CN109689071A

CN109689071A - 肺上皮工程中的人气道干细胞

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Publication number: CN109689071A
Application number: CN201780044011.1A
Authority: CN
Inventors: S·E·吉尔平; H·C·奥特
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2017-05-04
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2037-05-04
Also published as: WO2017200762A3; AU2017268078A1; WO2017200762A2; CN109689071B; CA3024424A1; KR102362222B1; EP3458076A4; KR20190009329A; JP2019519217A; AU2017268078B2; EP3458076A2; JP6840774B2

Abstract

在肺上皮工程中使用人气道干细胞的方法，任选地其中所述细胞与γ分泌酶抑制剂接触；由此产生的生物人工气道器官，和其用途，例如用于移植。以及用生腱蛋白‑C和/或肌原纤蛋白2处理生物人工基质的方法。

Description

肺上皮工程中的人气道干细胞

优先权声明

本申请要求2016年5月16日递交的美国临时专利申请系列号62/337,041；2016年11月23日递交的62/426,146和2017年4月10日递交的62/483,760的权益。将前述的全部内容引入于此以作参考。

联邦政府资助的研究或开发

本发明是在国立卫生研究院授予的基金号OD008749和HL108678下由政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本文提供了在肺上皮工程中使用人气道干细胞的方法，任选地其中细胞与γ分泌酶抑制剂接触；由其产生的生物人工气道器官，和其用途，例如用于移植。

背景技术

肺移植代表许多经历以肺衰竭为典型的病症例如慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维化病、肺动脉高压、肺癌、和先天性肺病等的患者的最后希望。肺移植的典型等待时间可以是2年以上，导致等待名单上的那些人的30％死亡率。移植用工程化器官的技术的发展可最终提供终末期器官衰竭的解决方案而没有排斥的风险。

发明内容

在全器官灌注去细胞化的过程的基础上，本发明人旨在利用原代人供体肺组织来源的细胞再殖入(repopulate)和再生天然肺支架。

如本文所示，分离增殖性基底上皮干细胞群并在培养物中扩增，并实现啮齿动物和人肺细胞外基质(ECM)二者的强的再细胞化(recellularization)。在体外和离体的全啮齿动物肺再细胞化和仿生培养中均显示向纤毛气道上皮表型的分化。通过借由γ-分泌酶抑制Notch通路来实现远端上皮表型的诱导。在人ECM切片培养和在全啮齿动物肺培养中，通过体外mRNA分析表明增加的表面活性蛋白(surfactant protein)-B和C表达。分离的人肺叶的再细胞化，与延长的离体仿生培养相结合，进一步证实该细胞群的再生能力。再细胞化的肺构建体的功能分析证实整个培养中的细胞生存力和代谢活性、以及动态器官顺应性和气体交换。在最终组织分析中，观察到生理组织结构和形态的广泛再上皮化。

这些结果表明人气道干细胞的再生潜力和双谱系能力，这可用于整个肺组织生物工程和离体器官培养。

另外，评价从在源自新生儿(年龄<1周)或成人肺供体(每组n＝3个供体)的无细胞ECM上培养的成人肺组织分离的基底上皮干细胞(BESC)的行为。发现细胞增殖和存活的显著差异。进行肺支架的深入蛋白质组学分析，从而量化新生儿ECM中显著富含的蛋白质，并识别糖蛋白肌原纤蛋白-2(FBN-2)和生腱蛋白-C(TN-C)作为观察到的效果的潜在介质。在补充有FBN-2和/或TN-C的、胶原蛋白IV型涂布的板上培养的BESC显示显著增加的增殖和减少的细胞衰老；(注意该差异也在与未处理的板(无胶原蛋白IV型涂层)比较时发现。)未观察到上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition)的显著增加。在FBN-2和/或TN-C的情况下体外伤口闭合也增加。在再上皮化前用FBN-2和/或TN-C预处理的去细胞化的肺支架支持更大的上皮增殖和组织重建。离体肺培养3和7天后，在处理的肺支架上BESC分布、基质对齐(matrixalignment)和整体组织形态得到改善。这些结果表明支架再上皮化在新生儿肺ECM上增强，并且向天然支架补充FBN-2和TN-C是肺组织再生的有价值的工具。

因此，本文提供的是提供生物人工肺器官的方法。该方法包括提供来自人供体的增殖性基底干细胞群，其中细胞为Krt5⁺p63⁺细胞，优选从供体的气道获得；任选地将培养物中的细胞维持并扩增至多5次传代(例如其中细胞在60-100％、例如80％的汇合下传代)，任选地在不存在ROCK抑制剂的情况下；提供(无细胞)肺组织基质(lung tissue matrix)，其包括气道和丰富血管系统(substantial vasculature)；通过气道用干细胞接种肺组织基质，通过血管系统用内皮细胞接种肺组织基质；和在足以在气道和功能性血管系统中形成功能性上皮的条件下维持基质，其中维持基质包括使用包含notch抑制剂例如γ分泌酶抑制剂的液体培养基给肺组织基质提供足以发生第一期望程度的器官成熟、从而生成湿式成熟器官的时间的湿式通气；和任选地在湿式通气期间在器官室内维持基本上恒定的流体水平。

在一些实施方案中，器官室包括各自由控制模块控制的室压传感器和双向排出室泵(bi-directional drainage chamber pump)，所述控制模块响应于由室压传感器传输的数据来控制双向排出泵。

在一些实施方案中，所述方法包括通过平衡静脉线(venous line)中的压力水平与培养基储存器(media reservoir)中的压力水平来防止跨肺压力梯度。

在一些实施方案中，器官室进一步包含与器官室连接的气动压力控制模块，其中气动压力控制模块：在吸气阶段在器官室中产生负压；对于平台阶段维持器官室的压力；和在呼气阶段在器官室中产生正压。

在一些实施方案中，湿式通气包括将气管线与培养基储存器连接，其中气管线包括与控制器连接的双向气管泵；使用双向气管泵用培养基使肺组织基质充胀(inflating)；和使用双向气管泵从肺组织基质抽出培养基来使肺组织基质收缩(deflating)，其中培养基在湿式通气期间持续更新。

在一些实施方案中，湿式通气包括将气管线与培养基储存器连接，其中气管线包括各自与控制器连接的第一泵和第二泵；使用第一泵用培养基使肺组织基质充胀；和使用第二泵从肺组织基质抽出培养基来使肺组织基质收缩，其中培养基在湿式通气期间持续更新。在一些实施方案中，控制器响应于与气管线连接的气管压力传感器传输的数据来控制双向气管泵。

在一些实施方案中，所述方法包括使用包含notch抑制剂的液体培养基提供湿式通气至少2、5、7、或10天，任选地接着使用不包含notch抑制剂的液体培养基的另外的湿式通气。

在一些实施方案中，肺组织基质包含生腱蛋白-c(TN-C)，例如除了可天然存在于源自去细胞化气管支架的基质中的任何生腱蛋白-c以外的补充性生腱蛋白-c；所述方法可包括在细胞接种前使肺组织基质与生腱蛋白-c接触，例如，将包含生腱蛋白-c、例如约0.5-10ug/ml生腱蛋白-C的溶液递送至肺组织基质支架气道。

在一些实施方案中，肺组织基质包含肌原纤蛋白-2(FBN-2)，例如除了可天然存在于源自去细胞化气管支架的基质中的任何FBN-2以外的补充性FBN-2；所述方法可包括在细胞接种前使肺组织基质与FBN-2接触，例如，将包含FBN-2，例如约0.1至100ug/ml FBN-2，例如0.5-50、1-20、5-15、5-20、10-20ug/ml FBN-2的溶液递送至肺组织基质支架气道。

在一些实施方案中，肺组织基质包含TN-C和FBN-2二者。

本文还提供通过本文所述的方法生产的功能性肺(functional lung)。在一些实施方案中，器官是完整的肺或其血管化部分。

本文还提供治疗具有受损的或降低的肺容量的受试者的方法，其包括将通过本文所述的方法生产的功能性肺移植入受试者中。

除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。文本描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其他、合适的方法和材料。材料、方法、和实例仅为例示性的，而并不旨在为限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其它参考文献以其全部引入以作参考。在冲突的情况中，以包括定义在内的本说明书为准。

从以下详细说明和附图、以及从权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得明显。

附图说明

该专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的该专利或申请公开的副本将在请求和支付必要费用的情况下由专利局提供。

图1A-E。原代人肺上皮干细胞体外扩增的表征。体外(A)第1代(P1)和(B)第4代(P4)原代人上皮细胞的亮视野和免疫荧光图像，显示集落生长晕，富集Krt5+p63+基底干细胞。比例尺＝100μm(C)通过传代体外定量Ki67阳性细胞。每次传代n＝3个定量的图像(P1-P4)。与第1代(P1)比较的单因素方差分析(1-way ANOVA)和邓尼特后检验(Dunnet post-test)。所有误差条代表标准偏差。(D)P1和P4的上皮细胞标志物的流式细胞术定量。收集2x10⁴个事件。门控(gated)群从而排除双联体细胞(doublet)和自荧光细胞。每次传代n＝3个细胞系(E)通过细胞传代的基因表达的定量PCR分析。盒须图表示中位数，加上第一和第三四分位数。须代表2.5-97.5％的数据范围。每次传代n＝3个细胞系。归一化为β-肌动蛋白表达并且相对于正常的尸肺组织对照。

图2A-F。通过气-液界面培养向纤毛气道上皮的分化。(A)第21天，气-液界面(ALI)处的原代人肺上皮干细胞。通过苏木精和伊红染色观察到纤毛发生的诱导。比例尺＝25μm。(B)免疫荧光图像显示在ALI处保留基底干细胞群(Krt5/p63+)，功能性纤毛发生(FOXJ1和乙酰化α微管蛋白)和紧密连接形成(E-钙粘着蛋白)。比例尺＝25μm。(C)连续气道正压(continuous positive airway pressure，CPAP)模型的去细胞化肺基质上的气-液界面(在仅血管灌注培养7天后，20mmHg气道压力持续7天)。(D)免疫荧光图像表明，与CPAP前的肺相比(第7天相对于第14天)，维持基底干细胞群(Krt5)、诱导FOXJ1表达、增强的紧密连接形成(E-钙粘着蛋白)、和增殖减少(Ki67)。比例尺＝50μm。(E)在肺组织+CPAP或-CPAP(仅血管灌注)中第14天的E-钙粘着蛋白的蛋白水平的蛋白质印迹分析。(F)与第14天的肺相比(CPAP另外7天或仅灌注)，在再细胞化和血管灌注仅7天后的再细胞化肺中的基因表达的定量PCR分析。示出来自3个独立的再细胞化肺的数据。在实验三次重复中，每个时间点，每个肺分析n＝3个独立的组织样品。归一化为β-肌动蛋白表达并且相对于正常的尸肺组织对照。所有误差条代表标准偏差。通过单因素方差分析和图基多重比较后检验(Tukey'smultiple comparisons post-test)来分析。

图3A-H。通过Notch抑制诱导远端II型肺细胞表型(distal Type II pneumocytephenotype)。(A)用Notch抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、即一种磷酸二酯酶抑制剂，和N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-(S)-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT，也称为GSIIX，γ分泌酶抑制剂)处理5天的体外的原代上皮基底细胞(第3代)的免疫荧光图像，表明表面活性蛋白-B(SP-B)阳性细胞的增加。比例尺＝100μm。(B)用IBMX(100μM)、DAPT(50μM)、或组合IBMX+DAPT体外处理5天的细胞的基因表达的定量PCR分析，表明SP-B和SP-C表达增加。示出n＝3的实验重复。相比于无处理(NT)的单因素方差分析和邓尼特后检验。尽管在该实验中，DAPT和IBMX单独无效，在其他重复中它们显示一些活性。三维培养分析表明球状体形成。(C)球状体的免疫荧光图像表明3D球状体培养中Krt5+p63+表型的优势。比例尺＝50μm。(D)苏木精和伊红染色的球状体表明第7天时的管腔发育。(E)第7天时未处理的和Notch抑制的(IBMX+DAPT)细胞中的球状体的亮视野图像。比例尺＝100μm。(F)球状体数量量化为初始接种的总细胞数的百分比，表明IBMX+DAPT处理的细胞中球状体形成的降低。在实验三次重复中定量的n＝3个独立培养。通过T检验分析。(G)第7天时具有或不具有Notch抑制(IBMX+DAPT)的球状体培养的基因表达的定量PCR分析。示出来自3个独立培养的数据，以实验二次重复分析。归一化为β-肌动蛋白表达并相对于正常的尸肺组织对照。(H)SP-C蛋白还可以用DAPT+IBMX体外处理5天后在BESC的条件培养基中(第4代，p4)通过ELISA测量。所有误差条代表标准偏差，通过t-检验分析。

图4A-E。在去细胞化肺支架培养物中原代基底气道干细胞诱导为远端II型肺细胞表型。(A)基底上皮干细胞与人去细胞化肺切片共培养5天，表明细胞通过整联蛋白α2β1和α3β1与肺基质粘附、沿着基质连接的区域形成紧密连接(E-钙粘着蛋白)、和持续增殖(Ki67+)。比例尺＝100μm。(B)在具有或不具有Notch抑制(IBMX+DAPT)的细胞-基质培养5天的基因表达的定量PCR分析，表明处理后诱导SP-B和SP-C、以及棒状细胞分泌蛋白(Club CellSecretory Protein，CCSP)表达的损失。示出来自2个单独的实验的数据，其中将细胞接种至源自两个不同肺供体的基质(对于HL30，n＝3，对于HL38，n＝3)，以实验二次重复分析。归一化为β-肌动蛋白表达并相对于正常的尸肺组织对照。通过T-检验分析(IBMX+DAPT相对于NT)。误差条代表标准偏差。(C)用原代基底干细胞(20x10⁶)加IBMX+DAPT处理再细胞化肺的仿生培养。(D)与未处理的肺(第5天)相比，在恒定灌注培养中用IBMX+DAPT处理5天的再细胞化的肺中基因表达的定量PCR分析。每个肺分析n＝3个独立肺组织样品，实验三次重复。归一化为β-肌动蛋白表达并相对于正常的尸肺组织对照。通过T-检验分析(IBMX+DAPT相对于NT)。误差条代表标准偏差。(E)第5天时再细胞化的肺的免疫荧光图像(无处理相对于IBMX+DAPT Notch抑制)，证实维持Krt5/p63+基底细胞群、增加紧密连接强度(E-钙粘着蛋白)、增加SP-C阳性细胞、和水通道蛋白-5阳性细胞的损失。比例尺＝50μm。

图5A-K。用原代人肺基底干细胞再细胞化和培养整个去细胞化人肺支架。(A)能够恒定器官灌注和负压通气的示例性肺生物反应器的示意图。(B)生物反应器中的单片人去细胞化肺叶，其中突出显示肺静脉、气道、和肺动脉。用原代PAEC(肺动脉内皮细胞，160-240x10⁶)和BESC(基底上皮干细胞，220-280x10⁶，n＝3)接种肺叶，并在恒定培养基灌注加周期性负压通气下维持。(C)经8天再细胞化肺灌注培养的肺动脉压力，n＝3的再细胞化的肺。数据代表平均压力+/-SD。(D-E)与新鲜培养基相比，48小时器官灌注后，(D)从肺培养基采样的培养基中的葡萄糖测量的变化。每48小时更换培养基，并且值代表葡萄糖浓度(mg/dL)的改变，和(E)乳酸浓度(mmol/L)的变化。示出的数据代表每个时间点n＝2个独立的肺培养。误差条代表标准误差。(F)负压通气期间的代表性压力迹线(trace)(6次/min的呼吸速率)。同时记录器官室、肺动脉、PEEP室、气道、和肺静脉中的压力。(G)通气期间的峰值跨壁压(mmHg)。(H)通气期间的计算的潮气量(mL)。盒须图代表中位数，加第一和第三四分位数。须代表数据的范围。界外值(大于盒须图的1.5xIQR的点)由加号(+)表示。(I)在生物反应器中负压通气期间产生的代表性压力-体积环。描绘的环t＝0表示为蓝色，t＝终点(final)表示为红色(J)单片下肺叶的端点正压通气激发(challenge)。(K)正压通气激发期间灌注液的pH、pO₂、pCO₂、和HCO₃的代表性测量。再细胞化肺叶，并在试验前培养7天，并且用21％和100％FiO₂来功能激发。

图6A-H。仿生培养后的肺组织再细胞化的分析。(A)仿生培养的第7天灌注含有刃天青的培养基从而分析细胞生存力。通过向粉色的转变来使蓝色染料的活细胞代谢可视化，表明培养后的广泛的细胞存留、分布和生存力。(B)再细胞化的肺组织的H&E切片的代表性扫描(i)比例尺＝5mm和(ii)比例尺＝100μm。(C)培养第7天时连续的E-钙粘着蛋白+上皮细胞增殖(Ki67+)的免疫荧光图像。比例尺＝50μm。(D)通过Ki67+染色定量再细胞化的肺组织中的细胞增殖。每个肺分析三个代表性区域，其中每个区域定量4个图像。误差条代表标准偏差。通过单因素方差分析来分析，其中未识别显著性。(E)培养第7天的再细胞化的肺的免疫荧光图像，证实维持Krt5+p63+基底细胞群并很少观察到非粘附的proSP-B+细胞。(F)培养后大气道的细胞存留和再增殖(repopulation)，通过再细胞化的(i-ii)大鼠和(iii)人肺中的Krt5+、p63+和E-钙粘着蛋白+上皮细胞来证明。(G)肺支架的毛细血管隔室中CD31+细胞的定位和组织。比例尺＝50μm。(H)培养的第7天或第10天(最后一天)时肺组织的基因表达的定量PCR分析。示出来自3个独立的再细胞化的肺培养的数据，其中每个肺分析n＝4个独特的组织样品，实验二次重复。表达归一化为β-肌动蛋白并相对于正常的尸肺组织对照。示出体外维持的细胞的基因表达水平用于参考。所有误差条代表标准偏差。通过单因素方差分析来分析，其中未识别显著性。

图7A-B：原代内皮细胞分离和培养。(A)从大血管分离原代肺内皮细胞，并在分选CD31+群之前在EGM2培养基中培养5天。门控策略表明排除双联体细胞和死亡量(deaddeals)(太平洋蓝(Pacific Blue)+)、和分离CD31+群。示出代表性实例。(B)明胶涂布的培养瓶上培养物中分选群的免疫荧光染色，表明内皮纯度。比例尺＝100μm

图8A-C：ROCK抑制剂对细胞表型和衰老的影响。(A)第1代和第4代n＝3的单独细胞系的基因表达分析，添加或不添加ROCK抑制剂Y27632(10μM)。误差条代表标准偏差。通过每次传代的t-检验未发现未处理和处理(+ROCK)之间的显著差异。(B)第1代和第4代的细胞的代表性图像，具有或不具有ROCK抑制剂，其中台盼蓝添加至培养基。(C)第1代和第4代的细胞的代表性图像，具有或不具有ROCK抑制剂，在pH 6下对衰老相关的β-半乳糖苷酶活性染色。比例尺＝50μm。

图9A-B：内皮细胞共培养对基底细胞群的影响。(A)与原代肺内皮细胞的共培养中原代上皮基底细胞(第4代)的qPCR基因表达分析。数据代表基底细胞群(Epi+)加transwell插入物(insert)上的内皮细胞上的培养物(Endo+)，在培养基中添加或不添加VEGF(VEGF+，40/ml)。(B)处理和未处理的上皮(未检测)和内皮的VEGF受体的表达。表达水平归一化为β-肌动蛋白，并且相对于正常肺组织来表达。在重复试验中分析n＝3次重复。误差条＝标准偏差。通过对于Epi+未处理组的单因素方差分析和邓尼特后检验分析。

图10A-B。用DAPT(50nM)体外预处理BESC 5天，然后递送至大鼠肺支架(20x 10⁶)，并维持远端2型样命运，不进行连续的抑制剂处理。(A)体外处理结束时(第5天)基因表达的定量PCR分析，并且在递送至大鼠肺支架和离体培养后另外5天无抑制剂。示出来自3个独立的孔(体外)或3个独立的组织块(离体)的数据。表达归一化为β-肌动蛋白并相对于正常的尸肺组织对照。(B)离体培养第5天在再细胞化的肺组织中对表面活性蛋白C和p63免疫荧光染色。50um比例尺。

图11。使用靶向γ-分泌酶的双小分子(在该图中，LY411575和GSI-X)有效地在体外将组织来源的BESC导向远端肺细胞命运的Notch信号通路的直接抑制。在体外处理结束时(第5天)基因表达的定量PCR分析。示出来自n＝3的独立孔、以实验重复来分析的数据。表达归一化为β-肌动蛋白表达并相比于未处理的细胞(SAGM)计算变化倍数。在该处理的情况下，还增加1型肺细胞标志物AQP5，这在DAPT/IBMX处理(如图3所示)的情况下也未发现。

图12A-C。分离的人ECM上的上皮培养。(A)制备体外培养用基质涂层的方法。(B)在新生儿(N1-N3)和成人(A1-A3)基质涂层上生长的BESC的定量基因表达分析。表达归一化为B-肌动蛋白，并且相对于正常成人肺组织来表达。(C)第7天时测量总活细胞和死细胞荧光的细胞毒性分析。

图13A-B。通过蛋白质组学分析的新生儿和成人肺组成。(A)各样品中检测到的蛋白质的热图(Heat map)。(B)新生儿相对于成人基质(n＝3/组)中总体基质组(matrisome)组成。

图14A-B。成人和新生人肺支架中基质蛋白的量化比较。(A)检测到的基质蛋白的火山图。(B)在(A)中突出显示的蛋白质的详细情况。

图15A-E。BESC响应于FBN-2和TN-C的体外分析。(A)基因表达分析，归一化为β-肌动蛋白，并且相对于正常成人肺组织来表达。(B)免疫荧光染色(C)Ki67+定量(n＝3的组织/组)。比例尺＝50μm(D)体外迁移分析，180min内无细胞区域的变化的代表性图像和定量。比例尺＝100μm。(E)各涂层上的BESC的粘着斑激酶(FAK)的表达。基因表达分析，归一化为β-肌动蛋白，并且相对于正常成人肺组织来表达。

图16A-E。预处理的基质上的离体肺上皮再生。(A)再上皮化的肺支架的定量基因表达(B)肺组织的苏木精和伊红评估。比例尺＝50μm。(C)再生第3天和第7天的肺组织的免疫荧光染色。比例尺＝50μm。(D)肺上皮再生的第3天和第7天的Ki67阳性细胞的定量。(E)通过隔膜厚度(septal thickness)定量组织形态。

图17A-C。新生儿人肺的去细胞化。(A)供体左肺和右肺。(B)供体肺的套管插入术(cannulation)。比例尺＝5cm。(C)通过0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液的灌注去细胞化来去细胞化新生儿供体肺。

图18。隔膜厚度的代表性测量。红线表示测量的区域(n＝5/图像)。比例尺(白色)＝50μm。

具体实施方式

基于天然细胞外基质支架的实体器官生物工程推动了最近对于终末器官衰竭的再生医学方法的热情(1)。主要方法涉及将再生细胞群与相应的生物基质组合从而形成活的功能性移植物。为此目的，天然实体器官细胞外基质(ECM)支架可以通过用特定洗涤剂灌注去细胞化来容易地产生，使得生物相容性框架作为再生的基础(2-7)。

临床相关器官再细胞化在识别细胞来源和建立功能性仿生器官培养条件以支持移植前的器官成熟两方面存在显著挑战(8)。

最佳细胞来源将容易获得和体外扩增，并且将理想地具有多谱系分化的能力。虽然通过关键发育阶段直接分化诱导的多能干细胞提供获得肺特异性细胞群的有希望的选择(9-11)，但体外培养的长度和有限的细胞数限制它们目前用于大规模器官工程的应用。虽然在很大程度上是静态的，但成人肺组织具有显著的再生能力，这归功于响应于组织损伤而激活的许多兼性干/祖细胞群(12)。通过转录因子p63和表达细胞角蛋白5(Krt5)鉴定的气道基底细胞充当气道上皮的多能干细胞，并且对生理细胞更新和再生期间维持气道稳态是重要的(13,14)。此类必需细胞群占人气道上皮中细胞的30％(15)，并且气道再生的早期研究表明当接种至裸鼠气管上时分离的基底细胞重现完全分化的气道上皮的能力(16)。响应于损伤，基底上皮干细胞可迅速增殖并产生纤毛和棒状细胞后代，证实它们在组织稳态和损伤修复中的重要功能(17)。肺基底细胞可从肺组织容易地分离(18,19)并在培养物中繁殖(20)，这使它们成为组织工程应用的有用靶群。此类原代干细胞群的体外培养也为研究基础生物学和组织再生提供重要工具(13)，特别是考虑到它们多谱系分化的能力(21,22)。

本文描述的是从容易获得的组织来源分离高度增殖性基底干细胞群，并证明体外超过100倍扩增。通过Krt5⁺p63⁺表达识别的该细胞群已在肺修复(23-25)和人类疾病的动物模型(26)中研究。

在Krt5⁺p63⁺群中，可存在其他不同的基底干细胞亚群，其各自在组织稳态和修复中具有独特的作用。这包括最近报道的在正常远端肺内的谱系阴性上皮祖细胞(LNEP)，其在损伤后可特异性增殖(27)。尚不清楚这些少见的细胞亚组是否可单独起作用，或者它们是否需要受损组织环境中其他细胞的组合信号传导和作用。数学模型支持异质基底干细胞群，提出大约相等数量的多能干细胞和定型前体(28)。损伤的作用，包括来源、强度、和持续时间，也是细胞激活和命运的重要决定因素。考虑年龄和物种作为两个实例，所研究的细胞群的起源也可以促进再生能力和细胞命运。最近已显示在发育的小管阶段的胚胎肺具有富含由间充质细胞和血细胞包围的上皮祖细胞的独特生态位，并且这些细胞可以移植入受损的肺并分化为多个谱系(29)。

肺损伤后，重建完整的上皮对于恢复肺稳态至关重要(30)。在肺修复的本模型中，去细胞化的肺支架用作上皮细胞迁移的临时基质，重现(至少部分)体内激活的过程从而覆盖和修复裸露的气道和气体交换表面(31)。基底细胞帮助上皮细胞锚定到基质并保护下面的间质(stroma)的生理作用通过其表达丰富的细胞骨架、连接和粘附蛋白得到辅助，这支持了基底细胞在天然肺ECM的再上皮化中的实用性(32)。

气道损伤的啮齿动物模型已建立了上皮修复的时间线。在上皮损伤后，发生细胞扩散和迁移作为最初12-24小时中的主要修复机制，24小时后开始增殖并持续数周(33)。该时间线与离体培养和再生中的肺修复的本模型一致。修复机制的下一步将是重建假复层上皮，这可需要数周来建立(34)。整个大鼠肺支架上的气-液界面培养的本模型证实FOXJ1的初始上调和7天的增加的紧密连接形成。可需要延长的生物反应器培养来使重建的上皮完全成熟，因为体外ALI模型需要3-4周来重现成熟的气道生物学(35)。在再细胞化和离体培养后，在本重建上皮中未识别显著的肺细胞谱系。可能需要更长的再生时间结合信号传导通路的调节来诱导从递送的干细胞群定向肺细胞分化，其中动物模型证实远端肺再生需要50-90天(27,36)。

Notch信号传导在肺上皮发育和稳态中起必需和复杂的作用，并且Notch配体在肺中以非常高的水平表达(37)。肺发育需要多个细胞谱系的精确模式化，其中很多命运选择通过直接的细胞-细胞通讯(cell-to-cell communication)控制。在胚胎肺泡发育期间，Notch的组成性过表达抑制远端上皮的发育，反而促进主要缺乏肺泡标志物的囊肿形成(38)。在通过DAPT的Notch抑制后，也显示早期肺近端-远端细胞命运决定中对Notch信号传导的需要，导致Nkx2.1⁺远端肺祖细胞群的积累(38)。另外如本文所示，通过γ-分泌酶的Notch通路的药理抑制可在体外和离体肺支架培养中诱导向II型肺细胞表型的全局过渡。这证实了小鼠基底干细胞的3-D球状体培养的报道(27)。在Notch抑制后也观察到CCSP表达的损失，进一步突出Notch激活在基底细胞向分泌谱系分化中的重要作用(39,40)。对于器官工程，这些信号的精确控制可需要Notch通路的药物激活或抑制来实现最佳细胞图案化。将需要进一步开发先进的生物工程程序来将这些生物化学信号以剂量或时间控制的方式递送至特定的近端或远端肺隔室。机械力也有助于激活Notch信号传导，暴露金属蛋白酶切割位点，并促进随后的从自身抑制构象的变化(41)。这些机械考虑因素对于三维全器官仿生培养中的细胞-细胞信号传导相对于传统的二维培养可具有额外的意义。由仿生器官灌注引起的剪切流体力可在培养期间进一步引导细胞沿着支架组织。已显示上皮细胞在体外沿着流体流线迁移，这可通过局部微环境中的旁分泌趋化因子场(field)引导(42)。

肺支架再细胞化和离体再生的本模型提供了以系统方式进一步研究上皮修复的独特且容易获得的工具。

基于去细胞化支架的器官再生可能是损伤的最终模型和细胞修复潜力的试验。鉴于分离的环境，结合通过再生器官的离体培养提供的仿生刺激，可以直接评估特定细胞群再生天然组织的能力。在本研究中，通过利用系统模块(building-block)方法，通过证实原代分离的气道干细胞群可在无细胞肺支架上实现广泛的组织再生并可被引导向近端和远端上皮谱系两者来作出向前的关键一步。

本文有关于气道器官生成和保存中涉及的方法和材料。描述了方法、装置、细胞、和组合物，其用于生成可用于为准备好移植入人和其他动物中的功能性气道器官的生长提供更实际的环境的功能性肺组织。在给定基质例如人工或去细胞化的肺组织基质上生成肺组织。本发明进一步基于该实际的环境用于供体器官的更长时间的保存、修复、和改变的用途，从而为移植提供更多、改进的、和个体化的移植物。

如本文所用的，“功能性”肺组织执行正常的健康肺的大部分或所有功能，例如允许氧从空气输送至血流中，和二氧化碳从血流释放至空气中。其可湿润吸入的空气，产生表面活性物质(surfactant)从而降低肺泡中的表面张力，和/或生成并转运粘液从而将吸入的微粒物质从远端移动至近端气道。

如本文所用的，使用或定义术语“去细胞化的”和“无细胞的”为使用标准的组织学染色方法在组织切片中完全或几乎完全没有可检测的细胞内物质、内皮细胞、上皮细胞、和细胞核。优选地，但不必要地，还已从去细胞化的器官或组织除去残留的细胞碎片。

去细胞化的组织/器官基质

在本发明的一些实施方案中，在去细胞化的基质上生成肺组织。如以下所讨论的，用于制备去细胞化的肺组织基质的方法和材料是本领域内已知的。任何合适的材料可用于制备此类基质。在优选的实施方案中，组织基质可为从去细胞化的肺组织开发的无细胞的组织支架。例如，例如人肺如一个或一对人肺或其部分等的组织，例如人、猪、牛、灵长类动物、或绵羊尸肺或其部分，可通过合适的方法来去细胞化从而从组织除去天然细胞，同时维持组织或组织部分的形态完整性和血管系统，并保留细胞外基质(ECM)蛋白质(参见TapiasLF和Ott HC.Decellularized scaffolds as a platform for bioengineeredorgans.Current opinion in organ transplantation.2014；19(2):145-52)。用于去细胞化哺乳动物肺组织的方法描述于例如O'Neill JD等人,Decellularization of human andporcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.Ann ThoracSurg.2013Sep；96(3):1046-55；Nichols JE等人,Production and assessment ofdecellularized pig and human lung scaffolds,Tissue Eng Part A.2013Sep；19(17-18):2045-62；Gilpin SE等人,Perfusion decellularization of human and porcinelungs:Bringing the matrix to clinical scale.Journal of Heart and LungTransplantation.2014；33:298-308；Song JJ等人,Bioartificial lung engineering.AmJ Transplant.2012Feb；12(2):283-8；和Ott HC等人,Regeneration and orthotopictransplantation of a bioartificial lung.Nat Med.2010Aug；16(8):927-33。示例性的去细胞化方法可包括例如使用液氮使组织(例如肺组织)进行重复的冻融循环。在其他情况下，可使组织进行阴离子或离子细胞破裂介质例如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG)、或TritonX处理。还可用核酸酶溶液(例如核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶)处理组织，并在无菌磷酸盐缓冲盐水中在温和搅拌的情况下洗涤。示例性的方法在本领域内已知，例如O'Neill JD等人,Decellularization of human and porcine lung tissues forpulmonary tissue engineering.Ann Thorac Surg.2013Sep；96(3):1046-55。在一些情况下，可使用本领域已知的方法和材料通过冲洗器官或组织的血管、导管和/或腔来进行去细胞化。例如，如Maghsoudlou等人,Preservation of micro-architecture and angiogenicpotential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment.Biomaterials.2013Sep；34(28):6638-48中描述的。在冲洗步骤后，可经由管线(line)使用如上所述的细胞破裂介质例如去离子水中的1％SDS灌注器官或组织。通过组织的灌注可以是顺行的或逆行的，并且可以改变方向从而改善灌注效率。根据器官或组织的大小或重量以及特定阴离子或离子洗涤剂和细胞破裂介质中阴离子或离子洗涤剂的浓度，通常用细胞破裂介质以约2至12小时每克组织来灌注组织。包括洗涤在内，器官可灌注至多约12至约72小时每克组织。通常将灌注调整为生理条件包括流速和压力，例如5-100mmHg之间的压力和源生物体和个体的生理心输出量的0.1-10倍之间的流速。

在另一示例性方法中，去细胞化方法包括将洗涤剂，例如(1)0.1％SDS(2)2％，脱氧胆酸钠(SDC)，或(3)8mmol/升(3)3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)(pH12)洗涤剂以30cm H₂O的恒定压力灌注通过肺动脉。所有3种洗涤剂的实验方案包括：

1.用磷酸盐缓冲盐水(PBS)初始顺行洗涤10分钟，

2.洗涤剂灌注，其时间为使不透明的半透明基质可视化(指示去细胞化)所需的时间加该初始时间的另外20％(例如70分钟+14分钟)，

3.15分钟去离子H₂O洗涤，和

4.用添加的抗生素和抗真菌剂另外172小时PBS洗涤。

该去细胞化方法，例如可包括去离子H₂O之后的1％Triton-X的另外洗涤。SDC实验方案可包括SDC之前的0.1％Triton-X灌注和SDC之后的1mol/升NaCl洗涤。

类似地，猪和人肺去细胞化方法可包括通过肺动脉以恒定压力灌注洗涤剂或其他去细胞化剂，然后用H₂O、1％Triton-X溶液、和PBS顺序洗涤。与大鼠肺类似，在目视检查和出现不透明半透明基质时可认为去细胞化完成。起始器官的可变性主要由于收获期间预冲洗的广泛性，并且任何产生的凝块可促成所需的灌注长度。通常，去细胞化灌注的时间可例如从4至7天变化。

去细胞化组织可基本上(例如至少：85重量％纯度、90重量％纯度、92重量％纯度、95重量％纯度、96重量％纯度、97重量％纯度、98重量％纯度、和99重量％纯度)由组织的全部或大部分区域的细胞外基质(ECM)组分、包括血管树的ECM组分组成。ECM组分可包括以下的任意或全部：纤连蛋白、肌原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白家族的成员(例如胶原I、III、和IV)、糖胺聚糖、基质、网状纤维和血小板反应蛋白，其可保持组织化为限定的结构例如基膜。在优选的实施方案中，去细胞化的肺组织基质保留完整的血管系统。保留基本上完整的血管系统使得能够在移植时将组织基质与受试者的血管系统连接。另外，去细胞化组织基质可进一步用例如照射(例如UV、γ)处理从而降低或消除在去细胞化的组织基质上或中残留的任何类型的微生物的存在。

使用物理、化学、和酶手段获得去细胞化的组织基质的方法在本领域内已知，参见例如Liao等人,Biomaterials 29(8):1065-74(2008)；Gilbert等人,Biomaterials 27(9):3675-83(2006)；Teebken等人,Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.19:381-86(2000)。还参见美国专利公开号2009/0142836；2005/0256588；2007/0244568；和2003/0087428。

人工器官基质

在本方法的一些实施方案中，在人工器官基质上生成肺组织。用于制备人工器官基质的方法和材料在本领域内已知。任何合适的材料可用于制备此类基质。在优选的实施方案中，人工器官基质可为从多孔材料例如聚乙醇酸、Pluronic F-127(PF-127)、Gelfoam海绵、胶原蛋白-糖胺聚糖(GAG)、血纤蛋白原-纤连蛋白-玻连蛋白水凝胶(FFVH)、和弹性蛋白开发的支架。参见例如Ingenito等人,J Tissue Eng Regen Med.2009Dec 17；Hoganson等人,Pediatric Research,May 2008,63(5):520-526；Chen等人,Tissue Eng.2005Sep-Oct；11(9-10):1436-48。在一些情况下，人工器官基质可具有与肺泡单元相似的多孔结构。参见Andrade等人,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2007Feb；292(2):L510-8。在一些情况下，植入人工器官基质可表达器官特异性标志物(例如克拉拉细胞、肺细胞、和呼吸上皮的肺特异性标志物)。在一些情况下。植入的人工器官基质可组织化为可识别的结构(例如在人工肺基质中与肺泡和末端支气管相似的结构)。例如，使用FFVH制成的植入人工肺基质可促进体外的细胞附着、扩散和细胞外基质表达以及体内的明显植入(apparentengraftment)，证据为对周围的组织具有营养效应。参见Ingenito等人，同上。还参见美国专利号7,662,409和6,087,552；美国专利公开号2010/0034791；2009/0075282；2009/0035855；2008/0292677；2008/0131473；2007/0059293；2005/0196423；2003/0166274；2003/0129751；2002/0182261；2002/0182241；和2002/0172705。

用生腱蛋白-C和/或肌原纤蛋白-2处理

用于肺器官工程的最佳支架将不仅提供需要的结构，而且将另外指导新的肺组织的组织和功能。ECM是复杂的实体，其参与许多生物过程，包括组织发育和修复(Balestrini和Niklason,Annals of biomedical engineering.2015；43(3):568-76)。当考虑全器官再生中的ECM时，用于制备支架的天然肺组织来源可对随后的再生具有直接影响。多个研究已显示潜在的肺病理可引起在去细胞化之后保留的ECM的变化，并且可在组织修复期间保持(Burgess等人,The Journal of pathology.2016；240(4):397-409)。对于肺纤维化和肺气肿，这已证实(Booth等人American journal of respiratory and critical caremedicine.2012；186(9):866-76；Sokocevic等人Biomaterials.2013；34(13):3256-69)。肺的年龄也可导致去细胞化的支架的重要不同。已显示老化的ECM上的生长可导致层粘连蛋白α3和α4链的显著较低的细胞表达，这再现了在老化的肺ECM中观察到的层粘连蛋白缺陷。这些数据进一步突出了包含在肺支架中的深入生物信息，和可在修复细胞群和下方蛋白基质之间存在的反馈环(Godin等人,PloS one.2016；11(3):e0150966)。

肺发育在出生之后活跃地持续，并且ECM重构是出生后的肺泡化过程中的重要组分。该机制作用是显著增加气体交换表面积，因为肺进一步细化未成熟的肺泡结构并进行二次分隔(septation)从而生成更大数量的小尺寸肺泡(Whitsett等人,Physiologicalreviews.1995；75(4):749-57)。在离体组织再生的情况下，未充分研究该过程的后果和ECM组成的特定差异。胎儿伤口以比成人更快的速率修复，几乎没有或没有疤痕(Yates等人,Birth defects research Part C,Embryo today:reviews.2012；96(4):325-33)。婴儿期肺叶切除术后可以肺再生长，恢复气道功能和完全恢复肺体积(McBride等人,The Journalof clinical investigation.1980；66(5):962-70)。相反地，ECM的失调是衰老的重要驱动因素，并且ECM中的衰老相关的改变可直接传递给周围的细胞，导致慢性肺病例如肺气肿和肺纤维化的发展(Meiners等人,The European respiratory journal.2015；45(3):807-27)。衰老的另一后果是干细胞功能障碍和耗竭的现象，其中多能祖细胞池(multipotentpool of progenitors)逐渐减少并且变得更加衰老(Thannickal等人,American journalof respiratory and critical care medicine.2015；191(3):261-9)。干细胞和生态位(包括ECM)之间的这些相互作用可引起再生能力的此类降低。

本研究考察了与成人肺供体相比，来自活跃地进行肺泡化的新生儿肺的ECM的差异，并且评价这些差异对离体肺上皮修复的影响。在新生儿人肺ECM中存在发育相关的蛋白质肌原纤蛋白-3(FBN-3)、肌原纤蛋白-2(FBN-2)、和生腱蛋白-C(TN-C)的增加，并且报道了在无细胞肺支架上的体外和离体肺再生中补充这两种蛋白质可增强上皮增殖，降低衰老，帮助细胞附着和迁移，并且最终改善再生的组织形态和结构。

在一些实施方案中，在细胞接种前用例如在对于大鼠肺基质而言为15ml的总体积中包含生腱蛋白-C(例如0.5-10ug/ml，例如约1-3ug/ml)和/或肌原纤蛋白-2(例如完整的或N和C片段)(例如0.5-10ug/ml，例如约1-3ug/ml)的溶液预处理包含肺组织基质例如去细胞化的肺组织基质或人工肺基质。在这些方法中，生腱蛋白-C和/或肌原纤蛋白-2是外源的，即添加至其中温育基质的溶液中(在与基质接触之前或期间)，并且是除了已存在于基质(或已存在于溶液中所存在的任何血清中)的任何生腱蛋白-C和/或肌原纤蛋白-2以外的。在一些实施方案中，该方法包括将包含生腱蛋白-c和/或肌原纤蛋白-2、例如约0.5-10ug/ml生腱蛋白-C和/或约0.5-10ug和/或肌原纤蛋白-2的溶液递送至支架气道(例如通过重力压力)，并且例如在存在生腱蛋白-C和/或肌原纤蛋白-2的情况下温育基质，例如在37℃下温育约1小时。在一些实施方案中，细胞接种于包含生腱蛋白-C和/或肌原纤蛋白-2的溶液中。作为肌原纤蛋白-2的替代或除了肌原纤蛋白-2以外，可以使用肌原纤蛋白-3。

人生腱蛋白-C前体的示例性序列在GenBank中为NM_002160.3(核酸)和NP_002151.2(蛋白质)。示例性蛋白序列如下：

因为氨基酸1-22似乎是信号序列，在一些实施方案中，可以使用成熟生腱蛋白-C蛋白质，例如SEQ ID NO:1的氨基酸23-2201。可选地，可以使用包含氨基酸23至625的片段。

人肌原纤蛋白-2前体的示例性序列在GenBank中为NM_001999.3(核酸)和NP_001990.2(蛋白质)。人肌原纤蛋白-2前体的示例性蛋白序列如下：

因为氨基酸1-28似乎是信号序列，在一些实施方案中，可以使用成熟肌原纤蛋白-2，例如SEQ ID NO:2的氨基酸29-2912。在一些实施方案中，肌原纤蛋白-2制成为两个单独的肽，例如N和C片段，例如N-末端半rFBN2-N(氨基酸1–1732)和C-末端半rFBN2-C(氨基酸1531–2771)，例如在人293细胞中生产。参见例如Lin等人,J.Biol.Chem.277:50795-50804(2002)。

人肌原纤蛋白-3前体的实例性序列在GenBank中为NM_001321431.1(核酸)和NP_001308360.1(蛋白质)或NM_032447.4(核酸)和NP_115823.3(氨基酸)。

优选使用的蛋白质的序列与以上提供的成熟参考序列至少80％相同(例如至少90％、95％、或99％相同)，并且具有本文所述的活性。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的而比对序列(例如可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或二者中引入空位用于最佳比对，并且为了比较的目的可以忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，为了比较的目的比对的参考序列的长度为参考序列的长度的80％，在一些实施方案中为至少90％或100％。然后比较对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中对应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，于是分子在该位置处是相同的(如本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数的函数，考虑需要引入来最佳比对两个序列的空位数、和各空位的长度。

可使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间的百分比同一性的测定。例如，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用已结合至GCG软件包(可在万维网上在gcg.com处获得)中的GAP程序中的Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法，使用默认参数，例如空位罚分为12、空位延伸罚分为4、和移码空位罚分为5的Blossum 62评分矩阵来测定。

可以使用任何形式的TNC或FBN-2，例如重组生产的蛋白质(例如从细胞，例如原核或真核，优选哺乳动物(更优选人)细胞，或从产生蛋白质的转基因动物表达和分离，或者在体外无细胞系统中转录和翻译)或从天然来源分离的蛋白质。尽管优选人蛋白质，但也可使用其他哺乳动物物种，例如牛、山羊、猪、马、或绵羊。

尽管本公开例示TNC和/或FBN-2与一些细胞类型的用途，也可使用其他。

细胞接种

在本文所述的一些方法中，用细胞例如分化或再生的细胞接种肺组织基质，例如去细胞化的肺组织基质或人工肺基质。

可以使用任何合适的再生细胞类型、例如初始或未分化的细胞类型可用于接种肺组织基质。细胞可以在包括但不限于干细胞阶段(例如诱导后)、祖细胞阶段、成血成血管细胞、或分化阶段(例如CD 31+、vWF+)等多个阶段接种。如本文所用的，再生细胞可包括但不限于祖细胞、前体细胞、和“成体”来源的干细胞包括脐带细胞(例如人脐静脉内皮细胞)和胎儿干细胞。再生细胞还可包括分化或定向的细胞类型。适用于本文提供的方法和材料的干细胞可包括人诱导多能干细胞(iPSC)(例如未分化的、分化的内胚层、前内胚层(anteriolized endoderm)、TTF-1阳性肺祖细胞)、人间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、多潜能成体祖细胞(MAPC)、iPS来源的间充质细胞、或胚胎干细胞。在一些情况下，还可使用源自其他组织的再生细胞。例如，源自皮肤、骨骼、肌肉、骨髓、滑膜、或脂肪组织的再生细胞可用于开发干细胞接种的组织基质。

在一些情况下，可替代地或进一步地用分化的细胞类型例如(优选人)上皮细胞和内皮细胞接种本文提供的肺组织基质。例如，可经由血管系统(例如通过动脉线或静脉线)用内皮细胞、和经由气道(例如通过气管线)用来自人供体的增殖性基底干细胞(其中细胞为Krt5+p63+细胞)接种肺基质。还可用一种或多种细胞类型(例如以下类型中的一种或多种：上皮和间充质细胞、成体外周血来源的上皮细胞、脐带血来源的上皮细胞、iPS来源的上皮细胞、祖细胞阶段细胞(例如平滑肌)、成体肺来源的细胞混合物(例如大鼠、人)、商购可得的小气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、胚胎干(ES)细胞来源的上皮细胞、和/或人脐静脉内皮细胞(HUVEC))接种肺基质。

任何类型的合适的商购可得的培养基和/或培养基试剂盒可用于接种和培养细胞。例如，SAGM培养基可用于小气道细胞(例如Lonza的SAGM BulletKit)，EGM-2试剂盒可用于内皮细胞(例如Lonza的EGM-2 BulletKit)。可如例如Brudno Y等人Biomaterials 34(2013)9201-9209中所述来使用针对接种的内皮细胞类型定制的培养基(例如通过增加或减少生长因子例如VEGF)。在内皮细胞的情况下，一系列不同的培养基组合物可用于诱导细胞接种、扩增、移植、和成熟的不同阶段。例如，在第一阶段中，细胞接种的构建体可用‘血管生成培养基’灌注2-30天从而增加内皮细胞扩增、迁移、和代谢。该介质的特征在于高浓度的细胞因子，例如5-100ng/ml的VEGF和5-100ng/ml的bFGF，以及存在通过激活蛋白质激酶C来激活血管生成通路的佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)，例如5-100ng/ml PMA，和刺激内皮细胞出芽的Ang-1。在第二阶段，可接着用支持内皮成熟和紧密连接形成的‘紧密化培养基(tightening media)’灌注细胞接种的构建体。紧密化培养基具有较低水平的细胞因子，具有与血管生成培养基相同的基础组成但具有降低水平的VEGF、bFGF和PMA(0.1-5ng/mlVEGF、FGF、和PMA)。促进紧密连接形成并已显示减轻肺水肿的氢化可的松可进一步添加至紧密化培养基从而促进血管成熟。其他促成熟因子例如PDGF和Ang-2可添加至紧密化培养基从而促进血管形成。可以滴定这些因子的浓度从而支持不同的血管大小。培养基的变化可逐渐进行从而避免突然的细胞因子变化的有害影响。与内皮细胞支持培养基类似，顺序的培养基变化可用于指导上皮细胞命运。初始培养基可包含例如，10-200ng/ml的激活蛋白A和0.01-1uM的Pi3K抑制剂例如ZSTK 474从而诱导确定的内胚层，接着01-10uM的TGF-β抑制剂例如A-8301和0.05-1uM的BMP4拮抗剂例如DMH-1从而诱导前内胚层，和最后1-100ug/ml的BMP4、10-500ng/ml的FGF2、10-500nM的GSK-3β抑制剂例如CHIR 99021、1-100nM的PI3K抑制剂例如PIK-75和1-100nM的甲氨蝶呤从而诱导肺祖细胞的生成。

可以使用用于分离和收集接种用细胞的任何合适的方法。例如，诱导的多能干细胞通常可通过转录因子例如Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC、Nanog、和Lin28的异位表达从“重编程”为多能状态的体细胞获得。参见Takahashi等人,Cell 131:861–72(2007)；Park等人,Nature 451:141–146(2008)；Yu等人,Science 318:1917–20(2007)；Zhu等人,Cell StemCell.7:651-5 2010；和Li等人,Cell Res.21:196-204(2011)；Malik和Rao,Methods MolBiol.2013；997:23-33；Okano等人,Circ Res.2013Feb 1；112(3):523-33；Lin和Ying,Methods Mol Biol.2013；936:295-312。外周血来源的单核细胞可从患者血液样品分离，并用于产生诱导的多能干细胞。在其他实例中，诱导的多能干细胞可通过用优化来用于Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC连同小分子例如转化生长因子β(SB431542)、MEK/ERK(PD0325901)和Rho-激酶信号传导(Thiazovivin)高共表达的构建体重编程来获得。参见Groβ等人,Curr MolMed.13:765-76(2013)和Hou等人,Science 341:651:654(2013)。用于从干细胞生成内皮细胞的方法综述于Reed等人,Br J Clin Pharmacol.2013Apr；75(4):897-906。脐带血干细胞可从新鲜或冷冻的脐带血分离。间充质干细胞可从例如原始未纯化的骨髓或经ficoll纯化的骨髓获得。上皮和内皮细胞可根据本领域公知的方法从活体或尸体供体例如从将接受生物人工肺的受试者分离和收集。例如，上皮细胞可从皮肤组织样品(例如穿孔活检组织)获得，并且内皮细胞可从血管组织样品获得。

在一些实施方案中，经由置于血管系统中的导管将蛋白水解酶灌注至组织样品中。经酶处理的组织的一部分可以进行进一步的酶和机械破坏。可以分离以此方式获得的细胞混合物从而纯化上皮和内皮细胞。在一些情况下，基于存在或不存在特定的细胞表面标志物，可以使用基于流式细胞术的方法(例如，荧光激活的细胞分选)来分选细胞。此外，肺细胞(上皮、间充质和内皮)可从肺活检组织获得，所述活检组织可通过经支气管和支气管内活检或通过肺组织的手术活检来获得。在使用非自体细胞的情况下，应当考虑选择免疫类型匹配的细胞，使得在移植入受试者时不会排斥器官或组织。

可在缓冲溶液(例如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水)中漂洗分离的细胞，并在细胞培养基中重悬。标准的细胞培养方法可用于培养和扩增细胞群。一旦获得后，细胞可用于接种组织基质，例如经由动脉或静脉线(内皮细胞)或通过气道(器官)管线(上皮细胞)引入基质。例如，可以以任何合适的细胞密度用至少一种细胞类型体外接种组织基质。例如，接种基质的细胞密度可为至少1x10³细胞/克基质。可使用范围可为约1x10⁵至约1x10¹⁰细胞/克基质之间(例如至少100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、或10,000,000,000细胞/克基质)的细胞密度。

在一些情况下，可用上述细胞类型和细胞密度例如通过重力流动或灌注接种来接种如本文所提供的去细胞化或人工的肺组织基质。例如，流动灌注系统可用于经由保存于组织基质中的血管系统(例如通过动脉线)接种去细胞化的肺组织基质。在一些情况下，可在合适的条件下使用自动化流动灌注系统。此类灌注接种方法可改善接种效率，并在整个组合物中提供更均一分布的细胞。定量生物化学和图像分析技术可用于评估静态或灌注接种方法后接种细胞的分布。

在一些情况下，可以用一种或多种生长因子浸渍或灌注组织基质从而刺激接种的再生细胞的分化。例如，可用适用于本文所提供的方法和材料的生长因子浸渍或灌注组织基质，所述生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β生长因子、骨形态发生蛋白(例如BMP-1、BMP-4)、血小板来源的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)，例如FGF-10、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、或生长分化因子-5(GDF-5)。参见例如Desai和Cardoso,Respire.Res.3:2(2002)。可包封这些生长因子从而控制瞬时释放。可以用不同的生长因子增强支架的不同部分从而增加生长因子刺激的空间控制。在本方法中，可以用notch抑制剂、例如γ分泌酶抑制剂灌注接种气道的细胞。

可以在接种后温育接种的组织基质一段时间(例如从几小时至约14天或更多)从而增强组织基质中细胞的粘附和渗透。可在其中可使至少一些再生细胞在无细胞组织基质内和上增殖和/或分化的条件下维持接种的组织基质。此类条件可包括但不限于合适的温度(35-38摄氏度)和/或压力(例如大气压)、电和/或机械活性(例如经由正压或负压通气，其中呼气末正压(positive end expiratory pressure)为1-20cmH₂O、平均气道压为5-50cmH₂O、和峰值呼气压为5-65cmH₂O)，合适的气体，例如O₂(1-100％FiO₂)和/或CO₂(0-10％FiCO₂)，合适量的湿度(10-100％)，和无菌或接近无菌条件。此类条件还可以包括湿式通气、湿式至干式通气和干式通气。在一些情况下，可以将营养补充物(例如，营养物和/或碳源诸如葡萄糖)、外源激素、或生长因子添加至接种的组织基质。在优选的实施方案中，将notch抑制剂、例如γ分泌酶抑制剂通过气道添加至接种的细胞。可以进行组织学和细胞染色从而分析接种细胞的保留和增殖。可以进行任何合适的方法从而分析接种细胞分化。一般而言，本文所述的方法会在例如本文所述的气道器官生物反应器装置中进行。

因此，本文所述的方法可用于生成可移植的生物人工肺组织，例如用于移植入人受试者中。如本文所述的，可移植的组织将优选保留足够完整的血管系统，其可以与患者的血管系统连接。

本文所述的生物人工肺组织可以与包装材料组合从而生成制造品或试剂盒。用于生产制造商品的组分和方法是公知的。除了生物人工组织以外，制造品或试剂盒可以进一步包括例如一种或多种抗粘合剂、无菌水、药用载体、缓冲液、和/或用于促进体外和/或移植后功能性肺组织形成的其它试剂。另外，此类制造品中可以包含描述可如何使用其中含有的组合物的印刷的说明。制造品或试剂盒中的组分可以在各种合适的容器中包装。

Notch/γ-分泌酶抑制剂

可用于本方法的γ分泌酶抑制剂包括例如RO4929097；DAPT(N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙基酯)；L-685458((5S)-(叔丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)羟基-(2R)苄基己酰基)-L-leu-L-phe-酰胺)；BMS-708163(Avagacestat)；BMS-299897(2-[(1R)-1-[[(4-氯苯基)磺酰基](2,5-二氟苯基)氨基]乙基-5-氟苯丁酸)；MK-0752；YO-01027；MDL28170(Sigma)；LY411575(N-2((2S)-2-(3,5-二氟苯基)-2-羟基乙酰基)-N1-((7S)-5-甲基-6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂-7-基(azepin-7-yl))-l-丙氨酰胺，参见US 6,541,466)；ELN-46719(LY411575的2-羟基-戊酸酰胺类似物(其中LY411575为3,5-二氟-扁桃酸酰胺)(美国专利号6,541,466))；PF-03084014((S)-2-((S)-5,7-二氟-1,2,3,4-四氢萘基-3-基氨基)-N-(1-(2-甲基-1-(新戊基氨基)丙-2-基)-1H-咪唑-4-基)戊酰胺,Samon等人,Mol Cancer Ther 2012；11:1565-1575)；和化合物E((2S)-2-{[(3,5-二氟苯基)乙酰基]氨基}-N-[(3S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-1,4-苯并二氮杂-3-基(benzodiazepine-3-yl)]丙酰胺；参见WO 98/28268和Samon等人,Mol Cancer Ther 2012；11:1565-1575；可得自Alexis Biochemicals))，或其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，合适的γ分泌酶抑制剂包括：司马西特(semagacestat)(也称为LY450139，(2S)-2-羟基-3-甲基-N-[(1S)-1-甲基-2-氧代-2-[[(1S)-2,3,4,5-四氢-3-甲基-2-氧代-1H-3-苯并氮杂-1-基]氨基]乙基]丁酰胺，可得自Eli Lilly；WO 02/47671和美国专利号7,468,365)；LY411575(N-2((2S)-2-(3,5-二氟苯基)-2-羟基乙酰基)-N1-((7S)-5-甲基-6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂-7-基)-L-丙氨酰胺，可得自EliLilly,Fauq等人,Bioorg Med Chem Lett 17:6392-5,2007)；begacestat(也称为GSI-953,美国专利号7,300,951)；芳基磺酰胺(AS,Fuwa等人,Bioorg Med Chem Lett.16(16):4184-4189,2006)；N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-(S)-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT,Shih和Wang,Cancer Res.67:1879-1882,2007)；N-[N-3,5-二氟苯乙酰基]-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸甲酯(也称为DAPM，γ-分泌酶抑制剂XVI，可得自EMD Millipore)；化合物W(3,5-双(4-硝基苯氧基)苯甲酸，可得自Tocris Bioscience)；L-685,458((5S)-(叔丁氧基羰基氨基)-6-苯基-(4R)-羟基-(2R)-苄基己酰基)-L-亮氨酰-L-苯基丙氨酰胺，可得自Sigma-Aldrich,Shearmen等人,Biochemistry 39,8698-8704,2000)；BMS-289948(4-氯-N-(2,5-二氟苯基)-N-((1R)-{4-氟-2-[3-(1H-咪唑-1-基)丙基]苯基}乙基)苯磺酰胺盐酸盐，可得自Bristol Myers Squibb)；BMS-299897(4-[2-((1R)-1-{[(4-氯苯基)磺酰基]-2,5-二氟苯胺基}乙基)-5-氟苯基]丁酸，可得自Bristol Myers Squibb，参见Zheng等人,Xenobiotica39(7):544-55,2009)；avagacestat(也称为BMS-708163,(R)-2-(4-氯-N-(2-氟-4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苄基)苯基磺酰氨基)-5,5,5-三氟戊酰胺，可得自Bristol Myers Squibb,Albright等人,J Pharmacol.Exp.Ther.344(3):686-695,2013)；MK-0752(3-(4-((4-氯苯基)磺酰基)-4-(2,5-二氟苯基)环己基)丙酸，可得自Merck)；MRK-003((3'R,6R,9R)-5'-(2,2,2-三氟乙基)-2-((E)-3-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)丙-1-烯-1-基)-5,6,7,8,9,10-六氢螺[6,9-亚甲基苯并[8]轮烯-11,3'-[1,2,5]噻二唑烷]1',1'-二氧化物，可得自Merck,Mizuma等人,Mol Cancer Ther.11(9):1999-2009,2012)；MRK-560(N-[顺-4-[(4-氯苯基)磺酰基]--4-(2,5-二氟苯基)环己基]-1,1,1-三氟-甲磺酰胺,Best等人,JPharmacol Exp Ther.317(2):786-90,2006)；RO-4929097(也称为R4733,(S)-2,2-二甲基-N1-(6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂-7-基)-N3-(2,2,3,3,3-五氟丙基)丙二酰胺，可得自Hoffman-La Roche Inc.,Tolcher等人,J Clin.Oncol.30(19):2348-2353,2012)；JLK6(也称为7-氨基-4-氯-3-甲氧基异香豆素，可得自Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Petit等人,Nat.Cell.Biol.3:507-511,2001)；Tarenflurbil(也称为(R)-氟比洛芬(Flurbiprofen)，(2R)-2-(3-氟-4-苯基苯基)丙酸)；ALX-260-127(也称为化合物11，由Wolfe等人,J.Med.Chem.41:6,1998描述)；硫化舒林酸(SSide,Takahashi等人,JBiolChem.278(20):18664-70,2003)；1,1,1-三氟-N-(4-[5-氟-2-(三氟甲基)苯基]-4-{[4(三氟甲基)苯基]磺酰基}环己基)甲磺酰胺(描述于US20110275719)；N-[反-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2-氰基-5-氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氯苯基)环丁基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-(顺-3-(2,5-二氟苯基)-3-{[4-(三氟甲基)苯基]磺酰基}环丁基)-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-{顺-3-(5-氯-2-氟苯基)-3-[(4-氯苯基)磺酰基]环丁基}-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-{顺-3-(2,5-二氟苯基)-3-[(4-氟苯基)磺酰基]环丁基}-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-{顺-3-(2,5-二氟苯基)-3-[(3,4-二氟苯基)磺酰基]环丁基}-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氰基苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；4-{[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基][三氟甲基)磺酰基]氨基}丁酸(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟-N-[2-(四氢-2-吡喃-2-基氧基)乙基]甲磺酰胺(描述于US20110263580)；{[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基][(三氟甲基)磺酰基]氨基}乙酸甲酯(描述于US20110263580)；N-[3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟-N-甲基甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-[3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟-N-甲基甲磺酰胺(描述于US20110263580)；4-{[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基][(三氟-甲基)磺酰基]氨基}丁酸甲酯(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-N-[(三氟甲基)磺酰基]甘氨酸(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)-1-甲基环丁基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-(顺-3-(2,5-二氟苯基)-1-甲基-3-{[4-(三氟甲基)苯基]磺酰基}环丁基)-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟-N-[(三氟甲基)磺酰基]甲磺酰胺(描述于US20110263580)；[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基][(三氟甲基)磺酰基]氨基化(azanide)钠(描述于US20110263580)；[顺-3-[(4-氯苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基][(三氟甲基)磺酰基]氨基化钾(描述于US20110263580)；N-[顺-3-[(4-三氟甲氧基苯基)磺酰基]-3-(2,5-二氟苯基)环丁基]-1,1,1-三氟甲磺酰胺(描述于US20110263580)；1,1,1-三氟-N-(4-[5-氟-2-(三氟甲基)苯基]-4-{[4-(三氟甲基)苯基]磺酰基}环己基)甲磺酰胺(描述于US20110263580)；γ-分泌酶抑制剂I(也称为Z-Leu-Leu-Nle-CHO，苄氧基羰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨醛(norleucinal)，可得自Calbiochem)；γ-分泌酶抑制剂II：

(MOL)(CDX)(可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂III，(N-苄氧基羰基-Leu-亮氨醛，可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂IV，(N-(2-萘甲酰基)-Val-苯基丙氨醛，可得自Calbiochem)；γ-分泌酶抑制剂V(也称为Z-LF-CHO，N-苄氧基羰基-Leu-苯基丙氨醛，可得自EMD Millipore)；γ-分泌酶抑制剂VI(1-(S)-内-N-(1,3,3)-三甲基二环[2.2.1]庚-2-基)-4-氟苯基磺酰胺，可得自EMD Millipore)；γ分泌酶抑制剂VII，(也称为化合物A，MOC-LL-CHO，薄荷氧基羰基-LL-CHO，可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂X，({1S-苄基-4R-[1-(1S-氨甲酰-2-苯乙基氨甲酰)-1S-3-甲基丁基氨甲酰]-2R-羟基-5-苯基苯基}氨基甲酸叔丁酯，可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂XI，(7-氨基-4-氯-3-甲氧基异香豆素，可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂XII，(也称为Z-Ile-Leu-CHO，Shih和Wang,Cancer Res.67:1879-1882,2007)；γ分泌酶抑制剂XIII，(Z-Tyr-Ile-Leu-CHO，可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂XIV，(Z-Cys(t-Bu)-Ile-Leu-CHO，可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂XVII，(也称为WPE-III-31C)，(MOL)(CDX)(可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂XIX，(也称为苯并二氮杂(benzodiazepine)，(2S,3R)-3-(3,4-二氟苯基)-2-(4-氟苯基)-4-羟基-N-((3S)-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)-丁酰胺，Churcher等人,J MedChem.46(12):2275-8,2003)；γ分泌酶抑制剂XX，(也称为二苯并氮杂(dibenzazepine)，(S,S)-2-[2-(3,5-二氟苯基)乙酰基氨基]-N-(5-甲基-6-氧代-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂-7-基)丙酰胺，(MOL)(CDX)(Weihofen等人,Science 296:2215-2218,2002，可得自Calbiochem)；γ分泌酶抑制剂XXI，((S,S)-2-[2-(3,5-二氟苯基)-乙酰基氨基]-N-(1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-苯并[e][1,4]二氮杂-3-基)-丙酰胺，可得自Calbiochem)；5-甲基-2-丙-2-基环己基)N-[4-甲基-1-[(4-甲基-1-氧代戊-2-基)氨基]-1-氧代戊-2-基]氨基甲酸酯(可得自HDHPharma Inc.)；N-反-3,5-二甲氧基肉桂酰-Ile-亮氨醛(可得自Calbiochem)；N-叔丁氧基羰基-Gly-Val-缬氨醛(Valinal)；异戊酰-VV-Sta-A-Sta-OCH3(可得自Calbiochem)；二乙基-(5-苯基-3H-氮杂-2-基)-胺(描述于US 8188069)；二乙基-(5-异丙基-3H-氮杂-2-基)-胺(描述于US 8188069)；二乙基-(4-苯基-3H-氮杂-2-基)-胺(描述于US 8188069)；二乙基-(6-苯基-3H-氮杂-2-基)-胺(描述于US 8188069)；5-苯基-1,3-二氢-氮杂-2-酮(azepin-2-one)(描述于US 8188069)；5-异丙基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US8188069)；4-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；6-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；2-丁氧基-5-苯基-3H-氮杂(描述于US 8188069)；1-甲基-5-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；5-异丙基-l-甲基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；1-甲基-4-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；1-甲基-6-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；1-甲基-5-苯基-1H-氮杂-2,3-二酮-3-肟(描述于US 8188069)；5-异丙基-l-甲基-lH-氮杂-2,3-二酮-3-肟(描述于US 8188069)；1-甲基-6-苯基-1H-氮杂-2,3-二酮-3-肟(描述于US 8188069)；1-甲基-4-苯基-1H-氮杂-2,3-二酮-3-肟(描述于US 8188069)；3-氨基-l-甲基-5-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；3-氨基-5-异丙基-l-甲基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；3-氨基-l-甲基-4-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US8188069)；3-氨基-l-甲基-6-苯基-l,3-二氢-氮杂-2-酮(描述于US 8188069)；(S)-[1-(1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(描述于US 8188069)；[(S)-1-(5-异丙基-l-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]氨基甲酸叔丁酯(描述于US 8188069)；[(S)-1-(1-甲基-2-氧代-4-苯基-2,3-二氢-1H-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]氨基甲酸叔丁酯(描述于US 8188069)；[(S)-1-(1-甲基-2-氧代-6-苯基-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(描述于US 8188069)；(S)-2-氨基-N-(1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-氮杂-3-基)-丙酰胺(描述于US 8188069)；(S)-2-氨基-N-(5-异丙基-l-甲基-2-氧代-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基)丙酰胺(描述于US 8188069)；(S)-2-氨基-N-(I-甲基-2-氧代-6-苯基-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基)丙酰胺盐酸盐(描述于US 8188069)；(S)-2-氨基-N-(I-甲基-2-氧代-4-苯基-2,3-二氢-l H-氮杂-3-基)丙酰胺盐酸盐(描述于US 8188069)；(S)-2-氟-3-甲基-丁酸(描述于US 8188069)；(S)-2-羟基-3-甲基-N-[(S)-1-((S)-1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-1H-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]-丁酰胺(描述于US 8188069)；(S)-2-氟-3-甲基-N-[(S)-1-(1-甲基-2-氧代-5-苯基-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]-丁酰胺(描述于US8188069)；(S)-2-羟基-N-[(S)-1-(5-异丙基-l-甲基-2-氧代-2,3-二氢-1H-氮杂-3-基氨基甲酰基)乙基]-3-甲基-丁酰胺(描述于US 8188069)；(S)-2-羟基-3-甲基-N-[(S)-1-(1-甲基-2-氧代-4-苯基-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]-丁酰胺(描述于US 8188069)；(S)-2-羟基-3-甲基-N-[(S)-1-(1-甲基-2-氧代-6-苯基-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]-丁酰胺(描述于US8188069)；和(S)-2-氟-3-甲基-N-[(S)-1-(1-甲基-2-氧代-6-苯基-2,3-二氢-lH-氮杂-3-基氨基甲酰基)-乙基]-丁酰胺(描述于US 8188069)，或其药学上可接受的盐。

γ-分泌酶抑制剂的其他实例公开于美国专利申请公开号2004/0029862、2004/0049038、2004/0186147、2005/0215602、2005/0182111、2005/0182109、2005/0143369、2005/0119293、2007/0190046、2008/008316、2010/0197660和2011/0020232；美国专利号6,756,511；6,890,956；6,984,626；7,049,296；7,101,895；7,138,400；7,144,910；7,183,303；8,188,069；和国际公开号WO 1998/28268；WO 2001/70677、WO 2002/049038、WO 2004/186147、WO 2003/093253、WO 2003/093251、WO 2003/093252、WO 2003/093264、WO 2005/030731、WO 2005/014553、WO 2004/039800、WO 2004/039370、WO 2009/023453，EP1720909、EP 2178844、EP 2244713。

前述所有的全部公开内容引入于此以作参考。

使用人工肺的方法

本文还提供使用生物人工肺组织和在一些情况下促进肺功能的方法和材料。在一些实施方案中，本文提供的方法可以用于恢复具有受损的或降低的肺容量的疾病(例如囊性纤维化病、COPD、肺气肿、肺癌、哮喘、肺动脉高压、肺创伤、或其它遗传性或先天性肺异常，例如支气管囊肿、肺发育不全和低常增生(pulmonary agenesis and hypoplasia)、多肺泡叶、肺泡毛细管发育异常、隔离包括动静脉畸形(AVM)和弯刀综合征、肺淋巴管扩张(pulmonary lymphangiectasis)、先天性肺叶性肺气肿(CLE)、和囊性腺瘤样畸形(CAM)和其它肺囊肿)的患者中的一些肺功能。本文提供的方法还包括如下的那些，其中受试者鉴定为需要特定的规定治疗，例如升高的肺功能、或增加或改善的肺容量。

可根据本文提供的方法生成生物人工肺组织(例如全器官或其部分)。在一些实施方案中，该方法包括将如本文提供的生物人工肺组织移植入需要其的受试者(例如人类患者)。在一些实施方案中，将生物人工肺组织移植入患病或受损组织的部位。例如，生物人工肺组织可移植入受试者的胸腔中，替换(或配合)不发挥功能或发挥功能不良的肺；用于进行肺移植的方法是本领域已知的，参见例如Boasquevisque等人,Proceedings of theAmerican Thoracic Society 6:66-78(2009)；Camargo等人,Eur J Cardiothorac Surg2008；34:1206-1209(2008)；Yoshida等人,Ann Thorac Cardiovasc Surg.11(1):7-11(2005)；Venuta等人,Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683(2005)；Yang和Conte,Transplantation Proceedings 32(7):1521-1522(2000)；Gaissert和Patterson,“Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation,”in TheTransplantation and Replacement of Thoracic Organs,第2版.Springer Netherlands(1996)。

该方法可包括在部分或完全除去受试者的肺的手术过程期间和/或肺切除期间移植如本文提供的生物人工肺或其部分。该方法还可包括从活的供体或尸体收获肺或其部分，并在本文所述的生物反应器中保存或再生肺。在一些情况下，本文提供的方法可用于替换或补充肺组织并在受试者例如人类或动物受试者中起作用。

可进行任何合适的方法从而分析移植之前或之后的肺功能。例如，可实施方法从而评估组织愈合、评估功能性、和评估细胞向内生长(in-growth)。在一些情况下，可收集组织部分，并用固定剂例如中性缓冲福尔马林等处理。此类组织部分可脱水，包埋在石蜡中，并用切片机切片来进行组织学分析。可用苏木精和伊红(H&E)染色切片，然后安放于玻璃载玻片上以供形态学和细胞性的显微镜评价。例如，可进行组织学和细胞染色从而检测接种的细胞增殖。分析可包括移植的组织基质的功能性评价或成像技术(例如计算机断层摄影术(CT)、超声、或磁共振成像(例如造影剂增强的MRI))。分析可进一步包括在静息和生理应激下的功能性试验(例如身体体积描记术、肺功能测试)。可使用本领域已知的方法，例如组织学、电子显微术、和机械测试(例如体积和顺从性(compliance)的)来分析用细胞接种的基质的功能性。气体交换可以作为另一功能性分析来测量。为了分析细胞增殖，可以通过例如检测胸苷掺入来测量胸苷激酶活性。在一些情况下，基于血液中的氧水平，可以进行血液试验来评估肺的功能。

为了促进培养期间的功能性分析，本文所述的生物反应装置的任何系列可包括取样口(sampling port)从而允许功能参数(例如pH、葡萄糖、乳酸盐、Na、K、Ca、Cl、重碳酸盐(bicarb)、O₂、CO₂、sat)的单次或实时测量。代谢物也可用于使用比色分析来监测细胞数和生存力，并且生物化学分析可用于监测细胞成熟(例如测量表面活性蛋白等)。例如，增加的表面活性物质浓度可表明培养肺具有承受干式通气的足够的上皮细胞。在一些情况下，内皮屏障功能可用作血管成熟的标志物。可用不同大小的分子(例如限定大小的右旋糖酐和白蛋白)、和微珠(将大小从0.2增加至5um)、以及分离的红细胞灌注肺。然后可取样支气管肺泡灌洗液，从而评估这些标志物向肺泡腔中的泄露。例如，500-kDa右旋糖酐可与支气管肺泡灌洗分析组合使用，从而测定保留在血管隔室内的右旋糖酐的百分比。保留的右旋糖酐的百分比的增加表明屏障功能的改善，这是因为对右旋糖酐的屏障功能依赖于存活的和功能性的内皮，而右旋糖酐将在持续灌注期间随时间扩散穿过裸露的血管基底膜(例如在无细胞肺中)。例如，尸肺可基本上保留血管隔室内的所有右旋糖酐，而无细胞肺可保留小百分比的右旋糖酐(例如10.0％±8.0％)。大于容许的最小值(例如>10％的4um微珠、或大于20％的0.2um微珠)的这些标志物向肺泡腔中的泄露可用于表明肺不足够成熟，无法承受干式通风。

在一些情况下，分子生物学技术例如RT-PCR可用于量化代谢物(例如表面活性蛋白、粘蛋白-1)和分化标志物(例如TTF-1、p63、表面活性蛋白C)的表达。可使用任何合适的RT-PCR实验方案。简言之，可以通过如下收集总RNA：均质化生物样品(例如腱样品)，进行氯仿提取，并使用旋转柱(spincolumn)(例如微量旋转柱(Mini spin column)(QIAGEN,Valencia,CA))或其他核酸结合底物提取总RNA。在其他情况下，可使用抗体和标准免疫分析来检测与肺细胞类型和此类细胞类型的不同分化阶段相关的标志物。

气道器官生物反应器装置

示例性的气道器官生物反应器和其使用方法描述于WO 2015/138999，将其全部内容引入于此以作参考。其他示例性的生物反应器描述于Charest等人,Biomaterials.2015Jun；52:79-87；Gilpin等人,Ann Thorac Surg.2014Nov；98(5):1721-9；讨论1729；Price等人,Tissue Eng Part A 2010；16(8):2581–91；Petersen等人,CellTransplant 2011；20(7):1117–26；Bonvillain等人,J Vis Exp 2013；(82):e50825；Nichols等人,J Tissue Eng Regen Med.2016Jan 12.doi:10.1002/term.2113。

实施例

本发明在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1.肺上皮工程中人气道干细胞的再生潜力

传统上已持有肺上皮维持和修复的有限谱系概念。基底上皮细胞相对地未分化并特征性地表达转录因子Trp-63(p63)和细胞角蛋白5和14(Krt5/14)，并在修复期间作为肺气道的干细胞(32)。这在体内裸露气道修复模型中得到证实(43)。基底肺上皮细胞已分类为多潜能成体组织干细胞，其具有在损伤后产生基底(自我更新)、纤毛和克拉拉(棒状)细胞的能力(21,44)。远端肺泡上皮中的传统谱系等级(lineage hierarchy)模型将2型肺细胞定义为终末分化的1型肺细胞的祖细胞(45,46)。肺上皮谱系能力的新范例的实例包括支气管肺泡干细胞(BASC)，一种提出的细支气管棒状细胞和肺泡细胞二者的祖细胞群(47)。已报道发育的肺中的、可在出生后转变为成熟II型肺细胞祖细胞的双能肺泡祖细胞(48)。经典的肺泡II型/I型分化等级也已受到挑战，并且报道了新的、双向的潜力(49)。在流感损伤后，Krt5⁺气道干细胞的递送揭示了远端肺渗入，并有助于I型和II型肺细胞谱系二者(36)。这些研究突出了对传统细胞等级和身份的发展的理解。Notch信号传导也是在损伤后上皮命运决定的基础(27)。低水平Notch信号传导存在于稳态肺上皮，并在气道损伤后增加，驱动基底干细胞向分泌谱系的分化(39)。对上皮修复和远端肺细胞分化中的Notch信号传导的幅度和时间二者的更细致的理解正在发展。

本实验旨在利用此类易得和可扩增的基底干细胞群来响应损伤的能力，并在全器官工程的背景下重建上皮完整性和功能性组织(13,44)。天然细胞外基质内保留的结构和生物学生态位提供引导细胞植入和研究肺组织修复机制的有效模板(50,51)，并与扩展的仿生培养一并为人肺构建体的再生提供重要平台。

方法

以下材料和方法用于下述实施例。

研究批准

在知情同意后，从新英格兰器官银行(New England Organ Bank)获得不适用于移植的供体肺。实验由MGH IRB和动物利用方案(Animal Utilization Protocol)批准。

表1：肺供体信息

数据代表年龄(年)、性别(男性(M)或女性(F))、体重指数(BMI)、和供体状态(心脏死亡后捐献(DCD)或脑死亡后捐献(DBD))。年龄和BMI以总结的平均值±标准偏差表示。

细胞分离和扩增

在αMEM中洗涤供体肺外周组织(1-英寸立方体)，然后用剪刀切成～1/4英寸的片，并在0.1mg/ml DNAse(Sigma)和1.4mg/ml Pronase(Roche,11459643001)中消化24小时/4℃(52)。在未涂布的培养瓶上、SAGM中涂布消化的组织30分钟/37℃，然后非粘附的细胞转移并粘附至人胶原-IV(Sigma-Aldrich C7521)-涂布的培养瓶。在SAGM(Lonza,CC-3118)中维持上皮细胞并在80％汇合下传代(约3-5天/传代)。对于用γ-分泌酶抑制剂(1)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(100μg/ml IBMX,Sigma-Aldrich,I5879)和(2)N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙基酯(50μg/ml DAPT,Selleck Chemicals,S2215)处理的细胞，每天更换培养基。使用相同的消化实验方案从供体肺的大血管分离原代内皮细胞。通过流式细胞术分选内皮群体的CD31⁺纯度，并在明胶涂布的培养瓶上、EGM2(Lonza,CC-3162)中维持和增殖直至用于人肺再细胞化(参见图7A-B)。

气-液界面培养

在用胶原蛋白IV涂布的0.4μM Transwell插入物上涂布第3代的原代上皮细胞，并用SAGM保持浸没培养5天。仅在基底室中用PneumaCult^TM-ALI培养基(StemcellTechnologies,05001)替换培养基，并在气-液界面处维持21天，隔日更换培养基。

三维球状体分析

通过40μm筛网过滤第3代的原代上皮细胞，从而除去任何细胞团块，然后以5000个细胞/90uL的50:50基质胶(matrigel)-SAGM底物的密度转移至0.4μM Transwell插入物上，接着进行先前公开的实验方案(46)。通过光学显微镜(40x)确认单细胞悬浮液。仅在基底室中用SAGM维持细胞7天。

肺去细胞化

大鼠人供体肺如前所述去细胞化(2,6)。

基质切片培养分析

如前所述制备人肺基质切片(6)。将原代上皮细胞(第3代)以50,000个细胞/切片接种至基质并用SAGM维持5天。

大鼠肺再细胞化和培养

从2-D培养收获原代上皮细胞(第3代)，计数，并通过重力将其重新引入溶液(20ml)中的支架气道。通过蠕动泵将通过肺动脉的持续培养基灌注维持在4ml/min并每天更换。

对于连续气道正压(CPAP)大鼠肺培养，在上皮再细胞化和用SAGM恒定灌注培养7天后，将培养基更换为PneumaCult^TM-ALI(Stemcell Technologies,05001)，并且CPAP以20cmH₂O开始。气道正压通过将气管连接至连续加压至20cmH₂O的二级储存室来持续。

人肺再细胞化和仿生培养

从完整的去细胞化的人肺手术分离单片肺叶并将套管置于肺动脉、肺静脉、和支气管中。通过浸泡在4％乙醇中的0.1％过乙酸中60分钟/25℃来将肺叶灭菌，接着3xPBS洗涤，然后经2小时暴露于10,000拉德(Rad)的γ-辐射。分离的肺叶无菌地安装在生物反应器中并通过过夜SAGM灌注进行组织预处理(primed)。

以通过泵以50mmHg的恒定压力经由肺动脉将总共160-240x10⁶个原代供体来源的CD31⁺内皮细胞首先递送至血管系统。90分钟后，通过泵以50ml/min在溶液(500ml总培养基)中将220-280x10⁶个上皮细胞(第4代)递送至主气道。在单独的实验中，再细胞化总共n＝4个独立的肺叶。

含有40ng/ml VEGF的SAGM的恒定灌注在20-40ml/min下维持7(n＝3)或10(n＝1)天。连续监测灌注压并维持在生理范围内(平均值＝21.39±4.53mmHg，参见图5C)。通过室压振荡产生负压通气从而实现6次呼吸循环/分钟的呼吸速率。在培养的第3天开始通气并维持2-小时/天。通过iSTAT卡盒(iSTAT cartridge)(CG4+/CG8+,Abbott)每天试验来自肺动脉、肺静脉、和室的培养基。

在培养的最后一天进行正压通气激发。使用Drager Evita 4通风器施加体积控制的通气，其中潮气量为150-200mL、PEEP为5mmHg、和呼吸速率为12次呼吸/min。使用GC3+iSTAT卡盒，在通气10分钟后用21％FiO₂并再在10分钟后用100％FiO₂分析样品。

在培养的最后一天，以30ml/min的恒定流量循环0.05mM刃天青溶液90分钟，然后目视检查组织的染料颜色的代谢转化。然后将组织样品固定在5％福尔马林中，或保存在RNAlater(Qiagen)中用于随后的分析。

定量PCR

使用RNEasy Plus(Qiagen)分离RNA。使用Superscript III试剂盒(Invitrogen)转录cDNA。使用Taqman探针和OneStep Plus系统(AppliedBiosystems)分析定量基因表达。表达归一化为β-肌动蛋白表达并相对于尸肺组织对照样品。

免疫染色

一抗(1:100)：p63(Santa Cruz，sc-25268)、Krt5(Abcam，ab24647)、E-钙粘着蛋白(BD，610181)、表面活性蛋白-B(Millipore，AB3430)、前表面活性蛋白-C(Abcam，ab3786)、水通道蛋白-5(Abcam，ab92320)、乙酰化α-微管蛋白(Abcam，ab24610)、α₂β₁整联蛋白(Abcam，ab24697)、α₃β₁整联蛋白(Abcam，ab24696)、和CD31(Daki，M082301-2)。二抗(1:400)：Alexafluor 488和594(Life Technologies)。

结果

首先从人类尸体外周肺组织分离高度增殖的细胞群。在培养基中的连续传代期间可重复地观察到Krt5⁺p63⁺基底干细胞群的强烈扩增(图1A-B)。分离的细胞群的增殖能力通过3次传代来维持(染色的Ki67⁺细胞，63.4±8.08％)，其在第4代时开始下降(图1C)。通过第1代和第4代细胞的流式细胞术分析进一步检验表型稳定性，证实Krt5⁺p63⁺基底干细胞谱系的扩增(图1D)。基因表达纵向作图(图1E)，另外证实气道干细胞群的富集，其中平行损失1型和2型肺细胞、以及CCSP⁺分泌细胞。在细胞扩增期间没有测量到间充质基因波形蛋白或平滑肌肌动蛋白(SMA)表达的增加，并且上皮-间充质转化相关转录因子ZEB1和SNAIL的表达没有增加。还通过Ki67的基因表达证实第3代的最大细胞增殖。在本实验中，在细胞分离和传代期间使用ROCK抑制剂Y-27632(53)不增强基底细胞群、或改变增殖(Ki67、PCNA)或衰老(衰老相关细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A、CDKN2A)(54)(图8A-C)，并且不用于体外扩增。

在无细胞肺支架上成功形成功能性上皮将需要含有多个细胞谱系的复杂组织的重建。因此，通过证实在体外气-液界面(ALI)处培养时分离和扩增的细胞的纤毛发生能力来试验其再生潜力(图2A)。观察到假复层上皮，其包括乙酰化α-微管蛋白⁺纤毛上层、基底Krt5⁺p63⁺细胞层、叉头蛋白(Forkhead box protein)-J1(FOXJ1)的核表达、和细胞-细胞紧密连接形成(E-钙粘着蛋白)，共同表明保持表型多样性、分化潜力、和生理自组织能力(图2B)。为了试验这种在全器官再细胞化中的潜力，将再上皮化的大鼠肺在恒定培养基灌注下维持7天，然后转变为连续气道正压(CPAP)模型另外7天从而在肺支架上再现ALI，或者仅用血管灌注维持，总共14天离体培养(图2C)。在CPAP培养后维持广泛的基底细胞(Krt5⁺)再增殖，内衬(lining)气道和肺泡结构。观察到FOXJ1表达的诱导，E-钙粘着蛋白强度的增加、和增殖(Ki67)的降低(图2D-E)。通过基因表达定量证实向纤毛上皮表型的早期诱导，揭示在培养的第7天和第14天时CPAP肺相对于仅血管灌注的肺中FOXJ1和E-钙粘着蛋白表达的显著增加(图2F)。

接着通过借由γ-分泌酶活性抑制Notch信号传导来检验细胞可塑性。尽管单个试剂的结果在一定程度上取决于供体细胞而可变，但用Notch抑制剂IBMX和DAPT的组合体外处理第3代细胞诱导核Nkx2.1和细胞质proSP-C表达(图3A)。这通过基因表达分析进一步证实，表明II型肺细胞标志物表面活性蛋白-B(SP-B)和SP-C的显著增加(Notch抑制后22.06±0.29倍增加)，同时保持基底干细胞群(p63)(图3B)。在Notch信号传导抑制后还定量了1型肺细胞标志物水通道蛋白5(AQP5)和HOPX1的损失、和分泌细胞标志物表达(CCSP)的损失。当在条件培养基中通过ELISA测量时，表面活性蛋白-C的产生也增加(0.33±1.13pg/ml未处理相对于1.13±0.09pg/ml Notch抑制处理后)。用GSI X和LY411575处理还增加AQP5表达(其是1型细胞而不是2型细胞的标志物，但2型细胞分化为1型细胞)，但IBMX+DAPT处理不支持AQP5表达(参见图3和图11)。

培养于基质支持物(Matrigel)中的单个上皮细胞可以在体外经7天形成3D球状体，具有管腔发育(图3D)和上皮极性的证据(图3C)。用双Notch抑制(IBMX+DAPT)处理的培养物形成显著较少的球状体(图3E-F)。基因表达分析进一步证实在3D培养中抑制Notch信号传导通路可促进向II型肺细胞群(SP-B、SP-C)的转化、I型肺细胞(AQP5、HOPX1)的损失、棒状细胞(CCSP)的损失、和基底干细胞标志物表达(p63)无显著改变(图3G)。

体外接种至人去细胞化的肺切片的细胞表明特定细胞经由整联蛋白α2β1和α3β1附着至基质，沿着基质附着区域形成紧密连接(E-钙粘着蛋白)，和持续的整体增殖(Ki67⁺)(图4A)。在接种于来自新生儿供体(HL38，年龄3天)和来自健康成人肺(HL30)的肺基质上的细胞中分析Notch抑制后的基因表达。II型肺细胞群的诱导发现于用Notch抑制剂处理的两种培养物中(图4B)。扩大至整个啮齿动物肺再上皮化和培养(图4C)，相对于仅用培养基灌注的肺，用Notch抑制剂的连续培养基灌注5天后还证实了向II型肺细胞群的转变(图4D-E)。

为了使得能够大规模全器官培养，将本分离的肺生物反应器系统调整适用于完整人肺支架的再细胞化(55)(图5A)。将扩增的基底干细胞群递送至人肺支架的气道，另外，将原代人肺来源的内皮细胞(CD31⁺)递送至血管隔室(图5B)。将生物反应器保持离体再生器官的生理灌注范围(平均值＝21.39±4.53mmHg)(图5C)，同时以非侵入性方式监测细胞存活和代谢活性7-10天。每48小时测量灌注液中的增加的葡萄糖消耗和乳酸产生(图5D-E)。通过在设定的室压目标之间振荡实现6次呼吸/分钟的肺构建体的负压通气(图5F)，导致15.88mmHg(14.42-21.73mmHg，n＝2447次呼吸)的中值峰值跨壁压力和138.08ml/呼吸(78.08-183.32ml,n＝2447次呼吸)的中值潮气量(图5G-I)。进行正压通气作为潜在器官功能的终点试验(图5J)，并且在21％和100％的FiO₂下的通气10分钟后，测量向灌注液培养基的氧合转移。测量所得的72mmHg(PaO₂/FiO₂＝343mmHg)的pO₂，其增加至412mmHg(PaO₂/FiO₂＝412mmHg)，相应的pCO₂分别为17.5mmHg和24.9mmHg(图5K)。这表明再生的人肺构建体可支持再细胞化和培养后的最低的器官功能和气体转移。

在含有刃天青的灌注液的代谢后，目视评估组织再细胞化和细胞生存力，注意到通过活细胞代谢为粉色(图6B)。通过跨越各肺的多个区域的组织学染色研究覆盖的程度和细胞形态(图6B)。发现了在整个再增殖支架中的广泛细胞分布，从上气道至远端肺区域，其中细胞排列与保留的基质结构一致。证实了再引入的细胞在基质内继续扩增的能力。在器官培养结束时高达75％的细胞在增殖(61.7％±10.4)(图6C-D)。发现基底干细胞群与内皮细胞共培养增加体外上皮增殖(图9A-B)，这支持全肺培养中的效果。在整个再生的肺组织中观察到强的Krt5⁺p63⁺基底干细胞表型(图6Ei)，识别了非粘附性proSP-B⁺细胞的非常小的贡献(图6Eii)。还在大鼠和肺全肺培养物中观察到上皮细胞粘附至大气道(图6F)。在整个血管隔室中观察到异质内皮细胞覆盖，这对应于基于接种的初始细胞数的预期分布。可识别不发育的气体交换单元，其由内衬肺泡-毛细血管界面的单层内皮和上皮细胞代表(图6Gi)，并发现了再增殖的血管(图6Gii)。进一步分析保留在培养的肺中的上皮细胞群的基因表达，证实相对于正常肺，维持基底干细胞群(p63表达超过正常尸肺组织的25倍)，和其他成熟肺上皮谱系(CCSP、FOXJ1、Nkx2.1、和SP-B)的非常低的表达水平(图6H)。

另外，在BESC递送至无细胞大鼠肺支架的气道和离体仿生培养后证实诱导远端2型肺细胞命运，其中通过血管灌注液递送抑制剂DAPT+IBMX 5天(SP-C表达的13.08±1.15倍增加)，参见图4A-B和E。BESC还可在再细胞化之前体外预分化，然后显示在肺支架再生和抑制剂撤除(withdrawal)后维持持续的远端命运，参见图10A。再生肺组织的分析证实具有组织化的组织结构和形态的广泛的肺泡再细胞化，参见图10B。

实施例2.通过生腱蛋白-C和肌原纤蛋白-2增强的天然人支架上的上皮细胞再生

通常，基于天然基质支架的器官工程涉及将再生细胞群与对应生物基质组合从而根据需要形成功能性移植物。在肺去细胞化后保留的细胞外基质(ECM)为再细胞化后的全器官再生提供必要的结构和生物物理提示。在活跃的肺泡生成期间，早期产后肺中的独特的ECM组成可具有可帮助驱动细胞粘附、存活、和增殖的不同信号。

方法

以下材料和方法用于实施例2。

研究批准。在知情同意后，从新英格兰器官银行获得不适用于移植的人供体肺(参见下表1)。实验由麻省总医院内部审查委员会(Massachusetts General HospitalInternal Review Board)和动物利用方案批准。供体的统计情况(demographics)列于表1。

表1–供体统计情况。年龄为天(D，新生儿)和年(成人)。妊娠期列为周(新生儿，不适用(N/A)于成人供体)。性别列为男性(M)或女性(F)。两组均列出体重指数(BMI)。

细胞分离和扩增。从如上所述的成人供体肺外周组织分离上皮细胞，并在体外在小气道生长培养基(SAGM,Lonza,CC-3118)中维持在人胶原蛋白IV(Sigma-Aldrich,C7521)-涂布的培养瓶上，直至在第3代用于实验。

肺去细胞化。如前所述去细胞化大鼠和人供体肺(Gilpin等人,The Journal ofheart and lung transplantation:the official publication of the InternationalSociety for Heart Transplantation.2014；33(3):298-308；Guyette等人,Natureprotocols.2014；9(6):1451-68)。简言之，从雄性斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley)大鼠(250-300g，>8周龄，Charles River Laboratories)移出尸体大鼠肺，并通过以40mmHg经由肺动脉灌注0.1％SDS溶液来去细胞化，接着洗涤。通过以30mmHg和60mmHg之间的恒定压力经由肺动脉灌注0.5％SDS溶液来进行人肺去细胞化。

肺ECM消化用于体外涂布和培养。冻干来自去细胞化的肺(新生儿，n＝3，和成人，n＝3)的组织样品，并在胃蛋白酶缓冲液(每mL的0.1M无菌HCl为1mg胃蛋白酶)中以10mg/mL在室温下机械均化24h。在涂布前，胃蛋白酶消化的组织在0.1M乙酸中1:100稀释至0.1mg/mL的终浓度。将涂层添加至组织培养板并在300xg下离心5min。总共1x10⁶个BESC(通过p63和Krt5表达来识别)添加至24孔板的各孔，并在SAGM中培养7d。

在用如上所述用ECM涂布的96孔板中进行细胞毒性分析，其中将总共1x10⁵个BESC添加至各孔。5天培养后，按照生产商的说明进行MultiTox-FluorMultiplex细胞毒性分析(Promega)，并且在400Ex/505Em下读取活细胞荧光；在485Ex/520Em下测量死细胞荧光。

蛋白质组学样品制备。如前所述制备去细胞化的新生儿和成人肺组织用于蛋白质组学分析(Li等人,Biomaterials.2016；75:37-46；Li等人Biomaterials.2016；81:104-13)。在冰上切碎约90mg各组织，并用一次性颗粒杵(disposable pellet pestle)在1.5-mL管中研磨1min，接着添加300μL SDT溶液—4％SDS,0.1M Tris-HCl(pH 7.6)和0.1M二硫苏糖醇(DTT)(所有试剂都来自Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。然后在95℃下加热样品7min，并用探针超声波仪(Misonix XL2015,Misonix microtip PN/418,Farmingdale,NY)在冰上超声处理—交替20秒开和20秒关6min，接着在22℃下以16,100×g离心5min。在30K MWVivacon 500过滤器(Sartorius,Bohemia,NY)中混合样品上清液的等分试样(2×30μL)与2×200μL的8M脲/0.1M Tris缓冲液(pH 8.0)。洗涤样品，用碘乙酰胺烷基化，进一步洗涤，然后用胰蛋白酶(Promega,Madison,WI；50:1(w/w)的蛋白质:酶比)在37℃下过夜消化，通过离心收集消化的肽。然后用10％三氟乙酸(TFA)猝灭消化，TFA的终浓度为0.5％。

经猝灭的消化物在HPLC系统(Shimadzu,Columbia,MD)上使用C18柱(5μm,,250×4.6mm,Phenomenex,Torrance,CA)进行高pH分级。流动相A为20mM甲酸铵水溶液，流动相B为70％乙腈(ACN)中的20mM甲酸铵；0–100％流动相B的梯度在20min内发生。HPLC流速为1mL/min，收集洗脱液并合并为6个级分，各级分在SpeedVac中蒸干，并在5％CAN，2％甲酸(FA)中重构。

用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的蛋白质组学分析。将重构的肽溶液注入与ESI离子阱/Orbitrap质谱仪(LTQ Orbitrap Velos,Thermo Scientific,Waltham,MA)偶联的Waters nanoAcquity HPLC中。在填充有20cm的1.7μmBEH C18颗粒(Waters,Milford,MA)的100μm内径柱上分离肽，并以0.3μL/min在0.1％FA中以增加的ACN的梯度在2.5h内洗脱。筒式加热器(heatercartridge)用于将毛细管柱保持在60℃。在Orbitrap中以60,000的分辨率进行全质量扫描(300-1500m/z)。选择十个最强峰用于通过高能碰撞解离(HCD)以42％碰撞能量进行的碎裂(fragmentation)，然后用7,500的分辨率和2.5m/z的分离宽度分析。用30s内1次的重复计数和120s的排除持续时间进行动态排除。

蛋白质组学数据分析。通过MaxQuant版本1.5.2.8分析获得的原始文件(Cox等人,Nat Biotech.2008；26(12):1367-72)。使用的UniProt数据库包含2013年12月5日下载的来自智人(Homo sapiens)的20,278个审核的序列，补充有262种常见污染物。前体和片段离子质量公差分别设定为4.5ppm和20ppm。指定了静态半胱氨酸脲甲基化(+57.0215Da)和高达7个可变的甲硫氨酸和脯氨酸氧化(+15.9949Da)。允许肽和蛋白质水平上的1％的错误发现率。允许至多两个遗漏的切割，并且需要每个蛋白质最少两个独特的肽。丢弃包含与来自反向数据库的蛋白质或污染物匹配的蛋白质组。仅独特的剃刀肽(razor peptide)用于定量，并需要最小计数为2。通过基于强度的绝对定量(iBAQ)测量各样品中的蛋白质的相对丰度，并且将嵌入MaxQuant软件包中的无标记定量(LFQ)算法用于在不同样品之间比较蛋白质的丰度。Perseus软件(版本1.5.0.15)用于下游数据处理。通过在至少一个样品组(新生儿或成人)中要求至少两个有效值来过滤蛋白质。校正的强度进行log2变换，并且通过利用0.3的宽度和0.9的降级(downshift)使用数据插补来替换缺失值。进行双样本t检验和Benjamini-Hochberg校正来统计学比较新生儿和成人组织中的个体蛋白的LFQ值。

体外培养和迁移分析。用人胶原蛋白IV(10μg/ml)在37℃下Sigma-AldrichC7521)预涂布24孔板2h。在移除胶原蛋白溶液后，接着将TN-C(10μg/ml，R&D 3358-TC-050)或者人FBN-2(10μg/ml)(Lin等人,The Journal of biological chemistry.2002；277(52):50795-804)的重组N末端半部分(half)(FBN-2-N)或C末端半部分(FBN-2-C)添加至选择的孔中，并在37℃下温育2h。随后将总共1×10⁵BESC涂布至各孔并在SAGM中培养7d。

对于迁移分析，如上涂布后，在细胞接种前将小插入物(IBIDI)添加至孔。在插入物中接种总共1×10⁴个细胞并温育12h，然后移除插入物。180min内每30min取亮视野图像从而追踪细胞迁移。用ImageJ软件(Schneider等人,Nature methods.2012；9(7):671-5)分析图像从而定量无细胞区域中的变化。

离体大鼠肺再细胞化和培养。通过经由气管递送，用(A)PBS对照，(B)TN-C，10μg/ml，(C)FBN-2，(FBN-2的N-末端和C-末端各10μg/ml)，或(D)TN-C+FBN-2(TN-C和FBN-2的N-末端和C-末端各10μg/ml)预涂布去细胞化的肺支架。溶液在37℃下循环至气管90min。然后通过重力在20ml的SAGM中将总共20×10⁶个原代肺上皮细胞(第3代)递送至支架气道。通过肺动脉的SAGM的恒定培养基灌注维持在4ml/min下(压力15-20mmHg)并每天更换。再细胞化的肺在培养物中维持7天，其中在第3天移除右肺用于时间点分析。

定量PCR。分离mRNA(Qiagen RNeasy Plus试剂盒)并转录为cDNA(InvitrogenSuperScript III)。使用Taqman探针和OneStep Plus系统(Applied Biosystems)分析基因表达。在实验重复(n＝2的qPCR反应的重复孔)中分析各生物样品，并且将各重复的Ct值取平均值并用作n＝1的独特的生物样品。各样品的表达归一化为β-肌动蛋白(ACTA1)基因表达(ΔCt)并相对于尸体外周肺组织对照样品(ΔΔCt)，其中通过2-ΔΔCt计算变化倍数(Livak和Schmittgen,Methods.2001；25(4):402-8)。对各报告的实验分析总共n＝3的独特的生物样品。

免疫染色。在去石蜡化和再水化后，适当时，用0.1％Triton X-100透析5μm组织切片用于细胞内抗原。在染色前用冰冷的甲醇固定培养物中的细胞。用1％驴血清封闭所有样品1小时。一抗全部1:100稀释：p63(Biocare Medica，CM163A)、Krt5(Abcam，ab24647)、E-钙粘着蛋白(BD Biosciences，610181)、Ki67(Abcam，ab16667)。二抗全部1:400稀释：与AlexaFluor 488或594(Life Technologies)缀合的驴抗小鼠、兔、或山羊。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色样品从而可视化细胞核并使用Nikon Ti-Eclipse显微镜成像。

使用ImageJ软件(NIH)进行图像分析，并在n＝3的独特的切片上测量隔膜厚度，其中每个切片n＝5个测量的区域(参见图18)。

统计分析。对于所有实验，所述n值代表独立的生物样品。根据需要使用GraphPad软件通过单因素或双因素方差分析数据。相应地报告所有统计学显著性。*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。

结果

将认为不适用于临床移植的捐献的人肺首先通过0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液的恒定压力血管灌注来去细胞化(参见图17A-B)，接着充分洗涤从而除去残余洗涤剂和细胞组分，从而产生细胞外基质蛋白质支架(先前描述于Gilpin等人,The Journal ofheart and lung transplantation:the official publication of the InternationalSociety for Heart Transplantation.2014；33(3):298-308；Guyette等人,Natureprotocols.2014；9(6):1451-68)。总共n＝3个新生儿(小于1周寿命)肺支架和n＝3个成人肺支架以该方式制备用于随后的分析(参见表1)。

我们首先旨在评价原代供体组织来源的基底上皮干细胞(BESC)在源自新生儿相对于成人肺的ECM上培养时的反应。为此，来自各新生儿和成人供体的无细胞肺ECM制备为体外上皮细胞培养用涂层(图12A)。在BESC在各底物上培养7d后，发现相比于成人肺ECM上生长的细胞，新生儿ECM上的细胞显著地更有增殖性(Ki67和PCNA表达)和更少衰老(CDKN2A表达)(图12B)。没有发现上皮表型的显著不同(E-钙粘着蛋白、p63表达)，并且没有观察到间充质标记物平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达的增加。通过总细胞评估，通过7d培养，在新生儿ECM涂层上比成人肺ECM上移植显著更多的活细胞，而未发现死细胞数的差异(图12C)。

然后为了研究可介导该效果的蛋白质组成的差异，我们通过蛋白质组学分析用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)评估了来自新生儿与成人供体肺的无细胞肺支架。图13A中的热图显示了来自各生物样品的各蛋白质的丰度的改变。在两组中，除了较小数量的高丰度蛋白质以外(红色)，测量了很多低丰度蛋白质(绿色)。基质组的子类的进一步分析(图13B)显示新生儿肺支架包含大量胶原蛋白，而其他子类(糖蛋白、蛋白多糖、ECM调节剂等)在成人支架中更丰富。

然后在新生儿相对于成人支架中比较各单独的基质蛋白的测量的丰度。生成火山图，显示针对统计p值作图的蛋白质丰度的变化倍数(成人相对于新生儿)。在新生儿或成人支架中富含的选择的蛋白质在图14A中突出显示，并在图14B中详细列出。

发现相对于成人样品，新生儿支架中富含肌原纤蛋白2和3(肌原纤蛋白-2＝202.74倍变化，p＝2.8x10^-2)。肌原纤蛋白是弹性蛋白沉积和弹性纤维形成所必需的糖蛋白，其支持肺泡发育和结构(Peirce等人,Ciba Foundation symposium.1995；192(199-212；讨论-4)。具体地，FBN-2的表达模式主要限于发育胎儿组织(Zhang等人,The Journalof cell biology.1994；124(5):855-6)。另外，已显示在发育和组织修复两者中，FBN-2与TN-C相互作用(Brinckmann等人,Laboratory investigation；a journal of technicalmethods and pathology.2010；90(5):739-52)。TN-C还发现于产后肺ECM并且已显示帮助分枝形态发生过程(Young等人,Developmental biology.1994；161(2):615-25)。这两种蛋白质在新生儿肺支架中富含促使我们进一步分析它们作为在新生儿肺ECM涂层上发现的增强的上皮修复反应的潜在介质的作用。

我们试验了这些单个蛋白质是否可在体外再现新生儿ECM对BESC的有益作用。BESC在首先用胶原蛋白IV涂布、然后用TN-C和/或FBN-2重组N-和C-末端半部分补充的板上培养，并将其与未涂布的孔上的培养比较(图15A)。如当BESC在分离的新生儿ECM涂层上培养时所观察到的，我们发现在FBN-2和TN-C涂布的板上生长的BESC显著地较多增殖和较少衰老，其中在TN-C+FBN-2-C末端半部分涂层上测量到最显著的反应。当与未涂布或胶原蛋白IV涂布的孔比较时，未发现上皮表型的不同。未检测到响应于不同蛋白质涂层，TN-C、FBN-2、或波形蛋白的显著变化(图15A)。另外，如通过平滑肌肌动蛋白(SMA)表达和转录因子SNAIL和ZEB所评估的，在不同涂层上未识别到上皮-间充质转化(EMT)的证据(图15A)。在不同的ECM涂层上生长的BESC的免疫荧光染色证实基因表达分析的发现，并且当定量Ki67表达时，在FBN-2和TN-C涂布的板上发现显著不同(图15B-C)。通过定量细胞迁移分析，还在不同的蛋白质涂层上研究了BESC迁移。FBN-2的N-和C-末端半部分的混合物用于迁移分析。当与仅胶原蛋白IV涂层比较时，在FBN-2和TN-C涂布的板上在3h内识别出显著较高的BESC迁移速率(p<0.001，图15D)。另外，作为细胞迁移的另一指标的粘着斑激酶(FAK)(Mitra等人,Nature reviews Molecular cell biology.2005；6(1):56-6)的基因表达在各种涂层上测量，其中在TN-C+FBN-2C末端片段涂布的板上生长的BESC中具有显著较高的表达水平(图15E)。

为了在整个肺上皮组织再生的背景下最终评估这些发现，我们评价了上皮再细胞化前无细胞肺支架的BN-2(混合的N和C末端片段)和TN-C预处理的效果。在预涂布和BESC再上皮化后，肺维持在离体仿生培养中7d，其中在第3天移除右肺用于时间点分析。

在再生的第3天和第7天，用支架预处理，组织分析再次识别了显著较多的上皮增殖(图16A)。通过FBN-2+TN-C支架涂层显著降低培养的第7天细胞衰老的增加。FBN-2+TN-C处理后第3天测量E-钙粘着蛋白表达的增加，但另外通过支架涂层未改变上皮命运。处理未上调FBN-2和TN-C。未注意到间充质表型或EMT相关转录因子表达的增加。当与未处理的肺比较时，通过苏木精和伊红染色的再上皮化的肺组织的总形态分析揭示涂布的肺中改善的组织结构、细胞对齐(alignment)至基质、和较少的细胞肥大(图16B)。这些观察在培养的第7天时最明显。

进行免疫荧光染色从而评估上皮命运和增殖。Krt5+BESC的Ki67表达的定量证实当用FBN-2和TN-C预涂布肺支架时增殖的显著增加，其中当两种蛋白质组合用于支架涂布时，发现最大的细胞反应(图16C-D)。

通过测量隔膜厚度定量组织形态还证实预涂布支架导致再生的肺组织中较多细胞对齐和较少隔膜增厚的观察(图16E和图18)。这导致在大小和结构两方面具有更相似于天然肺组织的外观的肺泡结构。

共同地，这些结果表明用FBN-2和TN-C蛋白质处理无细胞肺基质可增强基底上皮干细胞迁移、增殖，并帮助肺组织修复。

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其他实施方案

应理解虽然已结合其详细的说明书描述本发明，但是前述说明书旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点、和修改在所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种提供生物人工肺器官的方法，所述方法包括：

提供来自人供体的增殖性基底干细胞的群，其中所述细胞为Krt5⁺p63⁺细胞，优选从所述供体的气道获得；

任选地将培养物中的所述细胞维持并扩增至多5次传代(优选其中细胞在60-100％、优选80％的汇合下传代)，任选地在不存在ROCK抑制剂的情况下；

提供包含气道和丰富血管系统的(无细胞)肺组织基质；

通过所述气道用所述干细胞接种所述肺组织基质，和通过所述血管系统用内皮细胞接种所述肺组织基质；和

在足以在所述气道和功能性血管系统中形成功能性上皮的条件下维持所述基质，其中维持所述基质包括使用包含notch抑制剂、优选γ分泌酶抑制剂的液体培养基给所述肺组织基质提供足以发生第一期望程度的器官成熟、从而生成湿式成熟器官的时间的湿式通气；和任选地在湿式通气期间在器官室中维持基本上恒定的流体水平。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述器官室包括各自由控制模块控制的室压传感器和双向排出室泵，所述控制模块响应于由所述室压传感器传输的数据来控制双向排出泵。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过平衡静脉线中的压力水平与培养基储存器中的压力水平来防止跨肺压力梯度。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述器官室进一步包含与所述器官室连接的气动压力控制模块，其中所述气动压力控制模块：

在吸气阶段在所述器官室中产生负压；

对于平台阶段维持所述器官室的压力；和

在呼气阶段在所述器官室中产生正压。

5.根据权利要求1所述的方法，其中湿式通气包括：

将气管线与培养基储存器连接，其中所述气管线包括与控制器连接的双向气管泵；

使用所述双向气管泵用培养基使所述肺组织基质充胀；和

使用所述双向气管泵从所述肺组织基质抽出培养基来使所述肺组织基质收缩，

其中所述培养基在湿式通气期间持续更新。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述湿式通气包括：

将气管线与培养基储存器连接，其中所述气管线包括各自与控制器连接的第一泵和第二泵；

使用所述第一泵用培养基使所述肺组织基质充胀；和

使用所述第二泵从所述肺组织基质抽出培养基来使所述肺组织基质收缩，

其中所述培养基在湿式通气期间持续更新。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述控制器响应于与所述气管线连接的气管压力传感器传输的数据来控制双向气管泵。

8.根据权利要求1所述的方法，其包括使用包含notch抑制剂的液体培养基提供湿式通气至少2、5、7、或10天，任选地接着使用不包含notch抑制剂的液体培养基另外湿式通气。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述肺组织基质包含外源添加的生腱蛋白-c和/或外源添加的肌原纤蛋白-2中的一种或两种。

10.根据权利要求9所述的方法，其包括在接种前将肺组织基质与生腱蛋白-c或肌原纤蛋白-2中的一种或两种接触。

11.一种功能性肺，其根据权利要求1-10任一项所述的方法生产。

12.根据权利要求11所述的功能性肺，其中器官为完整的肺或其血管化的部分。

13.一种治疗具有受损的或降低的肺容量的受试者的方法，所述方法包括将根据权利要求11所述的肺移植入所述受试者体内。

14.根据权利要求11所述的功能性肺在治疗具有受损的或降低的肺容量的受试者的方法中的用途。

15.根据权利要求11所述的功能性肺，其用于治疗具有受损的或降低的肺容量的受试者的方法。