WO2023033137A1

WO2023033137A1 - 腎臓オルガノイド及びその製造方法

Info

Publication number: WO2023033137A1
Application number: PCT/JP2022/033078
Authority: WO
Inventors: 実高里; 義基佐原
Original assignee: 大塚製薬株式会社; 国立研究開発法人理化学研究所
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2022-09-02
Publication date: 2023-03-09
Also published as: EP4397749A1; JPWO2023033137A1; TW202313964A

Abstract

腎臓オルガノイドを製造するための新規な方法を提供することを１つの目的とする。　初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地を用いて培養することを含み、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする、腎臓オルガノイドを製造する方法。

Description

腎臓オルガノイド及びその製造方法

　本発明は、腎臓オルガノイド及びその製造方法に関する。より具体的には、本発明は、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイド、及びその製造方法に関する。本発明はまた、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを含む再生医療用組成物に関する。本発明はまた、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物、及びその製造方法に関する。本発明はまた、被検物質に対する薬物応答性を評価する方法にも関する。本発明はまた、近位尿細管の成熟化を促進する方法にも関する。

　腎臓は、体内細胞の生命活用により生成される代謝物（例えば、尿素、尿酸及びクレアチニン）を尿中に濃縮して体外に排出する。腎臓はまた、体内細胞の実質的な生存環境である細胞外液の量及びその物理化学的特性（例えば、電解質濃度、浸透圧、ｐＨ）を調整する。

　腎臓は、腎小体（糸球体及びボウマン嚢）と尿細管とを機能単位とするネフロンの集合体である。糸球体でろ過された血液（原尿）は、尿細管を経て尿となる。尿細管は、糸球体に続く近位尿細管から始まり、中間尿細管、遠位尿細管、及び結合尿細管を経て、皮質集合管に繋がる。

　ヒトｉＰＳ細胞から腎臓オルガノイドを製造する方法が報告された（特許文献１及び２）。

　非特許文献１は、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｌｐｈａ（ＰＰＡＲＡ）アゴニストであるＦｅｎｏｆｉｂｒａｔｅが、マウスの近位尿細管細胞において近位尿細管遺伝子の発現を上昇させることを報告する。

特表２０１６－５２７８７８特表２０１７－５３７６５５

Dhillon P, et. al., Cell Metabolism Volume 33, Issue 2, 2 February 2021, Pages 379-394.e8

　当該分野には、成熟した近位尿細管を含む腎臓オルガノイドに対する要望が存在する。当該分野には、腎障害に対する感受性が増加した腎臓オルガノイドを用いた、被検物質に対する薬物応答性を評価する方法に対する要望が存在する。

　本開示は、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする新規な腎臓オルガノイドを提供することを１つの目的とする。本開示は、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドの新規な製造方法を提供することを１つの目的とする。本開示は、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを含む新規な再生医療用組成物を提供することを１つの目的とする。本開示はまた、被検物質に対する薬物応答性を評価する新規な方法を提供することを１つの目的とする。本開示はまた、近位尿細管の成熟化を促進する方法を提供することを１つの目的とする。

　本発明者らは、腎臓オルガノイドをＰＰＡＲＡアゴニストとＲＸＲアゴニストとの組合せの存在下で培養することで、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドが形成されることを見出した。形成された前記腎臓オルガノイドでは、低濃度シスプラチンに対する薬物応答性に対する感受性が増加した。

　前記知見に基づき、本開示は、以下の態様に係る発明を提供する。
［項１］　腎臓オルガノイドを製造する方法であって、初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地を用いて培養することを含み、前記腎臓オルガノイドが成熟した近位尿細管細胞を含有する、方法。
［項１－１］　前記ＰＰＡＲアゴニストが、ＰＰＡＲＡアゴニスト、ＰＰＡＲＧアゴニスト、ＰＰＡＲＤアゴニスト、ＰＰＡＲＡ／Ｇアゴニスト、ＰＰＡＲＡ／Ｄアゴニスト、ＰＰＡＲＧ／Ｄアゴニスト、及びＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄアゴニストからなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の方法。
［項１－２］　前記ＰＰＡＲアゴニストが、ＰＰＡＲＡアゴニストである、項１又は項１－１に記載の方法。
［項２］　中間中胚葉細胞から前記初期腎オルガノイドを誘導することを更に含み、前記初期腎オルガノイドを誘導することが、前記中間中胚葉細胞を、繊維芽細胞増殖因子を含み、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂを用いて培養して、中間中胚葉スフェロイドを形成させること、前記中間中胚葉スフェロイドを、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａを用いて培養し、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含み、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂを用いて培養することを含む、項１～項１－２のいずれか一項に記載の方法。
［項２－１］　前記ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂが、更にＰＰＡＲアゴニストを実質的に含まない、項２に記載の方法。
［項３］　多能性幹細胞から前記中間中胚葉細胞を誘導することを更に含み、前記中間中胚葉細胞を誘導することが、前記多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａを用いて培養し、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含み、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂを用いて培養することを含む、項２又は項２－１に記載の方法。
［項４］　前記腎臓オルガノイドが、近位尿細管マーカーを発現し、前記近位尿細管マーカーが、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、及びＡＢＣＢ１からなる群より選択される少なくとも１種である、項１～項３のいずれか一項に記載の方法。
［項４－１］　前記腎臓オルガノイドが、近位尿細管マーカーを発現し、前記近位尿細管マーカーが、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、及びＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも１種である、項１～項３のいずれか一項に記載の方法。
［項５］　前記腎臓オルガノイドが、更にＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーを発現し、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーがＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＰＴ１Ａ、ＦＡＢＰ１、ＣＹＰ２７Ａ１、及びＡＣＯＸ１からなる群より選択される少なくとも１種である、項４に記載の方法。

［項６］　前記腎臓オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量が、前記初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量より１．２倍以上多い、項４又は項５に記載の方法。
［項６－１］　前記腎臓オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量が、前記初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量より１．２倍以上多い、項５に記載の方法。
［項６－２］　前記腎臓オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量が、前記初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量より１．５倍以上多く、且つ前記腎臓オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量が、前記初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量より１．２倍以上多い、項５に記載の方法。
［項６－３］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項６に記載の方法。
［項６－４］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項６－１に記載の方法。
［項６－５］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）であり、且つ、前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項６－２に記載の方法。
［項６－６］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項４又は項５に記載の方法。
［項６－７］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項５に記載の方法。
［項６－８］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）であり、且つ、前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項５又は項６－７に記載の方法。

［項７］　前記ＰＰＡＲアゴニストが、ＣＰ７７５１４６、ピリニクス酸（ＷＹ１４６４３）、ベザフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、シプロフィブレート、ペマフィブレート、ビニフィブレート、クリノフィブレート、クロフィブリン酸、ニコフィブレート、ピリフィブレート、プラフィブリド、ロニフィブレート、テオフィブレート、トコフィブレート、ＳＲ１０１７１、ＧＷ６４７１、Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ、Ｐｉｒｉｎｉｘｉｃ　ａｃｉｄ、ＧＷ７６４７、Ｉｃａｒｉｉｎ、Ｅｕｐａｔｉｌｉｎ、Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ、Ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｉｃ　Ａｃｉｄ、ＮＸＴ６２９、Ｓａｒｏｇｌｉｔａｚａｒ　Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ、Ｓａｒｏｇｌｉｔａｚａｒ、Ｏｌｅｏｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ、ＢＭＳ－６８７４５３、Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ　ＸＬＩＸ、ＣＵＤＡ、Ｃｉｐｒｏｆｉｂｒａｔｅ　ｉｍｐｕｒｉｔｙ　Ａ、ＣＰ－８６８３８８　ｆｒｅｅ　ｂａｓｅ、ＡＶＥ－８１３４、リノール酸、リノレン酸、及びＰＰＡＲα－ＭＯ－１からなる群より選択される少なくとも１種のＰＰＡＲＡアゴニスト；ロシグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、エファツタゾン、ＡＴｘ０８－００１、ＯＭＳ－４０５、ＣＨＳ－１３１、ＴＨＲ－０９２１、ＳＥＲ－１５０－ＤＮ、ＫＤＴ－５０１、ＧＥＤ－０５０７－３４－Ｌｅｖｏ、ＣＬＣ－３００１、ＡＬＬ－４、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ、Ｔ００７０９０７、５－Ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ、ＧＷ１９２９、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ　ｍａｌｅａｔｅ、Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ、Ｍａｇｎｏｌｏｌ、Ｇｌａｂｒｉｄｉｎ、Ｂａｌａｇｌｉｔａｚｏｎｅ、Ｍｉｆｏｂａｔｅ、Ｉｎｏｌｉｔａｚｏｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＥＨＰ－１０１、Ａｄｅｌｍｉｄｒｏｌ、Ｏｒｏｘｉｎ　Ａ、Ｃｅｆｍｉｎｏｘ　ｓｏｄｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌ　ｏｌｅａｎｏｎａｔｅ、１５－Ｄｅｏｘｙ－Δ－１２，１４－ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｊ２、ＧＳＫ３７６５０１Ａ、４－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ　ｈｏｎｏｋｉｏｌ、Ｃａｕｌｏｐｈｙｌｌｏｇｅｎｉｎ、Ｄａｒｇｌｉｔａｚｏｎｅ、Ａｎｇｅｌｏｙｌｇｏｍｉｓｉｎ　Ｈ、ＤＳ－６９３０、Ｉｎｏｌｉｔａｚｏｎｅ及びＡｒｈａｌｏｆｅｎａｔｅからなる群より選択される少なくとも１種のＰＰＡＲＧアゴニスト；フィナデルパー、ＡＳＰ０３６７、ＧＷ５０１５１６、Ｐｐａｒδアゴニスト５、ＭＢＸ８０２５、ＧＷ０７４２、Ｌ１６５０４１、ＨＰＰ－５９３及びＮＣＰ－１０４６からなる群より選択される少なくとも１種のＰＰＡＲＤアゴニスト；サログリタザール、アレグリタザール、ムラグリタザール、テサグリタザール及びＤＳＰ－８６５８からなる群より選択される少なくとも１種のＰＰＡＲＡ／Ｇアゴニスト；ＥＬＡ及びＴ９１３６５９のいずれか一方又は両方であるＰＰＡＲＡ／Ｄアゴニスト；リノール酸及びＴ３Ｄ－９５９のいずれか一方又は両方であるＰＰＡＲＧ／Ｄアゴニスト；又はＩＶＡ３３７、ＴＴＡ、Ｂａｖａｃｈｉｎｉｎ、ＧＷ４１４８、ＧＷ９１３５、ベンザフィブラート、ロベグリタゾン、及びＣＳ０３８からなる群より選択される少なくとも１種であるＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄアゴニスト；若しくはそれらの組合せ、及び／又は
　ＲＸＲアゴニストが、９－ｃｉｓレチノイン酸（アリトレチノイン）、ＡＧＮ１９５２０４、ＴＴＮＰＢ（アロチノイド酸）、Ａｄａｐａｌｅｎｅ、Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ、Ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ、ＣＨ５５、及びＡＭ５８０からなる群より選択される少なくとも１種である、項１～項６－８のいずれか一項に記載の方法。
［項８］　項１～項７のいずれか一項に記載の方法で製造された、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド。
［項９］　腎臓オルガノイドであって、前記腎臓オルガノイドが成熟した近位尿細管細胞を含有し、前記腎臓オルガノイドは、近位尿細管マーカーを発現し、前記近位尿細管マーカーが、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、及びＡＢＣＢ１からなる群より選択される少なくとも１種である、腎臓オルガノイド。
［項９－１］　腎臓オルガノイドであって、前記腎臓オルガノイドが成熟した近位尿細管細胞を含有し、前記腎臓オルガノイドは、近位尿細管マーカーを発現し、前記近位尿細管マーカーが、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、及びＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも１種である、腎臓オルガノイド。
［項１０］　ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＰＴ１Ａ、ＦＡＢＰ１、ＣＹＰ２７Ａ１、及びＡＣＯＸ１からなる群より選択される少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーを更に発現する、項９に記載の腎臓オルガノイド。

［項１１］　前記近位尿細管マーカーにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記近位尿細管マーカーにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量より１．２倍以上多い、項９又は項１０に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－１］　前記腎臓オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量より１．２倍以上多い、項１０に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－２］　前記腎臓オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量より１．５倍以上多く、且つ前記腎臓オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量より１．２倍以上多い、項１０に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－３］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項１１に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－４］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項１１－１に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－５］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）であり、且つ、前記腎臓オルガノイドにおける発現量が前記初期腎オルガノイドでの発現量よりも１．２倍多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項１１－２に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－６］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項９又は項１０に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－７］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項１０に記載の腎臓オルガノイド。
［項１１－８］　前記腎臓オルガノイドにおける発現量が初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）であり、且つ、前記腎臓オルガノイドにおける発現量が初期腎オルガノイドでの発現量よりも有意に多い前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が、少なくとも１個（例えば１個、２個、３個、４個、５個、又は６個）である、項１０又は項１１－７に記載の腎臓オルガノイド。

［項１２］　項１～項７のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は項８～項１１－８のいずれか一項に記載の腎臓オルガノイドを、非ヒト哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に導入することを含む、腎臓オルガノイドを腎臓又はその周辺部位に有する非ヒト哺乳動物を製造する方法であって、前記腎臓オルガノイドが成熟した近位尿細管細胞を含有する、方法。
［項１３］　項１～項７のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は項８～項１１－８のいずれか一項に記載の腎臓オルガノイドを、腎臓又はその周辺部位に有する、非ヒト哺乳動物。
［項１４］　項１～項７のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は項８～項１１－８のいずれか一項に記載の腎臓オルガノイドを含む、腎臓の損傷又は疾患を処置するための再生医療用組成物。
［項１５］　被検物質に対する薬物応答性を評価する方法であって、項１～項７のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は項８～項１１－８のいずれか一項に記載の腎臓オルガノイド、項１２に記載の方法で製造された非ヒト哺乳動物、又は項１３に記載の非ヒト哺乳動物と、被検物質とを接触させること、及び前記被検物質に対する前記腎臓オルガノイド、又は前記非ヒト哺乳動物における薬物応答性を測定することを含む、方法。
［項１５－１］　薬物応答性の測定結果に基づいて、被検物質の腎毒性を評価することを更に含む、項１５に記載の方法。
［項１６］　腎臓の損傷又は疾患を処置する方法であって、項１～項７のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は項８～項１１－８のいずれか一項に記載の腎臓オルガノイド、或いは項１４に記載の医療用組成物を、その必要のある哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に導入することを含む、方法。
［項１７］　近位尿細管の成熟化を促進する方法であって、初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地を用いて培養することを特徴とする、方法。

図１は、１つの実施形態に係る成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド作製、及び薬剤の腎毒性評価の概要を示すフローチャート図である。図２ａ～図２ｉは、ＣＰ７７５１４６と９－ｃｉｓレチノイン酸との組合せの存在下で培養した腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞における、近位尿細管マーカー（図２ａ：ＵＧＴ２Ａ３、図２ｂ：ＡＺＧＰ１、図２ｃ：ＳＬＣ３９Ａ４、図２ｄ：ＢＨＭＴ、図２ｅ：ＡＣＥ２、図２ｆ：ＡＱＰ６、図２ｇ：ＣＵＢＮ、図２ｈ：ＬＲＰ２、及び図２ｉ：ＡＢＣＢ１）の発現量を示す一連の棒グラフである。図３ａ～図３ｆは、ＣＰ７７５１４６と９－ｃｉｓレチノイン酸との組合せの存在下で培養した腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞における、ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカー（図３ａ：ＡＰＯＡ１、図３ｂ：ＡＰＯＣ３、図３ｃ：ＣＰＴ１Ａ、図３ｄ：ＦＡＢＰ１、図３ｅ：ＣＹＰ２７Ａ１、及び図３ｆ：ＡＣＯＸ１）の発現量を示す一連の棒グラフである。図４ａ～図４ｉは、ＣＰ７７５１４６単独の存在下、９－ｃｉｓレチノイン酸単独の存在下、又はＣＰ７７５１４６と９－ｃｉｓレチノイン酸との組合せの存在下で培養した腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞における、近位尿細管マーカー（図４ａ：ＵＧＴ２Ａ３、図４ｂ：ＡＺＧＰ１、図４ｃ：ＳＬＣ３９Ａ４、図４ｄ：ＢＨＭＴ、図４ｅ：ＡＣＥ２、図４ｆ：ＡＱＰ６、図４ｇ：ＣＵＢＮ、図４ｈ：ＬＲＰ２、及び図４ｉ：ＡＢＣＢ１）の発現量を示す一連の棒グラフである。図５ａ～図５ｅは、ＣＰ７７５１４６単独の存在下、９－ｃｉｓレチノイン酸単独の存在下、又はＣＰ７７５１４６と９－ｃｉｓレチノイン酸との組合せの存在下で培養した腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞における、ＰＰＡＲＡ下流遺伝子群（図５ａ：ＡＰＯＡ１、図５ｂ：ＡＰＯＣ３、図５ｃ：ＣＰＴ１Ａ、図５ｄ：ＦＡＢＰ１、及び図５ｅ：ＡＣＯＸ１）の発現量を示す一連の棒グラフである。図６ａ及び図６ｂは、シスプラチン（ＣＤＤＰ）非存在下（図６ａ）、又は５μシスプラチン存在下（図６ｂ）で培養したＣｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ発現細胞についての２Ｄ散布図である。図６ｃ及び図６ｄは、シスプラチン（ＣＤＤＰ）非存在下（図６ａ）、又は５μシスプラチン存在下（図６ｂ）で培養したＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイド由来のＬＴＬ陽性細胞についての２Ｄ散布図である。

図７は、シスプラチン腎毒性試験の結果を示す棒グラフである。図８ａは、腎臓オルガノイドの免疫染色画像を示す。図８ｂは、腎臓オルガノイドを構成する細胞のヒストグラムである。図８ｃは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドにおけるＬＴＬ陽性細胞の割合およびＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドにおけるＬＴＬ陽性細胞の割合を示す棒グラフである。図９ａは、ＬＲＰ２の発現量を示す棒グラフである。図９ｂは、ＣＵＢＮの発現量を示す棒グラフである。図１０ａは、腎臓オルガノイドにおけるエンドソームのサイズ分布を示す箱ひげ図である。図１０ｂは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドにおける、１細胞あたりの総エンドソーム数に対するＬａｒｇｅ　ｅｎｄｏｓｏｍｅ（≧０．５μｍ^２）の割合を示す円グラフである。図１０ｃは、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドにおける、１細胞あたりの総エンドソーム数に対するＬａｒｇｅ　ｅｎｄｏｓｏｍｅ（≧０．５μｍ^２）の割合を示す円グラフである。図１１は、腎臓オルガノイドにおけるデキストラン取込みを示す箱ひげ図である。図１２は、ＰＰＡＰＡアンタゴニストを用いて作製した腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の成熟化マーカーの発現量を示す一連の棒グラフを示す。図１２ａは、ＵＧＴ２Ａ３の発現量を示す棒グラフである。図１２ｂは、ＡＺＧＰ１の発現量を示す棒グラフである。図１２ｃは、ＳＬＣ３９Ａ４の発現量を示す棒グラフである。図１２ｄは、ＢＨＭＴの発現量を示す棒グラフである。図１２ｅは、ＡＣＥ２の発現量を示す棒グラフである。図１２ｆは、ＡＱＰ６の発現量を示す棒グラフである。図１２ｇは、ＣＵＢＮの発現量を示す棒グラフである。図１２ｈは、ＬＲＰ２の発現量を示す棒グラフである。図１２ｉは、ＡＢＣＢ１の発現量を示す棒グラフである。図１２ｊは、ＡＰＯＡ１の発現量を示す棒グラフである。図１２ｋは、ＡＰＯＣ３の発現量を示す棒グラフである。図１２ｌは、ＣＹＰ２７Ａ１の発現量を示す棒グラフである。図１２ｍは、ＦＡＢＰ１の発現量を示す棒グラフである。

図１３は、ＲＸＲアンタゴニストを用いて作製した腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の成熟化マーカーの発現量を示す一連の棒グラフを示す。図１３ａは、ＵＧＴ２Ａ３の発現量を示す棒グラフである。図１３ｂは、ＡＺＧＰ１の発現量を示す棒グラフである。図１３ｃは、ＳＬＣ３９Ａ４の発現量を示す棒グラフである。図１３ｄは、ＢＨＭＴの発現量を示す棒グラフである。図１３ｅは、ＡＣＥ２の発現量を示す棒グラフである。図１３ｆは、ＡＱＰ６の発現量を示す棒グラフである。図１３ｇは、ＣＵＢＮの発現量を示す棒グラフである。図１３ｈは、ＬＲＰ２の発現量を示す棒グラフである。図１３ｉは、ＡＢＣＢ１の発現量を示す棒グラフである。図１３ｊは、ＡＰＯＡ１の発現量を示す棒グラフである。図１３ｋは、ＡＰＯＣ３の発現量を示す棒グラフである。図１３ｌは、ＣＹＰ２７Ａ１の発現量を示す棒グラフである。図１３ｍは、ＦＡＢＰ１の発現量を示す棒グラフである。図１４は、ピリニクス酸を用いて作製した腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の成熟化マーカーの発現量を示す一連の棒グラフを示す。図１４ａは、ＵＧＴ２Ａ３の発現量を示す棒グラフである。図１４ｂは、ＡＺＧＰ１の発現量を示す棒グラフである。図１４ｃは、ＳＬＣ３９Ａ４の発現量を示す棒グラフである。図１４ｄは、ＢＨＭＴの発現量を示す棒グラフである。図１４ｅは、ＡＣＥ２の発現量を示す棒グラフである。図１４ｆは、ＡＱＰ６の発現量を示す棒グラフである。図１４ｇは、ＣＵＢＮの発現量を示す棒グラフである。図１４ｈは、ＬＲＰ２の発現量を示す棒グラフである。図１４ｉは、ＡＢＣＢ１の発現量を示す棒グラフである。図１４ｊは、ＡＰＯＡ１の発現量を示す棒グラフである。図１４ｋは、ＡＰＯＣ３の発現量を示す棒グラフである。図１４ｌは、ＣＰＴ１Ａの発現量を示す棒グラフである。図１４ｍは、ＦＡＢＰ１の発現量を示す棒グラフである。

［成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド］
　本開示の１つの態様は、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを提供する。本開示の１つの態様は、近位尿細管マーカーを発現し、前記近位尿細管マーカーが、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、及びＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも１種である、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを提供する。また、本開示の１つの態様において、ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーを更に発現していてもよく、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーが、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＰＴ１Ａ、ＦＡＢＰ１、ＣＹＰ２７Ａ１、及びＡＣＯＸ１からなる群より選択される少なくとも１種である、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを提供する。

　本明細書において用語「オルガノイド」は、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で形成された３次元的な生体組織類似の細胞集合体を意味する。生体組織類似の細胞集合体は、例えば、対応する生体組織中で観察される構造体を含む細胞集合体である。生体組織中で観察される構造体は、例えば顕微鏡で観察可能な構造（例えば、腎臓の場合、糸球体又は尿細管）であってよい。オルガノイドを構成する細胞は、例えば、そのほとんどが分化能及び増殖能を有する細胞である。オルガノイドは、例えば、マーカー遺伝子の発現（その転写産物又は翻訳産物）によって特徴づけられる。糸球体は、例えば、糸球体マーカー、例えばＰｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ又はＮｅｐｈｒｉｎ若しくはそれらの組合せの発現により特定することができる。近位尿細管は、例えば、後述する近位尿細管マーカーの発現により特定することができる。

　本明細書において用語「初期腎オルガノイド」は、ＬＨＸ１陽性の１つ以上の後腎胞（renal vesicle）を有するオルガノイドを意味する。初期腎オルガノイドは、好ましくは、上皮細胞マーカーであるＥｐＣＡＭを発現する細胞を含む。後腎胞は、好ましくは、ＬＨＸ１陽性であり、及びＪＡＧ１陽性又はＣＤＨ６陽性である。後腎胞は、好ましくは、ＬＨＸ１陽性であり、ＪＡＧ１陽性であり、及びＣＤＨ６陽性である。初期腎オルガノイドは、公知の方法、例えばＴａｋａｓａｔｏ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２０１４；１６：１１８－２６（引用により本明細書に組込まれる）に記載された方法、又はＴａｋａｓａｔｏ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５２６：５６４－５６８．（引用により本明細書に組込まれる）に記載された方法に従って、多能性幹細胞から製造することができる。初期腎オルガノイドは、例えば、本開示に係る工程Ｂ、好ましくは実施例に記載の工程Ｂに従って、中間中胚葉細胞から製造することができる。中間中胚葉細胞は、本開示に係る工程Ａ、好ましくは実施例に記載の工程Ａに従って、多能性幹細胞から製造することができる。初期腎オルガノイドは、本開示に係る工程Ａ及び工程Ｂ、好ましくは実施例に記載の工程Ａ及び工程Ｂに従って、多能性幹細胞から製造することができる。

　本明細書において「成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド」は、後述する近位尿細管マーカーを発現する細胞を含む、腎臓オルガノイドを意味する。成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、１つ以上の糸球体及び／又は尿細管を有していてもよい。１つの例において、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、更にＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカー（好ましくはＰＰＡＲＡ）を発現する細胞を含む。成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、例えば、近位尿細管及び糸球体を含む。本明細書において「腎臓オルガノイド」は、初期腎オルガノイドから分化誘導された、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドまでのあらゆる成熟段階にあるオルガノイドを含む。腎臓オルガノイドには、例えば、公知の腎臓オルガノイド又は公知の方法で製造された腎臓オルガノイドも含まれる。

　本明細書において「成熟した近位尿細管細胞」は、後述する近位尿細管マーカーを発現する。１つの例において、成熟した近位尿細管細胞は、更に後述するＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーを発現する。近位尿細管細胞は、例えば、腎臓オルガノイドにおいて糸球体の近傍に存在する。１つの例において、成熟した近位尿細管細胞は、前記近位尿細管マーカー及び前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーを発現する。

　特定のマーカー（例えばマーカー遺伝子又はマーカータンパク質）を発現しているオルガノイドは、例えば、前記オルガノイド由来の特定の細胞集団の、細胞あたりの特定のマーカーの平均発現量が、対照オルガノイド由来の前記特定の細胞集団の、細胞あたりの前記特定のマーカーの平均発現量よりも有意に多いオルガノイドであってよい。この文脈において用語「有意に」は、例えば、ｔ検定でのｐ値が０．０５未満、好ましくは０．０１未満であることを意味する。特定の細胞集団は、例えば、近位尿細管細胞である。オルガノイド由来の特定の細胞集団である近位尿細管細胞は、例えば、特定のマーカー（例えばＬＴＬ）に対する抗体を利用したＭＡＣＳを用いて製造することができる。発現量の比較は、例えば、少なくとも３個（例えば、３個、４個、５個、６個又は７個若しくは８個以上）のオルガノイドを用いて行うことができる。１つの例において、特定のマーカーを発現しているオルガノイドは、前記オルガノイド由来の特定の細胞集団の、細胞あたりの特定のマーカーの平均発現量が、対照オルガノイド由来の前記特定の細胞集団の、細胞あたりの前記特定のマーカーの平均発現量よりも１．２倍以上（例えば、１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２．０倍以上、２．３倍以上、又は２．５倍以上、或いは１．２倍～２．５倍又は１．５倍～２．５倍）多い。１つの例において、目的のオルガノイドは、本開示に係る成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドであり、対照オルガノイドは、初期腎オルガノイドである。

　１つの実施形態において、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量よりも有意に多い。１つの実施形態において、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量よりも有意に多い。１つの実施形態において、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量よりも有意に多く、及び／又はＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量が、初期腎オルガノイドにおける前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量よりも有意に多い。

　前記した実施形態に係る腎臓オルガノイドは、前記腎臓オルガノイドでの前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量が、前記初期腎オルガノイドでの前記少なくとも１種の近位尿細管マーカーの発現量よりも多く（例えば１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２．０倍以上、２．３倍以上、又は２．５倍以上、或いは１．２倍～２．５倍又は１．５倍～２．５倍多く）、及び／又は前記腎臓オルガノイドでの前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量が、前記初期腎オルガノイドでの前記少なくとも１種のＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量よりも多い（例えば１．２倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２．０倍以上、２．３倍以上、又は２．５倍以上、或いは１．２倍～２．５倍又は１．５倍～２．５倍多く）。前記例において、前記「発現量が多い」は「発現量が有意に多い」であってよい。

　目的のオルガノイド（例えば成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド）でのマーカーの発現量と対照オルガノイド（例えば初期腎オルガノイド）での前記マーカーの発現量との比較は、例えば、複数個（例えば少なくとも２個）のマーカーを用いて行うことができる。この例において、特定のマーカーを発現しているオルガノイドは、複数個（例えば１０個）のマーカーのうち、所定数（例えば６個）以上のマーカーの目的のオルガノイドでの平均発現量が、対照オルガノイドでの平均発現量よりも多いオルガノイドである。前記所定数は、例えば、測定するマーカーの数（例えば８個）と同じであってもよく（８個）、１個以上少なくてもよい（例えば７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個）。前記所定数は、例えば、測定するマーカーの数が９個の場合、３個以上、４個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは６個以上である。

　前記した実施形態に係る腎臓オルガノイドは、前記初期腎オルガノイドでの発現量よりもその発現量が多い近位尿細管マーカーの数が所定数（例えば、１個、２個、３個、又は４個）以上であり、及び／又は、前記初期腎オルガノイドでの発現量よりもその発現量が多いＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの数が所定数（例えば、１個、２個、３個、又は４個）以上である。所定数は、近位尿細管マーカーの群に含まれるマーカーの数、及びＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群に含まれるマーカーの数に応じて、それぞれ適宜設定される。所定数は、例えば、前記マーカーの群に含まれるマーカーの種類と、本明細書の実施例において有意差又は発現量が増加する傾向が観察されたマーカーの種類とを考慮して、設定される。１つの例において、所定数は、前記マーカーの群にマーカーＡ、マーカーＢ、マーカーＣ及びマーカーＤが含まれ、実施例においてマーカーＡ、マーカーＢ及びマーカーＣについて有意差又は発現量が増加する傾向が観察された場合、所定数は、少なくとも１個（例えば１個、２個、又は３個）、少なくとも２個（例えば２個又は３個）、又は３個と設定してよい。前記例において、前記「発現量が多い」は「発現量が有意に多い」であってよい。

　特定のマーカーを発現しているオルガノイドは、例えば、特定のマーカーを発現する細胞を所定の割合以上で含むオルガノイドである。この文脈において「所定のマーカーを発現する細胞」は、成熟した近位尿細管細胞であってよい。前記所定の割合は、例えば、オルガノイドを構成する細胞集団の５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上又は２５％以上であってよい。１つの例において、特定のマーカーを発現しているオルガノイドは、特定のマーカーを所定レベル以上で発現する細胞を５％以上（例えば、１０％以上、１５％以上、２０％以上又は２５％以上）含むオルガノイドである。前記所定レベルは、例えば、前記特定のマーカーを発現していない陰性対照の細胞集団の発現レベルの第３四分位数である。

　上記した例において、所定のマーカーは、後述する近位尿細管マーカー及び／又は後述するＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーである。マーカーの発現量は、その転写産物の量、その翻訳産物の量、又は相対レベルであってよい。マーカーが遺伝子である場合、マーカーの発現量は、その転写産物の量、その翻訳産物の量、又は相対レベルであってよい。マーカーが遺伝子である場合、マーカーの発現量は、好ましくは、その転写産物の量、又は相対レベルである。マーカーがタンパク質である場合、マーカーの発現量は、その翻訳産物の量、又は相対レベルであってよい。相対レベルは、内在性コントロールに対するそのマーカーの相対的な量を意味する。内在性コントロールは、例えば、βアクチン又はグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を用いることができる。相対レベルは、例えば、βアクチンに対するマーカーの相対的な量である。転写産物の量は、例えば定量ＰＣＲにより測定することができる。翻訳産物の量は、例えば、ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳにより測定することができる。蛍光免疫染色法により、又は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）若しくは磁気アフィニティーセルソーティング（ＭＡＣＳ）により測定することができる。ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳは、商業的に入手可能なＦＡＣＳ装置又はＭＡＣＳ装置を用いて実施することができる。

　本明細書において用語「ＬＨＸ１」は、ＬＩＭホメオボックス１の略語であり、ＬＨＸ１遺伝子にコードされるタンパク質を意味する。ＬＨＸ１を発現する細胞は、例えば抗ＬＨＸ１抗体を用いた免疫染色法により検出することができる。ＬＨＸ１陽性の後腎胞は、腎臓オルガノイドについて抗ＬＨＸ１抗体を用いた免疫染色法により検出することができる。

　本明細書において用語「ＪＡＧ１」は、ＪＡＧ１遺伝子にコードされるＪａｇｇｅｄ１タンパク質の略語であり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路にある４つの受容体と相互作用する５つの細胞表面タンパク質の１つを意味する。ＪＡＧ１を発現する細胞は、例えば抗ＪＡＧ１抗体を用いた免疫染色法により検出することができる。ＪＡＧ１陽性の後腎胞は、腎臓オルガノイドについて抗ＪＡＧ１抗体を用いた免疫染色法により検出することができる。

　本明細書において用語「ＣＤＨ６」は、ＣＤＨ６遺伝子にコードされるカドヘリン６タンパク質を意味する。ＣＤＨ６を発現する細胞は、例えば、抗ＣＤＨ６抗体を用いた免疫染色法により検出することができる。ＣＤＨ６陽性の後腎胞は、腎臓オルガノイドについて抗ＣＤＨ６抗体を用いた免疫染色法により検出することができる。

　本明細書において用語「ＥｐＣＡＭ」は、上皮細胞接着分子の略語であり、膜貫通糖タンパク質を意味する。ＥｐＣＡＭは、上皮細胞マーカーとして用いることができる。ＥｐＣＡＭを発現する細胞は、例えば抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた免疫染色法により検出することができる。

　本明細書において「近位尿細管マーカー」は、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、及びＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも１種である。本明細書において、近位尿細管マーカーは、近位尿細管の成熟化マーカーとも称する。近位尿細管マーカーは、例えば、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、及びＡＢＣＢ１からなる群より選択される少なくとも１種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、又は１２種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、好ましくは８種、好ましくは９種、好ましくは１０種、好ましくは１１種、又はより好ましくは１２種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも４種（例えば、４種、５種、６種、７種、好ましくは８種、好ましくは９種、好ましくは１０種、好ましくは１１種、又はより好ましくは１２種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも６種（例えば、６種、７種、好ましくは８種、好ましくは９種、好ましくは１０種、好ましくは１１種、又はより好ましくは１２種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも７種（例えば、７種、好ましくは８種、好ましくは９種、好ましくは１０種、好ましくは１１種、又はより好ましくは１２種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される８種、９種、１０種、１１種又は１２種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される１０種、１１種又は１２種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される１１種又は１２種である。

　近位尿細管マーカーは、例えば、ＵＧＴ２Ａ３、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、及びＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、又は１０種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、５種、好ましくは６種、好ましくは７種、好ましくは８種、好ましくは９種、又はより好ましくは１０種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも４種（例えば、４種、５種、好ましくは６種、好ましくは７種、好ましくは８種、好ましくは９種、又はより好ましくは１０種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも６種、７種、８種、９種又は１０種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも８種、９種又は１０種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも９種又は１０種である。

　近位尿細管マーカーは、例えば、ＵＧＴ２Ａ３、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、及びＡＢＣＢ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、又は７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、５種、好ましくは６種、又はより好ましくは７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも４種（例えば、４種、５種、好ましくは６種、又はより好ましくは７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも６種又は７種である。

　近位尿細管マーカーは、例えば、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、及びＡＰＯＡ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、又は７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、好ましくは５種、好ましくは６種、又はより好ましくは７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも４種（例えば、４種、好ましくは５種、好ましくは６種、又はより好ましくは７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも５種、６種、又は７種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも６種又は７種である。

　近位尿細管マーカーは、例えば、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、及びＡＢＣＢ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、又は６種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、好ましくは５種、又はより好ましくは６種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも４種（例えば、４種、好ましくは５種、又はより好ましくは６種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも５種又は６種である。

　近位尿細管マーカーは、例えば、ＵＧＴ２Ａ３、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＣＥ２、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、及びＡＰＯＡ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、又は７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、好ましくは５種、好ましくは６種、又はより好ましくは７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも４種（例えば、４種、好ましくは５種、好ましくは６種、又はより好ましくは７種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも５種、６種、又は７種である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも６種又は７種である。

　近位尿細管マーカーは、例えば、ＵＧＴ２Ａ３、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＣＥ２、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、及びＡＢＣＢ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、又は６種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、好ましくは５種、又はより好ましくは６種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも４種（例えば、４種、好ましくは５種、又はより好ましくは６種）である。近位尿細管マーカーは、例えば、前記近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも５種又は６種である。

　用語「ＬＴＬ」は、Ｌｏｔｕｓ　Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ　Ｌｅｃｔｉｎの略語であり、オリゴ糖を含むα結合型Ｌ－フコースに対する特異性を示し得る糖タンパク質を意味する。用語「ＵＧＴ２Ａ３」は、ＵＤＰ－Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　２Ａ３を示す。用語「ＡＺＧＰ１」は、Ｚｉｎｃ－ａｌｐｈａ２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎの略語である。ＡＺＧＰ１遺伝子は亜鉛－α２－糖タンパク質（ＺＡＧ）をコードする。用語「ＳＬＣ３９Ａ４」は、Ｓｏｌｕｔｅ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｆａｍｉｌｙ３９　Ｍｅｍｂｅｒ４を示し、ＳＬＣ３９Ａ４遺伝子はＺｉｎｃ／Ｉｒｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ－ｌｉｋｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ４（ＺＩＰ４）をコードする。用語「ＢＨＭＴ」はＢｅｔａｉｎｅ－ＨｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅＳ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの略語である。ＢＨＭＴ遺伝子はベタインをメチル供与体として利用し、ホモシステイン（Ｈｃｙ）の再メチル化を触媒する酵素をコードする。

　用語「ＡＣＥ２」は、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ　２の略語である。ＡＣＥ２遺伝子はアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のアイソフォームをコードする。用語「ＡＱＰ６」はＡｑｕａｐｏｒｉｎ６の略語である。ＡＱＰ６遺伝子は細胞における水チャネルとして機能するアクアポリンタンパク質をコードする。用語「ＣＵＢＮ」はＣｕｂｉｌｉｎの略語である。ＣＵＢＮ遺伝子はビタミンＢ１２内因子複合体（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｆａｃｔｏｒ－ｖｉｔａｍｉｎ　Ｂ１２　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）として機能するＣｕｂｉｌｉｎをコードする。用語「ＬＲＰ２」は、ＬＤＬ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ２の略語であり、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と構造的類似性を有する受容体ファミリーに属するタンパク質である。ＬＲＰ２遺伝子はＬＤＬ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ２をコードする。用語「ＡＢＣＢ１」は、ＡＢＣ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｓｕｂｆａｍｉｌｙ　Ｂ　ｍｅｍｂｅｒ　１の略語である。ＡＢＣＢ１遺伝子は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターのスーパーファミリーのメンバーであるＰ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　１（ＡＢＣＢ１又はＭＤＲ１とも称される）をコードする。

　用語「ＳＥＲＰＩＮＡ１」は、ｓｅｒｐｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　Ａ　ｍｅｍｂｅｒ　１の略語である。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は、セリンプロテアーゼ阻害剤であるセルピンスーパーファミリー（Serpin superfamily）のプロトタイプメンバーであるＳＥＲＰＩＮＡ１をコードする。用語「ＡＰＯＡ１」は、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ－Ｉの略語であり、血漿中のＨＤＬ粒子の主要タンパク質成分を意味する。ＡＰＯＡ１遺伝子は、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ－Ｉをコードする。用語「ＳＰＡＲＣＬ１」は、ＳＰＡＲＣ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１の略語であり、Ｈｅｖｉｎとしても知られる、マトリックスタンパク質である。ＳＰＡＲＣＬ１遺伝子は、マトリックスタンパク質ＳＰＡＲＣＬ１をコードする。

　本明細書において「ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカー」は、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＰＴ１Ａ、ＦＡＢＰ１、ＣＹＰ２７Ａ１、及びＡＣＯＸ１からなる群より選択される少なくとも１種である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される１種、２種、３種、４種、５種又は６種である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、好ましくは５種又はより好ましくは６種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも３種（例えば、３種、４種、好ましくは５種又はより好ましくは６種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも４種、好ましくは５種又はより好ましくは６種である。

　ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＰＴ１Ａ、ＦＡＢＰ１、及びＣＹＰ２７Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、好ましくは４種、又はより好ましくは５種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、好ましくは４種、又はより好ましくは５種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される４種又は５種である。

　ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、ＡＰＯＡ１、ＣＰＴ１Ａ、ＦＡＢＰ１、ＡＣＯＸ１、及びＣＹＰ２７Ａ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、好ましくは４種、又はより好ましくは５種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、３種、好ましくは４種、又はより好ましくは５種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される４種又は５種である。

　ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、ＡＰＯＡ１、ＣＰＴ１Ａ、ＦＡＢＰ１、及びＡＣＯＸ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、２種、好ましくは３種、又はより好ましくは４種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも２種（例えば、２種、好ましくは３種、又はより好ましくは４種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される３種又は４種である。

　ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、ＡＰＯＡ１、ＣＰＴ１Ａ、及びＦＡＢＰ１からなる群より選択される少なくとも１種（例えば、１種、好ましくは２種、又はより好ましくは３種）である。ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、例えば、前記ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される２種又は３種である。

　用語「ＡＰＯＡ１」は、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ－Ｉの略語であり、血漿中のＨＤＬ粒子の主要タンパク質成分を意味する。ＡＰＯＡ１遺伝子は、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ－Ｉをコードする。用語「ＡＰＯＣ３」は、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ－ＩＩＩの略語であり、７９アミノ酸で構成される比較的小さいタンパク質を意味する。ＡＰＯＣ３遺伝子は、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ－ＩＩＩをコードする。用語「ＣＰＴ１Ａ」は、Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ＩＡの略語であり、ミトコンドリア外膜に関与する酵素である。ＣＰＴ１Ａ遺伝子は、Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ＩＡをコードする。

　用語「ＦＡＢＰ１」は、Ｆａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１の略語である。ＦＡＢＰ１遺伝子は、肝臓型脂肪酸結合タンパク質としても知られているＦａｔｔｙ　Ａｃｉｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　１をコードする。用語「ＣＹＰ２７Ａ１」は、ｓｔｅｒｏｌ　２７－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅとしても知られるシトクロームＰ４５０オキシダーゼをコードする遺伝子を意味する。用語「ＡＣＯＸ１」は、Ａｃｙｌ－ＣｏＡ　Ｏｘｉｄａｓｅ　１の略語である。ＡＣＯＸ１遺伝子は、ペルオキシソーム・アシル補酵素Ａオキシダーゼ１をコードする。

　成熟した近位尿細管細胞は、例えば、本開示に係るＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現する。成熟した近位尿細管細胞は、例えば、本開示に係る近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現する。成熟した近位尿細管細胞は、例えば、本開示に係るＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現し、且つ本開示に係る近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現する。成熟した近位尿細管細胞は、例えば、本開示に係るＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも３種（例えば、３種、４種、好ましくは５種又はより好ましくは６種）のマーカーを発現し、且つ本開示に係る近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも５種（例えば、５種、６種、７種、好ましくは８種又はより好ましくは９種）のマーカーを発現する。

　成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、本開示に係る近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現する。１つの例において、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、更に本開示に係るＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現する。成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、例えば、本開示に係る近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現し、且つ本開示に係る近位尿細管マーカーの群より選択される少なくとも１種を発現する。近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドでのＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現は、前記マーカー遺伝子の転写産物、又は前記マーカー遺伝子の翻訳産物に基づいて検出することができる。また、近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドでの近位尿細管マーカーの発現は、前記マーカー遺伝子の転写産物、又は前記マーカー遺伝子の翻訳産物に基づいて検出することができる。マーカー遺伝子の転写産物は、例えば、定量ＰＣＲにより測定することができる。マーカー遺伝子の翻訳産物は、例えば、蛍光免疫染色法により、又はＦＡＣＳ若しくはＭＡＣＳにより測定することができる。

　成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドでのＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、その発現量（例えばマーカー遺伝子の転写産物の量）が、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストのいずれか一方又は両方を実質的に含まない培地を用いて培養した腎臓オルガノイド（対照オルガノイド）での対応するＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量と比較して有意に大きい場合に、発現していると評価してよい。好ましくは、ＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量は、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない培地を用いて培養した対照オルガノイドでの対応するＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量と比較して有意に大きい場合に、発現していると評価される。また、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドでの近位尿細管マーカーは、その発現量（例えばマーカー遺伝子の転写産物の量）が、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストのいずれか一方又は両方を実質的に含まない培地を用いて培養した腎臓オルガノイド（対照オルガノイド）での対応する近位尿細管マーカーの発現量と比較して有意に大きい場合に、発現していると評価してよい。好ましくは、近位尿細管マーカーの発現量は、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない培地を用いて培養した対照オルガノイドでの対応する近位尿細管マーカーの発現量と比較して有意に大きい場合に、発現していると評価される。

　ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストのいずれか一方又は両方を実質的に含まない培地は、例えば、目的とする成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを誘導するために用いたＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地（例えば、後述する誘導培地Ｃ）と、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストのいずれか一方又は両方を実質的に含まないことを除いて組成及び／又は用量が同一の培地であってよい。この文脈において「実質的に含まない」は、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも完全に含まないことを排除しない。１つの例において、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない培地は、例えば、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＰＰＡＲアゴニスト、及び１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満のＲＸＲアゴニストを含んでよい。１つの例において、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない培地は、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも完全に含まない。

　他の態様において、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドでのＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーは、その発現量（例えばマーカー遺伝子の転写産物の量）が、初期腎オルガノイド（対照オルガノイド）での対応するＰＰＡＲＡ下流遺伝子マーカーの発現量と比較して有意に大きい場合に、発現していると評価してよい。また、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドでの近位尿細管マーカーは、その発現量（例えばマーカー遺伝子の転写産物の量）が、初期腎オルガノイド（対照オルガノイド）での対応する近位尿細管マーカーの発現量と比較して有意に大きい場合に、発現していると評価してよい。

［成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドの製造方法］
　本開示の１つの態様は、初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培養培地Ｃを用いて培養することを含む、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを製造する方法を提供する。

　本開示の１つの実施形態は、中間中胚葉細胞を、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ２）を用いて培養して、中間中胚葉スフェロイドを形成させること、及び前記中間中胚葉スフェロイドを、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａ（誘導培地ａ２）を用いて培養し、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ３）を用いて培養することで、初期腎オルガノイドを誘導すること（工程Ｂ）；及び初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む誘導培地Ｃを用いて培養すること（工程Ｃ）を含む、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを製造する方法を提供する。

　本開示の１つの実施形態は、多能性幹細胞を培養して、中間中胚葉細胞を誘導すること（工程Ａ）；前記中間中胚葉細胞を、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ２）を用いて培養して、中間中胚葉スフェロイドを形成させること、及び前記中間中胚葉スフェロイドを、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａ（誘導培地ａ２）を用いて培養し、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ３）を用いて培養することで、初期腎オルガノイドを誘導すること（工程Ｂ）；及び初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む誘導培地Ｃを用いて培養すること（工程Ｃ）を含む、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを製造する方法を提供する。

工程Ａ：　中間中胚葉細胞の分化誘導
　工程Ａは、多能性幹細胞を培養して、中間中胚葉細胞を誘導することを含む。より具体的には、工程Ａは、多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａ（誘導培地ａ１）を用いて培養し、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ１）を用いて培養して、中間中胚葉細胞を誘導することを含む。

　誘導培地ａ１を用いた多能性幹細胞の培養は、公知の細胞培養条件下で実施することができる。公知の細胞培養条件は、３７℃で５％ＣＯ_２下にて維持することであってよい。培養する温度は、３７℃に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知の温度を適宜用いることができる。ＣＯ_２濃度は、５％に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知のＣＯ_２濃度を適宜用いることができる。誘導培地Ａを用いた多能性幹細胞の培養は、２日～８日、３日～７日、４日～６日又は５日間実施することができる。

　工程Ａでは、誘導培地ａ１を用いた多能性幹細胞の培養後に、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地ｂ１を用いて培養することを含む。誘導培地ｂ１を用いた培養は、例えば、誘導培地ａ１を用いた培養により、多能性幹細胞で構成されるコロニーが、培養面に対して水平方向と、垂直方向とに広がり、丸みを帯びた形状となった後に、行うことができる。丸みを帯びた形状の細胞コロニーを、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂを用いて培養することで、中間中胚葉細胞が誘導され得る。

　誘導培地ｂ１を用いた前記丸みを帯びた形状の細胞コロニー（誘導培地ａ１を用いた多能性幹細胞の培養物）の培養は、公知の細胞培養条件下で実施することができる。公知の細胞培養条件は、３７℃で５％ＣＯ_２下にて維持することであってよい。培養する温度は、３７℃に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知の温度を適宜用いることができる。ＣＯ_２濃度は、５％に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知のＣＯ_２濃度を適宜用いることができる。誘導培地Ｂを用いた前記丸みを帯びた形状の細胞コロニーの培養は、２日～６日、２日～５日、２日～４日又は３日間実施することができる。この培養により、細胞コロニーは、丸みを帯びた形状からシート状に変化し得る。

　本明細書において用語「多能性幹細胞」は、試験管内で培養することができ、三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の組織に分化する能力、すなわち多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞は、例えば、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、又は組織内幹細胞等から樹立することができる。多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞から誘導された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、又は胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）である。多能性幹細胞は、好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。

　本明細書において用語「ＥＳ細胞」は、自己複製能を有し、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞を意味する。ＥＳ細胞は、例えば、ヒトＥＳ細胞である。

　本明細書において用語「ｉＰＳ細胞」は、体細胞から誘導された多能性幹細胞であり、体細胞を初期化することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞を意味する。ｉＰＳ細胞は、例えば、繊維芽細胞等の分化した細胞を、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃなどの遺伝子の発現により初期化して樹立することができる。ｉＰＳ細胞は、例えば、ヒトの繊維芽細胞等の分化した細胞を初期化することによって樹立されたヒトｉＰＳ細胞である。

　本明細書において「誘導培地Ａ」は、基本培地と、ＧＳＫ３β阻害剤を含有する添加剤とを含む。工程Ａで用いられる誘導培地Ａを、特に誘導培地ａ１とも称する。工程Ｂ（特に工程ｂ２）で用いられる誘導培地Ａを、特に誘導培地ａ２とも称する。本明細書において誘導培地Ａに対する説明は、特に異なると言及がない限り、誘導培地ａ１及び誘導培地ａ２にも適用される。誘導培地Ａは、例えば、基本培地（液体）に、前記添加剤（固体又は液体）を添加することで調製することができる。誘導培地Ａに添加される前記添加剤の濃度は、培養に用いられる細胞を与えた動物種を考慮して、当業者により適宜設定される。「基本培地」は、公知のプロトコルに従って調製することができる細胞培養用培地であってよく、又は商業的に入手できる細胞培養用培地であってよい。基本培地は、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、公知の幹細胞用の培地、又は公知の幹細胞を分化させるための培地であってよい。基本培地は、好ましくは幹細胞を分化させるための培地であり、例えば、ＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２　ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）であってよい。幹細胞を分化させるための培地は、例えば、Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．５，ｐｐ．７６８－７７６，２００８に従って調製することができる。誘導培地Ａは、無タンパク質培地（例えば、ＰＦＨＭ－ＩＩ）、抗生物質（例えばペニシリン／ストレプトマイシン、ゲンタマイシン）、又は抗生物質－抗真菌剤混合液（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）、若しくはこれらの組合せを更に含んでよい。

　本明細書において用語「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ経路を含む様々なシグナル伝達経路に関係するセリン・スレオニンタンパク質キナーゼ３βの作用を阻害する化合物を意味する。ＧＳＫ３β阻害剤は、例えば、ＣＨＩＲ－９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ－９８０１４、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｋ２５２Ａ、ＷＮＴ（好ましくはＷＮＴ３Ａ）又はＴＷＳ１１９、若しくはこれらの組合せであってよい。ＧＳＫ３β阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ－９９０２１又はＷＮＴ（好ましくはＷＮＴ３Ａ）である。誘導培地ａ１は、１～５０μＭ、２～２５μＭ、５～１５μＭ、５～８μＭ、又は８μＭのＣＨＩＲ－９９０２１が示すＧＳＫ３β阻害作用と同程度の作用を示す濃度でＣＨＩＲ－９９０２１以外のＧＳＫ３β阻害剤を含んでよい。誘導培地ａ２は、１～５０μＭ、２～２５μＭ、５～１５μＭ、５～１０μＭ、又は１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１が示すＧＳＫ３β阻害作用と同程度の作用を示す濃度でＣＨＩＲ－９９０２１以外のＧＳＫ３β阻害剤を含んでよい。

　「ＧＳＫ３β阻害作用」は、例えば、所定量のＧＳＫ３β阻害剤の存在下で、βカテニンの核移行による転写活性に基づいて測定することができる。βカテニンの核移行による転写活性は、公知の方法（例えばルシフェラーゼ活性測定）に従って測定することができる。βカテニンの核移行による転写活性は、例えば商業的に入手なキット（例えばＬＥＡＤＩＮＧ　ＬＩＧＨＴ（登録商標）　Ｗｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｔａｒｔｅｒ　ｋｉｔ）を用いて測定することができる。本明細書において用語「同程度の作用」は、対照となる作用と比べて、±３０％以内、±２０％以内、又は±１０％以内の作用を意味する。１つの実施形態において、同程度の作用は、対照となる作用と比べて±３０％以内の作用である。

　誘導培地Ａは、ＧＳＫ３β阻害剤（好ましくはＣＨＩＲ－９９０２１）を１～５０μＭ、２～２５μＭ、又は５～１５μＭ含有してよい。誘導培地Ａは、１～５０μＭ、２～２５μＭ、又は５～１５μＭのＣＨＩＲ－９９０２１が示すＧＳＫ３β阻害作用と同程度の作用を示す濃度でＧＳＫ３β阻害剤を含んでよい。誘導培地Ａは、ＧＳＫ３β阻害剤として１～２０００ｎｇ／ｍｌ、２～１０００ｎｇ／ｍｌ、又は５～４００ｎｇ／ｍｌのＷＮＴ（好ましくはＷＮＴ３Ａ）を含有してよい。誘導培地ＡがＧＳＫ３β阻害剤としてＷＮＴ（好ましくはＷＮＴ３Ａ）を含む場合、誘導培地ａ１は、１～５０μＭ、２～２５μＭ、５～１５μＭ、又は８μＭのＣＨＩＲ－９９０２１が示すＧＳＫ３β阻害作用と同程度の作用を示す濃度でＷＮＴ（好ましくはＷＮＴ３Ａ）を含有してよい。誘導培地ａ２は、１～５０μＭ、２～２５μＭ、５～１５μＭ、又は１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１が示すＧＳＫ３β阻害作用と同程度の作用を示す濃度でＷＮＴ（好ましくはＷＮＴ３Ａ）を含有してよい。

　本明細書において「誘導培地Ｂ」は、基本培地と、繊維芽細胞増殖因子を含有し、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない添加剤とを含む。工程Ａで用いられる誘導培地Ｂを、特に誘導培地ｂ１とも称する。工程ｂ１で用いられる誘導培地Ｂを、特に誘導培地ｂ２とも称する。工程ｂ３で用いられる誘導培地Ｂを、特に誘導培地ｂ３とも称する。本明細書において誘導培地Ｂに対する説明は、特に異なると言及がない限り、誘導培地ｂ１、誘導培地ｂ２及び誘導培地ｂ３にも適用される。１つの例において、誘導培地Ｂに係る添加剤は、更にＰＰＡＲアゴニストを実質的に含まない。誘導培地Ｂに係る添加剤は、例えば繊維芽細胞増殖因子を含有し、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない。誘導培地Ｂは、例えば、基本培地（液体）に、前記添加剤（固体又は液体）を添加することで調製することができる。誘導培地Ｂに関する基本培地は、誘導培地Ａに関する基本培地についての説明が適宜適用される。誘導培地Ｂに添加される前記添加剤の濃度は、培養に用いられる細胞を与えた動物種を考慮して、当業者により適宜設定される。誘導培地Ｂは、ヘパリン、無タンパク質培地（例えば、ＰＦＨＭ－ＩＩ）、抗生物質（例えばペニシリン／ストレプトマイシン、ゲンタマイシン）、又は抗生物質－抗真菌剤混合液（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）、若しくはこれらの組合せを更に含んでよい。中間中胚葉細胞からスフェロイドを形成させるために用いられる誘導培地ｂ２は、更にＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ－２７６３２）を含んでよい。

　誘導培地Ｂの文脈において用語「ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない」は、誘導培地ＢからＲＸＲアゴニストを完全に含まないことを除いて、組成及び／又は用量が同一の培地を用いた工程Ｂで形成された初期腎オルガノイドと同程度の成熟度を有するオルガノイドが分化誘導されるような量で、ＲＸＲアゴニストを含むことを意味する。「初期腎オルガノイドと同程度の成熟度を有するオルガノイド」は、ＬＨＸ１陽性の１つ以上の後腎胞を有し、且つフォルフ管細胞を前記オルガノイド由来の総細胞に対して５％未満（好ましくは４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、又は０．５％未満）含む。後腎胞は、好ましくは、ＬＨＸ１陽性であり、及びＪＡＧ１陽性又はＣＤＨ６陽性である。後腎胞は、好ましくは、ＬＨＸ１陽性であり、ＪＡＧ１陽性であり、及びＣＤＨ６陽性である。「フォルフ管細胞」は、ＣＤＨ１陽性であり、ＰＡＸ２陽性であり、且つＧＡＴＡ３陽性の細胞である。オルガノイド由来の総細胞に対するフォルフ管細胞の割合は、例えば、シングルセルプロテオーム解析（例えば、シングルセルＲＮＡ配列決定）によって測定することができる。ＲＸＲアゴニストを実質的に含まないは、ＲＸＲアゴニストを完全に含まないことを排除しない。１つの例において、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂは、１０ｐＭ未満、５ｐＭ未満、１ｐＭ未満、０．５ｐＭ未満又は０．１ｐＭ未満のＲＸＲアゴニスト（例えば９ｃｉｓレチノイン酸）を含む。ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂは、好ましくは、ＲＸＲアゴニスト（例えば９ｃｉｓレチノイン酸）を完全に含まない。

　他の例において、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂは、ＰＰＡＲアゴニスト（例えば、ＰＰＡＲＡアゴニスト、ＰＰＡＲＧアゴニスト、ＰＰＡＲＤアゴニスト、ＰＰＡＲＡ／Ｇアゴニスト、ＰＰＡＲＡ／Ｄアゴニスト、ＰＰＡＲＧ／Ｄアゴニスト及びＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄアゴニストからなる群より選択される少なくとも１種を含む）を実質的に含まない。誘導培地Ｂの文脈において用語「ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない」は、誘導培地ＢからＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも完全に含まないことを除いて、組成及び／又は用量が同一の培地を用いた工程Ｂで形成された初期腎オルガノイドと同程度の成熟度を有するオルガノイドが分化誘導されるような量で、ＲＸＲアゴニスト及び／又はＰＰＡＲアゴニストを含むことを意味する。１つの例において、ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない誘導培地Ｂは、１０ｐＭ未満、好ましくは５ｐＭ未満、１ｐＭ未満、０．５ｐＭ未満又は０．１ｐＭ未満のＲＸＲアゴニスト及び／又はＰＰＡＲアゴニストを含む。ＲＸＲアゴニストもＰＰＡＲアゴニストも実質的に含まない誘導培地Ｂは、好ましくは、ＲＸＲアゴニスト（例えば９ｃｉｓレチノイン酸）及びＰＰＡＲアゴニスト（例えばＰＰＡＲＡアゴニスト）を完全に含まない。

　本明細書において用語「ＣＤＨ１」は、カドヘリン１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。ＣＤＨ１陽性細胞は、ＣＤＨ１転写産物が産生されている細胞である。ＣＤＨ１陽性細胞は、逆転写酵素を用いた定量ＰＣＲ法又はシングルセルプロテオーム解析により検出することができる。

　本明細書において用語「ＰＡＸ２」は、ペアボックス遺伝子２（ｐａｉｒｅｄ　ｂｏｘ　ｇｅｎｅ　２）の略語であり、ホメオボックス転写因子をコードする遺伝子を意味する。ＰＡＸ陽性細胞は、ＰＡＸ２転写産物が産生されている細胞である。ＰＡＸ２陽性細胞は、逆転写酵素を用いた定量ＰＣＲ又はシングルセルプロテオーム解析により検出することができる。

　本明細書において用語「ＧＡＴＡ３」は、ＧＡＴＡ３転写因子をコードする遺伝子を意味する。ＧＡＴＡ３陽性細胞は、ＧＡＴＡ３転写産物が産生されている細胞である。ＧＡＴＡ３陽性細胞は、逆転写酵素を用いた定量ＰＣＲ又はシングルセルプロテオーム解析により検出することができる。

　ＣＤＨ１陽性であり、ＰＡＸ２陽性であり、及びＧＡＴＡ３陽性である細胞は、ＣＤＨ１転写産物、ＰＡＸ２転写産物、及びＧＡＴＡ３転写産物が産生されている細胞である。前記細胞は、シングルセルプロテオーム解析により検出することができる。

　本明細書において用語「繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）」は、繊維芽細胞又は内皮細胞の増殖を促進する分子量１６，０００～２０，０００のタンパク質を意味する。ＦＧＦは、例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、又はＦＧＦ２３、若しくはこれらの組合せであってよい。ＦＧＦは、例えば、ＦＧＦ９単独又はＦＧＦ９と他のＦＧＦ（例えばＦＧＦ４）との組合せであってよい。ＦＧＦは、好ましくはＦＧＦ９単独である。誘導培地Ｂは、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ９）を２０～１０００ｎｇ／ｍＬ、６０～５００ｎｇ／ｍＬ、又は１００～３００ｎｇ／ｍＬ含有してよい。誘導培地Ｂは、２０～１０００ｎｇ／ｍＬ、６０～５００ｎｇ／ｍＬ、又は１００～３００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ９が示す繊維芽細胞増殖作用と同程度の作用を示す濃度でＦＧＦ９以外のＦＧＦを含んでよい。

　本明細書において用語「中間中胚葉」は、多能性幹細胞を誘導培地Ａ（誘導培地ａ１）で培養して形成された丸みを帯びた形状の細胞コロニーを、誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ１）を用いて培養することによって形成されるシート状の細胞コロニーを意味する。本明細書において用語「中間中胚葉細胞」は、多能性幹細胞を誘導培地Ａ（誘導培地ａ１）で培養し、次いで、誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ１）で培養することにより製造することができる。中間中胚葉細胞は、例えば、多能性幹細胞を、誘導培地Ａ（誘導培地ａ１）で２日～８日、３日～７日、４日～６日又は５日間培養し、次いで、誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ１）で２日～６日、２日～５日、２日～４日又は３日間培養することで製造することができる。

　工程Ａは、例えば、以下の手順に従って実施することができる。ｉＭａｔｒｉｘ－５１１コーティング上でＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ）を用いて培養されたＨｕｍａｎ　ｉＰＳまたはＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離する。剥離した前記細胞を、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（１０μＭ　Ｙ－２７６３２）で懸濁し、前記細胞懸濁液に、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（ｎｉｐｐｉ）を最終濃度０．２５μｇ／ｃｍ^２となるように添加する。この細胞懸濁液を、１０、０００～１５、０００細胞／ｃｍ^２となるように１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、ＣＯ_２　５％下で１日間培養する。次に、播種した細胞を、誘導培地Ａ（誘導培地ａ１）であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）（８μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、以下基本培地への添加剤を括弧書きで示す）を用いて、３～５日間培養して、原始線条を誘導する。培地交換は４日目以降は毎日行う。培養期間を５日間とすることで、後方中間中胚葉細胞の割合を増やすことができ、それにより、多くの近位尿細管を形成させ得る。誘導培地Ａで培養した後の細胞を、誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ１）であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（２００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ９、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）を用いて、３～５日間培養し中間中胚葉細胞を誘導する。

工程Ｂ：　スフェロイド形成及び初期腎オルガノイドの形成
　工程Ｂは、工程Ａで形成された中間中胚葉細胞を、繊維芽細胞増殖因子誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ２）を用いて培養して、中間中胚葉スフェロイドを形成させること（工程ｂ１）、及び前記中間中胚葉スフェロイドを、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａ（誘導培地ａ２）を用いて培養し（工程ｂ２）、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ３）を用いて培養することで（工程ｂ３）、初期腎オルガノイドを誘導することを含む。

（工程ｂ１）
　工程ｂ１は、工程Ａで形成された中間中胚葉細胞を、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地ｂ２を用いて培養して、中間中胚葉スフェロイドを形成させることを含む。工程ｂ１は、工程Ａで形成された中間中胚葉細胞を、細胞剥離液を用いて中間中胚葉細胞を培養プレートから剥離することを更に含んでよい。細胞剥離液を用いた処理により、中間中胚葉細胞が分離され、細胞懸濁液が得られる。したがって、工程ｂ１は、工程Ａで形成された中間中胚葉細胞を分離して、細胞懸濁液を得ることを更に含んでよい。「細胞剥離液」は、細胞接着分子を分解する酵素を含む溶液を意味する。細胞剥離液は、例えば、トリプシン、好ましくは組換えトリプシン（例えば、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含む。細胞剥離液を用いた処理は、例えば、３７℃で３分～１０分、又は５分～１０分間インキュベートすることを含む。

　工程ｂ１は、前記細胞懸濁液を、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地ｂ２を用いて培養することを含む。この誘導培地ｂ２を用いた処理により、スフェロイドが形成され得る。誘導培地ｂ２は、効率的なスフェロイド形成の観点から、好ましくはＲＯＣＫ阻害剤を含む。工程ｂ１での培養は、公知の細胞培養条件下で実施することができる。公知の細胞培養条件は、３７℃で５％ＣＯ_２下にて維持することであってよい。培養する温度は、３７℃に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知の温度を適宜用いることができる。ＣＯ_２濃度は、５％に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知のＣＯ_２濃度を適宜用いることができる。ＲＯＣＫ阻害剤を含む誘導培地ｂ２を用いた工程ｂ１での培養は、０．５日～２日、０．５日、１日、１．５日間、好ましくは１日間実施することができる。誘導培地ｂ２がＲＯＣＫ阻害剤を実質的に含まない場合、工程ｂ１での培養では、追加の１日の培養を含んでよい。誘導培地Ｂ（特に、誘導培地ｂ２）の文脈において用語「実質的に含まない」は、ＲＯＣＫ阻害剤を、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満の濃度で含むことを意味する。「実質的に含まない」は、ＲＯＣＫ阻害剤を完全に含まないことを排除しない。工程ｂ１での培養により、中間中胚葉細胞が集まったスフェロイド（本明細書において「中間中胚葉スフェロイド」ともいう）が形成される。本明細書において用語「スフェロイド」は、試験管内で形成された３次元的な細胞集合体を意味する。

　本明細書において用語「ＲＯＣＫ阻害剤」は、Ｒｈｏキナーゼ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ：ＲＯＣＫ）を阻害する化合物を意味する。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えば、Ｎ－（４－ピリジニル）－４β－［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（Ｙ－２７６３２）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン（Ｈ－１１５２）、４β－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－（４－ピリジル）ベンゼン－１αカルボアミド（Ｗｆ－５３６）、Ｎ－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）－４β－［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１αカルボアミド（Ｙ－３０１４１）、Ｎ－（３－｛［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ｝フェニル）－４－｛［２－（４－モルホリニル）エチル］－オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、又はＮ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－６－メチル－２－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－ピリジン－５－カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）、若しくはこれらの組合せであってよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、例えば、Ｙ－２７６３２単独、又はＹ－２７６３２との他のＲＯＣＫ阻害剤との組合せであってよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくはＹ－２７６３２である。誘導培地Ｂ（特に誘導培地ｂ２）は、１～５０μＭ、２～２５μＭ、５～１５μＭ又は１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を含む。誘導培地Ｂ（特に誘導培地ｂ２）は、１～５０μＭ、２～２５μＭ、５～１５μＭ又は１０μＭのＹ－２７６３２が示すＲＯＣＫ阻害作用と同程度の作用を示す濃度でＹ－２７６３２以外のＲＯＣＫ阻害剤を含んでよい。

　ＲＯＣＫは、セリン・スレオニンタンパク質キナーゼである。ＲＯＣＫは、例えば、ミオシン軽鎖ホスファターゼ（ＭＬＣＰ）のミオシン結合サブユニット１（ＭＹＰＴ１）をリン酸化して、その酵素活性を抑制する。「ＲＯＣＫ阻害作用」は、例えば、そのリン酸化作用を阻害し得る化合物の存在下で、ＲＯＣＫによるＭＹＰＴ１のリン酸化量に基づいて測定することができる。１つの例において、ＲＯＣＫ阻害作用は、ＲＯＣＫによるＭＹＰＴ１のリン酸化量を測定し、そのリン酸化作用を阻害し得る化合物の存在下でＲＯＣＫによるＭＹＰＴ１のリン酸化量を測定し、及びそれらのリン酸化量を比較することで測定することができる。ＲＯＣＫ阻害作用は、商業的に入手可能なキット（例えば、９６ウェルＲＯＣＫ活性アッセイキット（ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ，ＩＮＣ．、カタログＮｏ．：ＳＴＡ－４１６）又はＲＯＣＫ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ　Ｋｉｔ（ＳＴＡ－４１６、ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＡＢＳ，ＩＮＣ．、カタログＮｏ．：ＳＴＡ－４１５））を用いて測定することができる。

　工程ｂ１で用いる誘導培地ｂ２は、工程Ａで用いる誘導培地ｂ１と組成及び／又は用量が同一であってもよく、異なっていてもよい。誘導培地ｂ２は、好ましくは、誘導培地ｂ１と組成及び／又は用量が同一である。誘導培地ｂ２は、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことを除いて、誘導培地ｂ１と組成及び／又は用量が同一である。

（工程ｂ２）
　工程ｂ２は、工程ｂ１で形成された中間中胚葉スフェロイドを、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａ（誘導培地ａ２）を用いて培養することを含む。工程ｂ２での培養は、例えば、気－液界面培養又は液体溶媒にて実施される。工程ｂ２での培養は、好ましくは気－液界面培養にて実施される。

　気－液界面培養は、例えば、細胞を収容でき、液透過性の膜を底面に有する培養ウェルインサートと、前記培養ウェルインサートを設置でき、培養液を充填できる培養ベースプレートとを備えた培養器具を用いることで実施できる。そのような培養器具は、例えば、商業的に入手可能であり、例えば、Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ　Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　ＰＥＴｍｅｍｂｒａｎｅ（ｃｏｒｎｉｎｇ）であってよい。工程ｂ２での培養は、公知の細胞培養条件下で実施することができる。公知の細胞培養条件は、３７℃で５％ＣＯ_２下にて維持することであってよい。培養する温度は、３７℃に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知の温度を適宜用いることができる。ＣＯ_２濃度は、５％に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知のＣＯ_２濃度を適宜用いることができる。前記培養は、１～２４時間、１～１２時間、１～８時間、１～５時間、２～４時間、又は３時間実施することができる。

　工程ｂ２で用いる誘導培地ａ２は、工程Ａで用いる誘導培地ａ１と組成及び／又は用量が同一であってもよく、異なっていてもよい。誘導培地ａ２は、好ましくは、誘導培地ａ１と組成及び／又は用量が同一である。誘導培地ａ２は、例えば、ＧＳＫ３βの濃度が高異なることを除いて、誘導培地ａ１と組成及び／又は用量が同一である。

（工程ｂ３）
　工程ｂ３は、工程ｂ２で培養した中間中胚葉スフェロイドを、繊維芽細胞増殖因子を含む誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ３）を用いて培養することを含む。工程ｂ３での培養により、初期腎オルガノイドが形成され得る。工程ｂ３での培養は、公知の細胞培養条件下で実施することができる。公知の細胞培養条件は、３７℃で５％ＣＯ_２下にて維持することであってよい。培養する温度は、３７℃に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知の温度を適宜用いることができる。ＣＯ_２濃度は、５％に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知のＣＯ_２濃度を適宜用いることができる。前記培養は、４日～１２日、４日～１０日、５日～８日、６日、７日又は８日間、好ましくは６日間実施することができる。工程ｂ３での培養は、例えば、培養したスフェロイドにおいて近位尿細管を含むネフロンの形成が確認されるまで実施される。工程ｂ３において、近位尿細管を含むネフロンの形成が確認されたスフェロイドは、初期腎オルガノイドとも称される。

　誘導培地ｂ３は、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ９）を２０～１０００ｎｇ／ｍＬ、６０～５００ｎｇ／ｍＬ、又は１００～３００ｎｇ／ｍＬ含有してよい。誘導培地ｂ３は、誘導培地ｂ１又はｂ２と組成及び／又は用量が同一であってもよく、異なっていてもよい。好ましくは、誘導培地ｂ３は、誘導培地ｂ１と同一の組成及び／又は用量を含む。誘導培地ｂ３は、例えば、誘導培地ｂ２と同一の組成及び／又は用量を含む。好ましくは、誘導培地ｂ３は、ＲＯＣＫ阻害剤を含むことを除いて、誘導培地ｂ２と同一の組成及び／又は用量を含む。

　工程Ｂは、例えば、以下の手順に従って実施することができる。工程Ａでの中間中胚葉細胞誘導後に、細胞をＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で剥離する。剥離した細胞を、誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ２）であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（２００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ９、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１０μＭ　Ｙ－２７６３２）中に懸濁し、得られた細胞懸濁液を、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）９６Ｍプレート（住友ベークライト）に１００、０００細胞／ｗｅｌｌになるように播種する。翌日、プレート内に形成されたスフェロイドを、Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ　Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　ＰＥＴｍｅｍｂｒａｎｅ　６ｗｅｌｌ　０．４μｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ（ｃｏｒｎｉｎｇ）のＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔの上に、３～６個のスフェロイド／ｗｅｌｌになるようにおく。スフェロイドを入れたＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔを、対応する培養プレートのウェルに設置した。前記培養プレートのウェルと、前記Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔのトランスウェル下面との間に、誘導培地Ａ（誘導培地ａ２）であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）を加えて、気－液界面にて前記スフェロイドを３７℃、ＣＯ_２　５％下で３時間培養する。３時間の培養後に、培地を、誘導培地Ｂ（誘導培地ｂ３）であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（２００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ９、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）に交換し、更に培養する。

工程Ｃ：　近位尿細管成熟化
　工程Ｃは、初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地（誘導培地Ｃとも称する）を用いて培養することを含む。工程Ｃで用いられる初期腎オルガノイドは、本開示に係る工程Ａ及びＢを実施して多能性幹細胞から製造された初期腎オルガノイド、又は公知の方法で製造された初期腎オルガノイドであってよい。公知の方法としては、Ｔａｋａｓａｔｏ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２０１４；１６：１１８－２６（引用により本明細書に組込まれる）に記載された方法、又はＴａｋａｓａｔｏ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１５；５２６：５６４－５６８．（引用により本明細書に組込まれる）に記載された方法が挙げられる。１つの実施形態において、工程Ｃで用いられる初期腎オルガノイドは、本開示に係る工程Ａ及びＢを実施して多能性幹細胞から製造された初期腎オルガノイドである。

　工程Ｃでの培養に用いられる初期腎オルガノイドは、初期の近位尿細管を含む。前記初期腎オルガノイドを工程Ｃで培養することで、成熟した近位尿細管細胞を含む腎臓オルガノイドが形成され得る。成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、本開示に係るマーカーの発現により特徴づけられる。

　工程Ｃでの培養は、公知の細胞培養条件下で実施することができる。公知の細胞培養条件は、３７℃で５％ＣＯ_２下にて維持することであってよい。培養する温度は、３７℃に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知の温度を適宜用いることができる。ＣＯ_２濃度は、５％に限定されるものではなく、細胞培養分野において公知のＣＯ_２濃度を適宜用いることができる。前記培養は、５日～２０日、６日～１８日、７日～１６日間、７日～１４日、７日～１２日、７日～１０日、７日～９日、又は７日～８日間実施される。

　工程Ｃで形成された成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、再生医療用組成物の有効成分として用いることができる。成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、被検物質による腎障害を評価する方法、又は被検物質に対する薬物応答性を評価する方法に用いることができる。

　本明細書において「誘導培地Ｃ」は、基本培地と、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含有する添加剤とを含む。誘導培地Ｃは、例えば、基本培地（液体）に、前記添加剤（固体又は液体）を添加することで調製することができる。誘導培地Ｃに関する基本培地は、誘導培地Ａに関する基本培地についての説明が適宜適用される。基本培地は多価不飽和脂肪酸、好ましくはリノール酸及び／又はリノレン酸を含んでいてもよい。基本培地が、本発明の効果に影響しない濃度で多価不飽和脂肪酸（例えばリノール酸及び／又はリノレン酸）を含む場合、添加剤であるＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストは、基本培地中の前記多価不飽和脂肪酸の濃度を考慮せず、本明細書に開示される濃度で添加されてよい。基本培地が、本発明の効果に影響し得る濃度で多価不飽和脂肪酸（例えばリノール酸及び／又はリノレン酸）を含む場合、添加剤であるＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストは、基本培地中の前記多価不飽和脂肪酸の濃度を考慮して、添加される。誘導培地Ｃに添加される前記添加剤の濃度は、培養に用いられる細胞を与えた動物種を考慮して、当業者により適宜設定される。誘導培地Ｃは、無タンパク質培地（例えば、ＰＦＨＭ－ＩＩ）、抗生物質（例えばペニシリン／ストレプトマイシン、ゲンタマイシン）、又は抗生物質－抗真菌剤混合液（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）、若しくはこれらの組合せを更に含んでよい。

　用語「ＲＸＲ」は、Ｒｅｔｉｎｏｉｄ　Ｘ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒの略語であり、核内受容体のステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーのメンバーであるタンパク質を意味する。ＲＸＲは、ＰＰＡＲ又はレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）などの核内受容体とヘテロダイマーを形成し、転写活性を調節する。

　本明細書において用語「ＲＸＲアゴニスト」は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と組み合わされたとき、遺伝子の転写制御活性を増大させる化合物または組成物を意味する。ＲＸＲアゴニストは、例えば、９－ｃｉｓレチノイン酸（アリトレチノイン、ＣＡＳ　Ｎｏ．：５３００－０３－８）、ＡＧＮ１９５２０４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２２０６１９－７３－８）、ＴＴＮＰＢ（アロチノイド酸、ＣＡＳ　Ｎｏ．：７１４４１－２８－６）、Ａｄａｐａｌｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６６８５－４０－９）、Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３５５９－４９－０）、Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１８２９２－４０－３）、Ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４４９７－５１－５）、ＣＨ５５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１０３６８－３３－７）、及びＡＭ５８０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０２１２１－６０－８）からなる群より選択される少なくとも１種である。ＲＸＲアゴニストは、例えば、９－ｃｉｓレチノイン酸、又はＡＧＮ１９５２０４である。ＲＸＲアゴニストは、例えば、９－ｃｉｓレチノイン酸である。

　誘導培地Ｃに添加するＲＸＲアゴニスト（例えば９－ｃｉｓレチノイン酸）の量としては、０．１～１０μＭ、０．５～５μＭ、０．５～３μＭ、０．５～２μＭ、又は１μＭを挙げることができる。誘導培地Ｃは、０．１～１０μＭ、０．５～５μＭ、０．５～３μＭ、０．５～２μＭ、又は１μＭの９－ｃｉｓレチノイン酸が示すＲＸＲアゴニスト作用と同程度の作用を示す濃度で９－ｃｉｓレチノイン酸以外のＲＸＲアゴニストを含んでよい。誘導培地Ｃに利用される基礎培地に含まれるＲＸＲアゴニスト作用を有する成分の量に応じて、適宜、添加するＲＸＲアゴニストの量が調整されうる。

　「ＲＸＲアゴニスト作用」は、例えば、ＲＸＲを作動し得る化合物の存在下で、ＲＸＲがＰＰＡＲとヘテロダイマーを形成し、前記ヘテロダイマーが結合するプロモーター領域の下流に存在するルシフェラーゼ遺伝子の発現量に基づいて測定することができる。１つの例において、ＲＸＲアゴニスト作用は、９－ｃｉｓレチノイン酸の存在下で形成されるＲＸＲとＰＰＡＲとのヘテロダイマーにより誘導されるルシフェラーゼの発現量を測定し、ＲＸＲを作動し得る化合物の存在下でのＲＸＲとＰＰＡＲとのヘテロダイマーにより誘導されるルシフェラーゼの発現量を測定し、それらを比較することで測定することができる。ＲＸＲアゴニスト作用は、商業的に入手可能なアッセイ（ＩＮＤＩＧＯ社、核内受容体ルシフェラーゼレポーターアッセイ）を用いて測定することができる。

　本明細書において「ＰＰＡＲ」は、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒの略語であり、核内レセプタースパーファミリーのメンバーに属する。ＰＰＡＲには、ＰＰＡＲアルファ（Ａ）、ＰＰＡＲガンマ（Ｇ）、ＰＰＡＲデルタ（Ｄ）の３つのサブタイプが存在する。

　本明細書において用語「ＰＰＡＲアゴニスト」は、ＰＰＡＲ、例えばＰＰＡＲＡ、ＰＰＡＲＧ、又はＰＰＡＲＤ若しくはこれらの組合せを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲアゴニストは、ＰＰＡＲＡアゴニスト、ＰＰＡＲＧアゴニスト、ＰＰＡＲＤアゴニスト、ＰＰＡＲＡ／Ｇアゴニスト、ＰＰＡＲＡ／Ｄアゴニスト、ＰＰＡＲＧ／Ｄアゴニスト、及びＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄアゴニストからなる群より選択される少なくとも１種である。ＰＰＡＲアゴニストは、好ましくは、ＰＰＡＲＡアゴニスト、ＰＰＡＲＧアゴニスト、又はＰＰＡＲＤアゴニストである。ＰＰＡＲアゴニストは、好ましくはＰＰＡＲＡアゴニスト、又はＰＰＡＲＧアゴニストである。ＰＰＡＲアゴニストは、より好ましくはＰＰＡＲＡアゴニストである。

　本発明において用語「ＰＰＡＲＡアゴニスト」は、例えば、ＰＰＡＲＡを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲＡアゴニストは、商業的に入手可能である（例えば、https://www.medchemexpress.com/Targets/PPAR.htmlを参照（引用により本明細書に組込まれる））。ＰＰＡＲＡアゴニストは、例えば、ＣＰ７７５１４６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７０２６８０－１７－９）、ピリニクス酸（ＷＹ１４６４３、ＣＡＳ　Ｎｏ．：５０８９２－２３－４）、ベザフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４１８５９－６７－０）、フェノフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４９５６２－２８－９）、ゲムフィブロジル（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５８１２－３０－０）、クロフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３７－０７－０）、シプロフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５２２１４－８４－３）、ペマフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ：８４８２５９－２７－８）、ビニフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６９０４７－３９－８）、クリノフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０２９９－０８－２）、クロフィブリン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８８２－０９－７）、ニコフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３１９８０－２９－７）、ピリフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５５２８５－４５－５）、プラフィブリド（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３３９４－０５－８）、ロニフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４２５９７－５７－９）、テオフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４９５６２－２８－９）、トコフィブレート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５０４６５－３９－９）、ＳＲ１０１７１、ＧＷ６４７１（ＣＡＳ　ＮＯ．：８８０６３５－０３－０）、Ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：４９５６２－２８－９）、Ｐｉｒｉｎｉｘｉｃ　ａｃｉｄ（ＣＡＳ　ＮＯ．：５０８９２－２３－４）、ＧＷ７６４７（ＣＡＳ　ＮＯ．：２６５１２９－７１－３）、Ｉｃａｒｉｉｎ（ＣＡＳ　ＮＯ．：４８９－３２－７）、Ｅｕｐａｔｉｌｉｎ（ＣＡＳ　ＮＯ．：２２３６８－２１－４）、Ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ（ＣＡＳ　ＮＯ．：２５８１２－３０－０）、Ｐａｌｍｉｔｅｌａｉｄｉｃ　Ａｃｉｄ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１００３０－７３－６）、ＮＸＴ６２９（ＣＡＳ　ＮＯ．：１４５４９２５－５９－７）、Ｓａｒｏｇｌｉｔａｚａｒ　Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１６３９７９２－２０－３）、Ｓａｒｏｇｌｉｔａｚａｒ（ＣＡＳ　ＮＯ．：４９５３９９－０９－２）、Ｏｌｅｏｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１１１－５８－０）、ＢＭＳ－６８７４５３（ＣＡＳ　ＮＯ．：１０００９９８－５９－３）、Ｇｙｐｅｎｏｓｉｄｅ　ＸＬＩＸ（ＣＡＳ　ＮＯ．：９４９８７－０８－３）、ＣＵＤＡ（ＣＡＳ　ＮＯ．：４７９４１３－６８－８）、Ｃｉｐｒｏｆｉｂｒａｔｅ　ｉｍｐｕｒｉｔｙ　Ａ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１４７４０５８－８９－３）、ＣＰ－８６８３８８　ｆｒｅｅ　ｂａｓｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：７０２６８１－６７－２）、ＡＶＥ－８１３４（ＣＡＳ　ＮＯ．：３０４０２５－０９－０）、リノール酸、リノレン酸、及びＰＰＡＲα－ＭＯ－１（ＣＡＳ　ＮＯ．：８１０６７７－３６－２）からなる群より選択される少なくとも１種である。ＰＰＡＲＡアゴニストは、好ましくは、ＣＰ７７５１４６、ピリニクス酸（ＷＹ１４６４３）、ベザフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、クロフィブレート、シプロフィブレート、リノール酸、リノレン酸、若しくはこれらの組合せである。ＰＰＡＲＡアゴニストは、より好ましくは、ＣＰ７７５１４６またはピリニクス酸（ＷＹ１４６４３）である。ＰＰＡＲＡアゴニストは、より好ましくは、ＣＰ７７５１４６である。

　本明細書において用語「ＰＰＡＲＧアゴニスト」は、ＰＰＡＲＧを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲＧアゴニストは、商業的に入手可能である（例えば、https://www.medchemexpress.com/Targets/PPAR.htmlを参照（引用により本明細書に組込まれる））。ＰＰＡＲＧアゴニストは、例えば、ロシグリタゾン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２２３２０－７３－４）、トログリタゾン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９７３２２－８７－７）、ピオグリタゾン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１１０２５－４６－８）（重水素化されていてもよい）、エファツタゾン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２２３１３２－３７－４）、ＡＴｘ０８－００１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：ＣＡＳ　ＮＯ．：１９３０１２－３５－０）、ＯＭＳ－４０５、ＣＨＳ－１３１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３１５２２４－２６－１）、ＴＨＲ－０９２１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０６９３２－８１－４）、ＳＥＲ－１５０－ＤＮ、ＫＤＴ－５０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３７４２５９－８４－３）、ＧＥＤ－０５０７－３４－Ｌｅｖｏ、ＣＬＣ－３００１、ＡＬＬ－４、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１２２３２０－７３－４）、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：３０２５４３－６２－０）、Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：９７３２２－８７－７）、Ｔ００７０９０７（ＣＡＳ　ＮＯ．：３１３５１６－６６－４）、５－Ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　Ａｃｉｄ（ＣＡＳ　ＮＯ．：８９－５７－６）、ＧＷ１９２９（ＣＡＳ　ＮＯ．：１９６８０８－２４－９）、Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ　ｍａｌｅａｔｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１５５１４１－２９－０）、Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ（ＣＡＳ　ＮＯ．：４７２－６１－７）、Ｍａｇｎｏｌｏｌ（ＣＡＳ　ＮＯ．：５２８－４３－８）、Ｇｌａｂｒｉｄｉｎ（ＣＡＳ　ＮＯ．：５９８７０－６８－７）、Ｂａｌａｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１９９１１３－９８－９）、Ｍｉｆｏｂａｔｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：７６５４１－７２－５）、Ｉｎｏｌｉｔａｚｏｎｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：２２３１３２－３８－５）、ＥＨＰ－１０１（ＣＡＳ　ＮＯ．：１８１８４２８－２４－８）、Ａｄｅｌｍｉｄｒｏｌ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１６７５－６６－７）、Ｏｒｏｘｉｎ　Ａ（ＣＡＳ　ＮＯ．：５７３９６－７８－８）、Ｃｅｆｍｉｎｏｘ　ｓｏｄｉｕｍ（ＣＡＳ　ＮＯ．：７５４９８－９６－３）、Ｍｅｔｈｙｌ　ｏｌｅａｎｏｎａｔｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１７２１－５８－０）、１５－Ｄｅｏｘｙ－Δ－１２，１４－ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｊ２（ＣＡＳ　ＮＯ．：８７８９３－５５－８）、ＧＳＫ３７６５０１Ａ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１０１０４１２－８０－２）、４－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌ　ｈｏｎｏｋｉｏｌ（ＣＡＳ　ＮＯ．：６８５９２－１５－４）、Ｃａｕｌｏｐｈｙｌｌｏｇｅｎｉｎ（ＣＡＳ　ＮＯ．：５２９３６－６４－８）、Ｄａｒｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：１４１２００－２４－０）、Ａｎｇｅｌｏｙｌｇｏｍｉｓｉｎ　Ｈ（ＣＡＳ　ＮＯ．：６６０５６－２２－２）、ＤＳ－６９３０（ＣＡＳ　ＮＯ．：１２４２３２８－８２－０）、Ｉｎｏｌｉｔａｚｏｎｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：２２３１３２－３７－４）及びＡｒｈａｌｏｆｅｎａｔｅ（ＣＡＳ　ＮＯ．：２４１３６－２３－０）からなる群より選択される少なくとも１種である。ＰＰＡＲＧアゴニストは、好ましくはロシグリタゾン又はトログリタゾン若しくはそれらの組合せである。

　本明細書において用語「ＰＰＡＲＤアゴニスト」は、ＰＰＡＲＤを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲＤアゴニストは、商業的に入手可能である（例えば、https://www.medchemexpress.com/Targets/PPAR.htmlを参照（引用により本明細書に組込まれる））。ＰＰＡＲＤは、例えば、フィナデルパー（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５１５１３８－０６－４）、ＡＳＰ０３６７、ＧＷ５０１５１６（Ｅｎｄｕｒａｂｏｌ）、Ｐｐａｒδアゴニスト５（分子式：Ｃ_２３Ｈ_２１Ｆ_３Ｎ_２Ｏ_２Ｓ）、ＭＢＸ８０２５（Ｓｅｌａｄｅｌｐａｒ、ＣＡＳ　Ｎｏ．：８５１５２８－７９－５）、ＧＷ０７４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３１７３１８－８４－６）、Ｌ１６５０４１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７９５５８－０９－１）、ＨＰＰ－５９３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６０４８１５－３２－８）及びＮＣＰ－１０４６からなる群より選択される少なくとも１種である。ＰＰＡＲＤアゴニストは、好ましくはフィナデルパー又はＡＳＰ０３６７若しくはそれらの組合せである。

　本明細書において用語「ＰＰＡＲＡ／Ｇアゴニスト」は、ＰＰＡＲＡ／Ｇを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲＡ／Ｇアゴニストは、商業的に入手可能である。ＰＰＡＲＡ／Ｇアゴニストは、例えば、サログリタザール（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４９５３９９－０９－２）、アレグリタザール（ＣＡＳ　番号：４７５４７９－３４－６）、ムラグリタザール（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３３１７４１－９４－７）、テサグリタザール（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５１５６５－８５－２）及びＤＳＰ－８６５８からなる群より選択される少なくとも１種である。

　本明細書において用語「ＰＰＡＲＡ／Ｄアゴニスト」は、ＰＰＡＲＡ／Ｄを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲＡ／Ｄアゴニストは、商業的に入手可能である。ＰＰＡＲＡ／Ｄアゴニストは、例えば、ＥＬＡ及びＴ９１３６５９のいずれか一方又は両方である。

　本明細書において用語「ＰＰＡＲＧ／Ｄアゴニスト」は、ＰＰＡＲＧ／Ｄを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲＧ／Ｄアゴニストは、商業的に入手可能である。ＰＰＡＲＧ／Ｄアゴニストは、例えば、リノール酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０－３３－３）及びＴ３Ｄ－９５９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２５８０７６－６６－２）のいずれか一方又は両方である。

　本明細書において用語「ＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄアゴニスト」は、ＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄを活性化する化合物又は組成物を意味する。ＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄアゴニストは、商業的に入手可能である。ＰＰＡＲＡ／Ｇ／Ｄアゴニストは、例えば、ＩＶＡ３３７（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ、ＣＡＳ　Ｎｏ．：９２７９６１－１８－０）、ＴＴＡ（テトラデシルチオ酢酸、ＣＡＳ　Ｎｏ．：２９２１－２０－２）、Ｂａｖａｃｈｉｎｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９８７９－３０－２）、ＧＷ４１４８、ＧＷ９１３５、ベンザフィブラート（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４１８５９－６７－０）、ロベグリタゾン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０７７２３－３３－１）、及びＣＳ０３８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７４３４３８－４５－１）からなる群より選択される少なくとも１種である。

　誘導培地Ｃに添加するＰＰＡＲアゴニスト（例えばＣＰ７７５１４６）の量としては、０．０５～５μＭ、０．１～３μＭ、０．１～２μＭ、０．２～１．５μＭ、０．２～１μＭ、又は０．３～１μＭを挙げることができる。誘導培地Ｃは、０．０５～５μＭ、０．１～３μＭ、０．１～２μＭ、０．２～１．５μＭ、０．２～１μＭ、又は０．３～１μＭのＣＰ７７５１４６が示すＰＰＡＲＡアゴニスト作用と同程度の作用を示す濃度でＣＰ７７５１４６以外のＰＰＡＲアゴニストを添加してもよい。誘導培地Ｃに利用される基礎培地に含まれるＰＰＡＲアゴニスト作用を有する成分の量に応じて、適宜、添加するＰＰＡＲアゴニストの量が調整されうる。ＰＰＡＲアゴニスト作用は、本明細書に記載したＲＸＲアゴニスト作用と同様の方法で測定することができる。１つの例において、ＰＰＡＲアゴニスト作用は、ＣＰ７７５１４６の存在下で形成されるＲＸＲとＰＰＡＲとのヘテロダイマーにより誘導されるルシフェラーゼの発現量を測定し、ＰＰＡＲを作動し得る化合物の存在下でのＲＸＲとＰＰＡＲとのヘテロダイマーにより誘導されるルシフェラーゼの発現量を測定し、それらを比較することで測定することができる。ＰＰＡＲアゴニスト作用は、商業的に入手可能なアッセイ（ＩＮＤＩＧＯ社、核内受容体ルシフェラーゼレポーターアッセイ）を用いて測定することができる。

　本発明において、基礎培地に添加するＲＸＲアゴニストとＰＰＡＲアゴニストのモル濃度比としては、ＰＰＡＲアゴニストを１としたときに、ＲＸＲアゴニストが０．３～１０の範囲であり、好ましくは０．５～５、より好ましくは０．５～４の範囲である。基礎培地中にいずれかまたは両方のアゴニストが含まれる場合、適宜、その比率を調整することができるが、全体量として、上記の範囲にあることが望ましい。

　工程Ｃは、例えば、以下の手順に従って実施することができる。腎臓オルガノイドを、誘導培地ＣであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（０．３μＭ　ＣＰ７７５１４６、１μＭ　９－ｃｉｓレチノイン酸、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）を用いて培養することで、近位尿細管の成熟化を促進する。

　誘導培地Ｃは、ＰＰＡＲアゴニスト（例えばピリニクス酸）を０．１～３０μＭ、０．５～２５μＭ、１～２０μＭ、２～１８μＭ、５～１５μＭ、７～１２μＭ、又は１０μＭ含有してもよい。工程Ｃは、例えば、以下の手順に従って実施することができる。腎臓オルガノイドを、誘導培地ＣであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（１０μＭ　ピリニクス酸、１μＭ　９－ｃｉｓレチノイン酸、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）を用いて培養することで、近位尿細管の成熟化を促進する。

［成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物、及びその製造方法］
　本開示の１つの態様は、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを腎臓又はその周辺部位に有する非ヒト哺乳動物を提供する。本開示の１つの態様は、成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを腎臓又はその周辺部位に有する非ヒト哺乳動物の製造方法を提供する。

　成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物は、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを、非ヒト哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に導入することを含む方法によって、製造することができる。前記非ヒト哺乳動物は、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを、非ヒト哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に導入すること、及び前記非ヒト哺乳動物を飼育することを含む方法によって、製造することができる。非ヒト哺乳動物の飼育は、例えば、非ヒト哺乳動物に対する公知の餌を与えることを含む。前記非ヒト哺乳動物と、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを製造するために用いられた多能性幹細胞、中間中胚葉細胞又は初期腎オルガノイドの動物種とは、移植片拒絶反応の軽減の観点から、同一種であることが好ましく、同一個体であることが更に好ましい。

　一例において、腫瘍細胞又は腫瘍片を、前記腎臓オルガノイドに導入し、前記腎臓オルガノイドを、非ヒト哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に導入することで、腎臓がんモデルとしての前記腎臓オルガノイドをその腎臓又はその周辺部位に有する非ヒト哺乳動物を製造することができる。腎臓がんモデルとしての前記非ヒト哺乳動物は、腎臓がんの治療薬候補物質の効果を評価する方法に用いることができる。腎臓がんモデルとしての前記非ヒト哺乳動物と、腫瘍細胞又は腫瘍片が導入された前記腎臓オルガノイドを製造するために用いられた多能性幹細胞、中間中胚葉細胞又は初期腎オルガノイドの動物種とは、移植片拒絶反応の軽減の観点から、同一種であることが好ましく、同一個体であることが更に好ましい。

　本明細書において「非ヒト哺乳動物」は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類；チンパンジーなどの非ヒト霊長類；牛、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目；ウマなどの奇蹄目；ウサギ、イヌ、ネコなどの愛玩動物であってよい。非ヒト哺乳動物は、好ましくはげっ歯類又は非ヒト霊長類である。

［再生医療用組成物］
　本開示の１つの態様は、本開示に係る成熟した近位尿細管細胞を含有することを特徴とする腎臓オルガノイドを含む、再生医療用組成物を提供する。

　本明細書において「再生医療用組成物」は、本開示に係る成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを含む。本開示に係る再生医療用組成物は、哺乳動物における腎臓の損傷又は疾患を治療するために用いることができる。再生医療用組成物は、例えば、医薬上許容される担体を適宜含んでよい。本明細書において用語「医薬上許容される担体」は、哺乳動物において安全性が高く、アレルギー反応性が小さい、前記腎臓オルガノイド以外の任意の成分を意味する。医薬上許容される担体は、例えば、医薬投与に適した水性若しくは非水性溶媒、溶液（例えば生理食塩水、基本培地又は細胞懸濁保存液）、凍結防止剤（例えばグリセロール）、水溶性高分子（例えばデキストラン）、又は緩衝剤（例えばリン酸緩衝液）を含む。再生医療用組成物は、公知の方法に従って適宜製造することができる。一例において、本開示に係る再生医療用組成物は、前記腎臓オルガノイドと、医薬上許容される担体（例えば基本培地）とを配合することで製造することができる。

　再生医療用組成物は、例えば、外科的手法により腎臓の所定の部位に移植することによって、又は注射器などの器具を用いて腎臓の所定の部位に注入することによって、その必要のある哺乳動物に投与される。再生医療用組成物が投与される哺乳動物と、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを製造するために用いられた多能性幹細胞、中間中胚葉細胞又は初期腎オルガノイドの動物種とは、移植片拒絶反応の軽減の観点から、同一種であることが好ましく、同一個体であることが更に好ましい。

　再生医療用組成物に関する用語「哺乳動物」は、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物である。ヒト以外の哺乳動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、牛、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなどの愛玩動物であってよい。１つの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。

　本明細書において「腎臓の損傷」又は「腎臓の疾患」は、例えば、外傷により損傷を受けた腎臓、腎臓の疾患（例えば、萎縮腎、腎血管性高血圧、アミロイド腎、高尿酸血症性腎症、及び尿細管性アシドーシス）、慢性の腎疾患（例えば、慢性糸球体腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、慢性腎盂腎炎、及び慢性腎不全）、又は慢性に関する症候群（例えば、Ｇｉｔｅｌｍａｎ症候群、Ｂａｒｔｔｅｒ症候群、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、Ｌｏｗｅ症候群、ネフローゼ症候群）、又は腎臓がんであってよい。

　本開示に係る再生医療用組成物は、哺乳動物における腎臓の損傷又は疾患を治療する方法に用いることができる。１つの実施形態は、本開示に係る成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを含む再生医療用組成物を、その必要のある哺乳動物に投与することを含む、腎臓の損傷又は疾患を治療する方法を提供する。

［腎臓の損傷又は疾患を治療する方法］
　本開示の１つの態様は、哺乳動物における腎臓の損傷又は疾患を治療する方法を提供する。

　哺乳動物における腎臓の損傷又は疾患を治療する方法は、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド、又は再生医療用組成物を、その必要のある哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に導入することを含む。哺乳動物に導入される腎臓オルガノイドは、例えば、オルガノイドの形態であってよく、又は単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌｓ）及び複数個の細胞で構成される細胞塊のいずれか若しくはその両方であってよい。１つの例において、哺乳動物における腎臓の損傷又は疾患を治療する方法は、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド由来の細胞群を、その必要のある哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に注入することを含む。

　本明細書において用語「その必要のある哺乳動物」は、腎臓の損傷又は疾患を有する又は有する疑いのある哺乳動物を意味する。腎臓の損傷又は疾患を有する哺乳動物は、医療従事者（例えば医師）が所定の診断基準に従って、腎臓の損傷又は疾患を有すると診断された哺乳動物を意味する。腎臓の損傷又は疾患を有する疑いのある哺乳動物は、例えば、前記哺乳動物の行動歴（例えば、外傷、及び腎臓組織に有害な薬物を受けた又は受けている）又は病歴（例えば、本開示に係る腎臓の疾患、慢性の腎疾患、腎臓に関する症候群、又は腎臓がんを患っている又は患っていた）に基づいて、腎臓の損傷又は疾患を有することが疑われる哺乳動物であってよい。本態様に係る哺乳動物は、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物である。ヒト以外の哺乳動物は、例えば、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、牛、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなどの愛玩動物であってよい。本態様に係る哺乳動物は、好ましくはヒト又は非ヒト霊長類、より好ましくはヒトである。

　腎臓の損傷又は疾患の「治療」は、その症状又は病態が維持され、低減し、又は消失することを含む。腎臓の損傷又は疾患の治療は、腎臓の損傷又は疾患を治癒することを含む。

　その必要のある哺乳動物に導入される成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド又は再生医療用組成物を製造するために用いられた多能性幹細胞、中間中胚葉細胞又は初期腎オルガノイドの動物種と、その必要のある哺乳動物とは、移植片拒絶反応の軽減の観点から、同一種または同一個体であることが好ましい。

［評価方法］
　本開示の１つの態様は、本開示に係る成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド又は前記腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物と、被検物質とを接触させること、及び前記被検物質に対する前記腎臓オルガノイド又は前記非ヒト哺乳動物における薬物応答性を測定することを含む、被検物質に対する薬物応答性を評価する方法を提供する。

　本明細書において「被検物質」は、例えば、低分子化合物、タンパク質（例えば抗体）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。被検物質は、例えば、哺乳動物における疾患（例えば、腎臓、膀胱、胃及び腸などの臓器における疾患）、又はがん（例えば、腎臓がん、膀胱がん、胃がん及び腸のがん）を治療するための薬物、或いはそれらの候補物質であってよい。被検物質は、例えば、腎障害を引き起こすことが知られている物質又はその可能性がある物質であってよい。被検物質は、例えば、１種であってもよく、又は２種以上の混合物であってもよい。被検物質は、好ましくは１種類の物質である。

　成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド又は前記腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物と、被検物質とを「接触させる」は、前記腎臓オルガノイド又は前記非ヒト哺乳動物と、被検物質とが接触可能な状況下に置くことを意味する。前記腎臓オルガノイドと、被検物質とを接触させることは、例えば、前記腎臓オルガノイドを含む培養液に、被検物質を混合することであってよい。前記非ヒト哺乳動物と、被検物質とを接触せることは、例えば、前記非ヒト哺乳動物に、被検物質を経口投与又は非経口投与することであってよい。

　前記薬物応答性は、例えば、被検物質による成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドの構造的特性又は機能的特性における変化を含む。この例において、前記薬物応答性の測定は、前記腎臓オルガノイドの構造的特性又は機能的特性の測定を含む。前記構造的特性は、例えば、腎臓オルガノイドにおける成熟した近位尿細管細胞の割合であってよい。前記機能的特性は、例えば、腎臓オルガノイドにおけるデキストランの取込み量であってよい。腎臓オルガノイドによるデキストラン取込みは、例えば、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２５，３７３－３８７，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　５，２０１９（参照により本明細書に組込まれる）またはＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２１、Ｖｏｌ．８（２）ｅ１５０に記載の方法に従って、測定することができる。

　前記構造的特性の変化は、例えば、被検物質を接触させていない成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドにおける成熟した近位尿細管細胞の割合（以下「第一の割合」という）と、被検物質を接触させた成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドにおける成熟した近位尿細管細胞の割合（以下「第二の割合」という）とを比較することを含む。前記構造的特性の変化は、例えば、第一の割合に対する第二の割合の比（＝［第二の割合］／［第一の割合］）であってよい。前記比が０．７である場合、被検物質との接触によって成熟した近位尿細管細胞が３０％減少したことを示唆する。この成熟した近位尿細管細胞の減少は、例えば、被検物質と前記細胞との接触によりアポトーシスなどの細胞死が誘発されたことが原因と考えられる。この成熟した近位尿細管細胞の減少は、被検物質が腎毒性を有することを示唆する。したがって、本開示に係る評価方法は、薬物応答性の測定結果に基づいて、被検物質の腎毒性を評価することを含む。他の例では、本開示に係る評価方法は、薬物応答性の測定結果に基づいて、被検物質による成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド又は前記腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物に対する腎毒性を評価することを含む。ここで、腎毒性を有する被検物質としては、抗生物質や抗菌薬（アミノグリコシド、バンコマイシン、ペニシリン等）、非ステロイド系抗炎症薬（イブプロフェン、インドメタシン、フェノプロフェン等）、抗がん薬（シスプラチン等）、造影剤、免疫抑制薬（シクロスポリン等）を例示することができるが、これらに限定されない。

　本開示に係る腎臓オルガノイドにおける成熟した近位尿細管細胞の割合は、例えば、前記腎臓オルガノイドを構成する細胞を単一の細胞に分離し、分離した細胞集団中の成熟した近位尿細管細胞の個数を、前記分離した細胞集団の総細胞数で割り付けることにより算出することができる。成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドから単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌｓ）に分離する方法は、公知の細胞塊（例えば、スフェロイド又はオルガノイド）から個々の細胞に分離する方法を用いることができる。前記腎臓オルガノイドから個々の細胞は、例えば、本開示に係る「腎臓オルガノイド由来の単一細胞の調製」を実施することで得ることができる。前記分離した細胞集団中の成熟した近位尿細管細胞の個数、前記総細胞数、又は前記割合は、例えば、ＦＡＣＳにより測定することができる。ＦＡＣＳによる成熟した近位尿細管細胞の測定は、例えば本開示に係る近位尿細管に特異的に結合するレクチン（例えばＬＴＬ）又は抗体を用いて実施することができる。前記抗体は、公知の蛍光物質で標識化されていてよい。

　前記機能的特性の変化は、例えば、被検物質を接触させていない成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドにおけるデキストランの取込み量（以下「第一の取込み量」という）と、被検物質を接触させた成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドにおけるデキストランの取込み量（以下「第二の取込み量」という）とを比較することを含む。前記機能的特性の変化は、例えば、第一の取込み量に対する第二の取込み量の比（＝［第二の取込み量］／［第一の取込み量］）であってよい。前記第一の取込み量及び第二の取込み量は、好ましくは近位尿細管の面積を揃えて測定される。前記比が１未満である場合、被検物質との接触によって成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドの機能的特性が低下したことを示唆する。したがって、本開示に係る評価方法は、薬物応答性の測定結果に基づいて、被検物質による腎機能の低下を評価することを含む。他の例では、本開示に係る評価方法は、薬物応答性の測定結果に基づいて、被検物質による成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド又は前記腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物に対する腎機能の低下を評価することを含む。

　成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドにおけるデキストランの取込み量は、例えば、前記腎臓オルガノイドを、蛍光標識したデキストランを添加した培地で所定時間（例えば２４時間）培養し、次いで、前記腎臓オルガノイドから発せられる蛍光を検出することで測定することができる。前記蛍光は、例えば蛍光顕微鏡を用いて測定することができる。

　１つの例において、前記薬物応答性の測定は、被検物質を接触させていない成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドにおける構造的又は機能的特性を測定して第一の測定結果を得ること；被検物質を接触させた成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドにおける構造的又は機能的特性を測定して第二の測定結果を得ること；及び前記第一の測定結果と前記第二の測定結果とを比較することを含む。１つの例において、本開示に係る評価方法は、前記薬物応答性の測定結果に基づいて、前記被検物質による成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド又は前記腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物における薬物応答性（例えば、腎機能の有無又はそのレベル）を評価することを含む。

　薬物応答性は、例えば、少なくとも３個（例えば、３個、４個、５個、６個又は７個若しくは８個以上）の成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド又は前記腎臓オルガノイドを有する非ヒト哺乳動物から測定した結果の平均値であってよい。

［近位尿細管の成熟化を促進する方法］
　本開示の１つの態様は、近位尿細管の成熟化を促進する方法を提供する。前記方法は、初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地を用いて培養することを含む。近位尿細管の成熟化を促進する方法は、インビトロで実施される。

　本明細書において用語「近位尿細管」は、腎臓オルガノイドにおける、ＬＴＬ結合細胞が集団する領域を意味する。近位尿細管は、例えば、刷子縁を有する。１つの例において、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地を用いて初期腎オルガノイドを培養して得られた腎臓オルガノイド（目的のオルガノイド）における近位尿細管マーカーの発現量が、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストのいずれか一方又は両方を実質的に含まない培地を用いて初期腎オルガノイドを培養して得られた腎臓オルガノイド（対照オルガノイド）における前記近位尿細管マーカーの発現量よりも有意に大きい場合、近位尿細管の成熟化が促進されたと評価し得る。他の例において、前記した目的のオルガノイドにおける所定サイズ以上のエンドソームの数が、前記対象オルガノイドにおける所定サイズ以上のエンドソームの数よりも有意に多い場合、近位尿細管の成熟化が促進されたと評価し得る。エンドソームの文脈における所定サイズは、例えば、０．５μｍ^２である。他の例において、前記した目的のオルガノイドにおけるデキストランの取込み量が、前記対象オルガノイドにおけるデキストランの取込み量よりも有意に多い場合、近位尿細管の成熟化が促進されたと評価し得る。

　本明細書において用語「含む」は、列挙される要素及び／又はステップが存在し、その他の要素及び／又はステップが追加されてもよいことを意味する。本明細書において用語「からなる」は、列挙される要素及び／又はステップが存在し、その他の要素及び／又はステップを排除することを意味する。本明細書において用語「から本質的になる」は、列挙される要素及び／又はステップが存在し、その他の要素及び／又はステップが、細胞層、オルガノイド、組成物、及び方法の新規な技術的特徴に影響を与えない範囲で追加されていてよいことを意味する。本明細書において用語「実質的に含まない」は、「完全に含まない」を排除しない。

　本開示により提供される用語、態様及び実施形態についての説明は、特に言及がない限り、本開示により提供する対応する用語、態様及び実施形態の間で適宜適用される。

　以下、具体的な実施例を記載するが、それらは本発明の好ましい実施形態を示すものであり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
［実施例］

材料および方法
　後述する実施例２及び３では、以下の成長因子及び化合物を用いた：
　ＣＨＩＲ９９０２１（ＴＯＣＲＩＳ、＃４４２３）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ９（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ、＃２７３－Ｆ９－０２５）、Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ４７８４－２５０ＭＧ）、ＣＰ７７５１４６（ＴＯＣＲＩＳ、＃４１９０）、及び９－ｃｉｓレチノイン酸（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ１４１０２３）。

（腎臓オルガノイド由来の単一細胞の調製）
　前記腎臓オルガノイドを遠沈管に移し、前記遠沈管に細胞剥離液（ＤＰＢＳ（＋）、５ｍｇ／ｍＬ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、１２５Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ））を加えた。前記オルガノイドは１つの遠沈管あたり１２個まで入れた。前記遠沈管を６℃で３０分間インキュベートした。前記３０分間のインキュベートの間、５分おきにピペッティングして、前記オルガノイドから分離した細胞を含む細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液１ｍＬに、氷冷した希釈溶液Ａ（ＤＰＢＳ（－）、０．５％　ＦＢＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１２５Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ）４ｍＬを加えた。希釈した細胞懸濁液を含む遠沈管を３００ｒｃｆ、４℃で１０分間の遠心にかけ、その上清を除去した。その沈殿物に、氷冷した希釈溶液Ａを加えて再懸濁した。前記細胞懸濁液を再び遠心にかけ、その沈殿物を希釈溶液Ａ中に再懸濁した。得られた細胞懸濁液を、３５μｍのフィルター付チューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、前記フィルターに通じて、単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｅｌｌｓ）を含む細胞懸濁液を調製した。

（ＭＡＣＳ法を用いたＬＴＬ陽性近位尿細管細胞の取得）
　調製した単一細胞を含む細胞懸濁液に、ＬＴＬ－ｂｉｏｔｉｎ（１：５０）を加え、４℃で１５分間インキュベートした。その後、前記細胞懸濁液を３００ｒｃｆ、４℃で５分間遠心にかけ、その上清を除去した。その沈殿物に、氷冷した希釈溶液Ａを加えて再懸濁した。細胞懸濁液を遠心分離にかけ、その沈殿物から細胞懸濁液を得る操作を更に２回行った。得られた希釈溶液Ａ中の細胞懸濁液に、ａｎｔｉ－ｂｉｏｔｉｎｍｉｃｒｏＢｅａｄｓ　Ｕｌｔｒａ　Ｐｕｒｅを加えて、４℃で１５分間インキュベートした。その後、前記細胞懸濁液を３００ｒｃｆ、４℃の５分間遠心にかけ、その上清を除去した。その沈殿物に、氷冷した希釈溶液Ａを加えて再懸濁した。この操作を更に２回行った。得られた希釈溶液Ａ中の細胞懸濁液から、ＭＡＣＳ法によりＬＴＬが結合する細胞（ＬＴＬ結合細胞又はＬＴＬ陽性細胞とも称する）を取得した。より具体的には、前記細胞懸濁液を、磁場に固定したＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）にアプライし、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＦｒａｃｔｉｏｎとしてＬＴＬ陽性の近位尿細管細胞を取得した。

（ＬＴＬ陽性細胞における遺伝子発現量の解析）
　取得したＬＴＬ陽性の近位尿細管細胞を含む細胞懸濁液から、Ｐｕｒｅｌｉｎｋ　ＲＮＡｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを鋳型として用い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）　ＲＴｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）（ＴａＫａＲａ）を用いて、ｃＤＮＡ合成を行った。合成したｃＤＮＡは、ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（商標）　ＩＩ（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）（ＴａＫａＲａ）を用いて、リアルタイムＰＣＲにより定量した。この定量ＰＣＲにより、発現量解析を行った。

［実施例１］　腎臓オルガノイド由来の細胞集団に対するシングルセルＲＮＡ配列決定
　実施例１は、腎臓オルガノイドの成熟に関与する因子を特定することを目的として行った。発明者らは、後述する工程Ａ及び工程Ｂを実施することで製造されたオルガノイドについて、分化誘導日数毎にシングルセルＲＮＡ配列決定を行い、細胞のクラスタリングを行った。その結果、分化誘導３１日に渡り間質細胞集団、筋肉細胞集団、神経細胞集団、糸球体細胞集団、ネフロン前駆細胞集団、及び尿細管細胞集団を含む多様性を持った細胞の集団へと分化していくこと、及び、各細胞集団に到達する日数にばらつきがあることが示された。さらに、シングルセルＲＮＡ配列決定の結果について疑似時間軸による解析を行った。その結果、製造日数が短いオルガノイドで特定の細胞種の特定の疑似時間を示す細胞が存在すること、即ち、成熟が早い細胞が存在すること、並びに、製造日数が長いオルガノイドで同じ細胞種の同じ疑似時間を示す細胞が存在すること、即ち、成熟が遅い細胞が存在することを見いだした。この結果は、特定の細胞種の同じ疑似時間を示すが、製造日数が異なる腎臓オルガノイド由来の細胞集団を比較することで、その細胞種の成熟化に関連する遺伝子を特定できる可能性を示唆する。そこで、近位尿細管細胞について、同じ疑似時間を示すが、製造日数が異なる腎臓オルガノイド由来の細胞集団について、発現変動遺伝子解析を行った。この遺伝子解析で、上流調節因子のうちで、発現量が増加した遺伝子であって、ｐ値が低いものを選抜した。

　この結果、ＰＰＡＲＡ関連の遺伝子、ＰＰＡＲＧ関連の遺伝子、及びＲＸＲ関連の遺伝子が活性化されていたことが示された。具体的には、ＰＰＡＲＡ関連の遺伝子では、ＰＰＡＲＡ（２．６倍、ｐ＝２．０Ｅ－１２）、ｐｉｒｉｎｉｘｉｃ　ａｃｉｄ（３．１倍、ｐ＝４．３Ｅ－１１）、ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ（２．６倍、ｐ＝４．８Ｅ－９）、ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ（２．４倍、ｐ＝１．４Ｅ－７）、ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ（２．８倍、ｐ＝７．２Ｅ－７）、及びｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ（２．８倍、ｐ＝９．０Ｅ－６）が活性化されていた。また、ＰＰＡＲＧ関連の遺伝子では、ｒｅｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ（３．０倍、ｐ＝１．２Ｅ－５）及びＰＰＡＲＧ（２．６倍、ｐ＝１．３Ｅ－５）が活性化されており、及びＲＸＲ関連の遺伝子では、ａｌｉｔｒｅｔｉｎｏｉｎ（２．４倍、ｐ＝５．９Ｅ－３）及びＡＧＮ１９４２０４（２．０倍、ｐ＝７．４Ｅ－３）が活性化されていた。

　実施例１の結果は、腎臓オルガノイドの培養において、ＰＰＡＲＡアゴニスト、ＰＰＡＲＧアゴニスト、又はＲＸＲアゴニスト、若しくはそれらの組合せを用いることによって、成熟した細胞を誘導できることを示唆する。

［実施例２］　成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドの作製
　実施例２では、実施例１により示唆されたＰＰＡＲＡアゴニスト、ＰＰＡＲＧアゴニスト、又はＲＸＲアゴニスト、若しくはそれらの組合せによる腎臓オルガノイドの成熟促進効果を検証した。図１は、１つの実施形態に係る成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド作製の概要を示すフローチャート図である。図１は、ヒトｉＰＳ細胞から中間中胚葉へ分化誘導する工程Ａ、中間中胚葉から初期腎オルガノイドへ分化誘導する工程Ｂ、及び初期腎オルガノイドから成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドへ分化誘導する工程Ｃを示す。図１は、後述する腎毒性を評価する工程を更に示す。実施例２では、図１で示される工程Ａ～Ｃを実施して、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを製造する。実施例２の工程Ｃでは、ＰＰＡＲＡアゴニストであるＣＰ７７５１４６と、ＲＸＲアゴニストである９ｃｉｓレチノイン酸との組合せを含む誘導培地Ｃを用いて、前記腎臓オルガノイドを培養する。

分化誘導用細胞の前培養
　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ細胞（１５０２．３株、Ｄｒ．Ｍｅｌｉｓｓａ　Ｌｉｔｔｌｅ、Ｍｕｒｄｏｃｈ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより譲受）を、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ）でコーティングした培養プレート表面上でＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ）にて維持培養した。前記細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３７℃で５分間インキュベートして剥離し、細胞懸濁液を得た。前記細胞懸濁液を２００ｒｃｆ、室温で５分間遠心し、上清を除去した後、沈殿物をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（１０μＭ　Ｙ－２７６３２）中に再懸濁した。前記細胞懸濁液に、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１（Ｎｉｐｐｉ）を０．２５μｇ／ｃｍ^２となるように添加し、１５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２となるように１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、３７℃、ＣＯ_２　５％下で１日間培養した。

工程Ａ：　中間中胚葉の分化誘導
　次に、前記培養で用いた培養培地を、誘導培地ＡであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ）（８μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）に交換し、５日間培養することで、ｉＰＳ細胞から原始線条を誘導した。培地交換は４日目以降は毎日行った。ｉＰＳ細胞は分化誘導１日目には細胞が集合しコロニーを形成し、分化誘導２日目には細胞コロニーは外側方向に拡がり始めた。分化誘導３日目には、細胞コロニーの中心付近では増殖した細胞が積層し始め、分化誘導４日目以降、コロニーは丸みを帯びた形状となった。分化誘導５日目に、誘導培地Ａを、誘導培地ＢであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（２００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ９、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）に変更した。

　前記細胞コロニーを、誘導培地Ｂにて、更に３日間培養し、原始線条から中間中胚葉に分化誘導した。この培養の間に、前記コロニーの形状は、丸みを帯びた状態からシート状に徐々に変化した。

工程Ｂ：　スフェロイド形成及び初期腎オルガノイドの形成
（工程ｂ１）
　中間中胚葉誘導後（分化誘導８日目）、前記細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３７℃で７分間インキュベートして剥離し、細胞懸濁液を得た。前記細胞懸濁液を４００ｒｃｆ、室温で３分間遠心し、上清を除去した後、沈殿物を誘導培地ＢであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（２００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ９、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ、１０μＭ　Ｙ－２７６３２）中に再懸濁した。前記細胞懸濁液を、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）９６Ｍプレート（住友ベークライト）に１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種した。その翌日（分化誘導９日目）、ウェル内にスフェロイドが形成された。

（工程ｂ２）
　形成されたスフェロイドを取り出し、Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ　Ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　ＰＥＴｍｅｍｂｒａｎｅ　６ｗｅｌｌ　０．４μｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔ上に１ウェルあたり６個のスフェロイドになるように置いた。スフェロイドを含むＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔを、対応する培養プレートのウェルに設置した。前記培養プレートのウェルと、前記Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｉｎｓｅｒｔのトランスウェル下面との間に、誘導培地ＡであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）を加えて、気－液界面にて前記スフェロイドを３７℃でＣＯ_２　５％下で３時間培養した。

（工程ｂ３）
　前記３時間の培養後に、誘導培地Ａを、誘導培地ＢであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（２００ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ９、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）に交換し、前記スフェロイドを、更に６日間（分化誘導１５日目まで）培養して、初期腎オルガノイドを誘導した。分化誘導１１～１２日では、前記スフェロイドにおいて、近位尿細管を含むネフロンの形成は確認できなかった。分化誘導１５日目では、初期の近位尿細管を含むネフロン様の構造が確認できた。

工程Ｃ：　近位尿細管成熟化
　分化誘導１５日目に、誘導培地ＣであるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（０．３μＭ　ＣＰ７７５１４６、１μＭ　９－ｃｉｓレチノイン酸、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）に交換し、得られた初期腎オルガノイドを、更に８日間（分化誘導２３日目まで）培養した。

　工程Ｃでは、初期の近位尿細管を含むネフロン様の構造が確認できた初期腎オルガノイドを用いる。近位尿細管を含むネフロンの形成が確認できないスフェロイドを、ＲＸＲアゴニスト（例えば９－ｃｉｓレチノイン酸）を含む培地を用いて培養すると、異なる分化の方向に進み、成熟した近位尿細管を含む腎臓オルガノイドを効率的に製造することができないと考えられる。例えば、工程Ｂにおいて、中間中胚葉細胞を、ＲＸＲアゴニスト（例えば９－ｃｉｓレチノイン酸）を含む誘導培地を用いて培養すると、ウォルフ管（前方ＩＭ由来）が支配的に誘導されたオルガノイドが形成される。その結果、ネフロン前駆細胞（後方ＩＭ由来）が減少したオルガノイドが形成され、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを効率的に製造することができない。

　分化誘導２３日目に、近位尿細管の成熟度について調べた。前記成熟度は、ＬＴＬを用いたＭＡＣＳ法による腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の成熟化マーカーの発現量に基づいて調べた。分化誘導１５日～２３日目までの間に誘導培地Ｃで培養した群（ＣＰ０．３＿９ｃｉｓＲＡ１群又はＭａｔｕｒｅ群）では、誘導培地ＣからＣＰ７７５１４６及び９－ｃｉｓレチノイン酸を除いた培養培地であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（０．２％ＤＭＳＯ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）で培養した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ群）と比べて、近位尿細管マーカー遺伝子群（図２ａ：ＵＧＴ２Ａ３、図２ｂ：ＡＺＧＰ１、図２ｃ：ＳＬＣ３９Ａ４、図２ｄ：ＢＨＭＴ、図２ｅ：ＡＣＥ２、図２ｆ：ＡＱＰ６、図２ｇ：ＣＵＢＮ、図２ｈ：ＬＲＰ２、及び図２ｉ：ＡＢＣＢ１）の発現量が、有意に上昇していた。これらの結果は、腎臓オルガノイドをＰＰＡＲＡアゴニスト（例えばＣＰ７７５１４６）とＲＸＲアゴニスト（例えば９－ｃｉｓレチノイン酸）との組合せの存在下で培養することで、従来より短い期間で成熟した近位尿細管細胞を誘導できることを示す。

　ＣＰ０．３＿９ｃｉｓＲＡ１群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比べて、ＰＰＡＲＡ下流遺伝子群（図３ａ：ＡＰＯＡ１、図３ｂ：ＡＰＯＣ３、図３ｃ：ＣＰＴ１Ａ、図３ｄ：ＦＡＢＰ１、図３ｅ：ＣＹＰ２７Ａ１、及び図３ｆ：ＡＣＯＸ１）の発現量も、有意に上昇していた。これらの結果は、腎臓オルガノイドをＰＰＡＲＡアゴニスト（例えばＣＰ７７５１４６）とＲＸＲアゴニスト（例えば９－ｃｉｓレチノイン酸）との組合せの存在下で培養することで、成熟した近位尿細管細胞を誘導できることを示す。

［実施例３］　工程Ｃの変形例
　実施例３では、工程Ｃにおいて、ＰＰＡＲＡアゴニストであるＣＰ７７５１４６単独、ＲＸＲアゴニストである９ｃｉｓレチノイン酸単独、及びそれらの組合せをそれぞれ含む培地を用いて、腎臓オルガノイドを培養する。実施例３で用いた前記アゴニストの組合せにおけるＰＰＡＲＡの濃度（１μＭ）は、実施例２での前記アゴニストの組合せにおけるＰＰＡＲＡの濃度（０．３μＭ）と異なる。

　工程Ｃにおいて、分化誘導１５日目の腎臓オルガノイドを、８日間、誘導培地Ｃからレチノイン酸を除いた培地であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（１μＭ　ＣＰ７７５１４６、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）で培養したＣＰ１群を調製した。分化誘導１５日目の腎臓オルガノイドを、８日間、誘導培地ＣからＣＰ７７５１４６を除いた培地であるＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（１μＭ　９－ｃｉｓレチノイン酸、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）で培養した９ｃｉｓＲＡ１群、及びＣＰ７７５１４６の濃度を１μＭとした誘導培地Ｃで培養したＣＰ１＿９ｃｉｓＲＡ１群（実施例３）を調製した。

　実施例２と同様にして、各群における近位尿細管マーカー遺伝子群（図４ａ：ＵＧＴ２Ａ３、図４ｂ：ＡＺＧＰ１、図４ｃ：ＳＬＣ３９Ａ４、図４ｄ：ＢＨＭＴ、図４ｅ：ＡＣＥ２、図４ｆ：ＡＱＰ６、図４ｇ：ＣＵＢＮ、図４ｈ：ＬＲＰ２、及び図４ｉ：ＡＢＣＢ１）の発現量を測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、誘導培地Ｃを用いて培養したＣＰ１＿９ｃｉｓＲＡ１群では、多数の近位尿細管マーカー遺伝子（図４ａ：ＵＧＴ２Ａ３、図４ｃ：ＳＬＣ３９Ａ４、図４ｅ：ＡＣＥ２、図４ｇ：ＣＵＢＮ、図４ｈ：ＬＲＰ２、及び図４ｉ：ＡＢＣＢ１）で発現量が増加する傾向が観察された。Ｃｏｎｔｒｏｌ群と、ＣＰ１群と、９ｃｉｓＲＡ１群とでは、ほぼ全ての近位尿細管マーカー遺伝子で発現量に大きな差は観察されなかった。これらの結果は、腎臓オルガノイドを、ＰＰＡＲＡアゴニスト（例えばＣＰ７７５１４６）とＲＸＲアゴニスト（例えば９－ｃｉｓレチノイン酸）との組合せの存在下で培養することで、近位尿細管細胞を誘導できることを示す。また、これらの結果は、ＰＰＡＲＡアゴニスト単独、又はＲＸＲアゴニスト単独の存在下で腎臓オルガノイドを培養しても、効率的に近位尿細管細胞を誘導できないことを示す。

　実施例２と同様にして、各群におけるＰＰＡＲＡ下流遺伝子群（図５ａ：ＡＰＯＡ１、図５ｂ：ＡＰＯＣ３、図５ｃ：ＣＰＴ１Ａ、図５ｄ：ＦＡＢＰ１、及び図５ｅ：ＡＣＯＸ１）の発現量を測定した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、多数のＰＰＡＲＡ下流遺伝子群（図５ａ：ＡＰＯＡ１、図５ｃ：ＣＰＴ１Ａ、図５ｄ：ＦＡＢＰ１、及び図５ｅ：ＡＣＯＸ１）で発現量が増加する傾向が観察された。Ｃｏｎｔｒｏｌ群と、ＣＰ１群と、９ｃｉｓＲＡ１群とでは、ほぼ全てのＰＰＡＲＡ下流遺伝子群で発現量に大きな差は観察されなかった。これらの結果は、腎臓オルガノイドをＰＰＡＲＡアゴニスト（例えばＣＰ７７５１４６）とＲＸＲアゴニスト（例えば９－ｃｉｓレチノイン酸）との組合せの存在下で培養することで、成熟した近位尿細管細胞を誘導できることを示す。また、これらの結果は、ＰＰＡＲＡアゴニスト単独、又はＲＸＲアゴニスト単独の存在下で腎臓オルガノイドを培養しても、成熟した近位尿細管細胞を効率的に誘導できないことを示す。

［実施例４］　シスプラチンに対する腎毒性評価
　実施例４では、図１で示した工程Ａ～Ｃを実施し、更に腎毒性評価を実施した。具体的には、実施例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞から中間中胚葉へ分化誘導し（工程Ａ）、中間中胚葉から初期腎オルガノイドへ分化誘導し（工程Ｂ）、更に初期腎オルガノイドから成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドへ分化誘導した（工程Ｃ）。分化誘導２３日目の成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドを、後述するシスプラチン腎毒性試験に供した。

腎臓オルガノイドにおけるシスプラチン腎毒性試験
（シスプラチン処理）
　分化誘導２３日目のＭａｔｕｒｅ群（実施例２）の腎臓オルガノイドを、シスプラチンを含まない誘導培地Ｃ（ＣＤＤＰ０μＭ）又はシスプラチンを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（シスプラチン点滴静注　１０ｍｇ「マルコ」（日医工ファーマ）５μＭ、０．３μＭ　ＣＰ７７５１４６、１μＭ　９－ｃｉｓレチノイン酸、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）で６日間培養した。培地交換は、２日に１回行った。

　分化誘導２３日目のＣｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドを、シスプラチンを含まないＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（ＣＤＤＰ０μＭ、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）又はシスプラチンを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（ＣＤＤＰ５μＭ、１μｇ／ｍＬ　Ｈｅｐａｒｉｎ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）で６日間培養した。培地交換は、２日に１回行った。

（フローサイトメトリーによる近位尿細管細胞の割合の評価）
　上述の「腎臓オルガノイド由来の単一細胞の調製」に従って、シスプラチン処置後の腎臓オルガノイドから単一細胞を含む細胞懸濁液を調製した。前記懸濁液中の細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（－）中に懸濁し、得られた細胞懸濁液を３７℃で１０分間インキュベートした。その後、前記細胞懸濁液を３００ｒｃｆ、４℃で５分間の遠心にかけ、その上清を除去した。その沈殿物に１００μＬのＤＰＢＳ（－）を加えて再懸濁し、更に冷メタノール９００μＬを加えて、氷上で３０分間インキュベートした。１０＾６細胞／１００μＬとなるようにＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＦＢＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ＤＰＢＳ（－））を用いて細胞数を調整した。得られた細胞懸濁液にＬＴＬ－ＦＩＴＣ（ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を１：１００の濃度で加え、４℃で３０分間回転攪拌した。その後、前記細胞懸濁液を３００ｒｃｆ、４℃で５分間の遠心にかけ、その上清を除去した。その沈殿物をＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＦＢＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　ＤＰＢＳ（－））中に再懸濁し、前記細胞懸濁液をセルストレーナーに通じた。得られた細胞懸濁液をフローサイトメーター（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＮｏｖｏＣｙｔｅ）を用いて解析した。

（結果）
　シスプラチンを含まないＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（ＣＤＤＰ０μＭ）で培養したＣｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドでは、ＬＴＬで強く染色される細胞集団は細胞全体の２６．５％であった（図６ａ）。シスプラチンを含まない誘導培地Ｃ（ＣＤＤＰ０μＭ）で培養したＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは、ＬＴＬを高発現する細胞集団は細胞全体の２８．１％であった（図６ｃ）。これらの結果は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドにて誘導されたＬＴＬで強く染色される細胞集団の細胞割合と、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドにて誘導されたＬＴＬで強く染色される細胞集団の割合とがほぼ等しいことを示す。実施例２及び３で示されるように、誘導培地Ｃを用いて培養した腎臓オルガノイドでは、成熟した近位尿細管細胞が誘導された。実施例２及び３での結果を併せて考慮すると、図６ｃで示されるＬＴＬで強く染色される細胞集団は、図６ａで示されるＬＴＬで強く染色される細胞集団に比べて、成熟した近位尿細管細胞を高い割合で含むと推測される。

　シスプラチンを含有するＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（ＣＤＤＰ５μＭ）で培養したＣｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドでは、ＬＴＬで強く染色される細胞は２２．５％であった（図６ｂ）。図６ａで示されたＬＴＬで強く染色される細胞集団の割合２６．５％と併せて考慮すると、実施例４は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドで誘導されたＬＴＬで強く染色される細胞集団では、約１５％（＝（１－２２．５／２６．５）×１００）の細胞がシスプラチンに感受性であったことを示す。

　シスプラチンを含有する誘導培地Ｃ（ＣＤＤＰ５μＭ）で培養したＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは、ＬＴＬで強く染色される細胞は１３．６％であった（図６ｄ）。図６ｃで示されたＬＴＬで強く染色される細胞集団の割合２８．１％と併せて考慮すると、実施例４は、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドで誘導されたＬＴＬで強く染色される細胞集団では、約５２％（＝（１－１３．６／２８．１）×１００）の細胞がシスプラチンに感受性であったことを示す。

　実施例４は、シスプラチンに感受性であった細胞が、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドでは約１５％であったのに対して、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは約５２％であったことを示した。この結果は、実施例２及び３のＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドと比較して、低濃度シスプラチン（例えば５μＭ）に対する感受性が高いことを示す。シスプラチンは、腎障害を引き起こすことが知られている。シスプラチンによる腎障害は主に近位尿細管の障害によることが知られている。これらを考慮すれば、本開示により提供される成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、高感度にシスプラチンによる腎障害を検知できることを示唆する。また、本開示により提供される成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイドは、近位尿細管で生じ得る薬剤による腎障害を評価する方法を提供できることを示唆する。

（追加試験）
　上記腎臓オルガノイドにおけるシスプラチン腎毒性試験を追加で行った（ｎ＝５）。
　シスプラチン存在下（ＣＤＤＰ５μＭ）で培養したＣｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドではＬＴＬで強く染色される細胞は１８．１％であったのに対して、シスプラチン存在下で培養したＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは１５．４％であった。同様の試験を５回行った。その結果、腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の低濃度シスプラチンに対する感受性が、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドと比較して、低濃度シスプラチン（例えば５μＭ）に対する感受性が有意に高いことが示された（図７）。

［実施例５］　近位尿細管細胞における成熟の促進
　実施例２に記載の腎臓オルガノイドの作製方法に従って、腎臓オルガノイドを作製した。分化誘導２３日目の腎臓オルガノイドを免疫染色して撮影した（図８ａ）。
免疫染色および透明化（ＩＦ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｌｅａｒｉｎｇ）
　腎臓オルガノイドを、４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃にて３０分処置した後、０．５ｘ　ＣＵＢＩＣ－Ｌ（１Ｍ　ＮａＣｌ：ＣＵＢＩＣ－Ｌ＝１：１）（東京化成工業株式会社、Ｔ３７４０）を加えて、室温で一晩インキュベーションした。その後、前記腎臓オルガノイドに、０．５％ＰＢＴＸ（０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００　ｉｎ　ＤＰＢＳ（－））を加えて１５分間インキュベーションし、膜透過処理を施した。前記腎臓オルガノイドをＤＰＢＳ（－）で３回洗浄した。腎臓オルガノイドを、ブロッキングバッファー（１０％　ロバ血清＋　０．３％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　ｉｎ　ＤＰＢＳ（－））で室温３時間処置したのち、一次抗体を加えて４℃で一晩インキュベーションした。その後、０．３％ＰＢＴＸで５回洗浄したのち、二次抗体を加えて４℃で一晩インキュベーションした。ＤＰＢＳ（－）で３回洗浄したのち、４％ＰＦＡで４℃で一晩インキュベーションし、その後ＤＰＢＳ（－）で３回洗浄した。さらに０．５ｘ　ＣＵＢＩＣ－Ｒ（東京化成工業株式会社、Ｔ３９８３）（５ｍｇ／ｍＬ　ＤＡＰＩ　１：１０００）を加えて室温で１５分処置したのち、ＣＵＢＩＣ－Ｒに液を置き換えて、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ８００　Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）にて画像を撮影した。

　近位尿細管マーカーに結合するＬＴＬの染色パターン、遠位尿細管マーカーＥＣＡＤの発現パターン、および糸球体マーカーＮＰＨＳ１の発現パターンについて、Ｃｏｎｔｒｏｌの腎臓オルガノイド（図８ａ上段）と、Ｍａｔｕｒｅの腎臓オルガノイド（図８ａ下段）との間に差は観察されなかった。分化誘導２９日目の腎臓オルガノイドを構成する細胞をフローサイトメーターに供し、全細胞中の近位尿細管細胞（ＰＴ　ｃｅｌｌｓ）割合を計測した（図８ｂ）。Ｃｏｎｔｒｏｌの腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の割合は２６．５％であり、Ｍａｔｕｒｅの腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の割合は２８．１％であった。同様の分析を５回行った。その結果、Ｃｏｎｔｒｏｌの腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の割合と、Ｍａｔｕｒｅの腎臓オルガノイドにおける近位尿細管細胞の割合との間に有意差はなかった（図８ｃ、unpaired t-test）。

　実施例５は、実施例２および３で示されたＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドにおける成熟化マーカー遺伝子の発現量増加は、ネフロン前駆細胞から近位尿細管細胞への分化が促進された結果ではなく、近位尿細管細胞の成熟が促進された結果であることを示す。本明細書の実施例は、ＰＰＡＲＡアゴニストおよびＲＸＲアゴニストの組合せは、腎臓オルガノイドの作製において、近位尿細管細胞の成熟を促進することを示す。

［実施例６］　タンパク質再吸収に関与するＬＲＰ２およびＣＵＢＮの発現量
　近位尿細管の機能は、タンパク質再吸収を含む。例えば、原尿中のアルブミン（タンパク質）は、近位尿細管のエンドソームに取り込まれる。エンドソームに取り込まれたアルブミンは、血管中に放出されてリサイクルされるか、またはライソソームにてアミノ酸に分解され、該アミノ酸は再利用される。ＬＲＰ２およびＣＵＢＮは、タンパク質の再吸収に関与する。

　実施例２と同様にして、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドおよびＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドを作製した。培養２０日、２３日、２６日および２９日目のオルガノイドにおけるＬＲＰ２およびＣＵＢＮの発現量をそれぞれ測定した（図９ａおよび図９ｂ
）。ＬＲＰ２およびＣＵＢＮの発現量はβアクチン（ＡＣＴＢ）の発現量に対してそれぞれ規格化した。分化誘導２６日目のＭａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドと比較して、その発現が増加した（図９ａおよび図９ｂ）。同様の結果が、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６およびＡＢＣＢ１についても得られた。これらの結果は、近位尿細管のタンパク質再吸収に関して、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドよりも、より早期に成熟することを示す。

［実施例７］　腎臓オルガノイドにおけるエンドソーム数
（ＴＥＭによるエンドソーム数の定量）
　透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）にて撮影するための組織試料を、以下のように調製した。培養２６日目の腎臓オルガノイドを、リン酸緩衝２％グルタルアルデヒドを用いて固定し、その後２％四酸化オスミウムを用いて氷浴中で３時間維持して固定した。固定化したオルガノイドを、エタノール溶液を用いて脱水し、エポキシ樹脂に包埋した。包埋したオルガノイドの切片を、ウルトラミクロトーム法により作製した。前記切片を酢酸ウラニルで１０分間、続いて鉛染色液で５分間染色した。染色した切片をＴＥＭ観察（ＨＩＴＡＣＨＩ　Ｈ－７６００　ａｔ　１００ｋＶ）に供した。取得した画像は、Ｉｍａｇｅ　Ｊ　Ｆｉｊｉを用いて、近位尿細管細胞の細胞質の面積（μｍ^２）、エンドソームの数および大きさ（μｍ^２）を計測し、定量した。

（結果）
　細胞質（μｍ^２）あたりのエンドソームの数は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドよりも、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドの方が有意に多かった（図１０ａ）。腎臓オルガノイドの１細胞中に検出される０．５μｍ^２以上のエンドソームの割合が０％の細胞は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドでは６５．４％であったのに対して、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは３８．５％と少なかった（図１０ｂおよび図１０ｃ）。０．５μｍ^２以上のエンドソームの割合が１～２０％の細胞は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドでは１５．４％であったのに対して、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは３４．６％と多かった（図１０ｂおよび図１０ｃ）。０．５μｍ^２以上のエンドソームの割合が４１～６０％の細胞は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドでは３．８％であったのに対して、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは７．７％と多かった（図１０ｂおよび図１０ｃ）。これらの結果は、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドと比較して、細胞質領域に対してエンドソームの数が有意に多く、かつ０．５μｍ^２以上のエンドソームの割合が多くなることを示す。

　胎仔ラットでは、発生が進むにつれ、近位尿細管部分には、Small VacuolesおよびLarge Vacuolesが増加する（Okada T, et al., Ann Anat. 1993 Feb;175(1):89-94、Journal of Ultrastructure Research 53, 254-270(1975)）。前記文献において、Small Vacuolesは直径０．５μｍ未満の液胞を示す。したがって、実施例７は、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドよりも、成熟した細胞を含むことを示す。

［実施例８］　腎臓オルガノイドによるデキストランの取り込み
Ｄｅｘｔｒａｎ　ｕｐｔａｋｅ　ａｓｓａｙ
　実施例２と同様に培養した２６日目の腎臓オルガノイドを含む培地に、ｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ　Ｄｅｘｔｒａｎ（１０，０００ＭＷ）ｆｏｒ　Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐ１０３６１）を１０μｇ／ｍＬになるように加え、３７℃、５％ＣＯ_２下で２４時間培養した。その後、腎臓オルガノイドを、氷冷したＤＰＢＳ（－）で３回洗浄し、ＬＴＬ－ＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＦＬ－１３２１）を含むＤＰＢＳ（－）（１：１００）中に４℃で２時間維持して、ＬＴＬによって近位尿細管を染色した。染色した腎臓オルガノイドは、ＣＶ８０００（Ｙｏｋｏｋａｗａ、Ｘ２０レンズ）を用いて、２Ｘ２のタイル画像を取得した。蛍光画像は、Ｚ軸方向（厚さ）に１００μｍにわたって５μｍ毎に取得した。ＣＶ８０００は、４８８ｎｍおよび５６１ｎｍの光を照射でき、ＢＰ５２５／５０およびＢＰ６００／３７のフィルターを備えた。ＬＴＬの２次元画像はＡｖｅｒａｇｅ　Ｉｍａｇｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＡｖｅＩＰ）を用いて、Ｄｅｘｔｒａｎの２次元画像はＳｕｍ　Ｉｍａｇｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＳｕｍＩＰ）を用いて、３次元の画像から作成した。作製した画像を用いて、ＬＴＬ結合領域内におけるＤｅｘｔｒａｎの蛍光強度を計測し、定量化した。

（結果）
　デキストランの蛍光強度は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドよりも、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドの方が有意に強かった（図１１、＊＊　ｐ＜０．０１、ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔ－ｔｅｓｔ）。この結果は、Ｍａｔｕｒｅ群の腎臓オルガノイドでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の腎臓オルガノイドと比較して、細胞外の物質を取り込む機能が向上していることを示す。実施例８は、Ｍａｔｕｒｅ郡の腎臓オルガノイドが、成熟した近位尿細管細胞を含有することを示す。

［比較例１］　ＰＰＡＲＡアンタゴニスト存在下での近位尿細管細胞の成熟化マーカーの発現量
　実施例２の工程Ｃ（分化誘導１５日目）にて、ＰＰＡＲＡアゴニストおよびＲＸＲアゴニストに代えて、ＰＰＡＲＡアンタゴニストであるＧＷ６４７１を用いたことを除いて、実施例２に記載の腎臓オルガノイドの作製方法と同じ方法に従って、腎臓オルガノイドを作製した。作製した腎臓オルガノイドにおける近位尿細管マーカー遺伝子群の発現量を測定した。工程Ｃ（分化誘導１５日目）にて、ＧＷ６４７１を加えていないＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（０．２％ＤＭＳＯ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）で培養した群をＣｏｎｔｒｏｌとした。

（結果）
　所定濃度のＧＷ６４７１を用いることで、近位尿細管細胞の成熟化マーカーであるＵＧＴ２Ａ３（図１２ａ）、ＡＺＧＰ１（図１２ｂ）、ＢＨＭＴ（図１２ｄ）、ＡＣＥ２（図１２ｅ）、ＡＱＰ６（図１２ｆ）、ＣＵＢＮ（図１２ｇ）、ＬＲＰ２（図１２ｈ）、ＡＢＣＢ１（図１２ｉ）、ＡＰＯＡ１（図１２ｊ）、ＡＰＯＣ３（図１２ｋ）、ＦＡＢＰ１（図１２ｎ）の発現量は、有意に低下した。ＳＬＣ３９Ａ４（図１２ｃ）およびＣＹＰ２７Ａ１（図１２ｌ）の発現量が低下する傾向が観察された。
　これらの結果は、ＰＰＡＲＡアンタゴニストが、成熟した近位尿細管細胞への早期の分化誘導を妨げ得ることを示す。

［比較例２］　ＲＸＲアンタゴニスト存在下での近位尿細管細胞の成熟化マーカーの発現量
　実施例２の工程Ｃ（分化誘導１５日目）にて、ＰＰＡＲＡアゴニストおよびＲＸＲアゴニストに代えて、ＲＸＲアンタゴニストであるＨＸ５３１を用いたことを除いて、実施例２に記載の腎臓オルガノイドの作製方法と実質的に同じ方法に従って、腎臓オルガノイドを作製した。作製した腎臓オルガノイドにおける近位尿細管マーカー遺伝子群の発現量を測定した。工程Ｃ（分化誘導１５日目）にて、ＨＸ５３１を加えていないＳＴＥＭｄｉｆｆ　ＡＰＥＬ２ｍｅｄｉｕｍ（０．２％ＤＭＳＯ、１％　ＰＦＨＭ　ＩＩ、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）で培養した群をＣｏｎｔｒｏｌとした。

（結果）
　所定濃度のＧＷ６４７１を用いることで、近位尿細管細胞の成熟化マーカーであるＵＧＴ２Ａ３（図１３ａ）、ＡＺＧＰ１（図１３ｂ）、ＳＬＣ３９Ａ４（図１３ｃ）、ＢＨＭＴ（図１３ｄ）、ＡＣＥ２（図１３ｅ）、ＡＱＰ６（図１３ｆ）、ＣＵＢＮ（図１３ｇ）、ＬＲＰ２（図１３ｈ）、ＡＢＣＢ１（図１３ｉ）、ＡＰＯＡ１（図１３ｊ）、ＡＰＯＣ３（図１３ｋ）、ＣＹＰ２７Ａ１（図１３ｌ）、およびＦＡＢＰ１（図１３ｎ）の発現量は、有意に低下した。
　これらの結果は、ＲＸＲアンタゴニストが、成熟した近位尿細管細胞への早期の分化誘導を妨げ得ることを示す。

　以上のとおり、比較例１および２の結果は、ＰＰＡＲＡアンタゴニストまたはＲＸＲアンタゴニストは、成熟した近位尿細管細胞への早期の分化誘導を妨げ得ることを示す。これらの結果は、ＰＰＡＲＡアゴニストおよびＲＸＲアゴニストの組合せが、腎臓オルガノイドにおいて、成熟した近位尿細管細胞への分化誘導を促進することを裏付ける。

［実施例９］　ピリニクス酸（ＷＹ１４６４３）存在下での腎臓オルガノイドの作製
　実施例２の工程Ｃ（分化誘導１５日目）にて、ＰＰＡＲＡアゴニスト（ＣＰ７７５１４６）およびＲＸＲアゴニスト（９ｃｉｓレチノイン酸）の組合せに代えて、ＰＰＡＰＡアゴニスト（ピリニクス酸）を用いたことを除いて、実施例２に記載の腎臓オルガノイドの作製方法と実質的に同じ方法に従って、腎臓オルガノイドを作製した。作製した腎臓オルガノイドにおける近位尿細管マーカー遺伝子群の発現量を測定した（ｎ＝３）。図１４は、ＰＰＡＰＡアゴニストであるピリニクス酸単独が近位尿細管マーカーの発現を増加させたことを示す。

　したがって、ＰＰＡＰＡアゴニスト（ピリニクス酸）にＲＸＲアゴニストを組合せることで、腎臓オルガノイドの作製において、近位尿細管細胞の成熟を促進することが期待される。

Claims

　腎臓オルガノイドを製造する方法であって、
　初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地を用いて培養することを含み、
　前記腎臓オルガノイドが成熟した近位尿細管細胞を含有する、方法。
　中間中胚葉細胞から前記初期腎オルガノイドを誘導することを更に含み、
　前記初期腎オルガノイドを誘導することが、前記中間中胚葉細胞を、繊維芽細胞増殖因子を含み、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂを用いて培養して、中間中胚葉スフェロイドを形成させること、及び
　前記中間中胚葉スフェロイドを、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａを用いて培養し、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含み、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂを用いて培養することを含む、請求項１に記載の方法。
　多能性幹細胞から前記中間中胚葉細胞を誘導することを更に含み、
　前記中間中胚葉細胞を誘導することが、前記多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む誘導培地Ａを用いて培養し、次いで、繊維芽細胞増殖因子を含み、ＲＸＲアゴニストを実質的に含まない誘導培地Ｂを用いて培養することを含む、請求項２に記載の方法。
　前記腎臓オルガノイドが、近位尿細管マーカーを発現し、
　前記近位尿細管マーカーが、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、及びＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で製造された、成熟した近位尿細管細胞を含有する腎臓オルガノイド。
　腎臓オルガノイドであって、
　前記腎臓オルガノイドが成熟した近位尿細管細胞を含有し、
　前記腎臓オルガノイドは、近位尿細管マーカーを発現し、
　前記近位尿細管マーカーが、ＵＧＴ２Ａ３、ＡＺＧＰ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＢＨＭＴ、ＡＣＥ２、ＡＱＰ６、ＣＵＢＮ、ＬＲＰ２、ＡＢＣＢ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＡＰＯＡ１、及びＳＰＡＲＣＬ１からなる群より選択される少なくとも１種である、腎臓オルガノイド。
　請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は請求項５又は６に記載の腎臓オルガノイドを、非ヒト哺乳動物の腎臓又はその周辺部位に導入することを含む、腎臓オルガノイドを腎臓又はその周辺部位に有する非ヒト哺乳動物を製造する方法であって、
　前記腎臓オルガノイドが成熟した近位尿細管細胞を含有する、方法。
　請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は請求項５又は６に記載の腎臓オルガノイドを、腎臓又はその周辺部位に有する、非ヒト哺乳動物。
　請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は請求項５又は６に記載の腎臓オルガノイドを含む、腎臓の損傷又は疾患を処置するための再生医療用組成物。
　被検物質に対する薬物応答性を評価する方法であって、
　請求項１～４のいずれか一項に記載の方法で製造された腎臓オルガノイド、又は請求項５又は６に記載の腎臓オルガノイド、請求項７に記載の方法で製造された非ヒト哺乳動物、又は請求項８に記載の非ヒト哺乳動物と、被検物質とを接触させること、及び
　前記被検物質に対する前記腎臓オルガノイド、又は前記非ヒト哺乳動物における薬物応答性を測定することを含む、方法。
　近位尿細管の成熟化を促進する方法であって、初期腎オルガノイドを、ＲＸＲアゴニスト及びＰＰＡＲアゴニストを含む培地を用いて培養することを特徴とする、方法。