KR20230052666A - 기관이식용 상피세포 튜브 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 기관이식용 상피세포 튜브 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 기관이식용 상피세포 튜브는 손상 부위에 제공되어, 조직에 생착됨에 따라 기관 협착과 염증 감소를 유도할 수 있는 상피세포층을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 기관이식용 상피세포 튜브 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
현저한 의료 기술의 발달과 함께, 더 이상의 치료가 어려운 장기에 대해 타인의 장기로 대체하는 장기 이식 기술이 발달하였다. 그 대상도 피부, 각막, 신장뿐 아니라, 심장까지도 이식이 가능해졌으며, 수술 경과도 과거에 비해 현저하게 좋아졌다. 다만, 이식 수여자 수보다 이식 공여자의 수가 현저하게 적은 문제 및 면역 거부 반응 등의 문제로 인해 실제로 장기 이식 수술이 이루어지거나 성공하는 사례가 충분치 못한 실정이다.
따라서, 최근에는 인공 대체물이나 이식 수여자 자신의 세포를 배양하여 제작한 조직을 이식하는 기술이 주목받고 있다. 구체적인 예로는 인공 피부 및 배양 피부가 있으나, 합성 고분자를 사용한 인공 피부는 거부 반응이 생길 가능성이 있어, 이식용 피부로서는 적합하지 못하다는 한계점이 있다. 반면 배양 피부의 경우에는 수여자 자신의 정상 피부로부터 세포를 추출하고 이로부터 적절한 사이즈까지 피부를 배양한 것으로서, 외부 물질에 대한 거부 반응이 일어나지 않는다.
수여자로부터 채취한 세포를 배양하는 것은 유리 표면 또는 특정 물질을 코팅한 합성 고분자의 표면 상에서 수행되었으며, 이 후 트립신과 같은 단백 분해효소나 화학약품을 처리하여 용기 표면에서 분리시켜 회수되는 과정을 거친다. 그러나 이러한 효소 또는 약품 처리과정은 불순물이 포함될 가능성이 높아질 뿐만 아니라, 세포가 화학적 처리에 의해 변성 또는 손상되어 세포 본래의 기능이 손상되는 등의 문제점이 존재한다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 연구들이 지속적으로 진행되고 있다.
본 발명은 기도 상피세포를 포함하는 이식용 구조물에 관한 것으로, 상기 상피세포는 기도를 덮고 있는 세포로서, 일종의 장벽으로 기능하여 호흡기를 보호하고, 섬모운동을 통해 이물질을 제거하는 등의 중요한 역할을 수행한다. 기도 손상은 외상, 종양 절제, 만성 염증성 기도질환, 선천적 원인 등 다양한 원인에 의해 발생하는 것으로, 특히 광범위한 기도 세포의 손상은 기도의 섬유화를 통해 기도의 부분적 또는 완전한 폐쇄를 일으켜, 반복적인 수술이 요구되는 등 생명의 위협이 되는 후유증을 낳는다.
본 발명은 손상된 기도 부위에 정상 적인 기도 상피를 이식하여 기도를 재생하거나 상피세포 손상에 따른 섬유화 과정을 근본적으로 해결할 수 있는 상피세포 튜브 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 기관이식용 상피세포 튜브 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상피세포의 섬모가 내강측(lumen side)을 향하도록 지지체에서 배양하고, 분화시킨 상피세포 튜브의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 기둥형 지지체의 외주면에 위치한 상피세포 전층을 포함하고, 상기 상피세포는 섬모가 내강측을 향하도록 배향된 것인 상피세포 튜브.
2. 위 1에 있어서, 상기 상피세포 전층은 배양한 상피세포 전층을 정전기적 인력에 의해 판상의 지지체에 부착시켜 형성된 것인 상피세포 튜브.
3. 위 1에 있어서, 상기 튜브는 상기 상피세포 전층을 포함하는 판상의 지지체의 말단을 연결하여 형성된 것인 상피세포 튜브.
4. 상피세포 전층을 상피세포의 섬모가 내측을 향하도록 판상의 지지체에 전사하는 단계; 및 상기 상피세포 전층이 외주면을 향하도록 상기 판상의 지지체의 말단을 연결하는 단계;를 포함하는 상피세포 튜브의 제조 방법.
5. 위 4에 있어서, 상기 상피세포 전층은 공기-액체 계면에서 배양되어 분화된 것인, 제조방법.
6. 위 5에 있어서, 상기 배양은 상피세포의 섬모는 공기와 접촉하고, 바닥면은 배양액에 노출되어 배양되는 것인, 제조방법.
7. 위 4에 있어서, 상기 지지체 말단이 연결된 상피세포 튜브를 배양하는 단계를 더 포함하는 것인, 상피세포 튜브의 제조 방법.
본 발명의 상피세포 튜브 및 이의 제조방법은 손상 부위에 제공되어, 조직에 생착됨에 따라 기관 협착과 염증 감소를 유도할 수 있는 상피세포층을 제공할 수 있다.
도 1은 실험 설계 개략도로, 완전히 분화된 상피를 유도하기 위한 공기-액체 계면(ALI) 세포 배양 시스템에서의 배양, 분화된 기도 상피를 분리하는 과정, 이식 전 ALI 배양 배지에서 배양하는 과정 및 기도 상피가 부착된 막을 마우스 기관으로 이식하는 과정을 포함한다.
도 2는 동소성 기관 이식 과정을 보여주는 것으로, 수컷 C57BL/6 마우스의 기관을 동종 마우스에 이식하는 것으로 구체적으로는 이식편이 수여자 기관 사이에 삽입되었다.
도 3은 브러싱 기술을 이용하여 기관 상피층을 제거하는 공여자 기관을 수술하는 과정을 나타내며, 손상되지 않은 가중층 상피 및 탈-상피화된 그룹의 H&E 염색 결과를 보여준다.
도 4는 인간 기도 상피 이식은 동물의 생존을 향상시킴을 확인할 수 있는 결과로서, 이식 후 14일차의 H&E 염색 결과, 기관 내강 직경 평가, STEM101, E-cadherin, Ki-67로 염색된 기관 분절 이미지 및 HPF 당 호중구 및 대식 세포의 수를 정량화한 그래프를 나타낸다.
도 5는 이식 후 7일차의 H&E 염색된 기관 섹션 이미지, 7일차에 기관 이식 후 동물의 생존 평가, 기관 내강 직경의 평가, 기관 섹션의 면역조직화학 염색 결과, 및 HPF당 호중구 수, 대식세포의 수, STEM101 양성 세포 수 및 Ki-67 양성 세포 수를 그룹별로 계산한 결과이다.
도 6은 인간 기도 상피 이식이 섬유증을 억제함을 보여주는 결과로서, 14일차 섬모, 분비 및 p63 양성 세포의 조직학적 관찰, 그룹별 HPF당 섬모세포, 배상 세포 및 p63-양성 세포의 수를 정량화한 결과, 및 14일차 그룹별 콜라겐 강도(intensity) 백분율을 나타낸 결과이다.
도 7은 인간 기도 상피 이식이 섬유증을 억제함을 보여주는 결과로서, 7일차 섬모, 분비 및 p63 양성 세포의 조직학적 관찰, 및 그룹별 HPF당 섬모세포, 배상 세포 및 p63-양성 세포의 수를 정량화한 결과이다.
도 2는 동소성 기관 이식 과정을 보여주는 것으로, 수컷 C57BL/6 마우스의 기관을 동종 마우스에 이식하는 것으로 구체적으로는 이식편이 수여자 기관 사이에 삽입되었다.
도 3은 브러싱 기술을 이용하여 기관 상피층을 제거하는 공여자 기관을 수술하는 과정을 나타내며, 손상되지 않은 가중층 상피 및 탈-상피화된 그룹의 H&E 염색 결과를 보여준다.
도 4는 인간 기도 상피 이식은 동물의 생존을 향상시킴을 확인할 수 있는 결과로서, 이식 후 14일차의 H&E 염색 결과, 기관 내강 직경 평가, STEM101, E-cadherin, Ki-67로 염색된 기관 분절 이미지 및 HPF 당 호중구 및 대식 세포의 수를 정량화한 그래프를 나타낸다.
도 5는 이식 후 7일차의 H&E 염색된 기관 섹션 이미지, 7일차에 기관 이식 후 동물의 생존 평가, 기관 내강 직경의 평가, 기관 섹션의 면역조직화학 염색 결과, 및 HPF당 호중구 수, 대식세포의 수, STEM101 양성 세포 수 및 Ki-67 양성 세포 수를 그룹별로 계산한 결과이다.
도 6은 인간 기도 상피 이식이 섬유증을 억제함을 보여주는 결과로서, 14일차 섬모, 분비 및 p63 양성 세포의 조직학적 관찰, 그룹별 HPF당 섬모세포, 배상 세포 및 p63-양성 세포의 수를 정량화한 결과, 및 14일차 그룹별 콜라겐 강도(intensity) 백분율을 나타낸 결과이다.
도 7은 인간 기도 상피 이식이 섬유증을 억제함을 보여주는 결과로서, 7일차 섬모, 분비 및 p63 양성 세포의 조직학적 관찰, 및 그룹별 HPF당 섬모세포, 배상 세포 및 p63-양성 세포의 수를 정량화한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기둥형 지지체의 외주면에 위치한 상피세포 전층을 포함하는 상피세포 튜브를 제공할 수 있다.
상기 상기세포는 동물의 체표나 체강 및 관상 장기의 내부 표면을 덮는 조직 또는 내,외분비샘을 이루는 조직을 구성하는 세포를 말하는 것으로, 예를 들면, 손상부위에 상응하는 정상적인 조직으로부터 유래된 상피세포일 수 있는 것으로 그 종류는 제한되지 않는다. 예를 들면 손상 부위가 기도일 경우에는 바람직하게는 기도 상피세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상피세포는 세포들이 가까이 붙어있으며, 다양한 세포 연접을 통해 서로 결합되어있으며, 각 세포는 극성(polarity)이 있어, 내강과 맞닿은 자유면(꼭대기면, apical surface), 이웃 세포와 맞닿은 가쪽면(lateral surface) 및 기저막과 맞닿은 바닥면으로 세포의 표면을 구분할 수 있는 것으로, 상피세포 전층은 자유면, 가쪽면 및 바닥면을 모두 포함한 상피세포 집단을 의미한다. 상피세포의 꼭대기면은 상피와 내강이 맞닿은 면을 말하며, 일부 상피세포는 꼭대기면에 미세융모, 섬모 등의 돌출된 구조가 존재한다.
상기 상피세포는 손상조직에 이식할 때에 조직 내강과 유사한 상태로 복구하고, 조직 생착률을 높이기 위해 상피세포의 꼭대기면, 즉 섬모는 내측을 향하도록, 즉 지지체 쪽으로 배향된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상피세포는 상피조직에 효소를 처리하거나 물리적으로 분리하는 등의 당 분야에 공지된 방법으로 수득될 수 있는 것으로, 예를 들면, 트립신 또는 프로테아제 처리와 함께, 스크래핑으로 상피세포를 얻는 것일 수 있고, 또는 피부세포나 섬유세포로부터 유도한 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)로부터 분화시키거나 상피조직 오가노이드를 만들어 이로부터 수득될 수 있는 것이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상피조직은 소화기관 내벽, 기관지 내강, 비강 등 단층 원주 상피세포로 이루어진 조직일 수 있으며, 구체적으로 본 발명에서는 비강 점막일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상피세포 튜브는 상피세포 전층이 지지체에 부착되어 형성되는 것으로서, 이는 세포의 부착해서 자라려는 성질을 이용하여 당 분야에 공지된 방법으로 부착될 수 있는 것으로, 구체적으로 본 발명에서는 정전기적 인력에 의해 상피세포를 지지체에 부착시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 지지체는 상피세포를 3차원 튜브형태로 배치하기 위한 것으로, 이식 전 또는 후에는 그 소재에 따라 염증을 유발할 수 있으므로 제거가 필요할 수 있으며, 그 소재는 기존 또는 향후 개발될 다양한 재료를 이용할 수 있는 것으로, 예를 들면 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 셀룰로오스 및 그 유도체, 키틴, 키토산, 콜라겐 또는 우레탄 외에도 3D 프린팅 기술을 활용한 3차원의 스캐폴드 소재일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 상피세포 튜브는 상기 지지체를 원주형으로 말아 그 말단을 연결하는 방식으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상피세포 튜브의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 제조방법은 상피세포 전층을 상피세포의 섬모가 내측을 향하도록 판상의 지지체에 전사하는 단계; 및 상기 상피세포 전층이 외주면을 향하도록 상기 판상의 지지체의 말단을 연결하는 단계;를 포함한다.
상기 상피세포 전층 및 지지체는 전술한 바와 같다.
상기 전사단계는 상피세포가 3차원으로 배치되기 위해 지지체에 부착되기만 하면 되는 것으로, 특정한 방법에 구애받지 않으며, 구체적으로 본 발명에서는 상피세포의 섬모, 즉 꼭대기 면이 지지체쪽에 정전기적 인력으로 부착되는 방식으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 지지체의 말단을 연결하는 단계는 상피세포 전층이 부착된 지지체 양 말단이 겹쳐지도록 배치하여 수행되는 것으로, 이후 겹쳐진 양 말단의 안쪽 지지체에 부착된 상피세포는 사멸되는 것일 수 있다.
상기 상피세포 전층의 배양은 당 분야에 공지된 배양 배지, 배양 조건 및 배양 방법에 의해 수행될 수 있는 것으로, 수득한 세포가 본래의 기능을 유지하면서 분화될 수 있는 배양 조건 및 방법이라면 그 방식에는 제한되지 않는다. 예를 들면, 접착 배양, 부유 배양 또는 3차원 배양 방법에 의해 배양될 수 있으며, 세포의 일부가 공기 중에 노출되어 효과적으로 분화될 수 있다는 측면에서 바람직하게는 3차원 배양 방법인 공기-액체 계면에서 배양 및 분화되는 것일 수 있다.
상기 공기-액체 계면(ALI, Air-liquid interface) 배양법은 주로 줄기세포, 또는 비강 상피세포와 형태적, 기능적으로 유사한 특징을 갖는 세포를 배양 및 분화시키기 위한 기법으로서, 공기-액체 계면에서의 상피세포 배양은 섬모세포로의 분화를 유도할 수 있으며, 구체적으로는 상피세포의 섬모는 공기와 접촉하고 바닥면은 배양액에 노출되어 배양되는 것일 수 있는 것으로, 상피세포 분화 및 기능적인(functional) 세포를 배양할 수 있다면 그 배양방법은 제한되지 않는다.
본 발명의 상피세포 튜브의 제조방법은 상기 지지체 말단을 연결하는 단계 이후 추가적인 배양 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 추가적인 배양 단계는 상피세포 튜브의 손상조직에의 생착률을 높이기 위한 것으로, 손상조직에 이식되기 전에 이루어지는 것일 수 있으며, 배양 시간은 지지체에 부착된 세포가 안정화될 수 있는 시간이면 특정 시간에 제한되지 않으나, 예를 들면 1 내지 72시간, 2 내지 48시간, 3 내지 24시간, 4 내지 12시간, 2 내지 24시간, 3 내지 36시간일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양 방법 및 배양 조건은 상기 전술한 방법 또는 당 분야에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 방법
(1) 동물 실험
54마리의 C57BL/6 수컷 마우스 (5주령, 24-25g)는 중앙실험동물에서 구입하였으며, 모든 동물은 병원체가 없는 특정 시설에 수용되어 물과 음식을 자유롭게 이용할 수 있었다. 동물과 관련된 모든 실험은 서울대학교 동물연구소 동물관리위원회의 승인을 받았으며 동물 실험에 관한 정부 및 국제 지침을 준수하였다.
(2) 사람의 기도 상피 세포 분리 및 공기-액체 계면(ALI) 세포 배양 시스템
대조군 피험자의 비강 점막을 0.1% 프로테아제와 함께 1시간 배양한 후 상피세포를 긁어내었다. DMEM (Dulbecco modified Eagle medium)으로 워싱한 후, 세포는 기관지 상피 세포 성장 기초 배지 (Lonza, Basel, Switzerland, cc-3171, cc4175)에서 유지되었다. 비강 상피세포를 0.4μm, 0.33cm2 폴리에스테르 트랜스웰 인서트(Costar, Corning, NY)에 웰당 5 × 104 세포의 밀도로 분주하였다. ALI 배양 배지는 기관지 및 상피 세포 성장 배지 Bullet 키트 (Lonza) 및 항생제(1% 페니실린 및 스트렙토마이신) 및 항진균제(0.2% 암포테리신 B, Life Technologies, 그랜드 아일랜드, 뉴욕)가 첨가된 DMEM 배지의 1:1 혼합물로 제조되었다. ALI 배양은 완전히 분화된 가중층(pseudostratified) 상피를 유도하기 위해 14일 동안 유지되었다.
(3) 공여자 수술 (Donor procedure)
18마리의 C57BL/6 마우스를 수여(recipient) 동물로 사용했다. Avertin (400 mg/kg, Sigma-Aldrich)을 복강 내 주사하여 공여자를 안락사시켰다. 전체 기관을 노출시키기 위해 정중선 경부 절개가 수행되었다. 분기점 말단의 윤상 연골(cricoid cartilage) 아래의 기관을 절개하고 채취하였다. 전체-길이의 기관(약 10개의 연골 고리)은 4개의 연골 고리의 두 부분으로 나뉘었다. 그 다음 표본을 약 5분 동안 1x PBS에 보관한 다음 ALI 배양 배지에 밤새 보관하였다. 모든 수술 절차는 해부 현미경의 도움으로 무균 조건에서 수행되었다.
세 가지 주요 실험군 (도 2):
그룹 1. 손상되지 않은 상피가 있는 기관, 대조군으로 사용된 가중층 원주 상피가 있는 온전한 기관.
그룹 2. 마우스 기관의 탈-상피화. 기관 분절은 칫솔질 기법 (치간 칫솔, 0.4mm(SSSS), Everden)을 사용하여 탈-상피화되었다. 브러싱 기술을 사용한 탈-상피화의 효율성은 H&E 염색에 의해 검증되었다.
그룹 3. 인간의 기도 상피를 탈-상피화된 기관으로 이식. 사람 기도 상피를 이식하기 전에 브러싱 기술을 사용하여 기관 분절을 탈-상피화하였다.
극성(polarization)이 보존된 기도 상피 시트의 전달.
ALI 인서트에서 다공성 막을 제거한 다음, 얇은 유리를 사용하여 분화된 기도 상피를 부드럽게 분리하였다. 집게(focep)를 사용하여 UpCell (ThermoScientific) 지지막을 기도 상피의 상단에 배치하였다. 기도 상피가 부착된 막을 3차원 튜브형태로 마우스 기관으로 전달하여 내강에서 고정되도록 하였다. 이식된 상피는 정점 표면이 내강을 향하고 기저 표면이 탈-상피화된 기관을 향하도록 극성화되었다 (polarized). 표본을 ALI 배양 배지 내 37 ℃에서 밤새 유지하였다.
(4) 수여자 수술 (recipient procedure)- 동소성(orthotropic) 기관 이식
총 36마리의 C57BL/6 마우스를 수여 동물로 사용했다. 동물을 수술-후 기간이 다른 두 그룹 (7일 또는 14일)으로 나누고 희생시켰다. 수여자는 온전한 기관 (n=12), 탈-상피화된 기관 (n=12), 또는 인간 기도 상피가 이식된 탈-상피화된 기관 (n=12)을 받도록 무작위화되었다. C57BL/6 마우스의 기관을 이전 방법대로(Hua et al, 2010) C57BL/6 마우스에 이식하였다. 수여 동물은 Avertin(400 mg/kg, Sigma-Aldrich)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 처음에는 전체 후두기관 복합체를 시각화하기 위해 짧은 정중선 경부 절개가 수행되었다. 수여 기관을 조심스럽게 절개한 다음 후두개 아래의 세 번째 연골 사이에서 절개했다. 공여자 기관 분절은 9-0 Prolene 봉합사(Ethicon)를 사용하여 원위부 문합으로 시작하여 종단 간 이식되었다 (도3).
경부 절개는 연속적인 7-0 Vicryl 봉합사(Ethicon)로 층으로 봉합되었고, 중단된 7-0 Vicryl 봉합사로 피부를 봉합하였다. 수술 절차는 멸균 방식으로 해부 현미경의 도움으로 수행되었다. 모든 수여 동물은 면역억제를 받지 않았다.
(5) 조직학적 평가
기관 이식편은 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 위해 이식 후 7일 및 14일에 수여 마우스로부터 수확되었다. 기관 이식편을 H&E 염색 또는 면역조직화학 염색을 위해 세로 섹션으로 절단하였다. 각 이식편 부분을 실온에서 24시간 동안 4% 포르말린에 고정시켰다. 포르말린으로 고정된 조직을 파라핀에 포매하고 4μm 절편으로 절단하였다.
그룹 간의 특성을 비교하기 위해 몇 가지 염색을 수행하였다: 제조사의 지침에 따라, 일반 형태학에 대해서는 헤마톡실린 및 에오신(H&E; Sigma-Aldrich), 배상(goblet) 세포에 대해서는 주기적인 Acid-Schiff(Sigma-Aldrich) 염색, 및 콜라겐 침착을 강조하기 위한 Masson's trichrome(Sigma-Aldrich) 염색. 호중구, 대식세포 및 배상 세포의 수는 4개 HPF의 평균 수로 표시되었다. 섬유증은 Image J 소프트웨어(버전 1.52p, NIH Image processing analysis, http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 측정하였다. 기관 내강 직경의 평가를 위해 각 HPF의 적절한 영역에서 서로 다른 지점에서 최소 3번의 측정이 이루어졌으며 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
(6) 인간 기도 상피의 면역조직화학적 평가
면역조직화학은 polink-2+ 중합된(polymerized) HRP 광범위 DAB 검출 시스템(Golden Bridge International Labs., Cat. No.D41-18)을 사용하여 수행되었다. 비강 조직의 파라핀 절편을 슬라이드에 마운팅하고 실온에서 24시간 동안 건조시켰다. 섹션을 탈파라핀화하고, 재수화하고, 100mml/L 시트레이트 완충액(pH 6.0; Dako) 내 121 ℃에서 10분 동안 오토클레이브하여 항원을 복원하였다. 메탄올 내 3% 과산화수소(H2O2)로 10분 동안 처리한 후, 섹션을 실온에서 1시간 동안 3% BSA에서 배양하여 비특이적 신호를 차단하였다.
순차적으로 조직 섹션은 STEM101 (1:100; Y40400, Takara Bio), E-cadherin (1:100; #3195, Cell signaling), Ki-67 (1:100; ab15580, Abcam) 및 p63 (1:100; Cat No, Company)에 대한 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 섹션을 광범위 항체 인핸서 및 폴리머-HRP에서 배양한 다음 DAB 검출 시스템으로 염색했다. 발색을 표준화하기 위해, 모든 실험에서 diaminobenzidine 염색의 배양 시간을 고정했다. 섹션을 헤마토실린QS (Vector Laboratories Inc., Cat. No. H-3404)로 3분 동안 대조염색하고, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 탈수하고, 자일렌으로 제거하고, PermountTM 마운팅 배지 (Fisher Scientific, Cat. No. SP15-100)로 마운팅하였다. 음성 대조군은 1차 항체를 생략하여 수행되었으며, 달리 명시되지 않는 한 실험은 모두 제조업체의 지침을 따랐다. 슬라이드는 카메라(DP70; Olympus)가 장착된 광학 현미경(BX-51; Olympus)과 전체 염색된 섹션의 현미경 시야로 평가되었다. 각 조직 섹션에서 4개의 영역은 고배율 필드(HPF, 배율 ×1,000) 하 평가를 위해 선택되었으며, 2명의 검사자가 측정하였다.
(7) 면역형광 염색
면역형광 염색을 위해 4-μm 조직 절편을 탈파라핀화하고 일련의 에탄올 워싱 시리즈를 사용하여 재수화하였다. 98 ℃에서 10분 동안 시트레이트 완충액 (10mM 시트르산나트륨, pH 6.0, 0.05% Tween20)에서 탈파라핀화된 조직 절편을 가열하여 에피토프 복원을 수행하였다. 섹션을 1x PBS에서 각각 5분씩 3회 워싱하였다. 조직 절편을 0.1% Triton X-100 및 3% BSA를 함유하는 PBS로 미리 배양하고, 상응하는 1차 항체를 적용하여 4 ℃에서 밤새 방치하였다. 다음 항체 (희석 비율 표시)는 면역염색 실험에 사용하였다: E-cadherin (1:100; #3195, Cell signaling) 및 Ac-Tubulin (1:100; T6793, Sigma). 그 다음 조직 섹션을 블로킹 버퍼에 희석된 Alexa-555 및 Alexa-488 접합 이차 항체의 혼합물 (1:400; Invitrogen) 내 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 핵은 1mg/mL의 DAPI (Sigma, Cat. No. D9542)로 대조염색되었고, 슬라이드는 형광 마운팅 배지 (Vectashield, Vector Laboratories Inc, Cat. No. H-1000)로 마운팅하였다. 모든 면역형광 염색은 어두운 곳에서 수행되었으며, AxioVision 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하여 Zeiss 형광 현미경으로 이미지를 획득하였다. 1차 항체 대신 정상 혈청으로 배양한 대조군에서는 면역염색이 관찰되지 않았다.
(8) 통계 분석
Kaplan-Meier 생존 곡선을 그려 세 그룹 간의 생존 비교를 수행하였다. 그룹 간의 비교는 비-모수 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 수행되었다. 모든 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 예시 도면은 Prism 버전 8.2.0 (GraphPad Software Inc.) 및 SigmaPlot 버전 10.0 (Systat Software Inc.)을 사용하여 생성되었다.
2. 실험 결과
(1) 동소성 기관 이식 후 동물 생존
이 연구에서는, 수술 후 7일 및 14일에 기관 분절을 채취하여 분석하였다 (도 2). 현미경으로 H&E 염색을 확인한 결과, 공여자 기관이 호스트 구조로 통합되는 것을 관찰하였다 (도 4A). 그룹 1의 모든 동물은 7일차 및 14일차에 생존하였다. 관찰된 기관 내강은 좁아지지 않았고, 기관의 점막은 정상 기관과 유사하였다. 그룹 2에서는 6마리 중 4마리가 수술 후 14일 내 사망하였다. 탈-상피화된 기관의 내강은 좁아졌고, 대규모 과립 조직 증식이 관찰되었다. 그룹 3에서는, 6마리 중 1마리가 수술 후 사망하였으며, 기관 내강 직경은 그룹 1에 비해 상당히 감소하였다 (도 4A-C, 도 5A-C). 이러한 결과는 인간 기도 상피의 이식이 동물의 생존을 향상시킬 가능성이 존재함을 암시한다.
(2) 이식된 인간 기도 상피의 조직학적 관찰
온전한 상피 표면의 존재는 그룹 1의 모든 동물에서 발견된다. 면역조직화학은 E-cadherin (부착 접합 마커), KI-67 (증식 마커) 및 p63 (기저 세포 마커)의 양성 발현을 나타냈다 (도 4D). 섬모 세포와 배상 세포가 상피에서 검출되었다 (도 6A-C). 대조적으로, 그룹 2에서 탈-상피화된 기관의 내강이 좁아지는 심각한 염증 반응으로 상피 재생의 부재를 관찰하였다 (도 4D-H 및 도5D-H). 인간 기도 상피의 존재는 그룹 3에서 수술 후 최대 14일 동안 이식된 기관에서 광학 현미경으로 확인되었다. 이식된 사람의 기도 상피는 두꺼운 층으로 되어있다 (도 4D). 면역조직화학은 E-cadherin, KI-67 및 p63의 양성 발현을 보였으며, STEM101(인간 핵 마커)은 그룹 3에서만 상피에서 검출되었다 (도 4D 및 G). 면역형광 검사는 섬모 세포의 양성 발현을 나타낸다 (도 6 및 도 7). 그러나 섬모 및 점액 생성 세포의 수는 7일 및 14일에 그룹 1에 비해 유의하게 적었다 (P<0.01). 콜라겐 침착을 입증하기 위해, 이식 후 14일차에 H&E 및 트리크롬 염색된 이식 기관을 현미경으로 검사하였다. 섬유증은 그룹 2에서 이식된 기관의 관강 표면에서 유의하게 발견되었다 (도 6A 및 E). 또한, 그룹 3에서 이식된 기관의 트리크롬 염색은 그룹 2와 비교하여 14일차에 낮은 상피하 콜라겐 침착을 입증하였다. 따라서, 이러한 결과는 인간의 기도 상피 이식이 염증을 억제하고 콜라겐 침착을 예방할 수 있는 가능성이 있음을 의미한다.
Claims (7)
- 기둥형 지지체의 외주면에 위치한 상피세포 전층을 포함하고, 상기 상피세포는 섬모가 내측을 향하도록 배향된 것인 상피세포 튜브.
- 청구항 1에 있어서, 상기 상피세포 전층은 배양한 상피세포 전층을 정전기적 인력에 의해 판상의 지지체에 부착시켜 형성된 것인 상피세포 튜브.
- 청구항 1에 있어서, 상기 튜브는 상기 상피세포 전층을 포함하는 판상의 지지체의 말단을 연결하여 형성된 것인 상피세포 튜브.
- 상피세포 전층을 상피세포의 섬모가 내측을 향하도록 판상의 지지체에 전사하는 단계; 및
상기 상피세포 전층이 외주면을 향하도록 상기 판상의 지지체의 말단을 연결하는 단계;를 포함하는 상피세포 튜브의 제조 방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 상피세포 전층은 공기-액체 계면에서 배양되어 분화된 것인, 제조방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 배양은 상피세포의 섬모는 공기와 접촉하고, 바닥면은 배양액에 노출되어 배양되는 것인, 제조방법.
- 청구항 4에 있어서, 상기 지지체 말단이 연결된 상피세포 튜브를 배양하는 단계를 더 포함하는 것인, 상피세포 튜브의 제조 방법.
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