WO2021201368A1 - 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 및 이의 제조 방법 - Google Patents

네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 및 이의 제조 방법 Download PDF

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조동우
남선아
김진원
이재연
김재윤
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가톨릭대학교 산학협력단
포항공과대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a kidney organoid having a nephron-like structure and a method for preparing the same.
  • the extracellular matrix is a non-cellular, extracellular macromolecular component present in all tissues and organs, and forms a three-dimensional network.
  • ECM-derived materials are commonly used in tissue regeneration strategies in the field of regenerative medicine.
  • the ECM is composed of collagen, enzymes and glycoproteins, and provides a microenvironment for network and cell growth.
  • Cells and ECMs are interactable components within tissues, and cells modify the composition and structure of the ECM in response to physical and biochemical signals transmitted from the ECM.
  • a hydrogel derived from a decellularized tissue-specific ECM can provide a function similar to that of a naturally occurring ECM.
  • Decellularized ECM-based hydrogels are one of the major materials used in tissue engineering aimed at providing structural integrity and biochemical cues.
  • hPSC-derived renal organoids have a segmental structure including podocytes, proximal tubules and distal tubules as a nephron-like arrangement. Comparative analysis of hPSC-kidney organoids in vitro and kidney tissue in vivo showed that renal organoids recapitulate human kidney development. However, the problem of limited vascularization and immaturity of nephron-like structures still remains to be overcome.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that the vascularization and maturation of the kidney organoids can be promoted when the decellularized extracellular matrix of the kidney is cultured with kidney organoids.
  • kidney organoids having a nephron-like structure comprising culturing kidney organoids in a collagenous three-dimensional matrix containing decellularized renal extracellular matrix.
  • Another object of the present invention is a collagenous three-dimensional matrix comprising a decellularized renal extracellular matrix; And it is to provide a method for preparing a kidney organoid having a nephron-like structure, comprising the step of transplanting kidney organoids cultured in the collagenous three-dimensional matrix into the kidneys of animals other than humans.
  • Another object of the present invention is to provide a kidney organoid having a nephron-like structure, prepared by the method according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a collagenous three-dimensional matrix for preparing kidney organoids having a nephron-like structure, including decellularized kidney extracellular matrix.
  • the present invention is a nephron-like, comprising the step of culturing renal organoids in a collagenous three-dimensional matrix containing decellularized renal extracellular matrix.
  • a method for preparing a kidney organoid having a structure is provided.
  • the present invention provides a three-dimensional collagen matrix comprising a decellularized renal extracellular matrix; And it provides a method for preparing a kidney organoid having a nephron-like structure, comprising transplanting kidney organoids cultured in the collagenous three-dimensional matrix into the kidneys of animals other than humans.
  • the kidney organoid may be derived from human pluripotent stem cells, but is not limited thereto.
  • the decellularized renal extracellular matrix may be prepared from kidney tissue of animals other than humans, but is not limited thereto.
  • the decellularized renal extracellular matrix may promote angiogenesis or vascular maturation of renal organoids, but is not limited thereto.
  • the decellularized renal extracellular matrix is a tubular epithelial transporter in renal organoids, aquaporin 1 (AQP1), a distal tubular cell marker, E-cadherin (E) -cadherin), ciliary gene, PKD1 (3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1), VEGF (Vascular endothelial growth factor), podocyte marker, nephrin (NPHS1), synaptopodin (SYNPO) And may increase the expression of one or more genes selected from the group consisting of podocyte adult transcription factor (WT1), but is not limited thereto.
  • WT1 podocyte adult transcription factor
  • the three-dimensional collagen matrix may be a hydrogel (hydrogel), but is not limited thereto.
  • the transplantation may be performed in the renal subcapsular space of an animal, but is not limited to a specific region of the kidney.
  • the transplanted kidney organoid can recruit endothelial cells from the kidney of a host animal, but is not limited thereto.
  • the blood vessel of the transplanted kidney organoid may be connected to the blood vessel of the host animal, but is not limited thereto.
  • the transplantation may be made by embedding kidney organoids in a collagenous three-dimensional matrix, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a renal organoid having a nephron-like structure, prepared by the method according to the present invention.
  • the present invention provides a collagenous three-dimensional matrix for preparing kidney organoids having a nephron-like structure, including a decellularized renal extracellular matrix.
  • kidney organoids prepared from human pluripotent stem cells according to the method of the present invention can be transplanted into humans to treat nephron loss, or used as a kidney on a chip as an ex vivo kidney model. .
  • FIG. 1a to 1c are diagrams showing the properties of decellularized and decellularized ECM hydrogels of the kidney: ( FIG. 1a ) schematically showing the process for preparing decellularized ECM from pig kidney; (FIG. 1B) hematoxylin-eosin, alcian blue, mason trichrome and anti-fibronectin staining results in renal dECM; (Fig. 1c) DNA content analysis result of renal dECM.
  • FIGS. 2A-2F are diagrams showing upregulation and enhanced vascularization of podocyte and tubular markers when renal organoids are cultured in ex vivo renal dECM: ( FIGS. 2A and 2B ) for 1 week with renal dECM. The result of observation of formation of vascular structure marker PCAM1-positive cells and vascular network after culture; (FIGS. 2c to 2f) Real-time quantitative PCR results showing that vascular precursors, maturation markers including PCAM1 and MCAM, and vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) are up-regulated when cultured in renal dECM.
  • vascular structure marker PCAM1-positive cells and vascular network after culture FIGS. 2c to 2f
  • FIGS. 3A and 3B are diagrams showing enhancement of cell viability and maturity of renal organoids when cultured in ex vivo renal dECM:
  • FIG. 3A Representative confocal microscopy images of live/dead staining;
  • FIG. 3B Representative confocal microscopy images of podocytes and proximal tubule cells.
  • FIGS. 4A-4F are diagrams showing the vascular network formation and maturation of glomerular-like structures of renal organoids in vivo when transplanted with renal dECM:
  • FIG. 4A Representative images of CD31 immunohistochemical staining in transplanted grafts ;
  • FIG. 4B Representative confocal microscopy images of MECA32 in transplanted grafts;
  • FIG. 4C Representative confocal microscopy images of MECA32 and collagen IV in transplanted grafts;
  • FIG. 4D Representative confocal microscopy images comparing the expression of VEGF;
  • FIG. 4E Representative microscopic images comparing the structure of podocytes and their arrangement with the glomerular basement membrane;
  • FIG. 4f A microscopic image showing the alignment of podocytes and endothelial cells in the basement membrane of the glomerulus.
  • Renal organoids derived from human totipotent stem cells have a segmented structure comprising nephron-like arrangement of podocytes, proximal tubules and distal tubules.
  • hPSCs human totipotent stem cells
  • the extracellular matrix provides a mechanical support and biochemical microenvironment for the growth and differentiation of cells.
  • the present inventors have developed a culture system of hPSC-derived kidney organoids containing a decellularized extracellular matrix (dECM) hydrogel of the kidney, and the culture system is a gene expression for maturation of podocytes and tubular epithelial cells.
  • the present invention was completed by confirming that angiogenesis of renal organoids could be improved by inducing upregulation of
  • the present invention provides a method for preparing renal organoids having a nephron-like structure, comprising the step of culturing renal organoids in a collagenous three-dimensional matrix containing decellularized renal extracellular matrix. can do.
  • the present invention provides a three-dimensional collagenous matrix comprising a decellularized renal extracellular matrix; And it can provide a method for producing a kidney organoid having a nephron-like structure, comprising the step of transplanting kidney organoids cultured in the collagenous three-dimensional matrix into the kidneys of animals other than humans. .
  • the term “decellularization” refers to the removal of other cellular components other than the extracellular matrix from a cell or tissue, for example, a nucleus, a cell membrane, a nucleic acid, and the like.
  • the term “decellularized extracellular matrix” refers to an extracellular matrix remaining after removal of cellular components such as nuclei, cell membranes, and nucleic acids from tissues or cells.
  • organs refers to an organ-specific cell aggregate made by aggregating and recombination of cells isolated from stem cells or organ origin cells by a three-dimensional culture method. In a similar manner, they are organ analogues of organ-specific cell types that self-organize (or self-pattern) through cell sorting and spatially limited lineage commitment. Thus, organoids exhibit the native physiology of the cell and have an anatomical structure that mimics the native state of the cell mixture (including both the remaining stem cells, the proximal physiological niche, as well as the defined cell types). Stem cells can be isolated from tissue or organoid fragments.
  • Organoid-derived cells differentiate to form organ-like tissues that exhibit multiple cell types that self-organize to form structures very similar to organs in vivo. Therefore, organoids are an excellent model for studying human organs and human organ development in systems that are very similar to in vivo development.
  • nephron is a basic unit constituting the structure and function of the kidney and plays a key role in the production of urine, also referred to as a renal unit.
  • the nephron consists of the renal corpuscle (glomeruli and glomerular sac), proximal tubule (toriasis curly tubule), loop of Henle, distal tubule (distal curly tubule), and collecting duct.
  • renal organoids derived from human iPSC induced pluripotent stem cell
  • renal organoids with renal dECM were transplanted into mouse kidneys and focused on their vascularization and maturation (see Examples 3 and 4).
  • renal organoids cultured with renal dECM were tubular epithelial transporter, aquaporin 1 (AQP1), distal tubule cell marker, E-cadherin, cilliary gene, PKD1.
  • AQP1 aquaporin 1
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • NPHS1 podocyte markers
  • SYNPO synaptopodin
  • WT1 podocyte adult transcription factor
  • the kidney organoid may be prepared by differentiation from human pluripotent stem cells, but is not limited thereto.
  • stem cell is a cell capable of differentiating into various cells constituting biological tissues, and is an undifferentiated cell that can reproduce without limitation to form specialized cells of tissues and organs.
  • Stem cells are pluripotent or pluripotent cells capable of developing, which can divide into two daughter stem cells, or one daughter stem cell and one derived (transit) cell, which then becomes a mature and complete form of tissue. proliferate into cells of
  • the term "pluripotent stem cell (pluripotent stem cell)” refers to a stem cell capable of differentiating into cells constituting endoderm, mesenchymal and ectoderm as a cell in a more developed state than a fertilized egg.
  • the totipotent stem cells used in the present invention are embryonic stem cells, embryonic germ cells, embryonic carcinoma cells, or induced pluripotent stem cells ( induced pluripotent stem cells), and more specifically, embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells (iPSCs).
  • the decellularized renal extracellular matrix may be prepared from kidney tissue of animals other than humans.
  • kidney tissue obtained from pigs was used, but the present invention is not limited thereto.
  • the decellularized renal extracellular matrix may be prepared by a method comprising the following steps, but is not limited thereto.
  • the decellularized renal extracellular matrix can promote angiogenesis or vascular maturation of renal organoids.
  • the three-dimensional collagenous matrix may be a hydrogel, but is not limited thereto.
  • hydrogel may be used interchangeably with the term “hydrogel” or “hydrogel”, and is a hydrophilic polymer network that forms a three-dimensional cross-link, with a high water content It has a protein composition that is almost similar to that of natural tissue. In addition, since it does not dissolve in an aqueous environment and can be made from various polymers, it has various chemical compositions and physical properties. In addition, since it is easy to process, it can be transformed into various shapes depending on the application. The hydrogel has high biocompatibility due to its high water content and physicochemical similarity with the extracellular matrix.
  • the decellularized extracellular matrix hydrogel of the kidney according to the present invention includes extracellular matrix proteins including collagen-IV, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and isoforms thereof may have been
  • the transplantation may be made in the renal subcapsular space of an animal, but is not limited to a specific region of the kidney.
  • the transplanted kidney organoid can recruit endothelial cells from the kidney of a host animal.
  • the blood vessels of the transplanted kidney organoid may be connected to the blood vessels of the host animal.
  • the transplantation may be made by embedding kidney organoids in a three-dimensional collagen matrix, and at least one or more kidney organoids embedded in the three-dimensional collagen matrix, for example, 5 It may include, but is not limited to, at least 30 or less kidney organoids (or cell aggregates).
  • the present invention may provide a renal organoid having a nephron-like structure, prepared by the method according to the present invention.
  • the present invention may provide a collagenous three-dimensional matrix for preparing kidney organoids having a nephron-like structure, including a decellularized renal extracellular matrix.
  • Kidney tissue obtained from pigs was sliced into slices with a thickness of 0.1 to 0.3 mm, and washed three times with distilled water for 30 minutes. Next, the slices were treated with 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA) in 1M NaCl (Samjeon Chemical, Korea) for 16 hours. After that, it was washed again 3 times for 1 hour. The remaining cell components were removed by treatment with DNase at 37°C for 6-7 hours. Then, the DNase-treated tissue slices were washed with PBS (phosphate-buffered saline) for 12 hours, sterilized with 0.1% peracetic acid solution for 1 hour, and washed again with distilled water. The decellularized tissue was freeze-dried at -80°C and then used for biochemical characterization and preparation of renal dECM hydrogels.
  • Triton X-100 Sigma-Aldrich, USA
  • 1M NaCl Sudjeon Chemical, Korea
  • Preparation of renal dECM hydrogel was performed by dissolving previously decellularized kidney tissue in acetic acid solution.
  • the acetic acid solution contained decellularized kidney tissue and pepsin in a mass ratio of 10:1, and stirred for 72 to 96 hours depending on the concentration of the decellularized tissue in the solution. After dissolution was completed, it was neutralized using sodium hydroxide, and finally diluted with distilled water to make a renal dECM hydrogel of the required concentration.
  • renal dECM was prepared using 1 ml papain solution (125 ⁇ g/ml papain in 0.1 M sodium phosphate containing 5 mM Na2-EDTA and 5 mM cysteine-HCl at pH 6.5). Digested at 60° C. for 16 hours. Then, dsDNA was isolated from the digested sample using the GeneJET genomic DNA purification kit (Thermo Scientific, USA). 1 ⁇ l of the digested sample was loaded into a nanodrop (NanoDrop; Thermo Scientific), and the amount of its contents was measured.
  • CMC11 iPSC cell line was obtained from clergy University (male donor). Cells with a passage number of 30 to 60 were used, and differentiation of renal organoids was performed according to a known method (Freedman et al., 2015). Briefly, hPSCs were grown in mTeSR1 medium (Stem Cell Technologies, USA) with 10 ⁇ M Y27632 (LC Laboratories, USA) in 24-well glass plates (LabTek, Australia) coated with 3% GelTrexTM (Thermo Fisher Scientific, USA). and plated at a density of 5,000 cells/well (day -3).
  • the medium was exchanged with mTeSR1 containing 1.5% GelTrex on day -2, mTeSR1 on day -1, respectively, and on day 0, it was replaced with RPMI (Thermo Fisher Scientific) containing 12 ⁇ M CHIR99021 (Tocris, UK), and on day 1.5 It was exchanged for RPMI (Thermo Fisher Scientific) containing B27 supplement. Then, RPMI (Thermo Fisher Scientific) medium containing B27 supplement was supplied every 2-3 days to promote the differentiation of renal organoids.
  • organoids attached to 24-well plates were microdissected using a 23-gauge needle on an inverted phase-contrast microscope. Then, the obtained renal organoids were placed on 8-well chamber slides (ibidi, Germany) coated with 0.1% renal dECM, and RPMI containing B27 supplement was supplied every 2-3 days. On day 25, renal organoids were fixed.
  • organoids were fixed on day 18.
  • PBS Thermo Fisher Scientific
  • 8% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, USA
  • the immobilized organoid cultures were blocked with 5% donkey serum (Millipore, USA) containing 0.3% Triton-X-100/PBS and incubated in PBS containing 3% bovine serum albumin (Sigma-Aldrich). After overnight incubation with the primary antibody, it was washed. After that, AlexaFluor secondary antibody (Invitrogen) was treated and cultured, washed and stained with DAPI or mounted using Vectashield H-1000.
  • AlexaFluor secondary antibody AlexaFluor secondary antibody
  • kidneys and kidney organoids were fixed, embedded in wax, and transversely cut with a thickness of 4 ⁇ m using a microtome.
  • Some kidney sections and kidney organoid sections were processed and stained with H&E staining or Mason trichrome staining.
  • the other sections were processed for immunohistochemical analysis after embedding. These tissue sections were hydrated with graded ethanol and rinsed with tap water. After dewaxing, the sections were incubated by microwave for 10 minutes with a retrieval solution. It was washed with tap water and incubated with methanolic H 2 O 2 for 30 min to block endogenous peroxidase.
  • the sections were incubated with 0.5% Triton X-100/PBS solution for 15 min and rinsed with PBS.
  • the non-specific binding sites were blocked with normal donkey serum (1:10 diluted with PBS) for 1 hour, and then incubated with the primary antibody at 4°C overnight.
  • the next day after rinsing with PBS, sections were incubated in peroxidase-conjugated donkey anti-mouse or anti-rabbit immunoglobulin G (IgG; Jackson Immuno Research Lab, USA) for 2 h and in 0.05M Tris buffer (pH 7.6). washed again with For detection, sections were treated with 0.05% 3,3′-diaminobenzidine (DAB) and 0.01% H 2 O 2 . Thereafter, the slices were washed with distilled water, dehydrated with ethanol and xylene, and then mounted on Canadian balsam and observed with an optical microscope.
  • DAB 3,3′-diaminobenzidine
  • tissue and organoid sections were stained with DAB and then treated with methanolic H 2 O 2 for 30 minutes to remove the remaining peroxidase from the first staining. The sections were then incubated with other primary antibodies. After washing once with PBS, the sections were incubated with peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit IgG (Jackson Immuno Research Lab) for 2 hours.
  • Vector SG Vector Laboratories, USA
  • the slices were washed with distilled water, dehydrated with graded ethanol and xylene, and then mounted on Canadian balsam and observed under an optical microscope.
  • the following antibodies were used as primary antibodies: anti-LTL (Vector Labs FL-1321, 1:500 dilution), anti-ZO-1 (Invitrogen 339100, 1:100), anti-NPHS1 (R&D AF4269, 1: 500), anti-ECAD (Abcam, ab11512, 1:100), anti-THP (MP Bio, 55140; 1:200), anti-claudin 1 (Claudin 1; Abcam an15098, 1:100), anti-WT1 ( Abcam ab89901, 1:100), anti-CD31 (R&D Systems AF3628, 1:200), anti-laminin (Sigma-Aldrich L9393. 1:200), anti-HNA (human nuclear antibody; Merck Millipore MAB1281, 1) :100) and anti-WT1 (Santa Cruz sc-192, 1:1
  • Adhesive organoids were microdissected from 24-well plates using a 23-gauge injection needle on day 18 of differentiation, and then carefully into Eppendorf tubes containing RB using a transfer pipette. moved Harvested renal organoids were transplanted into the renal subcapsular space of 8-week-old immunodeficient male NOD/SCID mice (Jackson Laboratories, USA) with 0.1% renal dECM.
  • RNAiso Plus kit (TAKARA, Japan) according to the manufacturer's instructions.
  • Complementary DNA was synthesized using Maxima First Strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR (Thermo Fisher Scientific). Gene expression was analyzed with Power SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems, USA) using real-time polymerase chain reaction (Applied Biosystems, USA).
  • kidney organoids obtained above were inserted into kidney dECM and cultured.
  • renal dECM increased the formation of vasculature marker PCAM1-positive cells and vascular network within 1 week in renal organoids.
  • the vascular network appeared to surround the nephron-like structure extensively.
  • the area, length, and diameter of PCAM1-positive vasculature were increased in renal organoids inserted into renal dECM compared with the control group (Fig. 2b).
  • vascular precursors and maturation markers including PCAM1 and MCAM as well as vascular endothelial cadherin (VE-cadherin) when cultured in renal dECM through real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was confirmed to increase (Fig. 2c).
  • the present inventors determined the enhanced vascularization effect of incubation with renal dECM in relation to the maturation of tubular epithelial cells.
  • tubular epithelial transporter tubular epithelial transporter
  • aquaporin 1 AQP1
  • distal tubular cell marker E- cadherin (E-cadherin)
  • cilliary cilliary
  • VEGF-A Vascular endothelial growth factor A
  • the present inventors analyzed the gene expression of VEGF-A and podocytes. As a result, it was confirmed that VEGF was up-regulated in organoids cultured with renal dECM (FIG. 2e).
  • NPHS1 nephrin
  • SYNPO synaptopodin
  • WT1 podocyte adult transcription factor
  • kidney organoids transplantation of human kidney organoids into mouse kidneys enhances the formation of perfusion vasculature that promotes the maturation of glomeruli and tubular-like structures in kidney organoids. Accordingly, the present inventors considered that renal dECM upregulates VEGF expression and enhances vascularization of renal organoids. If renal organoids with renal dECM are transplanted, vascularization in the transplanted graft is accelerated. It was hypothesized that this could lead to more progressive morphogenesis in the nephron-like structure of kidney organoids.
  • MECA32+ mouse endothelial cells
  • Fig. 4b mouse endothelial cells
  • Collagen IV a major component of the basement membrane, is essential for vascular integrity, stability and functionality during development. Accordingly, the present inventors investigated the expression of collagen in transplanted kidney organoids, considering that collagen IV is the most abundant protein in renal dECM. Confocal fluorescence microscopy revealed that transplanted renal organoids with renal dECM had more increased expression of collagen IV in glomerular capillaries and peritubular capillaries compared to those without renal dECM ( Fig. 4c top).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Podocytes are cells in the outer layer of the glomerular capillary loop of the kidney. As the first step in forming urine, the glomeruli filter the blood, returning large molecules such as proteins and passing small molecules such as water, salts and sugars. Long protrusions or foot processes of podocytes wrap around capillaries and rest on the glomerular basement membrane. The foot processes are connected by a porous structure called a slit membrane.
  • FIGS. 2A to 2F In vitro studies showed that incubation with renal dECM resulted in upregulation of VEGF expression along with increased glomerular vascularization and podocyte maturation ( FIGS. 2A to 2F ). Accordingly, the present inventors investigated the degree of maturation of the glomerular-like structure when the renal dECM was transplanted together in consideration of improved vascularization after transplantation of renal organoids.
  • TEM transmission electron microscopy
  • podocytes had apical microvilli, and were immature structures intermittently arranged along glomerular basement membrane (GBM)-like tracks. .
  • GBM glomerular basement membrane
  • erythrocyte fragments were observed in the transplanted kidney organoid, indicating that capillary formation was possible ( FIG. 4E ).
  • the transplanted kidney organoids lacked a true bona fide foot process with well-organized tertiary interdigitation along the GBM.
  • Bowman's capsule of transplanted organoids was structurally similar to that of adult mice, but had a substantially thicker capsule layer.
  • kidneys of renal organoids transplanted with renal dECM had secondary or tertiary foot processes interlocking with GBM, similar to those of adult mouse kidneys (Fig. 4e).
  • GBM was well organized and aligned with podocytes and endothelial cells compared to adult kidneys of mammals (Fig. 4f).
  • transplantation of renal organoids with renal dECM under the renal capsule of immunodeficient mice promoted recruitment of endothelial cells from the kidneys of host mice and maintained vascular integrity. Also, in transplanted renal organoids with renal dECM, slit diaphragm-like structures were more organized compared to those without renal dECM.
  • the present invention induced vascularization of renal organoids and induced expression of podocytes, tubular transporters and ciliary genes by using a renal organoid culture system using renal dECM hydrogel, and developed a more mature nephron-like structure. formed. Therefore, according to the production method of the present invention, a kidney organoid prepared from human pluripotent stem cells is transplanted into a human to treat nephron loss, or it can be used as a kidney on a chip as an ex vivo kidney model. It is expected to have great industrial use value.

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Abstract

본 발명은 본 발명은 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 및 이의 제조 방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신장 dECM 하이드로겔을 이용한 신장 오가노이드 배양 시스템은 신장 오가노이드의 혈관화를 유도하고 족세포, 관상 수송체 및 섬모 유전자의 발현을 유도하였으며, 더 성숙한 네프론 유사 구조를 형성시키는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 방법에 의해 제조된 신장 오가노이드는 인간에게 이식하여 네프론 소실을 치료하기 위한 옵션으로서, 생체 외 신장 모델로 칩 상의 신장(kidney on a chip)으로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 및 이의 제조 방법
본 발명은 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 4월 1일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2020-0039625호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
세포외 기질(extracellular matrix; ECM)은 모든 조직 및 기관 내에 존재하는 비-세포성, 세포외 거대분자 성분으로서 3차원 네트워크 형태를 이루고 있다. ECM 유래 물질은 재생 의학 분야에서 조직의 재생 전략에 흔히 사용되고 있다. ECM은 콜라겐, 효소 및 당단백질로 구성되어 있으며, 네트워크와 세포의 성장을 위한 미세환경(microenvironment)을 제공한다. 세포 및 ECM은 조직 내에서 상호 작용이 가능한 구성요소이며, 세포는 ECM으로부터 전달되는 물리적, 생화학적 신호에 반응하여 ECM의 조성 및 구조를 변형시킨다.
따라서 탈세포화된(decellularized) 조직 특이적 ECM으로부터 유래된 하이드로겔(hydrogel)은 자연적으로 발생한 ECM과 유사한 기능을 제공할 수 있다. 탈세포화된 ECM 기반의 하이드로겔은 구조적 무결성과 생화학적 신호를 제공하는 것을 목표로 하는 조직 공학에서 이용되는 주요 재료 중의 하나이다.
한편, 최근 줄기세포 분야의 진보에 따라, 인간 전능성줄기세포(human pluripotent stem cell; hPSC)로부터 신장 오가노이드를 생성하기 위한 몇 가지 다른 프로토콜이 확립되었다. hPSC-유래 신장 오가노이드는 네프론-유사 배열(arrangement)로서 족세포(podocyte), 근위세뇨관(proximal tubules) 및 원위세뇨관(distal tubules)을 포함하는 분절 구조를 가지고 있다. hPSC-신장 오가노이드의 생체 외(in vitro) 및 신장 조직의 생체 내(in vivo)에서의 비교 분석은 신장 오가노이드가 사람의 신장 발달을 되풀이한다는 사실을 보여주었다. 그러나, 네프론-유사 구조의 제한된 혈관화(vascularization) 및 미성숙 문제는 여전히 극복해야 할 과제로 남아있다.
상기와 같은 문제를 극복하기 위해, 이전 연구에서는 신장 오가노이드를 동물의 신장이나 병아리의 장뇨막(chorioallantoic membrane)에 이식하는 방법, 또는 미세유체 배양 시스템으로의 생체 외 이식 방법을 개발해 왔다. 이러한 도전은 생체 외에서 신장 오가노이드의 네프론-유사 구조의 혈관화 및 성숙을 향상시키는데 각각 기여하였다. 그러나, 성체의 신장과 비교하면 혈관화 및 성숙은 여전히 불충분하여 새로운 도전이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 탈세포화된 신장의 세포외 기질을 신장 오가노이드(kidney organoids)와 함께 배양하는 경우, 신장 오가노이드의 혈관화 및 성숙을 촉진시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질에서 신장 오가노이드(organoids)를 배양하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질; 및 상기 콜라겐성 3차원 기질에서 배양되는 신장 오가노이드(organoids)를 인간을 제외한 동물의 신장에 이식하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법으로 제조된, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 제조용 콜라겐성 3차원 기질을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질에서 신장 오가노이드(organoids)를 배양하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질; 및 상기 콜라겐성 3차원 기질에서 배양되는 신장 오가노이드(organoids)를 인간을 제외한 동물의 신장에 이식하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 인간 전능성줄기세포(pluripotent stem cell) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 인간을 제외한 동물의 신장 조직으로부터 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 신장 오가노이드의 혈관 형성 또는 혈관의 성숙을 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 신장 오가노이드에서 관상피 수송체(tubular epithelial transporter), 아쿠아포린 1(AQP1), 원위세뇨관 세포 마커, E-카드헤린(E-cadherin), 섬모(cilliary) 유전자, PKD1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 족세포(podocyte) 마커, 네프린(NPHS1), 시냅토포딘(SYNPO) 및 족세포 성체 전사인자(WT1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현을 증가시킬 수 있으나, 상기 유전자에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 콜라겐성 3차원 기질은 하이드로겔(hydrogel)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 이식은 동물의 신장 피막하 공간(renal subcapsular space)에 이루어질 수 있으나, 신장의 특정 부위에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 이식된 신장 오가노이드는 숙주 동물의 신장으로부터 내피세포를 모집할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 이식된 신장 오가노이드의 혈관은 숙주 동물의 혈관과 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 이식은 콜라겐성 3차원 기질에 신장 오가노이드를 매립(embedding) 하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조된, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 제조용 콜라겐성 3차원 기질을 제공한다.
본 발명에 의하면, 신장 dECM 하이드로겔을 이용한 신장 오가노이드 배양 시스템을 이용함으로써 신장 오가노이드의 혈관화를 유도하고 족세포(podocytes), 관상 수송체 및 섬모 유전자의 발현을 유도하였으며, 더 성숙한 네프론 유사 구조를 형성하였다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 인간 전능성줄기세포로부터 제조한 신장 오가노이드를 인간에게 이식하여 네프론 소실을 치료하거나, 생체 외 신장 모델로서 칩 상의 신장(kidney on a chip)으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 내지 도 1c는 신장의 탈세포화 및 탈세포화된 ECM 하이드로겔의 특성을 나타낸 도이다: (도 1a) 돼지 신장으로부터 탈세포화된 ECM을 제조하는 과정을 나타낸 개략도; (도 1b) 신장 dECM에서의 헤마톡실린-에오신, 알시안 블루, 메이슨 트리크롬 및 항-피브로넥틴 염색 결과; (도 1c) 신장 dECM의 DNA 함량 분석 결과.
도 2a 내지 도 2f는 생체 외 신장 dECM에서 신장 오가노이드가 배양될 때 족세포 및 관상피 마커의 상향 조절 및 강화된 혈관화를 보여주는 도이다: (도 2a 및 도 2b) 신장 dECM과 함께 1주일 동안 배양한 후 혈관 구조 마커 PCAM1 양성 세포 및 혈관 네트워크 형성을 관찰한 결과; (도 2c 내지 도 2f) 신장 dECM에서 배양되는 경우 혈관 전구체, PCAM1, MCAM을 포함하는 성숙 마커 및 혈관 내피 카드헤린(VE-cadherin)이 상향 조절됨을 나타내는 실시간 정량 PCR 결과.
도 3a 및 도 3b는 생체 외 신장 dECM에서 배양시 신장 오가노이드의 세포 생존력 및 성숙도 향상을 보여주는 도이다: (도 3a) 라이브/데드 염색(live/dead staining)의 대표적인 공초점 현미경 이미지; (도 3b) 족세포 및 근위세뇨관 세포의 대표적인 공초점 현미경 이미지.
도 4a 내지 도 4f는 신장 dECM과 함께 이식될 때 생체 내에서 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성 및 사구체 유사 구조의 성숙을 보여주는 도이다: (도 4a) 이식된 이식편에서 CD31 면역조직화학 염색의 대표적인 이미지; (도 4b) 이식된 이식편에서 MECA32의 대표적인 공초점 현미경 이미지; (도 4c) 이식된 이식편에서 MECA32 및 콜라겐 IV의 대표적인 공초점 현미경 이미지; (도 4d) VEGF의 발현을 비교한 대표적인 공초점 현미경 이미지; (도 4e) 족세포의 구조 및 사구체기저막과의 배열을 비교한 대표적인 현미경 이미지; (도 4f) 사구체기저막에 족세포 및 내피세포가 정렬되어 있는 것을 보여주는 현미경 이미지.
인간 전능성줄기세포(hPSC) 유래의 신장 오가노이드는 네프론-유사 배열의 족세포(podocytes), 근위세뇨관 및 원위세뇨관을 포함하는 분절 구조를 가지고 있다. 그러나, 네프론 유사 구조의 제한된 혈관신생(vascularization) 및 이에 따른 혈관의 미성숙은 여전히 극복해야 할 과제로 남아있다.
세포외 기질(ECM)은 세포의 성장 및 분화를 위한 기계적 지지 및 생화학적 미세환경을 제공한다. 본 발명자들은 신장의 탈세포화 세포외 기질(decellularized extracellular matrix; dECM) 하이드로겔을 포함하는 hPSC 유래 신장 오가노이드의 배양 시스템을 개발하였으며, 상기 배양 시스템은 족세포 및 세뇨관 상피세포의 성숙을 위한 유전자 발현의 상향 조절을 유도하여 신장 오가노이드의 혈관신생을 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질에서 신장 오가노이드(organoids)를 배양하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질; 및 상기 콜라겐성 3차원 기질에서 배양되는 신장 오가노이드(organoids)를 인간을 제외한 동물의 신장에 이식하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “탈세포화(decellularization)”는 세포 또는 조직으로부터 세포외 기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다. 용어 “탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix)”은 조직 또는 세포로부터 핵, 세포막, 핵산과 같은 세포 성분이 제거되고 남은 세포외 기질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “오가노이드(Organoid)”는 줄기세포나 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 3차원 배양법으로 다시 응집·재조합하여 만든 장기 특이적 세포집합체를 의미하는 것으로서, 생체 내 상태와 유사한 방식으로 세포 분류와 공간적으로 제한된 계통 예정(lineage commitment)을 통해 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적인 세포 유형의 장기 유사체이다. 따라서, 오가노이드는 세포의 본래 생리학을 나타내며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함하는) 본래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가진다. 줄기세포는 조직 또는 오가노이드 단편으로부터 분리될 수 있다. 오가노이드가 생성된 세포는 생체 내(in vivo)에서 장기와 매우 유사한 구조를 형성하도록 자가-조직화된 다중 세포 유형을 나타내는 장기-유사 조직을 형성하도록 분화한다. 따라서, 오가노이드는 생체 내 발달과 매우 유사한 시스템에서의 인간 장기와 인간 장기 발달을 연구하기 위한 훌륭한 모델이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “네프론(nephron)”이란, 신장의 구조와 기능을 이루는 기본 단위로서 뇨 생성에서 핵심적인 역할을 하며, 신단위라고도 한다. 네프론은 신소체(사구체와 사구체주머니), 근위세뇨관(토리쪽곱슬뇨세관), 헨레고리, 원위세뇨관(먼쪽곱슬뇨세관), 집합관으로 구성되어 있다. 보통 신장 한 개에는 100~150만 개의 네프론이 존재하고 있다. 신장염과 같은 감염 병증으로 네프론의 기능이 마비되거나, 기타 병증으로 네프론의 수가 감소할 경우 신부전이 나타나게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 iPSC(induced pluripotent stem cell)에서 유래한 신장 오가노이드를 신장 dECM에 삽입하여 생체 외(in vitro)에서 배양하였다(실시예 2 참조). 본 발명의 다른 실시예에서는 신장 dECM을 갖는 신장 오가노이드를 마우스 신장에 이식하고 이들의 혈관화 및 성숙에 집중하였다(실시예 3 및 4 참조).
그 결과 신장 dECM과 함께 배양한 신장 오가노이드는 관상피 수송체(tubular epithelial transporter), 아쿠아포린 1(AQP1), 원위세뇨관 세포 마커, E-카드헤린(E-cadherin), 섬모(cilliary) 유전자, PKD1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 족세포(podocyte) 마커, 네프린(NPHS1), 시냅토포딘(SYNPO) 및 족세포 성체 전사인자(WT1)의 발현이 상향 조절 되었으며, 이에 따라 혈관화가 현저하게 촉진되어 신장의 네프론 구조가 성숙하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 신장 오가노이드는 인간 전능성줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 분화시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 “줄기세포(stem cell)”는, 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이며, 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래[전이(transit)] 세포로 분열될 수 있고, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 명세서에서 사용된 용어 “전능성줄기세포(pluripotent stem cell)”는 수정란보다 발생이 진행된 상태의 세포로서 내배엽, 중간엽 및 외배엽을 구성하는 세포로 모두 분화할 수 있는 줄기세포를 의미한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 전능성줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)이며, 보다 구체적으로는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포(iPSC)이다.
본 발명에 있어서, 상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 인간을 제외한 동물의 신장 조직으로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 돼지로부터 얻은 신장 조직을 이용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(a) 인간을 제외한 동물의 신장 조직을 0.01 내지 1mm 두께의 절편으로 만드는 단계;
(b) 소튬 클로라이드(NaCl)에 용해된 트리톤 X-100을 10 내지 24시간 처리하는 단계;
(c) DNase를 2 내지 10시간 처리하는 단계;
(d) 멸균하는 단계; 및
(e) 동결 건조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 신장 오가노이드의 혈관 형성 또는 혈관의 성숙을 촉진할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 탈세포화된 신장 세포외 기질에 의해 신장 오가노이드의 혈관화가 촉진되고 신장의 네프론 구조가 성숙한다는 사실을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 콜라겐성 3차원 기질은 상기 콜라겐성 3차원 기질은 하이드로겔(hydrogel)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 “하이드로겔(hydrogel)”은, 용어 “수화겔” 또는 “수화젤”과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 3차원적 가교를 형성하고 있는 친수성 고분자 망상구조로서, 높은 수분 함량을 가져 천연 조직과 거의 유사한 단백질 조성을 나타낸다. 또한, 수상 환경에서 용해되지 않고, 다양한 고분자로부터 만들어질 수 있기 때문에 여러 가지 화학적 조성과 물성을 갖는다. 또한, 가공이 용이하여 응용에 따라 다양한 형태로 변형할 수 있다. 하이드로겔은 높은 함수율(water content)과 세포외 기질(extracellular matrix)과의 물리화학적 유사성으로 인하여 높은 생체적합성을 갖는다.
본 발명에 따른 신장의 탈세포화된 세포외 기질 하이드로겔에는 콜라겐-IV, 라미닌(laminin), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan) 및 이들의 동형 단백질(isoform)을 포함하는 세포외 기질 단백질이 포함되어 있을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 이식은 동물의 신장 피막하 공간(renal subcapsular space)에 이루어질 수 있으나, 신장의 특정 부위에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 이식된 신장 오가노이드는 숙주 동물의 신장으로부터 내피세포를 모집할 수 있다. 또한, 상기 이식된 신장 오가노이드의 혈관은 숙주 동물의 혈관과 연결될 수 있다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 이식은 콜라겐성 3차원 기질에 신장 오가노이드를 매립(embedding) 하여 이루어질 수 있으며, 상기 콜라겐성 3차원 기질에 매립된 신장 오가노이드는 적어도 1개 이상, 예를 들면 5개 이상 30개 이하의 신장 오가노이드(또는 세포 응집체)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조된, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 제조용 콜라겐성 3차원 기질을 제공할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험예. 실험 재료 및 방법
1. 신장 조직의 탈세포화 및 dECM(decellularized extracellular matrix) 하이드로겔 제조
1.1. 신장 조직의 탈세포화
돼지로부터 얻은 신장 조직을 0.1 내지 0.3mm 두께의 슬라이스로 얇게 썰고, 30분 동안 증류수로 3회 세척하였다. 다음으로, 상기 슬라이스에 1M NaCl(삼전화학, 대한민국) 중의 0.5% 트리톤 X-100(Sigma-Aldrich, 미국)을 16시간 동안 처리하였다. 이후 1시간 동안 3번 다시 세척하였다. 37℃에서 6-7시간 동안 DNase를 처리하여 남아있는 세포 성분을 제거하였다. 이어서, DNase가 처리된 조직 슬라이스를 PBS(phosphate-buffered saline)로 12시간 동안 세척한 다음, 0.1% 과아세트산(peracetic acid) 용액으로 1시간 동안 멸균하고 증류수를 사용하여 다시 세척하였다. 탈세포화된 조직을 -80℃에서 동결 건조시킨 후 생화학적 특성화 및 신장 dECM 하이드로겔의 제조에 사용하였다.
1.2. 신장 dECM 하이드로겔의 제조
신장 dECM 하이드로겔의 제조는 앞서 탈세포화된 신장 조직을 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 수행하였다. 아세트산 용액에는 탈세포화된 신장 조직 및 펩신을 10:1의 질량 비율로 포함시켰고, 용액 속 탈세포화 조직의 농도에 따라 72시간에서 96시간 동안 교반하였다. 용해가 완료된 후에는 수산화나트륨을 이용하여 중성화를 시켰고, 최종적으로 필요한 농도의 신장 dECM 하이드로겔을 만들기 위해 증류수를 이용하여 희석하였다.
2. 신장 dECM의 생화학적 특성 분석
이중 가닥 DNA(dsDNA)를 정량하기 위해, 신장 dECM을 1ml의 파파인(papain) 용액(pH 6.5에서 5mM Na2-EDTA 및 5mM 시스테인-HCl을 함유한 0.1M 나트륨 포스페이트 중의 125μg/ml 파파인)을 이용하여 60℃에서 16시간 동안 소화시켰다. 그런 다음, GeneJET 유전체 DNA 정제 키트(Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 소화된 샘플로부터 dsDNA를 분리하였다. 소화된 샘플 1μl를 나노드랍(NanoDrop; Thermo Scientific)에 로딩하고, 그 내용물의 양을 측정하였다.
면역조직화학적(immunohistochemical) 분석을 위해, 생체(native) 신장 및 탈세포화된 조직을 10% 포르말린에 고정시키고, 파라핀에 포매한 다음 마이크로톰(microtome)을 이용하여 박편을 만들었다. 박편 샘플은 헤마톡실린-에오신(hematoxylin and eosin; H&E), 알시안 블루(alcian blue), 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 및 항-피브로넥틴(fibronectin)으로 염색하였다. 이어서, 염색된 샘플을 광학현미경으로 관찰하였다.
3. 신장 오가노이드의 분화
CMC11 iPSC 세포주는 가톨릭대학교(남성 기증자)로부터 입수하였다. 계대수 30에서 60 사이의 세포를 사용하였으며, 신장 오가노이드의 분화는 기존에 알려진 방법에 따라 수행하였다(Freedman et al., 2015). 간단히 말하면, hPSC는 3% GelTrex™(Thermo Fisher Scientific, 미국)로 코팅된 24-well 유리 플레이트(LabTek, 호주)에 10μM Y27632(LC Laboratories, 미국)가 함유된 mTeSR1 배지(Stem Cell Technologies, 미국)와 함께 5,000cells/well의 밀도로 플레이팅 하였다(-3일차).
배지는 각각 -2일차에 1.5% GelTrex를 포함한 mTeSR1로, -1일차에는 mTeSR1로 교환하였고, 0일차에는 12μM CHIR99021(Tocris, 영국)가 함유된 RPMI(Thermo Fisher Scientific)로 교환하였으며, 1.5일차에는 B27 보충제가 함유된 RPMI(Thermo Fisher Scientific)로 교환하였다. 그리고 이후에는 신장 오가노이드의 분화를 촉진시키기 위해 2-3일마다 B27 보충제가 함유된 RPMI(Thermo Fisher Scientific) 배지를 공급하였다.
18일째 되는 날에, 역위상차 현미경(inverted phase-contrast microscope) 상에서 24-well 플레이트에 부착된 오가노이드를 23-게이지 주사 바늘을 이용하여 미세절개(microdissection) 하였다. 그리고 나서, 수득한 신장 오가노이드를 0.1% 신장 dECM으로 코팅된 8-well 챔버 슬라이드(ibidi, 독일)에 놓고, 2-3일마다 B27 보충제가 함유된 RPMI를 공급하였다. 25일째 되는 날, 신장 오가노이드를 고정하였다.
4. 면역형광법 및 면역조직화학 분석
면역형광법(immunofluorescence) 분석을 위해, 달리 언급되지 않는 한, 오가노이드는 18일째 되는 날에 고정하였다. 고정을 위해, 동일한 부피의 PBS(Thermo Fisher Scientific) 및 8% 파라포름알데하이드(Electron Microscopy Sciences, 미국)를 15분 동안 배지에 첨가한 후, 샘플을 PBS로 3회 세척하였다. 고정된 오가노이드 배양물을 0.3% Triton-X-100/PBS를 함유하는 5% 당나귀 혈청(Millipore, 미국)으로 블로킹(blocking)하고, 3% 소혈청 알부민(Sigma-Aldrich)이 함유된 PBS 중의 1차 항체로 밤새 배양한 후 세척하였다. 그 후 AlexaFluor 2차 항체(Invitrogen)를 처리하여 배양한 다음, 세척하여 DAPI로 염색하거나 Vectashield H-1000를 이용하여 마운트(mount) 하였다.
포매 후 단일 면역조직화학(IHC) 염색의 경우, 신장 및 신장 오가노이드를 고정한 후 왁스에 매립하고 마이크로톰을 사용하여 4μm 두께의 횡 방향으로 절단하였다. 일부 신장 박편(section) 및 신장 오가노이드 박편은 H&E 염색 또는 메이슨 트리크롬 염색으로 가공 및 염색되었다. 다른 박편은 포매 후 면역조직화학 분석을 위해 처리하였다. 이들 조직 박편을 등급화된 에탄올로 수화시키고 수돗물로 헹구었다. 탈랍 후, 박편을 회수 용액(retrieval solution)과 함께 10분 동안 마이크로파에 의해 인큐베이션 하였다. 수돗물로 세척하고, 내인성 과산화효소(peroxidase) 차단을 위해 30분 동안 메탄올성 H 2O 2와 함께 인큐베이션 하였다. 다음으로, 박편을 0.5% Triton X-100/PBS 용액과 함께 15분간 배양하고 PBS로 헹구었다. 비특이적 결합 부위를 정상 당나귀 혈청(PBS로 1:10 희석)으로 1시간 동안 블로킹한 후, 4℃에서 1차 항체와 함께 밤새 인큐베이션 하였다. 다음날, PBS로 헹군 후, 섹션을 과산화효소가 컨쥬게이션된 당나귀 항-마우스 또는 항-토끼 면역 글로불린 G (IgG; Jackson Immuno Research Lab, 미국)에서 2시간 동안 인큐베이션 하고 0.05M 트리스 완충액(pH 7.6)으로 다시 세척하였다. 검출을 위해, 박편을 0.05% 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB) 및 0.01% H 2O 2로 처리하였다. 그 후, 박편을 증류수로 세척하고 에탄올 및 자일렌으로 탈수한 다음, 캐나다발삼(Canada balsam)에 장착하여 광학현미경으로 관찰하였다.
포매 후 다중 면역조직화학(IHC) 염색을 위해, 조직 및 오가노이드 박편을 DAB으로 염색한 후 메탄올성 H 2O 2로 30분 동안 처리하여 첫 번째 염색에서 남아있는 과산화효소를 제거하였다. 이어서, 박편을 다른 1차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. PBS로 1회 세척한 후, 박편을 과산화효소가 컨쥬게이션된 당나귀 항-토끼 IgG(Jackson Immuno Research Lab)와 함께 2시간 동안 배양하였다. 퍼옥시다아제의 검출을 위해, 벡터 SG(Vector Laboratories, 미국)를 발색체(chromogen)로 사용하여 회청색을 생성하였으며, DAB에 의해 생성된 갈색 염색과 쉽게 구별되도록 하였다. 박편을 증류수로 세척하고, 등급화된 에탄올 및 자일렌으로 탈수한 후, 캐나다발삼에 장착하여 광학현미경으로 관찰하였다. 1차 항체로는 다음 항체를 사용하였다: 항-LTL(Vector Labs FL-1321, 1:500 희석), 항-ZO-1(Invitrogen 339100, 1:100), 항-NPHS1(R&D AF4269, 1:500), 항-ECAD(Abcam, ab11512, 1:100), 항-THP(MP Bio, 55140; 1:200), 항-클라우딘 1(Claudin 1; Abcam an15098, 1:100), 항-WT1(Abcam ab89901, 1:100), 항-CD31(R&D Systems AF3628, 1:200), 항-라미닌(laminin; Sigma-Aldrich L9393. 1:200), 항-HNA(human nuclear antibody; Merck Millipore MAB1281, 1:100) 및 항-WT1(Santa Cruz sc-192, 1:100).
5. 전자현미경 분석
성체 마우스 신장 블록 샘플, 이식된 신장 오가노이드 및 시험관내 신장 오가노이드 샘플을 0.1M 포스페이트 완충액 중의 4% 파라포름알데하이드 및 2.5% 글루타르알데하이드를 이용하여 4℃에서 밤새 고정시켰다. 0.1M 포스페이트 완충액으로 세척한 후, 샘플을 동일한 완충액에서 1% 사산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 4℃에서 1시간 동안 후 고정(post-fixation)시켰다. 이어서, 샘플을 일련의 등급화된 에틸 알코올 용액으로 탈수시키고, 아세톤을 통해 교환한 후, Epon 812에 매립시켰다. 그 후 울트라마이크로톰(Leica Ultracut UCT, 독일)에 의해 초박형 박편(70-80nm)을 얻었다. 초박형 박편을 우라닐 아세테이트(uranyl acetate) 및 시트르산납(lead citrate)으로 이중 염색한 후, 60kV에서 투과 전자현미경(JEM 1010, 일본)으로 관찰하였다. 정량적 분석을 위해, 피질의 각 박편에서 20개의 저배율(×6,000) 필드를 무작위로 선택하였고, 100μm 2 당 자가포식소체(autophagosome)의 수가 결정되었다.
6. 인간 iPSC 유래 신장 오가노이드의 이식
접착성 오가노이드는 분화 18일째 되는 날, 23-게이지 주사 바늘을 이용하여 24-well 플레이트로부터 미세절개 하였고, 그 후 트랜스퍼 파이펫을 사용하여 RB를 함유하는 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)로 조심스럽게 옮겼다. 수확된 신장 오가노이드는 0.1% 신장 dECM와 함께 8주령의 면역 결핍 수컷 NOD/SCID 마우스(Jackson Laboratories, 미국)의 신장 피막하 공간(renal subcapsular space)에 이식되었다.
간단하게, 마우스를 졸레틸로 마취시킨 후, 등 측면 절개를 통해 신장을 노출시켰다. 23-게이지 주사 바늘로 약 2mm 가량 숙주 신피막을 절개한 후, 10 내지 20개의 신장 오가노이드를 함유하는 PE50 튜브를 신피막 아래에 조심스럽게 위치시켰다. 신장 오가노이드 및 0.1% 신장 dECM은 PE50 튜브의 다른 면을 통해 조심스럽게 불어넣어 전달되었다. 이식 후 14일이 경과한 시점에서 마우스를 희생시켰다(각 그룹당 n=3).
7. 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR) 분석
신장 오가노이드 샘플을 수집하고, RNAiso 플러스 키트(TAKARA, 일본)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 각 샘플로부터 총 RNA를 분리하였다. RT-qPCR 용 Maxima First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 상보적 DNA를 합성하였다. 유전자 발현은 실시간 중합효소 연쇄반응(Applied Biosystems, 미국)을 사용하여 Power SYBR Green PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, USA)로 분석하였다.
8. 통계학적 분석
모든 정량적 측정의 경우, 전체 모집단을 통계적 유의성의 계산에 사용하였고, n 값이 3인 평균값은 표준오차(standard error) 및 그래픽 신뢰구간(graphical confidence intervals)을 계산하는데 사용되었다. 그런 다음 Mann-Whitney 검정 또는 Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 데이터를 분석하여 그룹 간 유의성을 결정하였다. 각 그래프에서 오차 막대는 95% 신뢰구간인 -2 SEM (평균의 표준오차)을 나타낸다. <0.05의 p-값에는 단일 별표가, p <0.01에는 2개의 별표가, p <0.001에는 3개의 별표가 사용되었다.
실시예 1. 신장의 탈세포화 및 탈세포화된 신장 ECM 하이드로겔의 특성
신장의 탈세포화는 도 1a의 개략도에 나타낸 바와 같이 수행되었다.
먼저, 신장 dECM에서 H&E 염색을 통해 눈에 보이는 세포 성분(cellular component)이 없음을 확인하였다. 남아 있는 피브로넥틴 및 콜라겐 성분은 각각 알시안 블루(alcian blue), 항-피브로넥틴(anti-fibronectin) 및 메이슨 트리크롬 염색(Masson's trichrome staining)에 의해 시각적으로 평가하였다. 그 결과 도 1b에 나타난 바와 같이, 신장의 주요 ECM 성분인 피브로넥틴 및 콜라겐은 탈세포화된 신장 조직에서 잘 보존되어 있음을 확인하였다.
또한, 탈세포화 후 남아 있는 세포 성분을 평가하였다. 그 결과 도 1c에 나타난 바와 같이, 신장 dECM의 DNA 함량은 생체(native) 신장 조직의 DNA 함량과 비교하여 2.29% 수준에 그쳤으며, 단지 0.64ng의 DNA/mg만이 남아있을 뿐이었다. 이는 대부분의 세포 성분이 성공적으로 제거되었음을 나타내는 것이다.
실시예 2. 생체 외 신장 dECM 상에서의 신장 오가노이드 배양 및 그 효과
신장 오가노이드 배양에 있어 신장 dECM의 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 부착배양 분화 프로토콜(adherent culture differentiation protocol)을 사용하여 인간 iPSC로부터 신장 오가노이드를 생성한 후, 주변 기질(stroma)로부터 미세해부에 의해 정제하였다. 상기로부터 얻은 신장 오가노이드는 신장 dECM에 삽입하고 배양하였다.
그 결과 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 신장 dECM은 신장 오가노이드에서 1주 이내에 맥관구조(vasculature) 마커 PCAM1 양성 세포 및 혈관 네트워크 형성을 증가시켰다. 혈관 네트워크는 네프론-유사 구조를 광범위하게 둘러 싸는 모습을 나타내었다. 또한, PCAM1 양성 혈관 구조의 면적, 길이 및 직경은 대조군과 비교하여 신장 dECM에 삽입된 신장 오가노이드에서 증가되는 것을 확인하였다(도 2b).
또한, 실시간 정량 중합효소 연쇄반응(Real-time quantitative polymerase chain reaction; RT-qPCR)을 통해 신장 dECM에서 배양될 때 혈관 내피 카드헤린(VE-cadherin)뿐만 아니라 PCAM1 및 MCAM을 포함한 혈관 전구체 및 성숙 마커가 증가함을 확인하였다(도 2c).
마우스의 신장에 이식되거나 미세유체 시스템에서 배양되거나 또는 병아리의 장뇨막에 이식되는 경우, 신장 오가노이드의 혈관화 향상과 함께 관상구조의 진보적인 형태형성(Progressive morphogenesis)이 관찰될 수 있다. 본 발명자들은 세뇨관 상피세포의 성숙과 관련하여 신장 dECM과의 배양에 따른 향상된 혈관화 효과를 결정하였다. 그 결과 도 2d에 나타난 바와 같이, 신장 ECM 상에서 배양될 때, 관상피 수송체(tubular epithelial transporter), 아쿠아포린 1(AQP1), 원위세뇨관 세포 마커, E-카드헤린(E-cadherin) 및 섬모(cilliary) 유전자, PKD1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1)의 발현이 상향 조절됨을 확인하였다.
사구체의 혈관화가 인간 족세포 발달에 필수적이라는 사실을 고려하여, 본 발명자들은 또한 사구체 구획의 혈관화에 대한 신장 dECM의 효과를 알아보았다. 그 결과 신장 dECM에 삽입된 신장 오가노이드는 일부 PCAM1 양성 혈관 구조가 NPHS1 양성 세포로 침투한 반면, 대조군에서는 이러한 현상이 덜 관찰되었다(도 2a).
신장의 발달에 있어서, s-모양체(s-shape body) 단계에서는 족세포 전구체 세포에 의해 생성된 VEGF-A(Vascular endothelial growth factor A)가 침윤하는 내피세포를 끌어당김으로써, 이후의 족세포 성숙에 기여한다. 이에 본 발명자들은 VEGF-A와 족세포의 유전자 발현을 분석하였다. 그 결과 신장 dECM으로 배양된 오가노이드에서 VEGF가 상향 조절됨을 확인하였다(도 2e).
신장 dECM에서 배양될 때, 족세포(podocyte) 마커, 네프린(NPHS1), 시냅토포딘(SYNPO) 및 족세포 성체 전사인자(WT1)는 상향 조절되었다(도 2f). 상기와 같은 결과를 종합하면, 신장 dECM이 VEGF 발현을 상향조절하고, 족세포 성숙을 동반한 PCAM1-양성 혈관 구조에 의해 침윤 사구체 유사 구조를 야기함을 나타내는 것이다.
더불어 도 3a 및 3b에 나타난 바와 같이, 신장 dECM에서 배양될 때 신장 오가노이드를 구성하는 세포의 생존이 향상되었으며(도 3a), 근위세뇨관 상피 세포(proximal tubular cell)의 극성(polarity)가 향상됨을 확인하였다.
실시예 3. 신장 dECM을 포함하는 신장 오가노이드의 생체 내 이식 및 그 효과
마우스의 신장에 인간 신장 오가노이드를 이식한 경우 신장 오가노이드에서 사구체 및 관상 유사 구조의 성숙을 촉진하는 관류성 혈관 구조의 형성이 향상된다고 알려져 있었다. 이에 본 발명자들은 신장 dECM이 VEGF 발현을 상향 조절하고 신장 오가노이드의 혈관화를 향상시킨다는 점을 고려하여, 신장 dECM을 갖는 신장 오가노이드를 이식한다면 이식된 이식편(transplanted graft)에서의 혈관화를 가속화시킬 수 있고, 이를 통해 신장 오가노이드의 네프론-유사 구조에서 보다 진보적인 형태형성을 이끌어낼 수 있다고 가정하였다.
상기 가정을 시험하기 위해, 본 발명자들은 신장 dECM을 갖는 인간 iPSC로부터 유래된 신장 오가노이드를 생착시키기 위해 면역 결핍 NOD-SCID 마우스의 신피막(kidney capsule) 아래에 이식하였다. 이식 후 2주 동안 이식된 이식편에서 CD31-양성 세포를 갖는 혈관이 풍부하게 형성되었다(도 4a). 신장 dECM이 이식된 이식편의 혈관 직경은 신장 dECM을 결여하고 이식된 이식편의 혈관 직경보다 큰 것으로 나타났다(도 4a).
또한, 마우스 내피세포(MECA32+)는 이식된 신장 오가노이드 이식편과 사구체-유사 구조 내에서 풍부하게 관찰되었다(도 4b). 신장 dECM을 갖는 이식된 신장 오가노이드에서는 대조군과 비교하여 MECA32-양성 세포가 보다 더 풍부하게 관찰되었으며, 이는 신장 dECM이 마우스 신장으로부터 이식된 이식편으로의 내피세포 모집 효과 갖는다는 사실을 시사하는 결과이다.
기저막의 주요 성분인 콜라겐 IV는 발달 과정에서 혈관 완전성, 안정성 및 기능성에 필수적이다. 이에 본 발명자들은 콜라겐 IV가 신장 dECM의 가장 풍부한 단백질임을 감안하여, 이식된 신장 오가노이드에서 콜라겐의 발현을 조사하였다. 공초점 형광현미경에 의해 신장 dECM이 있는 이식된 신장 오가노이드는 신장 dECM이 없는 것과 비교하여 사구체 모세관(glomerular capillaries) 및 복막 모세혈관(peritubular capillaries)에서 콜라겐 IV의 발현이 더 증가되어 있음을 밝혀냈다(도 4c 상단).
또한, 신장 dECM과 함께 이식된 신장 오가노이드에 형성된 혈관 구조의 완전성을 확인하기 위해, 마우스의 꼬리 정맥에 500kDa 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)가 표지된 덱스트란(dextran)을 주사하였다. FITC가 표지된 덱스트란은 이식된 신장 오가노이드에서 사구체 유사 구조의 혈관 및 모세관 내부에 존재하였으며(도 4c 하단), 이는 이식된 신장 오가노이드의 혈관 구조가 숙주 마우스 유래의 침윤성 신장 혈관 구조와 연결되어 혈관 완전성을 유지함을 시사하는 것이다.
상기 결과를 종합하면, 신장 dECM은 숙주 마우스 신장으로부터 내피세포의 모집을 가속화시켰으며, 이는 기저막에서 콜라겐 IV를 증가시킴으로써 혈관 네트워크를 형성하고 혈관의 완전성을 유지시킨 것임을 확인한 것이다.
실시예 4. 신장 dECM을 포함하는 신장 오가노이드의 생체 내 이식 및 사구체 유사 구조의 성숙 효과
족세포(podocytes)는 신장의 사구체 모세혈관 루프의 외층에 있는 세포이다. 뇨를 형성하는 첫 번째 단계로서 사구체는 혈액을 여과하여, 단백질과 같은 큰 분자를 되돌려 보내고 물, 염 및 당과 같은 작은 분자를 통과시킨다. 족세포의 긴 돌출부 또는 족 돌기(foot processes)는 모세혈관 주위를 감싸고 사구체 기저막에 얹혀있게 된다. 족 돌기는 세극막이라고 부르는 다공성 구조에 의해 연결된다.
생체 외(in vitro) 연구에서, 신장 dECM과 함께 배양시 증가된 사구체의 혈관화 및 족세포의 성숙과 더불어 VEGF 발현의 상향조절이 나타남을 보였다(도 2a 내지 도 2f). 이에 본 발명자들은 신장 오가노이드 이식 후 향상된 혈관화를 고려하여, 신장 dECM을 함께 이식할 때 사구체 유사 구조의 성숙 정도를 조사하였다.
공초점 형광현미경으로 관찰한 결과, 신장 dECM이 있는 이식된 신장 오가노이드의 사구체 유사 구조에서 신장 dECM이 없는 것과 비교하여 VEGF의 발현이 더 증가하는 것을 확인하였다(도 4d).
또한, 세포의 초미세구조를 결정하기 위해 투과전자현미경(transmission electron microscopy; TEM)을 이용한 추가 구조 분석을 수행하였고, 생체 외 신장 오가노이드, 생체 내로 이식된 신장 오가노이드 및 성체 마우스의 신장을 상호 비교하였다.
그 결과 도 4e에 나타난 바와 같이, 생체 외 신장 오가노이드에서 족세포는 정단부 미세융모(apical microvilli)를 갖고 있었으며, 사구체기저막(Glomerular basement membrane; GBM) 유사 트랙을 따라 간헐적으로 배열되어 있는 미성숙 구조였다. 이와 비교하여, 단독으로 이식된 신장 오가노이드의 경우에는 이식된 신장 오가노이드에서 적혈구 조각이 관찰되어 모세혈관의 형성이 가능함을 나타내었다(도 4e). 하지만 이식된 신장 오가노이드는 GBM을 따라 잘 조직된 3차 깍지낌 구조(interdigitation)를 갖는 진정한 족 돌기( bona fide foot process)가 결여되어 있었다. 또한, 이식된 오가노이드의 보먼 주머니(Bowman's capsule)는 성체 마우스의 보먼 주머니와 구조적인 면에서 유사하였지만, 실질적으로는 더 두꺼운 캡슐층을 가지고 있었다. 이와는 대조적으로, 신장 dECM과 함께 이식된 신장 오가노이드의 족세포는 성체 마우스 신장의 것과 유사하게 GBM과 맞물리는 2차 또는 3차 족 돌기를 가지고 있었다(도 4e). 또한, 신장 dECM과 함께 신장 오가노이드를 이식한 경우에는, 포유동물의 성체 신장과 비교하여 GBM이 족세포 및 내피세포와 정렬되어 잘 조직되어 있었다(도 4f). 상기와 같은 결과는 이식된 신장 오가노이드에서 신장 dECM이 사구체 유사 구조의 성숙에 기여한다는 사실을 증명하는 것이다.
요약하면, 면역 결핍 마우스의 신피막 아래에 신장 dECM을 갖는 신장 오가노이드를 이식한 경우, 숙주 마우스의 신장으로부터 내피세포의 모집을 촉진시키고 혈관의 완전성을 유지하였다. 또한, 신장 dECM을 갖는 이식된 신장 오가노이드에서, 세극막(slit diaphragm) 유사 구조는 신장 dECM이 없는 것과 비교하여 더 조직화되었다.
이러한 결과는 신장 dECM 하이드로겔로부터 제공되는 미세환경이 iPSC 유래 신장 오가노이드의 혈관신생 및 성숙을 촉진시킨다는 사실을 시사하는 것이며, 이는 칩(chip) 상에 혈관이 지나가는 신장을 발생시키거나 재생 치료 등에 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 신장 dECM 하이드로겔을 이용한 신장 오가노이드 배양 시스템을 이용함으로써 신장 오가노이드의 혈관화를 유도하고 족세포(podocytes), 관상 수송체 및 섬모 유전자의 발현을 유도하였으며, 더 성숙한 네프론 유사 구조를 형성하였다. 따라서 본 발명의 제조 방법에 따라 인간 전능성줄기세포로부터 제조한 신장 오가노이드를 인간에게 이식하여 네프론 소실을 치료하거나, 생체 외 신장 모델로서 칩 상의 신장(kidney on a chip)으로 활용될 수 있는 바, 산업적 이용 가치가 클 것으로 예상된다.

Claims (13)

  1. 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질에서 신장 오가노이드(organoids)를 배양하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법.
  2. 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는 콜라겐성 3차원 기질; 및 상기 콜라겐성 3차원 기질에서 배양되는 신장 오가노이드(organoids)를 인간을 제외한 동물의 신장에 이식하는 단계를 포함하는, 네프론(nephron) 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드의 제조 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 신장 오가노이드는 인간 전능성줄기세포(pluripotent stem cell) 유래인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 인간을 제외한 동물의 신장 조직으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 신장 오가노이드의 혈관 형성 또는 혈관의 성숙을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 탈세포화된 신장 세포외 기질은 신장 오가노이드에서 관상피 수송체(tubular epithelial transporter), 아쿠아포린 1(AQP1), 원위세뇨관 세포 마커, E-카드헤린(E-cadherin), 섬모(cilliary) 유전자, PKD1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1), VEGF(Vascular endothelial growth factor), 족세포(podocyte) 마커, 네프린(NPHS1), 시냅토포딘(SYNPO) 및 족세포 성체 전사인자(WT1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 콜라겐성 3차원 기질은 하이드로겔(hydrogel)인 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  8. 제2항에 있어서,
    상기 이식은 동물의 신장 피막하 공간(renal subcapsular space)에 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 이식된 신장 오가노이드는 숙주 동물의 신장으로부터 내피세포를 모집하는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 이식된 신장 오가노이드의 혈관은 숙주 동물의 혈관과 연결되는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  11. 제2항에 있어서,
    상기 이식은 콜라겐성 3차원 기질에 신장 오가노이드를 매립(embedding) 하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조 방법.
  12. 제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드.
  13. 탈세포화된 신장 세포외 기질을 포함하는, 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 제조용 콜라겐성 3차원 기질.
PCT/KR2020/016709 2020-04-01 2020-11-24 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 및 이의 제조 방법 WO2021201368A1 (ko)

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