KR102571867B1 - 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법 - Google Patents

고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102571867B1
KR102571867B1 KR1020210178114A KR20210178114A KR102571867B1 KR 102571867 B1 KR102571867 B1 KR 102571867B1 KR 1020210178114 A KR1020210178114 A KR 1020210178114A KR 20210178114 A KR20210178114 A KR 20210178114A KR 102571867 B1 KR102571867 B1 KR 102571867B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
kidney
organoids
organoid
present
differentiation
Prior art date
Application number
KR1020210178114A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20230089470A (ko
Inventor
김용균
남선아
김진원
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020210178114A priority Critical patent/KR102571867B1/ko
Priority to PCT/KR2022/016267 priority patent/WO2023113203A1/ko
Publication of KR20230089470A publication Critical patent/KR20230089470A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102571867B1 publication Critical patent/KR102571867B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법 등에 관한 것이다. 본 발명자들은 탈세포화된 신장 세포외기질과 마트리젤 사이에 줄기세포를 배치하고 신장 오가노이드 분화용 조성물을 독창적으로 처리하여 신장 오가노이드를 제조하는 두 가지 프로토콜을 발명하였고, 이 프로토콜이 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성을 촉진하고 사구체 혈관 형성을 촉진하는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 신장 오가노이드의 성숙 효과가 우수함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 신장 오가노이드를 제조함으로써 질환 모델링, 약물 스크리닝, 및 재생의료 등에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법{Method for producing the highly differentiated kidney organoids}
본 발명은 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법 등에 관한 것이다.
최근 줄기 세포 생물학의 발전은 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 신장 오가노이드를 생성하기 위한 여러 프로토콜을 확립하였다. hPSC 유래 신장 오가노이드는 네프론과 유사한 구조를 가지고 있으며 실제 인간의 신장과 유사한 족세포, 근위 세뇨관, 및 원위 세뇨관을 갖는 분절된 구조를 포함한다. 최근 연구로 hPSC-신장 오가노이드는 인간 신장의 발달을 재현할 수 있으며 다양한 신장 질환을 모사할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 향후 hPSC-신장 오가노이드는 신장 조직 재생 및 복구를 위한 유망한 세포 공급원이며, 다양한 신장 질환 모델에서 치료 도구로 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 하지만 최근 기술의 발전에도 불구하고, hPSC에서 분화된 신장 오가노이드의 임상 적용에는 신장 오가노이드의 안전성, 미성숙, 및 제한된 혈관화 등의 극복해야 할 문제가 있다. 즉, 기존 프로토콜은 신장의 복잡한 구조와 기능을 완전히 재현하는 신장 오가노이드를 생성할 수 없어 신장 질환 모델링 및 재생 의학 모두에 적용이 제한된다. 따라서, 신장 오가노이드의 임상적 적용을 위해서는 고도로 분화가 되고 혈관망이 갖추어진 신장 오가노이드 분화 프로토콜 개발이 반드시 필요하다.
탈세포화된 신장 세포외기질(kidney dECM)은 탈세포화 조직 내 보존된 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin), 및 라미닌(laminin) 등을 포함하는 다양한 세포외기질 성분들이 온전한 조직 내와 유사한 삼차원적인 미세 환경을 제공함으로써, 배양된 세포의 생존, 증식, 및 분화를 향상시킬 수 있으며 신장 오가노이드와 같은 인공장기 재생에 특화된 환경을 제공할 수 있을 것으로 전망하고 있다.
본 발명자들은 탈세포화된 신장 세포외기질, 혈관 성장인자, 화합물 1의 독창적이고 적절한 처리 방법 개발을 통해 기존 hPSC-신장 오가노이드에 비해 훨씬 발달된 혈관망을 갖추고, 족세포 및 세뇨관 세포의 성숙도가 매우 강화된 신장 오가노이드 3D 배양 프로토콜 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명자들이 개발한 프로토콜로 제조된 신장 오가노이드는 재생 의학, 신장 약물 독성 검사, 난치성 신장 질환 신약 개발에 사용될 것으로 기대된다.
한국공개특허 제10-2017-0110579호
이에, 본 발명자들은 고도로 분화된 신장 오가노이드를 제작하기 위하여 예의 노력한 결과, 탈세포화된 신장 세포외기질, 마트리젤, 및 신장 오가노이드 분화용 조성물의 독창적인 처리 방법을 개발하여 신장 오가노이드를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 목적은 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; 상기 코팅된 배양용기에 줄기세포를 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제1키트, 제2키트, 및 지시서를 포함하는 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트로서, 상기 제1키트는 탈세포화된 신장 세포외기질, 줄기세포, 및 마트리젤을 포함하고, 상기 제2키트는 오가노이드 분화용 조성물을 포함하며, 상기 지시서는 제1키트, 및 제2키트를 순차적으로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조되고, 하기 특징을 만족시키는, 고도 분화 신장 오가노이드를 제공하는 것이다:
(a) 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성의 촉진;
(b) 사구체 혈관 형성 촉진;
(c) 신장 오가노이드 형태 형성 촉진; 및
(d) 신장 오가노이드 성숙도 증진.
본 발명의 또 다른 목적은 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; GLA(galactosidase alpha) 유전자가 녹아웃(knock-out)된 줄기세포를 상기 코팅된 배양용기에 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 파브리병(Fabry disease)의 혈관병 모사가 가능한 생체 장기 모사 모델의 제조 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; 상기 코팅된 배양용기에 줄기세포를 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 제1키트, 제2키트, 및 지시서를 포함하는 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트로서, 상기 제1키트는 탈세포화된 신장 세포외기질, 줄기세포, 및 마트리젤을 포함하고, 상기 제2키트는 오가노이드 분화용 조성물을 포함하며, 상기 지시서는 제1키트, 및 제2키트를 순차적으로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조되고, 하기 특징을 만족시키는, 고도 분화 신장 오가노이드을 제공한다:
(a) 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성의 촉진;
(b) 사구체 혈관 형성 촉진;
(c) 신장 오가노이드 형태 형성 촉진; 및
(d) 신장 오가노이드 성숙도 증진.
또한, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; GLA(galactosidase alpha) 유전자가 녹아웃(knock-out)된 줄기세포를 상기 코팅된 배양용기에 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 파브리병(Fabry disease)의 혈관병 모사가 가능한 생체 장기 모사 모델의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 단계는 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제를 추가하는 단계, 및 분화용 배지를 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 단계는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)를 추가하는 단계; 및 TGF-β 억제제를 추가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 줄기세포는 탈세포화된 신장 세포외기질, 및 마트리젤 사이에 배치되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 코팅하는 단계는 웰 플레이트의 각 웰을 탈세포화된 신장 세포외기질로 코팅하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 방법은 하기 특징을 만족시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(a) 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성의 촉진;
(b) 사구체 혈관 형성 촉진;
(c) 신장 오가노이드 형태 형성 촉진; 및
(d) 신장 오가노이드 성숙도 증진.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 방법은 PECAM1(Platelet endothelial cell adhesion molecule 1), MCAM(melanoma cell adhesion molecule), PKD1(Polycystin 1), PKD2(Polycystin 2), PKHD1(polycystic kidney and hepatic disease 1), SLC34A1(Solute Carrier Family 34 Member 1), ATP1A1(ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1), LRP2(LDL Receptor Related Protein 2), 및 GATA3(GATA Binding Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 줄기세포는 전능성줄기세포(pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서 상기 오가노이드 분화용 조성물은 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제, VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β 억제제, 및 분화용 배지로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명자들은 탈세포화된 신장 세포외기질과 마트리젤 사이에 줄기세포를 배치하고 신장 오가노이드 분화용 조성물을 독창적으로 처리하여 신장 오가노이드를 제조하는 두 가지 프로토콜을 발명하였고, 이 프로토콜이 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성을 촉진하고 사구체 혈관 형성을 촉진하는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 신장 오가노이드의 성숙 효과가 우수함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 신장 오가노이드를 제조함으로써 질환 모델링, 약물 스크리닝, 및 재생의료 등에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a은 신장 dECM(Decellularized extracellular matrix) 하이드로겔을 기반으로 한 신장 오가노이드 분화를 위한 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 1b는 마트리젤 기반 프로토콜, 프로토콜 A, 및 프로토콜 B에 의해 배양된 신장 오가노이드의 형태에 대한 명시야 이미지를 나타낸 것이다(스케일 바 = 200μm).
도 1c는 마트리젤 기반 프로토콜, 프로토콜 A, 및 프로토콜 B에 의해 배양된 신장 오가노이드의 직경을 나타낸 것이다.
도 1d 및 1e는 PECAM1의 공초점 이미지, 및 PECAM1 양성 영역을 그래프로 나타낸 것이다(스케일 바 = 50μm).
도 1f 및 1g는 PECAM1 및 신장오가노이드의 혈관 직경에 관한 공초점 이미지와 그래프를 나타낸 것이다(스케일 바 = 25μm).
도 1h는 마트리젤 기반 프로토콜, 프로토콜 A, 및 프로토콜 B에 의해 배양된 신장 오가노이드에서 RT-qPCR을 통해 MCAM, 및 PECAM1의 유전자 발현을 나타낸 것이다(수치는 평균 ± SEM; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001).
도 2a 마트리젤 기반 프로토콜, 및 프로토콜 B에 의해 배양된 신장 오가노이드에서 NPHS1(족세포), PECAM1(혈관 네트워크) 및 Laminin(기저막)의 면역형광염색의 이미지를 나타낸 것이다(흰색 화살표: NPHS1+ 족세포 클러스터로의 PECAM1+ 내피 세포의 침습; 스케일 바 = 20μm).
도 2b 및 2c는 프로토콜 B에 의해 배양된 신장 오가노이드에서 WT1(족세포), PECAM1(혈관 네트워크), 및 콜라겐 IV(기저막)의 면역형광염색의 이미지를 나타낸 것이다(흰색 화살표: WT1+ 족세포 클러스터로의 PECAM1+ 내피 세포의 침습; 도 2b의 스케일 바 = 20μm; 도 2c의 스케일 바 = 100μm).
도 2d는 PECAM1, WT1, 및 콜라겐 IV이 염색된 공초점 현미경 이미지를 신장 오가노이드의 구조와 동일한 전자 현미경(EM) 이미지와 중첩하여 상관 광전자 현미경(CLEM; correlative light-and electron-microscopy) 연구를 수행한 결과를 나타낸 것이다(스케일 바 = 20μm).
도 3a 내지 3c는 마트리젤 기반 프로토콜, 프로토콜 A에 의해 배양된 신장 오가노이드에서 LTL, 콜라겐 IV, TUBA4A, 및 아세틸화된 튜불린의 면역형광염색의 이미지를 나타낸 것이다(도 3a 및 3c의 스케일 바 = 20μm; 도 3b의 스케일 바 = 50μm).
도 3d는 PKD1, PKD2, 및 PKHD1(섬모 유전자); SLC34A1, 및 ATP1A1(관상 상피 수송 유전자); ABCB1, 및 LRP2(약물 수송 유전자);의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다(수치는 평균 ± SEM; *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).
도 3e는 프로토콜 A에 의해 배양된 신장 오가노이드에서 CK8, GATA3 및 LTL의 면역형광염색의 이미지를 나타낸 것이다(스케일 바 = 50μm).
도 3f는 GATA3의 발현 수준을 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 GLA 돌연변이 1 및 GLA 돌연변이 2에서 GLA 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 야생형 및 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 NPHS1 및 LTL의 면역형광염색의 이미지를 나타낸 것이다(스케일 바 = 50 μm).
도 4c는 지질 방울, 당단백질 및 얼룩말 소체(zebra bodies)의 축적을 TEM 이미지를 통해서 확인한 결과를 나타낸 것이다(스케일 바 = 1 μm).
도 4d는 야생형, GLA 돌연변이 신장 오가노이드, 인간 재조합 아갈시다제-α를 처리한 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 Gb3의 면역형광염색의 이미지를 나타낸 것이다(스케일 바 = 50 μm).
도 4e는 야생형, GLA 돌연변이 신장 오가노이드, 인간 재조합 아갈시다제-α를 처리한 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 Gb3 양성 영역을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4f는 야생형, GLA 돌연변이 신장 오가노이드, 인간 재조합 아갈시다제-α를 처리한 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 NPHS1, PECAM1, 및 LTL의 면역형광염색의 이미지를 나타낸 것이다(흰색 화살표: PECAM1+ 내피 세포의 NPHS1+ 족세포 구조로 침습; 스케일 바 = 50 μm).
본 발명의 일 실시예에서는 프로토콜 A와 B를 이용하여 신장 오가노이드를 생성한 경우, 신장 오가노이드의 크기가 증가한 점, 혈관 네트워크 형성이 촉진되었으며, PECAM1 양성 혈관구조의 면적과 직경이 증가한 점, 혈관마커인 PECAM1 및 그 전구체인 MCAM의 유전자 발현이 증가한 점을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 일 실시예에서는 프로토콜 A와 B를 이용하여 신장 오가노이드를 생성한 경우, PECAM1+ 혈관 유사 구조의 작은 가지가 NPHS1+ 또는 WT1+ 사구체 구조를 침습하는 것을 확인하여 사구체 혈관 형성 효과를 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 일 실시예에서는 프로토콜 A를 이용하여 신장 오가노이드를 생성한 경우, 섬모 유전자(PKD1, PKD2, PKHD1), 관상 상피 수송 유전자(SLC34A1, ATP1A1), 및 약물 수송 유전자(ABCB1, LRP2)의 발현은 상향 조절된 것을 확인하였고, 전방 중간 중배엽(AIM; anterior intermediate mesoderm) 마커인 GATA3의 강한 발현을 확인하였다. 이를 통해 신장 오가노이드의 성숙 효과를 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 일 실시예에서는 프로토콜 B를 이용하여 제조한 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 Gb3가 축적되는 것을 확인하였으며, 족세포 및 세뇨관의 세포질에서 동심체(concentric body, 얼룩말 소체)를 형성하는 것을 관찰하였다. 또한, 재조합 인간 아갈시다제-α를 사용한 ERT는 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 사구체 혈관 형성, 및 큰 내강 혈관 형성으로 혈관 네트워크를 회복시켰는바, 프로토콜 B가 파브리병 모델링 및 치료 옵션 개발에 유용하다는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
따라서, 본 발명자들은 본 발명의 제조 방법이 신장 오가노이드의 혈관화 및 성숙을 유도하며, 질병 모델링, 약물 스크리닝, 및 재생의료 등에 유용하게 활용할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; 상기 코팅된 배양용기에 줄기세포를 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 단계는 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제를 추가하는 단계, 및 분화용 배지를 공급하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 코팅하는 단계는 웰 플레이트의 각 웰을 탈세포화된 신장 세포외기질로 코팅할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 탈세포화된 신장 세포외기질의 농도는 0.01 내지 50%(w/v)일 수 있으며, 상기 마트리젤의 농도는 0.1 내지 10%일 수 있으며, 상기 GSK3 억제제의 농도는 1 내지 50μM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 마트리젤을 추가하는 단계에서 내부의 구멍(cavity)이 발달한 조밀한 공 모양의 콜로니 형성을 관찰할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 분화용 배지는 mTesr, RPMI, 또는 B27이 보충된 RPMI 배지일 수 있으며, 분화용 배지는 1 내지 7일 마다 교체할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제는 CHIR99021, CHIR 98014, 3F8, A1070722, Alsterpaullone, AR-A014418 등일 수 있으며, 일 실시예에 따르면 CHIR99021일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 방법으로 10 내지 50일, 10 내지 40일, 10 내지 30일, 10 내지 20일, 11 내지 50일, 11 내지 40일, 11 내지 30일, 11 내지 20일, 12 내지 50일, 12 내지 40일, 12 내지 30일, 12 내지 20일, 13 내지 50일, 13 내지 40일, 13 내지 30일, 13 내지 20일, 14 내지 50일, 14 내지 40일, 14 내지 30일, 또는 14 내지 20일 동안 신장 오가노이드 제조가 진행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 신장 오가노이드로 분화시키는 단계는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)를 추가하는 단계; 및 TGF-β 억제제를 추가하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 VEGF는 1 내지 수회, 1 내지 15회, 1 내지 12회, 1 내지 10회, 1 내지 7회, 1 내지 5회, 2 내지 15회, 2 내지 12회, 2 내지 10회, 2 내지 7회, 2 내지 5회, 3 내지 15회, 3 내지 12회, 3 내지 10회, 3 내지 7회, 또는 3 내지 5회로 오가노이드 분화 기간 동안에 나누어서 처리될 수 있으며, 일 실시예에 따르면 4회로 나누어서 처리될 수 있고, 구체적으로 오가노이드 분화 6, 9, 12, 및 14일째에 1 내지 100ng/ml로 처리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 TGF-β 억제제는 1 내지 수회, 1 내지 15회, 1 내지 10회, 1 내지 7회, 1 내지 5회, 또는 1 내지 3회로 오가노이드 분화 기간 동안에 나누어서 처리될 수 있으며, 일 실시예에 따르면 1회로 처리될 수 있고, 구체적으로 오가노이드 분화 12일째에 1 내지 50μM로 처리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “탈세포화(decellularization)”는 세포 또는 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다. 또한, “탈세포화된 세포외기질(decellularized extracellular matrix)”은 조직 또는 세포로부터 핵, 세포막, 핵산과 같은 세포 성분이 제거되고 남은 세포외기질을 의미한다.
본 발명에서, “오가노이드(Organoid)”는 줄기세포나 장기 기원세포로부터 분리한 세포를 3차원 배양법으로 다시 응집·재조합하여 만든 장기 특이적 세포집합체를 의미하는 것으로서, 생체 내 상태와 유사한 방식으로 세포 분류와 공간적으로 제한된 계통 예정(lineage commitment)을 통해 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적인 세포 유형의 장기 유사체이다. 따라서, 오가노이드는 세포의 본래 생리학을 나타내며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함하는) 본래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가진다. 줄기세포는 조직 또는 오가노이드 단편으로부터 분리될 수 있다. 오가노이드가 생성된 세포는 생체 내(in vivo)에서 장기와 매우 유사한 구조를 형성하도록 자가-조직화된 다중 세포 유형을 나타내는 장기-유사 조직을 형성하도록 분화한다. 따라서, 오가노이드는 생체 내 발달과 매우 유사한 시스템에서의 인간 장기와 인간 장기 발달을 연구하기 위한 훌륭한 모델이다.
본 발명에서, 상기 고도 분화는 신장 오가노이드의 혈관화가 촉진되고, 관상 구획의 성숙 등 신장 오가노이드가 성숙한 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 탈세포화된 신장 세포외기질은 인간을 제외한 동물의 신장 조직으로부터 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 돼지로부터 얻은 신장 조직을 이용하였으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 탈세포화된 신장 세포외기질은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(a) 인간을 제외한 동물의 신장 조직을 절편으로 만드는 단계;
(b) NaCl에 용해된 트리톤 X-100을 처리하는 단계;
(c) DNase를 처리하는 단계;
(d) 멸균하는 단계; 및
(e) 동결 건조하는 단계.
본 발명에서, 상기 단계 (a)의 절편은 0.01 내지 1mm 두께일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 줄기세포는 탈세포화된 신장 세포외기질, 및 마트리젤 사이에 배치될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 줄기세포는 전능성줄기세포(pluripotent stem cell)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “줄기세포(stem cell)”는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 미분화 세포들을 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이며, 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래[전이(transit)] 세포로 분열될 수 있고, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 발명에서, “전능성줄기세포(pluripotent stem cell)”는 수정란보다 발생이 진행된 상태의 세포로서 내배엽, 중간엽 및 외배엽을 구성하는 세포로 모두 분화할 수 있는 줄기세포를 의미한다. 예를 들어 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)일 수 있으며, 일 실시예에서 따르면 유도만능줄기세포(iPSC; induced pluripotent stem cells)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, “VEGF(Vascular endothelial growth factor)”는 혈관내피성장인자로서, 혈관내피세포에 특이적으로 작용하여 세포 증식이나 혈관신생을 촉진하는 당단백질이다. 이는 혈관 네트워크 형성을 촉진 시킬 수 있다.
본 발명에서, “TGF-β(transforming growth factor β) 억제제”는 상피세포와 조혈세포의 성장, 이동, 분화 및 사멸 등을 조절하는 다기능성 사이토카인이다. 이는 족세포 분화를 강화시킬 수 있다. 일 실시예에서는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이 사용되었으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 1]
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl]benzamide의 IUPAC 네임을 가질 수 있으며, 화학식은 C22H16N4O3, 분자량은 384.4 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 화합물은 화합물 1로 명명될 수 있다.
본 발명에서, 상기 방법은 하기 특징을 만족시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
(a) 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성의 촉진;
(b) 사구체 혈관 형성 촉진;
(c) 신장 오가노이드 형태 형성 촉진; 및
(d) 신장 오가노이드 성숙도 증진.
본 발명에서, 상기 방법은 혈관 마커인 PECAM1(Platelet endothelial cell adhesion molecule 1); 혈관 마커의 전구체인 MCAM(melanoma cell adhesion molecule); 섬모 유전자인 PKD1(Polycystin 1), PKD2(Polycystin 2), PKHD1(polycystic kidney and hepatic disease 1); 관상 상피 수송 유전자인 SLC34A1(Solute Carrier Family 34 Member 1), ATP1A1(ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1); 약물 수송 유전자인 ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1), LRP2(LDL Receptor Related Protein 2); 및 전방 중간 중배엽(AIM; anterior intermediate mesoderm) 마커인 GATA3(GATA Binding Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 제1키트, 제2키트, 및 지시서를 포함하는 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트로서,
상기 제1키트는 탈세포화된 신장 세포외기질, 줄기세포, 및 마트리젤을 포함하고, 상기 제2키트는 오가노이드 분화용 조성물을 포함하며, 상기 지시서는 제1키트, 및 제2키트를 순차적으로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트을 제공한다.
본 발명에서, 상기 지시서는 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; 상기 코팅된 배양용기에 줄기세포를 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 오가노이드 분화용 조성물은 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제, VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β 억제제, 및 분화용 배지로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 오가노이드 제조는 오가노이드를 생성하거나 유지시킬 수 있는 모든 행위를 포함한다. 예를 들면 세포 또는 특정 조직으로부터 분리된 세포가 특정 기능을 갖는 조직이나 기관 세포로 분화시키는 것일 수 있으며, 또는 오가노이드를 생존, 성장, 또는 증식시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조되고, 하기 특징을 만족시키는, 고도 분화 신장 오가노이드를 제공한다.
(a) 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성의 촉진;
(b) 사구체 혈관 형성 촉진;
(c) 신장 오가노이드 형태 형성 촉진; 및
(d) 신장 오가노이드 성숙도 증진.
본 발명에서, 상기 신장 오가노이드를 질환 모델링, 생체 장기 모사 모델, 또는 약물 스크리닝에 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 약물 스크리닝은 환자 개인의 질환 특성에 맞는 약물을 스크리닝 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 신장 오가노이드는 생체 내에서 피실험자의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 피실험자의 신장 질환의 치료 방법을 포함한다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 하나의 태양에서 방법은 신장 질환의 증상의 개선, 치료 또는 경감이 필요한 피실험자에서 상기 증상의 개선, 치료 또는 경감을 포함한다. 상기 방법은 또한 신장 오가노이드를 상기 피실험자의 신장 질환의 치료에 유효한 양으로 투여함을 포함한다.
상기 피실험자의 치료 방법은 신장 오가노이드를 투여하거나 신장 오가노이드를 이식함을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 투여 또는 이식 결과 상기 피실험자에서 신장 질환의 증상이 개선, 치료 또는 경감된다. 상기 개선, 치료 또는 경감은 자연적 감각 또는 인공 장치를 사용하여 탐지될 수 있는 상기 신장 질환 또는 상기 신장 질환의 증상의 임의의 변화일 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "피실험자" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 예를 들어 가축 및 애완동물, 예를 들어 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 뮤린 포유동물을 포함한다. 바람직하게, 상기 피실험자는 인간이다.
본 발명의 신장 오가노이드는 약학적 조성물에 1 pg 내지 30g w/v%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "개체"란 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에서 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 신장 질환을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 신장 질환 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 신장 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물 내의 상기 신장 오가노이드의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 폴리에칠렌글리콜 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3), 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3),질소가스(N2),에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
또한, 본 발명은 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; GLA(galactosidase alpha) 유전자가 녹아웃(knock-out)된 줄기세포를 상기 코팅된 배양용기에 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 파브리병(Fabry disease)의 혈관병 모사가 가능한 생체 장기 모사 모델의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서, “파브리병” 은 α-갈락토시다아제 A(GLA; α-galactosidase A)의 결핍 또는 부재로 발생하는 리소좀 저장 질환(Lysosomal storage disorders) 중 하나이다. 파브리병은 X-연관 열성 형질로 유전되며 주로 남성에게 나타나고, 여성의 경우 증상이 비교적 경미하게 나타난다. α-갈락토시다아제 A의 결핍 또는 부재는 리소좀 내에 Gb3(globotriaosylceramide)의 축적을 야기하며, 이로 인해 말초 신경병증, 피부, 신장 질환, 심근병증, 뇌졸중의 심각한 합병증을 야기한다.
본 발명에서, 상기 녹아웃은 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템을 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "CRISPR-Cas9" 또는 "CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템"은 크리스퍼(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR) 유전자 가위라 불리는 게놈 편집 방법으로, 특정 염기서열에 특이적으로 결합하는 RNA(gRNA)와 특정한 염기서열을 자르는 가위 역할인 Cas9 단백질로 구성된다. 이러한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 세포나 동물에 플라스미드(Plasmid) DNA를 도입하여 특정 유전자의 기능을 억제 할 수 있는 녹아웃(knock-out)이 가능하다.
본 발명에서, "녹아웃(knock-out)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 결실, 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절(down-regulation)을 의미한다.
본 발명에서, "생체 장기 모사 모델"은 실제 인체장기가 작동하는 생리환경을 모사한 것을 의미하며, 본 발명에서는 신장 오가노이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
실험예 1. 신장의 탈세포화
돼지의 신장 조직을 0.1 내지 0.3mm 두께로 슬라이스하고 증류수로 30분 동안 3회 세척하였다. 다음으로, 상기 슬라이스를 1M NaCl(Samchun Pure Chemicals)에 용해된 0.5% Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 16시간 동안 처리하였다. 그런 다음 1시간 동안 3번 더 세척하였다. 남아 있는 세포 성분을 제거하기 위하여 DNase를 37℃에서 6-7시간 동안 투여하였다. DNase가 처리된 조직 절편을 PBS로 12시간 동안 세척한 후, 0.1% 과아세트산(peracetic acid) 용액으로 1시간 동안 멸균하고, 증류수로 다시 세척하였다. 탈세포화된 조직을 -80℃에서 동결 건조시킨 후, 생화학적 특성화 및 신장 dECM 하이드로겔 제조에 사용하였다.
실험예 2. 신장 dECM 하이드로겔의 제조
신장 dECM 하이드로겔의 제조는 앞서 탈세포화된 신장 조직을 아세트산(acetic acid) 용액에 용해시켜 수행하였다. 아세트산 용액에는 탈세포화된 신장 조직 및 펩신을 10:1의 질량 비율로 포함시켰고, 용액 속 탈세포화 조직의 농도에 따라 72시간에서 96시간 동안 교반하였다. 용해가 완료된 후에는 수산화나트륨을 이용하여 중성화를 시켰고, 최종적으로 필요한 농도의 신장 dECM 하이드로겔을 만들기 위해 증류수를 이용하여 희석하였다.
실험예 3. 신장 오가노이드 분화
CMC11 iPSC 세포주는 가톨릭대학교(남성 기증자)로부터 입수하였다. 계대수 30에서 60 사이의 세포를 사용하였으며, 신장 dECM이 없는 신장 오가노이드 분화는 이전에 설명한 대로 수행하였다. 간단히 말해서, hPSC는 3% GelTrex(Thermo Fisher Scientific)로 코팅된 24-웰 유리 플레이트(LabTek)에 mTeSR1 배지(Stem Cell Technologies) + 10μM Y27632(LC Laboratories)와 함께 5,000 cells/well의 밀도로 플레이팅 하였다(-3일차). 배지를 각각 -2일차에는 1.5% GelTrex를 포함하는 mTeSR1로, -1일차에는 mTeSR1로 교환하였고, 0일차에는 RPMI(Thermo Fisher Scientific) + 11 μM CHIR99021(Tocris)로 교환하였으며, 1.5일차에는 RPMI + B27 보충제(Thermo Fisher Scientific)로 교환하였다. 그리고 이후에는 신장 오가노이드의 분화를 촉진시키기 위해 2-3일마다 B27 보충제가 함유된 RPMI(Thermo Fisher Scientific) 배지를 공급하였다.
신장 dECM을 기반으로 한 신장 오가노이드 분화를 위해, 두 가지 프로토콜을 개발하였다. 두 가지 프로토콜은 Freedman의 프로토콜(Nature communications 2015, 6 (1), 1.)을 전반적으로 따랐으나, 다음과 같이 수정하였다.
프로토콜 A에서, 24-웰 플레이트의 각 웰을 희석된 신장 dECM(0.1%)으로 코팅한 다음, 해리되고 미분화된 인간 iPSC를 균일하게 배치하였다. 24시간 후, 1.5% 마트리젤을 첨가함으로써, 인간 iPSC를 신장 dECM의 하부 층과 마트리젤의 상부 층 사이에 끼웠다. 3일째에, 신장 오가노이드 분화를 촉진하기 위해 CHIR을 처리하였다. 그 후, 2-3일마다 B27 보충제가 함유된 RPMI(Thermo Fisher Scientific) 배지를 공급하였다.
프로토콜 B는 프로토콜 A와 전반적으로 비슷하지만, 혈관 네트워크를 강화하기 위해 6, 9, 12, 및 14일에 VEGF(각각 10ng/ml, 20ng/ml, 30ng/ml, 50ng/ml)를 처리하고, 족세포 분화를 강화하기 위해 12일에 10μM의 화합물 1을 처리하였다.
실험예 4. 면역형광분석(Immunofluorescent analyses)
면역형광법 분석을 위해, 달리 언급되지 않는 한, 오가노이드는 18일째 되는 날에 고정하였다. 구체적으로, 고정을 위해 동일한 부피의 PBS(Thermo Fisher Scientific) 및 8% 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences)를 배지에 15분 동안 첨가한 후, 샘플을 PBS로 3회 세척하였다. 그 후, 고정된 오가노이드 배양물을 5% 당나귀 혈청(donkey serum, Millipore) + 0.3% Triton-X-100/PBS으로 블로킹(blocking)하였다. 그런 다음. 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, Sigma) + 1차 항체[항-아세틸화 튜불린(Sigma-Aldrich T7451, 1:200), 항-콜라겐 IV(Southern Biotech 1340-01, 1:300), 항-사이토케라틴 8(anti-Cytokeratin 8, Abcam ab9023, 1:200), 항-GATA3(R&D AF2605, 1:200), 항-Gb3(TCI A2506, 1:200), 항-GLA(Thermo Fisher Scientific PA5-27349, 1:1000), 항-라미닌(anti-Laminin, Sigma-Aldrich L9393. 1:200), 항-LTL(Vector Labs FL-1321, 1:200 희석), 항-MECA32(BD Pharmingen 555849, 1:200), 항-NPHS1(R&D AF4269, 1:200), 항-Pecam1(Abcam ab9498, 1:200), 항-TUBA4A(Abcam ab24610, 1:200), 및 항-WT1(Abcam ab89901, 1:200)]가 포함된 PBS에서 밤새 인큐베이션한 후 세척하고, AlexaFluor 2차 항체(Invitrogen)와 인큐베이션하였다. 그 후, 세척하여 DAPI로 염색하거나 Vectashield H-1000를 이용하여 마운트(mount)하였다. Zeiss LSM 700 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany) 및 ZEN 3.1 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하였다.
실험예 5. 투과 전자현미경(TEM) 분석
성체 마우스 신장 블록 샘플, 이식된 신장 오가노이드 샘플, 및 신장 오가노이드 시험관내 샘플을 0.1M 인산 완충액 중의 4% 파라포름알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드를 이용하여 4℃에서 밤새 고정하였다. 0.1 M 인산염 완충액으로 세척한 후, 샘플을 동일한 완충액에서 1% 사산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 4℃에서 1시간 동안 후 고정(post-fixation)시켰다. 다음으로 샘플을 일련의 등급화된 에틸 알코올 용액으로 탈수하고, 아세톤을 통해 교환한 다음 Epon 812에 매립시켰다. 그 후, 울트라마이크로톰(Ultramicrotome, Leica Ultracut UCT, Germany)을 사용하여 초박형 박편(70-80nm)을 얻었다. 초박형 박편을 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 시트르산납(lead citrate)으로 이중 염색한 후, 60kV에서 투과 전자현미경(JEM 1010, Japan)으로 관찰하였다. 정량적 분석을 위해, 피질의 각 박편에서 20개의 저배율(x 6,000) 필드를 무작위로 선택하였고, 100μm2 당 자가포식소체(autophagosome)의 수가 결정되었다.
상관 광전자 현미경 연구(correlative light and electron microscopic study)를 위해 진동마이크로톰(vibratome) 박편을 0.1 MPB에서 2.3 M 수크로스(sucrose)로 동결보호하고, 액체질소로 동결하였다. FC7 크라이오챔버(FC7 cryochamber, Leica)가 장착된 Leica EM UC7 울트라마이크로톰에서 유리칼을 사용하여 -100℃에서 반-얇은 동결절편(Semi-thin cryosections, 2μm 두께)을 절단하였다. 박편은 PCAM1 및 WT1에 대한 마우스 다클론 항체를 사용하여 4℃에서 밤새 표지되었다. Alexa Fluor 2차 항체(Invitrogen)를 사용하여 항체 염색을 시각화하였다. 또한, 박편을 DAPI로 10분 동안 대조 염색하였다. 커버슬립(Coverslip) 박편은 공초점 현미경으로 관찰하고, 차동 간섭 대비 설정(differential interference contrast setting)으로 x200 또는 x400 배율로 사진을 찍어, 전자 현미경으로 나중에 관찰할 특정 영역을 확인하였다. 커버슬립을 절편에서 띄운 후, HQ 은 강화 키트(HQ silver enhancement kit, Nanoprobes)를 사용하여 3분 동안 은 강화(silver enhancement)를 수행하고, 앞서 설명한 대로 EM을 위한 조직을 준비하였다.
실험예 6. 실시간 정량 중합효소 연쇄반응 분석(Real-time quantitative PCR analysis)
신장 오가노이드 샘플을 채취하고 RNAiso Plus Kit(Takara, Japan)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 각 샘플로부터 총 RNA를 분리하였다. RT-qPCR용 Maxima First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 상보적 DNA를 합성하였다. 유전자 발현은 실시간 PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, USA)로 분석하였다. 실험에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 모든 qRT-PCR은 3회 수행되었고, 상대적 mRNA 발현 수준은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 결정하였다.
정방향/역방향 서열번호
ABCB1 F-5’ CCATGCTCAGACAGGATGTG 1
R-5’ TTCCTGTCCCAAGATTTGCT 2
ATP1A1 F-5’ CCAATTGTGTTGAAGGCACC 3
R-5’ CCGTGATGATGTGGATAAAATGT 4
LRP2 F-5’ TGTGATGCAGCCATCGAACT 5
R-5’ TGCATTTGGGGAGGTCAGTC 6
MCAM F-5’ CGTCTCGTAAGAGCGAACTTG 7
R-5’ CGATGTATTTCTCTCCCTGGTC 8
PDGFR-β F-5’ TGCAGACATCGAGTCCTCCAAC 9
R-5’ GCTTAGCACTGGAGACTCGTTG 10
PECAM1 F-5’ TCATTACGGTCACAATGACGA 11
R-5’ GAGTATCTGCTTTCCACGGC 12
PKD1 F-5’ AACAAGTCTTTGGCCATCAC 13
R-5’ TACTCGTTCAGCACGGTGAC 14
PKD2 F-5’ TCTTGCCAATTTCAGCCTTT 15
R-5’ GCACAACGATCACAACATCC 16
PKHD1 F-5’ CCATTCTCTGCCAGGTTAGC 17
R-5’ ACCCCTAATCAGCACAGTGG 18
SLC34A1 F-5’ TCACGAAGCTCATCATCCAG 19
R-5’ TTCCTCAGGGACTCATCACC 20
실험예 7. 통계 분석
모든 정량적 측정의 경우, 전체 모집단을 통계적 유의성을 계산에 사용하였고, n값이 3인 평균값은 표준오차(standard error) 및 그래픽 신뢰구간(graphical confidence intervals)을 계산하는데 사용하였다. 그런 다음 Mann-Whitney 검정 또는 Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 데이터를 분석하여 그룹 간의 유의성을 결정하였다. 각 그래프에서 오차 막대는 95% 신뢰 구간인 -2 SEM(평균의 표준오차)을 나타낸다. p<0.05에는 단일 별표가, p<0.01에는 2개 별표가, p<0.001에는 3개의 별표가 사용되었다.
[실시예]
실시예 1. 신장 dECM 하이드로겔의 겔화 및 생화학적 특성화
신장 dECM 하이드로겔 생산 공정을 최적화하기 위해, 5단계 프로토콜을 설계하였다: (i) 돼지 신장 조직 수확; (ii) 탈세포화; (iii) 동결건조; (iv) 소화(digestion); 및 (v) 중화. 그 결과, 세포 구성 요소가 성공적으로 제거되었다.
실시예 2. 신장 dECM 하이드로겔을 기반으로 한 인간 신장 오가노이드의 분화를 위한 프로토콜
신장 오가노이드 분화에 대한 신장 dECM의 효과를 확인하기 위해, 신장 dECM 하이드로겔을 사용하여 인간 iPSC에서 신장 오가노이드로 분화하는 두 개의 3D 배양 시스템을 개발하였다. 각 배양 시스템은 도 1a에 나타내었다.
도 1a에 나타난 바와 같이, 프로토콜 A에서는, 24-웰 플레이트의 각 웰을 인산완충생리식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 희석된 0.1%(w/v) 신장 dECM으로 코팅한 다음, 해리되고 미분화된 인간 iPSC를 균일하게 배치하였다. 24시간 후, 우리는 1.5% 마트리젤을 추가하여 hPSC를 신장 dECM의 하부 층과 마트리젤의 상부층 사이에 끼웠다. 샌드위치 된 hPSC는 48시간 이내에 조밀한 공 모양의 콜로니를 형성한 다음, 내부 구멍(cavity)이 발달하였다. 그 후, 3일째에 세포를 CHIR로 처리한 다음 도 1에 설명된 대로 신장 오가노이드 분화를 촉진하기 위해 2-3일마다 적절한 배지를 공급하였다.
또한, 도 1a에 나타난 바와 같이, 프로토콜 B는 프로토콜 A와 동일하게 시작했지만 혈관 네트워크를 강화하기 위해 6, 9, 12, 및 14일에 VEGF(Vascular endothelial growth factor; 혈관내피세포 성장인자)를 추가하고, 신장의 사구체낭의 내엽을 이루는 세포인 족세포 분화를 강화하기 위해 12일에 TGF-β 억제제인 화합물 1을 추가하였다.
실시예 3. 인간 신장 오가노이드에서 신장 dECM 하이드로겔의 혈관 네트워크의 형성의 향상 효과 확인
신장 오가노이드의 분화에서 신장 dECM 하이드로겔의 효과를 확인하기 위해, 프로토콜 A와 B를 사용하여 신장 오가노이드를 생성하고, 신장 dECM 없이 마트리젤을 사용하여 생성된 신장 오가노이드의 표현형(대조군 신장 오가노이드)과 비교하였다. 그 결과는 도 1b 및 1c에 나타내었다.
도 1b 및 1c에 나타난 바와 같이, 명시야 현미경 검사법(Bright field microscopy)은 프로토콜 A와 B에 의해 생성된 신장 오가노이드가 관형 구조를 가지고 있으며, 오가노이드 크기가 대조군 신장 오가노이드보다 컸음을 보여주었다.
신장 오가노이드에서 네프론과 같은 구조를 광범위하게 둘러싸고 있는 혈관 네트워크의 형성에 대한 신장 dECM 하이드로겔의 효과를 공초점 이미지를 통해 확인하였다. 그 결과는 도 1d 내지 1g에 나타내었다.
도 1d 내지 1g에 나타낸 바와 같이, PECAM1(Platelet endothelial cell adhesion molecule 1)+ 혈관 네트워크의 형성은 대조군 오가노이드에서 제한되었고, 프로토콜 A에 의해 생성된 신장 오가노이드에서 증가했으며, 프로토콜 B에 의해 생성된 것에서는 더욱 증가하였다. 또한, PECAM1 양성 혈관구조의 면적과 직경은 프로토콜 A에서 향상되었고, 프로토콜 B에서 더욱 향상되었다.
또한, 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)을 통해 혈관마커 PECAM1 및 그 전구체인 MCAM의 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과는 도 1h에 나타내었다.
도 1h에 나타난 바와 같이, 프로토콜 A와 B에서 대조군 신장 오가노이드의 상기 유전자 발현과 비교하여, 혈관마커 PECAM1, 및 그 전구체인 MCAM의 유전자 발현을 상향 조절함을 확인하였다.
실시예 4. 신장 dECM 하이드로겔의 사구체 혈관 형성 및 신장 오가노이드 형태 형성 향상 효과 확인
4.1. 신장 dECM 하이드로겔의 사구체 혈관 형성 효과 확인
시험관 내 오가노이드의 신장 dECM 유도 혈관 형성(kidney dECM-induced vascularization of organoids)이 사구체 구획으로 확장되었는지 확인하였다. 구체적으로, 프로토콜 A, 및 B를 사용하여 배양된 신장 오가노이드에서 PECAM1+ 혈관 구조에 의해 침습된 NPHS1+ 또는 WT1+ 족세포 클러스터를 공초점 이미지를 통하여 확인하였다. 그 결과는 도 2a 내지 2c에 나타내었다.
도 2a에 나타난 바와 같이, 프로토콜 A를 사용하더라도 대조군에 비해 사구체 구조를 둘러싼 혈관화가 증가하였으나, 사구체 구조로의 PECAM1+ 혈관 침습은 거의 관찰되지 않았다. 한편, 프로토콜 A에 VEGF 및 화합물 1을 추가하는 프로토콜 B를 사용한 경우, 사구체 구조를 감싸는 혈관화가 현저히 향상된 것을 확인하였고, 더 큰 직경의 PECAM1+ 혈관 유사 구조를 확인하였다.
도 2a 내지 2c에 나타난 바와 같이, 큰 PECAM1+ 혈관 유사 구조의 작은 가지가 NPHS1+ 또는 WT1+ 사구체 구조를 침습하는 것을 확인하였다.
또한, 사구체 구조로의 PECAM1+ 혈관 침습을 확인하기 위해, PECAM1, WT1, 및 콜라겐 IV이 염색된 공초점 현미경 이미지를 신장 오가노이드의 구조와 동일한 전자 현미경(EM) 이미지와 중첩하여 상관 광전자 현미경(CLEM; correlative light-and electron-microscopy) 연구를 수행하였다. 그 결과는 도 2d에 나타내었다.
도 2d에 나타난 바와 같이, 공초점 현미경, 및 전자 현미경 이미지의 오버레이를 통하여 PECAM1+ 내피 세포가 WT1+ 족세포 클러스터로 침투하였음을 확인하였다.
4.2. 신장 dECM 하이드로겔의 신장 오가노이드 형태 형성 향상 효과 확인
신장 오가노이드가 마우스 신장에 이식되거나 미세 유체 시스템에서 배양되거나 병아리 융모요막(chick chorioallantoic membrane)에 이식될 때, 관형 구조의 점진적인 형태 형성은 신장 오가노이드의 혈관화의 증가와 함께 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 dECM을 기반으로 하는 배양 시스템에 의해 혈관화가 강화될 때, 시험관 내 신장 오가노이드의 인간 iPSC 유래 관형 세포에서 신장 오가노이드의 점진적 형태 형성 및 성숙이 발생할 것이라고 추측하였다. 이에 신장 오가노이드에서 LTL 및 콜라겐 IV TUBA4A 아세틸화된 튜불린(acetylated tubulin)에 대한 면역형광 염색을 통해 공초점 이미지를 확인하였다. 그 결과는 도 3a 내지 3c에 나타내었다.
도 3a 내지 3c에 나타난 바와 같이, 브러시 경계 마커 연꽃 테트라고놀로부스 렉틴(LTL; lotus tetragonolobus lectin) 및 일차 섬모의 정점 농축(apical enrichment)과 함께, 근위세뇨관의 향상된 분극이 신장 dECM으로 배양된 신장 오가노이드에서 확인되었다.
또한, 섬모 유전자(PKD1, PKD2, PKHD1), 관상 상피 수송 유전자(SLC34A1, ATP1A1), 및 약물 수송 유전자(ABCB1, LRP2)의 발현을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과는 도 3d에 나타내었다.
도 3d에 나타난 바와 같이, 분극와 일치하게, 신장 dECM과 함께 배양된 신장 오가노이드에서 섬모 유전자(PKD1, PKD2, PKHD1), 관상 상피 수송 유전자(SLC34A1, ATP1A1), 및 약물 수송 유전자(ABCB1, LRP2)의 발현은 상향 조절되었다. 이는 신장 오가노이드의 기능적 잠재력이 향상되었음을 의미한다.
ECM 및 ECM 관련 단백질은 세포의 공간적 조직화를 위한 물리적 기질을 제공하고, 성장 인자를 방출하며, 인테그린 경로와 같은 신호 전달 경로를 조절함으로써, 신장 발달에서 UB의 분지 형태 형성 및 성숙에 중요한 역할을 한다. 또한, 본 발명의 신장 dECM은 UB 세포의 분지 형태 형성에 중요한 사이토카인인 교세포 신경 성장인자(GDNF; glial cell-derived neurotrophic factor)를 포함한다. 따라서 본 발명자들은 신장 오가노이드에서 신장 dECM이 UB의 유도에 기여했는지 확인하였다.
또한, 신장 오가노이드에서 CK8, GATA3, 및 LTL에 대한 면역형광 염색을 통해 공초점 이미지를 확인하였다. 그 결과는 도 3e에 나타내었다.
도 3e에 나타난 바와 같이, 면역형광분석을 통해 프로토콜 A를 사용하여 분화된 신장 오가노이드에서 전방 중간 중배엽(AIM; anterior intermediate mesoderm) 마커인 GATA3의 강한 발현을 확인하였다.
또한, GATA3의 발현 수준을 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 통해 확인하였다. 그 결과는 도 3f에 나타내었다.
도 3f에 나타난 바와 같이, 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq; Single-cell RNA sequencing)을 통해 프로토콜 A를 사용하여 분화된 신장 오가노이드에서 GATA3+ 세포 집단의 증가를 확인하였다. 이는 UB 발달의 초기 단계인 신장 오가노이드에서 신장 dECM이 AIM의 분화에 효과가 있다는 것을 의미한다.
상기 결과를 종합하며, 신장 dECM이 신장 오가노이드에서 사구체 혈관화 및 관상 구획의 성숙을 향상시키는데 우수한 효과가 있다는 것이다.
실시예 5. 혈관화된 신장 오가노이드 및 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 사용한 혈관병증이 있는 파브리 신장병증(Fabry nephropathy with vasculopathy)의 재현(Recapitulation)
Cas9, GLA 특이적 단일 가이드 RNA(GLA-specific single-guide RNA) 및 GFP를 발현하는 올인원 벡터로 형질감염 시켜, GLA 돌연변이 인간 iPSC의 2개 클론(GLA 돌연변이 1 및 GLA 돌연변이 2)을 만들었다. 그런 다음, GLA 돌연변이 인간 iPSC를 프로토콜 B를 사용하여 신장 오가노이드로 분화시켰다. 그 후, GLA 돌연변이 1 및 GLA 돌연변이 2에서 GLA 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 그 결과는 도 4a에 나타내었다.
도 4a에 나타난 바와 같이, GLA 단백질은 GLA 돌연변이 1 인간 iPSC에서 분화된 신장 오가노이드에서 확인할 수 없었고, GLA 돌연변이 2 인간 iPSC에서 분화된 신장 오가노이드에서는 GLA 단백질 수준이 감소하였다. 이는 GLA-돌연변이 1 인간 iPSC에서 분화된 신장 오가노이드의 구조적 기형은 표현형을 분석하기에는 너무 심했던 반면, GLA-돌연변이 2 인간 iPSC에서 분화된 신장 오가노이드의 구조적 기형은 상대적으로 경미하여 분석이 가능하였다. 따라서 파브리병의 모델로 GLA-돌연변이 2 인간 iPSC에서 분화된 신장 오가노이드를 사용하였다.
야생형 및 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 NPHS1 및 LTL의 면역형광염색분석을 하였다. 그 결과는 도 4b에 나타내었다.
도 4b에 나타난 바와 같이, 족세포의 기저측면에서 발현된 NPHS1의 트랙의 선형 패턴은 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 조직화되지 않았다. 또한, GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 세뇨관 극성의 붕괴를 확인하였다.
지질 방울, 당단백질 및 얼룩말 소체(zebra bodies)의 축적을 TEM 이미지를 통해서 확인하였다. 그 결과는 도 4c에 나타내었다.
도 4c에 나타난 바와 같이, 풍부한 지질 방울, 전자 밀도 과립 침전물(electron-dense granular deposits), 및 전자 밀도 라멜레이트 지질 유사 침전물(electron-dense lamellate lipid-like deposits)이 족세포 및 세뇨관의 세포질에서 동심체(concentric body, 얼룩말 소체)를 형성하는 것이 인간 신장 파브리병의 표현형과 호환되는 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 관찰되었다.
야생형, GLA 돌연변이 신장 오가노이드, 인간 재조합 아갈시다제-α를 처리한 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 Gb3의 면역형광염색 분석을 하였고, Gb3 양성 영역을 그래프로 확인하였다. 그 결과는 도 4d 및 4e에 나타내었다.
도 4d 및 4e에 나타난 바와 같이, Gb3의 축적은 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 두드러지며, 이는 재조합 효소 대체 요법(ERT; recombinant enzyme replacement therapy)으로 아갈시다제-α(agalsidase-α)를 처리한 후 감소하였다. 이는 GLA 돌연변이 신장 오가노이드가 파브리병을 효율적으로 재현한다는 것을 나타낸다.
다음으로, 우리는 프로토콜 B에 의해 생성된 GLA 돌연변이 신장 오가노이드를 사용하여 파브리병의 혈관병증의 표현형을 결정하였다. 야생형, GLA 돌연변이 신장 오가노이드, 인간 재조합 아갈시다제-α를 처리한 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 NPHS1, PECAM1, 및 LTL의 면역형광염색분석을 하였다. 그 결과는 도 4f에 나타내었다.
도 4f에 나타난 바와 같이, GLA-돌연변이 인간 iPSC 신장 오가노이드에서 혈관화(Vascularization)가 제한되었으며, 신장 오가노이드의 야생형에서는 고도로 혈관화되었다. 한편, 재조합 인간 아갈시다제-α를 사용한 ERT는 GLA 돌연변이 신장 오가노이드에서 사구체 혈관 형성, 및 큰 내강 혈관 형성으로 혈관 네트워크를 회복시켰다.
상기 결과는 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템과 결합된 혈관화된 신장 오가노이드를 생성하는 방법은 파브리병의 혈관병증과 같은 질병 모델링 및 치료 옵션 개발에 유용하다는 것을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Method for producing the highly differentiated kidney organoids <130> MP21-218 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABCB1_F <400> 1 ccatgctcag acaggatgtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ABCB1_R <400> 2 ttcctgtccc aagatttgct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP1A1_F <400> 3 ccaattgtgt tgaaggcacc 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP1A1_R <400> 4 ccgtgatgat gtggataaaa tgt 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP2_F <400> 5 tgtgatgcag ccatcgaact 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRP2_R <400> 6 tgcatttggg gaggtcagtc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCAM_F <400> 7 cgtctcgtaa gagcgaactt g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCAM_R <400> 8 cgatgtattt ctctccctgg tc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFRb_F <400> 9 tgcagacatc gagtcctcca ac 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFRb_R <400> 10 gcttagcact ggagactcgt tg 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PECAM1_F <400> 11 tcattacggt cacaatgacg a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PECAM1_R <400> 12 gagtatctgc tttccacggc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKD1_F <400> 13 aacaagtctt tggccatcac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKD1_R <400> 14 tactcgttca gcacggtgac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKD2_F <400> 15 tcttgccaat ttcagccttt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKD2_R <400> 16 gcacaacgat cacaacatcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKHD1_F <400> 17 ccattctctg ccaggttagc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PKHD1_R <400> 18 acccctaatc agcacagtgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC34A1_F <400> 19 tcacgaagct catcatccag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC34A1_R <400> 20 ttcctcaggg actcatcacc 20

Claims (12)

  1. 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; 상기 코팅된 배양용기에 줄기세포를 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신장 오가노이드로 분화시키는 단계는 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제를 추가하는 단계, 및 분화용 배지를 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신장 오가노이드로 분화시키는 단계는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)를 추가하는 단계; 및 TGF-β 억제제를 추가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 탈세포화된 신장 세포외기질, 및 마트리젤 사이에 배치되는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 코팅하는 단계는 웰 플레이트의 각 웰을 탈세포화된 신장 세포외기질로 코팅하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 하기 특징을 만족시키는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법:
    (a) 신장 오가노이드의 혈관 네트워크 형성의 촉진;
    (b) 사구체 혈관 형성 촉진;
    (c) 신장 오가노이드 형태 형성 촉진; 및
    (d) 신장 오가노이드 성숙도 증진.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 PECAM1(Platelet endothelial cell adhesion molecule 1), MCAM(melanoma cell adhesion molecule), PKD1(Polycystin 1), PKD2(Polycystin 2), PKHD1(polycystic kidney and hepatic disease 1), SLC34A1(Solute Carrier Family 34 Member 1), ATP1A1(ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), ABCB1(ATP Binding Cassette Subfamily B Member 1), LRP2(LDL Receptor Related Protein 2), 및 GATA3(GATA Binding Protein 3)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 전능성줄기세포(pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법.
  9. 제1키트, 제2키트, 및 지시서를 포함하는 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트로서,
    상기 제1키트는 탈세포화된 신장 세포외기질, 줄기세포, 및 마트리젤을 포함하고, 상기 제2키트는 오가노이드 분화용 조성물을 포함하며, 상기 지시서는 제1키트, 및 제2키트를 순차적으로 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 신장 오가노이드 제조용 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 오가노이드 분화용 조성물은 GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3) 억제제, VEGF(Vascular endothelial growth factor), TGF-β 억제제, 및 분화용 배지로 이루어지는 군으로부터 선택된 2 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 고도 분화 오가노이드 제조용 키트.
  11. 삭제
  12. 탈세포화된 신장 세포외기질로 배양용기를 코팅하는 단계; GLA(galactosidase alpha) 유전자가 녹아웃(knock-out)된 줄기세포를 상기 코팅된 배양용기에 배치하는 단계; 마트리젤을 추가하는 단계; 및 오가노이드 분화용 조성물을 사용하여 신장 오가노이드로 분화시키는 단계로 이루어진 파브리병(Fabry disease)의 혈관병 모사가 가능한 생체 장기 모사 모델의 제조 방법.
KR1020210178114A 2021-12-13 2021-12-13 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법 KR102571867B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210178114A KR102571867B1 (ko) 2021-12-13 2021-12-13 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법
PCT/KR2022/016267 WO2023113203A1 (ko) 2021-12-13 2022-10-24 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210178114A KR102571867B1 (ko) 2021-12-13 2021-12-13 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230089470A KR20230089470A (ko) 2023-06-20
KR102571867B1 true KR102571867B1 (ko) 2023-08-30

Family

ID=86772925

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210178114A KR102571867B1 (ko) 2021-12-13 2021-12-13 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102571867B1 (ko)
WO (1) WO2023113203A1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102253326B1 (ko) * 2020-05-13 2021-05-18 가톨릭대학교 산학협력단 파브리병의 생체 장기 모사 모델 및 이의 제조방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014277667B2 (en) 2014-12-15 2022-07-14 The University Of Queensland Differentiation of pluripotent stem cells to form renal organoids
KR20190127041A (ko) * 2018-05-03 2019-11-13 한국생명공학연구원 간 오가노이드 및 그의 제조 방법
KR102094929B1 (ko) * 2018-07-06 2020-03-30 한국생명공학연구원 신장 스페로이드 및 그의 제조 방법
KR102285598B1 (ko) * 2020-04-01 2021-08-05 가톨릭대학교 산학협력단 네프론 유사 구조를 갖는 신장 오가노이드 및 이의 제조 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102253326B1 (ko) * 2020-05-13 2021-05-18 가톨릭대학교 산학협력단 파브리병의 생체 장기 모사 모델 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biomimetics, vol.6(40), pp.1~20(2021.06.16.)*
Dev Biol., vol.420(2), pp.210~220(2016)*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023113203A1 (ko) 2023-06-22
KR20230089470A (ko) 2023-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2021100428A (ja) 単離した腎細胞およびその使用
JP5340599B2 (ja) 臍帯組織由来産褥細胞ならびにその製造方法および使用方法
US7247477B2 (en) Methods for the in-vitro identification, isolation and differentiation of vasculogenic progenitor cells
RU2558778C2 (ru) Лечение инсульта с использованием изолированных плацентарных клеток
ES2600555T3 (es) Reparación y regeneración de tejido ocular usando células derivadas del post parto
JP6042614B2 (ja) 肺臓の組織工学
US7658951B2 (en) Method of improving cardiac function of a diseased heart
WO2014027684A1 (ja) 心筋梗塞の修復再生を誘導する多能性幹細胞
CN105916977A (zh) 用于使用自体细胞系统从生殖系细胞离体产生有发育能力的卵的方法和组合物
JP2010029680A (ja) 三次元組織構造体
TW202011974A (zh) 利用胎盤幹細胞之血管新生
US20080194023A1 (en) Generating vascular smooth muscle cells in vitro from ES cells
JP2008523823A (ja) ヒト胚性幹細胞の分化ならびにそれに由来する心筋細胞および心筋前駆細胞
US20230174950A1 (en) Kidney Organoids Having a Nephron-like Structure and Methods of Preparing the Same
CN105769910B (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的应用
BR102014006335A2 (pt) células-tronco de polpa dentária imaturas multifuncionais e aplicações terapêuticas
TW201908478A (zh) 調節米勒神經膠質細胞之方法
JP2021104053A (ja) 刺激胎盤幹細胞を使用した血管新生
KR102133693B1 (ko) 타액선 유래 줄기세포를 타액선 조직으로 분화시키는 방법 및 구강 건조증 치료 또는 예방용 조성물
KR102571867B1 (ko) 고도 분화 신장 오가노이드 제조 방법
EP1690929A1 (en) Regeneration treatment system
JP2017537702A (ja) 前駆細胞を用いた眼球症状の治療法
US20170290861A1 (en) Treatment of diabetic foot ulcer using placental stem cells
JP2019524688A (ja) 前駆細胞を用いた網膜血管疾患の治療
JP2019501888A (ja) 前駆細胞を用いた網膜変性の治療

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right