KR20170110579A - 신장 오가노이드를 형성시키기 위한 다능성 줄기세포의 분화 - Google Patents
신장 오가노이드를 형성시키기 위한 다능성 줄기세포의 분화 Download PDFInfo
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Abstract
네프론, 요관 싹 및 이들의 혈관구조 및/또는 전구세포를 포함하는 신장 오가노이드의 생성 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 혈관화된 신장 오가노이드의 형성을 촉진하는 조건하에서 중간 중배엽 세포를, 섬유아세포 성장인자 9 및/또는 섬유아세포 성장인자 20 및/또는 섬유아세포 성장인자 2 및 임의로, 골형성 단백질 7; 헤파린; Wnt 작용물질; 레티노산; 및 RA 길항물질로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상과 접촉시킴을 포함한다. 또 다른 실시태양은 다능성 줄기세포를 Wnt 작용물질 및 섬유아세포 성장인자 9 및/또는 섬유아세포 성장인자 20 및/또는 섬유아세포 성장인자 2와 연속적으로 접촉시킨 다음 상기 Wnt 작용물질에 비교적 짧게 다시-노출시킴으로써 중배엽 세포를 생성시킴을 포함한다. 상기 신장 오가노이드는 신장 수복 및 재생, 신장 또는 그의 기능적 성분의 바이오프린팅, 신장세포 어레이, 및 신독성에 대한 화합물의 선별과 같은 최종 용도를 가질 수 있다.
Description
본 발명은 신장 발생(kidney development)에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은, 적어도 부분적으로 혈관화되고 신장 간질 구획 (renal interstitial compartment)을 함유하는 네프론 및/또는 요관싹 및/또는 이들의 전구세포를 포함하는 신장 오가노이드의 시험관내 생성 방법에 관한 것이다.
세계적으로 매년 8%씩 상승하는 말기 신장병의 이환율에 따라, 신장 재생 전략이 시급히 필요하다. 신장은 요관싹(UB)의 형성 및 상기 싹과 인접한 IM-유래된 후신 간엽(MM)간의 상호작용을 통해 중간 중배엽(IM)으로부터 분화하는 중배엽 기관이다. 네프론은 상기 MM으로부터 유래된 네프론 전구세포 집단으로부터 발생한다. 상기 IM 또는 MM내의 다른 전구세포들은 사구체 모세관을 포함한 신장 혈관구조의 성분 및 신장 기질/간질에 기여하는 것으로서 간주된다. 상기 IM 자체는 후방 원시줄무늬 (posterior primitive streak)로부터 유래한다. 상기 신장의 발생 기원은 충분히 이해되고 있지만, 인간 신장에서 네프론 형성은 출생 전에 완성된다5. 따라서, 상실된 네프론을 대체할 수 있는 산후 줄기세포는 없다.
인간 다능성 줄기세포는 신장병에 대한 세포-기반 치료제의 생성에 큰 가능성을 갖는다. 그러나, 예를 들어 신장병에 대한 임상용 세포 공급원으로서 및 치료제로서 인간 다능성 줄기세포의 실현은, 네프론 및 신장의 다른 구조를 생성시키는 필수 세포 유형을 생성시키는 방법에 대한 이해의 결여가 장애가 되었다.
본 발명자들은 정상적인 배발생 동안 사용되는 성장인자들을 사용하여 충분히 화학적으로 한정된 단층 배양 조건하에서 후방 원시줄무늬 및 중간 중배엽(IM)을 통해 인간 다능성 줄기세포의 분화를 성공적으로 지시하였다. 상기 분화 프로토콜은 시험관내에서, 네프론 형성 및 원위세관, 근위세관 및 보우만 주머니를 형성하는 분할을 포함한 자기-조직화 구조를 형성하는 요관싹(UB) 및 후신 간엽(MM)의 동기 유도 (synchronous induction)를 생성시킨다. 오가노이드는 또한 간엽-유래된 신장 기질을 함유한다. 상기와 같은 hESC-유래된 성분들은 생체외에서 광범위한 신장 잠재력을 나타내며, 이는 다능성 줄기세포-기반 신장 재생 잠재력을 예시한다. 이에 더하여, 본 발명자들은 분화된 요관싹(UB), 후신 간엽(MM) 및 MM-유래된 네프론 및 기질을 포함하는 신장 오가노이드내에서 혈관의 분화를 지시하였다. 특정한 형태에서, 본 발명은 단축된 배양 기간 동안 신장 오가노이드를 형성하는 응집된 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 생성을 제공한다. 보다 특히, 본 발명은 내피 및 신장 간질에 의해 둘러싸인 완전히 분할된 (segmented) 네프론을 포함하고 인간 태아 신장과 전사적으로 유사한 복잡한 다세포성 신장 오가노이드를 형성하도록 인간 다능성 줄기세포를 지시하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 하나의 태양은 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 하나 이상의 신장 오가노이드로의 응집을 유도하거나 촉진하고 이에 의해 상기 신장 오가노이드가 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함하도록 하는 조건하에서 중간 중배엽(IM) 세포를 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유아세포 성장인자 20(FGF20) 및/또는 섬유아세포 성장인자 2(FGF2); 및 임의로 골형성 단백질 7(BMP7); 헤파린; Wnt 작용물질 (agonist); 레티노산(RA), 유사체 또는 작용물질; 및 RA 길항물질 (antagonist)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 적어도 부분적인 혈관화 및/또는 혈관 전구세포의 존재는 중간엽 세포 또는 조직으로부터의 혈관 내피 또는 혈관 전구세포의 발생을 촉진하거나 지시하는 조건에 의해 촉진된다.
하나의 실시태양에서, 상기 신장 오가노이드의 혈관화는 하나 이상의 인간 다능성 줄기세포 및/또는 그로부터 분화된 혈관 내피 전구세포의 포함에 의해 촉진된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 신장 오가노이드의 혈관화는 혈관화를 촉진하는 적합한 산소 분압의 사용에 의해 촉진된다.
하나의 실시태양에서, 상기 IM 세포는 후방 원시줄무늬 세포로부터 유래되거나 분화된다.
하나의 실시태양에서, 상기 후방 원시줄무늬 세포는 인간 다능성 줄기세포(hPSC)로부터 유래되거나 분화된다. hPSC의 비제한적인 예는 인간 배아 줄기세포(hESC) 및 유도된 인간 다능성 줄기세포(iPSC)를 포함한다.
본 발명의 관련 태양은 중배엽 세포의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 hPSC를 Wnt 작용물질과 접촉시켜 중배엽 세포를 생성시키는 단계를 포함한다. 상기 중배엽 세포는 중배엽 세포들의 혼합 집단, 예를 들어 입쪽 IM 및/또는 꼬리쪽 IM을 포함한 중간 중배엽(IM) 및 완성 중배엽 (definitive mesoderm)일 수 있다.
상기 방법은 상기 완성 중배엽 세포를 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유아세포 성장인자 20(FGF20) 및/또는 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)와 접촉시키는 후속 단계를 추가로 포함할 수 있다.
적합하게는, 상기 완성 중배엽 세포를 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유아세포 성장인자 20(FGF20) 및/또는 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)와 접촉시키는 후속 단계는 중간 중배엽(IM)의 형성을 촉진하고, 후속으로 상기 IM 세포로부터 요관 상피 및 네프론 전구세포 모두의 분화를 생성시킨다.
추가의 실시태양에서, 상기 방법은 FGF2, FGF9 및/또는 FGF20의 존재하에서 배양을 위해 상기 세포를 펠릿으로 해리시키고 재응집시키는 후속 단계를 추가로 포함한다. 적합하게는, 상기 단계는 네프론을 포함하는 신장 오가노이드의 생성을 촉진한다. 상기 FGF2, FGF9 및/또는 FGF20 존재하에서의 배양을 플로팅 필터상에서 공기/배지 계면에서 수행할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 상기 방법은 FGF2, FGF9 및/또는 FGF20의 제거 전 Wnt 작용물질의 첨가 및 성장인자 부재하의 후속 배양을 추가로 포함한다. 상기 단계는 신장 오가노이드내 네프론의 형성을 더욱 촉진한다. 적합하게는, 상기 Wnt 작용물질은 비교적 단기간(예를 들어 30 내지 60분) 동안 비교적 고농도이다.
임의로, 상기 언급한 단계들 중 임의의 단계에서 상기 Wnt 작용물질, 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유아세포 성장인자 20(FGF20) 및/또는 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)의 존재하에서의 세포의 배양은 레티노산(RA) 길항물질, RA 또는 RA 작용물질, 골형성 단백질 7(BMP7) 및/또는 레티노산 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 신장 오가노이드는 적어도 부분적으로 혈관화된다.
바람직하게, 상기 신장 오가노이드는 내피, 혈관주위 세포 및 신장 간질에 의해 둘러싸인 분할된 네프론을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 신장 오가노이드의 혈관화는 하나 이상의 인간 다능성 줄기세포 및/또는 그로부터 분화된 혈관 내피 전구세포의 포함에 의해 촉진된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 신장 오가노이드의 혈관화는 혈관화를 촉진하는 적합한 산소 분압의 사용에 의해 촉진된다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 생육성 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포를 식별하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 생육성 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포의 식별은 상기 생육성 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포에 대한 마커로서 다수의 핵산 및/또는 단백질의 동시-발현의 측정 또는 검출을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 언급한 태양의 방법에 따라 생성된 단리되거나, 농축되거나 또는 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드를 제공한다.
바람직하게, 상기 신장 오가노이드는 내피 및 신장 간질에 의해 둘러싸인 분할된 네프론을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 신장, 또는 신장 세포 또는 조직의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 언급한 태양들의 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드로부터 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 분화시켜 상기 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생성시키는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드를 전체 기관 탈세포화된 신장의 재세포화에 사용하여 재구성된 또는 교체 신장을 생성시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 상기 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드를 신장 질환 및 병증의 세포 요법을 위한 공급원으로서 사용할 수 있다.
몇몇 태양에서, 상기 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드를 신장 이식 또는 만성 신장 손상 또는 질병의 치료를 위한 전체 신장, 신장 세포 및/또는 조직의 바이오프린팅 또는 생물공학용 세포 또는 조직의 공급원으로서 사용할 수 있다.
특정 태양은 신장 구조물의 바이오프린트 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 다수의 hPSC 또는 다른 전구세포를 침착시켜, 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나, 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 신장 구조물을 형성시킴을 포함한다.
적합하게는, 상기 신장 구조물은 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함한다.
적합하게는, 상기 hPSC 또는 다른 전구세포에, 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 3차원 구조로 생성시키기 위한 본 명세서에 개시된 방법을 수행한다.
상기 특정 태양은 또한 상기 언급한 방법에 의해 생성된, 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 바이오프린트된 신장 구조물을 제공한다.
또 다른 특정 태양은 신장 구조물의 바이오프린트 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 다수의 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 침착시켜 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나, 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 신장 구조물을 형성시킴을 포함한다.
적합하게는, 상기 바이오프린트된 신장 구조물은 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함한다.
적합하게는, 상기 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 hPSC로부터 생성되었다.
상기 특정 태양은 또한 상기 언급한 방법에 의해 생성된, 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나, 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는, 바이오프린트된 신장 구조물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 평면 기하학적 구조 (planar geometry)를 갖는 네프론 전구세포 및 요관 전구세포의 어레이 (array)를 제공한다.
상기 어레이는 2 내지 15 또는 그 이상의 적층된 어레이를 포함할 수 있다.
상기 어레이는 바둑판 패턴으로 적층될 수 있다.
본 발명의 관련 태양은 상기 언급한 태양의 어레이 또는 그 중의 세포의 성숙화 또는 분화에 의해 수득된 신장 오가노이드를 제공한다.
적합하게는, 상기 신장 오가노이드는 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 하나 또는 다수의 화합물의 신독성을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 하나 또는 다수의 화합물을 상기 언급된 태양들의 단리되거나 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포, 바이오프린트된 신장 구조물, 어레이 및/또는 신장 오가노이드, 또는 그로부터 분화되거나 또는 달리 수득된 신장 세포 또는 조직과 접촉시켜, 상기 하나 또는 다수의 화합물이 신독성인지 아닌지를 측정하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 태양은 신독성 선별을 위해 상기 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포의 신장 오가노이드로의 바이오프린팅을 제공한다.
도 1. CHIR과 FGF9 단독(b) 또는 RA(a) 또는 RA 길항물질(c)과 함께 3, 4 또는 5일 동안의 차별적인 배양 효과.
도 2. 형성되는 네프론들간에 존재하는 MEIS1+ 기질 집단의 존재. 적색 = MEIS1; 청색 = 핵.
도 3. CD31+ 혈관 전구세포의 존재. 적색 = NPHS1(발세포 (podocyte)), 청색 = 핵, 녹색 = CD31.
도 4. 서로 결합된 집합관(GATA3+PAX2+ECAD+), 원위세관(ECAD+GATA3-LTL-), 근위세관(LTL+AQP1+) 및 사구체(WT1+NPHS1+SYNPO+)를 포함한, 정상 발생 네프론의 모든 분절들의 존재(정상적인 배아 기관형성을 암시한다). 분홍색 = GATA3, 녹색 = ECAD, 청색 = LTL, 적색 = WT1, 집합관(분홍색 및 녹색), 원위세관(녹색), 근위세관(청색), 사구체(핵이 적색).
도 5. 펠릿화 후 11일 배양의 신장 오가노이드. a = 3 내지 5 ㎝의 직경을 나타내는 광시야 상. b = 면역형광 염색의 상. 녹색 = ECAD, 적색 = NPHS1, 청색 = LTL, 원위세관(녹색), 근위세관(청색), 사구체(적색).
도 6. 재응집시 바로 고 CHIR(5 μM)의 45분 펄스의 추가에 이어서, 5일 동안 AGN(레티노산 억제제), BMP7, 저 CHIR 또는 RA와 함께 또는 상기 없이 FGF9 중에서 배양, 이어서 6일 동안 상기 인자들 없이 배양. a = CHIR 부재하의 4일 펠릿; b = 45분 CHIR 펄스 존재하의 4일 펠릿; c = CHIR 부재하의 11일 펠릿; d = 45분 CHIR 펄스 존재하의 11일 펠릿.
도 7. 집합관 또는 신장 간엽 계통의 선택적인 유도. a, 배발생13에서 IM의 A-P 패턴화의 기전을 예시하는 도해. PSM 세포 이동의 타이밍이, AI와 PI간의 운명을 선택하는 FGF9 및 RA에의 노출 타이밍을 결정한다. PSM, 체절발생전 중배엽; AI, 전방 중간 중배엽; PI, 후방 중간 중배엽; UE, 요관 상피; MM, 후신 간엽. b, 3개의 실험 타임라인의 도해. c, 상기 타이밍들로부터의 분화의 초기 7일의 시간과정 qPCR. 실험을 단층 배양 조건을 사용하여 수행하였다. (평균±s.d., n = 3개의 독립 실험) d, AI 마커, GATA3 및 PI 마커, HOXD11에 대한 분화 7일째의 면역형광. 스케일 = 100 ㎛. 실험 반복 = 3 e, 원시줄무늬 단계 후 RA 신호전달을 예시하는 도해. RA-대사 효소, CYP26이 PSM 영역에서 발현되어 PSM 세포를 RA 신호로부터 차폐한다. f, 3개 실험 타임라인의 도해. RA 또는 AGN193109(AGN)를 CHIR99021 다음에 FGF9와 함께 첨가한 다음 성장인자를 회수하였다(GF 없음). 실험을 단층 배양 조건으로 수행하였다. g, 3일 CHIR99021에 이어서 ±RA/AGN으로부터 분화 18일째의 면역형광. AGN은 초기 이동 세포의 AI 명시를 방해하여 후방화를 야기하였다. 18일째에, GATA3 및 HOXD11은 각각 UE 및 MM을 표시한다(좌측 패널). GATA3+PAX2+ECAD+ 세포는 UE를 나타내는 반면 GATA3-PAX2+ 세포는 MM(ECAD-) 및 그의유도체(ECAD+)를 나타낸다(우측 패널). 실험 반복 = 3. 스케일 = 100 ㎛.
도 8. 시험관내에서 인간 태아 신장과 동등한 신장 오가노이드의 생성. a, hPSC로부터 분화 프로토콜의 도해. b, 일련의 시간에 걸친 자기-조직화 신장 오가노이드의 전체적인 광시야 관찰. 오가노이드 분화의 성공률은 94.2%(138 오가노이드, 5 실험)였다. 스케일 = 1 ㎜. c, 구조적 복잡성을 나타내는 전체 신장 오가노이드의 타일 스캔 면역형광. 스케일 = 1 ㎜ d, 4개의 구획(집합관(CD, GATA3+ECAD+), 원위세관(DT, GATA3-ECAD+LTL-), 근위세관(PT, ECAD-LTL+) 및 사구체(G, WT1+)를 포함한다)으로 분할된 네프론을 나타내는 고배율 면역형광 현미경검사. 스케일 = 100 ㎛. e, 11일째 신장 오가노이드의 기부에서 상부까지의 일련의 z-스택 상을 생성시키는 공초점 현미경검사(연장된 데이터 비디오 1 및 2). 도해는 오가노이드 내 상이한 구조물들의 위치를 예시한다. e', e" 및 e"'는 e에 나타낸 위치에서 상기 오가노이드를 통해 촬영된 전형적인 상들이다. 네프론의 각 분절을 하기 기재한 바와 같이 표시한다(또는 도해에 색칠한다): 집합관, GATA3+ECAD+(황색 중 녹색 점); 원위세관, ECAD+(황색); 근위세관, LTL+(적색); 사구체, NPHS1(녹색 원). 스케일 = 100 ㎛. f, 13개의 인간 태아 조직에 대한 신장 오가노이드의 상대적인 전사 일치성을 가시화하는 열 지도(0에서부터 1까지의 점수를 키젠(KeyGene) 연산15을 사용하여 측정하였다). RNA-seq를 4개의 시점(응집 후 0, 3, 11, 18일째)으로부터의 전체 신장 오가노이드 x 1 실험/시점으로부터의 3개의 개별적인 오가노이드상에서 수행하였다(부록 표 2를 참조하시오). g, 앞서 한정된15 85개 핵심 유전자(부록 표 3)를 기본으로, 처음 3개월 및 두 번째 3개월 모두로부터의 인간 태아 기관과 0, 3, 11 및 18일째 신장 오가노이드의 계층적 군집화를 나타내는 계통도. 이는 11일 및 18일 배양으로부터의 처음 3개월 태아 신장과 밀접한 합치 (match)를 명백히 나타낸다.
도 9. 신장 오가노이드는 배양 시간에 따라 점진적인 성숙과 함께 분화하는 네프론, 기질 및 혈관구조의 분화를 함유한다.
a, IM으로부터 신장의 각 세포 성분까지의 발생 경로를 예시하는 도해. CD, 집합관; DT, 원위세관; LoH, 헨레 고리; PT, 근위세관; POD, 발세포; VASC, 혈관구조; STROM, 신장 간질. b-j, 11일 또는 18일째의 신장 오가노이드의 면역형광. b, PAX2, GATA3 및 ECAD에 의해 표시된 집합관. 스케일 = 50 ㎛. c,d, 11일째의 LTL+ECAD-의 초기 근위세관(빈 화살촉). LTL+ECAD+ 성숙화 근위세관은 18일째에 나타난다(백색 화살촉). 스케일 = 100 ㎛. e, 근위세관은 큐빌린(CUBN)을 발현한다. 스케일 = 50 ㎛. f, UMOD 및 ECAD에 의해 표시된 헨레 고리. 스케일 = 50 ㎛. g, WT1 및 NPHS1에 의해 표시된 발세포를 갖는 발생중인 사구체. 스케일 = 50 ㎛. h, 신장 간질내 CD31+ 내피. 스케일 = 200 ㎛. i, 배양 18일째에 사구체내로의 내피 침입의 증거. 스케일 = 50 ㎛. j, MEIS1에 의해 표시된 신장 간질. 스케일 = 100 ㎛. k-m, 신장 오가노이드의 투과형 전자 현미경검사. k, 비교적 드문 짧은 미세융모(m) 및 밀착연접(tj)을 갖는 추정적인 원위세관. l, 브러시 보더(bb)의 특징인 광범위 밀접 충전된 미세융모로 충전된 관강을 갖는 추정적인 근위세관. m, 특징적인 큰 핵 및 1차(pf) 및 2차 발(sf) 돌기를 갖는 발세포(p). 데이터를 최소한 3개의 독립적인 실험으로부터 나타낸다.
도 10. 근위세관의 기능적 성숙화.
a, LTL+ 세관의 식작용 능력을 나타내는 덱스트란 흡수 분석. 스케일 = 50 ㎛. b, 20 μM의 시스플라틴에 의한 신장 오가노이드 처리는 LTL+ECAD+ 근위세관 세포에서 세포사멸을 야기하였다. 세포사멸 세포를 절단된 카스파제 3 항체-염색(CASP3)에 의해 검출하였다. 스케일 = 100 ㎛. c, 신독성제, 시스플라틴에 의한 성숙한 근위세관-특이적 세포사멸을 나타내는 다수의 세포사멸 세관의 정량분석. 5 uM 및 20 uM 시스플라틴에 반응하여, LTL+ECAD+ 성숙 근위세관(PT)은 용량-의존적으로 세포사멸을 겪었다. 대조적으로, LTL+ECAD- 미성숙 PT는 시스플라틴에 반응하지 않았다. P 값을 독립적인 t-검정에 의해 계산하였다(평균±s.e., n = 5개의 독립적인 실험).
도 11. 신장 오가노이드에서 신장형성의 조절. a, 응집 직후 1시간 동안 5 μM의 CHIR99021에 의한 오가노이드 자극은 신장형성을 촉진한 반면(CHIR 펄스), CHIR99021 부재하에서는 단지 제한적인 수의 신장형성 사건만이 발생하였다(펄스 없음). 스케일 = 1 ㎜. b, 상기 CHIR99021 펄스 후 FGF9의 첨가없이, 오가노이드는 신장형성을 개시하지 않았다(-FGF9). 스케일 = 200 ㎛.
도 12. 신장 오가노이드의 발생 중 유전자 발현의 변화. a-c, 신장 오가노이드 배양의 4개 시점(0, 3, 11 및 18일째)에서 선택된 마커 유전자의 발현 변화를 나타내는 그래프. X-축은 RNA 서열분석에서 각 유전자에 대한 검출 수를 나타낸다. 네프론 전구세포(Cap 간엽) 및 집합관 전구세포(요관 끝 (ureteric tip)의 마커는 3일까지 정점이었으며 이어서 떨어졌다(a). 초기 네프론의 마커는 3일까지 증가한 반면, 성숙한 네프론 성분들(근위 및 원위세관 및 발세포)의 마커는 3일 후에 출발하였다. 삽화는 발생중인 신장에서 각각의 선택된 유전자의 발현 영역(청색)을 나타낸다(b).
도 13. D0, D3, D11, D18 분화 실험 및 처음 및 두 번째 3개월(GSE66302)15로부터의 21개 인간 태아 기관의 계층적 군집화를 나타내는 계통도. 샘플 명칭은 개별적인 ID 다음에 기관 명칭 및 임신 주수로 구성된다. 예를 들어, 'DJ1 신장_9'는 개별적인 ID: DJ1으로부터 임신 9주째의 신장을 나타낸다. D0 및 D3 신장 오가노이드는 생식선과 군집을 이루며, 이는 중간 중배엽으로부터의 생식선과 신장 모두의 공통 기원과 일치한다. D11 및 D18 신장 오가노이드는 첫 번째 3개월 인간 신장과 가장 강한 유사성을 나타낸다. 상기 분석에 사용된 분류자 유전자를 표 3에 상세히 나타낸다.
도 14. 신장 오가노이드에서 비-상피 구조물의 특성화. 모든 상을 18일째 신장 오가노이드로부터 촬영하였다. a, KDR+ 혈관상에 부착하는 PDGFRA+ 세포주위 세포. 스케일 = 50 ㎛. b, 일부 사구체는 초기 혈관사이세포를 나타내는 것처럼 PDGFRA+ 세포를 함유하였다19. 스케일 = 50 ㎛.
도 2. 형성되는 네프론들간에 존재하는 MEIS1+ 기질 집단의 존재. 적색 = MEIS1; 청색 = 핵.
도 3. CD31+ 혈관 전구세포의 존재. 적색 = NPHS1(발세포 (podocyte)), 청색 = 핵, 녹색 = CD31.
도 4. 서로 결합된 집합관(GATA3+PAX2+ECAD+), 원위세관(ECAD+GATA3-LTL-), 근위세관(LTL+AQP1+) 및 사구체(WT1+NPHS1+SYNPO+)를 포함한, 정상 발생 네프론의 모든 분절들의 존재(정상적인 배아 기관형성을 암시한다). 분홍색 = GATA3, 녹색 = ECAD, 청색 = LTL, 적색 = WT1, 집합관(분홍색 및 녹색), 원위세관(녹색), 근위세관(청색), 사구체(핵이 적색).
도 5. 펠릿화 후 11일 배양의 신장 오가노이드. a = 3 내지 5 ㎝의 직경을 나타내는 광시야 상. b = 면역형광 염색의 상. 녹색 = ECAD, 적색 = NPHS1, 청색 = LTL, 원위세관(녹색), 근위세관(청색), 사구체(적색).
도 6. 재응집시 바로 고 CHIR(5 μM)의 45분 펄스의 추가에 이어서, 5일 동안 AGN(레티노산 억제제), BMP7, 저 CHIR 또는 RA와 함께 또는 상기 없이 FGF9 중에서 배양, 이어서 6일 동안 상기 인자들 없이 배양. a = CHIR 부재하의 4일 펠릿; b = 45분 CHIR 펄스 존재하의 4일 펠릿; c = CHIR 부재하의 11일 펠릿; d = 45분 CHIR 펄스 존재하의 11일 펠릿.
도 7. 집합관 또는 신장 간엽 계통의 선택적인 유도. a, 배발생13에서 IM의 A-P 패턴화의 기전을 예시하는 도해. PSM 세포 이동의 타이밍이, AI와 PI간의 운명을 선택하는 FGF9 및 RA에의 노출 타이밍을 결정한다. PSM, 체절발생전 중배엽; AI, 전방 중간 중배엽; PI, 후방 중간 중배엽; UE, 요관 상피; MM, 후신 간엽. b, 3개의 실험 타임라인의 도해. c, 상기 타이밍들로부터의 분화의 초기 7일의 시간과정 qPCR. 실험을 단층 배양 조건을 사용하여 수행하였다. (평균±s.d., n = 3개의 독립 실험) d, AI 마커, GATA3 및 PI 마커, HOXD11에 대한 분화 7일째의 면역형광. 스케일 = 100 ㎛. 실험 반복 = 3 e, 원시줄무늬 단계 후 RA 신호전달을 예시하는 도해. RA-대사 효소, CYP26이 PSM 영역에서 발현되어 PSM 세포를 RA 신호로부터 차폐한다. f, 3개 실험 타임라인의 도해. RA 또는 AGN193109(AGN)를 CHIR99021 다음에 FGF9와 함께 첨가한 다음 성장인자를 회수하였다(GF 없음). 실험을 단층 배양 조건으로 수행하였다. g, 3일 CHIR99021에 이어서 ±RA/AGN으로부터 분화 18일째의 면역형광. AGN은 초기 이동 세포의 AI 명시를 방해하여 후방화를 야기하였다. 18일째에, GATA3 및 HOXD11은 각각 UE 및 MM을 표시한다(좌측 패널). GATA3+PAX2+ECAD+ 세포는 UE를 나타내는 반면 GATA3-PAX2+ 세포는 MM(ECAD-) 및 그의유도체(ECAD+)를 나타낸다(우측 패널). 실험 반복 = 3. 스케일 = 100 ㎛.
도 8. 시험관내에서 인간 태아 신장과 동등한 신장 오가노이드의 생성. a, hPSC로부터 분화 프로토콜의 도해. b, 일련의 시간에 걸친 자기-조직화 신장 오가노이드의 전체적인 광시야 관찰. 오가노이드 분화의 성공률은 94.2%(138 오가노이드, 5 실험)였다. 스케일 = 1 ㎜. c, 구조적 복잡성을 나타내는 전체 신장 오가노이드의 타일 스캔 면역형광. 스케일 = 1 ㎜ d, 4개의 구획(집합관(CD, GATA3+ECAD+), 원위세관(DT, GATA3-ECAD+LTL-), 근위세관(PT, ECAD-LTL+) 및 사구체(G, WT1+)를 포함한다)으로 분할된 네프론을 나타내는 고배율 면역형광 현미경검사. 스케일 = 100 ㎛. e, 11일째 신장 오가노이드의 기부에서 상부까지의 일련의 z-스택 상을 생성시키는 공초점 현미경검사(연장된 데이터 비디오 1 및 2). 도해는 오가노이드 내 상이한 구조물들의 위치를 예시한다. e', e" 및 e"'는 e에 나타낸 위치에서 상기 오가노이드를 통해 촬영된 전형적인 상들이다. 네프론의 각 분절을 하기 기재한 바와 같이 표시한다(또는 도해에 색칠한다): 집합관, GATA3+ECAD+(황색 중 녹색 점); 원위세관, ECAD+(황색); 근위세관, LTL+(적색); 사구체, NPHS1(녹색 원). 스케일 = 100 ㎛. f, 13개의 인간 태아 조직에 대한 신장 오가노이드의 상대적인 전사 일치성을 가시화하는 열 지도(0에서부터 1까지의 점수를 키젠(KeyGene) 연산15을 사용하여 측정하였다). RNA-seq를 4개의 시점(응집 후 0, 3, 11, 18일째)으로부터의 전체 신장 오가노이드 x 1 실험/시점으로부터의 3개의 개별적인 오가노이드상에서 수행하였다(부록 표 2를 참조하시오). g, 앞서 한정된15 85개 핵심 유전자(부록 표 3)를 기본으로, 처음 3개월 및 두 번째 3개월 모두로부터의 인간 태아 기관과 0, 3, 11 및 18일째 신장 오가노이드의 계층적 군집화를 나타내는 계통도. 이는 11일 및 18일 배양으로부터의 처음 3개월 태아 신장과 밀접한 합치 (match)를 명백히 나타낸다.
도 9. 신장 오가노이드는 배양 시간에 따라 점진적인 성숙과 함께 분화하는 네프론, 기질 및 혈관구조의 분화를 함유한다.
a, IM으로부터 신장의 각 세포 성분까지의 발생 경로를 예시하는 도해. CD, 집합관; DT, 원위세관; LoH, 헨레 고리; PT, 근위세관; POD, 발세포; VASC, 혈관구조; STROM, 신장 간질. b-j, 11일 또는 18일째의 신장 오가노이드의 면역형광. b, PAX2, GATA3 및 ECAD에 의해 표시된 집합관. 스케일 = 50 ㎛. c,d, 11일째의 LTL+ECAD-의 초기 근위세관(빈 화살촉). LTL+ECAD+ 성숙화 근위세관은 18일째에 나타난다(백색 화살촉). 스케일 = 100 ㎛. e, 근위세관은 큐빌린(CUBN)을 발현한다. 스케일 = 50 ㎛. f, UMOD 및 ECAD에 의해 표시된 헨레 고리. 스케일 = 50 ㎛. g, WT1 및 NPHS1에 의해 표시된 발세포를 갖는 발생중인 사구체. 스케일 = 50 ㎛. h, 신장 간질내 CD31+ 내피. 스케일 = 200 ㎛. i, 배양 18일째에 사구체내로의 내피 침입의 증거. 스케일 = 50 ㎛. j, MEIS1에 의해 표시된 신장 간질. 스케일 = 100 ㎛. k-m, 신장 오가노이드의 투과형 전자 현미경검사. k, 비교적 드문 짧은 미세융모(m) 및 밀착연접(tj)을 갖는 추정적인 원위세관. l, 브러시 보더(bb)의 특징인 광범위 밀접 충전된 미세융모로 충전된 관강을 갖는 추정적인 근위세관. m, 특징적인 큰 핵 및 1차(pf) 및 2차 발(sf) 돌기를 갖는 발세포(p). 데이터를 최소한 3개의 독립적인 실험으로부터 나타낸다.
도 10. 근위세관의 기능적 성숙화.
a, LTL+ 세관의 식작용 능력을 나타내는 덱스트란 흡수 분석. 스케일 = 50 ㎛. b, 20 μM의 시스플라틴에 의한 신장 오가노이드 처리는 LTL+ECAD+ 근위세관 세포에서 세포사멸을 야기하였다. 세포사멸 세포를 절단된 카스파제 3 항체-염색(CASP3)에 의해 검출하였다. 스케일 = 100 ㎛. c, 신독성제, 시스플라틴에 의한 성숙한 근위세관-특이적 세포사멸을 나타내는 다수의 세포사멸 세관의 정량분석. 5 uM 및 20 uM 시스플라틴에 반응하여, LTL+ECAD+ 성숙 근위세관(PT)은 용량-의존적으로 세포사멸을 겪었다. 대조적으로, LTL+ECAD- 미성숙 PT는 시스플라틴에 반응하지 않았다. P 값을 독립적인 t-검정에 의해 계산하였다(평균±s.e., n = 5개의 독립적인 실험).
도 11. 신장 오가노이드에서 신장형성의 조절. a, 응집 직후 1시간 동안 5 μM의 CHIR99021에 의한 오가노이드 자극은 신장형성을 촉진한 반면(CHIR 펄스), CHIR99021 부재하에서는 단지 제한적인 수의 신장형성 사건만이 발생하였다(펄스 없음). 스케일 = 1 ㎜. b, 상기 CHIR99021 펄스 후 FGF9의 첨가없이, 오가노이드는 신장형성을 개시하지 않았다(-FGF9). 스케일 = 200 ㎛.
도 12. 신장 오가노이드의 발생 중 유전자 발현의 변화. a-c, 신장 오가노이드 배양의 4개 시점(0, 3, 11 및 18일째)에서 선택된 마커 유전자의 발현 변화를 나타내는 그래프. X-축은 RNA 서열분석에서 각 유전자에 대한 검출 수를 나타낸다. 네프론 전구세포(Cap 간엽) 및 집합관 전구세포(요관 끝 (ureteric tip)의 마커는 3일까지 정점이었으며 이어서 떨어졌다(a). 초기 네프론의 마커는 3일까지 증가한 반면, 성숙한 네프론 성분들(근위 및 원위세관 및 발세포)의 마커는 3일 후에 출발하였다. 삽화는 발생중인 신장에서 각각의 선택된 유전자의 발현 영역(청색)을 나타낸다(b).
도 13. D0, D3, D11, D18 분화 실험 및 처음 및 두 번째 3개월(GSE66302)15로부터의 21개 인간 태아 기관의 계층적 군집화를 나타내는 계통도. 샘플 명칭은 개별적인 ID 다음에 기관 명칭 및 임신 주수로 구성된다. 예를 들어, 'DJ1 신장_9'는 개별적인 ID: DJ1으로부터 임신 9주째의 신장을 나타낸다. D0 및 D3 신장 오가노이드는 생식선과 군집을 이루며, 이는 중간 중배엽으로부터의 생식선과 신장 모두의 공통 기원과 일치한다. D11 및 D18 신장 오가노이드는 첫 번째 3개월 인간 신장과 가장 강한 유사성을 나타낸다. 상기 분석에 사용된 분류자 유전자를 표 3에 상세히 나타낸다.
도 14. 신장 오가노이드에서 비-상피 구조물의 특성화. 모든 상을 18일째 신장 오가노이드로부터 촬영하였다. a, KDR+ 혈관상에 부착하는 PDGFRA+ 세포주위 세포. 스케일 = 50 ㎛. b, 일부 사구체는 초기 혈관사이세포를 나타내는 것처럼 PDGFRA+ 세포를 함유하였다19. 스케일 = 50 ㎛.
본 발명은 중간 중배엽(IM)으로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 동기, 동시 분화를 촉진하여 적어도 부분적으로 혈관화된 신장 오가노이드 또는 다른 신장 세포 또는 조직 응집체를 생성하도록 맞춘 특정한 시험관내 배양 조건의 확인에 적어도 부분적으로 기초를 둔다. 보다 구체적으로, FGF9 + 헤파린 단독, 또는 골형성 단백질 7(BMP7), 레티노산(RA), RA 길항물질, Wnt 작용물질; 및/또는 FGF20 + 헤파린; 및/또는 FGF2 + 헤파린을 포함한 하나 이상의 작용제와 함께 중간 중배엽의 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 이에 더하여, 상기 시험관내 배양 방법은 후방 원조줄무늬, IM 및 후신 중간엽 단계를 통해 인간 배아 줄기세포를 분화시키는 시스템을 제공하여 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생성시킨다. 유리하게, 몇몇 분자, 예를 들어 RA, RA 길항물질 및/또는 Wnt 작용물질의 존재 또는 부재를, 네프론 전구세포 대 요관 상피 전구세포의 생성, 또는 이와 역의 생성을 우선적으로 촉진할 수 있도록 조작할 수 있다. 보다 특히, 본 발명은 또한 인간 다능성 줄기세포를, 내피 및 신장 간질에 의해 둘러싸인 완전히 분할된 네프론을 포함하고 인간 태아 신장과 전사적으로 유사한 복잡한 다세포 신장 오가노이드를 형성하도록 지시할 수 있다는 발견에 기초를 둔다. 혈관화는 중간엽 세포 또는 조직으로부터 혈관 내피의 발생을 촉진하거나 지시하는 조건들에 의해 촉진될 수 있다.
상기 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포는 생체내에서 서로의 분화를 동시에 유도, 지시하고 요관 트리(ureteric tree) 및 네프론 전구세포 간엽을 포함한 독특한 관상 상피 구조물로 발달할 수 있으며, 이러는 동안 상기 상피 구조물은 상기 요관 끝을 대신하여 상기 네프론 전구세포를 유지한다. 따라서, 본 발명에 따라 생성된 hESC-유래된 요관 상피 및/또는 네프론 전구세포가 상기 요관 및 중간엽 구획 모두로부터 신장 세포로 분화하도록 지시될 수 있음이 제안된다. 더욱 또한, 상기 세포가 응집된 오가노이드 구조물로 '자기-조직화'하는 능력을 활용하여, 예를 들어 신장 생물공학에 의해 신장 수복을 촉진할 수 있다. 상기 네프론 전구세포, 그로부터 유래된 네프론, 또는 상술한 바와 같이 "자기-조직화된" 신장 오가노이드는 또한 신독성 시험(이는 앞서 시험에 적합한 세포를 생성시킬 수 없음에 의해 곤란하였다)에 적합할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술과학용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 기재한다.
내용상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "포함하다"란 용어 및 상기 용어의 어미변화, 예를 들어 "포함하는", 및 "포함된"은 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계들을 제외하고자 하지 않는다.
부정 관사 "하나의"는 단일의 부정 관사로서, 또는 달리 상기 부정 관사가 지칭하는 단일의 주어보다 하나 이상 더 많음은 제외하는 것으로서 판독해서는 안 된다. 예를 들어, "하나의" 세포는 하나의 세포, 하나 이상의 세포 및 다수의 세포를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해서, "단리된"은 자연 상태로부터 제거되었거나 또는 달리 인간의 조작이 가해진 물질을 의미한다. 단리된 물질(예를 들어 세포)은 그의 자연 상태에서 통상적으로 상기와 동반되는 성분들이 실질적으로 또는 필수적으로 없거나, 또는 인위적인 상태에서, 그의 자연 상태에서 통상적으로 상기와 동반되는 성분들과 함께 있도록 조작될 수도 있다.
"농축된" 또는 "정제된"은 농축 또는 정제 전의 선행 상태에 비해 특정 상태(예를 들어 농축된 또는 정제된 상태)에서 보다 높은 발생률, 표시 또는 빈도를 가짐을 의미한다.
"분화하다", "분화하는" 및 "분화된"이란 용어들은 발생 경로의 보다 이른 또는 초기 단계로부터 상기 발생 경로의 말기 또는 보다 성숙한 단계로의 세포의 진행에 관한 것이다. 이와 관련하여 "분화된"은 상기 세포가 완전히 분화되고 다능성 또는 상기 발생 경로를 따라 또는 다른 발생 경로를 따라 추가로 진행하는 능력을 상실했음을 의미하거나 내포하지 않는다. 분화는 세포 분열을 동반할 수 있다.
"전구세포"는 자기-재생과 함께 또는 상기 없이 하나의 또는 다수의 발생 경로를 따라 분화할 수 있는 세포이다. 전형적으로, 전구세포는 단일분화성이거나 올리고분화성이며 적어도 제한된 자기-재생이 가능하다.
당해 분야에 충분히 이해되는 바와 같이, 세포의 분화 단계 또는 상태는 다수의 마커 중 하나의 발현 및/또는 비-발현을 특징으로 할 수 있다. 이와 관련하여, "마커"는 발현 또는 발현 패턴이 발생 전체를 통해 변하는 세포, 세포 집단, 계통, 구획 또는 부분집합의 게놈에 의해 암호화되는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 핵산 마커 발현은 당해 분야에 공지된 임의의 기법, 예를 들어 핵산 서열 증폭(예를 들어 폴리머라제 쇄 반응) 및 핵산 하이브리드화(예를 들어 미세어레이, 노던 하이브리드화, 원위치 하이브리드화)에 의해 검출되거나 측정될 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 단백질 마커 발현은 당해 분야에 공지된 임의의 기법, 예를 들어 유식 세포측정, 면역조직화학, 면역블럿팅, 단백질 어레이, 단백질 프로파일링(예를 들어 2D 젤 전기영동)에 의해 검출되거나 측정될 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 하나의 태양은 중간 중배엽(IM) 세포를 BMP7; 레티노산(RA); RA 길항물질; Wnt 작용물질; 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 FGF20; 및 헤파린과 접촉시켜 상기 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생성시키는 단계를 포함하는 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 생성 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "레티노산" 또는 "RA"에 대한 언급은 모든 형태의 레티노산(예를 들어 모든 트랜스 RA 및 9-시스 RNA), RA와 유사한 생물 활성을 갖는 유사체 및/또는 레티노산 수용체(RAR) 작용물질을 포함한다. 다양한 상이한 RA 유사체 및 RAR 작용물질(RARα, β 또는 γ에 대해 선택성 및 비선택성 작용물질 포함)을 R&D 시스템스 및 토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
"RA 길항물질"에 대한 구체적인 언급은 레티노산 수용체(RAR) 길항물질 및 RAR을 통한 RA 신호전달을 억제하거나, 차단하거나 방지하는 임의의 다른 분자(들)를 포함한다. RAR 길항물질의 비제한적인 예는 AGN193109, LE 135, ER 50891, BMS 493, BMS 453 및 MM 11253을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 상기 정의는 상기 RA 길항물질이 또한 또는 한편으로 또 다른 리간드의 결합으로부터 RAR을 통한 신호전달에서 장애물을 모방할 가능성을 배제하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "Wnt 작용물질"은 기본적인 Wnt 신호전달 경로와 관련하여 GSK3(예를 들어 GSK3-β)를 억제하지만, 바람직하게는 다른 기본적이지 않은 Wnt 신호전달 경로와 관련해서는 억제하지 않는 분자이다. Wnt 작용물질의 비제한적인 예는 CHIR99021, LiCl SB-216763, CAS 853220-52-7 및 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) 및 R&D 시스템스와 같은 공급처로부터 상업적으로 입수할 수 있는 다른 Wnt 작용물질을 포함한다. 상기 정의를, 상기 Wnt 작용물질이 GSK3β 활성의 하나 이상의 다른 억제제를 모방할 가능성을 절대적으로 배제하는 것으로서 판독해서는 안 된다.
섬유아세포 성장인자, 예를 들어 FGF2, FGF9 및 FGF20이 호환 가능함을 또한 이해하겠지만, FGF9가 바람직하다. 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 FGF2, FGF9 및/또는 FGF20의 생물 활성을 촉진하거나 증대시키기 위해서 전형적으로는 헤파린을 포함시킨다.
FGF9, BMP7, 레티노산(RA); RA 길항물질; Wnt 작용물질; FGF20 및 헤파린 각각의 바람직한 농도는 본 명세서에서 이후에 보다 상세히 기재할 것이다. 또한 RA 작용물질 또는 유사체, RA 길항물질 및/또는 Wnt 작용물질과 같은 몇몇 분자의 존재 또는 부재를, 네프론 전구세포 대 요관 상피 전구세포의 생성 또는 이와 역의 생성을 우선적으로 촉진하도록 조절하거나 조작함을 또한 언급할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "네프론 전구세포"는 초기 간엽에서 상피로의 전이를 통해 모든 네프론 분절(집합관 이외의)로 분화할 수 있는 후신 간엽으로부터 유래된 전구세포이며, 네프론 상피, 예를 들어 결합 분절, 원위 곡세뇨관(DCT) 세포, 원위 직세뇨관(DST) 세포, 근위 직세뇨관(PST) 분절 1 및 2, PST 세포, 발세포, 사구체 내피 세포, 상행 헨레 고리 및/또는 하행 헨레 고리를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 네프론 전구세포는 또한 자기-재생이 가능하다.
후신 간엽의 특징적인 또는 전형적인 마커의 비제한적인 예는 WT1, SIX1, SIX2, SALL1, GDNF 및/또는 HOXD11을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 네프론 전구세포의 특징적인 또는 전형적인 마커의 비제한적인 예는 WT1, SIX1, SIX2, CITED1, PAX2, GDNF, SALL1, OSR1 및 HOXD11을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"요관 상피 전구세포"는 신장 조직 및/또는 구조물, 예를 들어 집합관으로 발달할 수 있는 중신관 또는 그의 유도체 요관싹으로부터 유래되거나, 수득될 수 있거나 또는 기원하는 상피 전구세포를 의미한다.
요관 상피 전구세포의 특징적인 또는 전형적인 마커의 비제한적인 예는 HOXB7, cRET, GATA3, CALB1, E-카데린 및 PAX2를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 앞서 기재한 바와 같이, 상기 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포는 FGF9 단독의 존재하에서 또는 BMP7, 레티노산(RA), 작용물질 또는 유사체, RA 길항물질, 예를 들어 AGN193109 및/또는 FGF20 및 바람직하게는 헤파린을 포함하는 하나 이상의 작용제와 함께 중간 중배엽(IM) 세포로부터 분화된다.
"중간 중배엽(IM)" 세포는 완성 중배엽(상기는 차례로 후방 원시줄무늬로부터 유래된다)으로부터 발생하고 최종적으로 비뇨생식계(요관 및 신장 및 생식선과 같은 다른 조직 포함)로 발달할 수 있는 배아 중배엽 세포를 의미한다. 중간 중배엽의 특징적인 또는 전형적인 마커의 비제한적인 예는 PAX2, OSR1 및/또는 LHX1을 포함한다.
또한, IM 세포의 생성이, 상기 IM 세포가 다른 세포 유형(예를 들어 완성 중배엽)이 존재하지 않는 IM 세포의 순수한 또는 동종 집단임을 암시함을 의미하는 것은 아님을 알 것이다. 따라서, "IM 세포" 또는 "IM 세포의 집단"에 대한 언급은 상기 세포 또는 세포 집단이 IM 세포를 포함함을 의미한다.
적합하게는, 본 발명에 따라 IM 세포를 본 명세서에서 이후에 보다 상세히 기재하는 바와 같이, 후방 원시줄무늬 세포를 상기 후방 원시줄무늬 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진하는 하나 이상의 작용제와 접촉시킴으로써 생성시킨다.
바람직하게, 상기 IM 세포를, 후방 원시줄무늬 세포를 상기 후방 원시줄무늬 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진하는 하나 이상의 작용제와 접촉시킴으로써 생성시킨다.
전형적으로, 상기 하나 이상의 작용제는 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및 임의로 RA 길항물질, 예를 들어 AGN193109 및/또는 하나 이상의 다른 FGF, 예를 들어 FGF2 및/또는 FGF20을 포함한다.
"후방 원시줄무늬(PPS)" 세포는 포유동물 배발생의 초기 단계 동안 포배 중에서 형성되는 원시줄무늬 구조물의 후방 단부로부터 수득될 수 있는 세포 또는 상기 세포에 기능적으로 및/또는 표현형적으로 상응하는 세포를 의미한다. 상기 후방 원시줄무늬는 양측 대칭을 확고히 하며, 낭배형성 부위를 결정하고, 배엽층 형성을 개시시킨다. 전형적으로, 후방 원시줄무늬는 중배엽의 전구세포(즉 추정상 중배엽)이고 전방 원시줄무늬는 내배엽의 전구세포(즉 추정상 내배엽)이다. 후방 원시줄무늬의 특징적인 또는 전형적인 마커의 비제한적인 예는 Brachyury(T)이다. 전방 원시줄무늬의 특징적인 또는 전형적인 마커의 비제한적인 예는 SOX17이다. MIXL1은 후방 및 전방 원시줄무늬 모두에 의해 발현될 수 있다.
또한 후방 원시줄무늬 세포의 생성은, 상기 후방 원시줄무늬 세포가 다른 세포 유형이 존재하지 않는 후방 원시줄무늬 세포의 순수한 또는 동종 집단임을 암시함을 의미하는 것은 아님을 알 것이다. 따라서, "후방 원시줄무늬 세포" 또는 "후방 원시줄무늬 세포의 집단"에 대한 언급은 상기 세포 또는 세포 집단이 후방 원시줄무늬 세포를 포함함을 의미한다.
적합하게는, 본 발명에 따라 후방 원시줄무늬 세포를 본 명세서에서 이후에 보다 상세히 기재하는 바와 같이, hPSC 세포를 상기 hPSC 세포의 후방 원시줄무늬 세포로의 분화를 촉진하는 하나 이상의 작용제와 접촉시킴으로써 생성시킨다.
전형적으로, 상기 하나 이상의 작용제는 골형성 단백질 4(BMP4), 액티빈 A 및/또는 Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021을 포함한다.
"인간 다능성 줄기세포" 및 "hPSC"란 용어는 다능성을 나타내는 인간 조직으로부터 유래되거나, 수득될 수 있거나 기원하는 세포를 지칭한다. 상기 hPSC는 인간 배아 줄기세포 또는 인간 유도 다능성 줄기세포일 수 있다.
인간 다능성 줄기세포는 내부 세포 덩어리로부터 유래되거나 또는 다수의 태아 또는 성인 체세포 유형으로부터 야마나카(Yamanaka) 인자를 사용하여 재프로그램화될 수 있다. hPSC의 생성은 체세포 핵 이식을 사용하여 가능할 수 있다.
"인간 배아 줄기세포", "hES 세포" 및 "hESC"란 용어는 성숙한 동물 중에 존재하는 세포 유형을 전부 생성시키는 능력을 갖는, 자가-내생성 및 다능- 또는 분화전능성인 인간 배아 또는 배세포로부터 유래되거나, 수득될 수 있거나 기원하는 세포를 지칭한다. 인간 배아 줄기세포(hESC)를 예를 들어 인간 생체내 착상전 배아, 시험관내 수정된 배아, 또는 배반포 단계로 확대된 단세포 인간 배아로부터 수득된 인간 배반포로부터 단리할 수 있다.
"유도 다능성 줄기세포" 및 "iPSC"란 용어는 외인성 유전자, 예를 들어 OCT4, SOX2 , KLF4 및 c- MYC의 바람직한 조합을 포함한 전사 인자의 발현을 통해 다능성 상태로 재프로그램화된 임의의 유형의 인간 성인 체세포로부터 유래되거나, 수득될 수 있거나 기원하는 세포를 지칭한다. hiPSC는 hESC와 동등한 다능성 수준을 나타내지만 분화 및 세포 전달 전에 동시 유전자 보정과 함께 또는 상기 보정 없이 자기유래 요법을 위해 환자로부터 유래될 수 있다.
보다 일반적으로, 본 명세서에 개시된 방법을 유전자-편집을 사용하여 돌연변이 모델을 생성시키거나 또는 유전자-편집을 사용하여 보정된 돌연변이 hPSC를 생성시키기 위해 후속 변형된 hPSC 또는 임의의 환자로부터 유래된 임의의 다능성 줄기세포에 적용할 수 있었다. 유전자-편집은 CRISPR, TALEN 또는 ZF 뉴클레아제 기술에 의할 수 있다.
상기로부터, 본 발명의 바람직한 광범위한 형태가 하기의 연속적인 단계들을 포함하는 방법을 제공함을 알 것이다:
(i) hPSC를, 상기 hPSC의 후방 원시줄무늬 세포로의 분화를 촉진하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키고;
(ii) 후방 원시줄무늬 세포를, 상기 후방 원시줄무늬 세포의 중간 중배엽 세포로의 분화를 촉진하는 하나 이상의 작용제와 접촉시키고;
(iii) 중간 중배엽 세포를 FGF9, 및 임의로 BMP7; 레티노산; RA 길항물질, 예를 들어 AGN193109; Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021; FGF20; 및 헤파린 중 하나 이상과 접촉시켜 상기 중간 중배엽 세포로부터 후신 중간엽 세포 및 요관 상피 전구세포를 생성시킨다.
이들 후속 단계를 본 명세서에서 이후에 하기와 같이 기재할 것이다.
(i)
hPSC의
후방
원시줄무늬로의
분화
상기로부터 인식되는 바와 같이, hPSC를 혈청 부재하에 적합한 배양 배지, 예를 들어 APEL 분화 배지(Ng et al., 2008, Nat. Protoc. 3:768)(상기 배지로 제한되지 않는다)에서 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021과 접촉시켜, 후방 원시줄무늬 세포를 적합하게 포함하는 후방 원시줄무늬 세포를 생성시킨다. 상기 hPSC는 hESC 또는 iPSC일 수 있다.
적합하게는, BMP4는 약 5 내지 40 ng/㎖의 농도이고 액티빈 A는 약 3 내지 40 ng/㎖의 농도이다. 하나의 실시태양에서 BMP4의 농도는 약 20 내지 35 ng/㎖, 또는 보다 바람직하게는 약 30 ng/㎖이다. 하나의 실시태양에서, 액티빈 A의 농도는 약 5 내지 30 ng/㎖ 또는 보다 바람직하게는 10 ng/㎖이다. 적합하게는, 최적의 상대적인 활성비는 3:1 내지 1:6 BMP4 대 액티빈 A의 범위이다. 바람직하게는, 최적의 상대적인 활성비는 3:1 내지 1:1 BMP4 대 액티빈 A의 범위이다.
일부 실시태양에서, Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021은 약 0.5 내지 50 μM, 바람직하게는 약 4 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 약 5 내지 20 μM 또는 유리하게는 약 8 μM 범위의 농도일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, CHIR99021은 단독으로, BMP4 및 액티빈 A의 부재하에서 존재한다.
상기 줄기세포의 집단을 BMP4, 액티빈 A 및/또는 Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021이 있는 배지에서 36 내지 120시간 동안 배양할 수 있다.
일부 비제한적인 실시태양에서, 세포를 hESC에 요구되는 것보다 더 긴 기간 동안 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021과 접촉시킬 수 있다. 예로서, iPSC와 같은 세포를 96 내지 120시간 이하 동안 BMP4, 액티빈 A 및/또는 CHIR99021과 접촉시킬 수 있다.
상기 배양 배지를 24 내지 48시간마다 교환할 수 있다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, hPSC를 본 명세서에 기재된 바와 같이 MBP4, 액티빈 A 및/또는 Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021과 접촉시킨 결과 후방 원시줄무늬를 포함한 원시줄무늬(PS)가 형성된다. 이는 중배엽 및 내배엽 조직의 생성을 향한 초기 단계이다. 전형적으로, pPSC의 분화는 후방 원시줄무늬(추정상 중배엽)의 특징적인 마커를 발현하는 세포 및 전방 원시줄무늬(추정상 내배엽)의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 포함하는 세포들의 혼합 집단을 향한다.
후방 원시줄무늬(추정상 중배엽)의 특징적인 마커의 비제한적인 예는 Brachyury(T)를 포함한다.
전방 원시줄무늬(추정상 내배엽)의 특징적인 마커의 비제한적인 예는 SOX17을 포함한다.
(
ii
) 후방
원시줄무늬
세포의 중간 중배엽(
IM
)
으로의
분화
적합하게는, 후방 원시줄무늬 세포, 또는 후방 원시줄무늬 세포를 포함하는 혼합 원시줄무늬 집단을, 혈청의 부재하에서 적합한 배양 배지, 예를 들어 APEL 분화 배지에서 적어도 FGF9, 및 임의로 FGF2 및/또는 FGF20 및/또는 레티노산(RA) 길항물질을 포함하는 하나 이상의 섬유아세포 성장인자(FGF)와 접촉시킨다.
전형적으로, 상기 레티노산 신호전달 길항물질은 레티노산 수용체(RAR) 억제제 또는 길항물질, 예를 들어 AGN193109이다.
적합하게는, FGF2, FGF9 및/또는 FGF20은 약 100 내지 400 ng/㎖의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, FGF2, FGF9 및/또는 FGF20은 약 150 내지 300 ng/㎖ 또는 유리하게는 약 200 ng/㎖의 농도이다. 하나의 실시태양에서, 상기 RA 길항물질(예를 들어 AGN193109)의 농도는 약 0.1 내지 10 μM 또는 보다 바람직하게는 0.5 내지 5 μM이다.
상기 세포를 적어도 약 96시간 동안, 그러나 약 190 내지 200시간 이하로, FGF9와 단독으로 또는 FGF2 및/또는 FGF20 및/또는 RA 길항물질(예를 들어 AGN193109)과 함께 접촉시킨다. 바람직하게, 상기 세포를 약 96시간 동안 FGF9와 단독으로 또는 FGF2 및/또는 FGF20 및/또는 RA 길항물질(예를 들어 AGN193109)과 접촉시킨다.
상기 배양 배지를 40 내지 48시간마다 교환할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 후방 원시줄무늬 세포(상기는 전형적으로 후방 원시줄무늬(추정상 중배엽) 및 전방 원시줄무늬(추정상 내배엽)의 특징적인 마커를 발현한다)를 FGF9와 단독으로 또는 FGF2 및/또는 FGF20과 함께 접촉시킨 결과, 상기 세포가 중간 중배엽(IM)의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단을 향해 분화한다. 중간 중배엽의 특징적인 마커의 비제한적인 예는 PAX2, LHX1 및 OSR1을 포함한다.
(
iii
) 중간 중배엽(
IM
)의
네프론
전구세포
및 요관 상피
전구세포로의
분화
적합하게는, 후방 원시줄무늬 세포와 FGF2, FGF9 및/또는 FGF20과의 접촉에 이어서, 생성된 IM 세포를 FGF9와 단독으로 또는 BMP7, RA, RA 길항물질, FGF20, Wnt 작용물질 및/또는 헤파린 중 하나 이상과 함께 혈청의 부재하에서 적합한 배양 배지, 예를 들어 APEL 분화 배지에서 접촉시킨다.
적합하게는, FGF9는 약 20 ng 내지 1 ㎍/㎖의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, FGF9는 약 50 내지 500 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300 ng/㎖ 또는 유리하게는 약 200 ng/㎖의 농도이다. 전형적으로, 헤파린은 약 0.1 내지 10 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 0.3 내지 5 ㎍/㎖, 0.5 내지 2 ㎍/㎖ 또는 유리하게는 약 1 ㎍/㎖의 농도로 포함된다.
하나의 실시태양에서, FGF20은 약 20 ng 내지 1 ㎍/㎖의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, FGF20은 약 50 내지 500 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300 ng/㎖ 또는 유리하게는 약 200 ng/㎖의 농도이다.
하나의 실시태양에서, FGF2는 약 20 ng 내지 1 ㎍/㎖의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, FGF2는 약 50 내지 500 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300 ng/㎖ 또는 유리하게는 약 200 ng/㎖의 농도이다.
FGF20 및 FGF2는 FGF9를 대체하거나 보충할 수 있는데, 이들은 유사한 생물 활성을 갖기 때문이다.
하나의 실시태양에서, BMP7은 약 25 ng 내지 75 ng/㎖의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, BMP7은 약 35 내지 60 ng/㎖, 45 내지 55 ng/㎖ 또는 유리하게는 약 50 ng/㎖의 농도이다.
하나의 실시태양에서, RA는 약 10 pM 내지 1 μM의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, RA는 약 30 pM 내지 0.5 μM, 보다 바람직하게는 약 50 pM 내지 0.2 μM 또는 유리하게는 약 0.1 μM의 농도이다. 본 발명에 얽매이는 것은 아니지만, 예비 데이터는 보다 높은 농도의 RA는 요관 상피 전구세포 비율의 상대적인 증가를 촉진하고 보다 낮은 농도의 RA는 요관 상피 전구세포 비율의 상대적인 감소를 촉진함을 암시한다.
하나의 실시태양에서, RA 길항물질, 예를 들어 AGN193109는 약 50 pM 내지 10 μM의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, AGN193109는 약 0.01 μM 내지 5 μM, 보다 바람직하게는 약 0.1 μM 내지 5 μM 또는 유리하게는 약 1 μM의 농도이다. 본 발명에 얽매이는 것은 아니지만, 예비 데이터는 보다 높은 농도의 AGN193109가 후신 중간엽 세포 비율의 상대적인 증가를 촉진함을 암시한다.
하나의 실시태양에서, Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021은 약 0.1 μM 내지 10 μM, 바람직하게는 약 0.2 μM 내지 5 μM 또는 보다 바람직하게는 약 1 내지 2 μM 범위의 농도로 존재한다.
본 발명에 얽매이는 것은 아니지만, 상기 Wnt 작용물질은 상기 IM 세포로부터 네프론 전구세포 생성의 상대적인 증가를 촉진한다. 바람직하게, 세포를 FGF9와 단독으로 또는 BMP7, RA, Wnt 작용물질, RA 길항물질 및/또는 FGF20 및/또는 FGF2 + 헤파린 중 하나 이상과 함께 적어도 72시간 동안, 그러나 360시간 이하로 접촉시킨다. 바람직하게, 상기 세포를 약 160 내지 220시간 동안 또는 보다 바람직하게는 약 190 내지 200시간 동안 접촉시킨다.
상기 배양 배지를 48 내지 72시간마다 교환할 수 있다.
전형적으로, 중간 중배엽 세포를 본 명세서에 개시된 바와 같이 FGF9와 단독으로 또는 BMP7, RA, RA 길항물질, Wnt 작용물질 및/또는 FGF20 및/또는 FGF2 및 바람직하게는 헤파린 중 하나 이상과 함께 접촉시키는 것은 상기 중간 중배엽 세포를 후신 간엽의 세포 및 요관 상피 세포 계통으로 분화시킨다. 상기 후신 간엽 계통은 FGF9 및 헤파린 중에서 약 72시간 배양 후 최적으로 생성되는 네프론 전구세포를 포함한다. 또한, RA 유사체 또는 작용물질 및/또는 RA 길항물질의 존재, 부재 및/또는 농도를, 상기 방법에 의해 생성되는 후신 간엽에 비해, 상기 방법에 의해 생성되는 요관 상피의 상대적인 양을 조작하기 위해 선택할 수 있음이 제안된다. 앞서 기재된 바와 같이, RA는 후신 간엽의 댓가로 요관 상피의 형성을 촉진하는 반면, RA 길항물질, 예를 들어 AGN193109는 요관 상피의 댓가로 후신 간엽의 형성을 촉진한다. Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021이 또한 요관 상피의 댓가로 후신 간엽의 생존 및/또는 형성을 촉진할 수 있다.
상기 후신 간엽 계통 또는 그의 세포의 세포들의 특징적이거나 전형적인 마커의 비제한적인 예는 WT1, SIX1, SIX2, SALL1, GDNF 및/또는 HOXD11을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
상기 네프론 전구세포의 특징적이거나 전형적인 마커의 비제한적인 예는 WT1, SIX2, CITED1, PAX2, GDNF, SALL1 및 HOXD11을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
상기 요관 상피 계통 세포의 특징적이거나 전형적인 마커의 비제한적인 예는 HOXB7, GATA3, CALB1, E-카데린, PAX2 및/또는 cRET를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
네프론 전구세포는 WT1, SIX2, CITED1, PAX2, GDNF, SALL1 및 HOXD11의 동시-발현에 근거하여, hPSC 세포 배양의 출발로부터 상기 방법의 개시 후 11 내지 15일째, 또는 유리하게는 상기 개시 후 14일째(11 내지 15일의 범위)에 최대로 생성되는 듯하다.
요관 상피 전구세포는 HOXB7, cRET, E-카데린 및 PAX2의 동시-발현에 근거하여, hPSC 세포 배양의 출발로부터 상기 방법의 개시 후 적어도 10일 또는 유리하게는 14일째에 최대로 생성될 수 있다.
상기 방법의 바람직한 형태에서, FGF9는 본 명세서에 기재된 단계 (ii) 및 (iii) 모두의 적어도 일부에 또는 상기 단계 전체를 통해 존재한다. 보다 바람직하게, Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021은 본 명세서에 기재된 단계 (i)의 적어도 일부에 존재한다.
따라서 특히 바람직한 방법은 하기의 연속적인 단계들을 포함한다:
(a) 인간 다능성 줄기(hPCS)세포를 CHIR99021과 접촉시켜 상기 hPSC 세포의 후방 원시줄무늬 세포로의 분화를 촉진하고;
(b) 상기 후방 원시줄무늬 세포를 FGF9와 단독으로 또는 RA 길항물질, 예를 들어 AGN193109와 함께 접촉시켜 상기 후방 원시줄무늬 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진하고;
(c) 상기 IM 세포를 FGF9 및 헤파린과 단독으로 또는 RA 길항물질, 예를 들어 AGN193109와 함께 접촉시켜 상기 IM 세포로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생성시킨다.
상기 바람직한 형태에 따라, 약 18 내지 20일의 총 배양 기간 동안 hES 세포의 초기 집단으로부터 신장 분화를 촉진시킬 수 있다.
hPSC로부터
신장
오가노이드의
빠른 생성
본 발명의 관련 태양은 완성 중배엽 세포의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 hPSC를 보다 연장된 기간(최적으로는 3 내지 5일) 동안 Wnt 작용물질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 적합하게, 상기 태양의 방법은 완성 중배엽 세포 및 IM 세포(머리 및 꼬리쪽 IM을 모두 포함할 수 있다) 중 하나 이상을 포함하는 중배엽 세포 집단을 생성시킨다. 전형적으로, Wnt 작용물질과의 배양 지속기간이 길수록, 보다 많은 꼬리쪽 IM이 발생하고 보다 적은 입쪽 IM이 존속된다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 또한 상기 중배엽 세포를 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유아세포 성장인자 20(FGF20) 및/또는 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)와 접촉시키는 후속 단계를 포함한다. 적합하게, 상기 단계는 꼬리 및 입쪽 IM의 분화를 촉진한다. 적합하게, 상기 꼬리 및 입쪽 IM은 각각 차례로 네프론 전구세포 및 요관 상피 세포로 분화할 것이다. 앞서 기재된 바와 같이, RA 또는 유사체 또는 작용물질의 포함은 요관 상피 전구세포의 상대적인 생성을 증가시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 중간 중배엽(IM) 세포와 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유아세포 성장인자 20(FGF20) 및/또는 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)와의 접촉 후에, 상기 방법은 상기 세포의 해리 및 재응집의 후속 단계를 추가로 포함한다. 이를 플로팅 필터상의 배양물 중에서 공기-배지 계면에서 수행할 수 있다. 적합하게, 상기 단계는 네프론, 기질 및 혈관구조를 함유하는 신장 오가노이드의 형성을 촉진한다.
또 다른 실시태양에서, 배양(예를 들어 플로팅 필터상에서)을 위한 응집체 형성 후에, 상기 방법은 30 내지 60분 동안 Wnt 작용물질의 후속 첨가를 추가로 포함한다. 적합하게, 상기 단계는 최대의 네프론을 갖는 응집된, 신장 오가노이드의 생성을 촉진한다.
상기 방법의 바람직한 목적은 오가노이드 또는 다른 적어도 부분적으로 조직화된 신장 구조물을 형성하는 응집된, 분화된 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생성시키는 것임을 알 것이다. 바람직하게, 정상 발생중인 네프론의 모든 분절의 존재는 집합관(표현형에 의하면 GATA3+ECAD+), 초기 원위세관(표현형에 의하면 GATA3-LTL-ECAD+), 초기 근위세관(표현형에 의하면 LTL+ECAD-) 및 사구체(표현형에 의하면 WT1+)를 포함하는 상기 오가노이드 중에 존재할 수 있으며, 이는 정상적인 배아 기관형성을 암시한다.
하나의 실시태양에서, 오가노이드로서 배양을 위한 분화된 세포의 응집체의 형성을 상술한 바와 같이 약 7일 동안 성취할 수 있다.
Wnt 작용물질(예를 들어 CHIR99021)의 바람직한 농도는 약 1 내지 50 mM, 바람직하게는 약 1 내지 20 μM, 5 내지 15 μM 또는 유리하게는 약 8 μM이다. 바람직하게, 상기 Wnt 작용물질과의 접촉 지속기간은 약 4일이다.
적합하게, FGF9는 약 20 ng 내지 1 ㎍/㎖의 농도이다. 바람직한 실시태양에서, FGF9는 약 50 내지 500 ng/㎖, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300 ng/㎖ 또는 유리하게는 약 200 ng/㎖의 농도이다. 바람직하게, FGF9/FGF20/FGF2와의 후속 접촉의 지속기간은 약 3일 동안 헤파린을 포함한다.
바람직하게, Wnt 작용물질, 예를 들어 CHIR99021의 짧은 펄스의 후속 첨가는 FGF9/FGF20/FGF2 + 헤파린에서 배양에 이은 재응집 즉시이다. Wnt 작용물질(예를 들어 CHIR99021)의 바람직한 농도는 약 1 내지 15 μM, 바람직하게는 약 2 내지 10 μM 또는 유리하게는 약 5 μM이다. 상기 짧은 펄스는 전형적으로 0.5 내지 2시간, 예를 들어 약 45분 또는 1시간이다.
응집된, 적어도 부분적으로 조직화된 구조물, 예를 들어 신장 오가노이드의 형성을, 상기 배양된 세포들간의 물리적 접촉을 유지하거나 촉진함으로써 지원할 수 있다. 이에 관하여, 상기 Wnt 작용물질(예를 들어 CHIR99021)의 "짧은 펄스"의 첨가 전에 상기 펠릿의 펠릿화가 오가노이드 형성을 지원할 수 있다.
임의로, 배양물은 레티노산(RA) 길항물질, RA 또는 RA 작용물질, 골형성 단백질 7(BMP7) 및/또는 헤파린 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 레티노산(RA) 길항물질, RA 작용물질, 골형성 단백질 7(BMP7) 및/또는 헤파린의 각각의 농도 및 효과는 본 명세서에서 이후에 기재하는 바와 같을 수 있다.
혈관화
유도
적합하게는, 상기 신장 오가노이드 또는 응집체 중의 혈관 전구세포의 존재 및/또는 적어도 부분적인 혈관화는 중간엽 세포 또는 조직으로부터 혈관 내피 또는 혈관 전구세포의 발생을 촉진하거나 지시하는 조건에 의해 촉진된다.
적합하게, 상기 언급한 태양에 따라 생성된 오가노이드 및/또는 분화된 세포의 응집체를, 적어도 부분적인 혈관화, 특히 사구체 구조물의 혈관화, 또는 적어도 혈관 내피 또는 다른 혈관 세포 또는 조직의 전구세포의 생성을 촉진하는 조건하에서 배양할 수 있다. 일부 실시태양에서, 혈관화를, 중간엽 세포 또는 조직으로부터 혈관 내피의 발생을 촉진하거나 지시하는 조건에 의해 촉진한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 혈관 내피 전구세포(예를 들어 인간 다능성 줄기세포로부터 분화된)를 상술한 바와 같이 IM 세포와 함께 동시-배양하거나, 또는 적어도 부분적으로 분화된 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 배양물에 첨가하여 혈관 세포 또는 조직, 예를 들어 혈관 내피를 생성시킴을 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 배양 중 감소된 산소 분압을 포함할 수 있다. 전형적으로, 21% O2가 표준 조직 배양 인큐베이터 중에 존재하는 통상적인 산소 분압이다. 본 발명은 5 내지 12% O2를 고려하며, 이는 발생 중인 배아에서 경험하는 산소 분압에 더 등가일 수 있다. 상기는, VEGFA를 생성시키고 이에 의해 Flk1+ 혈관 내피 전구세포의 형성 및 이동을 유도하는 상기 후신 간엽의 능력을 개선시킬 수 있다.
상기에 비추어, BMP4, BMP7, 액티빈 A, FGF2, FGF9 및 FGF20과 같은 단백질 작용제에 대한 언급은 비제한적으로 인간, 마우스 및 래트를 포함한 임의의 포유동물 기원의 고유 또는 재조합 또는 화학 합성 단백질을 포함하는 것으로서 이해해야 한다. 더욱 또한, 이들 단백질은 당해 분야에 주지된 바와 같은 화학적 변형, 글리코실화, 지질화, 표지, 예를 들어 비오틴 및 추가적인 아미노산 서열, 예를 들어 에피토프 태그 또는 융합 짝을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 언급한 단백질을 상업적으로 수득하고/하거나 통상적인 실험 또는 제조 과정에 의해 재조합체 또는 화학 합성 단백질로서 제조할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생성된 단리되거나 또는 정제된 네프론 전구세포, 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드를 제공한다.
바람직하게, 상기 신장 오가노이드는 내피 및 신장 간질에 의해 둘러싸인 분할된 네프론을 포함한다.
특정한 실시태양에서, 상기 네프론은 집합관(표현형에 의하면 GATA3+ECAD+), 초기 원위세관(표현형에 의하면 GATA3-LTL-ECAD+), 초기 근위세관(표현형에 의하면 LTL+ECAD-) 및 사구체(표현형에 의하면 WT1+)를 포함한, 4개 이상의 성분들로 분할된다. 적합하게, 집합관 트리은 상기 오가노이드의 기부에서 형성되며, 중간에서 원위 및 근위세관에 연결되고, 사구체가 상기 오가노이드의 상부에 있다.
네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포를 본 명세서에서 이전에 기재한 바와 같이 적합한 배양 기간 후에 수득할 수 있으며 일부 선택적 실시태양에서 표면 마커의 동시-발현에 따라 추가로 농축시키거나 정제할 수 있다. 세포 농축 또는 정제는 비제한적으로 유식 세포측정 세포 분류(예를 들어 FACS), 자기 면역비드(예를 들어 다이나비즈(Dynabeads)™)에 의한 양성 또는 음성 세포 선택, 패닝, 밀도 분리, 보체 매개된 용해 등을 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 기법 또는 공정에 의할 수 있다.
신장 재생 및 이식
만성 신장병은 매년 미국에서 3100만 명이, 호주에서 170만 명이 걸리는 심각한 의학적 상태이다. 환자는 증상을 나타내기 전에 그의 신장 기능의 90%를 상실하여, 신부전 및 투석 또는 신장 이식을 발생시킬 수 있다. 미국에서 말기 신장병에 대한 의료보험 비용은 2010년에 280억 달러로 추산되었다.
따라서, 본 발명의 태양은 신장, 또는 신장 세포 또는 조직의 생성 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 단리되거나 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포로부터 분화시켜 상기 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생성시키는 단계를 포함한다. 더욱 또한, 본 발명의 상기 태양은 중간엽 세포 또는 조직으로부터 혈관 내피 또는 혈관 전구세포의 발생을 촉진하거나 지시하는 조건하에서 적어도 부분적인 혈관화 및/또는 혈관 전구세포의 생성을 제공한다.
본 발명은 요관 상피 및 후신 간엽 계통 또는 구획의 세포를 생성시키는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 세포들은 생체내에서 서로 분화를 동시에 유도하고 지시한다. 이들 세포는 요관 트리 및 네프론 전구세포 간엽을 포함한 특유의 관상 상피 구조물로 발달할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 생성된 hPSC 세포-유래된 요관 상피 및/또는 네프론 전구세포는 요관 및 장간막 중간엽 구획 모두로부터 신장 세포로의 분화가 지시될 수 있음이 제안된다. 적합한 조건하에서, 상기 네프론 전구세포는 네프론 상피, 예를 들어 비제한적으로 결합 분절, 원위 곡세관(DCT) 세포, 원위 직세관(DST) 세포, 근위 직세관(PST) 분절 1 및 2, PST 세포, 발세포, 사구체 내피세포, 상행 헨레 고리 및/또는 하행 헨레 고리를 포함한 임의의 네프론 분절(집합관 외의)로 분화될 수 있다.
더욱 또한, 이들 세포의 '자기-조직화' 능력을 활용하여, 예를 들어 신장 조직 또는 기관 생물공학에 의해 신장 수복을 촉진할 수 있다.
상기 태양의 방법의 하나의 실시태양이 상기 단리되거나 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포를 인간에게 입양 전달하거나 이식하여 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생성시킴을 포함할 수 있음을 알 것이다.
상기 실시태양에 따라, 상기 단리되거나 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포의 신장 또는 신장 세포 또는 조직으로의 분화가 생체내에서 발생한다.
상기 태양의 방법의 또 다른 실시태양은 시험관내에서 상기 단리되거나 정제된 네프론 및/또는 요관 상피 전구세포의 신장, 또는 신장 세포 또는 조직, 또는 이들의 전구세포로의 적어도 부분적인 분화를 포함할 수 있다. 적합하게는, 상기 적어도 부분적으로 시험관내 분화된 세포 신장, 또는 신장 세포 또는 조직, 또는 이들의 전구세포를 인간에게 입양전달하거나 이식한다.
상기 실시태양 중 어느 하나 또는 둘 다에 따라, 상기 신장, 신장 세포 또는 조직은 상기 신장, 그의 세포 또는 조직의 재생 또는 수복을 촉진하거나 이에 기여할 수 있다.
하나의 실시태양은 조작된 또는 인공 신장을 생성시키기 위한 오가노이드, 또는 상기로부터 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포의 용도를 제공한다. 예를 들어 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포를 스캐폴드, 예를 들어 탈세포화된 인간 신장 또는 그의 세포외 기질(ECM) 성분, 폴리에스테르 플리스 또는 생분해성 중합체 스캐폴드내에 통합시켜 재생된 신장 세관 구조물을 생성시킬 수 있다. 예로서, 상기와 같은 방법은 (a) 상기 오가노이드로부터 하나 이상의 분화된 세포 유형 및/또는 중간 전구세포 유형을 단리하고; (b) 상기 하나 이상의 분화된 세포 유형 및/또는 중간 전구세포 유형을 탈세포화된 신장 스캐폴드에 전달함 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서 신장 스캐폴드로부터의 ECM을, 상기 하나 이상의 분화된 세포 유형 및/또는 중간 전구세포 유형을 시딩하거나 바이오프린트하여 상기 신장 스캐폴드 또는 기질을 재세포화하기 위한 기질(예를 들어 상기 ECM 단독으로부터 또는 하이드로겔과 함께 생성된)로서 사용할 수 있다.
또 다른 실시태양은 손상되거나 병든 신장의 수복에 관한 것이다. 예로서, 상기 방법은 (i) 상기 오가노이드로부터 하나 이상의 분화된 세포 유형 및/또는 중간 전구세포 유형을 단리하고; (ii) 상기 하나 이상의 분화된 세포 유형 및/또는 중간 전구세포 유형을 손상되거나 병든 신장내로 전달하여 상기 병들거나 손상된 신장의 수복 및/또는 재생을 촉진함 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 전달은 실질 주사를 통해 또는 혈관 경로를 통해 상기 손상되거나 병든 신장에 직접 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 신장 투석을 지원하거나 용이하게 하기 위한 장치에서 상기 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포로부터 분화된 신장 세포 또는 조직의 용도를 제공한다. 예를 들어, 생체인공 신장을, 신장 세포 또는 그의 전구세포를 반응기에 시딩하여 투석과 병행하여 사용하기 위한 '신장 보조 장치'를 생성시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포로부터 분화되거나 또는 달리 수득된 신장 세포 또는 조직을 사용하여 "바이오프린트된" 신장 또는 다른 네프론-함유 기관, 오가노이드 또는 기관-유사 구조물이 고려된다.
따라서 본 발명의 하나의 특정한 태양은 신장 구조물의 바이오프린트 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 다수의 hPSC 또는 다른 전구세포들을 침착시켜 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 신장 구조물을 형성시킴을 포함한다.
적합하게는, 상기 hPSC 또는 다른 전구세포에, 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 3차원 구조로 생성시키는 본 명세서에 개시된 방법을 가한다.
상기 특정한 태양은 또한 상기 언급된 방법에 의해 생성된, 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 바이오프린트된 신장 구조물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 특정한 태양은 신장 구조물의 바이오프린트 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 다수의 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 침착시켜 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 신장 구조물을 형성시킴을 포함한다.
적합하게, 상기 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포는 본 명세서에 개시된 방법에 의해 hPSC로부터 생성되었다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 적어도 부분적인 혈관화 및/또는 혈관 전구세포를 갖거나 또는 이를 발생시킬 수 있는 바이오프린트된 신장 구조물을 생성시킨다.
상기 특정한 태양은 또한 상기 언급된 방법에 의해 생성된, 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는, 바이오프린트된 신장 구조물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오프린트된 신장 구조물은 적어도 부분적인 혈관화 및/또는 혈관 전구세포를 갖거나 또는 발생시킬 수 있다.
적합하게, 상기 바이오프린트된 신장 구조물은 3차원 신장 구조물이다.
상기 3차원 구조물을 본 명세서에서 이후에 보다 상세히 기재하는 바와 같이, 다수의 바이오프린트된 "층" 또는 "어레이"로부터 구성하거나 또는 형성시킬 수 있음을 또한 알 것이다.
상기 바이오프린트된 신장 구조물 성분은 신장의 임의의 구조 및/또는 기능 성분, 예를 들어 비제한적으로 사구체, 방사구체기구, 간질 조직, 집합관, 보우만 주머니, 근위 및/또는 원시 곡세관, 혈관구조, 예를 들어 소동맥, 동맥, 정맥 및/또는 모세혈관이거나 또는 이들을 포함할 수 있다.
적합하게, 상기 바이오프린트된 신장 구조물은 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 바이오프린트된 신장 또는 신장 성분을 숙주에 이식하거나 또는 달리 양자 전달할 (adoptively transterrable) 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바이오프린팅"은 자동 또는 반-자동의, 컴퓨터-지원된, 3차원 프로토타이핑 장치(예를 들어 바이오프린터)에 상용성인 방법을 통해 세포(예를 들어 세포 용액, 세포-함유 젤, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 오가노이드, 다세포체 등)의 3차원의 정밀한 침착을 사용함을 포함한다. 이에 관하여, 미국특허 출원 US20120116568, US20130164339 및 US20140012407(이들은 본 명세서에 참고로 인용되며 잠재적으로 적합한 바이오프린트 기법의 비제한적인 예를 제공한다)을 참조하시오.
예로서, 일부 실시태양에서, 조작된, 이식성 신장 오가노이드 조직 및/또는 기관의 적어도 하나의 성분을 바이오프린트할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기 조작된, 이식성 조직 및/또는 기관 전체를 바이오프린트한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 바이오프린트된 구조물을 3차원 전달 장치(예를 들어 바이오프린터)에 의한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 신장 세포, 예를 들어 세포 용액, 세포 현탁액, 세포-포함 젤 또는 페이스트, 세포 농축물, 다세포체(예를 들어 원통, 회전타원체, 리본 등), 및 생체적합성 표면(예를 들어 하이드로젤 및/또는 다공성 멤브레인으로 구성된)상의 국한 물질의 3차원, 자동, 컴퓨터-지원된 침착에 기반한 고속 프로토타이핑 기술을 사용하는 방법으로 제조한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 일부 실시태양에서, 신장 조직 및/또는 기관에 관하여 "조작된"이란 용어는 세포, 세포 용액, 세포 현탁액, 세포-포함 젤 또는 페이스트, 세포 농축물, 다세포응집체, 및 그의 층들을 컴퓨터 스크립트에 따라 컴퓨터-지원된 장치(예를 들어 바이오프린터)에 의해 3차원 구조를 형성하도록 위치시킴을 의미한다. 추가의 실시태양에서, 상기 컴퓨터 스크립트는 예를 들어 하나 이상의 컴퓨터 프로그램, 컴퓨터 어플리케이션, 또는 컴퓨터 모듈이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 3차원 조직 구조물은 초기 형태형성에서 자기-조립 현상과 유사한 세포 또는 다세포체의 프린트-후 융합을 통해 형성된다.
수동 배치를 포함한 다수의 방법을, 생체적합성 표면상에서 세포, 다세포 응집체 및/또는 그의 층들을 어레이하여 3차원 구조물을 생성시키는데 이용할 수 있지만, 자동의 컴퓨터-지원된 기계, 예를 들어 바이오프린터에 의한 배치가 유리하다. 상기 기술에 의한 세포 또는 다세포체의 전달 이점은 세포 또는 다세포체의 빠르고 정확하며 재현성인 배치로, 다양한 조성을 갖는 세포, 다세포 응집체 및/또는 그의 층의 계획된 또는 소정의 배향 또는 패턴을 나타내는 구조물을 생성시킴을 포함한다. 이점은 또한 세포 손상을 최소화하면서 확실히 높은 세포 밀도를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 바이오프린트 방법은 연속적이고/이거나 실질적으로 연속적이다. 연속적인 바이오프린트 방법의 비제한적인 예는 바이오-잉크를 바이오프린터로부터 바이오-잉크의 저장소에 연결된 분배팁(예를 들어 주사기, 모세관 등)을 통해 분배하는 것이다. 추가의 비제한적인 실시태양에서, 연속적인 바이오프린트 방법은 기능 유닛의 반복 패턴으로 바이오-잉크를 분배하는 것이다. 다양한 실시태양에서, 반복적인 기능 유닛은 임의의 적합한 외형, 예를 들어 원, 사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형 및 불규칙한 외형을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 바이오프린트된 기능 유닛의 반복 패턴은 층 또는 어레이를 포함하며 다수의 층 또는 어레이를 인접하게(예를 들어 적층되게) 바이오프린트하여 조작된 조직 또는 기관을 형성시킨다. 다양한 실시태양에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 그 이상의 층 또는 어레이를 인접하게(예를 들어 적층되게) 바이오프린트하여 조작된 신장 조직 또는 기관을 형성시킨다.
일부 실시태양에서, 바이오프린트된 기능 유닛은 바둑판 패턴으로 반복된다. "바둑판 패턴"은 면이 겹침과 틈 없이 채워진 형태의 평면이다. 연속적인 및/또는 바둑판식 바이오프린트의 이점은 비제한적인 예로서, 바이오프린트된 조직의 증가된 생산성을 포함한다. 또 다른 비제한적인, 예시적인 이점은 바이오프린터를 앞서 침착된 바이오-잉크의 요소들과 정렬시킬 필요가 없다는 것이다. 연속적인 바이오프린팅은 또한 임의로 주사기 기전을 사용하여, 큰 바이오-잉크 저장소로부터 더 큰 조직의 프린팅을 용이하게 한다.
다양한 실시태양에서, 연속적인 바이오프린트 방법은 프린트 높이, 펌프 속도, 로봇 속도, 또는 이들의 조합과 같은 매개변수들을 서로에 대해 독립적으로 또는 상대적으로 최적화하고/하거나 균형을 맞춤을 포함한다. 일례로, 침착을 위한 상기 바이오프린터 헤드 속도는 3 ㎜/s이며, 이때 제1층에 대한 분배 높이는 0.5 ㎜였고, 각각의 후속층에 대한 분배 높이는 0.4 ㎜씩 증가하였다. 일부 실시태양에서, 상기 분배 높이는 상기 바이오프린터 분배팁의 직경과 대략적으로 동일하다. 제한없이, 적합한 및/또는 최적의 분배 거리는 상기 분배 바늘에 부착되거나 딱 붙는 물질을 생성시키지 않는다. 다양한 실시태양에서, 상기 바이오프린터 분배 팁은 증분을 포함하여 약 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ㎛ 이상의 내부 직경을 갖는다. 다양한 실시태양에서, 상기 바이오프린터의 바이오-잉크 저장소는 증분을 포함하여 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ㎤ 이상의 부피를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 펌프 속도는 상기 시스템 중의 잔압의 형성이 낮을 때 적합하고/하거나 최적이다. 일부 실시태양에서, 유리한 펌프 속도는 상기 저장소와 분배 바늘의 횡단면적간의 비에 따라 변하며, 이때 보다 큰 비는 보다 낮은 펌프 속도를 요한다. 일부 실시태양에서, 적합하고/하거나 최적인 프린트 속도는 상기 물질의 기계적 보전에 영향을 미치지 않으면서 균일한 라인의 침착을 가능하게 한다.
단지 예로서, 인베텍(Invetech)과 동업사인 오가노보(Organovo)는 인간 기관을 재현하기 위해 인간 세포를 목적하는 배향으로 놓기 위한 하이드로젤 스캐폴드를 사용하는 기관 프린트 기계를 개발하였다. 본 명세서에 기재된 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포로부터 분화되거나 또는 달리 수득된 신장 세포 또는 조직을 상기 언급한 오가노보 기계와 같은 기계와 함께 사용하여 "바이오프린트된" 인간 신장 오가노이드 또는 신장을 개발할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 평면 기하학적 구조를 갖는 네프론 전구세포 및 요관 전구세포의 어레이를 제공한다.
상기 어레이는 다수의 적층된 어레이, 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 이상이 적층된 어레이를 포함할 수 있다.
상기 어레이를 바둑판 패턴으로 적층시킬 수 있다.
본 발명의 관련 태양은 상기 언급한 태양의 어레이를 성숙화시킴으로써 수득된 신장 오가노이드를 제공한다.
적합하게, 상기 신장 오가노이드는 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포, 오가노이드 및 바이오프린트된 신장 구조물의 유도 분화는 세포요법용의 정제된, 분화된 신장 세포 하위유형, 오가노이드 및/또는 바이오프린트된 신장 구조물의 잠재적인 공급원일 수 있음을 알 것이다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포는 몇몇 유전자-상속된 신장 조건에서 유전자 보정 후 신장 세포 또는 조직을 생성시키는데 유용할 수 있다. 예를 들어 단일 유전자 신장 질환, 예를 들어 알포트 증후군(COL4A3 돌연변이) 및 다낭성 신장병(PKD1, PKD2 및 기타)의 보정은 유전자 보정 후 본 명세서에 기재된 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포로부터의 신장 조직의 재생에 의해 지원되거나 촉진될 수 있다.
특정한 실시태양에서, 유전학적 신장병을 갖는 환자로부터 유래되거나, 수득되거나 또는 기원하는 iPSC 계통을 시험관내에서 유전자 돌연변이(들)의 수복에 사용할 수 있다. 상기와 같은 세포를 본 발명의 방법에 따라 사용할 수 있으며 이어서 자기유래 세포 요법을 위해 상기 환자에게 투여할 수 있었다.
신독성
선별
본 명세서에 기재된 단리된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포의 유도 분화가 신독성 선별용의 정제된, 분화된 신장 세포, 바이오프린트된 신장 구조물, 신장 오가노이드, 어레이 또는 신장 조직 하위유형의 잠재적인 공급원을 제공할 수 있음을 알 것이다.
약물 및 세포-기반 요법을 포함하여, 질병의 예방에 목적을 둔 상기 중재의 개발은 시험관내 약물 시험에 1차 인간 신장세포를 이용할 수 없음으로 인해 어려워진다.
따라서, 본 발명의 또 다른 태양은 하나 또는 다수의 화합물의 신독성을 측정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 하나 또는 다수의 화합물을, 오가노이드로서 또는 단리 및 정제 후의 본 명세서에 기재된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포, 또는 상기로부터 분화되거나 또는 달리 수득된 신장 세포 또는 조직과 접촉시켜 상기 하나 또는 다수의 화합물이 신독성인지 아닌지를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게, 상기 방법을 오가노이드 또는 단리되거나 정제된 네프론 전구세포, 또는 상기 네프론 전구세포로부터 유래된 신장 세포 또는 조직을 사용하여 수행한다.
다수의 유용한 약물은 직접적인 관상 효과(예를 들어 아미노글리코시드 항생제, 시스플라틴, 방사성콘트라스트 매질, NSAID, ACE 억제제), 간질성 신염(예를 들어 β 락탐 항생제, 리튬, CsA, 항간질 약물, 예를 들어 페니토인) 또는 사구체신염과 같은 신독성 부작용을 갖는다. 따라서 본 명세서에 기재된 단리되거나 정제된 네프론 전구세포로부터 분화되거나 또는 달리 수득된 한정된, 특정한 신장 세포 및 조직 유형을 사용하여 신규 또는 기존 약물을 시험하는 것이 유리할 수 있다. 본 명세서에서 이후에 기재하는 "바이오프린트된" 신장 또는 바이오프린트된 신장 오가노이드를 또한 신독성 선별에 적용할 수 있다.
신독성을 시험관내에서 신장 세포 기능에 대한 임의의 적합한 시험에 의해 평가하거나 측정할 수 있다, 예를 들어 비제한적으로 인간 신독성 RT2 프로파일러(Profiler)™ PCR 어레이(퀴아겐(Qiagen)으로부터) 또는 고함량 분석(HCA) 복합 신독성 분석(유로핀스(Eurofins)로부터)에 의해 감소된 크레아티닌 제거 또는 생물마커 발현을 평가하거나 측정할 수 있다.
실시예에서 보다 상세히 기재하는 바와 같이, 시스플라틴은 성숙한 근위세관 세포에서의 신장 오가노이드 유발된 특정한 급성 세포사멸의 신장 시스플라틴 치료에서 근위세관 세포의 카스파제-매개된 급성 세포사멸을 유도하는(반면에 미성숙 세포는 세포사멸을 겪지 않는다) 신독성제이다.
따라서 본 발명은 하기의 비제한적인 실시예를 참조하여 쉽게 이해될 수 있으며 실행될 수 있다.
실시예
본 발명에 이르는 연구는 중간 중배엽(IM)으로부터 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 동기, 동시 분화를 촉진하도록 맞춰진 특정한 시험관내 배양 조건을 확인하였다. 보다 구체적으로, FGF9 + 헤파린 단독, 또는 골형성 단백질 7(BMP7), 레티노산(RA), RA 길항물질; Wnt 작용물질; 및/또는 FGF20 + 헤파린을 포함한 하나 이상의 작용제와 함께 중간 중배엽의 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포로의 분화를 촉진할 수 있다. 이에 더하여, 상기 시험관내 배양 방법은 후방 원시줄무늬, IM 및 후신 중간엽 단계를 통해 hPSC를 분화시켜 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 생성시키는 시스템을 제공한다. 몇몇 분자, 예를 들어 RA, RA 길항물질 및/또는 Wnt 작용물질의 존재 또는 부재를 조작하여 네프론 전구세포 대 요관 상피 전구세포의 생성, 또는 이와 역의 생성을 우선적으로 촉진할 수 있었다. 상기 후방 PS는 IM과 같은 중배엽에 대한 전구세포 집단이고, Wnt 작용물질(예를 들어 CHIR99021)을 사용하여 hPSC로부터 유도된다. 상기 IM은 2개의 핵심 신장 전구세포 집단: 요관 상피(UE), 집합관의 전구세포; 후신 간엽(MM), 네프론의 전구세포로 분화한다. 전방 IM은 UE를 생성시키는 반면, 후방 IM은 상기 MM으로 발달한다. 여기에서, 우리는 조심스럽게 결정된 CHIR99021의 사용 기간에 의해 상기 전방 및 후방 IM을 모두 동시에 유도하는 방법을 제공한다. 상기 동시 유도는 네프론, 간질 및 내피를 포함한 모든 예상된 신장 성분들을 함유하는 신장 오가노이드의 성공적인 생성을 이끈다. 우리는 또한 RA 신호전달의 억제제, 예를 들어 합성적인 효능 있는 범-레티노산 수용체(RAR) 길항물질 AGN 193109의 첨가가 후신 간엽 형성을 촉진할 것임을 제안한다.
실시예
1
물질 및 방법
상기 방법들에서 언급된 시약들의 공급처의 비제한적인 예를 표 1에 제공한다.
배지는 하기와 같다:
·젤라틴 용액: PBS 중의 0.1% 젤라틴. 이어서 상기 용액을 오토클레이브처리한다.
·FDMEM: 89% DMEM 고 글루코스, 10% 소 태아 혈청, 1% 글루타맥스 보충제, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신.
·KSR 배지: 77.8% DMEM/F-12, 20% 녹아웃 혈청 대용물, 1% NEAA, 1% 글루타맥스, 0.5% 페니실린/스트렙토마이신, 0.2% 2-머캅토에탄올(55 mM). 이어서 배지를 스테리컵(Stericup)-GP에 의해 여과한다.
·MEF-순화 KSR 배지: 하루에 T175 플라스크 중의 10x106 마우스 배아 섬유아세포에 40 ㎖의 KSR 배지를 공급한다. 다음날 상기 배지를 수집하고 또 다른 40 ㎖의 KSR 배지를 공급한다. 상기를 6회 반복한 후에, 수집하여 모은 배지를 스테리컵-GP에 의해 여과한다.
·APEL: STEMdiff APEL(100 ㎖)의 병에 0.5 ㎖의 항생제-항진균제를 보충한다.
또한, 추가적인 시약, 방법, PCR 프라이머 등에 대해서 국제 공보 WO2014/197934 및 문헌[Takasato, M. et al., 2014,. Nat. Cell Biol. 16, 118-26]을 참조하며, 상기의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
시드 공급기(-8일)
25 ㎠ 조직 배양 플라스크를 3 ㎖의 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅한다.
유사분열에 의해 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 동결된 바이알을 작은 얼음 펠릿이 남을 때까지 37 ℃에서 가온시킴으로써 해동시킨다. 가온된 5 ㎖의 FDMEM 배지를 바이알에 적가방식으로 가하고 서서히 혼합한다. 15 ㎖ 튜브에 수집하고 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리시킨다.
상등액을 제거하고 MEF를 FDMEM에 재현탁시킨다. 플라스크상에서 FDMEM 중에 ㎠당 12,000 세포로 시딩하고 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다.
hESC
/
iPSC의
해동(-7일)
유사분열에 의해 불활성화된 MEF를 함유하는 상기 제조된 25 ㎠ 조직 배양 플라스크상의 iPSC/hESC의 동결된 바이알을 작은 얼음 펠릿이 남을 때까지 37 ℃에서 가온시킴으로써 해동시킨다. 가온된 5 ㎖의 KSR 배지(부록 A 참조)를 바이알에 적가방식으로 가하고 서서히 혼합한다. 15 ㎖ 튜브에 수집하고 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리시킨다.
25 ㎠ 조직 배양 플라스크당 5 ㎖ KSR 배지를 제조한다. KSR 배지에 10 ng/㎖ bFGF를 가한다.
상등액을 제거하고 10 ng/㎖ bFGF를 함유하는 KSR 배지에 iPSC/hESC를 재현탁시킨다. 플라스크상에 시딩하고 37 ℃ CO2 인큐베이터에서 3일 동안 인큐베이션한다.
매일, 소비된 KSR 배지를 흡출하고 10 ng/㎖ bFGF를 함유하는 5 ㎖의 새로운 KSR 배지를 새로 보충한다.
hESC
/
iPSC의
해리 및
매트리젤
적응(-3일)
매트리젤
코팅:
3 ㎖의 저온 DMEM/F12 기본 배지를 15 ㎖ 튜브에 분액한다.
25 uL의 hESC 정성분석된 매트리젤을 DMEM/F12에 가한다. 충분히 혼합하고 25 ㎠ 조직 배양 플라스크로 옮긴다. (*매트리젤은 가온시 고화되므로 얼음상에서 취급한다.)
플라스크를 실온에서 적어도 30분 동안 유지시켜 매트리젤이 상기 표면을 코팅하게 한다.
5 ㎖ MEF 순화 KSR 배지(부록 B 참조)를 제조하고 10 ng/㎖ bFGF를 배지에 가한다.
세포 해리:
(
*
최적의 결과를 위해서, 세포는 대략 80-90%의
융합성
(confluent)이어야
한다. 세포가
융합성이
아니면, 배양일을 추가하거나
또는 보다 낮은
분할비를 허용한다.)
융합성 25 ㎠ 플라스크를 3 ㎖ PBS로 2회 세척한다.
2 ㎖의 TrypLE 셀렉트(Select)를 세포에 가하고 37 ℃에서 3분 동안 인큐베이션시킨다.
5 ㎖의 DMEM/F12 기본 배지를 세포에 피펫팅하고, 혼합하고, 세포가 상기 플라스틱 표면으로부터 확실히 들어올려지게 한다.
세포 현탁액을 15 ㎖ 튜브에 1:3 분할비로 수집하고 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리시킨다.
매트리젤
코팅된
플라스크상에
세포의
시딩
:
상등액을 제거하고 제조된 5 ㎖의 순화 KSR 배지를 세포에 가한다. 서서히 혼합한다.
매트리젤-함유 DMEM/F12를 제조된 조직 배양 플라스크로부터 흡출하고 세포를 시딩한다.
37 ℃ CO2 인큐베이터에서 2일 동안 밤새 인큐베이션시킨다.
매일, 소비된 순화 KSR 배지를 흡출하고 10 ng/㎖ bFGF를 함유하는 5 ㎖의 새로운 순화 KSR 배지를 새로 보충한다.
분화를 위한 세포
시딩
(-1일)
25 ㎠ 플라스크를 3 ㎖ PBS로 2회 세척한다. 2 ㎖ TrypLE 셀렉트를 세포에 가하고 37 ℃에서 3분 동안 인큐베이션시킨다.
5 ㎖ DMEM/F12 기본 배지를 세포에 피펫팅하고, 혼합하고 세포가 플라스틱 표면으로부터 확실히 들어올려지게 한다.
세포 현탁액을 15 ㎖ 튜브에 수집한다. 카운트한다.
4,000 세포/웰(12,500 세포/㎠)을 성취하는데 필요한 세포수를 계산한다.
목적하는 세포수를 15 ㎖ 튜브에 분액한다. 1,500 rpm에서 3분 동안 원심분리시킨다.
세포를 10 ng/㎖ bFGF를 함유하는 순화 KSR에, 웰당 50 uL로 재현탁시킨다. 세포를 96웰 유리 바닥 플레이트에 시딩하고 37 ℃에서 밤새 인큐베이션한다.
분화 단계 1(0일)
새로 개봉한 APEL 병에 대해서, 항생제-항진균제(100x)를 1/100으로 가한다.
APEL 중 8 μM CHIR을 제조한다.
96 웰 플레이트로부터 순화 KSR을 흡출한다.
8 μM CHIR을 함유하는 100 ㎕의 APEL을 세포에 가한다.
배지를 2일마다 새로 공급하면서, 37 ℃에서 4일 동안 배양시킨다.
분화 단계 2(4일)
APEL 중의 200 ng/㎖ FGF9 + 1 ㎍/㎖ 헤파린을 제조한다.
96 웰 플레이트로부터 CHIR을 함유하는 소비된 APEL을 흡출한다.
200 ng/㎖ FGF9 + 1 ㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 100 ㎕의 APEL을 세포에 가한다.
37 ℃에서 2일 동안 인큐베이션하고, 6일째에 200 ng/㎖ FGF9 + 1 ㎍/㎖ 헤파린을 함유하는 새로운 APEL로 배지를 새로 보충한다.
3D
오가노이드
배양(7일)
96 웰 플레이트에서 상이한 조건의 배양된 C32 IPS 세포를 수득한다.
배양 배지를 흡출하고 멸균 PBS로 신속히 세척한다.
상기 PBS를 흡출한다.
50 ㎕의 트립신 EDTA(0.25%)를 각 웰에 가한다.
세포가 표면으로부터 들어 올려지도록 37 ℃ 인큐베이터에 3분까지 둔다.
모든 세포가 유리(96 웰) 표면으로부터 확실히 들어 올려지도록 현미경하에서 모니터한다. 상기 세포가 상기 표면에 여전히 부착되어 있는 경우, 상기 세포를 트립신으로 부드럽게 피펫팅하여 다시 상기 인큐베이터에 추가로 2분 동안 둔다.
상기 트립신을 100 ㎕의 DMEM + 10% FBS + 1% P/S로 중화시킨다.
전체 배양물을 15 ㎖ 팔콘 튜브에 분액한다.
상기 세포를 1500 rpm의 속도로 5분 동안 원심분리시킨다.
단지 세포의 펠릿들만이 남을 때까지 상기 배지를 흡출한다.
상기 세포를 3 ㎖의 CHIR로 재현탁시킨다.
10 ㎕의 세포 현탁액을 꺼내어 혈구계로 세포수를 카운트한다.
각각의 3D 펠릿 오가노이드는 대략 5x105 세포를 가질 것이며, 필요한 양의 세포 현탁액을 15 ㎖ 팔콘 튜브에 분액한다.
상기 튜브를 2000RPM에서 2분 동안 원심분리시킨다.
1.2 ㎖의 APEL + 5 μM CHIR을 6 웰 트랜스웰 폴리에스테르 멤브레인 세포 배양 플레이트에 분액한다.
P1000 피펫을 사용하여 상기 펠릿을 APEL이 있는 용액 중에서 서서히 제거한다.
P1000 너비 구경팁을 사용하여 상기 펠릿을 채취한다.
상기 펠릿을 최소의 배지 캐리 오버로 상기 트랜스웰 필터상에 조심스럽게 도말한다.
세포 배양물 인큐베이터에 1시간 동안 둔다.
1.2 ㎖의 APEL + 200 ng/㎖의 FGF9 + 1 ㎍/㎖의 헤파린을 코닝 코스타(Corning Costar) 6 웰 플레이트에 분액한다.
APEL + 5 μM CHIR 중에서 1시간 동안 배양 중인 필터를 상기 APEL + 200 ng/㎖의 FGF9 + 1 ㎍/㎖의 헤파린 플레이트로 제거하고 5일 동안 배양한다(2일마다 배지를 교환한다)
5일 후에, 상기 필터를 제거하고 1.2 ㎖의 새로운 APEL이 있는 새로 제조된 코닝 코스타 6 웰 플레이트에 둔다.
상기 오가노이드를 APEL 단독 배지(배지를 2일마다 교환한다)에서 추가로 6일 동안 배양한다
3D
오가노이드
면역형광
(18일)
오가노이드 배양 6일 후에, 상기 펠릿을 4 ℃에서 20분 동안 1% 파라포름알데히드로 고정시킨다.
상기 파라포름알데히드를 제거하고 PBS로 3회 세척한다.
일단 고정되고 세척되었으면, 오가노이드를 면역형광 염색 1주일 전까지 4 ℃에서 보관할 수 있다.
대략 150 uL의 차단 완충제(10% 당나귀 혈청/0.3% 트리톤-x/PBS)를 매트텍(MatTek) 유리 바닥 접시에 분액한다.
상기 오가노이드를 상기 필터로부터 조심스럽게 절단하고 상기 필터를 상기 차단 완충제에 잠근다.
상기 오가노이드를 2-3시간 동안 차단시킨다.
차단 완충제 중에서 1차 선택 항체를 제조한다.
나열된 항체 대부분은 1:300의 희석비로 사용한다.
상기 매트텍 접시로부터 차단 완충제를 흡출하고, 150 ㎕의 차단 완충제 + 1차 항체를 상기 매트텍 접시에 분액한다.
상기 오가노이드를 1차 항체와 4 ℃에서 밤새 인큐베이션시킨다.
상기 1차 항체를 상기 접시로부터 흡출하고 PBTX로 6회(각각 10분) 세척한다.
PBTX(0.1% 트리톤-X/PBS) 중에서 2차 선택 항체(1:400 희석)를 제조한다.
2차 항체 중에서 오가노이드를 4시간 동안 인큐베이션한다.
2차 항체를 제거하고 PBS 중의 DAPI(1:1000 희석)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한다.
3회 세척한다(매번 PBS로 10분).
영상화 준비를 한다.
결과
도 1에 나타낸 바와 같이, 집합관(ECAD+, GATA3+, PAX2+)을 선택하기 위해서, 레티노산 신호전달의 활성화와 함께 보다 적은 일수(2-3)의 초기 Wnt 작용물질 및/또는 후속의 FGF9와의 배양이 최적이다. 네프론-형성 후신 간엽(WT1+HOXD11+ECAD-)을 선택하고 초기 네프론 마커를 발현하는 상피 구조물을 생성시키기 위해서, 레티노산 신호전달의 억제와 함께 보다 많은 일수(3-5)의 초기 Wnt 작용물질 및/또는 FGF9와의 후속 배양이 최적이다.
이제 우리는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 인간 다능성 줄기세포의 응집을 통해 형성된 오가노이드가 정상적인 신장 기관형성을 가리키는 하기의 특징들을 나타낸다는 증거를 갖는다. 도 2에 도시된 바와 같이, Meis1+ 기질 집단의 존재는 상기 형성되는 네프론들 사이에 존재하는 것으로 보인다. 상기 집단은 후신 간엽으로부터 발생하며, 배아 신장의 발생 네프론들 사이에 존재하고, 최종 기관의 주위혈관구조의 형성에 기여하는 것으로 나타났다. 도 3에서 CD31+ 혈관 전구세포의 존재. 우리는 내피에서 CD31에 의해 평가되는 바와 같은 증거를 관찰하지만, CD31은 성숙한 내피의 마커이며 아직 우리는 기능적 여과 단위를 형성하는 사구체의 능동 침입을 나타내는 초기 내피 전구세포를 관찰하지 못한다. 도 4 및 5는 정상적인 배아 기관형성을 암시하는, 서로 결합된 집합관(GATA3+PAX2+ECAD+), 원위세관(ECAD+GATA3-LTL-), 근위세관(LTL+AQP1+) 및 사구체(WT1+NPHS1+SYNPO+)를 포함한 정상적인 발생 네프론의 모든 분절들의 존재를 도시한다.
다수의 매개변수의 변화는 인간 다능성 줄기세포로부터 형성된 오가노이드 내에 존재하는 네프론 수, 전체 크기, 복잡성 및 성숙도를 개선시켰다.
여기에는 7일의 유도 후 오가노이드로서 배양을 위해 분화된 세포의 응집체의 형성이 포함된다. 처음에, 상기는 배양 14일 후 또는 18일 전에 형성될 수 있는 것으로 나타났다. 이제 우리는 8 μM CHIR에서 4일의 배양에 이어서 앞서 기재된 농도 범위의 AGN(레티노산 억제제), BMP7, 저 CHIR 또는 RA와 함께 또는 이들 없이 FGF9 중에서 3일의 배양을 포함한 7일 후에 오가노이드 형성을 확실히 획득할 수 있다. 도 6에 도시된 바와 같이, 응집체의 형성은 재응집시 바로 고 CHIR(5 μM)의 45분 펄스의 첨가에 이어서 앞서 기재된 농도 범위의 AGN(레티노산 억제제), BMP7, 저 CHIR 또는 RA와 함께 또는 이들 없이 FGF9 중에서의 배양에 의해 증대되었다.
혈관화된 사구체의 형성은 신장 기능에 중요하다. 상기와 같은 사구체 혈관구조가 심지어 시험관에서조차 형성될 수 있다는 증거는 상기 신장에 대한 모델로서 오가노이드의 신뢰성을 현저히 증대시킬 것이다.
하나의 접근법은 신장으로 분화된 인간 다능성 줄기세포를 오를로바(Orlova)31의 프로토콜과 같은 프로토콜을 사용하여 혈관 내피 전구세포로 분화된 인간 다능성 줄기세포와 병용한다.
또 다른 접근법은 분화 중 산소 분압을 21% O2(표준 조직 배양 인큐베이터 중에 존재하는 통상적인 산소 분압)에서 5 내지 12% O2(발생 중 배아에서 경험하는 산소 분압에 보다 동등함)로 감소시킨다. 우리는 상기가 VEGFA를 생성시키고 Flk1+ 내피전구세포의 형성 및 이동을 유도하는 후신 간엽의 능력을 충분히 개선시킬 수 있을 것으로 기대한다.
실시예
2
세포 배양 및 분화
나타낸 모든 실험은 에피솜 재프로그램화28를 사용하여 생성시킨 앞서 기재된 야생형 인간 iPSC 계통 CRL1502(클론# C32)를 사용하였다. 분화되지 않은 인간 iPSC를 앞서 기재된 바와 같이1 인간 ES 세포(hES) 배지와 함께 공급기 층으로서 마우스 배아 섬유아세포(MEF)(밀리포어(Millipore))상에서 유지시켰다. 세포를 인증받고 마이코플라스마 감염28에 대해 시험하였다. 인간 iPSC를 매트리젤-코팅된(밀리포어) 배양 접시상에 도말하고 60 내지 100% 융합률에 도달할 때까지 MEF-순화 hES 배지(MEF-CM)에서 배양하였다. 이어서, 세포를 다시 매트리젤-코팅상에서 MEF-CM에서 5,000 세포/㎠으로 도말하였다. 다음날, 세포는 40 내지 50%의 융합률에 도달하였으며, 세포를 항생제-항진균제(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))가 보충된 APEL 기본 배지(STEMCELL 테크놀로지스)에서 2 내지 5일 동안 8 μM의 CHIR99021로 처리한 다음 추가로 5 내지 2일 동안 FGF9(200 ng㎖-1) 및 헤파린(1 ㎍㎖- 1)으로 처리하였다(이때 배지를 2일마다 교환하였다). 7일째에, 세포를 수집하고 트립신 또는 TrypLE 셀렉트(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 단세포로 해리시켰다. 세포(0.5 x 106)를 2분 동안 x400 g에서 회전시켜 펠릿을 형성시키고 이어서 트랜스웰(Transwell) 0.4 ㎛ 기공 폴리에스테르 멤브레인(#CLS3450 코닝(Corning))상으로 옮겼다. 펠릿을 1시간 동안 APEL 중의 5 μM의 CHIR99021로 처리하고, 이어서 5일 동안 FGF9(200 ng㎖-1) 및 헤파린(1 ㎍㎖- 1)과 배양한 다음, 추가로 6 내지 13일 동안 APEL 기본 배지에서 배양하였으며, 이때 배지는 1주일에 3회 교환하였다. 배양 배지는 멤브레인을 초과하지 않아야 한다. 단층 배양물에서의 분화를 위해서, CHIR99021 유도 후 세포를 10일 동안 FGF9(200 ng㎖-1) 및 헤파린(1 ㎍㎖- 1)으로 처리한 다음 APEL 기본 배지로 추가로 6일 동안 처리하였다. 일부 실험에서, RA(0.1 μM) 또는 AGN193109(5 μM)를 FGF9 배지에 가하였다. 신장 오가노이드 생성을 기재하는 단계적 프로토콜을 실시예 1에 제공하였다.
면역세포화학
단층 세포를 위해서, 항체 염색을 앞서 기재된 바와 같이1 수행하였다. 신장 오가노이드를 위해서, 오가노이드를 PBS 중의 2% 파라포름알데히드로 4 ℃에서 20분 동안 고정시킨 다음 PBS로 3회 세척하였다. 이어서 오가노이드를 실온에서 2 내지 3시간 동안 10% 당나귀 혈청, 0.3% 트리톤 X/PBS로 차단하고 4 ℃에서 밤새 1차 항체와 인큐베이션하였다. 0.1% 트리톤 X/PBS로 5회 세척 후에, 2차 항체를 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 하기의 항체 및 희석을 사용하였다: 토끼 항-PAX2 (1:300, #71-6,000, 자이메드 레보라토리즈(Zymed Laboratories)), 염소 항-SIX1 (1:300, #sc-9709, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 토끼 항-SIX2 (1:300, #11562-1-AP, 프로틴테크(Proteintech)), 마우스 항-ECAD (1:300, #610181, BD 바이오사이언시즈(Biosciences)), 토끼 항-WT1 (1:100, #sc-192, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 마우스 항-HOXD11 (1:300, #SAB1403944, 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)), 염소 항-GATA3 (1:300, AF2605, R&D 시스템스), 토끼 항-JAG1 (1:300, #ab7771, 아브캠(Abcam)), 염소 항-큐빌린 (1:150, #sc-20607, 산타 크루즈 바이오테크놀로지), 양 항-NPHS1 (1:300, AF4269, R&D 시스템스), LTL-비오틴-접합된 (1:300, B-1325, 벡터 레보라토리즈(Vector Laboratories)), DBA-비오틴-접합된 (1:300, B-1035, 벡터 레보라토리즈), 마우스 항-KRT8 (1:300, #TROMA, DSHB), 마우스 항-CD31 (1:300, #555444, BD 파밍겐(Pharmingen)), 토끼 항-KDR (1:300, #2479, 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)), 염소 항-SOX17 (1:300, #AF1924, R&D 시스템스), 토끼 항-NG2 (1:300, #AB5320, 머크 밀리포어(Merck Millipore)), 토끼 항-SMA (1:300, #ab15267, 아브캠), 마우스 항-PDGFRA (1:200, #556001, BD 파밍겐), 토끼 항-라미닌 (1:300, #L9393, 시그마 알드리치), 토끼 항-UMOD (1:300, #BT-590, 바이오메디칼 테크놀로지스(Biomedical Technologies)), 마우스 항-MEIS1 (1:300, #ATM39795, 액티베모티프(activemotif)), 염소 항-FOXD1 (1:200, #sc-47585, 산타 크루즈 바이오테크놀로지) 및 토끼 항-절단된-CASP3 (1:300, #9661, 셀 시그널링 테크놀로지). 상들을 니콘(Nikon) Ti-U 현미경 또는 자이스(Zeiss) LSM 780 공초점 현미경을 사용하여 촬영하였다. 모든 면역형광 분석이 3회 넘게 성공적으로 반복되었으며 대표적인 상들을 도시한다.
전자 현미경검사
오가노이드를 하기와 같은 방법을 사용하여 전자 현미경검사를 위해 처리하였다. 2x PBS 중의 5% 글루타르알데히드의 용액을 생육 배지와 같은 부피로 상기 오가노이드 배양 접시에 직접 가하고 5분 동안 진공하에 두었다. 상기 오가노이드를 작은 블럭(∼2x2 ㎜)으로 절단하여 크기를 줄이고, 펠코 바이오웨이브(Pelco Biowave)(테드 펠라 인코포레이티드(Ted Pella In), 미국 캘리포니아주 레딩 소재)에서 80W 전력으로 6분 동안, 다시 진공 하에서, 새로운 2.5% 고정액 중에서 조사하였다. 이어서 샘플을 0.1 M 카코딜레이트 완충제 중에서 4x2 분 세척하였다. 이어서 샘플을 실온에서 30분 동안 0.1 M 카코딜레이트 완충제 중의 칼륨 페리시아나이드(3%) 및 오스뮴 테트록사이드(2%)를 함유하는 용액 중에 침지시켰다. 증류수 중에서 6x3 분 세척에 이어서, 상기 조직 블럭을 실온에서 30분 동안 티오카보하이드라지드(1%)를 함유하는 여과된 용액 중에서 인큐베이션하였다. 증류수에서 후속 세척(6x2 분) 후에, 샘플을 30분 동안 오스뮴 테트록사이드(2%)의 수용액 중에서 인큐베이션하고, 이어서 증류수(6x2 분) 중에서 인큐베이션하고, 4 ℃에서 30분 동안 1% 수성 우라닐 아세테이트 중에서 인큐베이션하였다. 추가적인 증류수 세척(2x2 분) 후에, 60 ℃로 가온된 아스파트산(pH 5.5) 중의 0.06% 납 니트레이트의 새로 제조된 여과된 용액을 상기 접시에 가하고 60 ℃에서 20분 동안 추가로 인큐베이션한 후에 실온에서 증류수(6x3 분)로 세정하였다. 조직 블럭을 상기 펠코 바이오웨이브에서 250 와트로 40초 동안 30%, 50%, 70%, 90%의 각 에탄올 용액 및 무수 에탄올 (absolute ethanol) 중에서 2회 탈수시켰다. 이폰(Epon) LX112 수지가, 상기 펠코 바이오웨이브에서 진공 하에 250 와트로 3분 동안 25%, 50% 및 75% 수지:무수 에탄올의 침투로 상기 조직을 매몰시키고, 최종 매몰/차단 및 60 ℃에서 12시간 동안 경화 전에, 100% 수지(2회)로 마무리하는데 사용되었다.
qRT
-
PCR
분석
전체 RNA를 퓨어링크(Purelink) RNA 미니 키트(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 세포로부터 추출하고 cDNA를 슈퍼스크립트(Super Script) III 역전사효소(라이프 테크놀로지스)를 사용하여 >100 ng 전체 RNA로부터 합성하였다. qRT-PCR 분석을 롯슈 라이트사이클러(Roche LightCycler) 96 실시간 PCR 기계에 의해 GoTaq qPCR 마스터 믹스(프로메가(Promega))로 수행하였다. 모든 절대 데이터를 먼저 GAPDH에 표준화하고 이어서 대조용 샘플에 표준화하였다(δ-δ-Ct 방법). qRT-PCR에 사용된 프라이머의 서열은 표 2에 나열된 바와 같다.
키진스(KeyGenes)를
사용하는 차세대 RNA 서열분석 및 비교 분석
서열분석을 일루미나(Illumina) NextSeq500(NextSeq 조절 소프트웨어 v1.2/실시간 분석 v2.1) 플랫폼을 사용하여 수행하였다. 라이브러리 풀을 희석하고 표준 NextSeq500 프로토콜에 따라 변성시키고 75 주기 NextSeq500 고출력 시약 키트(카탈로그 # FC-404-1005)를 사용하여 서열분석을 수행하여 단일-단부 76 bp 판독을 생성시켰다. 판독을 STAR29을 사용하여 참조 인간 게놈(hg19)에 대해 지도화하였으며, UCSC 주석 중의 각 유전자에 대한 판독수를 HTSeq 파이톤 패키지(http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/index.html) 중의 htseq-카운트를 사용하여 생성시켰다. 특유의 지도화된 판독수는 샘플당 18810634-36706805의 범위였다. 표준화된 판독수를 DESeq2 패키지30를 사용하여 계산하였다.
키진스를 사용하여, 신장(GSE66302)15을 포함하여 상이한 첫 번째 3개월 인간 기관에 대한 D0, D3, D11, D18 신장 오가노이드의 일치 점수를 생성시켰다. 첫 번째 및 두 번째 3개월(GSE66302)로부터의 D0, D3, D11, D18 신장 오가노이드 및 21개 인간 태아 기관의 계층적 군집화를 나타내는 계통도(도 13)는 키진스(www.keygenes.nl; 표 3)에 의해 측정된 바와 같은 85개 분류자 유전자의 발현 수준의 피어슨 보정을 기본으로 하였다. 상기 분류자 유전자를, 상기 데이터 세트로부터 배밖의 조직 (extraembryonic tissue)을 포함하지 않는 인간 태아 데이터의 상위 500개의 가장 상이하게 발현된 유전자들을 사용하여 키진스에 의해 산정하였다.
근위세관에
대한 기능 분석
덱스트란 흡수 분석을 위해서, 17일째의 오가노이드를 10 ㎍㎖-1의 10,000 MW 덱스트란 알렉사(Alexa)488-접합된 것(D-22910, 라이프 테크놀로지스)과 24시간 동안 배양하였다. 오가노이드를 고정시키고 침투없이 LTL에 의해 염색하였다. 신독성 분석을 위해서, 17일째의 오가노이드를 0, 5, 20 또는 100 μM의 시스플라틴(시그마 알드리치)과 24시간 동안 배양하였다. 세포사멸성 근위세관 대 전체 근위세관의 비를, 실험당 2 또는 3개의 전형적인 시야에서 이미지J(ImageJ)를 사용하여 수동으로 세었다. 통틀어, n = 5의 독립적인 실험. 상들을 자이스 LSM 780 공초점 현미경을 사용하여 촬영하였다.
결과 & 논의
우리는 앞서 시험관내에서 IM의 형성에 FGF9 또는 FGF2가 필요함을 입증하였다1. 따라서, 생체내에서 우리는 UE가 원시줄무늬 단계후 바로 FGF9 및 RA에 노출된 조기 이동하는 PSM 세포로부터 형성되는 반면, 늦게 이동하는, 따라서 보다 오래 Wnt 신호전달에 노출된 세포는 MM을 생성시킬 것으로 가정하였다13(도 7a). 이를 확인하기 위해서 및 실시예 1에 나타낸 데이터에 더하여, 우리는 FGF9의 첨가 전에 초기 Wnt 신호전달(CHIR99201)의 지속기간을 변화시키고 qPCR에 의한 AI 및 PI의 마커를 모니터하였다. 보다 짧은 기간의 CHIR99021은 AI 마커, LHX1 및 GATA3을 유도한 반면, 보다 오랜 일수의 CHIR99021은 7일째에 PI 마커, HOXD11 및 EYA1을 증가시켰다. CHIR99021에서 보다 오랜 일수 후에 PSM 마커, TBX6 및 T의 연장된 발현은 예상된 바와 같이, FGF9-유도된 운명 구속 (fate commitment)의 지연(도 7c)을 암시하였다. 면역형광 분석은 분화 7일째에 각각 GATA3 및 HOXD11에 의해 지시되는 바와 같이, CHIR99021의 보다 오랜(또는 보다 짧은) 지속기간이 보다 적은(보다 많은) AI, 그러나 보다 많은(보다 적은) PI를 유도함을 입증하였다(도 7d). 이러한 관찰은 배양 18일 후에 지속되었으며, 이때 우세한 UE 유도(GATA3+PAX2+ECAD+)는 CHIR99201에서 보다 적은 일수 후에 발생하였고 MM(PAX2+ECAD+) 및 그의 유도체(PAX2+ECAD+)의 우선적인 유도는 CHIR66201에서 보다 오랜 일수로 발생하였다. 더욱이, 우리는 RA 신호전달이 또한 FGF9와 함께, RA 또는 RAR 길항물질, AGN193109를 사용하여 IM의 A-P 운명 패턴화를 조절하는 지의 여부를 조사하였다(도 7e,f). RA는 UE 유도를 촉진한 반면 AGN193109는 UE를 억제하였지만 MM 계통의 유도는 증대시켰다(도 7g,h).
이러한 결과는 배발생에 대한 우리의 이해를 증가시킬 뿐만 아니라 신장 형성에 필수적인 2개의 IM-유래된 전구세포 집단 각각의 상대적인 유도를 조절하는 방법을 제공한다. 그 결과, 우리는 우리의 기존의 신장 분화 방법을, 형성된 MM의 비율을 증가시키고, 3D 배양 시간을 증가시키고, 네프론 형성을 능동적으로 촉발하도록 변형시켰다. 이러한 최적화된 접근법을 hESC 또는 인간 iPSC에 적용하였으며 상기 접근법은 CHIR99021의 초기 4일(이는 상기 단층 배양물 중의 UE 및 MM 모두의 유도를 생성시켰다)에 이어서, 오가노이드 배양물로의 전달 전 FGF9의 3일을 수반하였다(도 8a). 상기 생성되는 응집체를 20일 이하로 배양하였으며, 이 시간 동안 상기 응집체는 복잡한 신장 오가노이드를 자발적으로 형성하였다(도 8b). 정상적인 신장 발생 동안, 상기 MM으로부터 네프론 형성은 상기 UE로부터 분비된 Wnt9b에 반응하여 개시된다. 마우스에서, 이소성 네프론 형성은 표준적인 Wnt 작용물질의 첨가를 통해 촉발될 수 있다14. 실제로, 오가노이드당 최대의 네프론 수는 펠릿 형성 후에 1시간 동안 CHIR99021의 펄스를 필요로 하였다(도 8a 및 도 11a). 또한, 상기 CHIR99021 후 FGF9의 계속된 존재는 네프론형성에 필수적이었으며, 이는 Wnt-매개된 네프론 유도 후 FGF 신호전달에 대한 추가적인 역할을 암시하였다(도 11b). 각각의 오가노이드 내에서, 네프론은 적합하게는 4개의 성분(집합관(GATA3+ECAD+), 초기 원위세관(GATA3-LTL-ECAD+), 초기 근위세관(LTL+ECAD-) 및 사구체(WT1+)(도 8c, d) 포함)으로 분할되었다. 더욱이, 신장 오가노이드는 중간의 원위 및 근위세관에 결합하는, 상기 오가노이드 기부에 형성되는 집합관 트리과, 각 오가노이드 상부의 사구체에 의한 복잡한 형태형성 패턴화를 나타내었다(도 8e', e", e"'). 상기 패턴화는, 사구체가 피질 중에서 발생하는 반면 집합관은 상기 중간으로부터 기관을 통해 사방으로 퍼지는, 생체내에서 관찰되는 조직 조직화를 모방한다. 여기에서 다시, 개별적인 오가노이드 내 집합관 대 네프론의 상대적인 수준을 초기 CHIR99201에서 FGF9로의 변환 타이밍에 따라 변화시킬 수 있었다. 이어서, 우리는 응집 및 3D 배양 후 0, 3, 11 및 18일(d)째에 전체 신장 오가노이드의 RNA 서열분석을 수행하였다. 상기 시간경과를 통해, 우리는 네프론 전구세포 유전자 발현의 일시적인 상실, 그러나 발세포, 근위 및 원위세관을 포함한 다수의 네프론 분절의 마커의 증가를 관찰하였다(도 12). 전사 프로파일링을 수행하였으며 첫 번째 및/또는 두 번째 임신 3개월로부터의 21개의 인간 태아 기관/조직으로부터의 인간 태아 전사 데이터세트를 갖는 치우치지 않은 방법을 사용하여 비교하였다15. 상기 분석은 처음 3개월의 인간 태아 신장과의 배양 d11 및 d18째에 신장 오가노이드들을 군집화하였다(도 8f,g; 도 13). 보다 이른 배양 시점들(d0, d3)에서, 오가노이드는 상기 태아 생식선과 보다 밀접하게 합치되었으며, 발생학적으로 밀접하게 관련된 조직이 또한 상기 IM으로부터 유래되었다.
신장에서, 상피세포 유형(네프론 및 집합관)은 혈관 네트워크가 존재하는 신장 간질(기질)에 의해 둘러싸인다. 상기 IM은 MM을 형성할 뿐만 아니라, 기질 및 혈관 전구세포를 생성시킨다(도 9a)16 , 17. 우리는 추가적인 세포 유형의 증거 및 기능 성숙화의 증거를 위해 신장 오가노이드를 조사하였다. 집합관은 PAX2, GATA3 및 ECAD의 동시-발현을 근거로 구별될 수 있었다(도 9b). d11째에, 네프론 상피는 근위(LTL+ECAD-) 및 원위(LTL-ECAD+) 요소를 나타내었다(도 9c). d18까지, 근위세관은 성숙하여 LTL과 ECAD를 동시-발현하였으며, 이때 큐빌린이 정점 표면상에 뚜렷하였다(도 9d,e). 투과형 전자현미경검사(TEM)는 독특한 상피 하위유형; 집합관/원위세관의 특징적인 개방 관강을 둘러싸는 매우 짧은 미세융모(도 9k) 및 밀착연접을 갖는 정점의 브러시 보더를 나타내는 전형적인 근위세관 상피(도 9l)를 갖는 세포를 나타내었다. d18까지, 헨레 고리(UMOD+)가 형성되기 시작하였다(도 9f). d11까지, 근위세관에 결합된, 중심에 발세포가 형성된 보우만 주머니를 포함하는 WT1+NPHS1+ 초기 사구체18가 관찰되었다(도 9g). 신장 오가노이드는 또한 관강의 형성과 함께 CD31+KDR+SOX17+ 내피 네트워크를 발달시켰다(도 9h). TEM은 발세포의 특징적인 1차 및 2차 발 돌기 (foot process)의 존재를 보였다(도 9m). 발생 중인 신장에서, 신장 간질은 주위세포 및 사이세포로 분화한다19. 예상된 바와 같이, 신장 오가노이드는 인간 태아 신장에서 관찰되는 바와 같이20, KDR+ 내피를 따라 놓이는 PDGFRA+ 혈관주위 세포 및 사구체에 들어가는 PDGFRA+ 초기 사이세포를 함유하였다(도 14a,b). 초기 무혈관 사구체는 라미닌 염색 및 TEM에 의해 표시되는 바와 같이 기저막을 함유하였으며, 상기 기저막상에 부착하는 발 돌기를 나타내었다. 일부 예에서, 사구체는 체외 이식된 배아 마우스 신장에서 결코 관찰되지 않았던21 특징인 내피 침입의 증거를 나타내었다(도 9i). 최종적으로, 네프론은 MEIS1+ 신장 간질 세포22에 의해 둘러싸였으며, 이중 일부는 또한 FOXD1+이었고(도 9j), 이는 피질(FOXD1+MEIS1+) 및 수질(FOXD1-MEIS1+) 기질의 존재를 암시하였다. 따라서, 모든 예상된 신장 성분들은 패턴을 형성하고 상기 hPSC-유래된 신장 오가노이드내에서 성숙화하기 시작한다. 이러한 관찰과 일관되게, 배양 중 시간에 걸쳐 전사 변화가 존재하였고, 이때 네프론기원 간엽 및 요관 끝 마커의 점차적인 감소에 이어서 발세포, 근위세관, 원위세관 및 헨레고리에 특이적인 유전자의 상향조절이 존재하였다23 ,24(도 11).
질병 모델링 또는 약물 선별용 줄기-세포 유래된 신장 오가노이드의 유용성은 상기 오가노이드 내 네프론의 기능 성숙에 따라 변할 것이다. 이를 시험하기 위해서, 우리는 용질, 비타민, 호르몬 및 아미노산 재흡수에 중요한 역할을 하는 네프론 분절인 근위세관에 집중하였다. 큐빌린-매개된 근위세관 특이성 세포이물흡수의 능력은, 24시간 노출 후 LTL+ 세관에 의한 배지로부터의 덱스트란-알렉사488의 선택적 흡수에 의해 입증되었다(도 10a). 상기 근위세관은 다중약물 내성의 발현으로 인한 신독성에 대한 특정 표적(예를 들어 ABCB1, ABCG2) 및 음이온 및 양이온 운반체(예를 들어 SLC22 유전자과)를 나타낸다23 , 24. 시스플라틴은 신장에서 근위세관 세포의 카스파제-매개된 급성 세포사멸을 유도하는 상기와 같은 신독성제 중 하나이다25 , 26. 우리는 신장 오가노이드를, 절단된-CASP3 항체 염색을 검사하기 전에 24시간 동안 0, 5 및 20 μM 시스플라틴으로 처리하였다. 대조용 오가노이드는 때때로 세포사멸성 간질 세포를 나타낸 반면, 5 μM 및 20 μM 시스플라틴은 모두 성숙한 근위세관 세포(LTL+ECAD+)에서 특이적인 급성 세포사멸을 유도하였고, 반면에 미성숙 세포(LTL+ECAD-)는 세포사멸을 겪지 않았다(도 10b,c).
요약하면, 상기 연구는 소분자와 IM의 A/P 패턴화를 조심스럽게 균형잡음으로써, 인간 다능성 줄기세포를, 내피 및 신장 간질에 의해 둘러싸인 완전히 분할된 네프론을 포함하고 인간 태아 신장과 전사적으로 유사한 복잡한 다세포 신장 오가노이드를 형성하도록 지시할 수 있음을 입증한다. 이와 같이, 상기는 인간 신장 발생에 대한 우리의 이해를 개선시킬 것이다. 각각의 신장 오가노이드는 오가노이드당 >500 네프론의 상당한 크기(이는 14.5 dpc27에서 마우스 신장에 상당하는 수이다)에 달한다. 세관 기능 성숙, 사구체 혈관화 및 소변에 대한 단일 출구 경로를 갖는 연속적인 집합관 상피에 관하여 추가적인 개선의 여지가 있지만, 여기에서 관찰된 오가노이드 기능화의 정도 및 조직 복잡성은 약물을 독성에 대해 선별하거나, 유전자 신장병을 모델링하거나 또는 세포 요법에 대한 특정한 신장세포 유형의 공급원으로서 작용하는 그들의 용도를 지지한다.
우리가 분화된 hES 세포 배양물로부터 오가노이드를 형성할 수 있다는 사실은 단독으로 조직-기반 신독성 스크린, 시험관내 질병 모델을 생성시키거나 또는 신장 기능을 보충하기 위해 이식성 오가노이드를 개발할 가능성을 열어준다. 또한, 상기는 나중의 정제를 위한 특정한 성숙한 신장 세포 유형의 생성 가능성을 암시한다.
상기 방법을 사용하여 생성시킨 세포의 특정 용도는 하기를 포함한다:
·신독성 선별을 위해 미니-신장 오가노이드 또는 정제된 신장 세포를 생성시키고;
·일반적으로 또는 환자에 따라, 질병 모델링을 위해 미니-신장 오가노이드 또는 정제된 신장 세포를 생성시키고; 및/또는
·신장병의 치료학적 치료를 위한 약물 선별을 위해 미니-신장 오가노이드 또는 정제된 신장 세포를 생성시킨다.
이들을 미세생물반응기에서 또는 보다 큰 포맷의 스크린으로 바이오프린팅 후에 수행할 수 있었다. 질병 모델링 또는 약물 선별을 위해서, 우리는 개별적인 세포 유형을 정제하고 이를 특정 질병에 근거하여 유용한 정보를 제공하는 방식 또는 포맷으로 배양할 수 있을 듯하다. 예를 들어, 우리는 UB를 단리하고 매트리젤 배양물에서 증식시켜 낭종 형성(예를 들어 신결핵증과 같은 질병의 경우)을 평가하거나 MM을 단리하여 발세포를 생성시킬 수도 있다(예를 들어 핀란드 신장병증 또는 알포트 증후군과 같은 질병의 경우).
세포 요법 및 기관 교체 또는 수복의 특정한 예는 하기를 포함한다.
·세포 요법(급성 신장 손상 또는 만성 신장 손상)을 위한 신장 세포 유형을 생성시키고;
·전체 기관 교체 생물공학(교체 '기관'을 형성시키기 위해 다수의 보다 작은 신장들을 연결할 필요가 있을 수도 있다)을 위한 신장 세포 유형을 생성시키고; 및/또는
·탈세포화된 스캐폴드의 재세포화를 위한 신장 세포 유형을 생성시킨다.
·추가의 응용은
·1) 특정 신장 세포 유형으로의 분화의 판독정보로서 하나 이상의 형광 정보제공인자 (reporter)를 보고하도록 조작된 인간 다능성 줄기세포주로부터 신장 오가노이드의 생성. 이는 단일 출발 세포주로부터, 특정한 항체 가시화의 요구 없이 분화 복잡성 정도를 보고하고 상기 하나의 분화로부터 다양한 특정한 신장 세포 유형을 정제하기 위해 조합적인 FACS 분류를 용이하게 하는 오가노이드를 생성시킬 수 있게 한다.
·2) 세포 손상(신독성, 세포독성 또는 세포사멸/괴사의 유도에 대해 예견된 반응)의 판독정보로서 하나 이상의 형광 또는 루시페라제계 정보제공인자를 보고하도록 조작된 인간 다능성 줄기세포 계통으로부터의 신장 오가노이드의 생성. 이는 정량분석이 가능한 반응의 판독정보를 갖는 약물 또는 신독성 선별을 위한 오가노이드의 생성을 허용할 것이다.
·3) 다른 바이오프린트된 구조물과의 조합을 위해 집합관 또는 후신 간엽을 단독으로 생성시킴. 예를 들어, 별도로 분화되었지만 요관 트리으로 바이오프린트된 집합관과의 조합을 위해 네프론-형성 간엽을 단독으로 생성시킴. 여기에서 이점은 특이적으로 패턴화된 집합관 네트워크를, 최종 생성물이 소변을 단일 출구로 향하게 할 수 있는 이식성 기관으로서 작용하도록 분화시킬 수 있는 네프론 주변에 생성시키는 것일 수 있다.
본 명세서 전체를 통해 상기 목적은, 특징들의 임의의 하나의 실시태양 또는 특정한 콜렉션으로 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명의 바람직한 실시태양으로 기재되었다. 따라서, 당해 분야의 숙련가들은 본 명세에 비추어, 다양한 변형 및 변화를 본 발명의 범위로부터 이탈됨 없이 예시된 특정 실시태양으로 수행할 수 있음을 알 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 컴퓨터 프로그램, 연산, 특허 및 과학 문헌을 본 명세서에 참고로 인용한다.
[표 1]
[표 3]
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Claims (44)
- 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 생성 방법으로서, 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포의 하나 이상의 신장 오가노이드로의 응집을 유도하고 이에 의해 상기 신장 오가노이드가 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함하도록 하는 조건하에서, 중간 중배엽(IM) 세포를, 섬유아세포 성장인자 9(FGF9) 및/또는 섬유아세포 성장인자 20(FGF20) 및/또는 섬유아세포 성장인자 2(FGF2); 및 임의로 골형성 단백질 7(BMP7); 헤파린; Wnt 작용물질 (agonist); 레티노산(RA), 유사체 또는 작용물질; 및 RA 길항물질 (antagonist)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,
혈관화를, 중간엽 세포 또는 조직으로부터 혈관 내피 또는 혈관 전구세포의 발생을 촉진하거나 지시하는 조건에 의해 촉진하는 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
FGF9 및/또는 FGF20 및/또는 FGF2가 약 20 ng 내지 1 ㎍/㎖의 범위; 약 50 내지 500 ng/㎖의 범위; 약 100 내지 300 ng/㎖의 범위; 및 약 200 ng/㎖로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 농도로 존재하는 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
BMP 7이 약 25 내지 75 ng/㎖의 범위; 약 35 내지 60 ng/㎖의 범위; 약 45 내지 55 ng/㎖의 범위; 및 약 50 ng/㎖로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 농도로 존재하는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
RA, 유사체 또는 작용물질이 IM 세포로부터 요관 상피 전구세포의 상대적인 생성을 증가시키는 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
RA, 유사체 또는 작용물질이 약 10 pM 내지 1 μM의 범위; 약 30 pM 내지 0.5 μM의 범위; 약 50 pM 내지 0.2 μM의 범위; 및 약 0.1 μM로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 농도로 존재하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
RA 길항물질이 IM 세포로부터 네프론 전구세포 전구세포의 상대적인 생성을 증가시키는 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
RA 길항물질이 약 0.50 pM 내지 10 μM의 범위; 약 0.01 μM 내지 5 μM의 범위; 약 0.1 μM 내지 5 μM의 범위; 및 약 1 μM로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 농도로 존재하는 방법.
[청구항 8]
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
Wnt 작용물질이 IM 세포로부터 네프론 전구세포 전구세포의 상대적인 생성을 증가시키는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
Wnt 작용물질이 약 0.1 μM 내지 10 μM의 범위; 약 0.2 μM 내지 5 μM의 범위; 및 약 1 내지 2 μM의 범위로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 농도로 존재하는 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
헤파린이 약 0.1 내지 10 ㎍/㎖ 범위의 농도로 존재하는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
중간 중배엽(IM) 세포를 FGF9와 단독으로 또는 BMP7, RA, RA 길항물질, Wnt 작용물질, FGF20, FGF2 및/또는 헤파린 중 하나 이상과 함께 약 72 내지 360시간 동안 접촉시키는 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 IM 세포로부터 동기적으로 또는 동시에 생성시키는 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
후방 원시줄무늬 세포를, 상기 후방 원시줄무늬 세포의 IM 세포로의 분화를 촉진하는 하나 이상의 작용제와 접촉시킴을 포함하는 방법. - 제13항에 있어서,
인간 다능성 줄기세포(hPSC)를, 상기 hPSC의 후방 원시줄무늬 세포로의 분화를 촉진하는 하나 이상의 작용제와 접촉시킴을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
hPSC를 Wnt 작용물질과 접촉시켜 중배엽 세포를 생성시키는 단계를 포함하는 방법. - 제15항에 있어서,
중배엽 세포가 완성 중배엽 및 중간 중배엽 중 하나 이상을 포함하는 혼합 집단인 방법. - 제15항 또는 제16항에 있어서,
Wnt 작용물질의 농도가 약 8 μM인 방법. - 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
hPSC를 Wnt 작용물질과 약 4일 동안 접촉시키는 방법. - 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
중배엽 세포를 후속으로 FGF9 및/또는 FGF20 및/또는 FGF2와 약 3일 동안 접촉시키는 방법. - 제19항에 있어서,
세포를 Wnt 작용물질과 접촉시키는 후속 단계를 더 포함하는 방법. - 제20항에 있어서,
Wnt 작용물질의 농도가 약 5 μM인 방법. - 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
세포를 Wnt 작용물질과 약 1시간 동안 접촉시키는 방법. - 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
세포를 RA 길항물질, RA 또는 RA 작용물질, BMP7 및/또는 헤파린 중 하나 이상과 접촉시킴을 더 포함하는 방법. - 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
혈관구조 및/또는 혈관 전구세포의 생성을 더 포함하는 방법. - 제24항에 있어서,
혈관화를, 중간엽 세포 또는 조직으로부터 혈관 내피 또는 혈관 전구세포의 발생을 촉진하거나 지시하는 조건에 의해 촉진시키는 방법. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
hPSC가 인간 배아 줄기세포 또는 유도된 인간 다능성 줄기세포인 방법. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 단리되거나, 농축되거나, 정제된 네프론 전구세포, 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드.
- 제27항에 있어서,
분할된 (segmented) 네프론, 내피 및 신장 간질을 포함하는 신장 오가노이드. - 제28항에 있어서,
인간 태아 신장 또는 그의 하나 이상의 세포 유형과 전사적으로 유사한 하나 이상의 신장 세포 또는 세포 유형을 포함하는 신장 오가노이드. - 신장, 또는 신장 세포 또는 조직의 생성 방법으로서, 제26항의 단리되거나 정제된 네프론 전구세포, 요관 상피 전구세포 및/또는 신장 오가노이드로부터 상기 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 분화시켜 상기 신장, 또는 신장 세포 또는 조직을 생성시키는 단계를 포함하는 방법.
- 신장, 또는 신장 세포 또는 조직의 생성에 사용하기 위한, 제30항의 단리되거나, 농축되거나, 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포 또는 신장 오가노이드.
- 신장 구조물의 바이오프린트 방법으로서, 다수의 hPSC 또는 다른 전구세포를 침착시켜, 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함하고 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 신장 구조물을 형성시킴을 포함하는 방법.
- 제33항에 있어서,
hPSC 또는 다른 전구세포에 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법을 수행하여, 바이오프린트된 신장 구조물 중에 네프론 전구세포, 요관 상피 전구세포 및 혈관구조를 생성시키는 방법. - 신장 구조물의 바이오프린트 방법으로서, 본원에 개시된 다수의 네프론 전구세포 및 요관 상피 전구세포를 침착시켜, 적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함하고 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 신장 구조물을 형성시킴을 포함하는 방법.
- 제36항에 있어서,
네프론 전구세포, 요관 상피 전구세포 및 혈관구조가 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 방법에 의해 hPSC로부터 생성된 것인 방법. - 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된, 적어도 부분적으로 혈관화되고 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 갖거나 또는 신장 또는 그의 성분의 하나 이상의 기능적 특성을 나타낼 수 있는 바이오프린트된 신장 구조물.
- 제31항 또는 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 신장 이식 또는 만성 신장병의 치료를 위한 전체 신장 및 신장 조직의 바이오프린팅 또는 생물공학; (ii) 전체 기관 탈세포화된 신장의 재세포화에 의한 재구성된 또는 교체 신장의 생성; 또는 (iii) 손상된 신장 또는 하나 이상의 신장 질환 또는 병증의 세포 요법을 위한 방법. - 평면 기하학적 구조를 갖는 네프론 전구세포 및 요관 전구세포의 어레이.
- 제38항에 있어서,
2 내지 15 또는 그 이상 적층된 어레이를 포함하는 어레이. - 제39항에 있어서,
바둑판 패턴으로 적층된 어레이. - 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항의 어레이를 성숙화시킴으로써 수득된 신장 오가노이드.
- 제41항에 있어서,
적어도 부분적으로 혈관화되고/되거나 혈관 전구세포를 포함하는 신장 오가노이드. - 하나 또는 다수의 화합물의 신독성을 측정하는 방법으로서, 상기 하나 또는 다수의 화합물을 제26항, 제41항 또는 제42항 중 어느 한 항의 단리되거나 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포 또는 신장 오가노이드, 제36항의 바이오프린트된 신장 구조물, 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항의 어레이 또는 그로부터 분화되거나 달리 수득된 신장 세포 또는 조직과 접촉시켜, 상기 하나 또는 다수의 화합물이 신독성인지 아닌지를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제38항에 있어서,
하나 또는 다수의 화합물을, 단리되거나 정제된 네프론 전구세포 및/또는 요관 상피 전구세포, 신장 오가노이드 바이오프린트된 구조물, 또는 그로부터 분화되거나 달리 수득된 신장 세포 또는 조직과 접촉시킴으로써 수행되는 방법.
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