溶液。将明胶溶液通过0.1μm滤器进行过滤灭菌，并且以准备好配制的单次使用等分试样冷藏或冷冻保存。
生物材料的关键特性是它是一种热响应性水凝胶，使得它可以在不同温度胶凝和液化。NKA配制剂中使用的明胶溶液在室温(22-28℃)以上为液体，并在冷却至冷藏温度(2-8℃)时胶凝。
明胶溶液浓度
胶凝特性-在冷藏温度形成凝胶(倒置时无流动)和在室温变成流体(倒置时自由流动)的能力上评估0.5-1.0％范围内的明胶浓度。表9显示了不同浓度的明胶溶液的胶凝特性。
表9-不同浓度的明胶溶液的胶凝特性
Figure BDA0002382941840001271
由于用0.63％以上的明胶溶液配制的NKA能够始终满足验收标准，因此NKA配制剂的明胶浓度选择0.88±0.12％的范围。然而，应注意的是，包含约0.63％至约1％浓度范围内的明胶的配制剂也是合适的。
3.NKA配制剂
用明胶溶液(一种基于明胶的热响应性水凝胶)将SRC配制成NKA。基于明胶的热响应性水凝胶提供改善的细胞稳定性，从而延长产品货架期、对于临床效用在SRC转运和递送至肾皮质中期间的稳定性。配制剂开发评估明胶溶液的组成、浓度和稳定性。
使用锥虫蓝染料排除法对洗涤的SRC进行计数。从冷贮存中取出明胶溶液，并且通过加热至26-30℃液化。将含有所需数目细胞的SRC悬浮液体积离心，并且重新悬浮在液化明胶溶液中，以进行最后的洗涤步骤。将此悬浮液离心，并将SRC团粒重新悬浮在足够的明胶溶液中，以在配制的NKA中获得100x106个细胞/mL的所得SRC浓度。
NKA填充和胶凝
将NKA产品无菌填充到注射器中。在填充过程期间进行动态空气采样，包括活和非活采样。将NKA包装旋转至少2个小时，以在冷却至2-8℃的情况下使细胞保持悬浮，以形成最终的凝胶NKA。进行胶凝需要快速冷却，以使细胞不沉降在明胶溶液中。将注射器中的明胶溶液置于冷藏条件中时监测该明胶溶液的温度。如图15所示，观察到温度急剧下降。1小时后，温度通常下降到最终温度4.4℃的0.3℃之内。
明胶溶液的冷却开始胶凝过程，但是所形成的凝胶稳定化需要有限的时间，以使SRC在贮存时保持悬浮在凝胶中。将含有配制的NKA的注射器旋转过夜或1.25小时，然后直立放置过夜。随后，取出内容物，并在产物的四个不同区段中测量细胞浓度。分析指示这四个区段之间没有差异，因此一旦NKA在低温旋转了至少1.25小时，就不发生可测量的细胞沉降(图16)。
序列表
<110> 蒂莫西.伯特伦(Bertram, Timothy)
迪帕克.简(Jain, Deepak)
<120> 用于治疗肾疾病的免疫豁免的生物活性肾细胞
<130> 050400-516001WO
<150> 62/523,241
<151> 2017-06-21
<160> 346
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1368
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌
<400> 1
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
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Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
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Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala
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<210> 2
<211> 1368
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌
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Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
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His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Ala Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Arg Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Arg Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Ser Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Glu Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Ile Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Lys Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala
1010 1015 1020
Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala
1040 1045 1050
Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr
1085 1090 1095
Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys
1100 1105 1110
Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro
1115 1120 1125
Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val
1130 1135 1140
Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys
1145 1150 1155
Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser
1160 1165 1170
Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys
1175 1180 1185
Glu Val Arg Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu
1190 1195 1200
Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly
1205 1210 1215
Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1220 1225 1230
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys
1250 1255 1260
His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys
1265 1270 1275
Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala
1280 1285 1290
Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn
1295 1300 1305
Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Phe Gly Ala Pro Ala Ala
1310 1315 1320
Phe Ile Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Gly Arg Asn Arg Tyr Lys Ser
1325 1330 1335
Ile Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr
1340 1345 1350
Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 3
<211> 1388
<212> PRT
<213> 嗜热链球菌
<400> 3
Met Thr Lys Pro Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Thr Thr Asp Asn Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Met
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Ser Lys Lys Tyr Ile Lys Lys Asn Leu Leu
35 40 45
Gly Val Leu Leu Phe Asp Ser Gly Ile Thr Ala Glu Gly Arg Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Arg Asn Arg Ile Leu
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Thr Glu Met Ala Thr Leu Asp Asp Ala
85 90 95
Phe Phe Gln Arg Leu Asp Asp Ser Phe Leu Val Pro Asp Asp Lys Arg
100 105 110
Asp Ser Lys Tyr Pro Ile Phe Gly Asn Leu Val Glu Glu Lys Ala Tyr
115 120 125
His Asp Glu Phe Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Tyr Leu Ala Asp
130 135 140
Ser Thr Lys Lys Ala Asp Leu Arg Leu Val Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Tyr Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Glu Phe Asn Ser
165 170 175
Lys Asn Asn Asp Ile Gln Lys Asn Phe Gln Asp Phe Leu Asp Thr Tyr
180 185 190
Asn Ala Ile Phe Glu Ser Asp Leu Ser Leu Glu Asn Ser Lys Gln Leu
195 200 205
Glu Glu Ile Val Lys Asp Lys Ile Ser Lys Leu Glu Lys Lys Asp Arg
210 215 220
Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Lys Asn Ser Gly Ile Phe Ser Glu
225 230 235 240
Phe Leu Lys Leu Ile Val Gly Asn Gln Ala Asp Phe Arg Lys Cys Phe
245 250 255
Asn Leu Asp Glu Lys Ala Ser Leu His Phe Ser Lys Glu Ser Tyr Asp
260 265 270
Glu Asp Leu Glu Thr Leu Leu Gly Tyr Ile Gly Asp Asp Tyr Ser Asp
275 280 285
Val Phe Leu Lys Ala Lys Lys Leu Tyr Asp Ala Ile Leu Leu Ser Gly
290 295 300
Phe Leu Thr Val Thr Asp Asn Glu Thr Glu Ala Pro Leu Ser Ser Ala
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asn Glu His Lys Glu Asp Leu Ala Leu Leu Lys
325 330 335
Glu Tyr Ile Arg Asn Ile Ser Leu Lys Thr Tyr Asn Glu Val Phe Lys
340 345 350
Asp Asp Thr Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Lys Thr Asn
355 360 365
Gln Glu Asp Phe Tyr Val Tyr Leu Lys Lys Leu Leu Ala Glu Phe Glu
370 375 380
Gly Ala Asp Tyr Phe Leu Glu Lys Ile Asp Arg Glu Asp Phe Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro Tyr Gln Ile His Leu
405 410 415
Gln Glu Met Arg Ala Ile Leu Asp Lys Gln Ala Lys Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Ala Lys Asn Lys Glu Arg Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Asp Phe Ala Trp
450 455 460
Ser Ile Arg Lys Arg Asn Glu Lys Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Asp
465 470 475 480
Val Ile Asp Lys Glu Ser Ser Ala Glu Ala Phe Ile Asn Arg Met Thr
485 490 495
Ser Phe Asp Leu Tyr Leu Pro Glu Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Thr Phe Asn Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Arg
515 520 525
Phe Ile Ala Glu Ser Met Arg Asp Tyr Gln Phe Leu Asp Ser Lys Gln
530 535 540
Lys Lys Asp Ile Val Arg Leu Tyr Phe Lys Asp Lys Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Asp Lys Asp Ile Ile Glu Tyr Leu His Ala Ile Tyr Gly Tyr Asp Gly
565 570 575
Ile Glu Leu Lys Gly Ile Glu Lys Gln Phe Asn Ser Ser Leu Ser Thr
580 585 590
Tyr His Asp Leu Leu Asn Ile Ile Asn Asp Lys Glu Phe Leu Asp Asp
595 600 605
Ser Ser Asn Glu Ala Ile Ile Glu Glu Ile Ile His Thr Leu Thr Ile
610 615 620
Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Lys Gln Arg Leu Ser Lys Phe Glu Asn
625 630 635 640
Ile Phe Asp Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Ser Arg Arg His Tyr Thr
645 650 655
Gly Trp Gly Lys Leu Ser Ala Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Glu
660 665 670
Lys Ser Gly Asn Thr Ile Leu Asp Tyr Leu Ile Asp Asp Gly Ile Ser
675 680 685
Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ala Leu Ser Phe Lys
690 695 700
Lys Lys Ile Gln Lys Ala Gln Ile Ile Gly Asp Glu Asp Lys Gly Asn
705 710 715 720
Ile Lys Glu Val Val Lys Ser Leu Pro Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys
725 730 735
Gly Ile Leu Gln Ser Ile Lys Ile Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met
740 745 750
Gly Gly Arg Lys Pro Glu Ser Ile Val Val Glu Met Ala Arg Glu Asn
755 760 765
Gln Tyr Thr Asn Gln Gly Lys Ser Asn Ser Gln Gln Arg Leu Lys Arg
770 775 780
Leu Glu Lys Ser Leu Lys Glu Leu Gly Ser Lys Ile Leu Lys Glu Asn
785 790 795 800
Ile Pro Ala Lys Leu Ser Lys Ile Asp Asn Asn Ala Leu Gln Asn Asp
805 810 815
Arg Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Asp Met Tyr Thr Gly
820 825 830
Asp Asp Leu Asp Ile Asp Arg Leu Ser Asn Tyr Asp Ile Asp His Ile
835 840 845
Ile Pro Gln Ala Phe Leu Lys Asp Asn Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
850 855 860
Val Ser Ser Ala Ser Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asp Val Pro Ser Leu
865 870 875 880
Glu Val Val Lys Lys Arg Lys Thr Phe Trp Tyr Gln Leu Leu Lys Ser
885 890 895
Lys Leu Ile Ser Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg
900 905 910
Gly Gly Leu Ser Pro Glu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Gln Arg Gln Leu
915 920 925
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Arg Leu Leu Asp Glu
930 935 940
Lys Phe Asn Asn Lys Lys Asp Glu Asn Asn Arg Ala Val Arg Thr Val
945 950 955 960
Lys Ile Ile Thr Leu Lys Ser Thr Leu Val Ser Gln Phe Arg Lys Asp
965 970 975
Phe Glu Leu Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asp Phe His His Ala His
980 985 990
Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Ala Ser Ala Leu Leu Lys Lys Tyr
995 1000 1005
Pro Lys Leu Glu Pro Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Pro Lys Tyr
1010 1015 1020
Asn Ser Phe Arg Glu Arg Lys Ser Ala Thr Glu Lys Val Tyr Phe
1025 1030 1035
Tyr Ser Asn Ile Met Asn Ile Phe Lys Lys Ser Ile Ser Leu Ala
1040 1045 1050
Asp Gly Arg Val Ile Glu Arg Pro Leu Ile Glu Val Asn Glu Glu
1055 1060 1065
Thr Gly Glu Ser Val Trp Asn Lys Glu Ser Asp Leu Ala Thr Val
1070 1075 1080
Arg Arg Val Leu Ser Tyr Pro Gln Val Asn Val Val Lys Lys Val
1085 1090 1095
Glu Glu Gln Asn His Gly Leu Asp Arg Gly Lys Pro Lys Gly Leu
1100 1105 1110
Phe Asn Ala Asn Leu Ser Ser Lys Pro Lys Pro Asn Ser Asn Glu
1115 1120 1125
Asn Leu Val Gly Ala Lys Glu Tyr Leu Asp Pro Lys Lys Tyr Gly
1130 1135 1140
Gly Tyr Ala Gly Ile Ser Asn Ser Phe Thr Val Leu Val Lys Gly
1145 1150 1155
Thr Ile Glu Lys Gly Ala Lys Lys Lys Ile Thr Asn Val Leu Glu
1160 1165 1170
Phe Gln Gly Ile Ser Ile Leu Asp Arg Ile Asn Tyr Arg Lys Asp
1175 1180 1185
Lys Leu Asn Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr Lys Asp Ile Glu Leu
1190 1195 1200
Ile Ile Glu Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Ser Asp Gly
1205 1210 1215
Ser Arg Arg Met Leu Ala Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Lys Arg
1220 1225 1230
Gly Glu Ile His Lys Gly Asn Gln Ile Phe Leu Ser Gln Lys Phe
1235 1240 1245
Val Lys Leu Leu Tyr His Ala Lys Arg Ile Ser Asn Thr Ile Asn
1250 1255 1260
Glu Asn His Arg Lys Tyr Val Glu Asn His Lys Lys Glu Phe Glu
1265 1270 1275
Glu Leu Phe Tyr Tyr Ile Leu Glu Phe Asn Glu Asn Tyr Val Gly
1280 1285 1290
Ala Lys Lys Asn Gly Lys Leu Leu Asn Ser Ala Phe Gln Ser Trp
1295 1300 1305
Gln Asn His Ser Ile Asp Glu Leu Cys Ser Ser Phe Ile Gly Pro
1310 1315 1320
Thr Gly Ser Glu Arg Lys Gly Leu Phe Glu Leu Thr Ser Arg Gly
1325 1330 1335
Ser Ala Ala Asp Phe Glu Phe Leu Gly Val Lys Ile Pro Arg Tyr
1340 1345 1350
Arg Asp Tyr Thr Pro Ser Ser Leu Leu Lys Asp Ala Thr Leu Ile
1355 1360 1365
His Gln Ser Val Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ala
1370 1375 1380
Lys Leu Gly Glu Gly
1385
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 5
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 6
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(12)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 7
Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 8
Lys Lys Xaa Lys
1
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 9
Lys Arg Xaa Lys
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 10
Lys Lys Xaa Arg
1
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何氨基酸
<400> 11
Lys Arg Xaa Arg
1
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 12
Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Leu Asp
20
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 13
Met Ser Arg Arg Arg Lys Ala Asn Pro Thr Lys Leu Ser Glu Asn Ala
1 5 10 15
Lys Lys Leu Ala Lys Glu Val Glu Asn
20 25
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 14
Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 15
Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 16
Lys Leu Lys Ile Lys Arg Pro Val Lys
1 5
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 17
cgcgagcaca gctaaggcca cgg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 18
tcacgtcatc cagcagagaa tgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
acaaagtcac atggttcaca cgg 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 20
gagtagcgcg agcacagcta agg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 21
agtcacatgg ttcacacggc agg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 22
aagtcaactt caatgtcgga tgg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
actcacgctg gatagcctcc agg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 24
tcctgaattg ctatgtgtct ggg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 25
ggccacggag cgagacatct cgg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 26
cgtgagtaaa cctgaatctt tgg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
ttggagtacc tgaggaatat cgg 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 28
cagtaagtca acttcaatgt cgg 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
gcatactcat ctttttcagt ggg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
agggtaggag agactcacgc tgg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 31
ggccgagatg tctcgctccg tgg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 32
gagacatgta agcagcatca tgg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
gtcttttccc gatattcctc agg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 34
catactcatc tttttcagtg ggg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 35
acagcccaag atagttaagt ggg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
acatgtaagc agcatcatgg agg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
ggcatactca tctttttcag tgg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 38
tggagtacct gaggaatatc ggg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
ttcctgaatt gctatgtgtc tgg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 40
tcgatctatg aaaaagacag tgg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
cacagcccaa gatagttaag tgg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
ttcagacttg tctttcagca agg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 43
atactcatct ttttcagtgg ggg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
ttaccccact taactatctt ggg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
acttgtcttt cagcaaggac tgg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 46
cagcccaaga tagttaagtg ggg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
acccagacac atagcaattc agg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 48
tgggctgtga caaagtcaca tgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
gctactctct ctttctggcc tgg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 50
ctcgcgctac tctctctttc tgg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
ctcaggtact ccaaagattc agg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 52
ctgaatcttt ggagtacctg agg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
actctctctt tctggcctgg agg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
cttaccccac ttaactatct tgg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
tttgactttc cattctctgc tgg 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
gaagttgact tactgaagaa tgg 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
tggagagaga attgaaaaag tgg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
cagttgagag cctacctgga tgg 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
tgccgtcgta ggcgtcctgc cgg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
ggcgcttcct ccgcgggtac cgg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
agactgaccg agtggacctg ggg 23
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 62
cagactgacc gagtggacct ggg 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
acagactgac cgagtggacc tgg 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
cttcctccgc gggtaccggc agg 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
taccggcagg acgcctacga cgg 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 66
aggcgtcctg ccggtacccg cgg 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
cgtcctgccg gtacccgcgg agg 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 68
ccagtcacag actgaccgag tgg 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
gcagccatac attatctgga tgg 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 70
ccaggagaca cggaatgtga agg 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
ctctcaactg ctccgcctca tgg 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 72
ttgtaaaggt gagagcttgg agg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
tcgctgccgt gatgtggagg agg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 74
ggcgccatga cggccatcct cgg 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 75
tgtgtcttgg gggggtctga cgg 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 76
gcgcccgcgg ctccatcctc tgg 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 77
ctcaggtgga gaaggggtga agg 23
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 78
atttcttcac atccgtgtcc cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 79
gtggacctgg ggaccctgcg cgg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 80
ttcacatccg tgtcccggcc cgg 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 81
agcttgtaaa ggtgagagct tgg 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 82
acggccatcc tcggcgtctg ggg 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 83
gacggccatc ctcggcgtct ggg 23
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 84
tcaggtggag aaggggtgaa ggg 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 85
gacgccgagg atggccgtca tgg 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 86
tgacggccat cctcggcgtc tgg 23
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 87
tctcaactgc tccgcctcat ggg 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 88
gtatggctgc gacgtggggt cgg 23
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
cactcggtca gtctgtgact ggg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 90
cgcacgggta ccaggggcca cgg 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
ggatgtgaag aaatacctca tgg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 92
cacaccatcc agataatgta tgg 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
cgtcgcagcc atacattatc tgg 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 94
cggctccatc ctctggctcg cgg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
gtgtcttggg ggggtctgac ggg 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 96
acagcgacgc cgcgagccag agg 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 97
cgacgccgcg agccagagga tgg 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 98
gataatgtat ggctgcgacg tgg 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 99
ataatgtatg gctgcgacgt ggg 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 100
caccaagcgc aagtgggagg cgg 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 101
gctgcaagta agtatgaagg agg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
cgtggagacc aggcctgcag ggg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 103
ggtggagaag gggtgaaggg tgg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
ctgcagcgca cgggtaccag ggg 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 105
cggctactac aaccagagcg agg 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 106
agatcacact gacctggcag cgg 23
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 107
tgtggtggtg ccttctggag agg 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 108
agacagctct gggaaaagag ggg 23
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 109
gaagagctca ggtggagaag ggg 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 110
tgaagaaata cctcatggag tgg 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 111
tagcccacgg cgatgaagcg ggg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 112
cgtgtcgtcc acgtagccca cgg 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 113
gatcaccaag cgcaagtggg agg 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 114
ggacctgcgc tcttggaccg cgg 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 115
ggcgccgtgg atagagcagg agg 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 116
cgccgtggat agagcaggag ggg 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 117
tggatggcac gtgcgtggag tgg 23
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 118
cttctcacag atagaaaagg agg 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 119
tggtcgctgc cgtgatgtgg agg 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 120
cagattctcc ccagacgccg agg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 121
ggatggggag gaccagaccc agg 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 122
tggggtaagg agggagatgg ggg 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 123
ctcatggagt gggagcctgg ggg 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 124
cagatacctg gagaacggga agg 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 125
gagccagagg atggagccgc ggg 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 126
cctggccctg acccagacct ggg 23
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 127
catggtcaga gatggggtgg tgg 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 128
tggaggagga agagctcagg tgg 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 129
ttggaccgcg gcggacatgg cgg 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 130
tggaaccttc cagaagtggg cgg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 131
cctcctcctg ctactctcgg ggg 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 132
agctctggga aaagagggga agg 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 133
gggatggaac cttccagaag tgg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 134
agatggggta aggagggaga tgg 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 135
ggtggcctca tggtcagaga tgg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 136
ctgaccatga ggccaccctg agg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 137
gggtcatatg tgtcttgggg ggg 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 138
ctccgcaggg tagaagccca ggg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 139
aagcccctca ccctgagatg ggg 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 140
gtggagaagg ggtgaagggt ggg 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 141
gtggatagag caggaggggc cgg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 142
tgctctatcc acggcgcccg cgg 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 143
aaaaggaggg agttacactc agg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 144
tgagggacac atcagagccc tgg 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 145
gaaggagacg ctgcagcgca cgg 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
tctccgcagg gtagaagccc agg 23
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 147
gaagacagct ctgggaaaag agg 23
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 148
ccagaagtgg gcggctgtgg tgg 23
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 149
tctggttgta gtagccgcgc agg 23
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 150
aatgatgccc acgatgggga tgg 23
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 151
tggaaggttc catcccctgc agg 23
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 152
actgacctgg cagcgggatg ggg 23
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 153
aggaagagct caggtggaga agg 23
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 154
atgtggagga ggaagagctc agg 23
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 155
gagccccgct tcatcgccgt ggg 23
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 156
caggtcagtg tgatctccgc agg 23
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 157
gcgccgtgga tagagcagga ggg 23
<210> 158
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 158
agacctgggc gggtgagtgc ggg 23
<210> 159
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 159
ggaggaccag acccaggaca cgg 23
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 160
gagaccaggc ctgcagggga tgg 23
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 161
tatctctgct cctctccaga agg 23
<210> 162
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 162
caccctgaga tggggtaagg agg 23
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 163
cgtagcccac ggcgatgaag cgg 23
<210> 164
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 164
tgggtcatat gtgtcttggg ggg 23
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 165
cccaggcagt gacagtgccc agg 23
<210> 166
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 166
ggatggaacc ttccagaagt ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 167
ccaagcccct caccctgaga tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 168
caagtgggag gcggcccatg agg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 169
ggaagagctc aggtggagaa ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 170
cagcaatgat gcccacgatg ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 171
atggggtaag gagggagatg ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 172
ctgcggagat cacactgacc tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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gaagaaatac ctcatggagt ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 174
tcagatcacc aagcgcaagt ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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gctcttcctc ctccacatca cgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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ggattacatc gccctgaacg agg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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aagacagctc tgggaaaaga ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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ccaggcagtg acagtgccca ggg 23
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<213> 智人
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agctgtgatc actggagctg tgg 23
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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ttctgttttt gttctacccc agg 23
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<213> 智人
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ctgggcactg tcactgcctg ggg 23
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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cagcccacca tccccatcgt ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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gatcacactg acctggcagc ggg 23
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 192
gatgcccacg atggggatgg tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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gctgcagcgc acgggtacca ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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tggcctcatg gtcagagatg ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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acacggagct cgtggagacc agg 23
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<213> 智人
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cacgcacgtg ccatccaggt agg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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tgggctggga agacagctct ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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acccgcccag gtctgggtca ggg 23
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gtagcccacg gcgatgaagc ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 202
ctccgcagat acctggagaa cgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 203
ttctccccag acgccgagga tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<213> 智人
<400> 205
tccgcagata cctggagaac ggg 23
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<213> 智人
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 209
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<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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tccctcctta ccccatctca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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ctcaccttta caagctgtga ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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ggcccctcct gctctatcca cgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 220
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 221
ccagcccacc atccccatcg tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 222
accctgagat ggggtaagga ggg 23
<210> 223
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 223
gtgggtcata tgtgtcttgg ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
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gatgtaatcc ttgccgtcgt agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
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ctcagatcac caagcgcaag tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 226
agtagcagga ggagggttcg ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 227
cacagccgcc cacttctgga agg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 228
gtggcctcat ggtcagagat ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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gtggtgggtc atatgtgtct tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 230
ctccagtgat cacagctcca agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 231
gacccaggac acggagctcg tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 232
ctgtggtcgc tgccgtgatg tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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cctcaccctg agatggggta agg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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accctgaggt gctgggccct ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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gcactcaccc gcccaggtct ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
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cttccagaag tgggcggctg tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 240
gtgagacagc tgccttgtgt ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 242
tggacgacac gcagttcgtg cgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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tcccgttctc caggtatctg cgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 244
ctcttggacc gcggcggaca tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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cccatcgtgg gcatcattgc tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 247
caagcccctc accctgagat ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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cgtgggcatc attgctggcc tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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cacgatgggg atggtgggct ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 250
atctggatgg tgtgagaacc tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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acctgccatg tgcagcatga ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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tctcaccttt acaagctgtg agg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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ggttccatcc cctgcaggcc tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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cagacctggg cgggtgagtg cgg 23
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<213> 智人
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ggagtggctc cgcagatacc tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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aagagcgcag gtcctcgttc agg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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tcgtggagac caggcctgca ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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atgcccacga tggggatggt ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 259
ttaccccatc tcagggtgag ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
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cttcatcgcc gtgggctacg tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
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agagcgcagg tcctcgttca ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 262
gagtagcagg aggagggttc ggg 23
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<212> DNA
<213> 智人
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aaccctcctc ctgctactct cgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 264
ctccttggag ctgtgatcac tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 265
tgtgagacag ctgccttgtg tgg 23
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 266
tgaggccacc ctgaggtgct ggg 23
<210> 267
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 267
actccacgca cgtgccatcc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 268
cactgacctg gcagcgggat ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 269
catctcaggg tgaggggctt ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 270
tctccacgag ctccgtgtcc tgg 23
<210> 271
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<212> DNA
<213> 智人
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accctcatgc tgcacatggc agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 272
agcaggaggg gccggagtat tgg 23
<210> 273
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 273
gcgtctcctt cccgttctcc agg 23
<210> 274
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 274
ctccctcctt accccatctc agg 23
<210> 275
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 275
cgagctccgt gtcctgggtc tgg 23
<210> 276
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 276
gtcactcacc ggcctcgctc tgg 23
<210> 277
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 277
atggtcagag atggggtggt ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 278
tggtgggtca tatgtgtctt ggg 23
<210> 279
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 279
tgaacgagga cctgcgctct tgg 23
<210> 280
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 280
attgctggcc tggttctcct tgg 23
<210> 281
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 281
accctcctcc tgctactctc ggg 23
<210> 282
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 282
tacctcatgg agtgggagcc tgg 23
<210> 283
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 283
gcaggagggg ccggagtatt ggg 23
<210> 284
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 284
gcggctgtgg tggtgccttc tgg 23
<210> 285
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 285
ggagcagttg agagcctacc tgg 23
<210> 286
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 286
agcacctcag ggtggcctca tgg 23
<210> 287
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 287
ctccacgagc tccgtgtcct ggg 23
<210> 288
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 288
cggtgagtga ccccggccgg ggg 23
<210> 289
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<400> 289
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cagggcccag cacctcaggg tgg 23
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gggagcctgg gggcgagcag tgg 23
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ctgagccgcc atgtccgccg cgg 23
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gacctggcag cgggatgggg agg 23
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ggatggagcc gcgggcgccg tgg 23
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gagtagcgcg agcacagcta 20

Claims (69)

1.产生经基因组修饰的生物活性肾细胞(BRC)的方法，所述方法包括遗传修饰BRC中的基因组免疫原性基因，其中所述基因编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中所述基因是B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1、或HLA-DQB1基因。
3.权利要求1的方法，其中遗传修饰所述基因包括突变所述基因。
4.权利要求3的方法，其中突变所述基因包括删除所述基因或其一部分。
5.权利要求3的方法，包括突变B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1和/或HLA-DQB1基因中的两种或更多种的任何组合。
6.权利要求1的方法，其中所述BRC是选定的肾细胞(SRC)。
7.权利要求6的方法，其中所述SRC在SRC群体中。
8.权利要求7的方法，其中所述SRC是小管细胞(tubule cell)。
9.权利要求8的方法，其中所述小管细胞是近端小管细胞。
10.权利要求6的方法，其中所述SRC是内分泌细胞、血管细胞或肾小球细胞(glomerular cell)。
11.权利要求7的方法，其中所述SRC群体包括低氧(hypoxia)耐受性和碘克沙醇(iodixanol)耐受性的细胞。
12.权利要求7的方法，其中所述SRC群体包含表达透明质酸合酶-2(hyaluronicsynthase-2)的细胞。
13.权利要求7的方法，其中所述SRC群体包括能够进行受体介导的白蛋白转运(receptor-mediated albumin transport)的细胞。
14.权利要求1的方法，其中遗传修饰所述基因包括：(i)在所述BRC中表达基因编辑蛋白；或者(ii)递送基因编辑蛋白穿过所述BRC的细胞膜。
15.权利要求14的方法，其中所述基因编辑蛋白是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)、megaTAL或RNA引导的内切核酸酶。
16.权利要求15的方法，其中所述RNA引导的内切核酸酶是Cas蛋白。
17.权利要求15的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。
18.权利要求16的方法，其中遗传修饰所述基因还包括：(i)在所述BRC中表达引导RNA(gRNA)；或(ii)将引导RNA(gRNA)递送穿过所述BRC的细胞膜。
19.权利要求18的方法，其中所述Cas9蛋白和所述gRNA是核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complex)的一部分。
20.权利要求1的方法，其还包括培养所述BRC以产生在所述基因中具有遗传修饰的后代。
21.权利要求20的方法，其中与所述基因中不包含所述遗传修饰的相应细胞相比，所述后代具有降低的免疫排斥潜力。
22.权利要求15的方法，其中从转染的mRNA表达所述基因编辑蛋白。
23.权利要求15的方法，其中所述基因编辑蛋白是重组蛋白，并且与gRNA离体复合。
24.权利要求15的方法，其中所述基因编辑蛋白是重组蛋白，并且与gRNA离体复合，并且通过转染、脂质转染(lipofection)、电穿孔或显微注射将蛋白质/gRNA复合物递送至所述细胞。
25.权利要求17的方法，其中将编码选择标志物和/或针对靶定基因的特异性突变的其他核酸元件与Cas9蛋白/gRNA复合物一起导入所述细胞中。
26.权利要求18的方法，其中从转染的mRNA表达所述Cas蛋白，并且从质粒DNA表达所述gRNA。
27.权利要求22的方法，其中通过包括经修饰的核酸碱基或聚腺苷酸化序列来稳定化转染的mRNA。
28.权利要求22的方法，其中所述转染的mRNA与至少一种细胞穿透肽偶联。
29.权利要求16的方法，其中从DNA载体表达所述Cas蛋白。
30.权利要求29的方法，其中在所述细胞中表达所述gRNA的至少部分时间期间诱导所述Cas蛋白的表达。
31.权利要求29的方法，其中所述DNA载体不整合在基因组中。
32.权利要求29的方法，其中所述DNA载体是附加型载体(episomal vector)或人工染色体。
33.权利要求29的方法，其中所述DNA载体是转座子。
34.权利要求18的方法，其中所述gRNA是来自DNA载体的转录物。
35.权利要求1的方法，其中遗传修饰所述基因减少所述细胞表面上的MHC I类的量。
36.权利要求1的方法，其中遗传修饰所述基因减少所述细胞表面上的MHC II类的量。
37.权利要求1的方法，其包括遗传修饰两种或更多种基因，其中所述基因中的至少一种编码MHC I类分子内的蛋白质，并且所述基因中的至少一种编码MHC II类分子内的蛋白质。
38.权利要求1的方法，其中所述基因中的至少一种是HLA基因。
39.权利要求1的方法，用于制备要用作药物的BRC。
40.权利要求1的方法，用于制备用于治疗患者中的慢性肾疾病的BRC。
41.权利要求20的方法，其还包括扩增所述后代。
42.权利要求41的方法，其中扩增所述后代包括使所述后代传代至少1、2、3、4或5次。
43.权利要求42的方法，其中在每次细胞传代时监测细胞生长动力学。
44.权利要求41的方法，其中通过锥虫蓝染料排除(Trypan Blue dye exclusion)和PrestoBlue的代谢监测所述后代的细胞计数和存活力。
45.权利要求7的方法，其中所述SRC表达CK18。
46.权利要求45的方法，其中所述SRC表达GGT1。
47.权利要求41的方法，其中所述PrestoBlue的代谢以及VEGF和KIM-1的产生用作存活且具有功能的后代的存在的标志物。
48.权利要求44的方法，其中通过基因表达概况分析(gene expression profiling)或酶促活性的测量进一步建立BRC或SRC功能性。
49.权利要求48的方法，其中所测量的酶促活性针对LAP和/或GGT。
50.权利要求1的方法，其中通过肾活组织检查获得所述BRC。
51.通过根据权利要求1的方法能获得的工程化BRC群体。
52.工程化BRC，其在编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质的基因中包含突变。
53.权利要求52的工程化BRC，其中已经删除所述基因的至少一部分，其中所述基因是B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DPA1、HLA-DPA2、HLA-DQA1或HLA-DQB1基因。
54.用于治疗患者中的肾疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用BRC群体，其中所述BRC群体包含工程化BRC，其中所述工程化BRC在编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质的基因中包含突变。
55.权利要求54的方法，其中所述肾疾病是慢性肾疾病。
56.权利要求54的方法，其中所述BRC群体是SRC群体。
57.权利要求56的方法，其中所述SRC群体衍生自所述患者。
58.权利要求56的方法，其中所述SRC群体源自一个或多个供体。
59.权利要求56的方法，其中在暴露于低氧培养条件后获得所述SRC群体。
60.权利要求56的方法，其中在扩增的肾细胞的密度梯度分离后获得所述SRC群体。
61.权利要求56的方法，其中所述SRC群体表现出大于约1.0419g/mL的浮力密度(buoyant density)。
62.权利要求56的方法，其中与起始肾细胞群体相比，所述SRC群体含有更大百分比的一种或多种细胞类型并且缺少或缺乏一种或多种其他细胞类型。
63.可注射配制剂，其包含：
a)温度敏感性细胞稳定化生物材料，和
b)BRC群体，其中所述BRC群体包括工程化BRC，其中所述工程化BRC在编码主要组织相容性复合物(MHC)I类分子或MHC II类分子内的蛋白质的基因中包含突变，
其中所述温度敏感性细胞稳定化生物材料是水凝胶，所述水凝胶
(i)在约8℃以下维持基本上固体状态，其中所述基本上固体状态是凝胶状态，
(ii)在约环境温度以上维持基本上液体状态，并且
(iii)在约8℃和约环境温度以上之间具有固体至液体过渡状态。
64.权利要求63的可注射配制剂，其中所述水凝胶包含重组起源的胞外基质蛋白，衍生自源自肾脏或另一种组织或器官的胞外基质，或包含明胶。
65.权利要求64的可注射配制剂，其中所述明胶衍生自I型，αI胶原。
66.权利要求65的可注射配制剂，其中所述明胶衍生自猪I型，αI胶原或重组人I型，αI胶原。
67.权利要求63的可注射配制剂，其中所述BRC群体是选定的肾细胞(SRC)群体，并且所述工程化BRC是工程化SRC。
68.治疗患者中的肾疾病的方法，所述方法包括将权利要求61的配制剂注射到所述患者中，其中通过18至30号针注射所述配制剂。
69.权利要求68的方法，其中所述针具有约27号、约26号、约25号、约24号、约23号、约22号、约21号或约20号的直径。
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