JP5385904B2 - γ−セクレターゼ阻害剤 - Google Patents
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Description
R2はC1−C4アルキルであり、
R3は水素またはフェニルであり、
R4は水素、フェニル、またはC1−C4アルキルであり、R5は水素またはフェニルであるが、ただし、R3、R4、およびR5のうち1つは、水素以外であり、かつ、他の2つは水素である。
a)R1はヒドロキシである。
b)R2はメチルである。
c)R4は水素またはフェニルである。
d)R4はフェニルである。
e)R2がメチルであり、かつR4がフェニルである式Iの化合物。
f)R1がヒドロキシであり、R2がメチルであり、かつR4がフェニルである式Iの化合物。
g)式(ii)の化合物。
(ジエチル−(5−フェニル−3H−アゼピン−2−イル)−アミン)
4−ニトロ−ビフェニル(26.35g、132.3mmol)、ジエチルアミン(137.0mL、1.32mol)、およびヘキサエチルリン酸トリアミド(72.6mL、265.0mmol)の混合物を、2つの圧力管に分けた。当該管を密封し、内容物を120〜125℃で16時間加熱した。室温まで冷却した後、圧力管の内容物を合わせ、真空中で濃縮した。残渣を水で洗浄した(2×100mL)。水に不溶性な物質をジクロロメタンで希釈し、水(100mL)で洗浄し、1N HClで抽出した(2×150mL)。水性の酸層をジクロロメタンで洗浄した(3×200mL)。当該水性の酸層をNaOHペレットでアルカリ性(pH 12)にし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、真空中で濃縮し、6.89g(22%)の標記の中間体を、少量のヘキサエチルホスホロアミドが混入した濃褐色の油状固形物として得た。酸層からのジクロロメタン洗浄物をMgSO4で乾燥し、真空中で濃縮し、約66%のヘキサエチルホスホラミドおよび34%のHCl塩としての標記の中間体からなる80gの濃褐色の液体を得た。この物質をジクロロメタン(100mL)で希釈し、1N HCl(2×100mL)で抽出した。合わせた水層を、NaOHペレットでアルカリ性(pH 13)にし、ジクロロメタン(2×300mL)で抽出した。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、MgSO4で乾燥し、真空中で濃縮し、18.81gの標記の中間体を、約30%のヘキサエチルホスホラミドが混入した濃褐色の結晶として得た。当該標記の化合物は、さらに精製することなく、次反応に持ち越した。MS:(m/z)=241.2(M+1)。下記の化合物は、基本的に、調製1の方法によって調製した。
(5−フェニル−1,3−ジヒドロ−アゼピン−2−オン)
粗のジエチル−(5−フェニル−3H−アゼピン−2−イル)−アミン(12.47g)を、水(10.0mL)および2−メトキシ−エタノール(40.0mL)に加え、生じた混合物を加熱還流し、41/2日間撹拌した。揮発物を真空中で除去し、残渣をジクロロメタンで希釈し、0.1N HCl(2×200mL)、および飽和NaHCO3水溶液(2×200mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、真空中で濃縮し、粗の標記の化合物を、濃褐色の固形物(9.63g)として得た。この物質は、さらに精製することなく、次反応に持ち越した。MS:(m/z)=186.1(M+1)。下記の化合物は、基本的に、調製4の方法によって調製した。
(2−ブトキシ−5−フェニル−3H−アゼピン)
22リットルの反応フラスコに、加熱マントル、オーバーヘッド撹拌装置、冷却器、滴下ロート、温度計プローブ、および窒素導入口/排気口を装填した。当該フラスコを、窒素で完全にパージし、反応中ずっと窒素下に維持した。当該フラスコに、4−ニトロビフェニル(1700g、8.53モル)および1−ブタノール(3793g、51.2モル)を入れた。得られた混合物を加熱還流し、透明な溶液を形成させた。トリブチルホスフィン(3500g、17.3モル)を滴下ロートに入れ、当該熱した4−ニトロビフェニル溶液に滴下した。温度を、還流の維持に必要な温度まで徐々に上昇させた。当該反応は、ガスクロマトグラフィー分析によって、完了までモニターした。当該反応物を冷却し、これに水を加えた(500mL)。当該反応物を、油状物になるまで濃縮し、次いで、石油エーテル(8.0L)を加えた。得られた混合物を−40℃まで冷却し、望まないトリブチルホスフィンオキシドを除去するために濾過した。当該濾液を再度濃縮し、石油エーテル(8.0L)を加えた。当該混合物を冷却して濾過した。得られた濾液を油状物になるまで濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、標記の化合物を得た(908g、44%)。MS:(m/z)=242.1(M+1)。
(5−フェニル−1,3−ジヒドロ−アゼピン−2−オン)
2−ブトキシ−5−フェニル−3H−アゼピン(908g、3.42モル)を、2B−3 エタノール(8172mL)および脱イオン水(2724mL)に溶解させた。当該溶液をオートクレーブに入れ、150℃まで20時間加熱した。当該溶液を室温まで冷却し、減圧下で濃縮した。共沸蒸留によって、トルエン(2×2L)から、残った水を除去した。残った固形物をトルエン(1.7L)に溶解させ、95〜100℃の間で加熱した。当該溶液を90℃未満まで冷却し、ヘプタン(約4.8mL/g)を加えた。当該溶液を室温まで冷却させ、次いで、氷浴を使用して0〜5℃まで冷却した。固形物を濾過し、ヘプタンで洗浄し、乾燥して、標記の化合物(559g、88%)を淡褐色の固形物として得た。MS(EI):(m/z)=185.1。
(1−メチル−5−フェニル−1,3−ジヒドロ−アゼピン−2−オン)
5−フェニル−1,3−ジヒドロ−アゼピン−2−オン(168.5g、911.3mmol)をテトラヒドロフラン(1300mL)と混合し、当該溶液を約−30℃まで冷却した。カリウム第三級ブトキシド(107.4g、956.9mmol)を一度に加えた。発熱が認められ、反応物が−12℃まで加温された。当該発熱が静まった後、内容物を−25℃まで再冷却し、ヨードメタン(113.5mL、1.823mol)を加えたところ、わずかな発熱が生じた。当該反応物を室温まで加温し、撹拌した。10時間後、当該反応混合物をメチル第三級ブチルエーテル(1300mL)で希釈し、飽和塩化アンモニウム溶液(2×250mL)、水、および飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出した。合わせた水層を、メチル第三級ブチルエーテル(200mL)で逆抽出した。当該メチル第三級ブチルエーテル抽出物を合わせ、MgSO4で乾燥し、濾過した。当該溶液をロータリーエバポレーションで濃縮し、標記の化合物(185g、100%)を褐色の粉状の残渣として得た。当該物質は、精製することなく、次工程で直接使用した。下記の化合物は、基本的に、調製9の方法によって調製した。
(1−メチル−5−フェニル−1H−アゼピン−2,3−ジオン 3−オキシム)
1−メチル−5−フェニル−1,3−ジヒドロ−アゼピン−2−オン(183g、918.4mmol)をテトラヒドロフラン(1500mL)と混合し、当該溶液を−25℃〜−30℃まで冷却した。亜硝酸イソアミル(148.1mL、1.102mol)、次いでカリウム第三級ブトキシド(108.2g、964.4mmol)を加えたところ、発熱し、約−5℃になった。当該溶液を−10℃まで再冷却し、次いで、ゆっくり室温まで加温させた。当該反応物を一晩撹拌した。当該反応物を3N HCl水溶液(300mL)で希釈し、pHを約2にした。次いで、メチル第三級ブチルエーテル(4L)で希釈し、当該内容物を0.5〜1.0N HCl(2×600mL)および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。暗色の有機層をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮して、テトラヒドロフランで湿った残渣を得た。当該残渣をシクロヘキサン(300mL)で希釈し、濃縮して、メチル第三級ブチルエーテル(450mL)およびシクロヘキサン(1000mL)中でスラリーになった約275gの粗製残渣を得た。当該スラリーを約40℃まで加熱し、室温まで冷却し、濾過し、シクロヘキサンでリンスした。40℃での真空乾燥によって、標記の化合物(169g、81%)を褐色の粉末として得た。下記の化合物は、基本的に、調製13の方法によって調製した。
(3−アミノ−1−メチル−5−フェニル−1,3−ジヒドロ−アゼピン−2−オン)
1−メチル−5−フェニル−1H−アゼピン−2,3−ジオン 3−オキシム(25g、109mmol)を、酢酸(80mL)、メタノール(80mL)および水(40mL)と混合し、当該スラリーを約5℃まで冷却した。亜鉛末(29.81g、436mmol)を、数度に分けて加えた。反応物を室温まで放冷した。2時間後、当該反応物をセライト(登録商標)パッドで濾過し、メタノールでリンスした。当該濾液を、ロータリーエバポレーションで、大部分のメタノールが除去されるまで濃縮した。次いで、油状の紫色の溶液を、ジクロロメタン(200mL)で希釈すると、即時にいくらかの沈殿が生じた。当該濃いスラリーを濾過し、酢酸亜鉛(白色粉末)を除去した。得られた紫色の濾液を、さらに、ジクロロメタン(200mL)で希釈し、水酸化アンモニウム溶液で抽出した(2×100mL)。当該有機抽出物をMgSO4で乾燥し、濾過し、濃縮して21.5g(92%)の紫色の油状物を得た。加温した酢酸エチル(200mL)で希釈した後、微細な沈殿物が認められ、濾過によって除去した。残っている酢酸エチル溶液をガス状の塩化水素(約5g、137mmol)で処理し、初期に濃いスラリーを得て、これに塩化水素を大量に加えて薄めた。スラリーを室温で2時間撹拌後、当該内容物を濾過し、45℃で真空乾燥し、標記の中間体のHCl塩(22.9g、94%)を褐色の粉末として得た。22.9gのHCl塩を、150mLの1N 水酸化ナトリウムおよびジクロロメタンで処理した。層を分離させ、ジクロロメタン層を、さらに、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。次いで、当該ジクロロメタン溶液を、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮して、19.6gの標記の化合物を赤褐色の油状物として得た。下記の化合物は、基本的に、調製17の方法によって調製した。
((S)−[1−(1−メチル−2−オキソ−5−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−アゼピン−3−イルカルバモイル)−エチル]−カルバミン酸 tert−ブチルエステル)
3−アミノ−1−メチル−5−フェニル−1,3−ジヒドロ−アゼピン−2−オン(330g、1.54mol)を、ジクロロメタン(3L)、N−(tert−ブトキシカルボニル)−L−アラニン(291.4g、1.54mol)、およびヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(259.5g、1.617mol)と混合した。当該溶液を約10℃まで冷却した。この溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(335.4mL、1.925mol)、次いで1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(310.1g、1.617mol)を加え、当該内容物を徐々に室温まで加温した。3.5時間後、当該反応物を水(1000mL)に注ぎ、層を分離させた。有機層を、さらに、水(1000mL)、0.1N HCl(1000mL)、飽和NaHCO3溶液(1000mL)および最後に飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。ジクロロメタン層をNa2SO4で乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションで濃縮して、標記の化合物(約574g、97%)を黄褐色のフォームとして得た。当該物質は、次工程で直接使用するのに十分な純度だった。下記の化合物は、基本的に、調製21の方法で調製した。
((S)−2−アミノ−N−(1−メチル−2−オキソ−5−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−アゼピン−3−イル)−プロピオンアミド)
−5℃に冷却したトリフルオロ酢酸(800mL)の溶液に、(S)−[1−(1−メチル−2−オキソ−5−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−アゼピン−3−イルカルバモイル)−エチル]−カルバミン酸 tert−ブチルエステル(564g、1.46mol)のジクロロメタン(2L)溶液を、滴下ロートで加えた。当該反応物を、0℃で2時間撹拌し、その時点で、反応物の一定分量には、ごく微量の出発物質が残っていることを示していた。当該反応物は、ロータリーエバポレーションで濃縮し、ジクロロメタンで再希釈し、再濃縮し、シロップを得た。当該シロップ状の油状物を、ジクロロメタン(2〜3L)で希釈し、10% 炭酸ナトリウム溶液(2L)に加えた。水層が塩基性のpHとなるのに、さらに10% 炭酸ナトリウム溶液(2L)を必要とした。当該層を分離し、水層をジクロロメタン(600mL)で逆抽出した。次いで、合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム(1000mL)で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションで濃縮して、標記の中間体(約435g)を、油状のフォーム(そのうち標記の化合物は約406g(97%))として得た。下記の化合物は、基本的に、調製25の方法によって調製した。
((S)−2−フルオロ−3−メチル−酪酸)
3ガロン(約11355cm3)のナルゲン(Nalgene)(登録商標)容器に、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(4.06L、25.1mol)、(S)−2−アミノ−3−メチル−ブタン酸(147.9g、1.26mol)および亜硝酸ナトリウム(113g、1.64mol)を入れた。室温で12〜15時間撹拌した。冷水(5L)およびジエチルエーテル(7L)を、ナルゲン(登録商標)容器に注いだ。撹拌し、次いで、層を分離させた。有機層を水(3L)で洗浄した。合わせた水層をジエチルエーテル(3L)で抽出した。合わせた有機層を水(3L)、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液層のpHを、1N 硫酸でpH4未満に調整した。ジエチルエーテル(2×2L)で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、減圧下でロータリーエバポレーションによって、槽の温度が30℃を超えないことを確かめながら濃縮し、60gの標記の化合物を油状物(純度 約85〜90%、鏡像体過剰率 約60%)として得た。
((S)−2−フルオロ−3−メチル−酪酸の鏡像体過剰率の濃縮)
2−フルオロ−3−メチル酪酸(約235.5g、1.96mol)を、酢酸エチル(2.9L)に取り込み、R−(+)−α−メチルベンジルアミン(237.5g、1.96mol)を滴下ロートで滴下した。40℃までの温度上昇が認められた。当該溶液を冷却させた後、スラリーが生じ、これを室温で45分間撹拌した。次いで、当該スラリーを、濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル(300mL)でリンスした。当該湿ったケーキを酢酸エチル(4.5L)に懸濁し、加熱還流した。溶液を得るために、さらに酢酸エチル(450mL)を加え、次いで、当該溶液を室温で一晩、放置した。得られたスラリーを濾過し、当該濾過ケーキを酢酸エチル(200mL)でリンスした。当該濾過ケーキを40℃で真空乾燥し、262.3gの(S)−2−フルオロ−3−メチル酪酸の(R)−+−α−メチルベンジルアミン塩を粉末として得た。この塩の鏡像体過剰率は、キラルキャピラリー電気泳動解析によって、所望の(S)異性体について94%超であることが見出された。
(S)−2−アミノ−N−(1−メチル−2−オキソ−5−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−アゼピン−3−イル)−プロピオンアミド(406g、1.423mol)を、ジクロロメタン(3L)と混合し、当該溶液を0〜2℃まで冷却した。この溶液に、(S)−2−ヒドロキシ−3−メチル−酪酸(168.1g、1.423mol)、ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(239.7g、1.565mol)およびジイソプロピルエチルアミン(310mL、1.779mol)を加えたところ、わずかな発熱が生じた。当該内容物を約4℃まで冷却し、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(286.5g、1.494mol)を加えた。当該反応物を、室温まで徐々に加温した。4.5時間(温度 14℃)での高速液体クロマトグラフィー分析は、約5%の未反応の出発アミンが存在することを示した。さらに1〜1.5時間の撹拌後、反応物を水(1000mL)でクエンチし、層を分離した。ジクロロメタン層は、さらに、水(1000mL)、0.1N HCl(1000mL)、飽和炭酸水素ナトリウム(1000mL)および最後に飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出した。次いで、ジクロロメタン層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、ロータリーエバポレーションで濃縮し、結合した生成物の粗のジアステレオマーの混合物(505g)を、黄褐色のフォームとして得た。100%メタノールで溶出するキラルパック(Chiralpak)(登録商標)ADカラムを使用し、キラルクロマトグラフィーで当該異性体を分離した。溶出溶媒を異性体画分から除去した後、約210gの第1に溶出した異性体を、黄褐色フォームとして回収し、所望の異性体2については、約220g(44%)を、これもまた黄褐色粉末として回収した。第2に溶出した異性体は、所望の(S,S,S)−ジアステレオマーである。約140gの標記の化合物を、アセトン(1000mL)および水(95mL)に取り込ませた。当該溶液を、ロータリーエバポレーター上で、懸濁した粒子が認められなくなるまで、加熱した。当該溶液を、オーバーヘッド撹拌を備えたフラスコに移し、水(2750mL)を徐々に、15分間かけて加えた。得られたスラリーは、室温まで冷却させ、次いで、濾過し、ケーキを20% アセトン/水 溶液(650mL)でリンスした。40℃で一晩真空乾燥した後、約102gの標記試料を回収した。MS(m/z):386.2(M+1)。下記の化合物は、基本的に、実施例1の方法によって調製した。
(S)−2−ヒドロキシ−3−メチル−N−[(S)−1−((S)−1−メチル−2−オキソ−5−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−アゼピン−3−イルカルバモイル)−エチル]−ブチルアミドの絶対配置の決定
結晶は、ジクロロメタンに溶解させた(S)−2−ヒドロキシ−3−メチル−N−[(S)−1−((S)−1−メチル−2−オキソ−5−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−アゼピン−3−イルカルバモイル)−エチル]−ブチルアミド(実施例1、第2に溶出した画分)の溶液へのn−ペンタンの蒸気拡散によって成長した。(S)−2−ヒドロキシ−3−メチル−N−[(S)−1−((S)−1−メチル−2−オキソ−5−フェニル−2,3−ジヒドロ−1H−アゼピン−3−イルカルバモイル)−エチル]−ブチルアミドの単結晶を薄いガラス繊維上に載せ、−173℃の窒素に浸漬した。データは、MoKα 放射線源(λ=0.71073Å)、およびSMART 1000CCDエリア検出器を備えた、P4回折計(ブルカー(Bruker)−AXS、米国、ウィスコンシン州、マディソン)を使用して収集した。格子定数の精密化およびデータリダクションは、SAINTプログラム(Sheldrick、GM.SHELXS86、Acta Cryst.A46、467〜473(1990))を使用して行った。単位格子には、斜方晶のパラメータ(a=8.010(5)Å、b=20.345(15)Å、c=25.513(19)Å)を有する指標を付した。結晶構造の格子体積は、4157(5)Å3であり、1.232g/cm3の密度を有し、その単位格子中に2つの分子を有していた。当該構造は、直接法によって解析した(Sheldrick、G.M.、SHELXS93、Institute fur anorg chemie、ドイツ、ゲッティンゲン)。全ての原子パラメータは、独立に精密化した。空間群の選択(P212121)は、完全マトリックス最小二乗精密化の成功した収束(最終適合度が1.297であるF2)によって確かめた。最終的な残余要因(R1)は、=0.1905であり、最終的な精密化サイクル後の最も大きい相違のピークおよび正格子点は、それぞれ0.988および−0.754(e.A−3)であった。
(β−アミロイド生成のin vitroでの阻害)
β−アミロイド生成を阻害する化合物の能力を、スウェーデン変異を有する細胞株で評価した。このスクリーニングアッセイは、二重の変異(Lys651Met652からAsn651Leu652)(APP751ナンバリング)を含むアミロイド前駆体タンパク質751(APP751)の遺伝子を安定して形質移入(国際公開第94/10569号パンフレットに記載された方法)した細胞(HEK293=ヒト腎臓細胞株)を使用した。この変異は、通常、スウェーデン変異と呼ばれ、当該細胞(「293 751 SWE」と名付けられた)を、コーニング(Corning)96ウェル プレートに、2〜4×104細胞/ウェル(10% ウシ胎児血清を加えた、ダルベッコの最小基礎培地(シグマ、ミズーリ、セントルイス)中)で播種した。細胞数は、アッセイの線形範囲内(約0.03から1.0ng/mL)でβ−アミロイドのELISA結果を達成するために重要である。
(β−アミロイド放出および/または合成のin vivoでの抑制)
この実施例は、本発明の化合物が、どのようにβ−アミロイド放出および/または合成のin vivoでの抑制について試験され得るかを示している。これらの実験については、3〜4ヶ月齢のPDAPP マウスを使用した(Gamesら、(1995)Nature 373:523〜527)。試験される化合物に応じて、当該化合物は、通常、1〜10mg/mLの間で処方した。当該化合物の低い溶解度の要因のため、これらは、様々な媒体(コーン油、コーン油中の10% エタノール、2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(リサーチバイオケミカルズインターナショナル(Research Biochemicals International)、マサチューセッツ、ナティック)、およびカルボキシメチルセルロース(シグマケミカル社、ミズーリ、セントルイス)など)とともに処方されてもよい。
酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)用に海馬組織および皮質組織を調製するため、各脳領域を、10倍量の氷冷グアニジン緩衝液(5.0M グアニジン−HCl、50mM トリス−HCl、pH 8.0)中で、ポリトロンを使用して、ホモジナイズした。ホモジネートを、穏やかに、回転台上で、3〜4時間、室温で揺らし、β−アミロイドの定量化まで−20℃で保存した。
EDTA血漿を、1:1で、検体希釈剤(0.2グラム/l リン酸ナトリウム・H2O(一塩基性)、2.16グラム/l リン酸ナトリウム・7H2O(二塩基性)、0.5グラム/l チメロサール、8.5グラム/l 塩化ナトリウム、0.5mL トリトン X−405、6.0g/l グロブリンフリーのウシ血清アルブミン、および水)で希釈した。検体希釈剤中の試料および標準物質を、脳アッセイのための上記総β−アミロイドアッセイ(266 捕獲/3D6 レポーター)を使用して(検体希釈剤が、記載されたカゼイン希釈剤の代わりに使用されたことを除く)、アッセイした。
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