JP2022532926A

JP2022532926A - 幹細胞／前駆体の固形器官へのパッチ移植

Info

Publication number: JP2022532926A
Application number: JP2021569288A
Authority: JP
Inventors: エム．リード，ローラ; ザン，ウェンチェン; ワウティア，エリアン
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2022-07-20
Also published as: WO2018231726A1; CN111032090A; US20240082461A1; US20220347350A1; US11446412B2; CA3140912A1; US20190015556A1; MX2019014912A; US20180361027A1; WO2020242952A1; EP3976122A4; US11738117B2; SG11201911701SA; IL271146B2; KR20200028391A; IL271146A; BR112019026444A2; IL296689A; RU2020100063A3; US20220211911A1

Abstract

グラフト戦略によって細胞を固形器官（特に内臓）に移植する組成物および方法が提供される。これらの方法および組成物を使用して、病変器官を修復したり、実験的宿主の疾患状態のモデルを確立したりすることができる。本方法は、ドナー細胞を含有するパッチグラフトの組織または器官の表面への付着を伴う。ドナー細胞は、初期系譜段階間葉系細胞を支持する幹細胞／前駆体の混合物でありうる。本パッチグラフトは、宿主器官へのドナー細胞の遊走を促進し、ドナー細胞と宿主細胞との順調な組込みを支持して、疾患器官を修復する。【選択図】図１－１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月２４日に出願された米国出願第１６／４２２，０８６号の優先権および利益を主張するものである。さらに、本出願は、２０１７年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／５１８，３８０号および２０１８年４月３０日に出願された第６２／６６４，６９４号の優先権を主張する、２０１８年６月１１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３６９６０に関連する。これらの出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
この出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に出願された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、細胞の移植または組織生着の分野に関する。より具体的には、固形器官から固形器官または組織へ、特に内臓へのものである。本発明は、固形器官の疾患を治療するかまたは疾患のモデルシステムを確立するために、固形器官の組織内への細胞の迅速な移植、生着および組込みのための戦略を提供する組成物および方法に関する。この可能性の代表は、肝疾患または膵疾患の治療のための細胞療法である。

固形器官由来の細胞を伴う移植戦略、造血細胞、間葉系幹細胞の移植または皮膚に使用されるものとは異なる戦略について、アンメットニーズがある。通常は単一の細胞の懸濁液に由来する造血細胞および間葉系細胞の移植は、血管チャネルを介して常法的に行われ、「ホーミング」と呼ばれる過程である微小環境シグナル伝達があるために関連の標的部位における接着分子の活性化に依存する。皮膚に使用される方法では、標的部位に直接適用する細胞および／または組織を用いた移植方法が採用される。

皮膚以外の固形器官に由来する細胞の移植は、従来的に血管経路を介して送達されるか、または組織に直接注射されてきた。このアプローチは理に適ったものではないが、それはなぜなら、固形器官に由来する細胞上の接着分子が常に活性化され、生命を脅かす塞栓を生成する可能性のある急速な（秒速の）細胞凝集をもたらすためである。健康リスクを最小限にするために塞栓がうまく管理されていても、細胞生着の効率は低く、成体細胞では約２０％以下に過ぎず、幹細胞／前駆体ではさらに低い（＜５％）。ほとんどの移植された細胞は、死滅するかまたは異所部位に輸送され、そこで数ヶ月間生存し、不適切な部位に組織を生成し、その結果臨床的に悪影響を及ぼす可能性がある。標的部位に生着する少ない割合の細胞は、ゆっくりと組み込まれ、組織の重要な部分を再構築するために数週間から数ヶ月を要する。

細胞がヒアルロナンで被覆され、組織（例えば肝臓）のヒアルロナンのクリアランスにより血管経路を介して送達された場合に、肝臓に生着する点、および異所性の細胞送達を最小限にする点で改善がある。しかしながら、この改善は、移植戦略を用いた場合よりもやはり効率が低く、また重要なことに、異所部位への細胞の送達をやはり許容してしまう。

固形器官のグラフトは、動的な機械力に加えて、器官の構造のサイズ、形状、および複雑さに関する懸念があるために、設計が困難である。したがって、固形器官への細胞生着の方法を改善する必要性が残っている。本開示は、この必要性を満たし、関連する利点を提供する。

本明細書に記載されるのは、組織および固形器官への細胞の移植のための新規のパッチグラフト組成物および方法である。

一態様では、本開示は、細胞を、それを必要とする対象の固形器官に生着させる方法に関し、本方法は、
パッチグラフトを固形器官に接触させることであって、
パッチが、第一の粘弾性特性を有する生体材料に組み込まれる上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含み、生体材料が、前述の上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部を、固形器官の細胞の間に生着させるのを促進する、接触させることと、
前述の上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部が、固形器官の細胞の間に生着していることを明示することと、を含む。

いくつかの実施形態では、明示することは、対象から得られた生体試料において、固形器官からの分泌レベル、または固形器官の代謝効果を測定して、前述の上皮細胞の少なくとも一部が、固形器官の細胞の間に生着していることを明示することを含む。

別の態様では、本開示は、細胞を、それを必要とする対象の固形器官に生着させる方法に関し、本方法は、
パッチグラフトを固形器官に接触させることであって、
パッチが、第一の粘弾性特性を有するハイドロゲル層に組み込まれる上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含み、ハイドロゲルが、前述の上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部を、固形器官の外表面を通ってパッチから遊走させるのを促進する、接触させることと、
前述の上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部が、固形器官の外表面を通って遊走していることを明示することと、を含む。

いくつかの実施形態では、明示することは、遊走細胞のもたらす対象における生理学的効果を標示するパラメータまたはパラメータの変化を測定することを含む。

いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部が固形器官へ遊走するのを促進するバッキングをさらに含む。

いくつかの実施形態では、上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部は、固形器官の実質的な幅にわたって遊走し、固形器官全体にわたって分布する。

いくつかの実施形態では、固形器官は内胚葉器官である。

いくつかの実施形態では、固形器官は、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、ならびに前立腺および膣の泌尿生殖器洞領域を含む内胚葉器官である。

いくつかの実施形態では、内胚葉器官は肝臓を含み、生着はグリソン鞘のリモデリングを伴う。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）生着した上皮細胞および間葉系細胞と、（ｉｉ）宿主細胞との組み合わせをさらに生じさせる方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、機能性肝実質細胞を生じさせる。

いくつかの実施形態では、実質細胞は、肝細胞および胆管細胞を含む。

いくつかの実施形態では、内胚葉器官は膵臓を含み、生着は、移植部位近くの膵被膜および膵組織のリモデリングを伴う。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、機能性膵細胞を生じさせる。

いくつかの実施形態では、機能性膵細胞は、腺房細胞および島を含む。

いくつかの実施形態では、膵臓は、インスリン、ｃ－ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つを増加したレベルで分泌する。

いくつかの実施形態では、膵臓は、血糖値の減少という代謝効果を示す。

いくつかの実施形態では、膵臓は、グルコース耐性の増加という代謝効果を示す。

いくつかの実施形態では、膵臓は、消化酵素または重炭酸塩流体を増加したレベルで分泌する。

いくつかの実施形態では、消化酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、またはそれらの組合せを含む。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、膵臓によって分泌される消化酵素に由来する代謝産物のレベルの増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、消化の改善をもたらす。

いくつかの実施形態では、肝臓は、尿素、胆汁酸、リン脂質、リポタンパク質、ビリルビン、重炭酸塩に富む流体、または血液凝固因子を分泌する。

いくつかの実施形態では、対象から得られた生体試料は、コレステロール、血糖、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、アンモニア、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ、またはＬ－乳酸脱水素酵素のうちの少なくとも一つのレベルの減少を示す。

いくつかの実施形態では、パッチは、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含有するハイドロゲルを覆って配置されたバッキングを含む。

いくつかの実施形態では、バッキングは、ハイドロゲル層を宿主器官に繋ぐために使用される。

いくつかの実施形態では、上皮細胞、間葉系細胞のうち少なくとも一つ、またはその両方は、初期系譜段階細胞である。

いくつかの実施形態では、初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）は、血管芽細胞、内皮の前駆体、星状細胞、またはそれらの組合せを含む。

いくつかの実施形態では、初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）、ＥＬＳＭＣ、またはその両方は、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する。

いくつかの実施形態では、上皮細胞は成熟しており、間葉系細胞はＥＬＳＭＣである。

別の態様では、本開示は、対象の疾患、障害、または機能不全のある固形器官の機能性を導入、回復、増加、または改善することに関し、本方法は、上皮細胞および間葉系細胞の生着を促進する条件下で、疾患、障害、または機能不全のある固形器官を、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含むパッチグラフトに接触させることと、疾患、障害、または機能不全のある固形器官の機能性の導入、回復、増加、または改善を明示することとを含む。

いくつかの実施形態では、明示することは、対象から得られた生体試料において、分泌または代謝の産物または効果のレベルを測定することを含む。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部が、宿主器官の細胞の間に分布していることを明示することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、パッチグラフトの露出表面は、パッチグラフトの近傍の器官および組織へのパッチグラフトの癒着を阻害する被覆を含む。

いくつかの実施形態では、固形器官は内胚葉器官を含む。

いくつかの実施形態では、内胚葉器官は、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、または前立腺もしくは膣の泌尿生殖器洞由来の領域を含む。

いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、インスリン、ｃ－ペプチドグルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つの分泌のレベルの増加が測定される。

いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、血糖値の低下が測定される。

いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、グルコース耐性の増加が明示される。

いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、消化酵素または重炭酸塩流体のレベルの増加が明示される。

いくつかの実施形態では、消化酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼを含む。

いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、膵臓によって分泌される消化酵素に由来する産物のレベルの増加が測定される。

いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、消化の改善が明示される。

いくつかの実施形態では、固形器官は肝臓を含み、分泌物は、尿素、胆汁酸、リン脂質、リポタンパク質、ビリルビン、重炭酸塩に富む流体、血液凝固因子、またはそれらの組合せを含む。

いくつかの実施形態では、固形器官は肝臓を含み、代謝効果は、コレステロール、血糖、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、アンモニア、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ、またはＬ－乳酸脱水素酵素のうちの一つまたは複数のレベルの低下である。

いくつかの実施形態では、固形器官は肝臓を含み、対象は１型チロシン血症に罹患している。

いくつかの実施形態では、代謝効果は、チロシンまたはアルファ－フェトタンパク質のレベルの減少である。

別の態様では、本開示は、疾患、障害、または機能不全のある固形器官を有することに少なくとも部分的に起因する病態と診断された対象を治療する方法に関し、本方法は、
（ｉ）疾患、障害、または機能不全のある固形器官を、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含むパッチグラフトに接触させることと、
（ｉｉ）上皮細胞および間葉系細胞が、宿主固形器官の細胞に遊走し、該細胞間に分布することを可能にすることと、
（ｉｉｉ）疾患、障害、または機能不全のある固形器官の負の影響が、治療対象において軽減されていることを明示することと、を含む方法である。

いくつかの実施形態では、遊走および分布の段階は、疾患、障害、または機能不全の軽減をもたらす。

いくつかの実施形態では、固形器官は内胚葉器官である。

いくつかの実施形態では、内胚葉器官は、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、および前立腺または膣の泌尿生殖器洞領域を含む。

いくつかの実施形態では、内胚葉器官は膵臓であり、対象は糖尿病に罹患している。

一部の実施形態では、インスリン、ｃ－ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つのレベルの増加が測定される。

いくつかの実施形態では、血糖値の低下が明示される。

いくつかの実施形態では、グルコース耐性の増加が明示される。

いくつかの実施形態では、対象は哺乳類を含む。

いくつかの実施形態では、哺乳類はヒトである。

別の態様では、本開示は、上皮細胞と間葉系細胞との混合物と、一つまたは複数の生体材料層とを含むパッチグラフトに関し、この層は少なくとも、
ａ）固形器官を接触させるための第一の内層であって、第一の粘弾性特性を呈し、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を取り込み、上皮細胞および間葉系細胞の分泌型マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を産生する能力を支持し、前述の上皮細胞および間葉系細胞の生存率および未成熟性を促進する、第一の内層と、
ｂ）任意選択的に、固形器官以外の方向に遊走する細胞に障壁を付与するバッキングであって、第二の粘弾性特性を呈する、バッキングと、
ｃ）任意選択的に、パッチグラフトの近傍で、内壁および／または器官を含めた体腔の内表面へのパッチグラフトの癒着を最小限にする被覆または材料の第三の外層であって、前述の粘弾性特性が、流動学的形質を測定することによって決定されてパスカル（Ｐａ）で表現される、第三の外層とを含む。

いくつかの実施形態では、上皮細胞が初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）を含み、かつ間葉系細胞が初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）を含むか、または上皮細胞および間葉系細胞が、後期系譜段階であるが互いに同等の系譜段階である。

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、内皮の前駆体、星状細胞、またはそれらの組合せを含む。

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＥおよび／またはＥＬＳＭＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する。

いくつかの実施形態では、上皮細胞が後期系譜段階であるか、間葉系細胞が初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）であるか、または間葉系細胞が後期系譜段階でありかつ上皮細胞が初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）である。

いくつかの実施形態では、第二の粘弾性特性（Ｐａで表現される）は、第一の粘弾性特性よりも高い値を有する。

いくつかの実施形態では、一つまたは複数の生体材料層はハイドロゲルを含み、このハイドロゲルはさらに、最小硫酸化または非硫酸化グリコサミノグリカンを含む。

いくつかの実施形態では、非硫酸化グリコサミノグリカンはヒアルロナンを含む。

いくつかの実施形態では、ヒアルロナンはチオール修飾ヒアルロナンを含み、ジスルフィド架橋形成によるそのゲル化はポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）の存在下で惹起される。

いくつかの実施形態では、流動学的形質は、少なくとも部分的には、ゲル化前のチオール修飾ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡの開始濃度および剛性と、チオール修飾ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡの体積の正確な比によって達成されるゲル化後のハイドロゲルの最終的な剛性によって決定される。

いくつかの実施形態では、第一の内層は、約５０Ｐａから約１５０Ｐａまでの第一の粘弾性を呈す。

いくつかの実施形態では、任意選択的なバッキングは、約６００から約８００Ｐａまでの粘弾性を呈するヒアルロナンハイドロゲル層を含有する。

いくつかの実施形態では、任意選択的な第三の外層は、約２００から約３００Ｐａまでの粘弾性特性を有するヒアルロナンハイドロゲル層を含む。

いくつかの実施形態では、バッキングは絹を含む。

いくつかの実施形態では、絹バッキングは、Ｓｅｒｉ－Ｓｉｌｋ（商標）またはＣｏｎｔｏｕｒＳｅｒｉＳｉｌｋ（商標）を含めた、足場に編み込まれたカイコガ（商標）蚕絹の精製フィブロインを含む。

いくつかの実施形態では、上皮細胞は胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）を含み、間葉系細胞は初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む。

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞およびその直接の子孫、内皮の前駆体、星状細胞の前駆体、またはそれらの組合せを含む。

いくつかの実施形態では、血管芽細胞は、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＶＥＧＦｒを発現するが、ＣＤ３１を発現しない。

いくつかの実施形態では、内皮細胞の前駆体は、ＣＤ１３３、ＶＥＧＦｒ、ＣＤ３１、およびフォン・ヴィレブランド因子を発現する。

いくつかの実施形態では、星状細胞の前駆体は、ＣＤ１４６、ＩＣＡＭ－１、アルファ平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）を発現し、ビタミンＡに対して陰性である。

いくつかの実施形態では、上皮細胞と間葉系細胞との混合物は、成熟間葉系細胞の細胞懸濁液を枯渇させることによって、任意選択的に、３７℃で組織培養ディッシュまたは表面上で約１５分から約３０分以内に付着する細胞を除去するためのパニング手順を繰り返すことによって生成される。

いくつかの実施形態では、残りの細胞懸濁液の培養は、上皮細胞および間葉系細胞の自己組織化によって複数のオルガノイドが形成されるまで、低付着性ディッシュ上および無血清培地中で実施される。

いくつかの実施形態では、この無血清培地は、基本培地（銅不含、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１ｎＭセレン、０．１％ウシ血清アルブミン（精製済、脂肪酸不含、画分Ｖ）、４．５ｍＭニコチンアミド、０．１ｎＭ硫酸亜鉛七水和物、５μｇ／ｍｌトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍｌインスリン、および脂肪酸不含の高度に精製されたアルブミンと複合体を形成して存在する精製遊離脂肪酸の混合物）を含む。

いくつかの実施形態では、無血清培地は、１０μｇ／ｍＬの高密度リポタンパク質をさらに含む。

いくつかの実施形態では、複数のオルガノイドは、約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２２時間後、または約２４時間後に形成される。

いくつかの実施形態では、複数のオルガノイドは、
ａ）ＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ５、Ｃｄｘ２、およびＢｍｉ１からなる多能性遺伝子群から選択される少なくとも一つのマーカー、
ｂ）Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ４アルファ、ＨＮＦＢ１、およびＯＮＥＣＵＴ２からなる内胚葉転写因子群から選択される少なくとも一つのマーカー、
ｃ）ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＣＤ４４の一つまたは複数のアイソフォーム、ＣＸＣＲ４、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）、ＣＤ４９（インテグリンＡ６）、ＣＤ２９（インテグリンＢ１）、およびインテグリンＢ４からなる幹細胞／前駆体に関連する表面マーカー群から選択される少なくとも一つのマーカー；について陽性であるＢＴＳＣを含み、
ＢＴＳＣは、Ｐ４５０、アクアポリン、胆汁産生に関与する酵素、アミラーゼ、および消化酵素を含めた、成熟肝細胞または膵細胞のマーカーについて陰性である。

いくつかの実施形態では、一つまたは複数の生体材料層は、組換えＭＭＰを含む。

いくつかの実施形態では、一つまたは複数の生体材料層は、ＭＭＰを発現するように工学的に操作された細胞を含む。

本特許または本出願のファイルには、彩色された図面が含まれる。彩色図面を含む本特許または本特許出願の公報の写しは、要求および必要な料金の支払いがあった時点で、庁により提供されるものとなる。

図１Ａ～図１Ｄが示すのは、Ａ）オルガノイドの調製、パッチグラフトの組み立て、および手術の実施のために必要なプロセスおよび時間の見積もりの概略図である。Ｂ）幹細胞パッチグラフトに用いるドナー細胞を、Ｈ－２Ｂ（ＡＣＴＢ－ＩＲＥＳ－ｐＨ２Ｂ－ｅＧＦＰ）に連結された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有するトランスジェニックブタ由来の胆樹組織の細胞懸濁液から単離した。細胞を、無血清Ｋｕｂｏｔａ培地および低付着性培養ディッシュ中、オルガノイド（上皮細胞とその間葉系細胞パートナーとの浮遊凝集体）として調製した。胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）のオルガノイド、およびそれらの初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭ）パートナー（内皮および星状細胞となる血管芽細胞および前駆体）のオルガノイドを、位相差顕微鏡像と導入遺伝子ＧＦＰ６９の発現を示すものとの対比に示す。パラフィン包埋し、切片化し、ヘマトキシリン／エオシン染色した幹細胞オルガノイドの組織学像である。（ｄ）ＢＴＳＣおよびＥＬＳＭＣのオルガノイドの拡大画像である。Ｃ）複数の先行文献に示され総説に要約されるように、これらの細胞が肝臓および膵臓の両方の前駆体であることを標示する幹細胞、肝臓、および膵臓のマーカーの発現を明示する免疫蛍光像（ＩＦ）である。Ｄ）オルガノイドにおける様々な遺伝子の発現を評価し、細胞が幹細胞または初期前駆体であることを示す、ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイの代表例である。対照を仔ブタ肝由来の成熟肝細胞とした。同上。図２Ａ～図２Ｅが示すのは、Ａ）ブタの肝臓に貼付されたパッチグラフトの概略図であり、下側はグラフトの組成である。初期系譜段階細胞であって、上皮と間葉系細胞との両方が、細胞の運動性、遊走、および生着の主要な調節因子であるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生に必要である。グラフトの構造は、標的部位に繋がれた生体材料および細胞の層から成る。細胞を生着させるためには、標的部位に隣接して位置するグラフト生体材料のマトリックス成分は、ヒアルロナンハイドロゲルなどの軟らかい（約１００Ｐａ）ものでなければならない。培地成分は、ドナー細胞の分化に影響を与える血清、成長因子、およびサイトカインを欠いていなければならず、幹細胞／前駆体などの初期系譜段階細胞の生存および増殖拡大に合わせたものであるべきである。バッキングは、外科処置で使用されるのに十分な引張強さを有するが、ドナー細胞の分化へのその影響は中性としなければならない（Ｉ型コラーゲンを含むものは避けるべきである）。バッキングは、より剛直な１０×ハイドロゲル（約７００Ｐａ）により含浸または被覆されて、ドナー細胞の遊走を標的組織に向ける障壁としての役割を果たし、癒着を最小限にする。標的部位への付着後、外表面に被覆または塗布するのに十分な流体である２×ＨＡハイドロゲルを添加し使用し、癒着をさらに最小限にする。×は架橋ハイドロゲルの堅さを示した。Ｂ）宿主の肝臓に貼付されたグラフトである。Ｃ）グラフト組成を構成する層を示すグラフトの概略図である。Ｄ）特定のハイドロゲル層の流動学的特性（せん断および圧縮機械力）を実験的に評価するアッセイである。Ｅ）３層のヒアルロナンハイドロゲルの流動学的特性の解析である。同上。図３Ａ～図３Ｃが示すのは、Ａ）１週間後のパッチグラフトのマッソン・トリクローム染色像である。マッソン・トリクロームは、コラーゲン（青色）、細胞質（赤色）、および核（濃紫色）を識別する。これを、グリソン鞘（通常は肝小葉に隣接する）と、グラフトの外表面上での接着とを識別するために使用した。低倍率画像（１）にて、トリクローム染色が強く明らかにしたのは、移植後第一週に宿主組織がバッキングおよびグラフトから分離するのがしばしば観察されたことであり、それはＭＭＰの分泌に起因するものと考えられる。グラフトの隣にある肝小葉は、のちに組織内へのヒアルロナンの浸透によって引き起こされることが見出された脱色部を示す。ヘマトキシリン／エオシン染色した、（１）に続く切片のさらに高倍率の画像（２）では、広範囲のリモデリング領域の証拠があり、そこでは、グリソン鞘が変化し存在しないように見える。リモデリングゾーン内の二つの範囲のさらに高倍率の画像は、炎症応答（ａ）および肝小葉のリモデリング（ｂ）を際立たせている。Ｂ）３週間後のパッチグラフトのトリクローム染色像である。ヒアルロナンは再吸収され、ＭＭＰの発現の減弱に伴ってドナー細胞の成熟が可能になった。炎症は顕著に減少し、グラフトと肝実質との間の組織の帯（２）と、肝臓の組織学的構造の回復とが残った。Ｃ）ニチシノン不含で３０日間維持されたＮＲＧ／ＦＡＨマウスの肝臓に繋がれたブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのグラフトである。ヘマトキシリン／エオシン染色。同上。図４Ａ～図４Ｅが示すのは、Ａ）１週間後のブタ肝臓の表面のパッチグラフトの低倍率画像である。黒色の領域は、グラフトのヒアルロナンの領域を構成する。ドナーＧＦＰ±細胞（ピンク色の核を有する；白の矢印は多数のドナーＧＦＰ－ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのある領域を示す）は、ＧＦＰに対する抗体および二次的に赤色蛍光プローブＡｌｅｘａ５９４に連結された抗体により標識化することによって、視覚化された。宿主の核を、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により青色に染色した。宿主の組織（ａ）は、グラフトのヒアルロナン（ＨＡ：黒色の背景）内に広がる；バッキングの傍の組織は、所々にオルガノイドを含有するが、ほとんどのドナー細胞は、ピンク色の核を有するものとして容易に特定される細胞内に分散していた。リモデリングの領域を構成するこの範囲には、グリソン鞘の通常の構造がある証拠はない。Ｂ）ドナー細胞の生着および遊走は迅速であった。１週間以内では、識別されたすべてのドナー細胞は、グラフト部位の近くとまた肝葉の反対側との両方において、宿主肝臓内にあった（グラフト部位から推定される距離は約１．５ｃｍであり、ドナー細胞が１週間に遊走する有意な距離である）。肝葉のうちグラフト部位側から遠くの側、およそ１．５ｃｍの距離にある宿主の成熟肝細胞（リポフスチンの自己蛍光に由来する深緑色）の小葉の近くに、ドナー細胞（ピンク色の核）が示されている。Ｃ）成体の運命へのドナー細胞の成熟は、ＨＡの再吸収と並行して発生した。深緑色（リポフスチンの自己蛍光）の宿主肝細胞（ａ）の近くにドナーＧＦＰ＋細胞（ピンク色の核を有する単一細胞）を含有する領域が拡大されており、成熟ドナー（ｂ）肝細胞（ピンク色の核）およびドナーＧＦＰ＋幹細胞由来の制限された系譜とは容易に識別される。ＧＦＰ標識の細胞質染色のいくらかは、特に移植後第一週に観察されたが、第二週までに核染色が次第に増加した（図４Ｄ～図４Ｅを参照）。他のＩＨＣアッセイ（データ示さず）では、宿主およびドナー両方の肝細胞のプレートに囲まれた細胞の新緑色は、間葉系細胞（上皮および星状細胞）の混合物であることがＩＨＣアッセイにより立証された。これらの細胞に由来する明るい新緑色の自己蛍光は、リポフスチンの暗い深緑色と容易に区別可能であった。Ｄ）パッチ移植の１週間後のブタ肝臓の検査である。シリウスレッド染色、すなわちコラーゲンを染色するアゾ染料を使用し、パンサイトケラチン（ｐＣＫ）およびＳｏｘ９に対する免疫組織化学検査、ならびに免疫蛍光（ＩＦ）染色を、連続した３μｍ切片に実施した。パッチグラフト部位で、グラフト移植されたドナー細胞は肝小葉と合併していた。上部のパネル（元の倍率＝５×）では、パッチグラフトは、間葉系および上皮ｐＣＫ＋細胞（矢印）から構成される。中間のパネルでは、より高い倍率が提供されている（２０倍）。上皮細胞は、胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）の典型である免疫表現型を示し、胆汁サイトケラチン（ｐＣＫ）および内胚葉性幹細胞マーカーＳｏｘ９を発現する。これらの細胞中のＧＦＰ標識は明らかに核にあった。パッチグラフト内のＢＴＳＣは、細胆管を再構築する細胞列に配置され（矢印）、隣接する肝小葉の肝細胞プレートと直接的に連続している（矢じり）。小葉中の肝細胞は、ｐＣＫおよびＳｏｘ９が陰性である。下部のパネル（元の倍率＝２０×）では、ＧＦＰの免疫蛍光法により、個々のグラフト細胞およびその子孫を識別することが可能になっている。パッチグラフトに隣接した小葉中の肝細胞は、一部が核内で、一部が細胞内で、ＧＦＰ陽性であり、このことはこれらが宿主の肝実質に組み込まれたドナー細胞であったことを示している。パッチグラフトと肝小葉との間の界面では、ｐＣＫ＋／ＧＦＰ＋の小管が、小葉（矢じり）内のＧＦＰ＋／ｐＣＫ－細胞と直接的に連続しており、このことは肝細胞の運命に至る移植細胞の成熟を示唆している。Ｅ）パッチ移植の２週間後のブタ肝臓の検査である。ＩＦ染色により、ＧＦＰ＋細胞がグラフト部位から離れた小葉内に存在し、肝細胞核因子（ＨＮＦ）４αやアルブミンなどの成熟肝細胞マーカーを共発現することが明らかになった。ＧＦＰ標識はドナー細胞では主に核にあった。別個のチャネルまたは融合したチャネルが含まれていた。核を青色で表示した（ＤＡＰＩ）。元の倍率：４０×。同上。同上。図５Ａ～図５Ｐは、ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトを用いた、Ｉ型チロシン血症からのＮＲＧ／ＦＡＨマウスの救済を示す。ドナー細胞の肝臓内への進入の証拠を図３Ｃに示す。ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトを、ＮＲＧ／ＦＡＨマウスの肝臓に外科的に適用し、次いで定期的に水を与えた（ニチシノンを断薬）。図１１は、マウスの生存図を動物の体重と共に示す。パッチグラフトを付与した実験体は、生存し、３０日後に体重が増加していたが、対照は、２週間後に低下し始め、１７日目までに安楽死させねばならなかった。細胞を含むパッチグラフトを付与した動物の腎臓は正常であった（図５Ｎ）。図５Ａ～図５Ｂ）は、肝臓のＨ＆Ｅ染色切片の低倍率および高倍率の画像によって可視化した際の、ニチソン（ＮＴＢＣ）により処理された宿主における陽性対照ＮＲＧ／ＦＡＨマウス肝を示す。図５Ｃ～図５Ｄ）は、ＮＴＢＣ処理を断ったＮＲＧ／ＦＡＨマウス肝のＨ＆Ｅ染色切片の低倍率および高倍率の画像によって可視化しかつ１６日目に評価した際の、細胞を含まないパッチグラフトを有する陰性対照マウスを示す。図５Ｅ～図５Ｆ）は、ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣをグラフト移植したＮＲＧ／ＦＡＨマウス肝パッチの肝臓切片の低倍率および高倍率の画像を示す（図３Ｃも参照）。図５Ｇ～図５Ｈ）は、ＧＦＰについて染色した（ＮｏｖｏＲｅｄに結合されたＧＦＰに対する抗体を使用）グラフト移植肝の低倍率および高倍率の画像を示す。ＧＦＰ＋細胞は肝臓全体に存在し、ＧＦＰは主に核に局在していることに留意されたい（図５Ｈ）。図５Ｉは、ヒストンＨ２Ｂに連結したＧＦＰの局在を示す画像を示す。ＧＦＰ（ヒストンＨ２Ｂに連結）の発現が、一部の細胞の核および細胞質の両方に存在することに留意されたい。図５Ｐは、ヒストンＨ２Ｂに対する抗体により微弱な細胞質での標識を示す免疫蛍光画像を示す。図５Ｊ～図５Ｋ）は、一次抗体を含まずに調製した対照切片の低倍率および高倍率の画像を示す。図５Ｌ～図５Ｍ）は、ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣを移植したマウス肝（ＮＲＨ／ＦＡＨ）パッチに関する試験の対照を示す。図５Ｌは、ヤギ抗体の陰性対照を示す。図５Ｍは、ウサギ抗体の陰性対照を示す。図５Ｎは、（１）細胞を含まないグラフトである、および（２）ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣを有するグラフトである、肝臓上へのパッチグラフトを有するＮＲＨ／ＦＡＨマウスから得た腎臓の画像を示す。図５Ｏは、ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣをパッチ移植したマウス肝（ＮＲＨ／ＦＡＨ）をブタフマルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）について示し、ヒストンＨ２Ｂについては図５Ｐに示す通りである。。ヒストンであるＨ２Ｂは主に核に見られるが、一部の細胞でも細胞質に見られることに留意されたい。同上。図６Ａ～図６Ｈは、上皮幹細胞／前駆体およびそれらのパートナーＥＬＳＭＣの両方によって発現される分泌型および膜結合型のＭＭＰのアイソフォームを、肝臓の様々な成熟細胞におけるそれらと対比して示す図である。発現レベルの定量化では、膜結合型形態が幹細胞／前駆体／ＥＬＭＣおよび成熟上皮／間葉系パートナーの両方について類似することが示された。（Ｄ）での比較に注目されたい。これに対し、分泌型形態は、幹細胞／前駆体／ＥＬＭＣでは非常に高いレベルで発現し、成熟細胞型では低いかまたはごく僅かなレベルで発現していた。分析された成体細胞の細胞集団は、仔ブタの肝臓および胆樹組織の懸濁液から単離され、ＣＤ４５＋細胞（造血細胞）、ＣＤ１４６＋細胞（星状細胞）、ＣＤ３１＋細胞（内皮）、ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４５－細胞（分化決定された前駆体および二倍体肝細胞および胆管細胞）からなる。ＢＴＳＣは、方法の項に示されるプロトコールによって胆樹から単離された。図６Ａ）は、ＢＴＳＣにおけるＭＭＰ発現を示す。図６Ｂ）は、星状細胞および内皮におけるＭＭＰ発現を示す。図６Ｃ）は、２Ｎ（二倍体）肝細胞におけるＭＭＰ発現を示す。図６Ｄ）は、成体細胞型とＢＴＳＣとを対比した代表的なＭＭＰを示す。図６Ｅは、ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣグラフトを用いたリモデリングの領域における代表的なＭＭＰの発現を示す。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトに隣接した区画では、トリクロームにより染色され、リモデリングの領域（括弧）を示す。図６Ｆ）は、ＭＭＰ１（Ｎｏｖｏ－ｒｅｄ＋）についてのＩＨＣアッセイの代表的な画像を示す。メチルグリーンをバックグラウンド染色とした。図６Ｇ）は、ＭＭＰ２（Ｎｏｖｏ－ｒｅｄ＋）を染色した部分である。ヘマトキシリンをバックグラウンド染色とした。肝小葉内では、リモデリング過程は、小葉構造の完全な消失に移行したＭＭＰ２＋細胞の板または索（錆色）を含んでいた。ＨＡのクリアランスにより、小葉構造が再度出現した。同上。図７は、肝臓および膵臓における生着現象および組込み現象の実例の概略である。パッチグラフトを、パッチの隅での縫合を介して肝臓に繋いだ。膵臓による有害反応（例えば自己分解）を最小限にするために、パッチグラフトの膵臓への繋留は、パッチの隅で外科手術用糊により完全に行うか（マウス）、またはパッチの一端で十二指腸に縫合し、他端の隅で外科手術用糊を用いて膵臓を覆って行った（ブタ）。図８Ａ～図８Ｂは、トランスジェニックブタ肝臓対照と野生型ブタ肝臓対照との対比を示す。両方とも未染色の凍結切片であり、緑色蛍光について撮像されている。トランスジェニックブタ（８Ａ）から得た肝臓の凍結切片の高倍率画像であり、核局在化により点状であるＧＦＰ＋－Ｈ２Ｂ蛍光を有する。しかし、異なる細胞間の蛍光のレベルの変動に注目されたい。これに対し、野生型ブタ（８Ｂ）の肝臓から得た凍結切片は、リポフスチンおよび他の成分の自己蛍光に由来する緑色蛍光を示し、明らかに細胞質性である。図９Ａ～図９Ｂは、グラフト部位付近のリモデリングゾーンを示す。移植後の最初の２週間で、グラフトに隣接する領域は、グリソン鞘と肝実質の基部小葉状構造との広範囲リモデリングを受ける。図３も参照されたい。グラフト移植後１週間（９Ａ）および２週間（９Ｂ）の、リモデリングゾーンの特定領域のより高倍率の画像を用いて作製された画像。染色：ヘマトキシリン／エオシン。図１０は、ある特定のバッキングを有するパッチグラフトに伴う有害状態を示す。有害状態には、壊死、癒着、および胆汁うっ滞の部位が含まれ、胆汁うっ滞は、グラフトが複数の管に近すぎるところに配された結果、腫脹によりそれらの管が閉塞した際に起こることが見出された。図１１は、ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣをパッチ移植した後に薬剤ニチシノン（ＮＴＢＣ）を断ったＮＲＧ／ＦＡＨマウスの生存率および体重のチャートを示す。このチャートは、薬剤を断った後の動物で始まる。パッチグラフトを有する動物（ｎ３）は安定しており、実際に試験の３０日間にわたって体重が増加した。これに対して、対照（ｎ２）は一時的に安定していたが、約２週間の間に低下し始めた。それらを１６日目までに安楽死させる必要があった。図１２Ａ～図１２Ｅは、ある特定のバッキングを有するパッチグラフトを伴う有害状態を示す。有害反応には、壊死（１２Ａ）、変色（１２Ｂ）、および癒着（１２Ｃ）が含まれた。グラフトの生体材料および組成物に依存しないことが判明した難点は、皮膚感染（１２Ｄ、１２Ｅ）であった。皮膚感染は、免疫抑制に起因する一般的な問題を立証した。感染は、腹膜内に観察されないか、またはグラフトに付随しなかったが、皮膚のみに付随した。図１３Ａ～図１３Ｃは、ブタＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトを与えたＮＲＧ／ＦＡＨマウスの肝臓から得た凍結切片を示す（図１３Ａ）。マウスを移植の１か月後に評価した。切片をＤＡＰＩで染色したが、一次抗体では染色しなかった。全体的な淡緑色のバックグラウンドは、肝臓の様々な成分の自己蛍光に由来する。バー：５００μｍ。ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトに供され、１か月後に評価されたマウス。図１３Ｂは、ドナー細胞（赤色／紫色の核）優勢の組織において所々にある宿主細胞（青色の核および黄色／緑色の細胞質）を示す、凍結切片を示す。バー：５００μｍ。図１３Ｃは、ドナー（ブタ、ＧＦＰ＋）細胞優勢の組織において所々にあるマウス細胞を標示するための標識を用いた、１３Ｂのさらに高倍率の画像を示す。バー：１００μｍ。図１４は、宿主組織全体にわたるドナー細胞の急速な分布および組込みを示す。概略図は、ＧＦＰ＋ＢＴＳＣのパッチグラフトを仔ブタ肝に外科的に適用した１週間後にサンプリングされた、仔ブタの肝臓の領域を示す。仔ブタ肝の異なる領域を用いて、各領域のＧＦＰ発現のＤＮＡＰＣＲアッセイを調えた。アガロースゲルは、これらの各ゾーンにおけるＧＦＰ発現のＤＮＡＰＣＲアッセイの結果を示す。図１５Ａ～図１５Ｄは、ＤＳ－ｒｅｄマウス由来のＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのマウスオルガノイドを含むパッチグラフトを付与したマウスにおける、血清学的試験から得たデータを示す。対照は、細胞を含まないグラフトを受けた。パッチグラフトを、Ｉ型糖尿病のマウスモデルであるＮＲＧ／Ａｋｉｔａマウスの膵臓に付着させた。対照群（未処置または細胞を含まない生体材料で処置）のマウスの数は３であり、パッチグラフトで処置した糖尿病マウスの数は４および５であった。Ａ）は、未処置の糖尿病マウス（円）、グラフト生体材料のみで処置した糖尿病マウス（正方形）、およびパッチグラフト含有細胞（三角形）で処置した糖尿病マウスにおける血糖値を示す。Ｂ）は、未処置の糖尿病マウス（０日目、７日目、１４日目、および２１日目の１番目のカラムを参照）、グラフト生体材料のみで処置した糖尿病マウス（０日目、７日目、１４日目、および２１日目の２番目のカラムを参照）、ならびにパッチグラフト含有細胞で処置した糖尿病マウス（０日目、７日目、１４日目、および２１日目の３番目のカラムを参照）におけるＣ－ペプチドの血清レベルを示す。Ｃ）は、未処置の糖尿病マウス（２１日目および２８日目の１番目のカラムを参照）、グラフト生体材料のみで処置した糖尿病マウス（２１日目および２８日目の２番目のカラムを参照）、ならびにパッチグラフト含有細胞で処置した糖尿病マウス（２１日目および２８日目の３番目のカラムを参照）における血清インスリンレベルを示す。Ｄ）は、正常なマウス（三角形）、グラフト生体材料のみで処置した糖尿病マウス（円）、およびパッチグラフト含有細胞で処置した糖尿病マウス（正方形）における血糖値を示す。図１６Ａ～図１６Ｂは、インスリンに対する抗体で染色され（褐色）、ヘマトキシリンで対比染色されたマウス膵臓切片の代表的な光学顕微鏡像を示す（同じ倍率、バー＝１００μｍ）。（Ａ）ＤＳ－ｒｅｄマウスから調製されたＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを含有するパッチグラフトで処置した糖尿病マウス。（Ｂ）細胞を含まないグラフトで処置した糖尿病マウス。インスリンを発現していない細胞が多いことに注目されたい。インスリンタンパク質は、対照では明らかであるものの、血清学的アッセイにあるように機能的ではない（図１５）。パッチグラフトによる移植の１か月後に、免疫組織化学を組織上に調製した。図１７Ａ～図１７Ｃは、ＤＳ－ｒｅｄマウスから調製されたＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドのパッチグラフトを付与したＡｋｉｔａ／ＮＲＧマウスを示す。Ａ）は、ヘマトキシリンで対比染色された、免疫ペルオキシダーゼ（褐色）染色ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）を有する島またはパッチ領域を初期倍率４０×、バー＝１００μｍ）で示す、代表的な顕微鏡写真である。パッチグラフト中のオルガノイドで処置した糖尿病マウス。Ｂ）は、パッチ領域内およびその周りの抗体陽性オルガノイド（矢印）を示す。Ｃ）は、細胞を含まないパッチグラフトで処置したＡｋｉｔａ／ＮＲＧ糖尿病マウスの膵島を示す。ＮＧＮ３の発現は最小限であるかまたは全くないことに注目されたい。図１８Ａ～図１８Ｂは、ヘマトキシリンで対比染色された、免疫ペルオキシダーゼ（褐色）染色ニューロゲニン３を有する島またはパッチ領域を初期倍率４０×、バー＝１００μｍで示す、代表的な顕微鏡写真を示す。（Ａ）は、ＤＳ－ｒｅｄマウスから調製されたＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを含むパッチグラフトを付与した糖尿病マウスを示す。数個のＤＳ－ｒｅｄ陽性染色細胞（ドナー細胞を標示）を、膵実質（黒い矢印）に観察することができる。（Ｂ）一部の抗体陽性オルガノイドが、狭い部分（茶色の矢印）によって標示されるように見られる。注記：より広い（青色の）矢印は、グラフト内の絹繊維を指す。図１９Ａ～図１９Ｂは、手術の１週間後までのＧＦＰ＋トランスジェニックブタ由来のＢＴＳＣ／ＥＬＭＣのオルガノイドの野生型ブタ膵臓への生着についての証拠を示す。画像は、ブタ膵臓切片の低倍率画像を示し、ブタＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを含有するパッチグラフトを野生型仔ブタの膵臓に付着させてから１週間後の仔ブタの膵臓および周囲組織の切片における、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドール二塩酸塩）による染色、およびインスリン（Ａ）とアミラーゼ（Ｂ）とを対比した免疫蛍光染色である。インスリンの染色は、赤色蛍光プローブに結合された抗体を用いて行い、ＧＦＰの染色は、緑色蛍光プローブを有する抗体を用いて行った。細胞は、ブルンネル腺の位置である十二指腸の粘膜下層内にも遊走していることに注目されたい。Ａ）は、パッチグラフトが配された区域の近傍で、多数のＧＦＰ＋ドナー由来細胞が可視であることを示す。核はＤＡＰＩで染色されて青色を呈した。膵島ベータ細胞の特徴であるインスリン発現を、赤色蛍光プローブに結合された抗インスリン抗体により識別した。レシピエント膵臓の内因性（宿主）島ベータ細胞は、膵臓上部に赤色に見える。ドナー由来の島ベータ細胞は、ＤＡＰＩの青色とＧＦＰの緑色とのマージに由来する赤色／紫色の核を有し、インスリンの染色に由来する赤色／黄色の細胞質を有する。これらは、パッチグラフトの留置部位の近位の膵臓下部に観察される。この低倍率の画像は、膵臓への生着の程度、ならびに十二指腸の粘膜下領域への生着、ブルンネル腺の位置（肝臓および膵臓の器官形成に寄与する細胞のネットワークの開始点であると推定される）を明示する。バー：１ｍｍ。Ｂ）は、図１８Ａと同じ組織ブロックから得た連続切片におけるアミラーゼの免疫蛍光染色を示す。アミラーゼ（緑色）は、主に膵腺房組織で、ならびに粘膜層および十二指腸の内腔で検出される。インスリン（赤）はアミラーゼ（緑）と重複しない。この染色は、図１９Ａの染色と組み合わせると、ＧＦＰ＋ドナー由来細胞の大部分が膵腺房様の運命に分化決定されることを示唆している。バー：１ｍｍ。図２０Ａ～図２０Ｃは、３頭のＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣパッチグラフトのレシピエント（移植後７日目）から得た膵臓切片における、ＤＡＰＩ（青色）ならびにインスリンおよび他の膵島ホルモンおよびＧＦＰの免疫蛍光染色により染色された切片を示す。発明者らは、すべてのレシピエントにおいて、膵臓の実質で、およびパッチグラフト部位の近傍で、ＧＦＰ＋細胞を観察した。特に、ＧＦＰ＋細胞は、パッチグラフト部位からかなりの距離で現れ、レシピエント膵臓の実質に十分に組み込まれているようである。パッチグラフト材料（ＳＥＲＩ絹）は、ある程度の自家蛍光を異なるチャネルで呈し、移植後７日目にも依然として可視である。バー：２ｍｍ。図２０Ａは、図１９Ａのさらに高い倍率である。同上。同上。図２１Ａ～図２１Ｃは、図２０Ａ～図２０Ｃの切片に対応するさらに高い倍率の画像を示す。図２１Ａ～図２１Ｃは、ＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣパッチグラフトの移植の７日後に、膵臓における内因性宿主膵島ベータ細胞（インスリン＋／ＧＦＰ－：赤色の細胞質）ならびにドナー由来ベータ細胞（インスリン＋／ＧＦＰ＋：紫色の核および赤色／橙色の細胞質）が共存していることを示す証拠を示す。発明者らは、ドナー由来ならびに内因性宿主膵島－ベータ細胞を、すべての例で観察した。ＧＦＰ＋細胞の大部分は、膵腺房細胞の表現型と一致する表現型を呈した。管構造を形成するように組織化されたＧＦＰ＋細胞を、図２１Ａの下部に見ることができる。島細胞は、１週間でもＧＦＰ発現を核に示すが、腺房細胞における１週間でのＧＦＰ発現は細胞質にあった。パッチグラフトを肝臓に付着させてから第一週に図４Ａ～図４Ｅに観察されたように、ＧＦＰの細胞質での染色があり、これらの画像では、腺房細胞で細胞質にＧＦＰ染色がある（青色の核および緑色の細胞質）。肝臓では、これは移植の約２週間後までに、完全に核でのＧＦＰの染色になった。継続中の研究では、これが膵臓の腺房細胞でも起こるか否かが評価されている。バー：５０μｍ。同上。同上。図２２は、異なる幹細胞亜集団の図式的な線画を示す。

本明細書に記載されるのは、組織および固形器官への細胞の移植のための新規のパッチグラフトの組成物および方法である。

以下、本開示による実施形態をさらに十分に説明する。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であるように提供され、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するものとなる。本明細書の記載で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、本発明の限定を意図するものではない。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されたものなどの用語は、本出願および関連する前述の技術分野の文脈における意味と一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、本明細書に明示的にそれと定義されていない限り、理想化されたかまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解されよう。以下に明示的に定義されていないが、そのような用語は、それらの一般的な意味にしたがって解釈されるべきである。

本技術の実践は、別段の指示がない限り、当技術分野の技能の範囲内にある組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を採用するものとする。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌｅｄｓ．（２０１２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，４ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．ｅｄｓ．（２０１２）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎｅｔａｌ．（１９９１）ＰＣＲ１：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎｅｔａｌ．（１９９５）ＰＣＲ２：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ；ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅｅｄｓ．（２０１４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄｅｄｉｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１１）ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔｅｄ．（１９８４）ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＮｏ．４，６８３，１９５；ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＨａｍｅｓａｎｄＨｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．（１９８４）ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ；ＭｉｌｌｅｒａｎｄＣａｌｏｓｅｄｓ．（１９８７）ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓｅｄ．（２００３）ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ；ＭａｙｅｒａｎｄＷａｌｋｅｒｅｄｓ．（１９８７）ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；ａｎｄＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。

文脈が別途示さない限り、本明細書に記載の本発明の様々な特徴を任意の組合せで使用できることが特に意図されている。さらに、本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることも想定している。説明するために、本明細書が、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと述べている場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独または任意の組合せで省略および放棄できることが特に意図されている。

例えば、範囲を含めたｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量などのすべての数値表示は、必要に応じて１．０または０．１の増分で、あるいは＋／－１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％の変動で（＋）または（－）に変化する近似値である。必ずしも明示的に述べられていないが、すべての数値表示の前には用語「約」があることを理解されたい。また、必ずしも明示的に述べられていないが、本明細書に記載される試薬は例示に過ぎず、その同等物は当技術分野で公知であることを理解されたい。

本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形を同じく含むことが意図されている。

本明細書で使用される用語「約」は、量または濃度などの測定可能な値を指す場合、指定量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。

本明細書に開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を説明するために使用される際の用語または「許容可能」、「有効」もしくは「十分」は、開示された目的に前述の成分、範囲、剤形などが適していることが意図されている。

また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、一つまたは複数の関連する列挙された項目のうちの任意のおよびすべての可能性のある組合せ、ならびに二者択一（「または」）で解釈された際の組合せの欠如を指し、包含する。

本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法が列挙された要素を含むが他のものを除外しないことを意味することが意図されている。本明細書で使用される場合、移行句「～から本質的に成る」（および文法的変形）は、列挙された材料またはステップ、および列挙された実施形態の「基本的および新規な特性に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈されるものとなる。ＩｎｒｅＨｅｒｚ，５３７Ｆ．２ｄ５４９，５５１－５２，１９０Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ１９７６）（原文において強調）；ＭＰＥＰ § ２１１１．０３を参照されたい。ゆえに、本明細書で使用される場合の用語「～から本質的に成る」は、「含む」と同等であるものとして解釈されるべきではない。「から成る」は、他の成分の微量を超える要素、および本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。

本明細書で使用される場合、用語「有効な量」または「有効量」とは、病状または状態（例えば肝疾患または膵疾患）を治療するのに十分な量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、塗布または用量で投与することができる。このような送達は、個別の投与単位が使用される期間、組成物の生物学的利用性、投与経路などを含む多くの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の患者に対する組成物の特定の量は、使用される特定の薬剤の活性、患者の年齢、体重、健康状態、性別、および食事、投与の時間、排泄量、組成物の組合せ、治療している具体的な疾患（例えば肝疾患または膵疾患）の重症度、および投与の形態を含む種々の要因に依存することが理解される。

用語「同等物」または「生物学的同等物」は、特定の分子、生体材料、または細胞材料を指すときに互換的に使用され、所望の構造または機能を維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される過程および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定されてもよく、さらに、複数の遺伝子の発現レベルは、特定の試料の発現プロファイルを確立するために決定されてもよい。

本明細書で使用される場合、用語「機能的」は、具体的な特定の効果を達成することを意図して、任意の分子、生物学的材料、または細胞材料を修飾するために使用され得る。

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元（３Ｄ）構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を実施し得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えばプローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。

ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造に対する修飾を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断させることができる。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などにより、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別段に指定されるかまたは必要でない限り、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖体と、二本鎖体を構成することが公知であるかまたは予測される二つの相補的な一本鎖体のそれぞれとの両方を包含する。

用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、二つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指すために、互換的に最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてもよい。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されていてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸を含有する必要があり、タンパク質配列またはペプチド配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」とは、グリシンならびにＤおよびＬ両方の光学異性体、アミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸のいずれかを指す。

本明細書で使用される場合の用語「遺伝子」とは、ＲＮＡがコードしている（例えばｍＲＮＡ）かまたは非コードである（例えばｎｃＲＮＡ）であるかにかかわらず、ＲＮＡ分子に転写された任意の核酸配列を広く含むことを意味する。

本明細書で使用される場合の用語「単離された」とは、その他の材料を実質的に含まない分子または生物学的材料もしくは細胞材料を指す。

本明細書で使用される他の用語の定義は、使用される文脈において下記に提供されるものとなる。

パッチグラフトの組成物および戦略
別の態様では、本開示は、上皮細胞と間葉系細胞との混合物と、一つまたは複数の生体材料層とを含むパッチグラフトに関し、この層は少なくとも、

固形器官を接触させるための第一の内層であって、第一の粘弾性特性を呈し、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を取り込み、上皮細胞および間葉系細胞の分泌型マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を産生する能力を支持し、前述の上皮細胞および間葉系細胞の生存率および未成熟性を促進する、第一の内層と、

任意選択的に、固形器官以外の方向に遊走する細胞に障壁を付与するバッキングであって、第二の粘弾性特性を呈する、バッキングと、

任意選択的に、パッチグラフトの近傍で、内壁および／または器官を含めた体腔の内表面へのパッチグラフトの癒着を最小限にする被覆または材料の第三の外層であって、前述の粘弾性特性が、流動学的形質を測定することによって決定されてパスカル（Ｐａ）で表現される、第三の外層とを含む。

本明細書で使用される場合、用語「パッチグラフト」とは、ドナー細胞を宿主に移植することを可能にする適切な生体材料に包埋された細胞の組成を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、ドナー細胞を宿主に移植することを可能にする適切な生体材料に包埋された細胞の組成を指す。生体材料は、全体的に規定された条件（例えば、栄養因子、ビタミン、アミノ酸、炭水化物、ミネラル、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、および／または脂質からなる基本培地）下で調製し、固体化させて軟質ゲルとし（約１００Ｐａ）、バッキングにより覆うことができるものであるが、このバッキングは、宿主の組織または器官への外科的な付着を可能にする十分な引っ張り強度を有し、さらに、ドナー細胞の分化への影響が最小限であり宿主組織への悪影響が最小限である化学物質からなる。

本明細書で使用される際に、用語「バッキング」とは、（ｉ）それを中に移植されている対象と生体適合性があり、（ｉｉ）器官および組織（特に内部にあるもの）上に発生する圧縮力およびせん断力に耐える機械的復元力を呈し、それにより延いてはこの材料を手術用組織として機能できるものとし、（ｉｉｉ）材料と接触する細胞の分化状態に及ぼす影響が中性または最小限である、材料を指す。これに関して、適切な材料としては、以下に限定されないが、Ｓｅｒｉ－Ｓｉｌｋ（商標）（もしくはその誘導体）、ならびに／またはＰＧＡおよび／もしくはＰＬＬＡからなるパッチが挙げられる。合成材料の適切なパッチの非限定的な例としては、９１％ＰＧＡ－ｃｏ－９％ＰＬＬＡから構成される織布パッチ、９１％ＰＧＡ－ｃｏ－９％ＰＬＬＡから構成されるニットパッチ、または１００％ＰＧＡから構成される不織布パッチが挙げられる。他の可能性としては、羊膜のマトリックス抽出物または網または網のマトリックス抽出物が挙げられる。いくつかの実施形態では、バッキングは絹を含む。いくつかの実施形態では、バッキングは絹を含む。いくつかの実施形態では、絹バッキングは、Ｓｅｒｉ－Ｓｉｌｋ（商標）またはＣｏｎｔｏｕｒＳｅｒｉＳｉｌｋ（商標）を含めた、足場に編み込まれたカイコガ（商標）蚕絹の精製フィブロインを含む。

いくつかの実施形態では、バッキングは生体吸収性でもある。本明細書で使用される場合、「生体吸収性」とは、グラフトの宿主またはレシピエントの身体によって壊すことができ、機械的な除去を必要としない材料を指す。いくつかの実施形態では、生体吸収性バッキングは、約２から約１０週間、約２から約２０週間、約２から約５２週間、約４から約１６週間、約４から約１２週間、または約４から約８週間の期間で生体吸収性である。

本明細書で使用される場合、グラフトの生体材料には、バッキングとは独立して、ハイドロゲルを形成できるものが含まれる。用語「ゲル」とは、軟らかくて弱いものから硬くて丈夫なものまでの特性を有することができる固体のゼリー様材料を指す。ゲルは、定常状態にある際には流れを呈さない、実質的に希薄な架橋系として定義される。重量では、ゲルは概ね液体であるが、それらは液体内の三次元架橋ネットワークに起因して固体のように挙動する。ゲルに構造（硬度）を与え、その接着性に寄与するのは、流体内の架橋である。このように、ゲルは、固体が連続相であり液体が不連続相である、固体内の液体の分子の分散である。「ハイドロゲル」は、ポリマー鎖のネットワークから構築された高分子ポリマーゲルで構成されるゲルの非限定的な一例である。ハイドロゲルは、ネットワーク形成と共に、鎖の成長またはステップの成長のどちらかによって、親水性モノマーまたは親水性二量体（例えば、ヒアルロナンの場合）から合成される。空の欠陥と共に、網様の構造は、水素結合を介して大量の水を吸収するハイドロゲルの能力を高める。結果として、ハイドロゲルは、特徴的で堅固な、しかし弾性のある機械的特性を発達させる。そこでは、古い結合が材料内で破壊されると、新しい結合が自然に形成されることが可能となっている。静電気吸引力と共に、ハイドロゲルの構造は、非共有の水素結合を介した新しい結合の形成を促す。ハイドロゲルについて成功した材料の一つは、チオール修飾ヒアルロナンであり、これは、酸素および／またはポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）に曝露された際にハイドロゲルを形成するよう惹起させることができ、ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡの濃度（および／または酸素レベル）の正確な比率によって容易に「調整可能」とすることができる。ハイドロゲルの粘弾性特性は、流動学的形質を測定することによって決定し、パスカル（Ｐａ）で表すことができる。

いくつかの実施形態では、第二の粘弾性特性（Ｐａで表現される）は、第一の粘弾性特性よりも高い値を有する。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の生体材料層はハイドロゲルを含み、このハイドロゲルはさらに、最小硫酸化または非硫酸化グリコサミノグリカンを含む。いくつかの実施形態では、非硫酸化グリコサミノグリカンはヒアルロナンを含む。いくつかの実施形態では、ヒアルロナンはチオール修飾ヒアルロナンを含み、ジスルフィド架橋形成によるそのゲル化はポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）の存在下で惹起される。いくつかの実施形態では、流動学的形質は、少なくとも部分的には、ゲル化前のチオール修飾ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡの開始濃度および剛性と、チオール修飾ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡの体積の正確な比によって達成されるゲル化後のハイドロゲルの最終的な剛性によって決定される。

いくつかの実施形態では、パッチグラフトの流動学的進路は、架橋過程を達成するための温度によっても決定される。約５０Ｐａから約１５０Ｐａまでの内層ハイドロゲルを形成するための温度は、室温（ＲＴ）または３７℃とすることができる。約２００から約３００Ｐａのハイドロゲルを形成するための温度は、４℃または室温（ＲＴ）とすることができる。約６００から約８００Ｐａを形成するための温度は、室温（ＲＴ）または３７℃とすることができる。

本明細書で使用される場合、用語「ヒアルロナン」または「ヒアルロナン」とは、β１－４結合、β１－３結合によって連結されたグルコサミンおよびグルクロン酸［１－３］から構成される二糖単位のポリマー、およびその塩を指す。そのため、用語ヒアルロナンは、ヒアルロナンの天然形態および合成形態の両方を指す。天然起源のヒアルロナン（ＨＡ）、Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）との二糖単位を含む水溶性多糖類であって、この二糖単位は交互に連結されて線状ポリマーを形成する。高分子量ＨＡは、１００個から１０，０００個の二糖単位を含み得る。ＨＡは、多くの場合、ナトリウム塩であるヒアルロン酸ナトリウムとして天然に発生する。ＨＡ；ヒアルロン酸ナトリウムと、ＨＡまたはヒアルロン酸ナトリウムのどちらかの調製物は、多くの場合「ヒアルロナン」と呼ばれる。許容可能なヒアルロン酸塩の非限定的な例としては、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、およびヒアルロン酸カルシウムが挙げられる。

他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）をハイドロゲルで使用することもできる。これらには、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）とデルマタン硫酸（ＤＳ）、グルクロン酸とガラクトサミンとのポリマー、およびヘパラン硫酸（ＨＳ）とヘパリン（ＨＰ）、グルクロン酸とグルコサミンとのポリマーが含まれる。これらのＧＡＧの硫酸化の程度およびパターンは重要であり、なぜなら、硫酸化のパターンが、複数のタンパク質ファミリー（例えば凝固タンパク質、成長因子、サイトカイン、好中球酵素）との複合体の形成を規定するためである。例えば、ＰｏｗｅｌｌＡＫ，ＹａｔｅｓＥＡ，ＦｅｒｎｉｇＤＧ，ＴｕｒｎｂｕｌｌＪＥ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｈｅｐａｒｉｎ／ｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｐｐｒａｉｓａｌｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｆａｃｔｏｒｓａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００４年４月；１４（４）：１７Ｒ－３０Ｒを参照されたい。生着を最適化するパッチグラフトに適したものには、ヒアルロナン、非硫酸化ＧＡＧ、および以下に示されるような幹細胞のニッチに見られるコンドロイチン硫酸の形態など最小限の硫酸化を有するものが含まれる：ＫａｒｕｍｂａｉａｈＬ、ｅｔａｌ．ＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎＳｕｌｆａｔｅＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎＨｙｄｒｏｇｅｌｓＣｒｅａｔｅＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓＮｉｃｈｅｓｆｏｒＮｅｕｒａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ．２０１５Ｄｅｃ１６；２６（１２）：２３３６－４９ａｎｄＨａｙｅｓＡＪ，ｅｔａｌ．Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆａｔｅｓｕｌｆａｔｉｏｎｍｏｔｉｆｓａｓｐｕｔａｔｉｖｅｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ．ＪＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ．２００８Ｆｅｂ；５６（２）：１２５－３８（参照により本明細書に組み込まれる）。

ハイドロゲルの粘弾性特性は、約１０Ｐａから約５０Ｐａまで、約５０Ｐａから約１００Ｐａまで、約１００Ｐａから約１５０Ｐａまで、約１５０Ｐａから約２００Ｐａまで、約２００Ｐａから約２５０Ｐａまで、約２５０Ｐａから約３００Ｐａまで、約３００Ｐａから約３５０Ｐａまで、約３５０Ｐａから約４００Ｐａまで、約４００Ｐａから約４５０Ｐａまで、約４５０Ｐａから約５００Ｐａまで、約５００Ｐａから約５５０Ｐａまで、約５５０Ｐａから約６００Ｐａまで、約６００Ｐａから約６５０Ｐａまで、約６５０Ｐａから約７００Ｐａまで、約７００Ｐａから約７５０Ｐａまで、約７５０Ｐａから約８００Ｐａまで、約８００Ｐａから約８５０までとし得る。いくつかの実施形態では、ハイドロゲルの粘弾性特性は、約５０Ｐａ、約１００Ｐａ、約１５０Ｐａ、約２００Ｐａ、約２５０Ｐａ、約３００Ｐａ、約３５０Ｐａ、約４００Ｐａ、約４５０Ｐａ、約５００、Ｐａ、約５５０Ｐａ、約６００Ｐａ、約６５０Ｐａ、約７００Ｐａ、約７５０Ｐａ、または約８００Ｐａである。

いくつかの実施形態では、第一の内層は、約５０Ｐａから約１５０Ｐａまでの第一の粘弾性を呈す。いくつかの実施形態では、任意選択的なバッキングは、約６００から約８００Ｐａまでの粘弾性を呈するヒアルロナンハイドロゲル層を含有する。いくつかの実施形態では、任意選択的な第三の外層は、約２００から約３００Ｐａまでの粘弾性特性を有するヒアルロナンハイドロゲル層を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、バッキングの粘弾性特性は、第一の層の粘弾性特性よりも大きい。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、バッキングの粘度は、第一の層の粘度よりも約１．５から約１５倍大きい。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、バッキングの粘弾性特性は、第一の層の粘弾性特性よりも約２倍大きい。

出願人は、ヒアルロナンが上皮細胞、幹細胞および／または前駆細胞に影響を与えて、細胞の付着および細胞間相互作用に必要とされる重要な細胞接着分子を調節する因子を発現し、幹細胞および／または前駆細胞を、細胞懸濁液の調製、凍結保存の後の、または移植に伴う、これらの付着因子の内部移行から防ぐことができることを示している。そのような付着因子の非限定的な例としては、インテグリンが挙げられる。インテグリンは、細胞を基底膜の細胞外マトリックスタンパク質、他の細胞上のリガンド、および可溶性リガンドに付着させるように機能するヘテロ二量体膜貫通糖タンパク質の大きなファミリーである。インテグリンは、αおよびβとそれぞれ呼ばれる大小のサブユニットを含む。このサブユニットは、αβヘテロ二量体を形成し、ヒトでは少なくとも１８個のαおよび８個のβサブユニットが公知であり、２４個のヘテロ二量体を生成する。いくつかの実施形態では、幹細胞および／または前駆細胞は、より高いレベルのインテグリンサブユニット、例えばＩＴＧα１、ＩＴＧα２、ＩＴＧα２Ｂ、ＩＴＧα３、ＩＴＧα４、ＩＴＧα５、ＩＴＧα６、ＩＴＧα７、ＩＴＧα８、ＩＴＧα９、ＩＴＧα１０、ＩＴＧα１１、ＩＴＧαＤ、ＩＴＧαＥ、ＩＴＧαＬ、ＩＴＧαＭ、ＩＴＧαＶ、ＩＴＧαＸ、ＩＴＧβ１、ＩＴＧβ２、ＩＴＧβ３、ＩＴＧβ４、ＩＴＧβ５、ＩＴＧβ６、ＩＴＧβ７、およびＩＴＧβ８を発現する。好適な一実施形態では、幹細胞および／または前駆細胞は、より高いレベルのインテグリンサブユニットベータ１（ＩＴＧβ１）および／またはインテグリンサブユニットベータ４（ＩＴＧβ４）を発現する。ＴａｋａｄａＹ．ｅｔａｌ．（２００７）ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌ．８（５）：２１５。

いくつかの実施形態では、本開示の上皮細胞、幹細胞および／または前駆細胞は、少なくとも、未修飾の幹細胞および／または前駆細胞のインテグリンサブユニットの量よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％を超える量でインテグリンサブユニットを発現するという点で、天然起源の幹細胞および／または前駆細胞とは異なる。インテグリンサブユニットの増加は、幹細胞および／または前駆細胞を付着させ、細胞間相互作用を形成させる一助となるものと考えられる。

幹細胞ニッチの主要成分であるヒアルロナン（ＨＡ）は、損傷した肝臓における生存率、増殖、および生着を促進することから、細胞療法に使用される幹細胞の候補被覆物である。ＨＡの化学的特性および機械的特性は、幹細胞の必須要件に通じる。さらに、肝臓はＨＡクリアランスの主要部位であるため、ＨＡ被覆は、移植された細胞を肝臓へ選択的に標的化するための有益な戦略を意味する。

幹細胞および／または前駆細胞は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、ヒアルロナン（ＨＡ）により被覆することができる。例えば、幹細胞および／または前駆細胞を、ある量のＨＡと共にインキュベートして、約５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、またはそれ以上の時間にわたって穏やかに混合することができる。次いで、ＨＡ被覆された幹細胞および／または前駆細胞は、培地中で、例えばＫｕｂｏｔａ培地中でさらにインキュベートすることができる。

いくつかの実施形態では、ＨＡは、ＨＡの塩、例えば、アルカリ金属塩を含む。ＨＡは、多くの場合、ナトリウム塩であるヒアルロン酸ナトリウムとして天然に発生する。許容可能な追加的なヒアルロン酸塩の非限定的な例としては、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、およびヒアルロン酸カルシウムが挙げられる。幹細胞および／または前駆細胞の被覆に用いるＨＡを調製するために、ＨＡは、任意の医薬的に許容可能な担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、基本培地、Ｋｕｂｏｔａ培地、ホルモン規定培地などに再懸濁することができる。いくつかの実施形態では、医薬的に許容可能な担体は、一つまたは複数の成長因子類、一つまたは複数のグルコサミノグリカン糖類、またはそれらの組合せをさらに含む。

いくつかの実施形態では、医薬的に許容可能な担体中のヒアルロナンの量は、約０．０５％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖまでのヒアルロナンである。好適な一実施形態では、医薬的に許容可能な担体中のヒアルロナンの量は、約０．１％ｗ／ｖのヒアルロナンである。

本明細書で使用される場合、用語「被覆された」は、連続的または非連続的のどちらかであることを意味し、すなわち、ヒアルロナン（ＨＡ）被覆は、幹細胞および／または前駆細胞の表面を完全に覆うことができるか、または、被覆領域（例えば「島」）および被覆のない領域を形成するように一部のみを覆う。本発明の被覆はＨＡを含有するが、この被覆は他の物質も含むことができることも想定されている。いくつかの実施形態では、ヒアルロナンは、前述の幹細胞および／もしくは前駆細胞またはその凝集体の表面の少なくとも一部、例えば、前述の幹細胞および／もしくは前駆細胞またはその凝集体の表面の少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％を被覆する。いくつかの実施形態では、前述の凝集体の露出した表面の少なくとも約半分、または個々の幹細胞および／もしくは前駆細胞が、ヒアルロナンまたはその医薬的に許容可能な塩により被覆される。いくつかの実施形態では、幹細胞および／または前駆細胞は、外部に添加されたヒアルロナンの存在によって改変されている。

移植された細胞のサイズは、移植の成功のための重要な要因であることがある。細胞が大きすぎるか（例えば倍数体肝細胞）、またはそれらが大きな凝集体を形成する場合、血管経路を介したそれらの移植は、生命を脅かす可能性のある塞栓をもたらすことがある。細胞が小さすぎる場合、その生着効率は非常に低いことがあり、細胞は、異所部位に分布する傾向がより大きくなる。どちらの可能性も、細胞療法の検討に重要なことの一つである。肝疾患の細胞療法に使用される細胞は、動物モデルでは脾臓を介して肝臓内に、またはヒトでは門脈内または肝動脈内に注入されている。細胞径についてのサイズは、幹細胞（ＨｐＳＣ、ＢＴＳＣ）では約８～１０ｕｍ、肝芽細胞および分化決定された前駆体では約１２～１５ｕｍ、新生児肝で優勢な二倍体肝細胞では約１７～１８ｕｍ、成体肝で優勢な成熟肝細胞では約２５～３０ｕｍに及んでいる。

いくつかの実施形態では、幹細胞および／または前駆細胞の凝集体の大部分は、凝集体当たり約２個から約１０個の間の幹細胞および／または前駆細胞を含む。最も一般的には、５０～１００個の細胞個／凝集体を含む。一実施形態では、凝集体は、約９０～１００個の細胞を含む。一実施形態では、凝集体は、約８０～９０個の細胞を含む。一実施形態では、凝集体は、約７０～８０個の細胞を含む。一実施形態では、凝集体は、約６０～７０個の細胞を含む。一実施形態では、凝集体は、約５０～６０個の細胞を含む。

一実施形態では、凝集体は、約５個の幹細胞および／または前駆細胞、ならびに関連のＥＬＳＭＣを含む。いくつかの実施形態では、幹細胞および／または前駆体の凝集体は、平均直径が５０μｍ以下、４５μｍ以下、４０μｍ以下、３５μｍ以下、３０μｍ以下、２５μｍ以下、２０μｍ以下、１５μｍ以下、または１０μｍ以下である。好適な一実施形態では、幹細胞および／または前駆細胞の凝集体は、平均直径が３０μｍ以下である。

本明細書で使用される場合、用語「細胞」とは、グラフトの一つまたは複数の細胞を指す。本開示の細胞は真核である。いくつかの実施形態では、上皮細胞が初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）を含み、かつ間葉系細胞が初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）を含むか、または上皮細胞および間葉系細胞が、後期系譜段階であるが互いに同等の系譜段階である。いくつかの実施形態では、ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、内皮の前駆体、星状細胞、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ＥＬＳＥおよび／またはＥＬＳＭＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する。いくつかの実施形態では、上皮細胞が後期系譜段階であるか、間葉系細胞が初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）であるか、または間葉系細胞が後期系譜段階でありかつ上皮細胞が初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）である。いくつかの実施形態では、この細胞は、動物由来であり、幹細胞、成熟体細胞、前駆細胞、または幹細胞から成熟細胞までの系譜段階の中間体とすることができる。用語「細胞の集団」とは、同じまたは異なる起源を有する同じまたは異なる細胞型のうち一つまたは複数の細胞の群を指す。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、細胞株に、新たに単離された細胞に由来していてもよく、またはいくつかの実施形態では、この細胞の集団は、器官または組織の一部に由来していてもよい。

用語「幹細胞」とは、自己複製することができ（親細胞と同一の娘細胞を産生する）、多能性である、すなわち、一つ以上のタイプの成体細胞を生じさせることができる、細胞集団を指す。本明細書で使用される場合の用語「前駆細胞」または「前駆体」は、幹細胞の子およびそれらの後裔を包含するように広く定義される。前駆体は、多能性、二能性、または単能性であり得るが自己複製能力が（あるとしても）最小限である、細胞集団である。分化決定された前駆体は、単能性であって、ただ一つの成熟した細胞型に至る特定の系譜に分化することができるものである。幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚葉幹細胞、決定された幹細胞、周産期幹細胞、羊水由来幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、および血管芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。幹細胞と分化決定された前駆体との間の中間体としては、肝芽細胞および膵管前駆体などの細胞集団、ならびに多能性であり広範な増殖能を有し得るが自己複製能が（もしあれば）より限定的であり得る、他の形態のＴＡ細胞が挙げられる。

細胞は、決定された内胚葉性幹細胞またはそれらに由来する前駆体などの任意の決定された幹細胞とすることができる。さらに、これらの決定された幹細胞または前駆体は、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の系譜限定に由来し得る。ＥＳ細胞は、初期胚に由来する多能性幹細胞であり、三つ全ての胚葉の成体細胞を生じさせることができる。ｉＰＳ細胞は、転写因子または小分子により再プログラムされてＥＳ細胞に類似した表現型形質を有する出生後細胞であって、三つすべての胚葉の成体運命を生じさせることができる。但し、それらの胚葉はそのクロマチンにいくつかの分子的特徴を保持し、クロマチンは体細胞の誘導される胚葉を反映する。多能性または二能性の前駆体およびＴＡ細胞は、自己複製する能力が（あれば）限定的でありかつ二つ以上の成体の運命を生じさせ得る前駆体である。分化決定された前駆体は、単能性であり、自己複製能を有しておらず、ただ一つの成体細胞型を生じさせる。

上記に挙げられたこれらの型の幹細胞／前駆体に由来する細胞、ならびに成熟細胞は、分泌型および膜結合型の両方の複数のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の供給源、理想的には細胞性の供給源がある限り、うまく生着することができる。ＭＭＰは、未成熟細胞と成熟細胞との両方のすべての細胞型によって産生されるが、どのアイソフォームが産生されるか、およびどのレベルの具体的なＭＭＰの発現であるかが異なる。代表的な分泌型としては、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、およびＭＭＰ９が挙げられる。代表的な膜結合型としては、ＭＭＰ１４およびＭＭＰ１５が挙げられる。実験的には、分泌型ＭＭＰの最も高い産生は、初期系譜段階細胞、幹細胞、および初期前駆体によるものであることが見出されている。グラフトの生体材料は、これら複数形態のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を産生するための上皮細胞および間葉系細胞両方の能力を支持し、ＭＭＰは、基礎を成す組織を被膜へとリモデリングし、かつ複数形態の細胞外マトリックス成分の溶解により細胞の遊走を可能にするのに連動して、器官または組織を取り巻く被膜をリモデリングする。

生着のための「法則」とは、ＭＭＰ、特に分泌型アイソフォームの供給源がなければならないことであり、これが意味するところは、以下の場合に成功が生じるということである：
１）上皮細胞と間葉系細胞との両方が、幹細胞／前駆体であり（ゆえに両方ともＭＭＰの細胞性供給源である）、
２）上皮細胞が、幹細胞の前駆体であり、成熟間葉系細胞とパートナリングされており（ゆえに上皮幹細胞／前駆体は、ＭＭＰの細胞性供給源である）、
３）上皮細胞が、間葉系幹細胞／前駆体とパートナリングされた成熟細胞であり（ゆえに間葉系細胞はＭＭＰの細胞性供給源である）、
４）理論上は、グラフトにおいてＭＭＰの純化供給源（すなわち、クローン化された形態のＭＭＰ）を提供することが妥当である。

マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）
より一般的には、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス成分の破壊および調節に関与し、正常過程または発病過程での移植、浸潤、血管新生、血管形成、および遊走に関与する、亜鉛依存性プロテイナーゼの大きなファミリーである。マトリキシン、アダマリシン、アスタシン、およびセラリシンを含む少なくとも２４個のアイソフォームがある。それらの役割は、胎盤の移植などの正常のプロセス、ならびに癌の浸潤および転移などの発病のプロセスにおいて特徴を明らかにされてきた。本明細書に記載される研究は、移植された細胞の生着、遊走、および組込みに寄与する全く新しい役割のための証拠を提供する。幹細胞／前駆体は、上皮由来および間葉由来のどちらも、これらの役割において特に強力な複数のＭＭＰアイソフォームを発現する。細胞が成熟する結果、一つまたは複数の強力な幹細胞／前駆細胞関連ＭＭＰの発現が減弱し、それゆえに浸潤および遊走のプロセスが減少する。成体細胞はまた、ＭＭＰ、主に膜結合型（ＭＴ－ＭＭＰ）であるものも発現し、このＭＭＰは可塑性のプロセスには関与しているが、組織への細胞の大規模な生着および組込みには関与していない。この理解を実質的にまとめれば、グラフト生体材料、バッキング、およびその他の条件が、分泌型ＭＭＰなどの様々なＭＭＰの発現を最適化し、移植および遊走のプロセスの発生を可能にするものでなければならないということである。したがって、移植された細胞の分化を促す因子は、同時に、複合的なＭＭＰ応答を減弱させる。この理解が意味するのは、回避するべき因子としては、血清、分化を促す可溶性シグナル（例えば、ある種の成長因子、サイトカイン、およびホルモン）；分化を促す細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン、接着分子、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカン／プロテオグリカン）；およびグラフトの剛性に寄与する機械力が上げられるということである。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の生体材料層は、組換えＭＭＰを含む。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の生体材料層は、ＭＭＰを発現するように工学的に操作された細胞を含む。

用語「間葉系細胞」とは、間葉に由来する細胞を指し、そのようなものとしては、以下に限定されないが、多能性間質細胞である間葉系幹細胞、ならびに少なくとも二つの主要カテゴリーがある成熟および前駆体の間葉系細胞の様々な亜集団が挙げられる。

線維状コラーゲン（例えばＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型）、および関連のマトリックス成分、および典型的には直線状（ひも様）の細胞集団である細胞に関連する複合体を形成する結合シグナル（例えば成長因子／サイトカイン）を含む細胞外基質の形態を産生し、それらに囲まれている成熟した間葉系細胞。そのような細胞の非限定的な例としては、星状細胞、腱、間質、および筋繊維芽細胞が挙げられる。

ネットワークコラーゲン（例えばＩＶ型、ＶＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ型）および関連のマトリックス分子、およびより扁平または立方状または玉石状の形態を有する細胞に共に関連する結合シグナル（例えば成長因子、サイトカイン）を含む細胞外マトリックスの形態を生成し、それらに囲まれている成熟した間葉系細胞。そのような細胞の非限定的な例としては、内皮、および筋上皮が挙げられる。

これらの間葉系細胞型の前駆体としては、以下に限定されないが、多能性であり内皮（この後期段階は有窓内皮）または星状細胞（この後期段階は筋線維芽細胞（間質）の系譜に分化することができる血管芽細胞が挙げられる。前駆体としてはまた、多能性細胞であって線維芽細胞（間質）、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（軟骨細胞）、筋細胞（筋肉細胞）、および脂肪細胞（脂肪細胞）にも分化できる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）も挙げられる。

用語「上皮細胞増殖」は、典型的に立方状または玉石状の形態を有するコロニーを形成する上皮細胞のコロニーの直径、およびコロニーの細胞の直径の複合である成長の推定値と相関する。対照的に、間葉系細胞コロニーの成長の推定値は、コロニーの密度と相関するが、なぜなら、間葉系細胞はより遊走性および運動性が高く、コロニー密度はコロニー境界線内に留まる細胞の正味の合計を反映するためである。

用語「上皮細胞」とは、宿主の組織および／または全身のニーズに多様な機能を提供する特殊な細胞である、上皮に由来する細胞を指す。それらは、前駆体または未成熟細胞として遊走する能力により認知されている；すなわち、それらは成熟すると静止状態となってゆき、頂部、基底部、および側面を有する扁平または玉石様または柱状の分極細胞の層を形成し、これらの層は各種接合部（コネキシン、タイトジャンクション、接着）によって相互に結合される。その潜在的な増殖拡大性は、コロニーの直径によって（密度によってではなく）標示される。成熟した上皮細胞は、特殊な産物の分泌、または代謝（肝細胞、胆管細胞）、解毒（肝細胞）、酵素の産生（腺房細胞）、内分泌因子の産生（例えば、膵島または他の内分泌細胞）、電気活性度（神経細胞）、および吸収（腸細胞）への寄与など、多様な機能を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「支持」は、別の系譜からの細胞の伝播を支援することができるか、または生存、増殖拡大、遊走、分化、および成熟に関して隣接の細胞に及ぼされる影響で活性のある因子である「パラクラインシグナル」の産生を通じて隣接の細胞に支援をもたらすことのできる、細胞を説明するために使用される。例えば、支持的な間葉系細胞は、上皮細胞に対し、任意選択的にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）および／または一つもしくは複数の他のもの／または因子の分泌を介して影響を与える能力によって規定される。

用語「系譜段階パートナー」とは、本明細書では、所与の上皮の系譜段階に適した系譜段階であってその上皮細胞の生着を支持することができる、間葉系細胞を指す。肝臓または胆樹の幹細胞については、これらは血管芽細胞（ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１陰性）およびその直接の子孫、内皮の前駆体（ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１＋）、ならびに星状細胞の前駆体（ＣＤ１４６＋、ＩＣＡＭ－１＋、アルファ平滑筋アクチン＋（ＡＳＭＡ）、ビタミンＡ陰性）から構成される。上皮と間葉系細胞との間のパラクラインシグナル伝達も系譜段階に依存しており、このことは、特定のパラクラインシグナルとそれらのレベルとが初期、中期および後期段階の細胞において別個であることを意味する。それらは、骨髄または脂肪組織に由来するものである間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いることによって、部分的に模倣することができる。発明者らは、これらをまとめて初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）と呼ぶ。

いくつかの実施形態では、上皮細胞は胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）を含み、間葉系細胞は初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞およびその直接の子孫、内皮の前駆体、星状細胞の前駆体、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、血管芽細胞は、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＶＥＧＦｒを発現するが、ＣＤ３１を発現しない。いくつかの実施形態では、内皮細胞の前駆体は、ＣＤ１３３、ＶＥＧＦｒ、ＣＤ３１、およびフォン・ヴィレブランド因子を発現する。いくつかの実施形態では、星状細胞の前駆体は、ＣＤ１４６、ＩＣＡＭ－１、アルファ平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）を発現し、ビタミンＡに対して陰性である。

用語「胆樹幹細胞」（ＢＴＳＣ）とは、肝内および肝外の胆樹にわたって見られ、かつ壁外と壁内との両方の胆管周囲腺（ＰＢＧ）内に、ならびに胆嚢絨毛の陰窩内およびブルンネル腺中に位置する、幹細胞を指す。それらは、分化決定された肝前駆細胞および／または膵前駆細胞へと遷移する能力を有する。これまでのところ、幹細胞集団のうち、重複した形質を有しかつ極めて原始的なＢＴＳＣから肝臓または膵臓の幹細胞として定義可能な幹細胞集団までに及ぶ、少なくとも７つの亜集団が、胆樹の管壁内の壁内ネットワーク中に特定されている。

これらの幹細胞亜集団について何が知られているか、説明を以下に記載し、図２２に概説する。最も原始的なものは、壁外胆管周囲腺―胆管の表面に繋がれたもの－と、壁内胆管周囲腺―胆管壁内に見られるもの－との両方に見られる。胆管壁の中心にある線維筋層の近くの壁内胆管周囲腺（ＰＢＧ）は、陰窩であって（腸陰窩との類似性がある）、最も原始的な幹細胞集団が見られるニッチであると考えることもできる。胆樹ネットワーク内のＰＢＧの最大数は、肝膵総管内および大きな肝内胆管内で見られる。胆嚢にはＰＢＧは発生しないが、代わりに、胆嚢内の幹細胞ニッチが胆嚢絨毛の底部にあり、そこには、肝幹細胞の前駆体である中期から後期段階の幹細胞集団が含まれている。

いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、ＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ５、Ｃｄｘ２、およびＢｍｉ１などの多能性遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ４アルファ、およびＯＮＥＣＵＴ２などの内胚葉転写因子からなる群から選択される少なくとも一つのマーカー、ＥｐＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＮＣＡＭ、ＣＤ４４の一つまたは複数のアイソフォーム、ＣＸＣＲ４、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）、ＣＤ４９（インテグリンＡ６）、ＣＤ２９（インテグリンＢ１）、インテグリンＢ４などの幹細胞／前駆体の表面マーカーからなる群から選択される少なくとも一つのマーカーについて陽性であるＢＴＳＣを含む。ＢＴＳＣは、二つの幹細胞亜集団を生じさせる：すなわち、肝幹細胞（ＨｐＳＣ）および膵幹細胞（ＰＳＣ）であって、どちらも多能性遺伝子をより低いレベルで発現し、幹細胞／前駆体の表面マーカーを類似のレベルで発現し、また、ＨｐＳＣとＰＳＣとを画定する以下のマーカーを有する：ＨｐＳＣについてはＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ４アルファ、ＯＮＥＣＵＴ２、およびアルブミンの恒常的発現；ＰＳＣについてはＰｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＰＴＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＭＵＣ６、ＰＡＸ６、およびインスリンの恒常的発現。ＢＴＳＣ、ＨｐＳＣ、およびＰＳＣは、Ｐ４５０、アクアポリン、胆汁産生に関与する酵素、成熟腺房細胞によって産生される消化酵素の発現、およびアルブミンの調節性発現またはインスリンおよび膵島ホルモンの調節性発現など、成熟肝遺伝子または成熟膵遺伝子のマーカーについて陰性である。

一般的に、ＢＴＳＣの亜集団はすべて、肝臓と膵臓との両方の内胚葉性転写因子（例えばＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１）、多能性遺伝子（例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬＬ４、ＫＬＦ４／ＫＬＦ５、ＢＭＩ－１）；ＣＤ４４の一つまたは複数のヒアルロナン受容体アイソフォーム（標準および／またはバリアントアイソフォーム）；ＣＸＣＲ４；ならびにサイトケラチン８および１８を含む、バイオマーカーを発現する。胆樹内の幹細胞亜集団には、以下が含まれうる：
１：十二指腸の粘膜下層にのみ存在し、腸内の他のどこにも存在しない、ブルンネル腺内に見られる細胞（ＢＴＳＣの別の形態または別個の細胞集団である可能性あり－これを画定するための研究はまだ継続中）。これらは、上述のマーカー、ならびにＴｒａ－１６０、Ｔｒａ－１８１、およびサイトケラチン７も発現する。これらは、その形質によって腸幹細胞と区別可能である。
２：ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）およびＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを発現するがＬＧＲ５またはＥｐＣＡＭを発現しない、初期段階胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）；
３．より少ないＮＩＳを発現するが、ＬＧＲ５の発現を増加しＥｐＣＡＭの発現を増加させない、ＢＴＳＣの中間段階；
４．大型の肝内胆管および肝－膵総管でも多数見出される、後期段階のＢＴＳＣ（胆嚢に見られる唯一のＢＴＳＣ）。これらはＬＧＲ５とＥｐＣＡＭとの両方を発現する。これらは肝幹細胞および膵幹細胞の前駆体である。
５．肝幹細胞とは、ヘリング管に、大型の肝内細胆管のＰＢＧに、肝外胆樹のＰＢＧに、および肝－膵総管のＰＢＧに見られる幹細胞を指すが、最大数は肝内部位にあるものである。肝幹細胞は、自己複製および多能性となるための能力を保持する。これらの細胞についてのバイオマーカーとしては、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ－アルファ、ＩＴＧＢ１（ＣＤ２９）、ＯＮＥＣＵＴ２、ＳＡＬＬ４、ＬＧＲ５、ＣＤ４４、細胞質および細胞膜に見られる上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、恒常的に調節された僅かなレベルの（または発現のない）アルブミン、完全に欠如したαフェトタンパク質（ＡＦＰ）、Ｐ４５０Ａ７の欠如、およびセクレチン受容体（ＳＲ）の欠如が挙げられる。肝幹細胞およびその子孫である肝芽細胞は、サイトケラチン８、１８、および１９を発現する。
６．膵幹細胞は、胆樹全体にわたって（大型の肝内胆管のＰＢＧでも）少数見られるが、肝－膵総管のＰＢＧでは多数見られる。これらは、多能性遺伝子と、すべての幹細胞集団に認められる他の遺伝子の発現を有するが、ＳＯＸ１７を有さなくなったという点で異なる。系譜を膵島に限定するそれらの亜集団は、ＮＧＮ３を発現する。これらは細胞全体にわたって細胞膜でＥｐＣＡＭを発現し、インスリンを低く恒常的に調節して発現する（または発現しない）。それらの成熟は、インスリン発現の増加、および様々な因子によって調節されるその能力に相関する。

系譜ネットワーク内の中間体は「ＴＡ細胞」を指すが、この細胞は二能性（または多能性）とすることができ、顕著な増殖能を有するが真の自己複製は（もしあれば）ほとんど示さず、低いものから中程度までの（またはないことさえある）多能性遺伝子の発現を有し、肝臓（例えばアルブミン、アルファ－フェトタンパク質）または膵臓（例えばインスリン、ＭＵＣ６）の運命への分化決定を標示する形質を発現する。これらには、肝芽細胞（肝臓を生じさせるネットワーク）および膵管前駆体（膵臓を生じさせるネットワーク）が含まれる。

本明細書において使用される場合、用語「膵管前駆体」とは、膵臓内の膵管腺（ＰＤＧ）内に見られ、かつ腺房細胞および膵島を生じさせる、二能性細胞を指す。発明者らは、研究で、これらがＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１β、ＥｐＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ４４を発現し、亜集団がＮＧＮ３またはＭＵＣ６を発現することを見出した。

本明細書において使用される場合、用語「肝芽細胞」とは、肝細胞および胆管細胞の系譜を生じさせることができ、かつヘリング管内もしくはヘリング管に隣接してまたは大きな肝内胆管内のＰＢＧ中に見られる、二能性肝臓細胞を指す。これらは、肝幹細胞で観察されたものに比べて、増殖（すなわち増殖拡大）する並外れた能力を、低い自己複製能力（もしあれば）と併せて有する。これらの細胞は、肝臓幹細胞と重複するがそれとは異なるバイオマーカープロファイルによって特徴付けられる。これらは、ＳＯＸ９、低（または無視できる）レベルのＳＯＸ１７、高レベルのＬＧＲ５、ＨＮＦ４－アルファ、およびＥｐＣＡＭを発現するがそれらは主に細胞膜で見られ、またＰ４５０Ａ７、サイトケラチン７、セクレチン受容体を発現し、すべての肝芽細胞でアルブミンを一貫してかつ制御的に発現し、高レベルのアルフ－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、細胞接着分子（ＩＣＡＭ－１）を発現するがＮＣＡＭを発現せず、多能性遺伝子（例えばＳＡＬＬ４、ＫＬ４／ＫＬＦ５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ）を無視できるレベルで発現するかまたは全く発現せず、また、成熟肝臓実質マーカー（例えば、Ｐ４５０３ＡなどのＰ４５０）を発現しない。

本明細書で使用される場合、用語「分化決定された前駆体」とは、単一の細胞型、例えば分化決定された肝細胞前駆細胞を生じさせる、単能性前駆細胞を指す。いくつかの実施形態では、これらは多能性遺伝子を発現しない。分化決定された肝細胞前駆体は、アルブミン、ＡＦＰ、グリコーゲン、ＩＣＡＭ－１、グリコーゲン合成に関与する様々な酵素、およびギャップ接合遺伝子、コネキシン２８の発現によって認識される。これらは肝細胞を生じさせる。分化決定された胆管（または胆管細胞）前駆体は、胆管細胞を生じさせ、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン７および１９、アクアポリン、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）、および胆汁の産生に関連する膜ポンプの発現によって認識される。いくつかの実施形態では、分化決定された膵島前駆体は、インスリン、グルカゴン、および低レベルではあるがその他の膵島ホルモンを発現し、成熟すると、膵島ホルモンの発現レベルは増加するが、特定の細胞はある種のホルモンを選好的に発現する。

本明細書で使用される場合、用語「凝集体」とは、一緒に集められた複数の細胞を指す。凝集体は、サイズおよび形状の両方で異なってもよいし、実質的に均一なサイズおよび／または形状であってもよい。本明細書で使用される細胞凝集体は、例えば、球形、円柱形（好ましくは等しい高さおよび直径を有する）、またはとりわけ棒状など、様々な形状のものとすることができる。他の形状の凝集体を使用してもよいが、本開示の一実施形態では、細胞凝集体は球形または円柱形であることが一般的に好ましい。用語「非凝集」とは、個体、または単細胞、幹細胞および／もしくは前駆細胞を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、実質的に凝集した細胞、実質的に凝集していない細胞、またはそれらの混合物を含むことができる。

本明細書では、用語「オルガノイド」とは、本明細書に記載される単純なパニング法によって自己組織化される間葉系細胞を有するドナー上皮細胞の特定の細胞凝集体を指す。オルガノイドは、初期段階の上皮細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、決定された幹細胞、ＴＡ細胞、前駆体）と初期段階の間葉系細胞（血管芽細胞、内皮の前駆体、星状細胞の前駆体）とを混合することによって得ることができる。

成体上皮細胞と成熟間葉系細胞との混合物、および成熟上皮細胞と初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）とのキメラ混合物は、通常はオルガノイドを生成しないが、グラフト生体材料の懸濁液中の細胞の混合物として用いることができる。成熟上皮細胞（例えば肝細胞、胆管細胞、膵島、腺房細胞、腸細胞など）が成熟間葉系細胞（例えば内皮、星状細胞、間質細胞、筋線維芽細胞）とパートナリングされている場合、混合物は好結果のグラフトをもたらさないが、むしろ器官または組織の表面で持続するものをもたらす。これは、それらが細胞膜結合型ＭＭＰを発現するが分泌ＭＭＰを最小レベルで発現しているためであると考えられる。キメラ混合物が使用される場合（例えば、血管芽細胞を含む成熟肝細胞）には生着が発生するが、なぜなら、細胞の生着および遊走を可能にする分泌型ＭＭＰの供給源があるためである。

オルガノイドを確立するためのプロトコール。
本明細書に開示される一実施形態によれば、胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）および初期系譜段階間葉系細胞（「ＥＬＭＣ」）のオルガノイドは、グラフトに細胞を組み込む最も成功した方法であることが証明された。本明細書に開示されるのは、ＢＴＳＣおよびＥＬＭＣが、成熟した星状細胞／間質細胞を除去するためにパニングによってオルガノイドに自己選択できることであり、またこのことが、グラフトに対する系譜段階の適切な上皮－間葉パートナーの確立において、より効率的かつ効果的であることが証明された。別の態様では、本開示は、第一の型の細胞を第一の型の細胞の段階に適切な系譜パートナーである第二の型の細胞と共に培養すること、培養ディッシュに付着した成熟細胞をパニングにより除去すること、および自己組織化したオルガノイドを培養物の懸濁液から回収することによって、オルガノイドを形成する方法を提供する。第一の型の細胞は、上皮幹細胞であってもよいし、分化決定された上皮細胞であってもよい。第二の型の細胞は、間葉系譜の細胞、間葉系幹細胞、または初期系譜段階間葉系細胞であってもよい。

いくつかの実施形態では、間葉系細胞は、支持的な間葉系細胞である。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、懸濁液中の凝集細胞の系譜段階に合わせた無血清かつ全体的に規定された条件下、低付着性ディッシュ上で培養した後に形成される。

いくつかの実施形態では、上皮細胞と間葉系細胞との混合物は、成熟間葉系細胞の細胞懸濁液を枯渇させることによって、任意選択的に、３７℃で組織培養ディッシュまたは表面上に約１５分から約３０分以内に付着する細胞を除去するためのパニング手順を繰り返すことによって産生される。本明細書で使用される場合、用語「産生される」およびその等価物（例えば、産生、産生するなど）は、本開示のオルガノイドを存在に導く方法ステップを指す際に、「生成される」または「形成される」およびそれらの等価物と互換的に用いられる。そのようなパニング工程を複数回（例えば４～５回）行うことにより、初期系譜段階細胞の細胞懸濁液が濃縮される。次いで、細胞懸濁液を低付着性ディッシュに、かつ初期系譜段階細胞用に設計された無血清培地中に再び移し、３７℃のインキュベーター中に何時間かまたはさらに一晩置く。いくつかの実施形態では、残りの細胞懸濁液の培養は、上皮細胞および間葉系細胞の自己組織化によって複数のオルガノイドが形成されるまで、低付着性ディッシュ上および無血清培地中で実施される。いくつかの実施形態では、この無血清培地は、基本培地（銅不含、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１ｎＭセレン、０．１％ウシ血清アルブミン（精製済、脂肪酸不含、画分Ｖ）、４．５ｍＭニコチンアミド、０．１ｎＭ硫酸亜鉛七水和物、５μｇ／ｍｌトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍｌインスリン、および脂肪酸不含の高度に精製されたアルブミンと複合体を形成して存在する精製遊離脂肪酸の混合物）を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、１０μｇ／ｍＬの高密度リポタンパク質をさらに含む。追加的な無血清培地組成物は、本明細書の別の箇所に記載されている。

いくつかの実施形態では、複数のオルガノイドは、
ＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ５、Ｃｄｘ２、およびＢｍｉ１からなる多能性遺伝子群から選択される少なくとも一つのマーカー、
Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ４アルファ、ＨＮＦＢ１、およびＯＮＥＣＵＴ２からなる内胚葉転写因子群から選択される少なくとも一つのマーカー、
ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＣＤ４４の一つまたは複数のアイソフォーム、ＣＸＣＲ４、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）、ＣＤ４９（インテグリンＡ６）、ＣＤ２９（インテグリンＢ１）、およびインテグリンＢ４からなる幹細胞／前駆体に関連する表面マーカー群から選択される少なくとも一つのマーカー；について陽性であるＢＴＳＣを含み、
ＢＴＳＣは、Ｐ４５０、アクアポリン、胆汁産生に関与する酵素、アミラーゼ、および消化酵素を含めた、成熟肝細胞または膵細胞のマーカーについて陰性である。

いくつかの実施形態では、残りの細胞懸濁液の培養は、細胞懸濁液中に残留する細胞の自己組織化によって複数のオルガノイドが形成されるまで、低付着性ディッシュ上および無血清培地中で実施される。いくつかの実施形態では、複数のオルガノイドは、約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２２時間後、または約２４時間後に形成される。

細胞培養条件。
用語「培養」または「細胞培養」は、人工的なｉｎｖｉｔｒｏ環境での細胞の維持を意味する。「細胞培養システム」は、本明細書では、細胞の集団がｅｘｖｉｖｏ（生体外で）で成長し得る培養条件を指すのに用いられる。

用語「基本培地」とは、細胞培養に使用される緩衝液を指し、アミノ酸、糖、脂質、ビタミン、ミネラル、塩、微量元素、および細胞周囲の間質液の化学成分を模倣する組成物中の様々な栄養素から構成される。

「培養培地」は、本明細書では、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養溶液を指すのに用いられる。培養培地は、機能的特性によって、例えば、以下に限定されないが、細胞を特定の状態（例えば多能性状態、増殖状態、静止状態など）に維持する能力、細胞を成熟させる能力－いくつかの場合では、具体的には、特定の系譜の細胞へ前駆細胞の分化を促進する能力などによって、特徴付けられ得る。培養培地の非限定的な例は、典型的には約１０％から約２０％のレベルで血清を補充した任意の基本培地である、血清補充培地（ＳＳＭ）である。血清は、自家性（細胞と同じ種）であるか、またはさらに一般的には、商業的な目的のために日常的に屠殺される動物（例えばニワトリ、ウシ、ブタなど）から得られる血清とすることができる。

グラフト技術のために、細胞を幹細胞または初期前駆細胞として維持するための条件を使用する。すなわち、血清、または細胞を分化経路に駆り立てて成熟細胞の運命に向かわせる可能性のある任意の典型的な補充物を避ける。通例の基本培地に加えて、様々な栄養補助剤、脂質（アルブミンおよび高密度リポタンパク質などの担体分子と複合体を形成した遊離脂肪酸の混合物）。以下の二つのホルモン／成長因子のみを追加する：炭水化物代謝に必要なインスリン、およびポリメラーゼのためのＦｅ担体として必要なトランスフェリン。

本明細書で使用する場合の「Ｋｕｂｏｔａ培地」とは、銅不含、低カルシウム（＜０．５ｍＭ）、セレン、亜鉛、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、精製アルブミンに結合されかつ任意選択的に高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に結合された遊離脂肪酸の混合物を含有する、任意の基本培地を指す。いくつかの実施形態では、Ｋｕｂｏｔａ培地は、銅不含、低カルシウム（例えば０．３ｍＭ）、約１０^－９Ｍのセレン、約０．１％のウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン（高精製および脂肪酸不含）、約４．５ｍＭのニコチンアミド、約０．１ｎＭの硫酸亜鉛七水和物、約１０^－８Ｍのヒドロコルチゾン（肝臓前駆体には使用されるが膵臓前駆体には使用されない任意選択的な成分）、約５μｇ／ｍｌのトランスフェリン／Ｆｅ、約５μｇ／ｍｌのインスリン、約１０μｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質、および精製血清アルブミンに結合した後に加えられた精製遊離脂肪酸の混合物を含有する、任意の基本培地（例えばＲＰＭＩ１６４０またはＤＭＥＭ－Ｆ１２）を含む。遊離脂肪酸混合物は、それぞれ約１００ｍＭのパルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびステアリン酸からなる。この培地の調製の非限定的な例示的方法は、他で公開されており、例えば、ＫｕｂｏｔａＨ，ＲｅｉｄＬＭ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎ．（米国）２０００；９７：１２１３２－１２１３７であり、その開示は全体が参照により本明細書に組み込まれる。

分化のための限定培地の非限定的な例としては、内胚葉性幹細胞の成体運命への分化に使用されるホルモン規定培地（ＨＤＭ）が挙げられる。Ｋｕｂｏｔａ培地に補充物を追加して、正常な肝臓または胆樹の幹細胞の特定の成体運命への分化を促進する無血清のホルモン規定培地（ＨＤＭ）を生成することができる。内胚葉性幹細胞を成体運命に分化させる規定培地の非制限的な例としては、０．６ｍＭ以上の濃度に達するカルシウム、１ｎＭのトリヨードチロニン（Ｔ３）、１０^－１２Ｍの銅、１０ｎＭのヒドロコルチゾン、および２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を補充されたものが挙げられる。肝細胞（ＨＤＭ－Ｈ）と胆管細胞（ＨＤＭ－Ｃ）と膵島（ＨＤＭ－Ｐ）とを選択的に産生するために必要なこれらに加えた培地条件は以下のとおりである：
ＨＤＭ－Ｈ：７μｇ／Ｌのグルカゴン、２ｇ／Ｌのガラクトース、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ）、および２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞成長因子（ＨＧＦ）をさらに補充する；
ＨＤＭ－Ｃ：２０ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）および１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦをさらに補充する；および
ＨＤＭ－Ｐ：グルココルチコイド不含で調製し、１％のＢ２７、０．１ｍＭのアスコルビン酸、０．２５μＭのシクロパミン、１μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ－７を４日間さらに補充し、次いで５０ｎｇ／ｍｌのエクセンディン－４、および２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを補充したものに変更してさらに６日間誘導する。

本明細書に提供されるＨＤＭは、追加的な成長因子を含む補充とすることができるが、そのような成長因子としては、以下に限定されないが、Ｗｎｔリガンド、Ｒ－スポンジン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、様々なインターロイキン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ヘパリン結合成長因子、ＩＧＦ結合タンパク質、および／または胎盤成長因子が挙げられる。

本明細書に提供されるＨＤＭは、サイトカインを補充することができ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、培地は、細胞を所与の環境に提示または導入するために使用される「播種培地」であってもよい。他の実施形態では、培地は、細胞の分化を促進するために使用される「分化培地」であってもよい。そのような培地は、栄養素、ミネラル、アミノ酸、糖、脂質、および微量元素の混合物である「基本培地」から構成され、血清（血清補充培地またはＳＳＭ）かまたは精製ホルモン、成長因子、および栄養素の規定混合物のどちらかを補充されている、つまりホルモン規定培地（ＨＤＭ）であり、ｅｘｖｉｖｏでの細胞の生存、維持、または分化に使用される。本明細書で使用される場合、「ＨＤＭ－Ｈ」は、成熟肝細胞への内胚葉系幹細胞／前駆体の分化を促すように、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの基層と組み合わせて用いられるＨＤＭである。ＨＤＭ－Ｃは、細胞を成熟胆管細胞へと促すように、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの基層と併せて用いられるＨＤＭである。

本明細書で使用される場合、ＨＤＭはまた、精製細胞外マトリックス成分または細胞外マトリックスの濃縮抽出物の基層、特定の運命への分化を促進するマトリックス基層と併せて用いることができる。一例は、成熟肝細胞への内皮幹細胞／前駆体の分化を促すように、精製ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの基層と組み合わせた「ＨＤＭ－Ｈ」の使用である。ＨＤＭ－Ｃは、細胞を成熟胆管細胞にするように、Ｉ型コラーゲンおよびフィブロネクチンの基層と併せて用いることができるＨＤＭである。

ＨＤＭはまた、バイオマトリックス足場の単離に用いられるものなど、脱細胞工程の結果として生じる細胞外マトリックス抽出物と組み合わせて使用することもできる。ＨＤＭに関するさらなる詳細は、本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／００３４６３、米国特許第９，１０２，９１３号、米国特許第８，８０２，０８１号、およびＷＯ２０１２００３４５０に見出すことができる。

基本培地は、細胞培養に使用される緩衝液であり、アミノ酸、糖、脂質、ビタミン、ミネラル、塩、微量元素、および細胞周囲の間質液の化学成分を模倣する組成物中の様々な栄養素から構成される。さらに、細胞培養培地は、通常、少ない割合（典型的には２～１０％）の血清を補充された基本培地から構成される。グラフト技術のために、細胞を幹細胞または初期前駆細胞として維持するための条件を使用する。そのため、血清、または細胞を分化経路へと促すかまたは成熟細胞の運命に向かわせる可能性のある任意の典型的な補充物を避ける。通例の基本培地に加えて、様々な栄養補助剤、脂質（アルブミンおよび高密度リポタンパク質などの担体分子と複合体を形成した遊離脂肪酸の混合物）。以下の二つのホルモン／成長因子のみを追加する：炭水化物代謝に必要なインスリン、およびポリメラーゼのためのＦｅ担体として必要なトランスフェリン。内胚葉性の幹細胞／前駆体用に設計された無血清培地であるＫｕｂｏｔａ培地は、亜鉛、セレン、インスリン、トランスフェリン、脂質を補充されているがサイトカインまたは成長因子を含まない基本培地から構成される。他の成長因子およびサイトカイン、および特に血清は、ドナー細胞の分化を誘発し、それによって生着および遊走のプロセスに必要なＭＭＰの産生を最小限にすることから、避けるべきである。

いくつかの実施形態では、したがって、これらのパッチグラフトの条件は、少ない割合（典型的には２～１０％）の血清を補充された培地の常法的な使用に反している。血清は、生物学的過程（例えば増殖、分化）を促すために必要な必須シグナル伝達分子（ホルモン、成長因子、サイトカイン）を提供するために、長期間にわたり追加されてきたが、パッチグラフトのためのこれらの戦略では、生着を発生させることができるように血清を避けるべきである。いくつかの実施形態では、細胞の分化を避けるために、および／またはＭＭＰの分泌型形態の不活性化もしくは減弱を避けるために、血清が含まれていない。

いくつかの実施形態では、この無血清培地は、基本培地（銅不含、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１ｎＭセレン、０．１％ウシ血清アルブミン（精製済、脂肪酸不含、画分Ｖ）、４．５ｍＭニコチンアミド、０．１ｎＭ硫酸亜鉛七水和物、５μｇ／ｍｌトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍｌインスリン、および脂肪酸不含の高度に精製されたアルブミンと複合体を形成して存在する精製遊離脂肪酸の混合物）を含む。いくつかの実施形態では、無血清培地は、１０μｇ／ｍＬの高密度リポタンパク質をさらに含む。

パッチグラフト組成物の使用方法
一態様では、本開示は、細胞を、それを必要とする対象の固形器官に生着させる方法に関し、本方法は、
パッチグラフトを固形器官に接触させることであって、
パッチが、第一の粘弾性特性を有する生体材料に組み込まれる上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含み、生体材料が、前述の上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部を、固形器官の細胞の間に生着させるのを促進する、接触させることと、
前述の上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部が、固形器官の細胞の間に生着していることを明示することと、を含む。

本明細書で使用される場合、用語「生着」とは、細胞を組織または器官に組み込むことを指す。あるいは、グラフト、移植、生着（ｅｎｇｒａｆｔａｔｉｏｎ）、生着（ｉｎｇｒａｆｔａｔｉｏｎ）、または生着（ｉｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）という用語は、生着（ｅｎｇｒａｆｔａｔｉｏｎ）と互換的に使用され得る。

用語「遊走する」とは、組織または器官内の部位から別の部位への細胞移動を指す。

用語「組込み」とは、細胞が、宿主の器官または組織の細胞と結合し、器官または組織の一部となってゆくが、宿主細胞と融合しないことを指す。

いくつかの実施形態では、上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部は、固形器官の実質的な幅にわたって遊走し、固形器官全体にわたって分布する。いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部が固形器官へ遊走するのを促進するバッキングをさらに含む。

いくつかの実施形態では、上皮細胞は、初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）であり、間葉系細胞は、初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）である。

いくつかの実施形態では、ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、内皮の前駆体、星状細胞、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ＥＬＳＥおよび／またはＥＬＳＭＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する。いくつかの実施形態では、上皮細胞は成熟しており、間葉系細胞はＥＬＳＭＣである。いくつかの実施形態では、ドナー細胞の二つのカテゴリーのうちの少なくとも一つは、ＭＭＰの産生を可能にする幹細胞／前駆体であってもよい。好適な実施形態では、ＭＭＰは、ＭＭＰの分泌型アイソフォームである。

用語「組織」とは、本明細書では、生存もしくは死亡した生物体の組織、または生存もしくは死亡した生物体由来のまたはそれを模倣するように設計された任意の組織を指すのに用いられる。組織は、健康である、罹患している、外傷によって負傷している、損傷している、および／または遺伝的変異を有する場合がある。用語「自然組織」または「生体組織」およびその変形は、本明細書で使用される場合、その自然状態でまたは生物体から得たときから未改変の状態で存在する通りの生体組織を指す。「微小器官」とは、「天然の組織」を模倣する「生物工学的組織」の区分を指す。

生体組織は、任意の単一組織（例えば、相互接続され得る細胞の集合）、または生物体の身体の器官もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均質な細胞材料を含んでもよいし、または例えば、肺組織、骨格組織、および／もしくは筋組織を含むことができる胸部を含む身体の領域に見られるような複合構造であってもよい。例示的な組織としては、以下に限定されないが、肝臓、膵臓、胆樹、肺、腸、甲状腺、胸腺、膀胱、腎臓、前立腺、子宮、乳房、皮膚、脳、脊髄、血管（例えば大動脈、腸骨静脈）、心臓、筋肉、およびそれらの任意の組合せに由来するものが挙げられる。

いくつかの実施形態では、幹細胞／前駆細胞と間葉系細胞との混合物は、器官の幅の大部分にわたって、または全体ではないにしても、遊走し、器官全体にわたって均一に分布する。いくつかの実施形態では、固形器官は内胚葉器官である。いくつかの実施形態では、固形器官は、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、ならびに前立腺および膣の泌尿生殖器洞領域を含む内胚葉器官である。いくつかの実施形態では、内胚葉器官は肝臓を含み、生着はグリソン鞘のリモデリングを伴う。

本明細書で使用される場合、用語「リモデリング」とは、生着によって開始されて、部分的には分泌型ＭＭＰによって引き起こされる、組織の組織学的変化を指す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される生着プロセスは、結果としてグリソン鞘およびグラフト近くの宿主組織のリモデリングをもたらす。組織のリモデリングは一過性であり、細胞が宿主器官／組織内に完全に組み込まれた後に正常な組織学的構造に戻る。リモデリングは、細胞外マトリックス成分を識別するトリクローム染色などの複数の染色によって視覚化することができる。これらは、Ｈ＆Ｅによる染色によって補完される。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）生着した上皮細胞および間葉系細胞と、（ｉｉ）宿主細胞との組み合わせをさらに生じさせる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、機能性肝実質細胞を生じさせる。いくつかの実施形態では、実質細胞は、肝細胞および胆管細胞を含む。

いくつかの実施形態では、パッチは、幹細胞／前駆体細胞と間葉系細胞との混合物を含有するハイドロゲルを覆って配置されたバッキングを含む。いくつかの実施形態では、バッキングは、ハイドロゲル層を標的器官または標的部位に繋ぐために使用される。いくつかの実施形態では、内胚葉器官は膵臓を含み、生着は、移植部位近くの膵被膜および膵組織のリモデリングを伴う。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、機能性膵細胞を生じさせる。いくつかの実施形態では、機能性膵細胞は、腺房細胞および島を含む。

いくつかの実施形態では、幹細胞／前駆細胞と間葉系細胞との混合物の一部が、標的器官の細胞と組み合わされて存在する。いくつかの実施形態では、器官機能を回復する方法で使用されるパッチグラフトは、パッチグラフトの近傍の器官および組織へのパッチグラフトの癒着を阻害する被覆を含む。

いくつかの実施形態では、明示することは、対象から得られた生体試料において、分泌または代謝の産物または効果のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部が、宿主器官の細胞の間に分布していることを明示することをさらに含む。いくつかの実施形態では、パッチグラフトの露出表面は、パッチグラフトの近傍の器官および組織へのパッチグラフトの癒着を阻害する被覆を含む。いくつかの実施形態では、固形器官は内胚葉器官を含む。いくつかの実施形態では、内胚葉器官は、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、または前立腺もしくは膣の泌尿生殖器洞由来の領域を含む。いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、インスリン、ｃ－ペプチドグルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つの分泌のレベルの増加が測定される。

いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、血糖値の低下が測定される。いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、グルコース耐性の増加が明示される。いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、消化酵素または重炭酸塩流体のレベルの増加が明示される。いくつかの実施形態では、消化酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼを含む。いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、膵臓によって分泌される消化酵素に由来する産物のレベルの増加が測定される。いくつかの実施形態では、消化酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼを含む。いくつかの実施形態では、固形器官は膵臓を含み、消化の改善が明示される。

いくつかの実施形態では、固形器官は肝臓を含み、代謝効果は、コレステロール、血糖、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、アンモニア、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ、またはＬ－乳酸脱水素酵素のうちの一つまたは複数のレベルの低下である。いくつかの実施形態では、代謝効果は、チロシンまたはアルファ－フェトタンパク質のレベルの減少である。

別の態様では、本開示は、疾患、障害、または機能不全のある固形器官を有することに少なくとも部分的に起因する病態と診断された対象を治療する方法に関し、本方法は、
（ｉ）疾患、障害、または機能不全のある固形器官を、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含むパッチグラフトに接触させることと、
（ｉｉ）上皮細胞および間葉系細胞が、宿主固形器官の細胞に遊走し、該細胞間に分布することを可能にすることと、
（ｉｉｉ）疾患、障害、または機能不全のある固形器官の負の影響が、治療対象において軽減されていることを明示することと、を含む方法である。
いくつかの実施形態では、明示することは、対象から得られた生体試料において、分泌または代謝の産物または効果のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、遊走および分布の段階は、疾患、障害、または機能不全の軽減をもたらす。

いくつかの実施形態では、固形器官は内胚葉器官である。いくつかの実施形態では、内胚葉器官は、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、および前立腺または膣の泌尿生殖器洞領域を含む。いくつかの実施形態では、内胚葉器官は膵臓であり、対象は糖尿病に罹患している。一部の実施形態では、インスリン、ｃ－ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つのレベルの増加が測定される。いくつかのの実施形態では、血糖値の低下が明示される。いくつかの実施形態では、グルコース耐性の増加が明示される。

本明細書で使用される場合、用語「対象」および「患者」は、互換的に使用され、任意の動物を意味することが意図されている。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類であってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、マウス、ヒト、またはラットである。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類はヒトである。

本明細書で使用される場合、対象の疾患を「治療すること」または疾患の「治療」とは、（１）疾患の素因があるかまたは疾患の症状がまだ表れていない対象で、症状または疾患が発生するのを防ぐこと；（２）疾患を抑制すること、またはその発症を阻止すること；（３）疾患または疾患の症状を寛解または退行させることを指す。当技術分野で理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のために、有益なまたは所望の結果は、以下に限定されないが、検出可能または検出不能に関わらず、一つまたは複数の症状の緩和または寛解、状態（疾患を含む）の程度の減弱、状態（疾患を含む）の状況の安定化（すなわち悪化しない）、状態（疾患を含む）の遅延または減速、状態（疾患を含む）の進展、寛解、または緩和、状況および軽快（部分的か全体かに関わらず）のうちの一つまたは複数を含むことができる。

また本明細書に提供されるのは、肝臓の疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、この方法は、上皮細胞および間葉系細胞を含むハイドロゲルの第一の層と、ハイドロゲルの第二の層と、生体適合性かつ生分解性のバッキングを含む第三の層とを少なくとも含み、任意選択的にハイドロゲルの第四の層を含む、複数の層を含むパッチグラフトに、対象の肝臓を接触させることを含むか、それからなるか、または本質的になる。本方法のいくつかの実施形態では、肝疾患または障害は、肝線維症、肝硬変、ヘモクロマトーシス、肝臓がん、胆道閉鎖症、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝炎、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、肝蛭症、アルコール性肝疾患、アルファ１－アンチトリプシン欠損症、糖原病ＩＩ型、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｉｓｉｓ）、ジルベール症候群、原発性胆汁肝硬変、原発性硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、肝外傷またはウィルソン病である。

他の態様では、本明細書に提供されるのは、膵臓の疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、この方法は、上皮細胞および間葉系細胞を含むハイドロゲルの第一の層と、ハイドロゲルの第二の層と、生体適合性かつ生分解性のバッキングを含む第三の層とを少なくとも含み、任意選択的にハイドロゲルの第四の層を含む、複数の層を含むパッチグラフトに、対象の膵臓を接触させることを含むか、それからなるか、または本質的になる。本方法のいくつかの実施形態では、膵臓の疾患または障害は、糖尿病、膵外分泌不全、膵炎、膵臓がん、オッディ括約筋機能不全、嚢胞性線維症、膵管癒合不全、輪状膵、膵臓外傷、または膵管出血（ｈｅｍｏｓｕｃｃｕｓｐａｎｃｒｅａｔｉｃｕｓ）である。

他の態様では、本明細書に提供されるのは、胃腸の疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、この方法は、上皮細胞および間葉系細胞を含むハイドロゲルの第一の層と、ハイドロゲルの第二の層と、生体適合性かつ生分解性のバッキングを含む第三の層とを少なくとも含み、任意選択的にハイドロゲルの第四の層を含む、複数の層を含むパッチグラフトに、一つまたは複数の対象の腸を接触させることを含むか、それからなるか、または本質的になる。いくつかの実施形態では、胃腸の疾患または障害は、胃腸炎、胃腸がん、回腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、消化性潰瘍疾患、セリアック病、線維症、血管形成異常、ヒルシュスプルング病、偽膜性大腸炎、または胃腸外傷である。

開示の実施方法
本明細書に提供されるパッチグラフト組成物は、固形器官への細胞の直接的な移植を目的とする。本方法は安全であり、塞栓および異所的な細胞分布を回避し、組織内およびその全体にわたる細胞数の生着および分布を最適化する。

本開示の態様は、器官内に細胞を生着させるための組成物および方法に関する。固形器官から内臓へ細胞を移植する取組みでは、典型的には、血管経路を介した細胞の直接的な注入または送達のいずれかを用いた。Ｌａｎｚｏｎｉ，Ｇ．ｅｔａｌ．ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ３１，２０４７－２０６０（２０１３）。これらの移植方法では、結果として、移植される細胞が少数となり、生命を脅かす可能性のある塞栓のリスクがある。細胞をヒアルロナンに懸濁した後、ヒアルロナンをｉｎｓｉｔｕでゲル化させる惹起物質（ＰＥＧＤＡ）を共注入するという「注入グラフト」によって細胞が送達された場合は、移植が改善される。注入グラフト法は、少数とはいえ、典型的には注入部位あたり１０^６～１０^７細胞個を特定の部位に局在化させるための戦略を提供する。この戦略は、異所的な細胞分布を排除または最小限とし、部位における細胞の組込みを最適化する。しかしながら、成熟した機能性細胞が使用される場合、それらは免疫原性が高く、長期の免疫抑制を必要とする場合がある。

これらの障害および懸念に対処するために、難題は本明細書に記載される「パッチ移植」戦略によって克服される。いくつかの実施形態では、「バンドエイド様の」グラフトは、外科手術的に器官または組織の表面に繋がれる。そして、このグラフトの条件は、細胞が完全に部位内に生着し、器官／組織全体にわたって遊走し、次いで、関連する成体細胞型に成熟するようになることである。多数の細胞（例えば＞１０^８個の細胞）を移植するための潜在能力は、パッチのサイズ、グラフト内の細胞の数、および複数の形態のＭＭＰの供給源、理想的にはＭＭＰの細胞性供給源によって、完全に規定される。さらに、いくつかの実施形態では、全体的に規定された無血清条件下でオルガノイドを凍結保存できる容易さを考慮すると、オルガノイドの使用により、ドナー細胞を備蓄する能力が促進される。

本明細書に提供されるパッチグラフト組成物は、固形器官内への細胞の移植を目的とする。本方法は安全であり、塞栓および異所的な細胞分布を回避し、組織内およびその全体にわたる細胞数の生着および分布を最適化する。

本開示は、内臓を含めた固形器官または組織への細胞の移植の新規の方法を提供するものであり、肝臓に関する研究により本明細書で実証した。本方法は安全であり、塞栓および異所的な細胞分布を回避し、宿主組織全体にわたる多数の細胞の迅速な生着および分布を最適化する。１週間以内に、肝臓のかなりの部分にわたってドナー細胞のすべて（ブタでは≧１０^８、マウスでは≧１０^６）の生着があり、その後、グラフト部位からかなりの距離において細胞の遊走および組込みがあった。成熟細胞型への成熟は、生着した細胞の領域全体にわたって２週間の間に発生し、続いて、グリソン鞘および組織の組織学的構造および構成が、３週間の間に回復した。重要なことに、パッチグラフトは、病態から動物を救済することができたが、このことはＩ型チロシン血症のマウスモデルにおいてパッチグラフトを用いてここに実証されている。

本明細書に開示される固形器官上への細胞の移植の戦略は、当技術分野で公知のものと比較して根本的に異なっている。本明細書に開示される固形器官上の細胞の移植方法は、いくつかの実施形態では、標的部位／器官の表面上にグラフトを直接的に配置すること、およびドナー細胞が組織に生着して遊走することを可能にするように設計されたグラフト生体材料を使用することを含むことがある。このことは、皮膚の細胞療法の戦略には対応するが、内部組織、例えば腹腔の内部器官などについては、機械的な影響、すなわち互いに近くにある器官の摩耗または圧迫について対処するために、また特定の器官の周囲にある固有の流体微小環境を認識した上で、改良を必要とする。

本明細書に明示された本開示の発明者らは、肝臓と膵臓の両方の前駆体である決定された内胚葉幹細胞／前駆体である胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）のグラフトを用いた戦略のいくつかの例示的な実施形態である。いくつかの実施形態では、ＢＴＳＣは、肝臓の表面上にパッチグラフトによって移植された。いくつかの実施形態では、ＢＴＳＣは、膵臓の表面上にパッチグラフトによって移植された。

本開示のいくつかの実施形態で使用される動物モデルは、導入遺伝子を有するドナー細胞を移植されたマウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）およびブタ（Ｓｕｓｓｃｒｏｆａｄｏｍｅｓｔｉｃ）を含み、この導入遺伝子は、ヒストン（Ｈ２－Ｂ）遺伝子座に連結された蛍光プローブである緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に結合されており、それゆえに核バイオマーカーを提供する。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、マウスモデル、ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－ＩＬ２ＲガンマＣ－ｎｕｌｌ（ＮＲＧ）を使用したが、このモデルは免疫不全であり、またチロシン代謝経路における重要な酵素であるフマリルアセト－酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）を（Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９技術を使用して）遺伝学的に欠損させて作製されたものである。その喪失はＩ型チロシン血症をもたらす。マウスおよびブタは、トランスレーショナルリサーチにおける主要な動物種であり、前臨床試験において非ヒト霊長類の代替としてますます使用されている。

本開示の発明者らは、生着が上皮細胞とその系譜段階に適した間葉系細胞パートナーとの共移植を必要とすることを、以前に報告している。Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔａｌ．ＳｕｃｃｅｓｓｆｕｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＨｅｐａｔｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓＷｉｔｈＲｅｓｔｒｉｃｔｅｄＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｔｏＬｉｖｅｒＵｓｉｎｇＨｙａｌｕｒｏｎａｎＧｒａｆｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５７，７７５－７８４（２０１３）。肝臓および胆樹の幹細胞については、これらの間葉系細胞は、血管芽細胞（ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１陰性）およびその直接の子孫、内皮の前駆体（ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１＋、フォン・ヴィレブランド因子）、ならびに星状細胞の前駆体（ＣＤ１４６＋、ＩＣＡＭ－１＋、アルファ平滑筋アクチン＋（ＡＳＭＡ）、ビタミンＡ陰性）からなる。発明者らは、これらをまとめて初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣｓ）と呼ぶ。

いくつかの実施形態では、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを使用して、細胞懸濁液中の上皮細胞および間葉系細胞の系譜段階パートナーの比率を決定することによって、合致する上皮細胞および間葉系細胞のパートナーを分離し、次いで、免疫選択細胞を用いたグラフト内でそれらの比率を使用してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、パニング手順（方法を参照）を繰り返し、その後、残りの細胞懸濁液を低付着性ディッシュ上、無血清Ｋｕｂｏｔａ培地中で６～８時間培養することによって、成熟間葉系細胞の細胞懸濁液を枯渇させることがより効率的となり得る。約５０～１００個の細胞を含有する各凝集体により自己組織化されたオルガノイド。マーカー分析は、ＢＴＳＣとＥＬＳＭＣとのパートナリングを示した（図１Ａ～図１Ｄ）。図１Ａにまとめられているように、ＢＴＳＣ／ＥＬＭＣを直ちに使用したか、または規定の条件下で凍結保存し、グラフトの必要がある際に解凍した。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを、免疫蛍光法（ＩＦ）、ｑＲＴ－ＰＣＲ、およびＲＮＡ－ｓｅｑを用いて特性解析し、ＢＴＳＣ（図１Ａ～図１Ｄ）およびＥＬＳＭＣ（データ示さず）の古典的な形質を発現することが示された。オルガノイド中のＢＴＳＣは、低いレベルの多能性遺伝子（例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２）および内胚葉性幹細胞遺伝子（例えばＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＬＧＲ５、ＣＸＣＲ４、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＮＩＳ）を発現していたが、成熟した肝臓または膵臓の遺伝子を発現していなかった。代表的なｑＲＴ－ＰＣＲアッセイでは、移植前の細胞からこれらの所見が確認された（図１Ｄ）。免疫組織学的（ＩＨＣ）アッセイでは、より原始的な細胞（例えば、最も高いレベルの多能性遺伝子を発現するもの）がオルガノイドの内部に、後期成熟系譜段階のものが周辺部に分布することが示された（図１Ｃ）。図１Ａ～図１Ｄに示される結果は、ブタのオルガノイドの形成のための例示的な実施形態である。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、任意の哺乳類から同様に形成されてもよい。いくつかの実施形態では、オルガノイドがマウスから、または好ましくはヒト細胞から形成される。

パッチグラフトは、図２Ａ～図２Ｅに示されるように、縫合または外科用糊によって肝臓表面に固定される。流動学的に決定されて動的せん断係数（Ｇ＊）として表される規定レベルの剛性を達成するように、グラフト組成物は、正確な濃度のＨＡおよびＰＥＧＤＡにより調製されたチオール修飾ヒアルロナン（ＨＡ）ハイドロゲルの使用を含む（図２Ｃ）。ドナー細胞を軟質ＨＡ層（１００Ｐａ未満）に包埋し、肝臓表面に対して配置し、より剛直なＨＡ（約７００Ｐａ）を含浸させたバッキングで覆い、グラフトを絹パッチの隅で肝臓表面に縫合または接着した。ドナー細胞を配置した軟質ハイドロゲルは、生着に必要なマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生に必須の幹細胞性の形質を維持していた。ＨＡを含浸させた絹バッキングは、標的組織以外の方向への遊走に対する障壁としての役割を果たした。グラフトの外面を塗装または被覆することを可能にする約２００～３００Ｐａの剛性を有するＨＡハイドロゲルを手術時に使用し、ハイドロゲルは周囲の組織との癒着を最小限にする役割を果たした。

試行して断念したパッチ移植の唯一のバリアントは、被膜を鋭利に外科的に除去した後のものであった。出血が過剰であり、ドナー細胞へ及ぼされる血清の悪影響を考えると、肝不全に付随して血流停滞の変化した宿主において、または正常な宿主においてでさえ、将来的な使用を不要なものとした。このような器官被膜を変更する取組みを除けば、パッチグラフトは外科処置には手軽であることが証明された。

下記表１および表２に示されるように腹部外科手術で臨床的に既に使用されているものに焦点を当てて、複数のバッキングを供試した。ＳＥＲＩＳｉｌｋＳｕｒｇｉｃａｌＳｃａｆｆｏｌｄｓ（Ｓｏｆｒｅｇｅｎ社、メドフォード、マサチューセッツ州）のみが問題を引き起こさなかった。他のバッキングの問題（表１、図１２Ａ～図１２Ｅ）としては、脆弱性（例えばＳｅｐｒａｆｉｌｍ、Ｒｅｔｒｏｇｌｙｄｅ）、壊死または線維症の誘発および有意なレベルの癒着（例えばＳｕｒｇｉｓｉｓ、Ｖｅｔｒｉｘ）、ならびに再構成された絹タンパク質から作製した線維状スポンジバージョンまたはカルボキシメチルセルロース（「ベリーゼリー」）を補充したいずれかのバッキングと腹部との重度の癒着形成が含まれた（図１２Ａ～図１２Ｅ）。

二つの形態のＳＥＲＩＳｉｌｋ（Ｓｏｆｒｅｇｅｎ社、メドフォード、マサチューセッツ州）は、機械的支持と最小限の接着との最良の組合せを与え（表２）、標的部位への付着後に絹バッキングの外側（遊離側）表面へ２×ＨＡを適用することによって、さらに増強された効果をもたらした。生成物は、カイコガ絹の精製フィブロインであり、軟部組織支持体を提供するために足場に編み込まれている。Ｓｅｒｉ－Ｓｉｌｋのオリジナルバージョンの堅さゆえに、著しい曲率を有する部位への適用は困難であった。後の研究では、発明者らは、任意の程度の湾曲を有する標的部位へのグラフトの適用を可能にする、非常に高い柔軟性を有する「ＣｏｎｔｏｕｒＳｅｒｉＳｉｌｋ」（Ｓｏｆｒｅｇｅｎ社、メドフォード、マサチューセッツ州）を使用した。３週間のグラフトでは、ＳＥＲＩ－Ｓｉｌｋはコラーゲン帯に包まれていたが、これは軽度の線維症を示唆するものである。

術後１週間での生着の証拠を、トリクローム染色（図３Ａおよび図３Ｂ）およびヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（図３Ａ２および図３Ｂ２）で検証し、グリソン鞘のリモデリングに加えて、グラフト部位の下の実質組織の驚くほど広範なリモデリング領域が明示された（図９Ａ～９Ｂも参照）。この領域では、組織学的構造は完全に失われるか、または溶解の過程にあった（図６Ｅ～図６Ｈを参照）。グリソン鞘および小葉構造の再構成は、ドナー細胞の成熟およびＭＭＰ発現の減弱につながったＨＡの再吸収に続く３週間の間に発生した（図３Ｂ）。ＮＲＧ／ＦＡＨマウスの肝臓への生着は、術後３～４週間の間に、細胞が組織全体にわたって一様となって完了した（図３Ｃ、および図５Ａ～図５Ｐ）。

いくつかの実施形態において、トランスジェニックＧＦＰ＋ブタに由来するＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのドナーオルガノイドを、野生型ブタ（図３Ａおよび図３Ｂ、図４Ａ）にまたはＮＲＧ／ＦＡＨマウス（図３Ｃ、図５Ｌ～図５Ｐ）に移植し、ＧＦＰ発現によって識別した（図３Ｃ、および図８Ａ）。肝臓では、自家蛍光は、多くの異なる分子（例えば、芳香族アミノ酸、フラビン、ビタミンＡ、リポフスチン）に由来することがある。リポフスチンの自己蛍光は、ＧＦＰと重複する波長でピークとなる（図８Ａ）。したがって、肝臓におけるドナー細胞の識別を、ＧＦＰに対する抗体（ウサギ抗ＧＦＰ抗体、Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ６００－３０８）、ドナー細胞にピンク色の核を持たせる赤色蛍光プローブを有する二次抗体（ロバ抗ウサギ５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への結合（図４Ａおよび図１０）、二倍体細胞における赤色蛍光プローブとＤＡＰＩ由来の青色とのマージ）、およびより大きな核を有する細胞（おそらく倍数体細胞）中の青色の核に付随する点状のピンク色の実体により、実施してもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、その青色の核が認められたが、ＧＦＰ発現は認められなかった（図３Ｃ、図４Ａ、図１０）。多数のドナーＧＦＰ＋ＢＴＳＣＳ／ＥＬＳＭＣが、グラフトの近くの宿主肝臓で観察された（図４Ａ）。いくつかの実施形態において、ドナーＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣはまた、グラフト部位から約１．５ｃｍにある葉を横断した側の宿主小葉の近くで観察された（図４Ｂおよび図１０）。したがって、細胞は、いくつかの実施形態では、１週間で小葉の全幅を遊走することができる。

成熟肝細胞の肝小葉は、自己蛍光の緑色を伴う細胞質ゾルにリポフスチンを含有する。しかし、若い動物では、リポフスチンの量は最小限であり、核ＧＦＰ標識とは容易に区別された（図４Ｂ、図４Ｃｉｉ、および図８Ａ）。いくつかの実施形態では、成熟したドナーＧＦＰ＋細胞を、ピンク色の核を有する肝細胞の凝集体として認めた（図４Ｃ、図４Ｃｉ）。

いくつかの実施形態では、ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトを移植すると、オルガノイドによりグリソン鞘およびグラフト部位付近の組織のリモデリングが生じ、その後、１週間以内に宿主とドナー細胞とが合併した（図３Ａ～図３Ｃ～図５Ａ～図５Ｐ、図６Ｅ～図６Ｈ）。リモデリング領域のヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、ドナー細胞と宿主細胞との両方を含む炎症反応を示唆していた（図６Ｅ～図６Ｈ、図９Ａ～図９Ｂ）。ＧＦＰ標識は、グラフト中のＧＦＰ＋ＢＧＴＳＣ／ＥＬＳＭＣの核と、ＧＦＰ＋成体細胞の核にのみ見出された（図４Ａ～図４Ｅ）。しかし、成熟細胞において第一週にＧＦＰの細胞質染色もいくらか見られ、その後１週間または２週間以内に完全にまたは主に核に移行した（図４Ａ～４Ｅ、図５Ａ～５Ｐ）。

いくつかの実施形態では、肝臓の大きな領域内のドナー細胞の組込みは、２週間の間に完了し、それまでにＨＡはほぼ再吸収され、一部のドナー細胞は、胆管細胞（パンサイトケラチン、ｐＣＫ）および肝細胞（アルブミン）を含む成体肝細胞の運命に限定された系譜を有していた（図４Ａ～図４Ｅ）。いくつかの実施形態では、ドナーＧＦＰ＋細胞は、器官全体にわたって存在し、古典的な正弦波状のプレートまたは小管状の形態を獲得し（図４Ｅ）、中間体（例えばＳＯＸ９、アルファ－フェトタンパク質、ＨＮＦ４ａ）および成体（アルブミン、ｐＣＫ）の機能を発現していた（図４Ｅ）。

パッチ移植による生着効率により、結果として、本質的にすべてのドナー細胞が宿主肝に移植されて生存可能であり続けた。それらは肝臓表面でグラフトの残りには見出されず、他の器官（例えば肺）への異所的な細胞分布の証拠はなかった。肝臓を通るＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣグラフト中のドナー細胞の遊走速度により、１週間の終わるまでに器官（肝臓）の大部分の領域にドナー細胞がもたらされ、２～３週間までには組織（肝臓）全体にわたって細胞の均一な分散が生じた（図３Ａ～図３Ｃ～図５Ａ～図５Ｐ）。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞生着による病態から宿主を救済する方法を提供する。本開示の一実施形態では、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＮＲＧ／ＦＡＨ）マウスでの欠損によるＩ型チロシン血症のマウスモデルを救済する方法は、細胞生着によって救済された。ＮＲＧ／ＦＡＨは、ＬｉｓｈａｎＳｕ博士（ＵＮＣ、微生物・免疫学部）から入手した。ＮＲＧ／ＦＡＨマウスを、免疫不全マウスにてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して確立し、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）の欠損によるＩ型チロシン血症であるとともに異種グラフトに対する許容性を有するマウスモデルを得た。マウスを免疫不全宿主の常法的な条件下で維持し、その水に２－（２－ニトロ－４－トリフルオロメチルベンゾイル）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）、ニチシノンを供給する（２０ｕｇ／ｍｌ）ことによって、正常肝および正常腎を伴って持続させた。ニチシノンは、ＦＡＨ酵素欠損症の前にチロシン経路を遮断し、それゆえに肝臓および腎臓の両方に影響を及ぼす毒性中間体の蓄積を防止することが示されている。ＮＲＧ／ＦＡＨマウスを、ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドのパッチグラフトで処置し、次いでニチシノンを断薬した。対照には細胞を含まないパッチグラフトを与え、ニチシノンを断薬した。

ブタＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトを有するすべての動物は、ニチシノンの断薬後、４週間以上健康のままであり、体重（約１ｍｇ／２～３日おき）を増したのに対し、対照（細胞を含まないパッチグラフトを与えられ、ニチシノンを断薬した）は、移植後１７日目までに体重（約１ｍｇ／日）を失い始めた（図１１）。細胞を含まないパッチグラフトを有する対照マウスは、１７日目までに安楽死させねばならなかった。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣを含有するパッチグラフトを有するマウスは、３０日目に安楽死させた。組織学的アッセイでは、ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣを含むパッチグラフトを有するマウスが、ニチシノンにて維持されていた動物のものに類似した肝臓および腎臓を有することが示された（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｎ）。これに対し、細胞を含まない対照グラフトを有する動物の肝臓および腎臓には、大規模な損傷があった（図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｎ）。この肝臓および腎臓に対する影響は、ＦＡＨ欠損症の宿主におけるチロシン代謝由来の毒素に起因することが知られている。組織学的アッセイでは、パッチグラフトに残る細胞がないかまたは非常に限られた数であることが示された（図５Ｅ）。ブタドナー細胞由来のＧＦＰシグナルは、グラフト移植された肝臓全体にわたって観察され（図３Ｃ、図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ）、ＧＦＰの細胞質染色はいくらかあったもののほとんどが核内で発現されており、さらに、Ｈ２Ｂヒストンに対する独立したアッセイでは、核にあっても細胞質にあってもＧＦＰと共発現することが示された（図５Ｐ）。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣを含むパッチグラフトを有する動物における正常な肝臓および腎臓の組織学的試験に加えて、宿主肝内のドナー細胞がブタＦＡＨを発現することが示された（図５Ｏ）。

いくつかの実施形態では、本開示のパッチグラフトは、ドナー幹細胞におけるマトリクス－金属－プロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を維持する未成熟状態で幹細胞を維持する。グリソン鞘および隣接する肝小葉のリモデリングは、複数のＭＭＰの発現の上昇と相関し、これらのＭＭＰは、細胞外マトリックス成分を溶解し、細胞遊走に関連することが知られている酵素である。図６Ａ～図６Ｈは、幹細胞／前駆体と成体細胞との対比による発現していたＭＭＰのＲＮＡ配列試験およびＩＨＣアッセイのデータをまとめたものである。ＢＴＳＣは、分泌型形態（例えばＭＭＰ２、ＭＭＰ７）ならびに膜結合型形態（例えばＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５）の両方から構成される高レベルの複数のＭＭＰを発現していた。内皮および星状細胞の前駆体であるＥＬＳＭＣも、複数のＭＭＰの発現に寄与した。

ＲＮＡ－ｓｅｑデータから得た所見は、ＭＭＰ遺伝子によってコードされるタンパク質（酵素）に対するＩＨＣアッセイによって確認された（図６Ｅ～６Ｈ）。ＩＨＣアッセイでは、特にリモデリング領域において、分泌型形態のＭＭＰ、例えばＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、およびＭＭＰ９などの存在が確認された。ＭＭＰ１のタンパク質発現は、ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドに見出され、グラフトのリモデリング領域にも見出された。しかし、ＲＮＡ－ｓｅｑの知見の既存のデータバンクには、解析に使用されるブタＭＭＰ１のアノテーションされた種がないことから、ＭＭＰ１は含まれない。したがって、リモデリングゾーンにおけるその存在の認識は、ＩＨＣアッセイに基づく。

ドナー細胞の分化を引き起こす要因によって、分泌型ＭＭＰの発現の減弱が生じ、それに伴い生着および遊走の可能性は失われた（データ示さず）。これらには、血清、ドナー細胞の分化に影響を与えることが知られている様々な可溶性調節シグナル（例えば成長因子、サイトカイン、ホルモン）、ハイドロゲル中またはバッキング中の細胞外マトリックス成分（特にＩ型コラーゲン）、およびＨＡハイドロゲルの堅さ（例えばパスカルレベルで約２００～３００超）が含まれる。ＥＬＳＭＣの分化が間質へ優先的に進行した場合（例えば血清の存在下）には、グラフトは線維化し、内皮へ向かう場合（血管新生を促進する因子の存在下）には、グラフトは生細胞を含有したが、器官に向かう場合は表在したままであった（データ示さず）。

本開示は、内臓を含めた固形器官または組織への細胞の移植のための新規の方法を提供し、肝臓に関する研究によりここに実証した。本方法は安全であり、塞栓および異所的な細胞分布を回避し、宿主組織全体にわたる多数の細胞の迅速な生着および分布を最適化する。１週間以内に、肝臓のかなりの部分にわたってドナー細胞のすべて（ブタでは≧１０^８、マウスでは≧１０^６）の生着があり、その後、グラフト部位からかなりの距離において細胞の遊走および組込みがあった。成熟細胞型への成熟は、生着した細胞の領域全体にわたって２週間の間に発生し、続いて、グリソン鞘および組織の組織学的構造および構成が、３週間の間に回復した。重要なことに、パッチグラフトは、病態から動物を救済することができたが、このことはＩ型チロシン血症のマウスにおいてパッチグラフトを用いてここに実証されている。

本開示の方法は、直接注入によって、または血管経路を介して細胞を送達することによって、細胞を固形器官に移植する方法よりも優れている。これらの過去の移植方法では、結果として、移植される細胞が少数となり、生命を脅かす可能性のある塞栓のリスクがあり、有意なレベルの起こり得るが未知の臨床的に有意な異所的な細胞分布がある。これらの問題により、内部固形器官への細胞療法は、使用が最小限にであるかまたは全く使用されていない。

本開示では、オルガノイドが、適切な系譜段階特異的な上皮間葉系細胞パートナリングを確保するように、グラフトに用いる細胞に最も成功する配置を提供することを発見した。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、ドナー細胞混合物は、それらを成熟間葉のパニングによる除去の後にオルガノイド内に自己選択させることによって形成される。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液から特徴的な表面抗原を使用して関連細胞をフローサイトメトリーにより免疫学的に選択し、次いで、新鮮な単離組織由来の細胞懸濁液中に見出される比率にしたがってＢＴＳＣとＥＬＳＭＣとを混合することによって、上皮間葉系パートナーを共移植することによりドナー細胞混合物を形成してもよい。理論に拘束されるものではないが、系譜段階的に適した上皮間葉系パートナーを確立することによって、グラフトに対して関連するパラクラインシグナル伝達を提供し、規定された（血清不含の）条件下でオルガノイドを産生し、それらが容易に培養または凍結保存されるということが、本開示の仮説である。

一態様では、グラフトの一次設計は、細胞と適切な生体材料との混合からなり、この生体材料は、細胞を標的部位に局在化させたままとすることのできるハイドロゲルを形成することができる。軟質ハイドロゲル中の細胞は、ドナー細胞への影響に関して中性であるバッキングにより保護された。グラフト生体材料の好ましい実施形態は、ヒアルロナン（ＨＡ）などの非硫酸化または最小硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり得るが、ＨＡはＨＡに対する受容体と共にあらゆる幹細胞のニッチに見られ、ＨＡ受容体は古典的な幹細胞形質である。理論に拘束されるものではないが、ＨＡは未成熟体として（すなわち幹細胞／前駆体として）の維持を支持し、生着および宿主組織内への遊走および組込みに必須な分泌ＭＭＰの発現を最適化したということが、本開示の仮説である。

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の方法が、グリソン鞘のリモデリングとグラフト近傍の宿主組織のリモデリングとをもたらす生着プロセスを誘発したことを実証した（図３Ａ～図３Ｃ、図５Ａ～図５Ｐ、および図９Ａ～図９Ｂ）。リモデリングの所見を検証するために、トリクローム染色を使用し、細胞外マトリックス成分のその染色（図３Ａ～図３Ｃ）に加えてＨ＆Ｅによる染色（図３Ａ～図３Ｃおよび図９Ａ～図９Ｂ）により、炎症に伴うリモデリング現象が確認された。手術後およびそれに続くＨＡのクリアランスのあった３週間の間に、グリソン鞘および正常組織の組織構造の再構成があった。リモデリングゾーン（図３Ａ～図３Ｃ～図５Ａ～図５Ｐを参照）は、複数の形態のＭＭＰを含み（図６Ａ～図Ｈ）、３週間の間に正常な組織学的構造に一過的に戻ることが示された。

複数のタイプのＨＡがあるが、チオール修飾したものをＰＥＧＤＡにより惹起して架橋し、正確な生化学的および機械的特性を有するハイドロゲルを形成することができる。これらのＨＡハイドロゲルは、ｉｎｖｉｖｏでの細胞および分子の送達に臨床的に有用である。ＨＡのこれらの特性は、再現性があり、安定であり、弾性を与え、血液、リンパ液、または間質液のすべての可溶性シグナルのグラフト内へのアクセスを可能にし、生着および遊走が起こるまでドナー細胞の成熟を最小限にする。ＨＡ濃度およびＰＥＧＤＡ濃度の単純な変化により流動学的因子を変化させる能力は、ＨＡの「調整」を可能とし、細胞の遊走方向を導く際に、および癒着を最小限にする際に、追加的な利点をもたらす。軟質ＨＡハイドロゲルは、幹細胞のニッチにおける特性を模倣するものであり、ＭＭＰの幹細胞／前駆細胞関連レパートリー、特に分泌型ＭＭＰの発現に許容的であった。そのため、骨格組織の機能面で長年にわたって研究されたＨＡの機械的特性は、グラフト戦略の管理においても重要である。

幹細胞／前駆体を含有するパッチグラフトでは、結果として、数日以内にグラフトが組織内に「融解」し、その後ドナーと宿主細胞とが合併し、１週間以内に器官のかなりの領域にわたって細胞が分布するという顕著な現象が生じた（図３Ａ～図３Ｃおよび図５Ａ～図５Ｐを参照）。リモデリング相の間、主に移植後第一週に、ドナー細胞において、特にそれらが成体運命に限定された系譜を有する場合に、ＧＦＰ標識の細胞質での発現がしばしばあった（図４Ｃ）。このことは厄介であったが、なぜなら、ＧＦＰ標識はＨ－２Ｂヒストン遺伝子座にタグ付けされ、このようなタグ付けは標識が核にのみ見出されるべきものであったことを意味するためである。理論に拘束されるものではないが、ヒストンが炎症過程の間に細胞質に見出されたことから、そのような炎症過程に関する豊富な証拠がリモデリングゾーンにあったというのが本開示の仮説であるが（図９Ａ～図９Ｂ）、これらの炎症過程は、移植後の時間と共に減少し、その結果、グリソン鞘が再構成され、組織学的構造が安定化し、ドナー細胞が３～４週間までに主にまたは完全に核のＧＦＰ染色を有するものとなった（図４Ｄ、図４Ｅ、図５Ｇ）。対照試験では、ヒストンに対する抗体は、ＧＦＰに対するものと同様のパターンを生じた（図５Ｐ）。

生着および組込みのプロセスが、細胞外マトリックス成分を分解するカルシウム依存性の亜鉛含有エンドペプチダーゼのファミリーである複数のＭＭＰの発現と相関していたことが、本発明の発見である。

未成熟細胞は、高レベルの分泌形態（例えばＭＭＰ２、ＭＭＰ７）ならびに膜結合形態（例えばＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５）を発現する。ＩＨＣアッセイでは、分泌型ＭＭＰ（例えばＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７）のタンパク質レベルが、リモデリングの領域で豊富に発現するのが見出されたことが示された（図７）。

グラフトの生体材料、特にＨＡは、細胞内で幹細胞性の形質を維持することがｅｘｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｖｏで示されている。グラフトが、運命決定を惹起しうる公知のシグナルを欠くことから、異なる成体運命へと成熟したドナー細胞の所見は、成熟過程で運命を規定する関連因子の論理的な供給源としての、宿主組織の局所的な微小環境を示唆するものである。

パッチグラフト戦略は、多数の細胞を固形器官または組織に移植するのに安全かつ効果的であるため、欠損した機能の置き替えまたは病態の軽減をもたらす。生着し得るパッチ当たりの細胞数はかなりの数であり（ブタでは１０^８個、マウスでは１０^７個）、パッチグラフトの寸法およびオルガノイドの数によって定まる。これらの所見は、血管送達または注入グラフトによって実現可能な限られた数の細胞（例えば≦１０^６個）とは対照的である。

ドナー細胞を分化させる条件（可溶性成長因子、サイトカイン、血清、マトリックス成分、機械力）により、結果として、分泌型ＭＭＰが減少するとともに、生着および遊走のプロセスが阻止された。これらの所見を補完するものは、内皮とパートナリングした成熟肝細胞のパッチグラフトを用いた対照試験であり、そこでは、ドナー細胞は生存し機能的であったが、生着しなかった（データ示さず）。したがって、生着には分泌型ＭＭＰの供給源が必要であり、その供給源は、理想的には、動的に相互作用して複数の形態の分泌型ＭＭＰならびに細胞膜結合型ＭＭＰを生成することのできる細胞性供給源である。成熟細胞はこれを行うことができないが、なぜなら、細胞膜結合形態を唯一または主に発現していたためである（図６Ａ～図６Ｈ）。

このアプローチは、細胞療法の代替法を提供する。使用した生体材料およびバッキングは、宿主組織について中性であり、未成熟体としてドナー細胞の維持を一括して支持し、それゆえに生着、遊走、および組込みに必要なＭＭＰの関連レパートリーを産生することができる限り、安全であることが証明された。

略語
ＡＤＨＥＰ、成体肝細胞；ＡＦＰ、α－フェトタンパク質；ＡＬＢ、アルブミン；ＢＴＳＣ胆樹幹細胞；ＣＤ、共通決定基；ＣＤ４４、ヒアルロナン受容体；ＣＤ１３３、プロミニン；Ｃｄｘ２、尾部型ホメオボックス２；ＣＦＴＲ、嚢胞性線維症膜貫通透過性調節因子；ＣＫ、サイトケラチンタンパク質；ＣＸＣＲ４、ＣＸＣ－ケモカイン受容体４（フシンまたはＣＤ１８４とも呼ばれる；血小板因子４とも呼ばれる；ＥＧＦ、上皮成長因子；ＥＬＳＭＣ、血管芽細胞とその子孫、内皮および星状細胞の前駆体からなる初期系譜段階間葉系細胞；ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子；ＦＡＨ、チロシン代謝に極めて重要な酵素である（その不在はＩ型チロシン血症をもたらす）フマリル－アセト酢酸ヒドロラーゼ；ＦＧＦ、線維芽細胞成長因子；ＨＢ、肝芽細胞；ＨＧＦ、肝細胞成長因子；ＨｐＳＣ、肝幹細胞；ＫＭ、内胚葉幹細胞用に設計された無血清培地であるＫｕｂｏｔａ培地；ＫＲＴ、サイトケラチン遺伝子；ＬＧＲ５、Ｒ－スポンジンに結合するロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；Ｍａｆａ、Ｖ－Ｍａｆ筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログＡ；ＭＭＰ、細胞外マトリックスの溶解、細胞遊走、および再生応答に関連するプロテイナーゼの大きなファミリーである、マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＮＡＮＯＧ、自己再生に極めて重要に関与する転写因子；ＮＣＡＭ、神経細胞接着分子；ＮＧＮ、ニューロゲニン；ＮＲＧ、ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－ＩＬ２ＲガンマＣ－ｎｕｌｌ；ＮＩＳ、ナトリウム／ヨウ素共輸送体；ＯＣＴ４、（八量体結合転写因子４）、ＰＯＵ５Ｆ１（ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１）としても知られる、幹細胞によって発現される遺伝子；ＰＤＸ１、膵臓および十二指腸のホメオボックス１であって膵臓の発達に極めて重要な転写因子；ＰＢＧ、胆樹幹細胞のための幹細胞ニッチである胆管周囲腺；ＳＡＬＬ４、幹細胞の自己複製に重要であることが見出されているＳａｌ様タンパク質４；ＳＯＸ、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス；ＳＯＸ２、自己再生または胚性幹細胞および決定された幹細胞における多能性を維持するために必須の転写因子。ＳＯＸ９、内胚葉系組織（肝臓、腸、および膵臓に関連する転写因子；ＳＯＸ１７、肝臓の分化に必須の転写因子；ＶＥＧＦ、血管内皮細胞成長因子。

実施例１：パッチグラフトの調製および特性解析
本実施例は、パッチグラフトの調製および特性解析のための例示的な方法を記載する。

材料
機器、試薬、および／または供給品を提供する企業：Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州；ＡＣＤＬａｂｓ、トロント、カナダ；ＡｃｒｉｓＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州；ＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓ社（ＡＢＲ）、ロックビル、メリーランド州；ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、カリフォルニア州；ＡｌｐｃｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、セーレム、ニューハンプシャー州；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスター・シティ、カリフォルニア州；ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンノゼ、カリフォルニア州；ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎ、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州；ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、モンゴメリー、テキサス州；ＢｉｏＡｓｓａｙＳｙｓｔｅｍｓ、ヘイワード、カリフォルニア州；ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、トゥックズベリー、マサチューセッツ州；Ｂｉｏｔｉｍｅ、アラメダ、カリフォルニア州；ＣａｒｌＺｅｉｓｓＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ソーンウッド、ニューヨーク州；ＣａｒｏｌｉｎａＬｉｑｕｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ社、ウィンストン・セーレム、ノースカロライナ州；ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、ウィルミントン、マサチューセッツ州；Ｃｈｅｎｏｍｘ、アルバータ、カナダ；Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ、コート・バーノン・ヒルズ、イリノイ州；ＤｉａＰｈａｒｍａ、ウェスト・チェスター・タウンシップ、オハイオ州；ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州；ガタン社、プレザントン、カリフォルニア州；Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア州；Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ、レッドウッド、カリフォルニア州；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ニューヨーク州；Ｌｅｉｃａ、ワシントン、ＤＣ；ＬｉｆｅＳｐａｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、シアトル、ワシントン州；ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア州；ＯｌｙｍｐｕｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓＡｍｅｒｉｃａｓ社、ウォルサム、マサチューセッツ州；ＰｈｏｅｎｉｘＳｏｎｇｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＰＳＢ）、ブランフォード、コネチカット州；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社、ワーリントン、ペンシルバニア州；Ｑｕｉａｇｅｎ、ジャーマンタウン、メリーランド州；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州；ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、ノークロス、ジョージア州；ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、マンハイム、ドイツ；ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ダラス、テキサス州；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州；Ｓｏｆｒｅｇｅｎ、メドフォード、マサチューセッツ州；Ｔａｋａｒａ、大津、日本；ＴｏｕｓｉｍｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ社、ロックビル、メリーランド州；ＴｒｉａｎｇｌｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ（ＴＲＬ）、リサーチ・トライアングル・パーク、ノースカロライナ州；Ｕｍｅｔｒｉｃｓ、ウメオ、スウェーデン、ＶａｒｉａｎＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ社、パロアルト、カリフォルニア州；ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーリンゲーム、カリフォルニア州；ＶＷＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ラドノール、ペンシルバニア州。

動物
施設の所在地。宿主としてまたは細胞のドナーとして使用された動物は、ＮＣＳＵ（ノースカロライナ州ローリー市）のＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅの施設で維持された。これらの施設では、手術、剖検、ならびにすべての生体液および組織の収集が実施された。すべての手順は、ＮＣＳＵのＩＡＣＵＣ委員会によって承認された。

グラフトに使用されるブタ宿主。レシピエントとして使用されるブタは、６つの異なる品種の混合、すなわちヨークシャー、ラージホワイト、ランドレース（雌ブタ由来）、デュロック、スポット、およびピエトラン（雄ブタ由来）から成る６方向交配であった。この高度に不均一な遺伝的背景は、ヒト集団の不均一な遺伝的構成に相似するという点で望ましい。宿主動物はすべて雌であり、およそ６週齢であり約１５ｋｇであった。

細胞用ブタドナー。以下の二つの分類があった：ａ）ＧＦＰ導入遺伝子を担持するトランスジェニックドナー動物（この報告におけるすべての試験）、およびｂ）生後約６週齢の約１５ｋｇの雄ブタを雌に細胞移植するためのドナーとして使用（以降の報告で所見を報告した並行試験）。ＧＦＰ＋ドナー動物は、トランスジェニックＨ２Ｂ－ＧＦＰ雄ブタと野生型未経産ブタとを標準的な人工受精により繁殖させることによって得た。このモデルは、内因性β－アクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子座へのＩＲＥＳ－ｐＨ２Ｂ－ｅＧＦＰのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して開発された。トランスジェニック動物は、すべての組織においてｐＨ２Ｂ－ｅＧＦＰのユビキタスな発現を示す。

ＧＦＰをＨ２Ｂに融合することにより、ＧＦＰマーカーのヌクレオソームへの局在化が生じ、核の明瞭な視覚化ならびに染色体ダイナミクスの研究が可能となる。樹立系統を広範囲に分析し、ユビキタスかつ核局在性の発現が確認されている。さらに、繁殖はＨ２Ｂ－ＧＦＰの次世代への伝播を明示している。すべての動物は健康であり、複数の妊娠が確立し、子孫はｐＨ２Ｂ－ｅＧＦＰの伝播について予想されるメンデル比を示した。雄の子孫について誕生時に遺伝子型を同定し、導入遺伝子が陽性であったものを組織の収集およびドナー細胞の単離のために人道的に安楽死させた。

動物の遺伝子型解析。各ドナーおよびレシピエント動物について、ブタ白血球抗原クラスＩ（ＳＬＡ－Ｉ）およびクラスＩＩ（ＳＬＡ－ＩＩ）遺伝子座を、ＰＣＲ配列特異的プライマー戦略に基づき、これらの領域において公知の対立遺伝子を増幅するよう設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅している。システムは、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、およびＳＬＡ－３の遺伝子座６３を増幅する４７個の識別用ＳＬＡ－Ｉプライマーセットと、ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、およびＤＱＡの遺伝子座を増幅する４７個の識別用ＳＬＡ－ＩＩプライマーセットとで構成される。これらのプライマーセットは、類似した配列モチーフを共有する群によって対立遺伝子を区別するように開発され、公知のＳＬＡ－ＩおよびＳＬＡ－ＩＩの対立遺伝子を検出するために簡単かつ明確に示されている。併せて使用すると、これらのプライマーは、供試された各動物のハプロタイプを効果的にもたらし、それゆえにドナーとレシピエント動物とで一致するかまたは一致しないハプロタイプを簡単に確認するためのアッセイを提供する。

ＮＲＧ／ＦＡＨマウスの交配対を、ＬｉｓｈａｎＳｕ博士（微生物・免疫学部、ＵＮＣ、チャペルヒル、ノースカロライナ州）から入手し、免疫不全宿主に適切な条件下で、ＵＮＣ（チャペルヒル、ノースカロライナ州）の動物施設で維持した。これらのＦＡＨマウスは、ＮＲＧマウスを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって確立されたが、このことは、このマウスが免疫不全であり、二次的にフマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）を欠損したものとされていることを意味する。ＦＡＨ遺伝子は、チロシンおよびフェニルアラニン異化経路の最終酵素であるフマルリルアセト酢酸ヒドロラーゼをコードする。ＦＡＨは、肝臓および腎臓の細胞で高発現し、内分泌組織では少ない。ＮＲＧ（ＮＯＤ－Ｒａｇ１－／－ＩＬ２ＲｇａｍｍａＣ－ｎｕｌｌ）／ＦＡＨ（フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ）ノックアウトマウスは、ヒトにおける遺伝性チロシン血症１型（ＨＴ１）の主要な特徴を模倣する進行性の肝臓（および腎臓）損傷の表現型を示し、そのようなものには、チロシン血症、血中および尿中のスクシニルアセトンの出現、ならびに肝臓および腎臓の損傷が含まれる。マウスにおけるＦＡＨ欠損症の合併症は、２－（２－ニトロ－４－フルオロメチルベンゾイル）－１，３－シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ；ニチシノンとも呼ばれる）（２０μｇ／ｍＬ）を動物への水分補給に添加することにより管理した。ＮＴＢＣは、ＦＡＨの不在により生じるチロシン異化経路における毒性代謝物の産生を中断する。これらのマウスの肝臓および腎臓は、動物がニチシノン不含の通常の水を提供されない限り、正常な組織学的構造を示す。定期的な水が与えられた場合、重度のチロシン血症の証拠は２週間以内に発生し、結果としてマウスを３週間の間に安楽死させる必要がある。

培地および溶液
すべての培地をろ過滅菌し（０．２２μｍフィルター）、使用前に暗所で４℃に保った。基本培地および胎児ウシ血清（ＦＢＳ）をＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。すべての成長因子をＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから購入した。その他のすべての試薬は、記載されたものを除いて、Ｓｉｇｍａから得た。

細胞洗浄液。５９９ｍｌの基本培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０；Ｇｉｂｃｏ＃１１８７５－０９３）に、０．５グラムの血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ８８９６－５Ｇ、脂肪酸不含）、１０－９Ｍセレンおよび５ｍｌの抗生物質（Ｇｉｂｃｏ＃３５２４０－０６２、ＡＡＳ）を補充した。処理中の組織および細胞の洗浄に使用した。

コラゲナ－ゼ緩衝液。胆樹（管）組織用に６００Ｕ／ｍＬ（Ｒ１４５１２５ｍｇ）および器官（例えば肝臓）用に３００Ｕ／ｍｌ（１２．５ｍｇ）の終濃度でコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ＃Ｃ５１３８）を補充した１００ｍＬの細胞洗浄液で構成されている。

Ｋｕｂｏｔａ培地、すなわち内胚葉性幹細胞／前駆体用に設計された、全体的に規定された無血清培地を用いて、細胞懸濁液、オルガノイド、およびＨＡハイドロゲルを調製した。この培地は、銅不含、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１ｎＭセレン、０．１％ウシ血清アルブミン（精製済、脂肪酸不含、画分Ｖ）、４．５ｍＭニコチンアミド、０．１ｎＭ硫酸亜鉛七水和物、５μｇ／ｍｌトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍｌインスリン、１０μｇ／ｍｌ高密度リポタンパク質、および脂肪酸不含の高度に精製されたアルブミンと複合体を形成して存在する精製遊離脂肪酸の混合物を含む、任意の基本培地（ここではＲＰＭＩ１６４０）からなる。その調製は、方法のレビュー６７に詳細に記載されている。また、それはＰｈｏｅｎｉｘＳｏｎｇｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ブランフォード、コネチカット州）から入手可能である。

ヒアルロナン（ＨＡ）。可溶性の長鎖形態のＨＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号５２７４７）を、オルガノイド培養の安定化および凍結保存に使用した。ハイドロゲルの製造に使用されるもの、すなわちチオール修飾ＨＡは、Ｂｉｏｔｉｍｅの子会社であるＧｌｙｃｏｓａｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。これらのチオール修飾ＨＡの成分は、ＩＳＯ９００１：２０００プロセス（ｗｗｗ．ｂｉｏｐｐｏｌｙｍｅｒｓ．ｎｏｖｏｚｙｍｅ．ｃｏｍ／）にて宿主として枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いた専有の細菌発酵プロセスにより製造された。

この成分は、ＨｙａＣａｒｅ（登録商標）の商標の下でＮｏｖｏｚｙｍｅｓによって生産され、動物由来原料および有機溶剤の残留物を１００％含有していない。動物由来成分は生産に使用されておらず、タンパク質レベルは非常に低く、エンドトキシンは含まれない。生産量は欧州薬局方の定める基準に従う）。ＨＡハイドロゲルは、酸素の存在下でジスルフィド架橋の形成を惹起可能なチオール修飾ＨＡであるＧｌｙｃｏｓｉｌ（ＨｙＳｔｅｍ（登録商標）ＨＡ、ＥＳＩＢＩＯ－ＣＧ３１３）を使用して、またはポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を用いてチオエーテル連結を形成することによって、調製された。Ｇｌｙｃｏｓｉｌ（登録商標）は、脱気水を用いて１％リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、または発明者らの場合は無血清Ｋｕｂｏｔａ培地で、チオール化ＨＡの１％溶液として再構成される。再構成すると、数時間は液体のままであるが、酸素に曝露されるといくらかゲル化することができる。数分以内にゲル化を発生させるＰＥＧＤＡなどの架橋剤でＧｌｙｃｏｓｉｌを処理した場合、温度またはｐＨを変化させることなくより正確なゲル化が発生する。

架橋のレベルは、堅さまたは剛性のレベルへの主な寄与因であり、チオール修飾ＨＡとＰＥＧＤＡとの比を調整することによって制御することができる。予備試験では、様々なレベルの剛性を持つＨＡハイドロゲル中で幹細胞集団を供試し、剛性のレベルが１００～２００Ｐａ未満である場合にのみ、抗原性と機能性（例えば遊走する能力に関して）との両方の点で幹細胞として残ることを見出した。発明者らはこの所見を用いて、非常に柔らかい層とより剛直な層とのヒアルロナンハイドロゲルをバッキングに有したグラフトを設計し、標的組織以外の方向への遊走に対する障壁を形成するとともに、近くの組織からの細胞の付着を最小限にした。異なるレベルの剛性を有する三つのハイドロゲルのバージョンは、図２～図２Ｅに特徴付けられており、特徴は流動学的特性の直接的な測定値を含む。最も剛直な障壁である１０×ＨＡハイドロゲル（剛性＝７６０Ｐａ）の障壁は、事前にバッキング上に調製され、所望に応じて凍結保存することができた。手術時に、ドナー細胞を軟質の１×ＨＡハイドロゲル（剛性＝６０Ｐａ）により調製し、より剛直な１０×ハイドロゲル（既にバッキング上にある）上に配し、パッチを標的部位に繋いだ。繋いだ後、ＢＤＭｉｃｒｏ－Ｆｉｎｅ（商標）ＩＶ永久装着型ニードルを付けたＮＯＲＭ－ＪＥＣＴ４０１０．２００Ｖ０プラスチックシリンジを用いて、グラフトの外側に２×ＨＡハイドロゲル（剛性＝１０６Ｐａ）を被覆または塗装した。

ハイドロゲルのマクロスケールの流動学的特性は、応力制御された円錐平板レオメーター（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＡＲ－Ｇ２、円錐径４０ｍｍ、角度１°）を用いて決定した。ゲルを、１ｒａｄ／ｓの周波数および０．６Ｐａの応力振幅で振動しながらレオメーター上で活発に重合させ、併せて係数を継続的にモニタリングして架橋反応の十分な完了を照会した。

平衡化させたら、ハイドロゲルを振動周波数掃引に供した（応力振幅：０．６Ｐａ、周波数範囲：０．０１～１００Ｈｚ）。使用した３つのバージョンのヒアルロナンハイドロゲルの流動学的特性は図２Ａ～図２Ｅにまとめられており、軟質ハイドロゲル（約１００Ｐａ）、より剛性のもの（約７００Ｐａ）、および中間レベル（約２００～３００Ｐａ）を含む。

ドナー細胞
ドナー細胞を、上述のようにトランスジェニックＨ２Ｂ－ＧＦＰブタから得た。これらは、すべての細胞をＨ２Ｂ－ＧＦＰによりタグ付けするという点で、細胞移植研究に有意な利点を提供する。分子タグとして蛍光タンパク質を使用することにより、移植後のドナー細胞の遊走および生着を追跡することが可能になった。この融合タンパク質は、ヌクレオソームＨ２Ｂタンパク質にＧＦＰを融合していることによってヌクレオソームを標的とし、核／クロマチンのＧＦＰシグナルをもたらす。

グラフトの特性解析において、成熟肝細胞で絹バッキング（新緑色）とリポフスチン（深緑色）との両方の自己蛍光があったことは、それらの波長がＧＦＰの波長と重なることを考慮すると、課題を提示するものであった。したがって、発明者らは、ＧＦＰに対する抗体を用い、二次的には赤色蛍光プローブを有する抗体を用いて、ＧＦＰ＋シグナルをピンク色またはローズ色にシフトさせた（図４Ａ～図４Ｅ、図１０）。これにより、幹細胞は、ピンク色の核（核の青色のＤＡＰＩ染色と抗体によりタグ化されたローズ色のＧＦＰ＋標識との合併）を有する小さな細胞として認識された。肝細胞に成熟した任意のドナー細胞は、ピンク色の核を有し、細胞質内にはリポフスチンの自己蛍光を有することが認められた（図４Ａ～図４Ｅ）。マウス肝臓上のパッチグラフトでは、一部の細胞は完全にピンク色の核を有し、一部は斑点状のピンク色の実体を伴う大きな青色の核を有していた（図５Ａ～図５Ｐ）。これは、単一のピンク色の核を有していたドナー細胞（二倍体）と、より大きな核を有する倍数体細胞に成熟していた一部のドナー細胞との混合物に起因しており、ゆえにＧＦＰ標識が核の一つの領域に局在していた可能性があるものと発明者らは想定している。あるいは、個別のＧＦＰ標識の局在を有するものは、ドナーおよび宿主細胞と、４Ｎから３２Ｎに及ぶレベルの倍数性を有することが公知である若いマウス肝細胞とが融合していることを表す可能性がある。

細胞の調製。ブタ肝外胆樹組織（胆嚢、総管、肝管）をトランスジェニックブタから得た。滅菌したステンレス鋼マレットで組織を叩いて、肝内胆管と肝外胆管との連結を注意深く保ちつつ実質細胞を除去した。次いで、抗生物質、０．１％の血清アルブミン、および１ｎＭのセレン（１０－９Ｍ）を補充した滅菌無血清基本培地から構成される「細胞洗浄」緩衝液を用いて、胆樹を洗浄した。次いで、交差させたメスで機械的に切り分け、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｎＭセレン、３００Ｕ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ、０．３ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）、および抗生物質を補充したＲＰＭＩ－１６４０中の細胞懸濁液に、凝集体を酵素的に分散させた。消化を３２℃で３０～６０分間、頻繁に撹拌しながら行った。ほとんどの組織は、２ラウンドの消化を要し、続いて４℃、１１００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを合一し、細胞洗浄液に再懸濁した。細胞懸濁液を、４℃で５分間、３０Ｇで遠心分離して、赤血球を除去した。細胞ペレットを再び細胞洗浄液に再懸濁し、４０μｍナイロン細胞ストレーナーを通して濾過し（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎＦａｌｃｏｎ＃３５２３４０）、新鮮な細胞洗浄液を加えた。細胞数を決定し、トリパンブルーを用いて生存率を評価した。９０～９５％を超える細胞生存率が日常的に観察された。

パートナーとして要した間葉系幹細胞／前駆体。以前の研究では、発明者らは、肝幹細胞および胆樹幹細胞に求められる重要なパラクラインシグナルと、成熟実質細胞に必要とされる他のシグナルとの対応を示す、間葉系細胞の集団の抗原性プロファイルを画定した。ＢＴＳＣのパートナーとして必要な間葉系細胞は、ＭＨＣ抗原を含まず、側方散乱の低い、血管芽細胞（ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦ受容体＋およびＣＤ３１陰性）、内皮の前駆体（ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦ受容体＋、およびＣＤ３１＋）、ならびに星状細胞の前駆体（ＣＤ１４６＋、ＩＣＡＭ１＋、ＶＣＡＭ＋、アルファ平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）＋、およびビタミンＡ陰性）として識別可能な、亜集団である。発明者らは、これら３つの亜集団をまとめて、初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）と称する。

これに対して、成体肝細胞は、成熟した類洞内皮（ＣＤ３１＋＋＋、ＩＶ型コラーゲン＋、ＶＥＧＦ受容体＋、およびＣＤ１１７陰性）と、成熟した星状細胞および間質細胞（ＩＣＡＭ－１＋、ＡＳＭＡ＋、ビタミンＡ＋＋、Ｉ型コラーゲン＋）に関連する成体胆管細胞とに関連付けられる。

オルガノイドの形成。細胞懸濁液を、無血清Ｋｕｂｏｔａ培地中、マルチウェル平底細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３５３０４３）に加え、３７℃で約１時間インキュベートして成熟間葉系細胞の付着を促進した。培地が無血清であっても、成熟間葉系細胞は１０～１５分以内にディッシュに付着した。懸濁液中に残留する細胞を別のディッシュに移し、再び最大１時間インキュベートした。この繰り返しの結果、成熟間葉系細胞のかなりの部分の枯渇が生じた。成熟間葉系細胞の枯渇後、残りの浮遊細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇの超低付着性ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３４７１）にて、無血清Ｋｕｂｏｔａ培地中にウェル当たり約２×１０^５細胞個で播種し、ＣＯ_２インキュベーター中３７℃で一晩インキュベートした。一晩で形成される胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）およびＥＬＭＳＣから成るオルガノイド（図１Ａ～図１Ｄ）。これらのオルガノイド培養物は、特に培地に可溶性形態のＨＡ（Ｓｉｇｍａ）を補充した（０．１％）場合には、Ｋｕｂｏｔａ培地で数週間生存した。それらはまた、以下に記載されるように凍結保存することもできた。新生仔ブタ胆樹組織の各グラムから、発明者らは約１．５×１０^７個の細胞を得た。発明者らは、無血清Ｋｕｂｏｔａ培地でインキュベートした６ウェルの超低付着性プレートのウェル当たり約３～６×１０^５細胞個を使用した。細胞は、平均６０００～２０，０００個の小さなオルガノイド（約５０～１００細胞／オルガノイド／ウェル）を産生した。グラフトに対して、発明者らは、少なくとも１００，０００個のオルガノイド（＞１０^７細胞個）を使用した。バッキングのサイズに応じて、発明者らは、グラフト内のオルガノイドの数を、３ｃｍ×４．５ｃｍのバッキング上の約１ｍｌの軟質ヒアルロナンハイドロゲルに包埋して１０^８個以上（すなわち、約１０^９細胞個）のオルガノイドにまで増加させることができた。

幹細胞オルガノイドの凍結保存。単離した幹細胞オルガノイドを、不凍因子、デキストラン、およびＤＭＳＯを含有する等張性凍結保存緩衝液であるＣｒｙｏｓｔｏｒ１０（Ｂｉｏｌｉｉｆｅ、シアトル、ワシントン州；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｒｙｏｓｔｏｒ－ｃｓ１０．ｈｔｍｌ）中で凍結保存した。細胞の生存率は、０．１％のＨＡ（Ｓｉｇｍａ＃５２７４７）を補充することでさらに改善された。ＣｒｙｏＭｅｄ（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ－ＲａｔｅＦｒｅｅｚｅｒを使用して凍結保存を行った。解凍時の生存率は９０％超であったため、解凍後の細胞はオルガノイドを形成するか付着し、ｅｘｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｖｏで増殖拡大し、予想の成熟細胞をｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏで生じさせることができた。

グラフトの組成（図１Ａ～図１Ｄおよび図２Ａ～図２Ｅ）。細胞の単離およびグラフトの組立てを図１Ａ～図１Ｄおよび図７の概略図に描写し、図２Ａ～図２Ｅに詳細を要約した。バッキングを用いてグラフトを形成し（表１、上記）、その上に軟質ヒアルロナンハイドロゲル中に包埋した幹細胞オルガノイドを配した。これらを事前に簡単に調製し、インキュベーター内の培養ディッシュで一晩維持した。グラフトは、実験期間の間、標的部位で安定であることが判明した。オルガノイドの凍結保存は容易に達成されたが、軟質ハイドロゲル内の場合のオルガノイドの凍結保存は達成されなかった。このことは、軟質ハイドロゲルへのオルガノイドの包埋を手術の直前に行う必要があることを意味する。

手術
外科的処置。麻酔は、ケタミン／キシラジン（各２～３ｍｇ／ｋｇ体重）併用の静注または２０ｍｇ／ｋｇケタミンと２ｍｇ／ｋｇキシラジンとの筋注の投与によって誘導し、閉鎖循環式ガス麻酔ユニットを介して投与される酸素中イソフルランによって維持した。動物を背臥位に配置し、腹部を剣状突起（ｘｙｐｈｏｉｄ）から恥骨まで毛刈りした。ヨードスクラブおよびアルコール溶液を交互に用いて、皮膚を無菌的に調えた。手術室へ入った後、滅菌的手法を用いて繰り返し皮膚を調え、その範囲を外用ヨウ素溶液で覆った後に、滅菌済み外科用ドレープを適用した。手術担当者は適切な無菌的手法を用いた。腹部中央の切開は、皮膚を通り、皮下組織および白線を通り、剣状突起から開始して尾側に８～１２ｃｍ延ばして行った。左肝部を露出させ、３×４．５ｃｍのパッチグラフトを肝臓の腹側表面に適用したが、このパッチグラフトは、１０×ＨＡ（約７６０Ｐａ）を含有するバッキング上に、包埋したオルガノイドを含む１×ＨＡ（約６０Ｐａ）を配して含有しており、このパッチを肝被膜の表面に直接接触させて配した。４－０ポリプロピレンの４～６針の単結節縫合を用いて、パッチグラフトを肝臓に縫合した。次いで、グラフトの露出表面を、２ｍｌの２×ＨＡハイドロゲル（約１０６Ｐａ）で処理したが、このゲルの剛性レベルは、グラフトの外側に塗布または被覆することを可能にする十分な流動性であり、さらに隣接組織からの癒着を最小限にするよう機能した。外科手術グラフトの配置後、０－ＰＤＳを用いた単純連続縫合により白線を閉じた。２ｍｇ／ｋｇの０．５％ブピバカインを筋注して白線をブロックした。皮下組織および皮膚をそれぞれ、２－０のＰＤＳ縫合糸および３－０のＭｏｎｏｃｒｙｌ縫合糸により閉じた。組織接着剤を皮膚表面上に配した。

免疫抑制。トランスジェニックブタから野生型レシピエントへのグラフト移植は、同種異系であり、そのため免疫抑制が必要であった。使用した免疫抑制プロトコールは、第三者によって確立されたものであった。すべてのブタに、手術の２４時間前の開始で、免疫抑制薬タクロリムス（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびミコフェノール酸（５００ｍｇ）を１日２回経口投与した。薬剤を実験期間全体にわたって連続的に与えた。これらは、嗜好する食品と混合すれば動物に容易に与えることができた。

剖検の手順。すべての動物は、指定時点で、ケタミン／キシラジンによる鎮静およびイソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）麻酔の後、致死量のペントバルビタールナトリウムの静脈内注射によって人道的に安楽死させた。死亡を確認したら、死体を慎重に解剖し、標的臓器を摘出し、実験室への輸送のために冷却Ｋｕｂｏｔａ培地中に置いた。肝臓に加えて、肺、心臓、腎臓、および脾臓を回収し、１０％の中性ホルマリン中で固定した。

ＮＲＧ／ＦＡＨマウス用パッチグラフト。新生仔ブタ肝細胞（１０６Ｈ２Ｂ－ＧＦＰ細胞混合物）を用いて、１００μｌの１×ＨＡハイドロゲルに包埋されたオルガノイドを形成し、１０×ＨＡハイドロゲルを含浸させた０．７ｃｍ×１．２ｃｍのＳｅｒｉ－ｓｉｌｋ輪郭バッキングに移してパッチグラフトを形成した。次いで、内側葉と左外側葉との間にグラフトをスライドさせることによって、パッチグラフトをＮＲＧ／ＦＡＨマウス肝臓上に移植した。マイクロピペットを使用し、外科手術用糊をパッチの縁上に用いて、パッチをグラフト部位に固定した。これに続いて、癒着障壁として２００μＬの２×ＨＡハイドロゲルを塗布した。

筋層および皮膚を、縫合またはクリップを用いて閉鎖し、４００μＬの生理食塩水をマウスに水分補給のために与え、１００μＬのブプレノルフィンを術後処置として与えた。対照は、細胞を含まないパッチを受けた。すべての動物を一晩、手術の回復に供した。移植後１日目に、ＮＴＢＣを除去する７日間にわたる段階的な断薬プロセスを行った（１日目に２５％に減少、２日目から３日目に１２％に減少、４日目から６日目に６％に減少、７日目に０％に減少）。後の研究で、発明者らは、この段階的な断薬過程が必要ではないことを知った。単に薬剤をパッチ移植の外科処置後約２４時間以内に除去すればよい。体重測定値を使用して、動物の異常を確認した。

グラフトの特性解析
組織学的検査固定後４８時間超で、組織試料を７０％エタノール中、標識カセットに配置し、ＬｅｉｃａＡＳＰ３００Ｓ組織プロセッサーにて６０度でおよそ１０時間処理した。一晩の処理の完了後、ＬｅｉｃａＥＧ１１６０エンベデッドステーションを用いて試料を包埋した。型をワックスで充填し、試料を正しい配向に置いて、所望の切片を収集できるようにした。ブロックおよび組織試料を型から一つの単位として外せるようになるまで、カセットを冷却した。このブロックをＬｅｉｃａＲＭ２２３５マイクロトームを用いて５ミクロンで切断し、切片を水浴中に浮遊させ、スライド上に置いた。スライドを染色前に一晩風乾した。ＲｉｃｈａｒｄＡｌｌａｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＨｉｓｔｏｌｏｇｙＰｒｏｄｕｃｔｓを用いて、メーカー推奨プロトコールに従って、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ；試薬＃７２１１および＃７１１１）またはマッソン・トリクローム（マッソン・トリクローム染色：ＢｌｕｅＣｏｌｌａｇｅｎＫｉｔ＃８７０１９）で切片を染色した。上記プロトコールはＬｅｉｃａＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＸＬにプログラムされている。

肝臓の非染色凍結切片の免疫蛍光（ＩＦ）。野生型ブタおよびトランスジェニックブタ由来の肝臓の自家蛍光切片（図８）の検体を、ＯＣＴに包埋し凍結した組織から調製し、凍結切片作製用に－２００℃で急速凍結した。凍結切片を撮像して、Ｈ２Ｂに連結されたＧＦＰを含むドナー細胞を観察した（図８）。肝細胞（リポフスチン）の細胞質での高い自己蛍光、およびＳｅｒｉ－Ｓｉｌｋバッキングの自己蛍光は、ＧＦＰ＋細胞の可視化に際し問題を生じた。いくつかの実施形態では、パラフィン切片を調製し、ＧＦＰに対するウサギポリクローナル抗体（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｃｏｉｌｓ、ＮＥ６００－３０８）を用いてＧＦＰについて染色することによって、すなわちウサギ抗ＧＦＰ抗体を、二次抗体であるロバ抗ウサギＩｇＧＨ＆Ｌ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８；ａｂ１７５４７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と組み合わせて使用するとともに、ロバ抗ヤギＩｇＧＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗体を、肝臓の自己蛍光の非特異的染色を除外するために使用した（図３Ｃ、図４、および図１０）。ＧＦＰに対する抗体を用いた処理に続くＧＦＰの免疫蛍光法では、凍結切片を室温で１時間解凍した後、１０％緩衝ホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノール中で固定した。固定後、切片を１％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中２．５％ウマ血清により室温で１時間、ブロッキングした。ＰＢＳ中１０％ヤギ血清で希釈した一次抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。翌朝、切片をＰＢＳで３回すすぎ、ＰＢＳ中２．５％ウマ血清で希釈した二次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。ＺｅｉｓｓＣＬＳＭ７１０スペクトル共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて画像を撮影した。抗体を表３または表４に列挙する。トリパンブルーを含む染料を使用したクエンチングにより、自己蛍光を減少させた。トリパンブルーは、ＰＢＳ中０．４％で組織／細胞に使用した。これにより、バックグラウンドが著しく低減される。

図４Ｄおよび図４Ｅの画像について（イタリア、ローマ、サピエンザで実施）。標準的なプロトコールに従い、切片（３μｍ）をヘマトキシリン－エオシンおよびシリウスレッドにより染色した。免疫組織化学のため、内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール過酸化水素（２．５％）中での３０分間のインキュベーションによりブロッキングした。供給元により示されるように、プロテイナーゼＫ（コードＳ３０２０、Ｄａｋｏ、グロストルプ、デンマーク）を室温で１０分間適用することによって、抗原を賦活化した。次いで、切片を、一次抗体（パンサイトケラチン、Ｄａｋｏ、コード：Ｚ０６２２、希釈：１：１００；Ｓｏｘ９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、コード：ＡＢ５５３５、希釈：１：２００）と共に４℃で一晩インキュベートした。

試料をＰＢＳで５分間２回すすぎ、ビオチン化二次抗体（ＬＳＡＢ＋Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ、コードＫ０６９０、Ｄａｋｏ、グロストルプ、デンマーク）と共に、次いでストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＬＳＡＢ＋Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ、コードＫ０６９０、Ｄａｋｏ、グロストルプ、デンマーク）と共に、室温で２０分間インキュベートした。ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ、グロストルプ、デンマーク）を基質として使用し、切片をヘマトキシリン（ＰＭＩＤ：２９２４８４５８）で対比染色した。免疫蛍光法用に、非特異的なタンパク質結合を、５％の正常ヤギ血清によってブロッキングした。標本を一次抗体（ニワトリ抗ＧＦＰ、Ａｂｃａｍ、コード：ａｂ１３９７０、希釈＝１：２００；ウサギ抗ＨＮＦ４アルファ、Ａｂｃａｍ、コード：９２３７８、希釈：１：５０、ウサギ抗アルブミン、ａｂ２４０６、希釈＝１：５００）と共に４℃で一晩インキュベートした。標本を洗浄し、標識化アイソタイプ特異的二次抗体（抗ニワトリＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－５４６、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８、抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ペイズリー、英国）と共に１時間インキュベートし、４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により細胞核（ＰＭＩＤ：２６６１０３７０）の視覚化のために対比染色した。すべての免疫反応について、陰性対照（一次抗体を免疫前血清により置換）も含めた。ＪｅｎｏｐｔｉｋＰｒｏｇＲｅｓＣ１０ＰｌｕｓＶｉｄｅｏｃａｍ（イェーナ、ドイツ）を備えるＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓＤＭ４５００Ｂ光学および蛍光顕微鏡（ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ヴェッツラー、ドイツ）によってコード化された方式で、切片を調べた。免疫蛍光染色も共焦点顕微鏡（ＬｅｉｃａＴＣＳ－ＳＰ２）によって解析した。スライドを画像解析システム（ＩＡＳ－ＤｅｌｔａＳｉｓｔｅｍｉ、ローマ、イタリア）によりさらに処理し、盲検法で二人の研究者により独立して評価した。免疫蛍光染色をデジタルスキャナ（ＡｐｅｒｉｏＳｃａｎｓｃｏｐｅＦＬＳｙｓｔｅｍ、ＡｐｅｒｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、オックスフォード、英国）により走査し、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅにより処理した。

定量的逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、総ＲＮＡをオルガノイドまたはグラフトから抽出した。Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ１ｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ）を用いて合成した第一鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ配列検出システム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＦａｓｔｓｔａｒｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅＭａｓｔｅｒ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ｍＲＮＡレベルの定量的解析を行った。プライマーをＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅＬｉｂｒａｒｙＡｓｓａｙＤｅｓｉｇｎＣｅｎｔｅｒ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ）により設計した。プライマー配列を下記表５に列挙する。プライマーを５０℃で２分間、９５℃で１０分間アニーリングし、次いで９５℃（１５秒）および６０℃（１分）の４０サイクルを行った。グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現を、概ね対照および標準として用いた。

ＲＮＡシーケンシングおよび遺伝子発現解析。ＱｉａｇｅｎＲｎｅａｓｙキットを用いて、ＲＮＡを細胞から精製した。ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ２０００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して実施した。ｃＤＮＡライブラリーを、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑＳｔｒａｎｄｅｄｍＲＮＡ調製キットを用いて生成し、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００プラットフォーム上で配列決定した。１レーン当たり二つの試料を配列決定し、すべての試料で合計８レーンを占めた（一つのフローセル）。ＦａｓｔＱを用いて品質管理分析を完了した。配列リードのヒトゲノム（ｈｇ１９）へのマッピングを、デフォルトパラメータを用いてＭａｐＳｐｌｉｃｅ２により実施した。転写物の定量をＲＳＥＭ分析によって行い、ＤＥＳｅｑを使用して遺伝子発現を正規化し、差次的に発現する遺伝子を特定した。ＭａｐＳｐｌｉｃｅ２も使用して、候補融合転写物を検出した。融合コール（Ｆｕｓｉｏｎｃａｌｌｓ）は、候補融合接合部にわたって広がるリードの深さおよび複雑性に基づくものとした。ピアソンの相関分析を用いて遺伝子発現プロファイルを比較し、階層的クラスタリングをＲで実施した。階層的クラスタリングは、ＤＥＳｅｑパッケージで提供される分散安定化変換に従って実施した。経路濃縮分析を、ＩｎｇｅｎｕｉｔｙＰａｔｈｗａｙＡｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアにより行った。差次的遺伝子発現解析を、少なくとも一つのカテゴリーで最小平均正規化数＞５０である遺伝子に対してのみ実施した。

統計解析。試料間の統計的有意差を、スチューデントの両側ｔ検定を用いて計算し、結果を平均±標準偏差（ＳＤ）として表示する。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。

実施例２：ブタの肝臓へのパッチグラフトの投与
ブタＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを野生型ブタの肝臓に移植した研究からの代表的な所見。所見を図３～図４、図６、図８～図１０、図１４に示す）。細胞は、１週間以内に生着することができ、生着過程の間にグリソン鞘および直下組織のリモデリングを引き起こした（図３～図４、図６、図８～１０）。リモデリング過程は、炎症過程（図９Ａ～図９Ｂ）との類似性を示した。２～３週目までに、生着した細胞は、肝細胞および胆管細胞を含む成体細胞型への成熟を示した（図４Ａ～図４Ｅ）。生着プロセスは、複数のマトリックスメタロプロテイナーゼによって媒介されることが証明され（図６Ａ～図６Ｈ）、それらは宿主組織の劇的なリモデリングを引き起こした。グラフト生体材料のクリアランスに伴い、パラクラインシグナル（マトリックスおよび可溶性シグナル）のドメインは、ＭＭＰの減弱をもたらし、その後、ドナー細胞を成体細胞型に成熟させた。３週間の間に、宿主組織は安定し、完全に組み込まれたドナーおよび宿主細胞を全体的に呈した。ＧＦＰをコードするＤＮＡのＰＣＲ分析により、ドナー細胞の宿主肝の全領域への分布の立証が達成された（図１４）。本パッチ移植法は、宿主および組織にとって安全であることが証明された。唯一の難点は、ブタの免疫抑制による手術部位での皮膚感染の悪化であることがわかった（図１２Ａ～図１２Ｅ）。

実施例３：実施例３：マウスの肝臓へのパッチグラフトの投与
ブタＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを含有するパッチグラフトを、ＦＡＨ／ＮＲＧマウスの肝臓に外科的に付着させた。この肝臓を移植の１か月後に評価した。ドナー細胞が宿主肝全体にわたって見出された（図３Ｃ、図５Ａ～図５Ｐ、図１１、図１３Ａ～図１３Ｃ）。ブタ肝臓上のパッチグラフトと同様に、マウス肝臓上のパッチグラフトは、宿主肝全体にわたって急速な生着と組込みとをもたらした（図１３Ａ～図１３Ｃ）。実際に、１か月まで、ドナー細胞は宿主肝を大部分は存続させた。進行中の研究では、グラフトを外科的に付着させた後の様々な時点でのドナーと宿主細胞とを対比した支配の程度を評価している。

実施例４：膵臓へのパッチグラフトの投与
この実施例は、パッチグラフトを膵臓などの器官に投与するための例示的な方法を記載する。具体的には、この詳細なプロトコールでは、免疫不全でありまた糖尿病になり易い遺伝的状態も有する変異型マウス（Ａｋｉｔａ／ＮＲＧ）の膵臓にパッチグラフトを投与することを記載する。

作業区域の準備。外科手術器具を手術前にオートクレーブする。全体の外科処置は、環境汚染を最小限にするために層流キャビネット内で実施する。適切な無菌手法を用いて、必要な供給品を、調製区域、外科手術区域、および回復区域で組み立てる。循環水加熱パッドを準備する。循環水加熱パッドは、３８℃の温度を有し、手術中の温度安定化に使用する。加熱パッドを滅菌防水パッドで覆う。ＵＮＣ動物施設により提供されるＵＢ５６などの手術顕微鏡を、外科処置の間に使用する。ホットビーズ滅菌器などの器具滅菌器を、外科処置の合間に器具を滅菌するために使用する。最後に、平坦な紙のベッドで覆った清潔なケージからなる回復区域を準備する。

手術に用いる動物の準備。パッチグラフト手術には、８週齢の雄マウスを使用した。８週齢の雄マウスを標準ケージに収容し、１２時間／１２時間の明暗サイクルで維持し、標準齧歯類食を随意に給餌した。マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹膜注射により麻酔した。随意運動の緩徐な消失および筋弛緩を観察することによって、適切な麻酔を評価した。反射の喪失を、爪先をつまむことによって調べた。麻酔下の眼の乾燥を防ぐために、眼軟膏を塗布した。

手術部位の準備。胸郭および腹部を、防腐性クロルヘキシジン溶液により消毒した。毛皮をシェービングによって腹部の範囲（約２．５ｃｍ×１．５ｃｍ）から除いた。シェービング範囲を、クロルヘキシジン溶液に浸したガーゼを用いて消毒した後、アルコール溶液により消毒し、最後にクロルヘキシジン溶液を適用する。準備した外科手術部位が手術担当者に対し上向きに向くように、外科手術区域内に動物を配置する。滅菌作業域を作り出すために、防水外科手術用ドレープをマウスに覆い掛け、消毒された腹部域を露出させるとともに身体の残り部分を覆うようにする。処置を実施する前に、マウスを麻酔深度についてモニタリングした。

膵臓の表面上にパッチを固定。上部正中線切開は、滅菌外科用ブレードを用いて、剣状突起から臍まで延ばして皮膚に行う。上腹部四区分を露出させるために、下にある白腺と腹膜とを、滅菌はさみを用いて分離する。内臓の乾燥を防止するために、内臓に定期的に０．９％塩化ナトリウムの滅菌溶液を振りかける。滅菌ピンセットまたはスワブを用いて、胃を引き上げ、脾臓および膵臓の脾葉（尾部領域）を露出させる。培養ディッシュ中、新鮮な無血清Ｋｕｂｏｔａ培地に浸漬したパッチグラフト（その調製については以下を参照）を、膵臓の表面に置く。このパッチの隅を、外科用接着剤（ＰａｔｔｅｒｓｏｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｄｅｖｅｎｓ，ＭＡ）により固定する。

パッチグラフトの調製。パッチグラフト用のバッキングを手術前に十分に準備する。バッキングの上部で軟質ハイドロゲルに細胞を含有するパッチグラフトを、外科手術の数時間前に調製する。細胞、およびハイドロゲルを産生するヒアルロナン混合物は、すべて無血清Ｋｕｂｏｔａ培地中で調製する。１×、２×、および１０×の粘弾性（剛性）のレベルで剛性レベルを変化させて使用する、三つの異なるヒアルロナンハイドロゲルがあり、これらのレベルは、チオール修飾ヒアルロナンの濃度とポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）の濃度との比率を変化させることによって達成される。３つのハイドロゲル（１０×）のうち最も剛直なもの（約６００～８００Ｐａ）を、絹のバッキングに含浸させるために使用し、外科処置の前（例えば前日）に十分に調製する。手術時に、軟質ハイドロゲルを、４：１の比率でヒアルロナンをＰＥＧＤＡと混合することによって調製し（ヒアルロナン５０μｌの２０％がＰＥＧＤＡである）、約５分間ゲル化させる。次いで、オルガノイド（１×１０^５個）をこの軟質ハイドロゲルに混合し、混合物をバッキング上に積層し、ハイドロゲル／細胞混合物にゲル化過程をさらに３０分～２時間継続させた。これよりパッチグラフトを標的部位に繋ぐことができる。大部分の組織および器官については、グラフトの隅での縫合によりこれを行うことができる。膵臓などの繊細な組織については、外科手術用糊を用いることができ、パッチグラフトが部分的に十二指腸の上におよび部分的に膵臓の上に配置される場合、十二指腸には縫合を、膵臓には外科手術用糊を使用する。グラフトの付着後、近くの組織および器官による癒着を最小限にするために、２００μＬのＨＡハイドロゲル（粘弾性＝２００～３００Ｐａ）によりパッチグラフトを被覆する。

器官を腹腔内に戻す。３．０ポリグリコール繊条糸を用いて、切開を筋／腹膜層については連続的な縫合パターンで、皮膚については不連続な縫合パターンで閉じる。

手術後のケアとモニタリング。外科処置が完了した後、正常な体温を維持するために、加熱パッド上に置かれかつ平坦な紙のベッドに覆われたケージからなる回復区域内に、マウスを置く。術後の低血糖を避けるため、栄養補助剤（ＤｉｅｔＧｅｌＲｅｃｏｖｅｒｙ、ＣｌｅａｒＨ_２Ｏ社から注文入手）を、湿らせた食餌をケージの底部に置くことによって与える。標準齧歯類食ペレットを軟らかくなるまで水に浸すことによって、湿らせた食餌を調製する。流体支持（ｆｌｕｉｄｓｕｐｐｏｒｔ）は、湿らせた食餌および随意の水投与によって供給する。ブプレノルフィンを、鎮痛剤（０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇ）として、術後３日間、１日２回使用する。実験全体の追跡中、創傷からの液体または膿汁の分泌を含めた感染の可能性のある兆候の発生について、またはグルーミング行動および活性レベルの低下、食欲の低下ならびに体重減少によって特徴付けられる身体的悪化について、マウスを観察する。

実施例５：糖尿病性ＮＲＧ／Ａｋｉｔａマウスにおいて、生着したＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣは急速に高血糖を逆転させる
この例では、糖尿病の治療のためのパッチグラフトの使用を検討した。

マウスモデル。この例では、二つのマウスモデル、ＡｋｉｔａマウスおよびＮＲＧ／Ａｋｉｔａマウスを使用した。ＤＢＡバックグラウンドのＡｋｉｔａマウス（ＤＢＡ－ＡｋｉｔａＩｎｓ２Ａｋｉｔａ）は、最近記載されたＩ型糖尿病のマウス突然変異モデルである。糖尿病は、インスリン２のミスフォールディングに起因する選択的な膵臓β細胞の毒性および枯渇の結果である。Ａｋｉｔａ自然突然変異（Ｉｎｓ２Ａ^{Ａｋｉｔａ}）についてヘテロ接合性のマウスは、生育可能かつ繁殖可能なマウスである。それらは３～４週齢頃に発症する高血糖症、低インスリン血症、多飲症、および多尿症を有する。糖尿病性合併症コンソーシアムの動物モデル（ＡＭＤＣＣ）によって実施された研究では、ＤＢＡ／２Ｊ系統が特に糖尿病性腎症性合併症を発症しやすいことが示された。したがって、Ｉ型糖尿病のこのモデルの利点は、早期発症型の進行性の機能的および構造的な糸球体損傷があることと、糖尿病が自然発生的であるという事実である。

ＮＲＧ／Ａｋｉｔａマウスは、Ａｋｉｔａマウスの遺伝子欠損を有するように遺伝子改変されている免疫不全マウスである。この二つのマウスモデルの繁殖対をＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、メイン州）から注文入手し、ＵＮＣでコロニーを樹立するために使用した。８週齢のマウスをパッチグラフト試験に使用し、約１カ月間維持した後、マウスを安楽死させた。

パッチグラフトの投与と結果。パッチグラフトを、実施例１に記載されるように作製した。パッチグラフト手術では、細胞を含有するパッチグラフトを、実施例４に記載されるようにマウスの膵臓に投与した。対照では、グラフト生体材料を含むが細胞を含まずに外科手術を行った（例えば、グラフト生体材料のみで処置したマウス）。

手術後、パッチグラフトで処置したマウス、グラフト生体材料のみで処置したマウス、および未処置マウス（例えば、パッチグラフトもグラフト生体材料も受けなかったマウス）から血糖値を得た。パッチグラフトで処置したマウスは、生体材料のみで処置したマウスおよび未処置のマウスと比較して、血糖値の漸減を示した。この値の低下はパッチ移植の１週間後まで有意であり、その影響は最大３～４週間持続し、その後、マウスを安楽死させた。動物での手術の３日後から、２日おきにグルコース計を用いて血糖値を動的にモニタリングし、それぞれを５時間の絶食後に１回行った。その結果、パッチグラフトで処置した糖尿病マウスにおいて、高血糖が約７～１０日の間に軽減され、数匹のマウスが３週間以内に正常血糖に補正されたことが示された（図１５Ａ、三角形）。未処置の糖尿病マウス（図１５Ａ、円）でも生体材料のみで処置した糖尿病マウス（図１５Ａ、正方形）でも、高血糖症のそのような軽減は観察されなかった。さらに、血糖症の段階的な低下が、インスリン分泌を標示するＣ－ペプチドの血清レベルの有意な上昇と相関することが見出された（図１５Ｂ、７日目、１４日目、および２１日目の３番目のカラムを参照、それらはパッチグラフトで処置した糖尿病マウスに対応する）。マウス血清Ｃ－ペプチドレベルは、未処置の糖尿病マウス（図１５Ｂ、０日目、７日目、１４日目、および２１日目の１番目のカラム）、生体材料のみで処置した糖尿病マウス（図１５Ｂ、０日目、７日目、１４日目、および２１日目の２番目のカラム）、および０日目にパッチグラフトで処置した糖尿病マウス（図１５Ｂ、０日目の３番目のカラム）では最小であった。

血清インスリンレベルもまた、パッチグラフトで処置した糖尿病マウスで徐々に増加した（図１５Ｃ、２１日目および２８日目の３番目のカラム）。血清インスリンレベルは、未処置の糖尿病マウス（図１５Ｃ、２１日目および２８日目の１番目のバー）でも生体材料のみで処置した糖尿病マウス（図１５Ｃ、２１日目および２８日目２番目のカラム）でも増加しなかった。

腹腔内グルコース耐性試験（ＩＰＧＴＴ）も実施し、超生理学的グルコース刺激インスリン放出を評価した。このグルコーススパイクの測定値を、その後一定期間にわたって評価し、血漿グルコースの増加に対するインスリンの応答を決定した。非糖尿病マウス（正常なマウス対照、図１５Ｄ、三角形）と比較すると、生体材料のみで処置した糖尿病マウス（図１５Ｄ、円）は、高い基礎血糖と、持続的な高血糖を伴うグルコース耐性試験での変化とを示した。これに対し、細胞を含有するパッチグラフトで処置した糖尿病マウス（図１５Ｄ、正方形）は、非糖尿病対照マウス（図１５Ｄ、三角形）に比べて、正常（またはほぼ正常）な基礎血糖値と、ＩＰＧＴＴへの応答とを示した。このデータは、パッチグラフトが、どのようにこれらの従来の糖尿病マウスにグルコーススパイクを許容および管理する能力をもたらしたかについて、追加的な証拠を提供する。２４０分以内にオルガノイド移植マウスにおいて正常血糖へ完全な復帰があったことは、ＢＴＳＣ細胞が超生理学的なグルコーススパイクに応答する注目すべき能力があることの顕著な証拠である。しかし、高血糖症の補正は、非糖尿病対照マウスで観察された補正よりも有意に遅かった。

図１６Ａ～図１６Ｂ～図１８Ａ～図１８Ｂでは、ＤＳ－ｒｅｄマウス由来のパッチグラフトを有するＡｋｉｔａ／ＮＲＧマウスから得た膵臓切片の画像が示されている。これらの切片をインスリン（図１６Ａ～図１６Ｂ）またはＮＧＮ３（図１７Ａ～図１７Ｃおよび図１８Ａ～図１８Ｂ）について染色した。ドナー細胞を、ＤＳｒｅｄ染色によって可視化した際の図１８Ａ～図１８Ｂに赤色で示した。

実施例６．野生型仔ブタの膵臓に外科的に付着させたブタＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを含有するパッチグラフト。
この例では、トランスジェニックブタ由来のＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣオルガノイドを含むパッチグラフトの移植を、野生型ブタの膵臓上に行った。

ブタＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを含有するパッチグラフトを、野生型仔ブタの膵臓に繋ぎ合わせて、１週間後に評価した。ＧＦＰ＋ドナー細胞は、１週間以内に生着し、膵臓全体に広く分散しているのが見出された（図１９Ａ～図１９Ｂ～図２１Ａ～図２１Ｃ）。第一週の時点で、生着した細胞は島と腺房細胞との両方に成熟していた。しかし、核バイオマーカーであるＧＦＰは、島の核に観察されたものの、腺房細胞の細胞質に観察された。ＧＦＰが後の時点で、肝臓での生着により起こる際に核に安定するのか否かを、評価する試験が継続中である。

図１９Ａ～図１９Ｂ～図２１Ａ～図２１Ｃでは、緑色の細胞は、島であっても腺房細胞であっても、ドナー細胞である。切片をインスリン（赤色）に対しても染色して、青色核を有する赤色が宿主の膵島となるようにするとともに、赤色／紫色の核および黄色がかった細胞質を有するものが膵島におけるドナー細胞由来ベータ細胞となるようにした。インスリン、グルカゴン、ＧＦＰ、およびアミラーゼを検出するために使用される抗体を以下の表に示す。

トランスジェニックブタ由来のＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣをグラフト移植されているブタ膵臓の免疫蛍光染色を図１９Ａ～図１９Ｂに示す。インスリンに対する免疫蛍光染色は赤色として示され、ＧＦＰは緑色として示される。移植後７日目に、グラフトの領域を採取して分析した。核はＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジン－２’－フェニルインドールジヒドロクロリド）により染色され、青色を呈した。ＧＦＰ＋細胞は、Ｈ２Ｂヒストンに連結された導入遺伝子のために本来は緑色であったが、その緑色の強度は、緑色蛍光プローブに結合されたＧＦＰに対する抗体を用いて染色することによって増強された。多数のＧＦＰ＋ドナー由来細胞が、パッチグラフトが配された領域の近傍に可視である。膵島ベータ細胞の特徴であるインスリン発現を、赤色蛍光プローブに結合された抗インスリン抗体により識別した。内因性（宿主）島ベータ細胞は赤色に見え、膵臓の上部に明瞭である。ドナー由来ベータ細胞は、青色（ＤＡＰＩ）と緑色（ＧＦＰ）とのマージに由来する黄色がかった核と、パッチグラフトの配置部位の近位の膵臓下部におけるインスリンの染色に由来する赤色／オレンジ色の細胞質とともに見える。この低倍率の画像は、膵臓への生着の程度、ならびに十二指腸の粘膜下領域への生着、ブルンネル腺の位置（肝臓および膵臓の器官形成に寄与する細胞のネットワークの開始点であると推定される）を明示する。

同じ組織ブロックからの連続切片におけるアミラーゼおよびＧＦＰの免疫蛍光染色を図１９Ｂに示す。アミラーゼ（緑色）は、主に膵腺房組織で、ならびに粘膜層および十二指腸の内腔で検出される。インスリン（赤）はアミラーゼ（緑）と重複しない。この染色は、図１９Ａの染色と組み合わせると、ＧＦＰ＋ドナー由来細胞の大部分が膵腺房様の運命に分化決定されることを示唆している。

ＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣパッチグラフト移植（移植後７日目）の３頭のレシピエントから得た膵組織切片におけるインスリンおよびＧＦＰの免疫蛍光染色を、図２０Ａ～図２０Ｃに示す。ＧＦＰ＋細胞は、全てのレシピエントにおいて、膵臓の実質で、およびパッチグラフト部位の近傍で観察された。特に、ＧＦＰ＋細胞は、パッチ材料から数ミリミターの距離で出現し、レシピエント膵臓の実質に十分に組み込まれているように見えた。パッチ材料（ＳＥＲＩｓｉｌｋ）は、ある程度の蛍光を異なるチャネルで呈し、移植後７日目に依然として可視である。

図２１Ａ～図２０Ｃは、ＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣパッチグラフトの移植の７日後に、膵臓における内因性（宿主）島ベータ細胞（インスリン＋／ＧＦＰ－：赤色の細胞質）およびドナー由来の島ベータ細胞（インスリン＋／ＧＦＰ＋：黄色～橙色の細胞質）が共存していることを明示する。ドナー由来膵島ベータ細胞および内因性（宿主）膵島ベータ細胞が、すべての例で観察された。ＧＦＰ＋細胞の大部分は、膵腺房細胞の表現型と一致する表現型を呈した。管構造を形成するように組織化されたＧＦＰ＋細胞を、図２１Ａの下部に見ることができる。

実施例７．ストレプトゾシン（ＳＴＺ）によって動物に誘発された糖尿病を治療するためのＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトの使用
この実施例は、ＳＴＺを用いた処理により糖尿病とされたマウスにパッチグラフトを投与することによって糖尿病を治療するための、例示的な方法の詳細なプロトコールを記述する。

動物のケアおよび飼育。８～１４週齢のＣ５７ＢＬ／６（ＪａｘＳｔｏｃｋ０００６６４）、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｊａｘｓｔｏｃｋ０００６５１）、およびＤｓＲｅｄ．ＭＳＴＢ６（ＪａｘＳｔｏｃｋ００６０５１）を標準ケージに収容し、１２時間／１２時間の明暗サイクルで維持し、標準齧歯類食を随意に給餌する。

８～１４週齢の免疫不全ＮＳＧマウス（ＪａｘＳｔｏｃｋ００５５５７）を、１２時間／１２時間の明暗サイクルで無菌環境に収容し、オートクレーブ食を随意に給餌する。

ＤＳＲｅｄ．ＭＳＴＢ６マウスを、島およびＢＴＳＣ／ＥＬＭＣのドナーとして使用する。

Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、およびＮＳＧマウスをレシピエントとして使用する。

１４日間の糖尿病の導入。２５０ｍｇ／ｋｇ用量のストレプトゾトシン処理を介して、レシピエント予定体に糖尿病を誘発する。最初の注射後、血糖値をモニタリングし、血糖が３日間連続で＞３５０ｍｇ／ｄＬであることが見出される場合、動物は糖尿病とみなされる。稀なケースとして、ストレプトゾトシンの初回用量は、結果として部分的にのみ奏功する（例えば、血糖値が３日間連続で＞３５０ｍｇ／ｄＬに達しない）場合があるため、そのような動物は、ベータ細胞の枯渇と持続的な高血糖症の誘発とを完遂するために追加投与（複数可）を受ける。ストレプトゾトシン処置は最大３回まで反復し、各注射は３日間空けて行う。ストレプトゾトシンで処理された動物の９５～１００％は、糖尿病を発症するものと予想される。

ＬＰインスリンペレット皮下に配して、糖尿病動物を維持する。インスリンペレットは、＋１５日目にパッチグラフト移植後に除去される。

１日目：ヒアルロン酸（ＨＡ）ハイドロゲルを、２０％ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）リンカー溶液と組み合わせた。軟質ＨＡゲル成分を混合した後、約５分間ゲル化させ、次いで、ＢＴＳＣ／ＥＬＭＣオルガノイド（１×１０^５個）または島（２０００ＩＥＱ）を加え、ゲル化をさらに３０分から３時間継続させる。これを、より剛直なヒアルロナン層を含有する予め作製したバッキングの上に加える。これを１日前に調製し、空気－液体界面にて３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で培養することにより、ゼラチンを一晩で完成させた。

作業区域の準備。術前に手術器具をオートクレーブする。手術には適切な保護カバーを着用する。手術作業区域で使用する複数セットの滅菌手袋を利用可能とする。全体の外科処置は、環境汚染を最小限にするために層流キャビネット内で実行する。適切な無菌的手法を用いて、必要な供給品を、調製区域、外科手術区域、および回復区域で組み立てる。温度３８℃の加熱パッドを、手術中の温度安定化のために準備する。手術は、手術顕微鏡を使用して実施する。ホットビーズ滅菌器などの器具滅菌器を、外科処置の合間に器具を滅菌するために使用する。平坦な紙のベッドで覆った清潔なケージからなる回復区域を準備する。

手術用の動物の準備。一連の移植は性別不一致とする。すなわち、雄ドナー由来の細胞を雌レシピエントに移植し、Ｙ染色体の追跡および蛍光追跡の確認を可能にする。

同系背景におけるＤｓＲｅｄ．ＭＳＴＢ６細胞のパッチグラフト移植については、８～１４週齢のＣ５７ＢＬ／６レシピエントマウスを使用する。

同種背景におけるＤｓＲｅｄ．ＭＳＴＢ６細胞のパッチグラフト移植については、８～１４週齢のＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウスを使用する。

ヒト細胞のパッチグラフト移植については、８～１４週齢の免疫不全ＮＳＧレシピエントマウスを使用する。

マウスを秤量し、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の必要用量を計算する。マウスを、１００ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射により麻酔する。随意運動の緩徐な消失および筋弛緩を観察することによって、適切な麻酔を評価する。反射の喪失を、爪先をつまむことによって調べる。麻酔下の眼の乾燥を防ぐために、眼軟膏を塗布する。代替として、吸入を介したイソフルラン２％を用いて、マウスを麻酔してもよい。

手術部位の準備。毛皮をシェービングによって腹部（約２．５ｃｍ×１．５ｃｍの範囲）から除いた。胸郭および腹部を、防腐性クロルヘキシジン溶液により消毒する。シェービング範囲を、クロルヘキシジン溶液に浸したガーゼを用いて消毒した後、アルコール溶液により拭き、再びクロルヘキシジン溶液を適用する。腹部域の準備した外科手術部位が手術担当者に対し上向きに向くように動物を仰向けに置くことによって、外科手術区域内に動物を配置し固定する。滅菌作業域を作り出すために、消毒された腹部域を露出させておく開口を有するとともに身体の残り部分を覆う防水外科手術用ドレープを用いて、マウスを覆う。マウスを、処置前に麻酔深度についてモニタリングする。

膵臓の表面上にパッチを固定。上部正中線切開は、滅菌外科用ブレードを用いて、剣状突起から臍まで延ばして皮膚に行う。皮膚の切開を、剣状突起から上肢に向かって各方向に１ｃｍ延ばす。この切開を、両方向に臍から下肢に向かって各方向に１ｃｍ延ばす。上腹部四区分を露出させるために、下にある白腺と腹膜とを、滅菌はさみまたはメスを用いて分離する。切開を保持クリップにより分け広げる。内臓の乾燥を防ぐために、内臓に定期的に滅菌０．９％塩化ナトリウムを振りかける。滅菌ピンセットまたはスワブを使用して、胃を引き上げ、腸を引き下げ、脾臓および膵臓の脾葉（尾部領域）を露出させる。ＨＡゲルに包埋された細胞を充填したパッチ片を、培養ディッシュ中の新鮮なＫｕｂｏｔａ培地に浸漬する。ゲル側を膵臓に面するように配向する（このパッチはバンドエイドに類似し、ゲルは片側のみにある）。ゲル側が膵臓に接触するように、パッチを膵臓の本体の表面に置く。二つのパッチの隅を、外科用接着剤（ＰａｔｔｅｒｓｏｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ，Ｄｅｖｅｎｓ，ＭＡ）により固定する。器官同士の癒着を最小限にするために、パッチを２００μｌの２×ＨＡハイドロゲルにより被覆する。器官を腹腔内に戻す。３．０ポリグリコール繊条糸を用いて、切開を筋／腹膜層については連続的な縫合パターンで、皮膚については不連続な縫合パターンで閉じる。

手術後のケアとモニタリング。外科手術処置を完了した後、マウスを回復区域に置く。回復区域は、正常な体温を維持するために、加熱パッド上に置かれかつ平坦な紙のベッドで覆われたケージからなる。術後の低血糖を避けるため、栄養補助剤（ＤｉｅｔＧｅｌＲｅｃｏｖｅｒｙ、ＣｌｅａｒＨ_２Ｏ社から注文入手）を与えるものとし、標準齧歯類食ペレットを軟らかくなるまで水に浸し、湿らせた食餌をケージの底部に置くことによって与える。流体支持（ｆｌｕｉｄｓｕｐｐｏｒｔ）は、湿らせた食餌および随意の水供給によって供給する。ブプレノルフィンを、鎮痛剤（０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇ）として術後３日間、１日２回使用するか、または１回注射で７２時間作用するＳＲバージョンとして使用する。実験全体の追跡中、創傷からの液体または膿汁の分泌を含めた感染の可能性のある兆候の発生について、またはグルーミング行動および活性レベルの低下、食欲の低下ならびに体重減少によって特徴付けられる身体的悪化について、マウスを観察する。クラバモックスまたはバイトリルなどの予防抗生物質を、手術後最大１４日間、飲料水中に配する。

Claims

細胞を、それを必要とする対象の固形器官に生着させる方法であって、
パッチグラフトを固形器官に接触させること；
ここで、前記パッチは、第一の粘弾性特性を有する生体材料に組み込まれる上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含み、前記生体材料が、前記上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部を、前記固形器官の前記細胞の間に生着させるのを促進する、と
前記上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部が、前記固形器官の前記細胞の間に生着していることを明示することと、を含む方法。
前記明示することが、前記固形器官からの分泌のレベル、または前記固形器官の代謝効果を、前記対象から得られた生体試料中で測定して、前記上皮細胞の少なくとも一部が前記固形器官の前記細胞の間に生着していることを明示することを含む、請求項１に記載の方法。
細胞を、それを必要とする対象の固形器官に生着させる方法であって、
パッチグラフトを固形器官に接触させること；
ここで、前記パッチは、第一の粘弾性特性を有するハイドロゲル層に組み込まれる上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含み、前記ハイドロゲルが、前記上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部を、前記固形器官の外表面を通って前記パッチから遊走させるのを促進する、と、
前記上皮細胞、間葉系細胞、またはその両方の少なくとも一部が、前記固形器官の外表面を通って遊走していることを明示することと、を含む方法。
前記明示することは、前記遊走細胞のもたらす前記対象における生理学的効果を標示するパラメータまたはパラメータの変化を測定することを含む、請求項３に記載の方法。
前記パッチグラフトが、前記上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部が前記固形器官へ遊走するのを促進するバッキングをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部が、前記固形器官の実質的な幅にわたって遊走し、前記固形器官全体にわたって分布する、請求項５に記載の方法。
前記固形器官が内胚葉器官である、請求項１に記載の方法。
前記固形器官が、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、ならびに前立腺および膣の泌尿生殖器洞領域を含む内胚葉器官である、請求項１に記載の方法。
前記内胚葉器官が肝臓を含み、生着がグリソン鞘のリモデリングを伴う、請求項８に記載の方法。
（ｉ）生着した上皮細胞および間葉系細胞と、（ｉｉ）宿主細胞との組み合わせをさらに生じさせる、請求項８に記載の方法。
機能性肝実質細胞を生じさせる、請求項８に記載の方法。
前記実質細胞が肝細胞および胆管細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
前記内胚葉器官が膵臓を含み、生着が前記移植部位近くの膵被膜および膵組織のリモデリングを伴う、請求項８に記載の方法。
機能性膵細胞を生じさせる、請求項１３に記載の方法。
前記機能性膵細胞が、腺房細胞および膵島を含む、請求項１４に記載の方法。
前記膵臓が、インスリン、ｃ－ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つを増加したレベルで分泌する、請求項１４に記載の方法。
前記膵臓が、血糖値の減少という代謝効果を示す、請求項１４に記載の方法。
前記膵臓が、グルコース耐性の増加という代謝効果を示す、請求項１４に記載の方法。
前記膵臓が、消化酵素または重炭酸塩流体を増加したレベルで分泌する、請求項１４に記載の方法。
前記消化酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項１９に記載の方法。
前記膵臓によって分泌される消化酵素に由来する代謝産物のレベルの増加をもたらす、請求項１４に記載の方法。
前記消化酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、エラスターゼ、またはそれらの組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
消化の改善をもたらす、請求項２１に記載の方法。
前記肝臓が、尿素、胆汁酸、リン脂質、リポタンパク質、ビリルビン、重炭酸塩に富む流体、または血液凝固因子を分泌する、請求項１１に記載の方法。
前記対象から得られた生体試料が、コレステロール、血糖、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、アンモニア、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ、またはＬ－乳酸脱水素酵素のうちの少なくとも一つのレベルの減少を示す、請求項４に記載の方法。
前記パッチが、前記上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含有する前記ハイドロゲルを覆って配置されたバッキングを含む、請求項１に記載の方法。
前記バッキングが、前記ハイドロゲル層を前記宿主の器官に繋ぐために使用される、請求項２６に記載の方法。
前記上皮細胞と間葉系細胞のうち少なくとも一つ、またはその両方が初期系譜段階細胞である、請求項１に記載の方法。
前記初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）が、血管芽細胞、内皮の前駆体、星状細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項２８に記載の方法。
前記初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）、ＥＬＳＭＣ、またはその両方が、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する、請求項２８に記載の方法。
前記上皮細胞が成熟し、前記間葉系細胞がＥＬＳＭＣである、請求項１に記載の方法。
対象の疾患、障害、または機能不全のある固形器官の機能性を導入、回復、増加、または改善する方法であって、上皮細胞および間葉系細胞の生着を促進する条件下で、前記疾患、障害、または機能不全のある固形器官を、前記上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含むパッチグラフトに接触させることと、前記疾患、障害、または機能不全のある固形器官の機能性の導入、回復、増加、または改善を明示することと、を含む、方法。
前記明示することが、前記対象から得られた生体試料において、分泌または代謝の産物または効果のレベルを測定することを含む、請求項３２に記載の方法。
前記上皮細胞と間葉系細胞との混合物の少なくとも一部が、前記宿主器官の前記細胞間に分布していることを明示することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
前記パッチグラフトの露出表面が、前記パッチグラフトの近傍の器官および組織への前記パッチグラフトの癒着を阻害する被覆を含む、請求項３２に記載の方法。
前記固形器官が内胚葉器官を含む、請求項３２に記載の方法。
前記内胚葉器官が、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、または前立腺もしくは膣の泌尿生殖器洞由来の領域を含む、請求項３６に記載の方法。
前記固形器官が膵臓を含み、インスリン、ｃ－ペプチドグルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つの前記分泌レベルの増加が測定される、請求項３３に記載の方法。
前記固形器官が膵臓を含み、血糖値の低下が測定される、請求項３２に記載の方法。
前記固形器官が膵臓を含み、グルコース耐性の増加が明示される、請求項３２に記載の方法。
前記固形器官が膵臓を含み、消化酵素または重炭酸塩流体のレベルの増加が明示される、請求項３２に記載の方法。
前記消化酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼを含む、請求項４１に記載の方法。
前記固形器官が膵臓を含み、前記膵臓によって分泌される消化酵素に由来する産物のレベルの増加が測定される、請求項３３に記載の方法。
前記消化酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、ペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ゼラチナーゼ、またはエラスターゼを含む、請求項４３に記載の方法。
前記固形器官が膵臓を含み、消化の改善が明示される、請求項３２に記載の方法。
前記固形器官が肝臓を含み、分泌が尿素、胆汁酸、リン脂質、リポタンパク質、ビリルビン、重炭酸塩に富む流体、血液凝固因子、またはそれらの組合せを含む、請求項３３に記載の方法。
前記固形器官が肝臓を含み、代謝効果は、コレステロール、血糖、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、アンモニア、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ、またはＬ－乳酸脱水素酵素のうちの一つまたは複数のレベルの低下である、請求項３３に記載の方法。
前記固形器官が肝臓を含み、前記対象が１型チロシン血症に罹患している、請求項３２に記載の方法。
代謝効果が、チロシンまたはアルファ－フェトタンパク質のレベルの減少である、請求項３３に記載の方法。
疾患、障害、または機能不全のある固形器官を有することに少なくとも部分的に起因する病態と診断された対象を治療する方法であって、
（ｉ）前記疾患、障害、または機能不全のある固形器官を、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を含むパッチグラフトに接触させることと、
（ｉｉ）前記上皮細胞および間葉系細胞が、前記宿主固形器官の細胞に遊走し、前記細胞間に分布することを可能にすることと、
（ｉｉｉ）前記疾患、障害、または機能不全のある固形器官の負の影響が、前記治療対象において軽減されていることを明示することと、を含む、方法。
前記明示することが、前記対象から得られた生体試料において、分泌または代謝の産物または効果のレベルを測定することを含む、請求項５０に記載の方法。
前記遊走および分布の段階が、前記疾患、障害、または機能不全の軽減をもたらす、請求項５０に記載の方法。
前記固形器官が内胚葉器官である、請求項５０に記載の方法。
前記内胚葉器官が、肝臓、膵臓、腸、肺、胆管、胸腺、甲状腺、副甲状腺、および前立腺または膣の泌尿生殖器洞領域を含む、請求項５３に記載の方法。
前記内胚葉器官が膵臓であり、前記対象が糖尿病に罹患している、請求項５３に記載の方法。
インスリン、ｃ－ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドのうちの少なくとも一つのレベルの増加が測定される、請求項５５に記載の方法。
血糖値の低下が明示される、請求項５５に記載の方法。
グルコース耐性の増加が明示される、請求項５５に記載の方法。
前記対象が哺乳類を含む、請求項５０に記載の方法。
前記哺乳類がヒトである、請求項５９に記載の方法。
上皮細胞と間葉系細胞との混合物と、一つまたは複数の生体材料層とを含むパッチグラフトであって、前記層は少なくとも、
ａ）固形器官を接触させるための第一の内層であって、第一の粘弾性特性を呈し、上皮細胞と間葉系細胞との混合物を取り込み、前記上皮細胞および前記間葉系細胞の分泌型マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を産生する能力を支持し、前記上皮細胞および間葉系細胞の生存率および未成熟性を促進する、第一の内層と、
ｂ）任意選択的に、前記固形器官以外の方向に遊走する前記細胞に障壁を付与するバッキングであって、第二の粘弾性特性を呈する、バッキングと、
ｃ）任意選択的に、前記パッチグラフトの近傍で、内壁および／または器官を含めた体腔の内表面への前記パッチグラフトの癒着を最小限にする被覆または材料の第三の外層であって、前記粘弾性特性が、流動学的形質を測定することによって決定されてパスカル（Ｐａ）で表現される、第三の外層と、を含む、パッチグラフト。
前記上皮細胞が初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）を含み、かつ前記間葉系細胞が初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）を含むか、または前記上皮細胞と間葉系細胞が後期系譜段階であるが互いに同等の系統段階である、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記ＥＬＳＭＣが、血管芽細胞、内皮の前駆体、星状細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項６２に記載のパッチグラフト。
前記ＥＬＳＥおよび／またはＥＬＳＭＣが、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する、請求項６２に記載のパッチグラフト。
前記上皮細胞が後期系譜段階でありかつ前記間葉系細胞が初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）であるか、または前記間葉系細胞が後期系譜段階でありかつ前記上皮細胞が初期系譜段階上皮細胞（ＥＬＳＥ）である、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記第二の粘弾性特性（Ｐａで表現される）は、前記第一の粘弾性特性よりも高い値を有する、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記一つまたは複数の生体材料層がハイドロゲルを含み、前記ハイドロゲルがさらに、最小硫酸化または非硫酸化グリコサミノグリカンを含む、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記非硫酸化グリコサミノグリカンがヒアルロナンを含む、請求項６７に記載のパッチグラフト。
前記ヒアルロナンがチオール修飾ヒアルロナンを含み、ジスルフィド架橋形成によるそのゲル化がポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）の存在下で惹起される、請求項６８に記載のパッチグラフト。
前記流動学的形質が、少なくとも部分的には、ゲル化前のチオール修飾ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡの開始濃度および剛性と、チオール修飾ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡの体積の正確な比によって達成されるゲル化後のハイドロゲルの最終的な剛性によって決定される、請求項６９に記載のパッチグラフト。
前記第一の内層が、約５０Ｐａから約１５０Ｐａまでの第一の粘弾性を呈する、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記任意選択的なバッキングが、約６００から約８００Ｐａまでの粘弾性を呈するヒアルロナンハイドロゲル層を含有する、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記任意選択的な第三の外層が、約２００から約３００Ｐａまでの粘弾性特性を有するヒアルロナンハイドロゲル層を含む、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記バッキングが絹を含む、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記絹バッキングが、Ｓｅｒｉ－Ｓｉｌｋ（商標）またはＣｏｎｔｏｕｒＳｅｒｉＳｉｌｋ（商標）を含めた、足場に編み込まれたカイコガ（商標）蚕絹の精製フィブロインを含む、請求項７４に記載のパッチグラフト。
前記上皮細胞が胆樹幹細胞（ＢＴＳＣ）を含み、前記間葉系細胞が初期系譜段階間葉系細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記ＥＬＳＭＣが、血管芽細胞およびその直接の子孫、内皮細胞の前駆体、星状細胞の前駆体、またはそれらの組合せを含む、請求項７６に記載のパッチグラフト。
前記血管芽細胞がＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＶＥＧＦｒを発現するがＣＤ３１を発現しない、請求項７７に記載のパッチグラフト。
前記内皮細胞の前駆体が、ＣＤ１３３、ＶＥＧＦｒ、ＣＤ３１、およびフォン・ヴィレブランド因子を発現する、請求項７７に記載のパッチグラフト。
前記星状細胞の前駆体が、ＣＤ１４６、ＩＣＡＭ－１、アルファ平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）を発現し、ビタミンＡに対して陰性である、請求項７７に記載のパッチグラフト。
前記上皮細胞と間葉系細胞との混合物が、成熟間葉系細胞の細胞懸濁液を枯渇させることによって、任意選択的に、３７℃で組織培養ディッシュまたは表面上で約１５分から約３０分以内に付着する細胞を除去するためのパニング手順を繰り返すことによって、産生される、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記残りの細胞懸濁液の培養は、上皮細胞および間葉系細胞の自己組織化によって複数のオルガノイドが形成されるまで、低付着性ディッシュ上および無血清培地中で実施される、請求項８１に記載のパッチグラフト。
前記無血清培地が、基本培地（銅不含、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１ｎＭセレン、０．１％ウシ血清アルブミン（精製済、脂肪酸不含、画分Ｖ）、４．５ｍＭニコチンアミド、０．１ｎＭ硫酸亜鉛七水和物、５μｇ／ｍｌトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍｌインスリン、および脂肪酸不含の高度に精製されたアルブミンと複合体を形成して存在する精製遊離脂肪酸の混合物）を含む、請求項８２に記載のパッチグラフト。
前記無血清培地が、１０μｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質をさらに含む、請求項８３に記載のパッチグラフト。
前記複数のオルガノイドが、約２時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２２時間後、または約２４時間後に形成される、請求項８２に記載のパッチグラフト。
前記複数のオルガノイドが、
ａ）ＯＣＴ４、Ｓｏｘ２、Ｓａｌｌ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ５、Ｃｄｘ２、およびＢｍｉ１からなる多能性遺伝子群から選択される少なくとも一つのマーカー、
ｂ）Ｓｏｘ９、Ｓｏｘ１７、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ４アルファ、ＨＮＦＢ１、およびＯＮＥＣＵＴ２からなる内胚葉転写因子群から選択される少なくとも一つのマーカー、
ｃ）ＥｐＣＡＭ、ＮＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＣＤ４４の一つまたは複数のアイソフォーム、ＣＸＣＲ４、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）、ＣＤ４９（インテグリンＡ６）、ＣＤ２９（インテグリンＢ１）、およびインテグリンＢ４からなる幹細胞／前駆体に関連する表面マーカー群から選択される少なくとも一つのマーカー；について陽性であるＢＴＳＣを含み、
前記ＢＴＳＣは、Ｐ４５０、アクアポリン、胆汁産生に関与する酵素、アミラーゼ、および消化酵素を含めた、成熟肝細胞または膵細胞のマーカーについて陰性である、請求項８２に記載のパッチグラフト。
前記一つまたは複数の生体材料層が組換えＭＭＰを含む、請求項６１に記載のパッチグラフト。
前記一つまたは複数の生体材料層が、ＭＭＰを発現するように工学的に操作された細胞を含む、請求項６１に記載のパッチグラフト。