KR20190007267A - 3d 프린팅 인공기관 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3D 프린팅 인공기관 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 환자 맞춤형 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포 및 인체유래 기관점막 상피세포를 이용하여 기관연골 및 기관점막의 재생이 가능한 인공기관 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 따른 인공기관 지지체는 연골 및 점막조직의 재생이 동시에 수반되는 우수한 효과가 있으므로, 이에 따라 기도의 기능 유지와 관련된 점막 재생 향상과 더불어 기관 통기도를 장기적으로 유지하여 지지체 이후 발생하는 재협착을 줄일 수 있다. 따라서 본 발명의 인공기관 지지체는 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 기관 결손 및 이와 관련된 질환 치료에 매우 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

Description

3D 프린팅 인공기관 지지체 및 이의 제조방법{3D printing artificial trachea scaffold and manufacturing method thereof}

본 발명은 3D 프린팅 인공기관 지지체 및 전결손 기관이식에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 환자 맞춤형 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포 및 인체유래 기관점막 상피세포를 이용하여 기관연골 및 기관점막의 재생이 가능한 인공기관 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

기도는 크게 상기도와 하기도로 나뉘는데, 상기도는 코, 구강, 인두, 후두로 이루어지며, 하기도는 기관, 기관지, 세기관지, 및 폐포 등으로 나뉜다. 기관(trachea)은 하기도가 시작되는 구역으로, 후두 바로 아래에서 시작하여 양측 주 기관지로 분지되기 전까지의 기도를 의미하며, 엄지손가락 굵기인 약 2cm 정도의 직경을 가진 관 모양이다. 이러한 기관은 연골, 점막하층, 점막층 구조를 이루고 있으며, 이 중 연골은 기관의 형태를 유지하는 역할을 수행하고 점막하층에는 기관 내부로 점액을 분비하는 분비선이 존재한다. 점막세포는 꼭대기에 섬모(cilia)가 부착되어 있는 컬럼 형태의 상피(columnar epithelium)와 배상세포(goblet cell), 기저세포(basal cell)로 이루어져 있다. 이 중 섬모는 배상세포에서 분비된 점액에 걸린 공기 속의 먼지나 세균, 바이러스를 외부로 배설하는 중요한 기능을 하여 폐렴을 예방하는 역할을 한다. 또한 점막 세포는 각종 수로(water channel)를 통해 기도에 수분을 공급하는 역할도 수행한다. 점막 세포는 점막하층과 바로 연결된 것이 아니고 기저막(basement membrane)으로 불리는 막 위에 부착이 되어 있으며, 이는 점막이 재생될 때 매우 필수적인 구조물로써 다양한 성분으로 구성되어 있다고 알려져 있다.

이러한 기관은 선천적인 원인 및 식생활 변화, 환경오염에 의해 발생빈도가 높아지고 있으며, 종양의 제거, 다양한 외상에 의한 기관 손상 등의 이유로 그 손상 빈도가 높아지고 있다. 또한 고령화 사회에 따른 노인 중증 환자들의 치료에 필수적인 인공호흡기 사용 빈도의 증가로 인해 기관 손상이 심각한 의료 문제로 대두되고 있다. 이를 해결하기 위해 최근 사망한 사람의 공여 조직을 손상 기관에 이식하는 방법이 보고되고 있지만 공여 조직을 구하기 어려울 뿐만 아니라, 공여조직을 구한다고 해도 오랜 기간에 걸쳐 복잡한 전처리 과정을 거쳐야 기관을 이식할 수 있는 문제가 있다.

최근 조직공학 분야에서는 인공구조체를 만들어 체내에 이식함으로써 우리 몸의 결손된 조직 및 기능을 향상 또는 복원하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 조직 이식용 인공구조체의 개발은 생체 조직공학의 발전에 따라 세포들이 3차원적으로 부착하고 배양될 수 있는 기능화된 조직을 제공하고 있고 신체 내 조직과 공존할 수 있는 생체적합성 물질로 이루어지며, 세포의 성장과 함께 구조체가 세포로 교체될 수 있도록 생분해적 성질과 적당한 기계적 강도를 보유하고 있어야 한다. 최근 생체조직 공학의 발달과 더불어 인체 조직의 재생을 위하여 더욱 정교하고 조직적으로 인공구조체를 제작하기 위한 여러 가지 기계 공학적 기술들이 사용되고 있다. 이에, 최근 인공구조체에 의한 기관 재건이 시도되어오고 있으나, 이식 후에 점막 재생이 신속히 되지 않아 호흡하는 공기를 통해 들어오는 세균 및 바이러스에 대한 염증에 취약하고 육아조직의 형성, 접합부의 분리, 주위 조직의 손상 및 재협착, 이식물의 탈락 등 여러 합병증이 발생할 가능성이 높아 임상적으로 적용하는 데는 많은 문제점이 남아 있다. 또한 손상된 기관 점막은 정상 부위 기관 점막에서 기저 세포가 이동 및 분화하여 재생되나 기존 지지체에서의 점막 분화 이동은 제한적이다. 더욱이 생분해성 기관지지체가 흡수되면서 기도의 직경이 줄어드는 문제점이 발생하며, 이를 해결하기 위해 기도의 직경를 유지해주는 기관연골재생이 중요하다. 따라서, 기도의 통기성을 유지하며, 점막재생을 향상시키는 기관 재생용 지지체 도관의 개발이 시급한 실정이다.

한국등록특허 10-1663150

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 기관 조직의 연골 및 점막 재생이 동시에 수반되는 인공기관 지지체 개발을 위해 예의 연구한 결과, 환자 맞춤형 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포 및 인체유래 기관점막 상피세포를 이용하여 효과적인 기관연골 및 기관점막의 재생이 가능한 3D 프린팅 인공기관 지지체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 3D 프린팅 인공기관 지지체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 인공기관 지지체의 제조방법을 제공한다.

(a) 고분자 물질을 이용해 튜브형 나노섬유관을 제조하는 단계;

(b) 고분자 물질을 열용융하여 섬유형태로 가공한 후 상기 나노섬유관 외측면에 분사하여 적층시켜 지지체를 제조하는 단계;

(c) 상기 지지체의 내부에 인체유래 기관점막 상피세포를 접종하는 단계; 및

(d) 상기 지지체의 외부에 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포를 도말하여 3차원 인공기관 지지체를 제조하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 인공기관 지지체를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 고분자 물질은 후코이단(fucoidan), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트 }(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리언하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트 {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}, 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트{poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 고분자 물질은 폴리카프로락톤(polycarprolactone)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유도만능줄기세포는 사람 모유두세포(Dermal Papilla cell)를 역분화시켜 제조한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 연골세포는 상기 유도만능줄기세포를 분화시켜 얻은 간엽줄기세포로부터 분화된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (a)는 전기방사법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단계 (d)는 연골세포와 마트리겔(Matrigel)을 1:1 비율로 혼합하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, (e) 상기 인공기관 지지체를 생물반응기(bioreactor)에서 1 내지 3일 동안 배양시킬 수 있다.

본 발명자들은 3D 프린팅 기술을 이용하여 환자 맞춤형 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포 및 기관점막 상피세포가 포함된 인공기관 지지체를 제조하였고, 상기 지지체를 기관이 360° 완전히 결손된 동물모델에 이식한 후 생물학적 효능을 평가한 결과 결손된 부위에서 신생연골이 재생되며, 점막조직 층이 재생되는 것을 확인하였는바, 본 발명의 따른 인공기관 지지체는 연골 및 점막조직의 재생이 동시에 수반되는 우수한 효과가 있으므로, 이에 따라 기도의 기능 유지와 관련된 점막 재생 향상과 더불어 기관 통기도를 장기적으로 유지하여 지지체 이후 발생하는 재협착을 줄일 수 있다. 또한 시간의 경과에 따라 이식된 인공기관 지지체가 분해된 이후 재생된 연골 및 점막층이 기도를 대체하는 것을 기대해 볼수 있다. 따라서 본 발명의 인공기관 지지체는 조직공학 및 재생의학 분야에서 기관 결손 및 이와 관련된 질환 치료에 매우 유용하게 활용될 것으로 기대된다.

도 1은 주사전사현미경을 통해 본원발명의 3D 프린팅 인공기관 지지체의 내부 및 외부의 표면을 관찰한 결과이다.
도 2a 및 도 2b는 사람 모유두세포 유래 유도만능줄기세포의 전분화능을 검증하기 위한 것으로, 도 2a는 모유두세포로부터 역분화시킨 유도만능줄기세포를 현미경으로 관찰한 결과이고, 도 2b는 면역형광염색을 실시하여 상기 유도만능줄기세포에서 줄기세포능 마커인 Oct4, SSEA4, 및 Nanog의 발현을 나타내는 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 상기 유도만능줄기세포(DP-iPS) 유래 간엽줄기세포로부터 분화시킨 연골세포에 대하여 연골세포 특이 유전자의 발현을 검증하기 위한 것으로, 도 3a는 면역형광염색을 통해 SOX9 및 Aggrecan의 발현을 나타내는 결과이고, 도 3b는 real-time PCR을 통해 Collagen II, Aggrecan, 및 Sox9의 발현수준을 나타내는 결과이다.
도 4는 본원발명의 3D 인공기관 지지체의 내부 및 외부 표면에 각각 인체유래 기관점막 상피세포주 및 DP-iPS로부터 분화시킨 연골세포를 도말하는 방법을 그림으로 도시한 것이다.
도 5는 기관을 절단하여 결손시킨 토끼모델에 본원발명의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte) 및 콜라겐이 코팅된 인공기관 지지체(Col)를 이식한 모습을 보여주는 사진이다.
도 6은 각각의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte 및 Col)를 토끼모델에 이식하고 4주 후 내시경으로 이식한 부위를 보여주는 사진이다.
도 7은 각각의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte 및 Col)를 토끼모델에 이식하고 4주 후 Micro-CT 영상 분석 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 각각의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte 및 Col) 이식에 의한 기관연골 재생 정도 및 분포를 관찰하기 위하여 사프라닌 O(Safranin O) 염색을 실시한 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 각각의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte 및 Col) 이식에 의한 기관점막 재생 정도를 평가하기 위한 것으로, 도 9a는 알시안블루(Alcian blue) 조직 염색을 실시한 결과이고, 도 9b는 면역형광염색을 실시하여 Keratin-5과 β-tublin 단백질의 발현여부를 보여주는 결과이다.

본 발명은 환자 맞춤형 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포 및 인체유래 기관점막 상피세포를 이용하여 기관연골 및 기관점막의 재생이 가능한 3D 프린팅 인공기관 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 인공기관 지지체의 제조방법을 제공한다.

(a) 고분자 물질을 이용해 튜브형 나노섬유관을 제조하는 단계;

(b) 고분자 물질을 열용융하여 섬유형태로 가공한 후 상기 나노섬유관 외측면에 분사하여 적층시켜 지지체를 제조하는 단계;

(c) 상기 지지체의 내부에 인체유래 기관점막 상피세포를 접종하는 단계; 및

(d) 상기 지지체의 외부에 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포를 도말하여 3차원 인공기관 지지체를 제조하는 단계.

이하, 각 단계에 대하여 상세히 설명하고자 한다.

상기 단계 (a)는, 고분자 물질을 이용해 인공기관 지지체의 내부를 제조하기 위한 단계로서, 고분자 물질에 대하여 전기방사법을 통해 튜브형 나노섬유관을 제조할 수 있다.

상기 고분자 물질은 후코이단(fucoidan), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트 }(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리언하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트 {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}, 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트 {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리카프로락톤(polycarprolactone)일 수 있으나, 상기 물질과 유사한 특성을 갖는 고분자 물질이라면 이에 제한되지 않는다.

상기 단계(b)는, 단계(a)에서와 동일한 고분자 물질을 이용해 3D 프린팅 기법을 이용하여 이루어지며, 고분자 물질을 3D 프린터에 주입하고 열용융시키면서 가압하여 분사노즐을 통해 단계(a)에서 제조한 나노섬유관의 외측면에 분사하여 적층시킴으로써 지지체 층을 형성할 수 있다.

상기 단계(c)는, 상기 단계(a) 및 (b)를 통해 제조된 지지체의 내부에 인체유래 기관점막 상피세포를 접종하는 단계로서, 상기 세포를 피펫을 이용해 상기 지지체의 내부에 접종하여 이루어지며, 접종하는 세포의 수는 지지체의 크기에 따라 당업자가 적절히 조절하여 선택할 수 있다.

상기 단계(d)는, 상기 단계(a) 및 (b)를 통해 제조된 지지체의 외부에 연골세포를 도말하는 단계로서, 상기 연골세포는 유도만능줄기세포를 간엽줄기세포로 1차 분화시킨 후 상기 간엽줄기세포를 분화시켜 얻어진 것으로, 연골조직에서 직접 연골세포를 채취하는 경우 얻을 수 있는 연골세포의 수가 한정적이라는 단점이 있는 반면, 유도만능줄기세포를 간엽줄기세포로 분화시키고 이를 다시 연골세포로 분화시키는 과정을 통해 세포 수를 증가시켜 많은 수의 연골세포를 확보할 수 있다는 장점이 있다.

상기 연골세포는 마트리겔과 1:1의 동일한 비율로 혼합한 후 상기 지지체의 외부에 고르게 도말하고, 상기 연골세포가 고르게 부착될 수 있도록 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 1~3시간, 보다 바람직하게는 2시간 동안 반응시켜 연골세포가 부착된 지지체를 제조할 수 있다. 또한, 상기 연골세포 도말에서 마트리겔 대신 젤라틴, 알지네이트, 콜라겐, 히알루론산, 피브리노겐, 셀룰로오스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트 등의 천연고분자를 원료로 한 하이드로겔을 대체하여 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 일반적인 세포 배양배지인 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 이용할 수 있고, 상기 인큐베이터에서 반응시킨 후 동일한 배양배지를 추가로 넣어준 후 1~3일, 보다 바람직하게는 2일 동안 바이오리액터에서 배양하는 과정을 통해 지지체의 내부 및 외부에 점막 상피세포 및 연골세포가 부착된 인공기관 지지체를 제조할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 역분화 줄기세포로써 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌린, 배아 줄기세포처럼 만능성을 유도해낸 세포를 의미한다. 본 발명에서는 사람의 모유두세포를 채취하여 이를 역분화시키는 방법을 통해 유도만능줄기세포를 제조하였으나, 상기 유도만능줄기세포로의 역분화가 가능한 인체유래 세포라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 실시예를 통해 상기 방법에 따라 제조한 인공기관 지지체의 생물학적 효능을 평가하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 건강한 토끼의 기관을 1.5 cm 간격으로 전결손시킨 후 상기 인공기관 지지체를 봉합하여 이식하였다(실시예 4-2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 인공기관 지지체 및 비교군인 콜라겐이 코팅된 인공기관 지지체를 이식하고 4주 후 내시경 분석을 실시한 결과 두 그룹 모두에서 기관 협착이 거의 보이지 않은 것을 확인하였고(실시예 5-1 참조), Micro-CT 영상 분석을 실시한 결과 본 발명의 인공기관 지지체를 이식한 경우에서만 결손부위 중앙부로부터 재생된 연골을 관찰하였다(실시예 5-2 참조). 또한, 보다 상세히 기관연골의 재생 정도 및 분포를 검증하기 위해 사프라닌 O 염색을 실시하여 본 발명의 인공기관 지지체의 이식에 따른 신생 연골조직 생성을 확인하였다(실시예 5-3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 알시안블루 조직 염색을 실시하여 기관점막 재생 정도를 평가한 결과, 본 발명의 인공기관 지지체를 이식한 그룹에서만 재생된 점막조직 층 및 뮤신 발현을 확인하였으며, 면역형광염색을 통해 기관 점막층을 구성하는 기저세포에서 발현되는 Keratin-5 및 점막 섬모세포에서 발현되는 β-tublin 단백질의 발현을 확인하였다(실시예 5-4 참조).

상기 실시예 결과를 통해, 본 발명에 따른 인공기관 지지체는 연골 및 점막 조직의 재생이 동시에 일어나는 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.

이에, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된, 인공기관 지지체를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 3D 프린팅 인공기관 지지체의 제조

본 발명자들은 전기방사법과 3D 프린팅 기법을 혼합하여 인공기관 지지체를 제조하였다. 구체적으로, 먼저 지지체 내부를 제조하기 위하여 폴리카프로락톤(PCL)을 이용해 전기방사법(electrospining; 전압, 20 kv; 방사거리, 15 cm; 니들게이지, 22 G)으로 튜브형 나노섬유관을 제조하였다. 지지체 외부는 3D 프린팅 기법을 이용하여 PCL 마이크로파이버 가닥을 일정한 간격으로 적층하여 제조하였다. 보다 상세하게, 3D 프린터(3D Bio-SPS)에 PCL을 주입한 후 용융시키면서 가압하여 분사노즐을 통해 PCL 가닥(strand)이 나노섬유관의 외측면에 분사되도록 하여 적층시킴으로써 스캐폴드 층을 형성하였다.

상기 방법으로 제조한 나노섬유가 포함된 3D 프린팅 인공기관 지지체의 내외부 표면을 관찰하기 위해, 주사전자현미경(SEM; Model S-3000N, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 지지체 외부표면의 경우 평균 200 um 굵기의 PCL 마이크로섬유 가닥이 일정한 간격으로 적층되어 있는 것을 관찰하였다. 이는 PCL의 우수한 물성과 섬유의 특성을 더하여 체내에 이식된 인공기관 지지체가 목 운동시 장시간 기능을 유지할수 있도록 유연성을 제공한다. 또한, 지지체 내부 표면은 PCL 나노섬유가 균일하게 코팅된 형태를 관찰하였다. 기관점막세포의 생착과 채내 이식시 주변 점막조직의 재생을 촉진시키는 역할을 한다.

실시예 2. 모유두세포 유래 유도만능줄기세포의 전분화능 확인

본 발명자들은 사람의 머리카락의 근원세포인 모유두세포(Dermal Papilla cell; DP)에서 유도한 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)가 전분화능을 갖는지 확인하기 위하여 면역형광염색을 실시하여 Oct4, Sox2, 및 SSEA4 유전자의 발현여부를 검증하고자 하였다.

이를 위해, 마트리겔(Matrigel)(Corning)을 코팅한 35 mm glass bottom dish에서 4일 동안 배양한 iPSC를 1X PBS로 씻어내고, 상기 세포에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 처리하여 실온에서 8분간 고정시켰다. 고정된 세포를 다시 1X PBS를 이용해 3분 간격으로 2번 씻어낸 후 블로킹(Blocking) 용액(1% 우태아혈청(Bovine serum albumin; BSA), 0.1% Triton X-100 in 1X PBS)을 처리하고 실온에서 30분간 블로킹 과정을 실시하였다. 이후 다시 한 번 1X PBS로 상기 세포를 씻어내고 Oct4, Nanog, 및 SSEA4에 특이적인 항체(Santa cruz)를 antibody diluent solution(Thermo fisher)에 1:100으로 희석하여 세포에 처리한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 상기 1차 항체를 처리했던 세포를 1x PBS로 3회 씻어내고, 형광이 접합된 2차 항체(Alexa fluor 488, 555)를 1:200으로 희석하여 세포에 처리한 후 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 1X PBS로 다시 세포를 3회 씻어낸 다음 세포핵을 염색하기 위해 DAPI를 1:10000의 비율로 처리하여 3분 동안 실온에 두었다. 이어서 1X PBS로 간단히 세포를 씻어낸 후, 공초점 현미경(LSM710, Zeiss)으로 세포를 관찰하고 형광 이미지를 촬영하였다. 그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 모유두세포로부터 유도만능줄기세포가 성공적으로 유도된 것을 확인하였고, 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이, 줄기세포능 마커인 Oct4, SSEA4, 및 Nanog가 상기 모유두세포에서 역분화시킨 유도만능줄기세포에서 높게 발현되고 있음을 확인하였다.

실시예 3. 유도만능줄기세포(DP-iPSC)로부터 연골세포로의 분화

3-1. DP-iPSC 유래 간엽줄기세포로부터 연골세포로의 분화 유도

본 발명자들은 모유두세포에서 역분화시킨 유도만능줄기세포(DP-iPSC)를 연골세포(chondrocyte)로 분화시키고자 하였으며, 이러한 과정에서 상기 DP-iPSC를 직접적으로 연골세포로 분화시키지 않고, 1차적으로 간엽줄기세포로 분화시킨 후 상기 간엽줄기세포를 연골세포로 분화시키고자 하였다.

이를 위해, DP-iPSC로부터 분화시킨 간엽줄기세포에 0.25% 트립신-EDTA를 처리하여 배양접시로부터 떼어낸 후 15㎖ 튜브에 옮겨 원심분리기에서 1200rpm, 4℃의 조건으로 3분 동안 원심분리하였다. 다음으로 상층액을 제거하고, MSC-GM(Lonza) 배지로 펠렛을 재현탁 시킨 후 2.5 x 10⁵개씩 15 ㎖ 튜브에 분주하였다. 이어서 상기와 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 세포를 침강시킨 후 상층액을 제거하고 연골세포 분화배지(chondrocyte differentiation media)(R&D systems) 500 ㎖로 세포 펠렛을 재현탁하였다. 이후 다시 한 번 200 x g, 실온 조건에서 5분 동안 원심분리를 진행한 후 공기 순환을 위해 15 ㎖ 튜브의 뚜껑을 조금 열어두고 튜브를 세워서 37℃ 인큐베이터에서 28일간 배양하였다. 1~2일 후 직경 1 mm~2 mm정도의 round ball이 생기는 것을 관찰하였으며, 배지는 2~3일에 한번 씩 갈아주었다.

3-2. 분화된 연골세포에 대한 면역형광염색 분석

상기 실시예 3-1의 방법에 따라 28일 동안 배양하여 분화시킨 연골세포에 대하여 면역형광염색을 실시하여 연골세포 특이 유전자의 발현여부를 분석하고자 하였다. 이를 위해, 1X PBS로 2회 씻어내고, 4% 파라포름알데히드를 처리하여 8분 동안 상기 세포를 고정시켰다. 이후 1X PBS로 고정시킨 세포를 2회 씻어내고, OCT 몰드에 OCT compound(sakura)와 함께 연골세포를 드라이아이스 위에서 굳혔다. 굳힌 OCT 샘플을 cryotome(Leica)으로 깎아 슬라이드 글라스에 붙이고, 1X PBS로 씻어내어 OCT를 녹인 후 연골세포가 붙어있는 주위에 Dako 펜으로 소수성의 벽(hydrophobic barrier)을 그려주었다. 다음으로 상기 연골세포에 permeabilization buffer(0.5% Triton X-100, 0.68 μM EDTA in 1X PBS)를 처리하고 실온에서 15분간 반응시킨 후 블로킹 용액(5% horse serum, 0.02% sodium azide in 1X PBS)을 처리하고 실온에서 45분간 블로킹 과정을 실시한 다음 SOX9 및 Aggrecan에 대한 1차 항체를 antibody diluents solution(Thermo fisher)을 이용해 1:50으로 희석하여 처리하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 반응시킨 연골세포를 1X PBS로 3회 씻어낸 다음 블로킹 용액에 형광이 접합된 2차 항체(Alexa fluor 488, 555)를 1:100으로 희석하여 핵 염색을 위한 DAPI 용액(1:1000)과 함께 넣고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이어서 1X PBS로 다시 3회 씻어낸 후 슬라이드의 물기를 최대한 제거하고 마운팅 용액(Dako)을 한 방울 떨어트리고 커버글라스를 덮은 후 공초점 현미경으로 이미지를 촬영하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 분화된 연골세포에서 SOX9 및 Aggrecan이 발현되는 것을 확인하였다.

3-3. 분화된 연골세포의 유전자 발현 분석

상기 실시예 3-1의 방법에 따라 분화시킨 연골세포에 대하여 연골세포 특이 유전자의 발현여부를 검증하고자 하였다. 이를 위해, 분화시킨 연골세포를 모아 원심분리기로 침강 시킨 후 상층액을 제거하고, Trizol reagent(Ambion)를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 다음으로, 추출한 RNA를 cDNA로 역전사 시킨(TOYOBO) 후 SYBR Green master mix(Roche)를 이용하여 real-time PCR(Applied bio systems)을 실시해 연골세포 특이 유전자인 Collagen type II alaph 1(Collagen II), Aggrecan, 및 Sox9의 유전자 발현을 확인하였다. 본 실험에서 이용한 각 유전자에 대한 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

실험 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3-2의 결과와 일치하게 Collagen II, Aggrecan, 및 Sox9의 발현이 분화 전 세포인 간엽줄기세포(MSC)에 비하여 연골세포에서 증가된 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통해 모유두세포에서 역분화시킨 유도만능줄기세포 유래 간엽줄기세포로부터 연골세포가 효과적으로 분화된 것을 알 수 있었다.

	서열(5‘-3’)	서열번호
Sox9	(Forward) GACTTCCGCGACGTGGAC	1
	(Reverse) GTTGGGCGGCAGGTACTG	2
Collagen type II	(Forward) GGCAATAGCAGGTTCACGTACA	3
	(Reverse) CGATAACAGTCTTGCCCCACTT	4
Aggrecan	(Forward) TCGAGGACAGCGAGGCC	5
	(Reverse) TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA	6
18S RNA	(Forward) GGCCCTGTAATTGGAATGAGTC	7
	(Reverse) CCAAGATCCAACTACGAGCTT	8

실시예 4. 3D 프린팅 인공기관 지지체의 생체이식

4-1. 세포 도말

상기 실시예 1에서 제조한 3D 프린팅 인공기관 지지체를 생체 내에 이식하기 위해, 이식 전 두 가지 타입의 세포를 스캐폴드 내외부 표면에 각각 접종하였다. 보다 구체적으로, 지지체 내부에는 기관점막의 재생을 위해 인체유래 기관점막 상피세포주(Human bronchial epithelial cells; hBEC)를 5x10⁵ cells/cm² 농도로 피펫을 이용해 접종하였고, 지지체 외부표면에는 상기 실시예 3에서 분화 유도된 연골세포를 동일한 농도로 Matrigel^®에 1:1 비율로 혼합한 후 고르게 도말하였다. 이때 배지는 10% FBS가 함유된 DMEM을 사용하였으며, 세포가 고르게 부착되도록 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 유지시켰다. 이후 새로운 배양액을 추가로 넣어준 뒤, 2일 동안 바이오리액터에서 배양하였다. 도 4에 인공기관 지지체 내외부 표면에 두 가지 세포의 도말방법을 도시하였다.

이때, 본원발명의 3D 프린팅 인공기관 지지체의 생물학적 효능을 평가하기 위하여, 대표적 천연고분자인 콜라겐(Collagen)이 코팅된 3D 프린팅 지지체를 제조한 후 비교예로 사용하였다. 제조과정은 3차 증류수에 50 μg/ml 농도로 녹인 콜라겐 희석용액에 3D 프린팅 지지체를 침지하여 37℃ 배양기에서 24시간 동안 정치한 후 24시간 동안 동결 건조를 통해 콜라겐이 코팅된 3D 프린팅 인공기관 지지체를 제조하였다.

4-2. 세포가 부착된 3D 인공기관 지지체의 생체 이식

상기 4-1의 방법으로 2종의 세포를 도말하여 부착한 본 발명의 3D 인공기관 지지체를 생체에 이식한 후 생물학적 효능을 평가하기 위해, 실험동물로써 건강한 토끼(male, 2.5～3kg)의 기관을 수직방향으로 360° 절단한 모델을 이용하였다. 상기 실험동물을 틸레타민/졸라제팜(tiletamine/zolazepam)(10 mg/kg; Zoletil 50, Virbac Laboratories, France)과 2% 럼픈(xylazine hydrochloride)(2 mg/kg, Rumpun, Byely Co., Korea)으로 마취시키고, 토끼의 경부 정중앙 절개를 통해 노출한 기관을 1.5 cm 간격으로 전결손시킨 후 제작된 지지체 (길이, 1.5 cm)의 양쪽말단을 절단된 기관조직과 3 mm 간격으로 촘촘히 봉합하여 이식하였다. 이식 후 생리식염수를 부어 공기가 새지 않는지 확인하였으며, 도 5에 각 그룹별로 상기 인공기관 지지체가 이식된 모습을 나타내었다.

실시예 5. 3D 프린팅 인공기관 지지체의 생물학적 효능 분석

5-1. 내시경 분석

상기 실시예 4의 방법에 따라 인공 기관지지체를 토끼모델에 이식하고 4주 후에 기관 내시경을 실시하였다. 졸레틸을 이용해 토끼모델을 전신 마취시키고, 리도카인(Lidocaine)을 통해 성대마취를 유도한 후 내시경관을 기관지내로 삽입하였다. 내시경 분석 결과, 도 6의 인공기관이 이식된 말단부위 이미지에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 3D 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte) 및 콜라겐을 코팅한 인공기관 지지체(Col)를 이식한 그룹 모두에서 기관 협착이 거의 보이지 않았으며, 지지체와 봉합된 기관 조직 간의 경계면이 매끄러운 것으로 보아 스캐폴드 내로 조직세포와의 통합이 원활히 이루어진 것으로 판단되었다. 그러나 스캐폴드 중앙부분으로 갈수록 본래 기관조직과 색깔의 구분이 뚜렷해지며 간헐적인 육아종 (granuloma) 형성이 관찰되었고, 육안으로 지지체 표면이 건조된 상태로 관찰되었는데 이는 점막조직의 재생이 지지체 중앙부까지 이루어 지지 않은 것으로 보였다.

5-2. Micro-CT 영상 분석

인공기관 지지체 이식 후 결손부위 내 재생된 연골의 3차원적 분포를 확인하기 위해, 상기 실시예 5-1에서와 동일하게 인공기관 지지체를 이식하고 4주 후에 micro-CT 영상 분석을 실시하였다. 구체적으로, Micro-CT 영상장비 스캐너(NFR Polaris-G90; NanoFocusRay, Jeonju, Korea)로 실험동물의 기관 이식부위의 3차원 영상데이터(해상도, 512 x 512)를 확보하였으며, Micro-CT 이미지 소프트웨어(Lucion; Infinitt Healthcare, Seoul, Korea)를 통해 3D 영상 이미지를 출력하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 3D 이미지 상에서 흰색으로 보이는 연골링 중앙부에 잘라나간 결손부위가 두 그룹 모두 명확히 관찰되었으며, 콜라겐이 코팅된 인공기관 지지체(Col)와 비교하여 본 발명의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte)를 이식한 그룹에서는 결손부위 중앙부로부터 재생된 연골의 모습이 관찰되었다.

5-3. 기관연골 재생 평가

인공기관 지지체를 이식한 각 그룹 간의 연골재생 정도 및 분포를 관찰하기 위해, 사프라닌 O(safranin O) 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 콜라겐이 코팅된 인공기관 지지체(Col)를 이식한 그룹에서는 신생연골의 재생이 거의 관찰되지 않았으며, 육아조직(granulation tissue)만이 간헐적으로 관찰되었다. 반면 본 발명의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte)를 이식한 그룹에서는 붉은색으로 발현되는 신생 연골조직이 뚜렷이 관찰되었다. 이는 유도만능줄기세포로부터 분화된 연골세포가 연골재생에 효과적임을 알 수 있는 결과이다. 아마도 유도만능줄기세포 분화된 연골세포의 직간접적인 근거리분비 효과(paracrine effect)로 인해 신생연골의 재생에 영향을 주었을 것으로 판단된다.

5-4. 기관점막 재생 평가

인공기관 지지체를 이식한 각 그룹 간의 기관점막 재생 정도를 관찰하기 위해, 알시안블루(Alcian blue) 조직 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 콜라겐이 코팅된 인공기관 지지체(Col)를 이식한 그룹에서는 점막층의 재생이 전혀 관찰되지 않은 반면, 본 발명의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte)를 이식한 그룹에서 재생된 점막조직 층이 관찰되었으며, 뮤신(mucin)의 발현(파란색)이 다수 관찰되었다. 상기 결과는 본 발명의 인공기관 지지체 내부에 도말한 기관점막세포의 생물학적 효능 즉, 사이토카인 분비 및 근거리분비 효과에 기인한 것으로 판단된다.

상기 결과에 더하여, 기관점막 재생을 보다 특이적인 방법으로 확인하기 위해, Keratin-5과 β-tublin 항체를 이용하여 면역형광염색을 실시하였다. 이때, 비특이적인 반응을 억제하기 위해 절편한 조직 슬라이드를 블로킹 용액(3% BSA in PBS)에 1시간 동안 반응시켰으며, 1차 항체인 anti-Keratin-5(abcam)와 anti-β-tubulin(Leinco Technologies, Inc.)을 각각 처리하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 다음날 2차 항체(Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG; Invitrogen, USA)와 (Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG; Molecular Probes, USA)를 상기와 동일한 블로킹 용액에 1:500으로 희석하여 각각 처리하였으며, 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 핵 염색을 실시한 후 마운팅하고 형광현미경을 통해 관찰하였다. 그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인공기관 지지체(iPS-Chondrocyte)를 이식한 경우 기관 점막층을 구성하는 세포인 기저세포에서 발현하는 Keratin-5 단백질이 재생된 점막층 주변부에서 붉은색으로 강하게 발현되는 것이 관찰되었다. 또한, 녹색 형광을 통해 점막 섬모세포(ciliated cell)에서 발현되는 β-tublin 단백질이 강하게 발현되는 것을 확인하였다. 반면 세포가 이식되지 않는 콜라겐으로 코팅된 인공기관 지지체(Col)를 이식한 비교군에서는 점막조직에 특이적으로 발현하는 Keratin-5와 β-tublin이 거의 관찰되지 않았다. 이는 지지체 내부에 이식된 기관점막세포가 점막조직의 재생에 매우 효과적인 영향을 주고 있음을 보여주는 결과이다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL KOREA INSTITUTE OF MACHINERY & MATERIALS <120> 3D printing artificial trachea scaffold and manufacturing method thereof <130> MP16-346 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9_Forward <400> 1 gacttccgcg acgtggac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9_Reverse <400> 2 gttgggcggc aggtactg 18 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type II_Forward <400> 3 ggcaatagca ggttcacgta ca 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type II_Reverse <400> 4 cgataacagt cttgccccac tt 22 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan_Forward <400> 5 tcgaggacag cgaggcc 17 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan_Reverse <400> 6 tcgagggtgt agcgtgtaga ga 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S RNA_Forward <400> 7 ggccctgtaa ttggaatgag tc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S RNA_Reverse <400> 8 ccaagatcca actacgagct t 21

Claims (9)

1. 하기의 단계를 포함하는, 인공기관 지지체의 제조방법:
   (a) 고분자 물질을 이용해 튜브형 나노섬유관을 제조하는 단계;
   (b) 고분자 물질을 열용융하여 섬유형태로 가공한 후 상기 나노섬유관 외측면에 분사하여 적층시켜 지지체를 제조하는 단계;
   (c) 상기 지지체의 내부에 인체유래 기관점막 상피세포를 접종하는 단계; 및
   (d) 상기 지지체의 외부에 유도만능줄기세포로부터 분화시킨 연골세포를 도말하여 3차원 인공기관 지지체를 제조하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 고분자 물질은 후코이단(fucoidan), 콜라겐(collagen), 알지네이트(alginate), 키토산(chitosan), 히알루론산(hyaluronic acid), 실크(silk), 폴리이미드(polyimides), 폴리아믹스 산(polyamix acid), 폴리카프로락톤(polycarprolactone), 폴리에테르이미드(polyetherimide), 나일론(nylon), 폴리아라미드(polyaramid), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리벤질글루타메이트(poly-benzyl-glutamate), 폴리페닐렌테레프탈아마이드(polyphenyleneterephthalamide), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리아크릴로나이트릴(polyacrylonitrile), 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로오스(cellulose), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate), 폴리락산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리락산과 폴리글리콜산의 공중합체(PLGA), 폴리{폴리(에틸렌옥사이드)테레프탈레이트-co-부틸렌테레프탈레이트 }(PEOT/PBT), 폴리포스포에스터(polyphosphoester; PPE), 폴리포스파젠(PPA), 폴리언하이드라이드(Polyanhydride; PA), 폴리오르쏘에스터 {poly(ortho ester; POE}, 폴리(프로필렌푸마레이트)-디아크릴레이트 {poly(propylene fumarate)-diacrylate; PPF-DA}, 및 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트 {poly(ethylene glycol) diacrylate; PEG-DA}로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 고분자 물질은 폴리카프로락톤(polycarprolactone)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 유도만능줄기세포는 사람 모유두세포(Dermal Papilla cell)를 역분화시켜 제조한 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 연골세포는 상기 유도만능줄기세포를 분화시켜 얻은 간엽줄기세포로부터 분화된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 단계 (a)는 전기방사법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 단계 (d)는 연골세포와 마트리겔(Matrigel)을 1:1 비율로 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
8. 제1항에 있어서,
   (e) 상기 인공기관 지지체를 생물반응기(bioreactor)에서 1 내지 3일 동안 배양시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 인공기관 지지체.

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