KR20190009329A - 폐 상피 공학에서 인간 기도 줄기 세포 - Google Patents

폐 상피 공학에서 인간 기도 줄기 세포 Download PDF

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Abstract

임의적으로, 폐 상피 공학 기술에 인간 기도 줄기 세포를 이용하는 방법으로서, 세포가 감마 분비효소 억제제와 접촉되는 방법, 이에 의해 생성된 생체인공 기도 장기, 및 예를 들어, 이식을 위한 이의 용도. 또한, 테나스신-C 및/또는 피브릴린 2로 생체-인공 기질을 처리하는 방법.

Description

폐 상피 공학에서 인간 기도 줄기 세포
우선권 주장
본 출원은 2016년 5월 16일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 제 62/337,041호; 2016년 11월 23일 출원된 제 62/426,146호; 및 2017년 4월 10일 출원된 제 62/483,760호의 이익을 청구한다. 상기 언급된 것의 전체 내용은 본원에 참조로 통합된다.
연방 정부 지원 연구 또는 개발
본 발명은 국립보건원에 의해 부여된 승인 번호 OD008749 및 HL108678 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
기술 분야
본원에는 임의적으로, 폐 상피 공학 기술에서 인간 기도 줄기 세포를 이용하는 방법으로서, 세포가 감마 분비효소 억제제와 접촉되는 방법, 이에 의해 생성된 생체인공 기도 장기, 및 예를 들어, 이식을 위한 이의 용도가 제공된다.
배경
폐 이식은 폐 기능상실 예를 들어, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭성 섬유증, 폐 고혈압, 폐암 및 선천성 폐질환에 의해 전형화된 질환을 경험하는 많은 환자에 대한 마지막 희망을 대표한다. 폐 이식을 위한 전형적인 대기 시간은 2년 또는 그 초과일 수 있어, 대기 목록에 올라와 있는 대기자에 있어서 30% 사망률이 발생한다. 이식용 장기를 공학 처리하기 위한 기술 개발은 궁극적으로 거부반응의 위험 없이 말기 장기 기능상실에 대한 해법을 제공할 수 있다.
개요
전체 장기 관류 탈세포화 과정을 기반으로 하여, 본 발명자들은 천연 폐 스캐폴드(scaffold)를 재증식 및 재생성시키기 위해 일차 인간 공여자 폐 조직-유래된 세포를 사용하는 것을 목표로 하였다.
본원에 제시된 바와 같이, 증식성 기저 상피 줄기 세포 집단을 분리시키고 배양으로 확장시키고, 설치류 및 인간 둘 모두의 폐 세포외 기질(ECM)의 강력한 재세포화(recellularization)를 달성하였다. 섬모 기도 상피 표현형으로의 분화가 시험관내 및 생체외 둘 모두에서의 전체 설치류 폐 재세포화 및 생체모방 배양으로 입증되었다. 원위 상피 표현형의 유도는 γ-분비효소를 통한 노치(Notch) 경로의 억제에 의해 달성되었다. 증가된 계면활성제 단백질-B 및 C 발현은 시험관내, 인간 ECM 슬라이스 배양, 및 전체 설치류 폐 배양에서 mRNA 분석에 의해 입증되었다. 연장된 생체외 생체모방 배양과 결부된 분리된 인간 폐엽의 재세포화는 이러한 세포 집단의 재생 능력을 추가로 확인시켜주었다. 재세포화된 폐 구조물의 기능 분석은 배양 전반에 걸쳐 세포 생존능 및 대사 활성은 물론 동적 장기 순응도 및 가스 교환을 입증하였다. 최종 조직 분석시, 생리적 조직 구조 및 형태를 갖는 광범위한 재-상피화가 관찰되었다.
이러한 결과는 전체 폐 조직 생체공학(bioengineering) 및 생체외 장기 배양에 유용한 인간 기도 줄기 세포의 재생 가능성 및 이중계(bi-lineage) 능력을 입증한다.
또한, 신생아(1 세 미만) 또는 성인 폐 공여자(군 당 n = 3 공여자)로부터 유래된 무세포 ECM에서 배양된 성인 폐 조직으로부터 분리한 기저 상피 줄기 세포 (BESC)의 행동을 평가하였다. 세포 증식과 생존의 유의한 차이가 발견되었다. 신생아 ECM이 현저하게 풍부한 단백질을 정량화하기 위해 폐 스캐폴드에 대한 심층적인 단백질체 분석을 수행하였으며, 관찰된 효과의 잠재적 매개인자로서 당단백질 피브릴린-2(FBN-2)와 테나스신-C(TN-C)를 확인하였다. FBN-2 및/또는 TN-C가 보충된 콜라겐 타입 IV 코팅된 플레이트에서 배양된 BESC는 현저하게 증가된 증식 및 감소된 세포 노화를 입증하였다; (이러한 차이는 비처리된 플레이트(콜라겐 IV 코팅 없음)와 비교했을 때도 발견되었음을 주목하라). 상피에서 중간엽으로의 전이의 현저한 증가는 관찰되지 않았다. FBN-2 및/또는 TN-C에서 시험관내 상처 봉합 또한 증가하였다. 재-상피화 전에 FBN-2 및/또는 TN-C로 전처리된 탈세포화된 폐 스캐폴드는 보다 많은 상피 증식 및 조직 리모델링을 지지하였다. 3일 및 7일의 생체외 폐 배양 후, 처리된 폐 스캐폴드에서 BESC 분포, 기질 정렬 및 전체 조직 형태가 개선되었다. 이러한 결과는 스캐폴드 재-상피화가 신생아 폐 ECM에서 향상되고, FBN-2 및 TN-C의 천연 스캐폴드로의 보충이 폐 조직 재생에서 유용한 도구임을 입증한다.
따라서, 생체인공 폐 장기를 제공하는 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법은 인간 공여자 바람직하게는, 공여자의 기도로부터 수득된 증식성 기저 줄기 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 세포가 Krt5+p63+ 세포인 단계; 임의적으로, 5회 이하의 계대배양(예를 들어, 세포가 60-100%, 예를 들어 80% 컨플루언시로 계대배양됨)으로 배양물에서 임의적으로, ROCK 억제제의 부재하에 세포를 유지하고 확장시키는 단계; 기도 및 실질적인 맥관구조를 포함하는 (무세포) 폐 조직 기질을 제공하는 단계; 기도를 통해 줄기 세포를 및 맥관구조를 통해 내피 세포를 폐 조직 기질에 시딩하는 단계; 및 기도에서 기능성 상피 및 기능성 맥관구조의 형성에 충분한 조건하에 기질을 유지시키는 단계로서, 기질 유지가, 제1의 요망되는 장기 성숙 정도가 발생하기에 충분한 시간 동안 노치 억제제, 예를 들어, 감마 분비효소 억제제를 포함하는 액체 배지를 사용하여 습식 환기(wet ventilation)를 폐 조직 기질에 제공하여 습식-성숙한 장기를 생성시키고; 임의적으로, 습식 환기 동안 장기 챔버에서 실질적으로 일정한 유체 수준을 유지하는 것을 포함하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 장기 챔버는 챔버 압력 센서에 의해 송신된 데이터에 반응하여 양방향 배수 펌프를 제어하는 제어 모듈에 의해 각각 제어되는 양방향 배수 챔버 펌프 및 챔버 압력 센서를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 정맥 라인의 압력 수준을 배지 저장소의 압력 수준과 평형을 이루게 함으로써 경폐압 구배를 방지하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 장기 챔버는 장기 챔버에 연결된 공압 제어 모듈을 추가로 포함하며, 공압 제어 모듈은 흡기 단계 동안 장기 챔버에서 음압을 발생시키고; 평편기 동안 장기 챔버 압력을 유지하고; 호기 단계 동안 장기 챔버에서 양압을 발생시킨다.
일부 구체예에서, 습식 환기는 기관 라인을 배지 저장소에 연결하는 단계로서, 기관 라인은 제어기에 연결된 양방향 기관 펌프를 포함하는 단계; 양방향 기관 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 배지로 팽창시키는 단계; 및 양방향 기관 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 수축시켜 폐 조직 기질로부터 배지를 회수하는 단계를 포함하며, 배지는 습식 환기 동안 연속적으로 새로 공급(refresh)된다.
일부 구체예에서, 습식 환기는 기관 라인을 배지 저장소에 연결하는 단계로서, 기관 라인은 제어기에 각각 연결된 제1 펌프 및 제2 펌프를 포함하는 단계; 제1 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 배지로 팽창시키는 단계; 및 제2 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 수축시켜 폐 조직 기질로부터 배지를 회수하는 단계를 포함하며, 배지는 습식 환기 동안 연속적으로 새로 공급된다. 일부 구체예에서, 제어기는 기관 라인에 연결된 기관 압력 센서에 의해 송신된 데이터에 반응하여 양방향 기관 펌프를 제어한다.
일부 구체예에서, 방법은 적어도 2, 5, 7 또는 10일 동안 노치 억제제를 포함하는 액체 배지를 사용하여 습식 환기를 제공하고, 임의적으로 이어서, 노치 억제제를 포함하지 않는 액체 배지를 사용하여 추가의 습식 환기를 제공하는 것을 포함한다.
일부 구체 예에서, 폐 조직 기질은 테나스신-c(TN-C), 예를 들어, 탈세포화된 장기 스캐폴드로부터 유래된 기질에 자연적으로 존재할 수 있는 임의의 테나스신-c 이외에 보충 테나스신-c를 포함하며; 방법은 세포 시딩 전에 폐 조직 기질을 테나스신-c와 접촉시키는 단계, 예를 들어, 테나스신-c 예를 들어, 약 0.5-10 ug/ml 테나스신-C를 포함하는 용액을 폐 조직 기질 스캐폴드 기도에 전달하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 폐 조직 기질은 피브릴린-2(FBN-2), 예를 들어, 탈세포화된 장기 스캐폴드로부터 유래된 기질에 자연적으로 존재할 수 있는 임의의 FBN-2 이외에 보충 FBN-2를 포함하며; 방법은 세포 시딩 전에 폐 조직 기질을 FBN-2와 접촉시키는 단계, 예를 들어, FBN-2, 예를 들어, 약 0.1 내지 100 ug/ml의 FBN-2, 예를 들어, 0.5-50, 1-20, 5-15, 5-20, 10-20 ug/ml FBN-2를 포함하는 용액을 폐 조직 기질 스캐폴드 기도에 전달하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 폐 조직 기질은 TN-C 및 FBN-2 둘 모두를 포함한다.
또한, 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 기능성 폐가 본원에서 제공된다. 일부 구체예에서, 장기는 전체 폐 또는 이의 맥관화된 부분이다.
본원에 기술된 방법에 의해 생성된 기능성 폐를 대상체에 이식하는 것을 포함하는 손상되거나 감소된 폐용량을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 당해 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료가 본원에 기재되며; 당업계에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 기재 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 인용된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 기준이 될 것이다.
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도 1a-e. 시험관내에서 일차 인간 폐 상피 줄기 세포 확장의 특성 규명. (A) 계대 1(P1) 및 (B) 계대 4(P4)의 시험관내 일차 인간 상피 세포의 명시 야상 및 면역형광 이미지로서, Krt5+p63+ 기저 줄기 세포가 풍부한 콜로니 생장물을 예시한다. 눈금 막대 = 100 μm (c) 계대에 따른 시험관내 Ki67 양성 세포의 정량화. n = 계대당 정량화된 3개의 이미지 (P1-P4). 1-원 ANOVA는 계대 1(P1)과 비교하고 Dunnet 사후-시험을 이용하였다. 모든 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. (d) P1과 P4에서 상피 세포 마커의 유동 세포계측 정량화. 2x104 이벤트가 수집되었다. 집단은 더블렛 및 자가-형광 세포를 배제하기 위해 게이트 제어하였다. n = 계대 당 3개 세포주 (e) 세포 계대에 따른 유전자 발현의 정량적 PCR 분석. 박스 플롯은 중앙값과 1/4 분위수 및 3/4 분위수를 나타낸다. 위스커는 2.5-97.5% 데이터 범위를 나타낸다. n = 계대 당 3개 세포주. 정상적인 사체 폐 조직 대조군과 비교하여 β-액틴 발현에 대해 표준화됨.
도 2a-f. 공기-액체 계면 배양에 의한 섬모 기도 상피로의 분화. (a) 공기-액체 계면(ALI)에서 일차 인간 폐 상피 줄기 세포, 21일. 섬모발생의 유도는 헤마톡시알린 및 에오신 염색에 의해 관찰된다. 눈금 막대 = 25 μm. (b) 면역형광 이미지는 ALI에서 기저 줄기 세포 집단(Krt5/p63+), 기능성 섬모발생(FOXJ1 및 아세틸화된 α 투불린) 및 밀착 접합 형성(E-카드헤린)의 보존을 입증한다. 눈금 막대 = 25 μm. (c) 연속 기도 양압(CPAP: continuous positive airway pressure) 모델(맥관 관류만 시킨 배양 7일 후 7일 동안 20mmHg 기도 압력)에 의한 탈세포화된 폐 기질상의 공기-액체 계면. (d) 면역형광 이미지는 CPAP 이전의 폐와 비교하여, 기저 줄기 세포 집단(Krt5)의 유지, FOXJ1 발현 유도, 향상된 밀착 접합 형성(E-카드헤린) 및 증식(Ki67) 감소를 입증한다(7일 vs 14일). 눈금 막대 = 50 μm. (e) 폐 조직 +CPAP 또는 -CPAP(맥관 관류만)에서 14일째에 E-카드헤린 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석. (f) 14일(CPAP 또는 관류만 시킨 추가의 7일)에서의 폐와 비교하여, 7일 동안의 재세포화 및 맥관 관류만 시킨 후, 재세포화된 폐에서 유전자 발현의 정량적 PCR 분석. 3개의 독립적인 재세포화된 폐로부터의 데이터가 제시된다. n= 삼중 실험으로 폐 당, 시점 당 분석된 3개의 독립적인 조직 샘플. 정상적인 사체 폐 조직 대조군과 비교하여 β-액틴 발현으로 표준화됨. 모든 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. Tukey의 다중 비교 사후-테스트와 1-원 ANOVA로 분석.
도 3a-h. 노치 억제에 의한 원위 타입 II 폐세포 표현형의 유도. (a) 5일 동안 노치 억제제 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 포스포디에스테라제 억제제, 및 N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸-L-알라닐)]-(S)-페닐글리신 t-부틸 에스테르(DAPT, 또한, GSI IX로도 공지됨, 감마 분비효소 억제제)로 처리된 시험관내 일차 상피 기저 세포(계대 3)의 면역형광 이미지로서, 계면활성제 단백질-B(SP-B) 양성 세포의 증가를 입증한다. 눈금 막대 = 100 μm. (b) 시험관내에서 5일 동안 IBMX(100 μM), DAPT(50 μM) 또는 조합물 IBMX+DAPT로 처리된 세포의 유전자 발현의 정량적 PCR 분석으로서, SP-B 및 SP-C 발현의 증가를 입증한다. n = 3회 실험 중복이 제시된다. 비처리(NT)와 비교하여 Dunnet 사후-테스트를 이용한 1-원 ANOVA. 이 실험에서 DAPT와 IBMX는 단독으로는 효과가 없었지만, 다른 반복 실험에서 이들은 일부 활성을 보여주었다. 구체 형성을 입증하는 3-차원 배양 검정. (c) 3D 구체 배양에서 Krt5+p63+ 표현형의 우세를 입증하는 구체의 면역형광 이미지. 눈금 막대 = 50 μm. (d) 7일까지 루미날 발생을 입증하는 헤마톡실린 및 에오신 염색된 구체. (e) 7일째에 미처리된 세포 및 노치 억제된 (IBMX+DAPT) 세포 둘 모두에서 구체의 명시 야상. 눈금 막대 = 100 μm. (f) 초기에 시딩된 총 세포 수의 백분율로서의 구체 수의 정량화로서, IBMX + DAPT 처리된 세포의 구체 형성의 감소를 입증한다. n = 삼중 실험으로 정량화된 3개의 독립적인 배양. T-테스트에 의해 분석됨. (g) 노치 억제(IBMX + DAPT)의 존재 또는 부재하에 7일째에서 구체 배양물 중 유전자 발현의 정량적 PCR 분석. 3개의 독립적인 배양물로부터의 데이터가 이중 실험으로 분석되어 제시된다. 정상적인 사체 폐 조직 대조군과 비교하여 β-액틴 발현으로 표준화됨. (h) SP-C 단백질은 또한, 5일 동안 시험관내에서 DAPT+IBMX 처리 후의 BESC의 조건부 배지(계대 4, p4)에서 ELISA로 측정될 수 있다. 모든 오차 막대는 t-테스트로 분석된 표준 편차를 나타낸다.
도 4a-e. 탈세포화된 폐 스캐폴드 배양에서 원위 타입 II 폐세포 표현형으로의 일차 기저 기도 줄기 세포의 유도. (a) 5일 동안 인간 탈세포화된 폐 슬라이스와 기저 상피 줄기 세포의 공동-배양으로서, 인테그린 α2β1 및 α3β1을 통한 폐 기질로의 세포 유착, 기질 유착 영역에 따른 밀착 접합의 형성(E-카드헤린), 및 연속된 증식(Ki67+)을 입증한다. 눈금 막대 = 100 μm. (b) 5일 동안 노치 억제(IBMX+DAPT)의 존재 또는 부재의 세포-기질 배양에서 유전자 발현의 정량적 PCR 분석으로서, 처리 후 SP-B 및 SP-C의 유도 및 곤봉 세포 분비 단백질(CCSP) 발현의 손실을 입증한다. 이중 실험으로 분석된, 두 개의 상이한 폐 공여자(HL30에 대한 n = 3 및 HL38에 대한 n = 3)로부터 유래된 기질에 시딩된 세포를 이용하여, 제시된 2개의 개별 실험으로부터의 데이터. 정상적인 사체 폐 조직 대조군과 비교하여 β-액틴 발현으로 표준화됨. T-테스트(IBMX+DAPT vs. NT)로 분석됨. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. (c) 일차 기저 줄기 세포(20x106) 플러스 IBMX+DAPT 처리로 재세포화된 폐의 생체모방 배양. (d) 비처리 폐(5일)와 비교하여 일정한 관류 배양에서 5일 동안 IBMX+DAPT로 처리된 재세포화된 폐에서 유전자 발현의 정량적 PCR 분석. n= 삼중 실험으로 폐 당 분석된 3개의 독립적인 조직 샘플. 정상적인 사체 폐 조직 대조군과 비교하여 β-액틴 발현으로 표준화됨. T-테스트(IBMX+DAPT vs. NT)로 분석됨. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. (e) 5일째에 재세포화된 폐의 면역형광 이미지 (비처리 vs IBMX+DAPT 노치 억제)로서, Krt5/p63+ 기저 세포 집단의 유지, 증가된 밀착 접합 강도(E-카드헤린), SP-C 양성 세포 증가, 및 아쿠아포린-5 양성 세포 손실을 확인시켜준다. 눈금 막대 = 50 μm.
도 5a-k. 일차 인간 폐 기저 줄기 세포를 사용한 전체 탈세포화된 인간 폐 스캐폴드의 재세포화 및 배양. (a) 일정한 장기 관류 및 음압 환기가 가능한 예시적인 폐 생물반응기의 개략도. (b) 강조된 폐정맥, 기도 및 폐동맥에 대한 접근 포트를 지닌 생물반응기에서 단일의 인간 탈세포화된 폐엽. 엽에 일차 PAEC(폐 동맥 내피 세포, 160-240x106) 및 BESC(기저 상피 줄기 세포, 220-280x106, n = 3)를 시딩하고 일정한 배지 관류 플러스 주기적 음압 환기 하에 유지하였다. (c) 재세포화된 폐 관류 배양 8일에 걸친 폐동맥 압력, n = 3 재세포화된 폐. 데이터는 평균압 +/- SD를 의미한다. (d-e) 폐 배양 배지로부터 샘플링된 배지 중 (d) 글루코스 측정 변화. 배지는 48시간마다 교체하였으며, 값은 신선한 배지와 비교하여 장기 관류 48시간 후 글루코스 농도(mg/dL) 및 (e) 락테이트 농도(mmol/L)의 변화를 나타낸다. 제시된 데이터는 시점 당 n = 2개의 독립적인 폐 배양물을 나타낸다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다. (f) 음압 환기(호흡 속도 6/분) 동안 대표적인 압력 추적. 압력은 장기 챔버, 폐동맥, PEEP 챔버, 기도 및 폐 정맥에 동시에 기록된다. (g) 환기 동안 피크 경벽압 (mmHg). (h) 환기 동안의 계산된 일회 호흡량(mL). 박스 플롯은 중앙값과 1/4 분위수 및 3/4 분위수를 나타낸다. 위스커는 데이터 범위를 나타낸다. 이상점(박스 플롯의 1.5xIQR보다 큰 점)은 플러스 기호(+)로 표시된다. (i) 생물반응기에서 읍압 환기 동안 발생하는 대표적인 압력-부피 루프. 추적된 루프 t = 0은 청색으로 표시되고, t = 최종은 적색으로 표시된다. (j) 단일 하엽의 끝점 양압 환기 자극. (k) 양압 환기 자극(challenge) 동안 관류액의 pH, pO2, pCO2 및 HCO3의 대표적인 측정. 엽은 테스트 이전에 7일 동안 재세포화시키고 배양하고, 21% 및 100% FiO2를 사용하여 기능적 자극을 가하였다.
도 6a-h. 생체모방 배양 후 폐 조직 재세포화 분석. (a) 생체모방 배양 7일에 세포 생존력을 검정하기 위한 레사주린(Resazurin) 함유 배지의 관류. 청색 염료의 생존 가능한 세포 대사는 핑크 색상으로의 전환에 의해 시각화되며, 이는 배양 후 광범위한 세포 보유, 분포 및 생존력을 입증한다. (b) 재세포화된 폐 조직의 H&E 절편의 대표적인 스캔. (i) 눈금 막대 = 5mm 및 (ii) 눈금 막대 = 100 μm. (c) 배양 7일에 계속된 E-카드헤린+상피 세포 증식(Ki67+)의 면역형광 이미지. 눈금 막대 = 50 μm. (d) Ki67+ 염색에 의한 재세포화된 폐 조직에서 세포 증식의 정량화. 폐당 3개의 대표적인 영역을 분석하였으며, 영역 당 정량화된 4개의 이미지를 갖는다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 1-원 ANOVA에 의해 분석되며, 유의성은 확인되지 않았다. (e) Krt5+p63+ 기저 세포 집단의 유지 및 비-유착된 proSP-B+ 세포의 드문 관측을 확인시켜주는, 배양 7일째에 재세포화된 폐의 면역형광 이미지. (f) 배양 후 거대 기도의 세포 보유 및 재증식으로서, 재세포화된 (i-ii) 래트 및 (iii) 인간 폐에서 Krt5+, p63+ 및 E-카드헤린+상피 세포에 의해 입증되었다. (g) 폐 스캐폴드의 맥관 모세관 구획에서 CD31+ 세포의 국소화 및 조직화. 눈금 막대 = 50 μm. (h) 배양 7일 또는 10일(최종일)에 폐 조직의 유전자 발현의 정량적 PCR 분석. 3개의 독립적인 재세포화된 폐 배양물로부터의 데이터가 도시되며, 이중으로 실험된 폐당 분석된 n = 4개의 독특한 조직 샘플이다. 정상적인 사체 폐 조직 대조군과 비교하여 β-액틴에 대해 표준화된 발현. 시험관내에서 유지된 세포의 유전자 발현 수준이 참조로서 제시된다. 모든 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 1-원 ANOVA에 의해 분석되며, 유의성은 확인되지 않았다.
도 7a-b: 일차 내피 세포 분리 및 배양. (a) 일차 폐 내피 세포를 큰 혈관으로부터 분리하고, CD31+ 집단을 분류하기 전에 EGM2 배지에서 5일 동안 배양하였다. 게이팅 전략은 더블렛 및 사후 거래(퍼시픽 블루+)의 배제 및 CD31+ 집단의 분리를 입증한다. 대표적인 예를 나타내었다. (b) 젤라틴-코팅된 플라스크 상의 배양에서 분류된 집단의 면역형광 염색으로서, 내피 순도를 입증한다. 눈금 막대 = 100 μm.
도 8a-c: 세포의 표현형 및 노화에 대한 ROCK 억제제의 효과. (a) ROCK 억제제 Y27632(10 μM)이 첨가된 또는 첨가되지 않은 계대 1 및 계대 4에서 n=3개의 개별 세포주의 유전자 발현 분석. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 각 계대에서 t-테스트에 의해 비처리 및 처리(+ROCK) 사이의 유의한 차이는 발견하지 못하였다. (b) 트리판 블루를 배양 배지에 첨가한, ROCK 억제제의 존재 또는 부재하의 계대 1 및 계대 4에서 세포의 대표적인 이미지. (c) pH 6에서 노화 관련 β-갈락토시다제 활성에 대해 염색된, ROCK 억제제 존재 또는 부재의 계대 1 및 계대 4에서 세포의 대표적인 이미지. 눈금 막대 = 50 μm.
도 9a-b: 기저 세포 집단에 대한 내피 세포 공동-배양의 효과. (a) 일차 폐 내피 세포와의 공동 배양에서 일차 상피 기저 세포(계대 4)의 qPCR 유전자 발현 분석. 데이터는 배양 배지(VEGF+, 40/ml)에 VEGF를 첨가하거나 첨가하지 않은, 기저 세포 집단(Epi+) 플러스 트랜스웰 인서트(transwell insert)(Endo+)의 내피 세포 배양물을 나타낸다. (b) 처리된 및 비처리된 상피(검출되지 않음) 및 내피에 의한 VEGF 수용체의 발현. 발현 수준은 β-액틴에 대해 표준화되며, 정상적인 폐 조직과 비교하여 표현된다. n = 이중으로 분석된 3 복제물. 오차 막대 = 표준 편차. Epi+ 비처리된 군에 대한 Dunnet 사후-테스트를 이용한 1-원 ANOVA에 의해 분석됨.
도 10a-b. BESC는 5일 동안 시험관내에서 DAPT(50nM)로 전처리한 다음, 래트 폐 스캐폴드(20 x 106)에 전달하고, 계속된 억제제 처리 없이 원위 타입2-유사 운명을 유지하였다. (a) 시험관내 처리 말기(5일), 및 래트 폐 스캐폴드로의 전달 후 및 억제제 없이 추가로 5일 동안 생체외 배양에서 유전자 발현의 정량적 PCR 분석. 3개의 독립적인 웰(시험관내) 또는 3개의 독립적인 조직 조각(생체외)으로부터의 데이터가 제시된다. 정상적인 사체 폐 조직 대조군과 관련하여 β-액틴에 대해 표준화된 발현. (b) 생체외 배양 5일에 재세포화된 폐 조직에서 계면활성제 단백질 C 및 p63에 대한 면역형광 염색. 50 um 눈금 막대.
도 11. 조직-유래된 BESC를 시험관내에서 원위 폐세포 운명으로 효율적으로 유도하는 감마-분비효소를 표적으로 하는 이중 소분자(본 도면에서, LY411575 및 GSI-X)를 사용하여 노치 신호 경로의 직접 억제. 시험관내 처리의 말기(5일)에 유전자 발현의 정량적 PCR 분석. 중복 실험으로 분석된 n = 3개의 독립적인 웰로부터의 데이터가 제시되어 있다. β-액틴 발현으로 표준화된 발현 및 비처리된 세포(SAGM)와 비교하여 계산된 배수-변화. 이러한 처리를 이용하여, 타입1 폐세포 마커 AQP5 또한 증가하였으며, DAPT/IBMX 처리에서는 다시 발견되지 않았다 (도 3에서와 같음).
도 12a-c. 분리된 인간 ECM 상의 상피 배양. (a) 시험관내 배양을 위한 기질 코팅의 제조 방법. (b) 신생아(N1-N3) 및 성인(A1-A3) 기질 코팅에서 성장한 BESC의 정량적 유전자 발현 분석. B-액틴으로 표준화된 발현, 및 정상적인 성인 폐 조직과 비교하여 표현됨. (c) 7일에 총 생 세포 및 죽은 세포 형광을 측정하는 세포독성 검정.
도 13a-b. 단백질체분석에 의한 신생아 및 성인 폐 조성물. (a) 각 샘플에서 검출된 단백질의 히트 맵. (b) 신생아 대 성인 기질(n = 3/군)의 개략적 마트리솜(matrisome) 조성물.
도 14a-b. 성인 및 신생아 스캐폴드에서 기질 단백질의 정량적 비교. (a) 검출된 기질 단백질의 볼케이노 플롯. (b) (a)에서 강조된 단백질의 세부 사항.
도 15a-e. FBN-2 및 TN-C에 대한 BESC 반응의 시험관내 분석. (a) 유전자 발현 분석, β-액틴으로 표준화되고 정상 성인 폐 조직과 비교하여 표현됨. (b) 면역형광 염색 (c) Ki67+ 정량화 (n = 3 조직/군). 눈금 막대 = 50 μm (d) 시험관내 이동 검정, 대표 이미지 및 180분에 걸친 무세포 영역에서 변화의 정량화. 눈금 막대 = 100 μm. (e) 각 코팅 상에서 BESC에 의한 초점성 유착 키나제(FAK)의 발현. 유전자 발현 분석, β-액틴으로 표준화되고 정상 성인 폐 조직과 비교하여 표현됨.
도 16a-e. 전처리된 기질에서의 생체외 폐 상피 재생. (a) 재-상피화된 폐 스캐폴드의 정량적 유전자 발현 (b) 폐 조직의 헤마톡실린 및 에오신 평가. 눈금 막대 = 50 μm. (c) 재생 3일 및 7일째에서 폐 조직의 면역형광 염색. 눈금 막대 = 50 μm. (d) 폐 상피 재생 3일 및 7일째에서 Ki67 양성 세포의 정량화. (e) 중격 두께에 따른 조직 형태의 정량화.
도 17a-c. 신생아 폐의 탈세포화. (a) 공여자 왼쪽 및 오른쪽 폐. (b) 공여자 폐의 관삽입. 눈금 막대 = 5 cm. (C) 0.5% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 용액의 관류 탈세포화에 의한 신생아 공여자 폐의 탈세포화.
도 18. 중격 두께의 대표적인 측정. 적색 선은 측정된 면적을 나타낸다 (n = 5/이미지). 눈금 막대(백색) = 50 μm.
상세한 설명
천연 세포외 기질 스캐폴드를 기반으로 하는 고형 장기 생체공학은 최종 장기 기능손실을 위한 재생 의학 접근법에 대한 최근의 열의를 촉발시켰다(1). 주요 접근법은 살아있는 기능 이식편을 형성하기 위해 재생 세포 집단을 상응하는 생물학적 기질과 조합시키는 것을 포함한다. 이를 위해, 천연 고형 장기 세포외 기질(ECM) 스캐폴드는 특정 세제로의 관류 탈세포화에 의해 용이하게 생성될 수 있으며, 생체적합성 골격을 재생을 위한 토대가 되게 할 수 있다(2-7).
임상적으로 관련된 장기 재세포화는, 세포 소스를 확인할 뿐만 아니라 이식 전에 장기 성숙을 지지하기 위한 기능적 생체모방 장기 배양 조건을 확립하는데 있어서 중요한 도전 과제를 제시한다(8).
최적의 세포 소스는 시험관 내에서 용이하게 수득되고 확장될 것이며, 이상적으로는, 다중계 분화 능력을 보유할 것이다. 주요 발달 단계를 통해 유도된 만능성 줄기 세포의 지시된 분화가 폐-특이적 세포 집단을 얻는데 있어서 유망한 옵션을 제시하는 반면(9-11), 시험관내 배양의 길이 및 제한된 세포 수는 대규모 장기 공학에 대한 이들의 현재의 유용성을 제한한다. 대체로 휴지기 동안, 성인 폐 조직은, 조직 손상에 반응하여 활성화되는 수 많은 임의의 줄기/기원 세포 집단으로 인해, 현저한 재생 능력을 가지고 있다(12). 전사 인자 p63 및 사이토케라틴 5(Krt5)의 발현으로 확인되는 기도 기저 세포는 기도 상피의 다능성 줄기 세포로서 기능하며, 생리적 세포 회전(turnover) 및 재생 동안 기도 항상성을 유지하는데 결정적인 것이다(13, 14). 이러한 필수적인 세포 집단은 인간 기도 상피에서 세포의 30%를 차지하며(15), 기도 재생에 대한 초기 연구는 분리된 기저 세포가 벗겨진(denuded) 마우스 기관에 시딩될 경우 완전하게 분화된 기도 상피를 발생반복시키는 이들의 능력을 입증하였다(16). 손상에 대한 반응으로, 기저 상피 줄기 세포는 급속히 증식하여 섬모 및 곤봉 세포 자손 둘 모두를 발생시킬 수 있으며, 이는 조직 항상성 및 손상 수복에서 이들의 중요한 기능을 확인시켜 준다(17). 폐 기저 세포는 폐 조직으로부터 쉽게 분리되고(18, 19) 배양으로 증식될 수 있으며(20), 이는 이들을 조직 공학 응용 분야의 유용한 표적 집단이 되게 한다. 이러한 일차 줄기 세포 집단의 시험관내 배양은 또한, 기본 생물학 및 조직 재생을 연구하는데 있어서 중요한 도구를 제공하며(13), 특히 이들의 다중계 분화 능력을 고려할 때 그러하다(21, 22).
본원에 기술된 것은 쉽게 접근 가능한 조직 소스로부터의 고도로 증식성인 기저 줄기 세포 집단의 분리이며, 시험관 내에서 100배 초과의 확장을 입증하였다. Krt5+p63+ 발현에 의해 확인된 이러한 세포 집단은 폐 수복(23-25)의 동물 모델 및 인간 질병(26)에서 연구되었다.
Krt5+p63+ 집단 내에서, 기저 줄기 세포의 추가적인 구별되는 하위집단이 존재할 수 있으며, 각각은 조직 항상성 및 수복에 고유의 역할을 수행한다. 이는 정상의 원위 폐 내에서 최근 보고된 계열-음성 상피 기원(LNEP) 세포를 포함하며, 이는 손상 후 특별히 증식할 수 있다(27). 이러한 드문 세포 하위세트가 분리되어 작용할 수 있는지의 여부 또는 이들이 손상된 조직 환경에서 다른 세포의 조합된 신호 전달과 작용을 필요로 하는지의 여부는 분명하지 않다. 수학적 모델은 거의 동일한 수의 다능성 줄기 세포 및 수임 전구체를 제안하는, 이종성 기저 줄기 세포 집단을 지지한다(28). 소스, 세기 및 지속 시간을 포함하는 상해의 역할 또한 세포 활성화 및 운명의 중요한 결정 인자이다. 연령과 종을 두 가지 예로서 고려하여 연구된 세포 집단의 기원은 또한 재생 능력 및 세포 운명에 기여할 수 있다. 세관 발달 단계에서의 배아 폐는 중간엽 세포와 혈액 세포로 둘러싸인 상피 기원이 풍부한 구별되는 니치(niche)를 보유하는 것으로 최근 입증되었으며, 이들 세포는 손상된 폐에 이식되어 다중계로 분화될 수 있다(29).
폐 손상 후, 온전한 상피의 재확립은 폐 항상성을 회복시키는데 결정적이다(30). 폐 수복의 현재 모델에서, 탈세포화된 폐 스캐폴드는 상피 세포 이동을 위한 임시적 기질로서 작용하여, 생체내에서 활성화된 과정을 (적어도 부분적으로) 반복하여 벗겨진 기도 및 가스 교환 표면을 덮고 수복시킨다(31). 상피 세포를 기질에 고정시키고 기저 스트로마를 보호하는데 도움이 되는 기저 세포의 생리학적 역할은 이들의 풍부한 세포골격, 접합 및 점착 단백질의 발현에 의해 도움을 받으며, 이는 천연 폐 ECM의 재-상피화에서 이들의 입증된 유용성을 지지한다(32).
기도 손상의 설치류 모델은 상피 수복의 시각표를 확립하였다. 상피 손상 후, 세포 확산 및 이동이 처음 12-24 시간에 일차 수복 기전으로서 발생하며, 증식은 24시간 후 시작되며 수주 동안 계속된다(33). 이러한 시각표는 생체외 배양의 폐 수복 및 재생의 현재 모델과 일치한다. 구복 기전의 다음 단계는 거짓중증 상피의 재확립일 것이며, 이는 확립하는데 수주일 걸릴 수 있다(34). 전체 래트 폐 스캐폴드 상의 공기-액체 계면 배양의 현재 모델은 FOXJ1의 초기 상향조절을 입증하였으며, 7일째에 밀착 접합 형성을 증가시켰다. 연장된 생물반응기 배양은 재구성된 상피를 완전히 성숙시키는데 필요할 수 있는데, 시험관내 ALI 모델은 성숙한 기도 생물작용을 반복하는데 3-4주가 요구되기 때문이다(35). 재세포화 및 생체외 배양 후, 현재 재구성된 상피 내에서 유의한 폐세포 계열은 확인되지 않았다. 신호 전달 경로의 조절과 결합된 보다 더 긴 재생 시간은 전달된 줄기 세포 집단으로부터 수임 폐세포 분화를 유도하는데 아마도 필요하며, 동물 모델은 원위 폐 재생이 50-90일을 필요로 함을 입증한다(27, 36).
노치 신호 전달은 폐 상피 발달 및 항상성에 필수적이고 복잡한 역할을 하며, 노치 리간드는 폐에서 매우 높은 수준으로 발현된다(37). 폐 발달은 다중 세포 계열의 정확한 패턴화를 필요하며, 그 중 많은 운명의 선택은 직접적인 세포 대 세포 소통에 의해 제어된다. 배아 폐포 발달 동안, 노치의 항시적 과다 발현은 원위 상피의 발달을 억제하고, 대신에 주로 폐포 마커가 결핍된 낭종 형성을 촉진시킨다(38). 조기 폐 근위-원위 세포 운명 결정에서 노치 신호 전달에 대한 요구가 또한, DAPT에 의한 노치 억제 후 나타났으며, 이는 Nkx2.1+ 원위 폐 기원 세포 집단의 축적을 발생시켰다(38). 본원에 또한 제시된 바와 같이, γ-분비효소를 통한 노치 경로의 약리학적 억제는 시험관내 및 생체외 폐 스캐폴드 배양에서 타입 II 폐세포 표현형으로의 전반적 전이를 유도할 수 있다. 이는 마우스 기저 줄기 세포의 3-D 구체 배양의 보고를 확인시켜준다(27). 또한, 노치 억제 후에 관찰된 CCSP-발현의 손실이 있었으며, 이는 분비 계열로의 기저 세포 분화에서 노치 활성화에 대한 필수적인 역할을 더욱 강조한다(39, 40). 장기 공학의 경우, 이러한 신호의 정밀한 제어는 최적의 세포 패턴화를 달성하기 위해 노치 경로의 약학적 활성화 또는 억제를 필요로 할 수 있다. 용량 및 시간 제어된 방식으로 특정 근위 또는 원위 폐 구획에 이러한 생화학 신호를 특정하게 전달하기 위해 진보된 생체공학 절차의 추가적인 개발이 필요할 것이다. 역학적 힘은 또한 메탈로프로테아제 절단 부위를 노출시키고, 자동-억제된 형태로부터의 후속 변화를 촉진하는 노치 신호 전달의 활성화에 기여한다(41). 이러한 역학적 고려사항은 전통적인 2-D 배양 대비 3-차원 전체 장기 생체모방 배양에서 세포-세포 신호전달에 있어서 추가적으로 중요할 수 있다. 생체모방 장기 관류로부터 발생한 유체 전단력은 배양 동안 스캐폴드를 따라 세포 조직화를 추가로 지시할 수 있다. 상피 세포는 시험관내에서 유체 흐름 스트림라인을 따라 이동하는 것으로 나타났으며, 이것은 국소 미세환경에서 파라크린 케모카인 필드에 의해 지시될 수 있다(42).
폐 스캐폴드 재세포화 및 생체외 재생의 본 모델은 체계적 방식으로 상피 수복을 추가로 조사하기 위한 독특하고 쉽게 접근할 수 있는 도구를 제공한다.
탈세포화된 스캐폴드를 기반으로 하는 장기 재생은 아마도 세포 수복 잠재력의 손상 및 테스트의 궁극적인 모델이다. 재생 장기의 생체외 배양에 의해 제공되는 생체모방 자극과 결합된 분리된 환경을 고려하면, 천연 조직을 재생하는 특정 세포 집단의 능력을 직접적으로 평가하는 것이 가능하다. 본 연구에서는 체계적인 빌딩-블록 접근법을 사용하여, 일차로 분리된 기도 줄기 세포 집단이 무세포 폐 스캐폴드 상에서 광범위한 조직 재생을 달성할 수 있으며, 근위 및 원위 상피 계열 둘 모두로 유도될 수 있음을 입증함으로써 결정적인 단계의 진전이 이루어진다.
이 문서는 기도 장기 생성 및 보존과 관련된 방법 및 물질에 관한 것이다. 인간 및 다른 동물로의 이식을 위해 준비된 기능성 기도 장기의 성장을 위해 보다 실현가능한 환경을 제공하는데 사용될 수 있는 기능성 폐 조직을 생성하도록 구성된 방법, 디바이스, 세포 및 조성물이 기술된다. 폐 조직은 주어진 기질, 예를 들어, 인공 또는 탈세포화된 폐 조직 기질 상에 생성된다. 추가로 본 발명은 더 많은 개선되고 개별화된 이식용 이식편을 제공하기 위해 연장된 기간에 걸쳐 공여자 장기의 보존, 수복 및 변형을 위한 이러한 실현가능한 환경의 사용을 기반으로 하고 있다.
본원에서 사용된 "기능성" 폐 조직은, 예를 들어, 산소를 공기에서 혈류로 운반하고, 이산화탄소를 혈류에서 공기로 방출시키게 허용하는 대부분의 또는 모든 정상적인 건강한 폐의 기능을 수행한다. 폐는 흡입된 공기를 가습시키고, 계면 활성제를 생성하여 폐포에서 표면 장력을 감소시키고/거나 점액을 생성하고 운반하여 원위 기도로부터 근위 기도까지 흡입된 미립자 물질을 제거한다.
본원에서 사용된 용어 "탈세포화(decellularized)" 및 "무세포(acellular)"는 표준 조직학적 염색 절차를 이용한 검출가능한 세포내 물질, 내피 세포, 상피 세포, 및 조직학적 절편에서의 핵의 완전하거나 거의 완전한 부재로서 사용되거나 정의된다. 바람직하게는, 필수적이지는 않지만, 잔여 세포 파편 또한 탈세포화된 장기 또는 조직으로부터 제거되었다.
탈세포화된 조직/장기 기질
본 발명의 일부 구체예에서, 폐 조직은 탈세포화된 기질 상에서 생성된다. 탈세포화된 폐 조직 기질을 제조하기 위한 방법 및 물질은 하기 논의된 바와 같이 당해 공지되어 있다. 임의의 적절한 물질이 이러한 기질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조직 기질은 탈세포화된 폐 조직으로부터 발달된 무세포 조직 스캐폴드일 수 있다. 예를 들어, 조직, 예컨대, 인간의 폐, 예를 들어, 인간 폐 중 하나 또는 한 쌍 또는 이의 일부, 예를 들어, 인간, 돼지, 소, 영장류 또는 양 사체 폐 또는 이의 일부는 조직 또는 조직 일부의 형태학적 무결성(morphological integrity) 및 맥관구조를 유지하고, 세포외 기질(ECM) 단백질을 보존하면서 조직으로부터 천연 세포를 제거하기 위한 적절한 방법에 의해 탈세포화될 수 있다(문헌 [Tapias LF, and Ott HC. Decellularized scaffolds as a platform for bioengineered organs. Current opinion in organ transplantation. 2014;19(2):145-52] 참조). 포유동물 폐 조직을 탈세포화시키는 방법은 예를 들어, 문헌 [O'Neill JD et al., Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 2013 Sep;96(3):1046-55]; [Nichols JE et al., Production and assessment of decellularized pig and human lung scaffolds, Tissue Eng Part A. 2013 Sep;19 (17-18):2045-62]; [Gilpin SE et al., Perfusion decellularization of human and porcine lungs: Bringing the matrix to clinical scale. Journal of Heart and Lung Transplantation. 2014; 33: 298-308]; [Song JJ et al., Bioartificial lung engineering. Am J Transplant. 2012 Feb;12(2):283-8]; 및 [Ott HC et al., Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 2010 Aug;16(8):927-33]에 기술된다. 예시적인 탈세포화 방법은 예를 들어, 액체 질소를 사용한 반복된 동결-해동 주기로 조직(예를 들어, 폐 조직)을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 조직은 비이온성 또는 이온성 세포 붕괴 배지, 예컨대, 소듐 도데실 설페이트(SDS), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 또는 TritonX로 처리될 수 있다. 조직은 또한 누클레아제 용액(예를 들어, 리보누클레아제, 데옥시리보누클레아제)으로 처리될 수 있고, 약하게 교반하면서 멸균 인산염 완충 염수로 세척될 수 있다. 예시적인 방법은 당업계 예를 들어, 문헌 [O'Neill JD et al., Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 2013 Sep; 96(3):1046-55]에 공지되어 있다. 일부 경우에, 탈세포화는 당해 공지된 방법 및 물질을 이용하여 장기 또는 조직의 용기, 덕트(duct), 및/또는 캐비티(cavity)를 플러싱시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Maghsoudlou et al., Preservation of micro-architecture and angiogenic potential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment. Biomaterials. 2013 Sep; 34(28):6638-48]에 기술된 바와 같다. 플러싱 단계 후, 장기 또는 조직은 상기 기재된 바와 같이 세포 분열 배지 예를 들어, 탈이온수 중의 1% SDS와 라인을 통해 관류될 수 있다. 조직을 통과한 관류는 제방향(antegrade) 또는 역방향(retrograde)일 수 있고, 방향성은 관류 효율을 향상시키기 위해 교대될 수 있다. 장기 또는 조직의 크기 및 중량, 및 특정 비이온성 또는 이온성 세정제(들) 및 세포 붕괴 배지에서의 비이온성 또는 이온성 세정제(들)의 농도에 따라, 조직은 일반적으로 세포 붕괴 배지에 의해 조직 그램 당 약 2 내지 약 12시간 관류된다. 세척을 포함하여, 장기는 조직의 그램 당 약 12 내지 약 72시간 이하 동안 관류될 수 있다. 관류는 일반적으로 유량 및 압력 예를 들어, 5-100 mmHg의 압력 및 소스 유기체 또는 개체의 생리학적 심박출량의 0.1-10배의 유량을 포함하는 생리적 조건으로 조절된다.
또 다른 예시적 방법에서, 탈세포화 방법은 30 cm H2O의 일정압에서 폐동맥을 통과하여 세정제 예를 들어, (1) 0.1% SDS (2) 2% 소듐 데옥시콜레이트(SDC), 또는 (3) 8 mmol/리터 (3)3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) (pH12) 세정제를 관류시키는 것을 포함한다. 모두 3개의 세정제에 대한 프로토콜은 하기를 포함한다:
1. 인산염-완충 염수(PBS)로 10분 제방향 세척,
2. 불투명한 반투명 기질(탈세포화의 지표)을 시각화하는데 필요한 시간 플러스 그러한 초기 시간의 추가적 20% 동안 (예를 들어, 70분 + 14분) 동안 세제 관류,
3. 15분 탈이온화된 H2O 세척, 및
4. 항생제와 항균제가 첨가된 추가 172시간 PBS 세척.
예를 들어, 이러한 탈세포화 방법은 탈이온화된 H2O 후 1% Triton-X의 추가적인 세척을 포함할 수 있다. SDC 프로토콜은 SDC 전 0.1% Triton-X 관류 및 SDC 후 1 mol/리터 NaCl을 포함할 수 있다.
유사하게는, 돼지 및 인간 폐 탈세포화 방법은 일정압에서 폐동맥을 통과하는 세정제 또는 기타 탈세포화 제제의 관류 이어서, H2O, 1% Triton-X 용액, 및 PBS로의 후속 세척을 포함할 수 있다. 래트 폐와 유사하게, 탈세포화는 육안 검사 및 불투명한 반투명 기질의 출현으로 완료된 것으로 간주될 수 있다. 주로 수확 동안 사전-플러싱(pre-flushing)의 확장 및 임의의 발생한 혈전으로 인한 출발 장기의 가변성은 필요한 관류시간 길이에 기여할 수 있다. 일반적으로, 탈세포화 관류의 시간은 예를 들어, 4일 내지 7일로 다양할 수 있다.
탈세포화된 조직은 혈관 트리의 ECM 성분을 포함하는, 모든 또는 대부분의 조직 영역의 세포외 기질(ECM) 성분으로 필수적으로 (예를 들어, 적어도, 85 중량% 순수, 90 중량% 순수, 92 중량% 순수, 95 중량% 순수, 96 중량% 순수, 97 중량% 순수, 98 중량% 순수, 및 99 중량% 순수) 구성될 수 있다. ECM 성분은 피브로넥틴, 피브릴린, 라미닌, 엘라스틴, 콜라겐 패밀리의 일원(예를 들어, 콜라겐 I, III 및 IV), 글리코사미노글리칸, 세포간 물질(ground substance), 세망 섬유(reticular fiber) 및 트롬보스폰딘 중 임의의 또는 모든 물질을 포함할 수 있으며, 이는 규정된 구조, 예컨대, 기저판(basal lamina)으로서 조직화된 채 유지될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 탈세포화된 폐 조직 기질은 무손상 맥관구조를 보유한다. 실질적으로 무손상 맥관구조를 보존하는 것은 이식 시, 조직 기질을 대상체의 혈관 시스템에 연결가능하게 한다. 게다가, 탈세포화된 조직 기질은 추가로 예를 들어, 조사(예를 들어, UV, 감마)로 처리되어 탈세포화된 조직 기질 상에 또는 탈세포화된 조직 기질에 남아 있는 임의의 유형의 미생물의 존재를 감소시키거나 제거할 수 있다.
물리적, 화학적 및 효소적 수단을 이용하여 탈세포화된 조직 기질을 얻기 위한 방법은 당해 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Liao et al, Biomaterials 29(8):1065-74 (2008); Gilbert et al., Biomaterials 27(9):3675-83 (2006); Teebken et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 19:381-86 (2000)] 참조). 또한, 미국 특허공보 제 2009/0142836호; 제 2005/0256588호; 제 2007/0244568호; 및 제 2003/0087428호 참조.
인공 장기 기질
본 방법의 일부 구체예에서, 폐 조직은 인공 장기 기질 상에서 생성된다. 인공 장기 기질을 제조하기 위한 방법 및 물질은 당해 공지되어 있다. 임의의 적절한 물질이 이러한 기질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 인공 장기 기질은 예를 들어, 폴리글리콜산, Pluronic F-127(PF-127), 겔폼 스폰지(Gelfoam sponge), 콜라겐-글리코사미노글리칸(GAG), 피브리노겐-피브로넥틴-비트로넥틴 하이드로겔(FFVH), 및 엘라스틴과 같은 다공성 물질로부터 개발된 스캐폴드일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ingenito et al., J Tissue Eng Regen Med. 2009 Dec 17; Hoganson et al., Pediatric Research, May 2008, 63(5):520-526; Chen et al., Tissue Eng. 2005 Sep-Oct;11(9-10):1436-48] 참조. 일부 경우에, 인공 장기 기질은 폐포 유닛과 유사한 다공성 구조를 가질 수 있다. 문헌 [Andrade et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007 Feb;292(2):L510-8] 참조. 일부 경우에, 이식된 인공 장기의 기질은 기관-특이적 마커(예를 들어, 클라라 세포, 폐세포, 및 호흡 상피에 대한 폐-특이적 마커)를 발현시킬 수 있다. 일부 경우에, 이식된 인공 장기 기질은 식별가능한 구조(예를 들어, 인공 폐 기질에서 폐포 및 말단 기관지와 유사한 구조)로 조직화될 수 있다. 예를 들어, FFVH를 사용하여 제조된 이식된 인공 폐의 기질은 주변 조직에 대한 영양 효과의 증거로 세포 유착, 확산 및 시험관내 세포외 기질 발현 및 생체내 뚜렷한 생착(engraftment)을 촉진할 수 있다. 문헌 [Ingenito et al., supra] 참조. 또한, 미국특허번호 제 7,662,409호 및 제 6,087,552호; 미국특허공보 제 2010/0034791호; 제 2009/0075282호; 제 2009/0035855호; 제 2008/0292677호; 제 2008/0131473호; 제 2007/0059293호; 제 2005/0196423호; 제 2003/0166274호; 제 2003/0129751호; 제 2002/0182261호; 제 2002/0182241호; 및 제 2002/0172705호 참조.
테나스신 -C 및/또는 피브릴린 -2로의 처리
폐 장기 공학을 위한 최적의 스캐폴드는 필요한 구조를 제공할 뿐만 아니라, 새로운 폐 조직의 조직화 및 기능을 추가로 안내할 것이다. ECM은 조직 발달 및 수복을 포함하는 많은 생물학적 과정에 참여하는 복잡한 실체이다(Balestrini and Niklason, Annals of biomedical engineering. 2015;43(3):568-76). 전체 장기 재생에서 ECM을 고려할 경우, 스캐폴드를 제조하는데 사용되는 천연 폐 조직의 소스는 후속 재생에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 연구는 근본적인 폐 병리 현상이 탈세포화 후에도 유지되는 ECM의 변화를 일으킬 수 있으며, 조직 수복 동안 영구화될 수 있음을 보여주었다(Burgess et al., The Journal of pathology. 2016;240(4):397-409). 이는 폐 섬유증 및 폐기종 둘 모두에 대해 입증되었다(Booth et al. American journal of respiratory and critical care medicine. 2012;186(9):866-76; Sokocevic et al. Biomaterials. 2013;34(13):3256-69). 폐의 나이 또한 탈세포화된 스캐폴드에 대한 중요한 차이의 원인일 수 있다. 노화된 ECM에서의 성장은 라미닌 α3 및 α4 사슬의 세포 발현을 현저하게 저하시킬 수 있으며, 이는 노화된 폐 ECM에서 관찰되는 라미닌 결핍을 반복함을 보여 주었다. 이들 데이터는 폐 스캐폴드에 함유되어 있는 깊은 생물학적 정보, 및 회복 세포 집단과 근본적인 단백질 기질 사이에 존재할 수 있는 피드백 루프를 추가로 강조한다(Godin et al., PloSl., 2016; 11 (3):e0150966)
폐 발달은 출생 후 활발히 계속되며, ECM 리모델링은 폐포화의 출생-후 과정에서 필수적인 요소이다. 이러한 기작은 가스 교환 표면적을 극적으로 증가시키는 기능을 하는데, 폐가 미성숙 폐포 구조를 추가로 개선시키고, 2차 중격 형성을 통해 더 많은 수의 더 작은 크기의 폐포를 생성하기 때문이다(Whitsett et al., Physiological reviews. 1995;75(4):749-57). 이 과정의 결과 및 ECM 조성의 특정 차이는 생체외 조직 재생과 관련하여 잘 연구되지 않았다. 태아의 상처는 성인보다 빠른 속도로 회복되고, 흉터가 거의 없거나 전혀 없다(Yates et al., Birth defects research Part C, Embryo today: reviews. 2012;96(4):325-33). 영아기의 폐엽 절제술 후 폐 재성장은 가능하며, 기도 기능의 회복 및 폐 부피의 전체 회복이 가능하다(McBride et al., The Journal of clinical investigation. 1980;66(5):962-70). 반대로, ECM의 조절장애는 노화의 중요한 유도 인자이며, ECM의 연령-관련 변화는 주변 세포에 직접 전달되어 폐기종 및 폐 섬유증과 같은 만성 폐 질환의 발병에 기여한다(Meiners et al., The European respiratory journal. 2015;45(3):807-27). 노화의 또 다른 결과는 줄기 세포 기능 장애 및 고갈의 현상으로, 기원 세포의 다능성 풀(pool)이 점차 감소하고 노화가 증가하게 된다(Thannickal et al., American journal of respiratory and critical care medicine. 2015;191(3):261-9). ECM을 포함한 줄기 세포와 니치 사이의 이러한 상호작용은 재생 능력의 이러한 감소에 기여할 수 있다.
본 연구에서는 성인 폐 공여자와 비교하여 활발하게 폐포화를 겪고 있는 신생아 폐로부터의 ECM의 차이를 조사하였으며, 생체외 폐 상피 수복에서 이러한 차이의 결과를 평가하였다. 신생아 폐 ECM에서는 발달 관련 단백질인 피브릴린-3(FBN-3), 피브릴린-2(FBN-2) 및 테나스신-C(TN-C)이 증가되었으며, 무세포 폐 스캐폴드 상의 시험관내 및 생체외 둘 모두의 폐 재생에서 이들 두 단백질의 보충은 상피 증식을 향상시키고, 노화를 감소시키고, 세포 유착 및 이동을 돕고, 궁극적으로 재생된 조직 형태 및 구조를 향상시킬 수 있음이 보고되었다.
일부 구체예에서, 폐 조직 기질 예를 들어, 탈세포화된 폐 조직 기질 또는 인공 폐 기질은 세포 시딩 전에 래트 폐 기질에 대한 예를 들어, 총 15 ml 부피에서 테나스신-C(예를 들어, 0.5-10 ug/ml, 예를 들어, 약 1-3 ug/ml) 및/또는 피브릴린-2(예를 들어, 전체 또는 N 및 C 단편)(예를 들어, 0.5-10 ug/ml, 예를 들어, 약 1-3 ug/ml)를 포함하는 용액으로 전처리된다. 이들 방법들에서, 테나스신-C 및/또는 피브릴린-2는 외인성이며, 즉 (기질과 접촉되기 전 또는 동안에) 기질이 인큐베이션되는 용액에 첨가되며, 기질에 이미 존재하는 (또는 용액 중에 존재하는 임의의 혈청에 이미 존재하는) 임의의 테나스신-C 및/또는 피브릴린-2 이외의 것이다. 일부 구체예에서, 방법은 테나스신-c 및/또는 피브릴린-2 예를 들어, 약 0.5-10 ug/ml 테나스신-C 및/또는 약 0.5-10 ug 및/또는 피브릴린-2을 포함하는 용액을 예를 들어, 스캐폴드 기도로 (예를 들어, 중력에 의해) 전달하고, 예를 들어, 37℃에서 약 1시간 동안 테나스신-C 및/또는 피브릴린-2의 존재하에 기질을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 테나스신-C 및/또는 피브릴린-2를 포함하는 용액에 시딩된다. 피브릴린-2에 대한 대안으로 또는 이에 더하여, 피브릴린-3이 사용될 수 있다.
인간 테나스신-C 전구체에 대한 예시적인 서열은 GenBank의 NM_002160.3 (핵산) 및 NP_002151.2 (단백질)이다. 예시적인 단백질 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001
아미노산 1-22가 신호 서열로 보이므로, 일부 구체예에서, 성숙 테나스신-C 단백질 예를 들어, SEQ ID NO:1의 아미노산 23-2201이 사용될 수 있다. 대안적으로, 아미노산 23 내지 625를 포함하는 단편이 사용될 수 있다.
인간 피브릴린-2 전구체에 대한 예시적인 서열은 GenBank의 NM_001999.3(핵산) 및 NP_001990.2(단백질)이다. 인간 피브릴린-2 전구체에 대한 예시적인 단백질서열은 다음과 같다:
Figure pct00002
Figure pct00003
아미노산 1-28이 신호 서열로 보이므로, 일부 구체예에서, 성숙 피브릴린-2 단백질 예를 들어, SEQ ID NO:2의 아미노산 29-2912가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 피브릴린-2는 예를 들어, 인간 293 세포에서 생성된 2개의 별도의 펩티드 예를 들어, N 및 C 단편 예를 들어, N-말단 절반 rFBN2-N(아미노산 1-1732) 및 C-말단 절반 rFBN2-C(아미노산 1531-2771)로서 제조된다. 예를 들어, 문헌 [Lin et al., J. Biol. Chem. 277: 50795-50804 (2002)] 참조.
인간 피브릴린-3 전구체에 대한 예시적인 서열은 GenBank의 NM_001321431.1(핵산) 및 NP_001308360.1(단백질), 또는 NM_032447.4(핵산) 및 NP_115823.3(아미노산)이다.
바람직하게는, 사용된 단백질의 서열은 상기 제공된 성숙한 참조 서열과 적어도 80% 동일 (예를 들어, 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일)하며, 본원에 기술된 활성을 갖는다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적으로 정렬시킨다(예를 들어, 최적의 정렬을 위한 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있으며, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 바람직한 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 80%이며, 일부 구체예에서는, 적어도 90% 또는 100%이다. 그 후, 상응하는 아미노산 위치 또는 누클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 누클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 위치를 제2 서열의 상응하는 위치에서 동일한 아미노산 잔기 또는 누클레오티드가 차지할 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에서 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등하다). 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열의 비교 및 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 디폴트 매개변수 예를 들어, 12의 갭 패널티, 4의 갭 확장 패널티 및 5의 프레임 이동 갭 패널티를 갖는 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지(월드 와이드 웹 gcg.com에서 입수가능)의 GAP 프로그램에 통합된 니들맨 앤 원치(Needleman and Wunsch) ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) 알고리즘을 사용하여 두 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트를 결정할 수 있다.
임의의 형태의 TNC 또는 FBN-2 예를 들어, 재조합으로 생성된 단백질 (예를 들어, 세포 예를 들어, 원핵 또는 진핵 세포, 바람직하게는, 포유동물(더욱 바람직하게는, 인간) 세포로부터 발현되고 분리된 단백질, 또는 그러한 단백질을 생성하는 전이유전자 동물로부터의 단백질, 또는 시험관내에서 무세포 시스템에서 전사되고 번역된 단백질) 또는 천연 소스로부터 분리된 단백질이 사용될 수 있다. 인간 단백질이 바람직하지만, 또한, 다른 포유동물 종, 예를 들어, 소, 염소, 돼지, 말 또는 양이 사용될 수 있다.
본 발명은 TNC 및/또는 FBN-2을 일부 세포 유형과 함께 사용하는 것을 예시하고 있지만, 다른 것들도 사용될 수 있다.
세포 시딩
본원에 기재된 방법 중 일부에서, 폐 조직 기질, 예를 들어, 탈세포화된 폐 조직 기질 또는 인공 폐 기질은 세포, 예를 들어, 분화 또는 재생 세포로 시딩된다.
임의의 적절한 재생 세포의 유형, 예컨대, 순수(naive) 또는 미분화 세포 유형이 폐 조직 기질을 시딩하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 (예를 들어, 유도 후) 줄기 세포 단계, 기원 세포 단계, 혈관모세포 단계 또는 분화 단계 (예를 들어, CD31+, vWF+)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 단계에서 시딩될 수 있다. 본원에서 사용된 재생 세포는 비제한적으로, 기원 세포, 전구 세포, 및 탯줄의 제대(umbilical cord) 세포(예를 들어, 인간의 탯줄 정맥 내피 세포) 및 태아 줄기 세포를 포함하는 "성체(adult)"-유래 줄기 세포를 포함할 수 있다. 재생 세포는 또한 분화 세포 또는 수임 세포 유형을 포함할 수 있다. 본원에 제공된 방법 및 물질에 대한 적절한 줄기 세포는 인간의 유도된 만능성 줄기 세포(iPSC)(예를 들어, 미분화된, 분화된 내배엽, 전방화된 내배엽, TTF-1 양성 폐 기원 세포), 인간 중간엽 줄기 세포, 인간의 탯줄 정맥 내피 세포, 다능성 성체 기원 세포(MAPC), iPS 유래 중간엽 세포, 또는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 다른 조직으로부터 유래된 재생 세포가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 피부, 뼈, 근육, 골수, 활막(synovium), 또는 지방 조직으로부터 유래된 재생 세포가 줄기 세포-시딩된 조직 기질을 발달시키기 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 폐 조직 기질은 분화된 세포 유형, 예컨대, (바람직하게는, 인간) 상피 세포 및 내피 세포로 대안적으로 또는 추가로 시딩될 수 있다. 예를 들어, 폐 기질은 맥관구조를 통해 (예를 들어, 동맥 라인 또는 정맥 라인을 통과하여) 내피 세포로 시딩될 수 있으며, 기도를 통해 (예를 들어, 기관 라인을 통과하여) 인간 공여자로부터의 증식성 기저 줄기 세포로 시딩될 수 있으며, 여기에서 기저 줄기 세포는 Krt5+p63+ 세포이다. 폐 기질은 또한 하나 이상의 세포 유형으로 시딩될 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 유형의 상피 세포 및 중간엽 세포, 성인 말초 혈액 유래 상피 세포, 제대혈 유래 상피 세포, iPS 유래 상피 세포, 기원 단계 세포(평활근), 성인 폐 유래 세포 혼합물(예를 들어, 래트 인간), 상업적으로 이용 가능한 작은 기도 상피 세포 또는 폐포 상피 세포, 배아 줄기(ES) 세포-유래 상피 세포, 및/또는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)).
임의의 유형의 적절한 시중에서 입수가능한 배지 및/또는 배지 키트는 세포의 시딩 및 배양에 사용될 수 있다. 예를 들어, SAGM 배지는 작은 기도 세포에 사용될 수 있으며(예를 들어, Lonza에 의한 SAGM BulletKit), EGM-2 키트는 내피 세포에 사용될 수 있다(예를 들어, Lonza에 의한 EGM-2 BulletKit). 시딩된 내피 세포 유형으로 맞춤화된 배지가 예를 들어, 문헌 [Brudno Y et al. Biomaterials 34 (2013) 9201-9209]에 기술된 바와 같이 (예를 들어, VEGF와 같은 성장 인자를 증가시키거나 감소시킴으로써) 사용될 수 있다. 내피 세포의 경우, 상이한 배지 조성물의 서열을 사용하여 세포의 시딩, 확장, 생장 및 성숙의 상이한 단계를 유도할 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 단계에서, 세포 시딩된 구조물은 내피 세포 확장, 이동 및 대사를 증가시키기 위해 2-30일 동안 '혈관신생 배지'로 관류될 수 있다. 이 배지는 고농도의 사이토킨 예를 들어, 5-100 ng/ml의 VEGF 및 5-100 ng/ml의 bFGF, 및 단백질 키나제 C의 활성화를 통한 혈관신생 경로를 활성화시키는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA) 예를 들어, 5-100 ng/ml PMA, 및 내피 세포 발아를 자극하는 Ang-1의 존재를 특징으로 한다. 그 후, 두 번째 단계에서, 세포 시딩된 구조물은 내피 성숙 및 밀착 접합의 형성을 지지하는 '강화 배지'로 관류될 수 있다. 강화 배지는 더 낮은 수준의 사이토킨을 가지며, 혈관신생 배지와 동일한 기본 조성을 가지나, 감소된 수준의 VEGF, bFGF 및 PMA (0.1-5 ng/ml VEGF, FGF, 및 PMA)를 갖는다. 밀착 접합 형성을 촉진하고 폐부종을 감소시키는 것으로 밝혀진 하이드로코르티손은 맥관 성숙을 촉진하기 위해 강화 배지에 추가로 첨가될 수 있다. PDGF와 Ang-2와 같은 추가의 성숙유도(promaturation) 인자가 혈관 형성을 향상시키기 위해 강화 배지에 첨가될 수 있다. 이들 인자의 농도는 다양한 혈관 크기를 지지하도록 적정될 수 있다. 배지 교체는 갑작스러운 사이토킨 교체의 해로운 효과를 피하기 위해 점차적으로 수행될 수 있다. 내피 세포 지지 배지와 유사하게, 연속 배지 교체는 상피 세포 운명을 안내하는데 사용될 수 있다. 초기 배지는 한정된 내배엽을 유도하기 위해 예를 들어, 10-200 ng/ml의 액티빈 A 및 Pi3K 억제제, 예컨대, 0.01-1uM의 ZSTK 474, 후속하여, 전방화된 내배엽을 유도하기 위해 TGF-베타 억제제 예컨대, 01-10 uM의 A-8301 및 BMP4 안타고니스트 예컨대, 0.05-1 uM의 DMH-1, 및 최종적으로, 폐 기원 세포의 생성을 유도하기 위해 1-100 ug/ml의 BMP4, 10-500 ng/ml의 FGF2, GSK-3베타 억제제 예컨대, 10-500 nM의 CHIR 99021, PI3K 억제제 예컨대, 1-100 nM의 PIK-75 및 1-100 nM의 메토트렉세이트를 함유할 수 있다.
시딩을 위한 세포를 분리하고 수집하기 위한 임의의 적절한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 유도된 만능성 줄기 세포는 일반적으로 전사 인자, 예컨대, Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC, Nanog, 및 Lin28의 이소성(ectopic) 발현에 의해 만능 상태로 "재프로그래밍된" 체세포로부터 얻어질 수 있다. 문헌 [Takahashi et al., Cell 131:861-72 (2007)]; [Park et al., Nature 451:141-146 (2008)]; [Yu et al., Science 318:1917-20 (2007)]; [Zhu et al., Cell Stem Cell. 7:651-5 2010]; 및 [Li et al., Cell Res. 21:196-204 (2011)]; [Malik and Rao, Methods Mol Biol. 2013;997:23-33]; [Okano et al., Circ Res. 2013 Feb 1;112(3):523-33]; [Lin and Ying, Methods Mol Biol. 2013;936:295-312] 참조. 말초혈-유래 단핵 세포는 환자 혈액 샘플로부터 분리될 수 있으며, 유도된 만능성 줄기 세포를 생성하는데 이용될 수 있다. 기타 예에서, 유도된 만능성 줄기 세포는 소분자 예컨대, 형질전환 성장 인자 β (SB431542), MEK/ERK (PD0325901) 및 Rho-키나제 신호전달(Thiazovivin)과 함께 Oct4, Sox2, Klf4, c-MYC의 높은 공동-발현에 최적화된 구조물로 재프로그래밍함으로써 수득될 수 있다. 문헌 [Groß et al., Curr Mol Med. 13:765-76 (2013) and Hou et al., Science 341:651:654 (2013)] 참조. 줄기 세포로부터 내피 세포를 생성시키기 위한 방법은 문헌 [Reed et al., Br J Clin Pharmacol. 2013 Apr;75(4):897-906]에서 검토된다. 제대혈 줄기 세포는 신선하거나 냉동된 탯줄의 제대혈로부터 분리될 수 있다. 중간엽 줄기 세포는 예를 들어, 미가공의 비정제된 골수 또는 피콜(ficoll)-정제된 골수로부터 분리될 수 있다. 당해 공지된 방법에 따라, 상피 세포 및 내피 세포는 살아있는 또는 사체 공여자로부터 예를 들어, 생체인공 폐를 받을 대상체로부터 분리 또는 수집될 수 있다. 예를 들어, 상피 세포는 피부 조직 샘플(예를 들어, 펀치 생검)로부터 얻어질 수 있고, 내피 세포는 혈관 조직 샘플로부터 얻어질 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 분해 효소는 맥관구조에 위치한 카테터를 통해 조직 샘플 내로 관류된다. 효소적으로 처리된 조직의 일부는 추가의 효소적 파괴 및 기계적 파괴로 처리될 수 있다. 이러한 방식으로 얻어진 세포의 혼합물은 분리되어 상피 세포 및 내피 세포를 정제할 수 있다. 일부 경우에, 유동 세포계측-기반 방법(예를 들어, 형광-활성화된 세포 분류)은 특이적 세포 표면 마커의 존재 또는 부재를 기초로 하여 세포를 분류하는데 이용될 수 있다. 또한, 폐 세포(상피, 중간엽 및 내피)는 폐 기관지로부터 수득될 수 있으며, 이는 경기관지 및 기관지삽입 생검을 통해 또는 폐 조직의 수술 생검을 통해 얻을 수 있다. 비-자가 세포가 사용되는 경우에, 면역 유형-매칭 세포의 선택은 대상체에 이식될 경우에 장기 또는 조직이 거부 반응을 보이지 않도록 고려되어야 한다.
분리된 세포는 완충 용액(예를 들어, pH 7.4의 인산염 완충 염수)으로 세정되고 세포 배양 배지에서 재현탁될 수 있다. 표준 세포 배양 방법이 세포 집단을 배양하고 확장하는데 이용될 수 있다. 일단 얻어지면, 세포는 조직 기질을 시딩하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 동맥 또는 정맥 라인 (내피 세포)을 통해 또는 기도(기관) 라인(상피 세포)을 통해 기질 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 조직 기질은 임의의 적절한 세포 밀도로 생체 외에서 적어도 하나의 세포 유형으로 시딩될 수 있다. 예를 들어, 기질을 시딩하기 위한 세포 밀도는 적어도 1x103 세포/그램 기질일 수 있다. 세포 밀도는 약 1x105 내지 약 1x1010 세포/그램 기질(예를 들어, 적어도 100,000, 1,000,000, 10,000,000, 100,000,000, 1,000,000,000, 또는 10,000,000,000 세포/그램 기질)의 범위일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 제공된 탈세포화된 또는 인공 폐 조직 기질은 예를 들어, 중력류 또는 관류 시딩에 의해 상기 기재된 세포 유형 및 세포 밀도로 시딩될 수 있다. 예를 들어, 유동 관류 시스템을 사용하여 (예를 들어, 동맥 라인을 통과하여) 조직 기질에 보존된 맥관 시스템을 통해 탈세포화된 폐 조직 기질을 시딩할 수 있다. 일부 경우에, 자동화된 유동 관류 시스템은 적절한 조건 하에서 사용될 수 있다. 이러한 관류 시딩 방법은 시딩 효율성을 향상시키고, 조성물 전체에 보다 균일한 세포 분포를 제공할 수 있다. 생화학 및 화상 정량 분석 기술은 정적 또는 관류 시딩 방법에 따라 시딩된 세포의 분포를 평가하는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 조직 기질은 시딩된 재생 세포의 분화를 자극하기 위해 하나 이상의 성장 인자로 침투되거나 관류될 수 있다. 예를 들어, 조직 기질은 본원에 제공된 방법 및 물질에 대한 적절한 성장 인자, 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), TGF-β 성장 인자, 뼈 형성 단백질(예를 들어, BMP-1, BMP-4), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 기본 섬유모세포 성장 인자(b-FGF), 예를 들어, FGF-10, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 상피 성장 인자(EGF), 또는 성장 분화 인자-5(GDF-5)로 침투되거나 관류될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Desai and Cardoso, Respire. Res. 3:2 (2002)] 참조. 이러한 성장 인자는 캡슐화되어 일시적 방출을 제어할 수 있다. 스캐폴드의 상이한 부분은 성장 인자 자극의 공간적 제어를 부가하기 위해 상이한 성장 인자로 강화될 수 있다. 본 방법에서, 기도에 시딩되는 세포는 노치 억제제 예를 들어, 감마 분비효소 억제제로 관류될 수 있다.
시딩된 조직 기질은 시딩 후 소정 시간 동안(예를 들어, 몇 시간 내지 약 14일 이상) 인큐베이션되어 조직 기질에서 세포의 유착 및 침투를 향상시킬 수 있다. 시딩된 조직 기질은 재생 세포의 적어도 일부가 무세포 조직 기질 내에 및 무세포 조직 기질 상에 증식 및/또는 분화될 수 있는 조건 하에 유지될 수 있다. 이러한 조건은 비제한적으로, 적절한 온도(섭씨 35-38도) 및/또는 압력(예를 들어, 대기), 전기적 및/또는 기계적 활성(예를 들어, 1-20 cmH2O의 호기말 양압, 5-50 cmH2O의 평균 기도압 및 5-65 cmH2O의 피크 흡기압으로의 양압 또는 음압을 통한 환기), 적절한 가스 예를 들어, O2(1-100% FiO2) 및/또는 CO2(0-10% FiCO2), 적절한 양의 습도(10-100%), 및 멸균 또는 근(near)-멸균 조건을 포함할 수 있다. 이러한 조건은 또한 습식 환기, 습식 내지 건식 환기 및 건식 환기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 영양 보충물(예를 들어, 영양제 및/또는 탄소원, 예컨대, 글루코스), 외인성 호르몬, 또는 성장 인자가 시딩된 조직 기질에 첨가될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 노치 억제제 예를 들어, 감마 분비효소 억제제가 기도를 통과하여 시딩된 세포에 첨가된다. 조직학 및 세포 염색이 시딩된 세포 보유 및 증식에 대해 검정하기 위해 수행될 수 있다. 임의의 적절한 방법이 시딩된 세포 분화에 대해 검정하기 위해 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 기도 장기 생물반응기 장치로 수행될 것이다.
따라서, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 인간 대상체에 이식하기 위한 이식가능한 생체인공 폐 조직을 생성하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는, 이식가능한 조직은 환자의 맥관 시스템에 연결될 수 있는 충분히 무손상된 맥관구조를 보유할 것이다.
본원에 기재된 생체인공 폐 조직은 제조 제품 또는 키트를 만들기 위해 포장 물질과 결합될 수 있다. 제조 제품을 생산하기 위한 성분 및 방법은 잘 알려져 있다. 생체인공 조직 외에, 제조 제품 또는 키트는, 또한, 예를 들어, 하나 이상의 항-접착제, 멸균수, 약학적 캐리어, 완충액, 및/또는 시험관내 기능성 폐 조직의 발달 및/ 또는 후속의 이식을 촉진하기 위한 다른 시약을 포함할 수 있다. 또한, 이에 함유된 조성물을 사용할 수 있는 방법을 기재하는 인쇄된 지시 사항은 이러한 제조 제품에 포함될 수 있다. 제조 제품 또는 키트의 성분은 다양한 적합한 용기로 포장될 수 있다.
노치 /감마-분비효소 억제제
본 방법에 유용한 감마 분비효소 억제제는 예를 들어, RO4929097; DAPT (N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글리신-1,1-디메틸에틸 에스테르); L-685458 ((5S)-(t-부톡시카르보닐아미노)-6-페닐-(4R)하이드록시-(2R)벤질헥사노일)-L-leu-L-phe-아미드); BMS-708163 (아바가세스타트(Avagacestat)); BMS-299897 (2-[(1R)-1-[[(4-클로로페닐)설포닐](2,5-디플루오로페닐)아미노]에틸-5-플루오로벤젠부탄산); MK-0752; YO-01027; MDL28170 (Sigma); LY411575 (N-2((2S)-2-(3,5-디플루오로페닐)-2-하이드록시에타노일)-N1-((7S)-5-메틸-6-옥소-6,7-디하이드로-5H-디벤조[b,d]아제핀-7-일)-1-알라닌아미드, US 6,541,466 참조); ELN-46719 (LY411575의 2-하이드록시-발레르산 아미드 유사체 (여기에서 LY411575는 3,5-디플루오로-만델산 아미드임) (US 특허 번호 제 6,541,466호)); PF-03084014 ((S)-2-((S)-5,7-디플루오로-1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌-3-일아미노)-N-(1-(2-메틸-1-(네오펜틸아미노)프로판-2-일)-1H-이미다졸-4-일)펜탄아미드, 문헌 [Samon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575)]; 및 화합물 E((2S)-2-{[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]아미노}-N-[(3S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-1,4-벤조디아제핀-3-일]프로판아미드; WO 98/28268 및 문헌 [Samon et al., Mol Cancer Ther 2012;11:1565-1575] 참조; Alexis Biochemicals로부터 입수가능)), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
일부 구체예에서, 적합한 감마 분비효소 억제제는 하기를 포함한다: 세마가세스타트(semagacestat) (LY450139로도 공지됨, (2S)-2-하이드록시-3-메틸-N-[(1S)-1-메틸-2-옥소-2-[[(1S)-2,3,4,5-테트라하이드로-3-메틸-2-옥소-1H-3-벤즈아제핀-1-일]아미노]에틸]부탄아미드, Eli Lilly로부터 입수가능); WO 02/47671 및 미국 특허 번호 제 7,468,365호); LY411575 (N-2((2S)-2-(3,5-디플루오로페닐)-2-하이드록시에타노일)-N1-((7S)-5-메틸-6-옥소-6,7-디하이드로-5H-디벤조[b,d]아제핀-7-일)-L-알라닌아미드, Eli Lilly로부터 입수가능, 문헌 [Fauq et al., Bioorg Med Chem Lett 17: 6392-5, 2007]); 베가세스타트(begacestat)(GSI-953로도 공지됨, 미국 특허 제 7,300,951호); 아릴설폰아미드(문헌 [AS, Fuwa et al., Bioorg Med Chem Lett. 16(16):4184-4189, 2006]); N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-(S)-페닐글리신 t-부틸 에스테르(DAPT, Shih and Wang, Cancer Res. 67: 1879-1882, 2007); N-[N-3,5-디플루오로펜아세틸]-L-알라닐-S-페닐글리신 메틸 에스테르 (DAPM으로도 공지됨, 감마-분비효소 억제제 XVI, EMD Millipore로부터 입수가능); 화합물 W(3,5-비스(4-니트로페녹시)벤조산, Tocris Bioscience로부터 입수가능); L-685,458 ((5S)-(3차-부톡시카르보닐아미노)-6-페닐-(4R)-하이드록시-(2R)-벤질헥사노일)-L-류실-L-페닐알라닌아미드, Sigma-Aldrich로부터 입수가능, 문헌 [Shearmen et al., Biochemistry 39, 8698-8704, 2000]); BMS-289948(4-클로로-N-(2,5-디플루오로페닐)-N-((1R)-{4-플루오로-2-[3-(1H-이미다졸-1-일)프로필]페닐}에틸)벤젠설폰아미드 하이드로클로라이드, Bristol Myers Squibb로부터 입수가능); BMS-299897(4-[2-((1R)-1-{[(4-클로로페닐)설포닐]-2,5-디플루오로아닐리노}에틸)-5-플루오로페닐]부탄산, Bristol Myers Squibb로부터 입수가능, 문헌 [Zheng et al., Xenobiotica 39(7):544-55, 2009] 참조); 아바가세스타트(BMS-708163로도 공지됨, (R)-2-(4-클로로-N-(2-플루오로-4-(1,2,4-옥사디아졸-3-일)벤질)페닐설폰아미도)-5,5,5-트리플루오로펜탄아미드, Bristol Myers Squibb로부터 입수가능, 문헌 [Ajlbright et al., J Pharmacol. Exp. Ther. 344(3):686-695, 2013]); MK-0752(3-(4-((4-클로로페닐)설포닐)-4-(2,5-디플루오로페닐)사이클로헥실)프로판산, Merck로부터 입수가능); MRK-003((3'R,6R,9R)-5'-(2,2,2-트리플루오로에틸)-2-((E)-3-(4-(트리플루오로메틸)피페리딘-1-일)프로프-1-엔-1-일)-5,6,7,8,9,10-헥사하이드로스피로[6,9-메타노벤조[8]안눌렌-11,3'-[1,2,5]티아디아졸리딘] 1',1'-디옥시드, Merk로부터 입수가능, 문헌 [Mizuma et al., Mol Cancer Ther. 11(9):1999-2009, 2012]); MRK-560(N-[시스-4-[(4-클로로페닐)설포닐]--4-(2,5-디플루오로페닐)사이클로헥실]-1,1,1-트리플루오로­메탄설폰아미드, 문헌 [Best et. al., J Pharmacol Exp Ther. 317(2):786-90, 2006]); RO-4929097(R4733으로도 공지됨, (S)-2,2-디메틸-N1-(6-옥소-6,7-디하이드로-5H-디벤조[b,d]아제핀-7-일)-N3-(2,2,3,3,3-펜타플루오로프로필)말론아미드, Hoffman-La Roche Inc.로부터 입수가능, 문헌 [Tolcher et al., J Clin. Oncol. 30(19):2348-2353, 2012)]; JLK6(7-아미노-4-클로로-3-메톡시이소코우마린으로도 공지됨, Santa Cruz Biotechnology, Inc.로부터 입수가능, 문헌 [Petit et al., Nat. Cell. Biol. 3:507-511, 2001)]; 타렌플루르빌(Tarenflurbil)((R)-플루르비프로펜으로도 공지됨, (2R)-2-(3-플루오로-4-페닐페닐)프로판산); ALX-260-127(화합물 11로도 공지됨, 문헌 [Wolfe et al., J. Med. Chem. 41:6, 1998]에 기술됨); 술린닥 설피드(Sulindac sulfide)(문헌 [SSide, Takahashi et al., J Biol Chem. 278(20): 18664-70, 2003)]; 1,1,1-트리플루오로-N-(4-[5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐]-4-{[4(트리플루오로메틸)페닐]설포닐}사이클로헥실)메탄설폰아미드(US20110275719에 기술됨); N-[트랜스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드 (US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2-시아노-5-플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디클로로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-(시스-3-(2,5-디플루오로페닐)-3-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]설포닐}사이클로부틸)-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아르니드(US20110263580에 기술됨); N-{시스-3-(5-클로로-2-플루오로페닐)-3-[(4-클로로페닐)설포닐]사이클로부틸}-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-{시스-3-(2,5-디플루오로페닐)-3-[(4-플루오로페닐)설포닐]사이클로부틸}-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-{시스-3-(2,5-디플루오로페닐)-3-[(3,4-디플루오로페닐)설포닐]사이클로부틸}-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-시아노페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨);4-{[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸][트리플루오로메틸) 설포닐]아미노}부탄산(US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로-N-[2-(테트라하이드로-2-피란-2-일옥시)에틸]메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); 메틸{[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸][(트리플루오로메틸)설포닐]아미노}아세테이트(US20110263580에 기술됨); N-[3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로-N-메틸메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-[3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로-N-메틸메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); 메틸 4-{[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸][(트리플루오로-메틸)설포닐]아미노}부타노에이트 (US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-N-[(트리플루오로메틸)설포닐]글리신(US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)-1-메틸사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-(시스-3-(2,5-디플루오로페닐)-1-메틸-3-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]설포닐}사이클로부틸)-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로-N-[(트리플루오로메틸)설포닐]메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); 소듐[시스-3-[( 4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸][(트리플루오로메틸)설포닐]아자니드(US20110263580에 기술됨); 포타슘[시스-3-[(4-클로로페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸][(트리플루오로메틸)설포닐]아자니드(US20110263580에 기술됨); N-[시스-3-[(4-트리플루오로메톡시페닐)설포닐]-3-(2,5-디플루오로페닐)사이클로부틸]-1,1,1-트리플루오로메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); 1,1,1-트리플루오로-N-(4-[5-플루오로-2-(트리플루오로메틸)페닐]-4-{[4-(트리플루오로메틸)페닐]설포닐}사이클로헥실)메탄설폰아미드(US20110263580에 기술됨); 감마-분비효소 억제제 I (Z-Leu-Leu-Nle-CHO, 벤질옥시카르보닐-류실-류실-노르류신성으로도 공지됨, Calbiochem로부터 입수가능); 감마-분비효소 억제제 II:
Figure pct00004
(MOL)(CDX)(Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 III(N-벤질옥시카르보닐-Leu-류신, Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 IV,(N-(2-나프토일)-Val-페닐알닌, Calbiochem으로부터 입수가능); 감마-분비효소 억제제 V (Z-LF-CHO로서도 공지됨, N-벤질옥시카르보닐-Leu-페닐알라닌성, EMD Millipore로부터 입수가능); 감마-분비효소 억제제 VI(1-(S)-엔도-N-(1,3,3)-트리메틸바이사이클로[2.2.1]헵트-2-일)-4-플루오로페닐 설폰아미드, EMD Millipore로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 VII (화합물 A로도 공지됨, MOC-LL-CHO, 멘틸옥시카르보닐-LL-CHO, Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 X({1S-벤질-4R-[1-(1S-카르바모일-2-펜에틸카르바모일)-1S-3-메틸부틸카르바모일]-2R-하이드록시-5-페닐펜틸}카르밤산 3차-부틸 에스테르, Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 XI, (7-아미노-4-클로로-3-메톡시이소코우마린, Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 XII, (Z-Ile-Leu-CHO로도 공지됨, 문헌 [Shih and Wang, Cancer Res. 67: 1879-1882, 2007]); 감마 분비효소 억제제 XIII(Z-Tyr-Ile-Leu-CHO, Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 XIV(Z-Cys(t-Bu)-Ile-Leu-CHO, Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 XVII(WPE-III-31C로도 공지됨),
Figure pct00005
(MOL)(CDX)(Calbiochem으로부터 입수가능);감마 분비효소 억제제 XIX(벤조디아제핀으로도 공지됨, (2S,3R)-3-(3,4-디플루오로페닐)-2-(4-플루오로페닐)-4-하이드록시-N-((3S)-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-부티르아미드, 문헌 [Churcher et al., J Med Chem. 46(12):2275-8, 2003]); 감마 분비효소 억제제 XX(디벤즈아제핀으로도 공지됨, (S,S)-2-[2-(3,5-디플루오로페닐)아세틸아미노]-N-(5-메틸-6-옥소-6,7-디하이드로-5H-디벤조[b,d]아제핀-7-일)프로피온아미드,
Figure pct00006
(MOL)(CDX)(문헌 [Weihofen et al., Science 296: 2215-2218, 2002], Calbiochem으로부터 입수가능); 감마 분비효소 억제제 XXI((S,S)-2-[2-(3,5-디플루오로페닐)-아세틸아미노]-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-3-일)-프로피온아미드, Calbiochem으로부터 입수가능); 5-메틸-2-프로판-2-일사이클로헥실)N-[4-메틸-1-[(4-메틸-1-옥소펜탄-2-일)아미노]-1-옥소펜탄-2-일]카르바메이트(HDH Pharma Inc.으로부터 입수가능);N-트랜스-3,5-디메톡시신나모일-Ile-류신성(Calbiochem으로부터 입수가능);N-3차-부틸옥시카르보닐-Gly-Val-발린; 이소발레릴-V V-Sta-A-Sta-OCH3 (Calbiochem으로부터 입수가능); 디에틸-(5-페닐-3H-아제핀-2-일)-아민(US 8188069에 기술됨); 디에틸-(5-이소프로필-3H-아제핀-2-일)-아민(US 8188069에 기술됨); 디에틸-(4-페닐-3H-아제핀-2-일)-아민(US 8188069에 기술됨); 디에틸-(6-페닐-3H-아제핀-2-일)-아민(US 8188069에 기술됨); 5-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 5-이소프로필-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 4-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 6-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 2-부톡시-5-페닐-3H-아제핀(US 8188069에 기술됨); 1-메틸-5-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 5-이소프로필-1-메틸-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 1-메틸-4-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 1-메틸-6-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 1-메틸-5-페닐-1H-아제핀-2,3-디온-3-옥심 (US 8188069에 기술됨); 5-이소프로필-1-메틸-1H-아제핀-2,3-디온-3-옥심(US 8188069에 기술됨); 1-메틸-6-페닐-1H-아제핀-2,3-디온-3-옥심(US 8188069에 기술됨); 1-메틸-4-페닐-1H-아제핀-2,3-디온-3-옥심(US 8188069에 기술됨); 3-아미노-1-메틸-5-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 3-아미노-5-이소프로필-1-메틸-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 3-아미노-1-메틸-4-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); 3-아미노-1-메틸-6-페닐-1,3-디하이드로-아제핀-2-온(US 8188069에 기술됨); (S)-[1-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-카르밤산 3차부틸 에스테르(US 8188069에 기술됨); [(S)-1-(5-이소프로필-1-메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]카르밤산 3차-부틸 에스테르(US 8188069에 기술됨); [(S)-1-(1-메틸-2-옥소-4-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]카르밤산 3차-부틸 에스테르(US 8188069에 기술됨); [(S)-1-(1-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-카르밤산 3차-부틸 에스테르(US 8188069에 기술됨); (S)-2-아미노-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일)-프로피온아미드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-아미노-N-(5-이소프로필-1-메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일)프로피온아르니드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-아미노-N-(I-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일)프로피온아미드 하이드로클로라이드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-아미노-N-(I-메틸-2-옥소-4-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일)프로피온아미드 하이드로클로라이드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-플루오로-3-메틸-부티르산(US 8188069에 기술됨); (S)-2-하이드록시-3-메틸-N-[(S)-1-((S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-플루오로-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-하이드록시-N-[(S)-1-(5-이소프로필-1-메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)에틸]-3-메틸-부티르아미드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-하이드록시-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-4-페닐-2,3-디하이드로-lH-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드(US 8188069에 기술됨); (S)-2-하이드록시-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디하이드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드(US 8188069에 기술됨); 및 (S)-2-플루오로-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디하이드로-lH-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드(US 8188069에 기술됨), 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
감마-분비효소 억제제의 추가적인 예는 미국 특허 출원 공보 제 2004/0029862호, 제 2004/0049038호, 제 2004/0186147호, 제2005/0215602호, 제 2005/0182111호, 제 2005/0182109호, 제 2005/0143369호, 제 2005/0119293호, 제 2007/0190046호, 제 2008/008316호, 제 2010/0197660호 및 제 2011/0020232호; 미국 특허 번호 제 6,756,511호; 제 6,890,956호; 제 6,984,626호; 제 7,049,296호; 제 7,101,895호; 제 7,138,400호; 제 7,144,910호; 제 7,183,303호; 제 8,188,069호; 및 국제 공보 WO 1998/28268; WO 2001/70677, WO 2002/049038, WO 2004/186147, WO 2003/093253, WO 2003/093251, WO 2003/093252, WO 2003/093264, WO 2005/030731, WO 2005/014553, WO 2004/039800, WO 2004/039370, WO 2009/023453, EP 1720909, EP 2178844, EP 2244713를 포함한다.
상기 모두의 전체 기재내용은 본원에 참조로 통합된다.
생체인공 폐를 사용하는 방법
본원은 또한 생체인공 폐 조직을 사용하고, 일부 경우에, 폐 기능을 증진시키기 위한 방법 및 물질을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 방법은 폐용량을 손상시키거나 감소시키는 질병(예를 들어, 낭포성 섬유증, COPD, 폐기종(emphysema), 폐암, 천식, 폐고혈압, 폐 외상, 또는 다른 유전적 또는 선천적 폐 기형, 예를 들어, 기관지원성 낭포(bronchogenic cyst), 폐 부전 및 폐 형성 저하증, 다폐포엽(polyalveolar lobe), 폐포모세혈관 이형성증(alveolocapillary dysplasia), 동정맥기형(AVM; arteriovenous malformation) 및 시미타 증후군(scimitar syndrome), 폐 림프절 확장증(pulmonary lymphangiectasis), 선천성 엽성 폐기종(congenital lobar emphysema)을 포함하는 격절(sequestration), 및 낭성 선종양 기형(cystic adenomatoid malformation; CAM) 및 다른 폐 낭포)을 갖는 환자에서 일부 폐 기능을 복구하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 또한 대상체가, 특정 언급된 치료, 예를 들어, 증가된 폐 기능, 또는 증가되거나 향상된 폐용량이 필요한 것으로 밝혀진 것들을 포함할 수 있다.
생체인공 폐 조직(예를 들어, 전체 기관 또는 이의 일부)은 본원에 제공된 방법에 따라 생성될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이들을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 환자)에 본원에 제공된 생체인공 폐 조직을 이식하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 생체인공 폐 조직은 병든 또는 손상된 조직의 부위에 이식된다. 예를 들어, 생체인공 폐 조직은 비기능성 또는 약한-기능성 폐를 대신하여(또는 결합하여) 대상체의 흉강 내에 이식될 수 있으며; 폐 이식을 수행하기 위한 방법은 당해 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Boasquevisque et al., Proceedings of the American Thoracic Society 6:66-78 (2009)]; [Camargo et al., Eur J Cardiothorac Surg 2008;34:1206-1209 (2008)]; [Yoshida et al., Ann Thorac Cardiovasc Surg. 11(1):7-11 (2005)]; [Venuta et al., Transplantation Proceedings 37(6):2682-2683 (2005)]; [Yang and Conte, Transplantation Proceedings 32(7):1521-1522 (2000)]; [Gaissert and Patterson, “Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation,” in The Transplantation and Replacement of Thoracic Organs, 2d ed. Springer Netherlands (1996)] 참조).
상기 방법은 대상체의 폐를 부분적으로 또는 완전히 제거하는 외과적 절차 동안 및/또는 폐 절제술 동안 본원에 제공된 생체인공 폐 또는 이의 일부를 이식하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 또한 폐 또는 이의 일부를 살아있는 공여자 또는 사체로부터 수확하고, 본원에 기술된 생물반응기에서 폐를 보존하거나 재생하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 방법은 대상체, 예를 들어, 인간 또는 동물 대상체의 폐 조직 및 기능을 대체하거나 보완하는데 사용될 수 있다.
임의의 적절한 방법(들)이 이식 전 또는 후에 폐 기능을 검정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 조직 치유를 평가하고, 기능성을 평가하고, 세포내-성장을 평가하는 방법들이 수행될 수 있다. 일부 경우에, 조직의 일부는 수거되고, 예를 들어, 중성 완충 포르말린과 같이 고정액(fixative)으로 처리될 수 있다. 이러한 조직의 일부는 탈수되고, 파라핀에 담지되고, 그리고 조직학 분석을 위해 마이크로톰으로 절편화될 수 있다. 절편은 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색된 후, 형태학 및 세포 충실성(cellularity)의 현미경 평가를 위해 슬라이드 글라스 상에 놓일 수 있다. 예를 들어, 조직학 및 세포 염색이 시딩된 세포 증식을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 검정은 이식된 조직 기질 또는 영상 기술(예를 들어, 컴퓨터 단층 촬영법(CT), 초음파, 또는 자기 공명 영상(예를 들어, 조영-증강 MRI))의 기능성 평가를 포함할 수 있다. 검정은 또한 휴식(rest) 및 생리적 스트레스 하의 기능성 시험(예를 들어, 체플레티스모그래피(body pletysmography), 폐 기능 시험)을 포함할 수 있다. 세포로 시딩된 기질의 기능성은 당해 공지된 방법, 예를 들어, 조직학, 전자 현미경, 및 기계적 시험(예를 들어, 용적 및 컴플라이언스)을 이용하여 검정될 수 있다. 가스 교환은 또 다른 기능성 검정으로서 측정될 수 있다. 세포 증식을 검정하기 위하여, 티미딘 키나제 활성이, 예를 들어, 티미딘 혼입을 검출함으로써 측정될 수 있다. 일부 경우에, 혈액 시험이 혈중 산소 농도에 기초한 폐 기능을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
배양 동안 기능성 검정을 촉진하기 위해, 본원에 기술된 생물반응기 장치의 임의의 라인은 샘플링 포트를 포함하여 기능성 파라미터(예를 들어, pH, 글루코스, 락테이트, Na, K, Ca, Cl, 바이카르브(bicarb), O2, CO2, 포화(sat))의 단일 또는 실시간 측정을 허용할 수 있다. 대사산물은 또한, 비색 검정을 사용하여 세포 수 및 생존력을 모니터링하는데 이용될 수 있으며, 생화학 검정은 세포 성숙을 모니터링하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 계면활성제 단백질 등 측정). 예를 들어, 증가된 농도의 계면활성제는 배양 폐가 건식 환기를 견딜 수 있기에 충분한 상피 세포를 보유함을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 내피 장벽 기능은 혈관 성숙의 마커로서 사용될 수 있다. 폐는 다양한 크기의 분자(예컨대, 규정된 크기의 덱스트란 및 알부민), 및 마이크로비드(0.2 내지 5 um의 증가하는 크기)는 물론, 분리된 적혈구로 관류될 수 있다. 그 후, 기관지폐포 세척 유체는 이들 마커의 폐포 공간으로의 누출을 평가하기 위해 샘플링될 수 있다. 예를 들어, 500-kDa 덱스트란은 혈관 구획 내에 유지된 덱스트란의 백분율을 결정하는데 기관지폐포세척 검정과 조합되어 사용될 수 있다. 유지된 덱스트란 백분율의 증가는 덱스트란에 대한 장벽 기능이 생존가능한 기능성 내피에 의존적이기 때문에 장벽 기능의 향상을 나타내는 반면, 덱스트란은 일정한 관류 동안 시간에 걸쳐 벗겨진 맥관 기저막을 가로질러 분산될 것이다. 예를 들어, 사체 폐는 혈관 구획 내에서 실질적으로 모든 덱스트란을 보유할 수 있는 반면, 무세포 폐는 적은 백분율의 덱스트란(예를 들어, 10.0% ± 8.0%)을 보유할 수 있다. 허용되는 최소값(예를 들어, >10%의 4 um 마이크로비드, 또는 20% 초과의 0.2 um 마이크로비드)보다 큰 폐포 공간으로의 이들 마커의 누출은 폐가 건식 환기를 견딜 수 있을 정도로 충분한 성숙하지 않음을 나타내는데 사용될 수 있다.
일부 경우에, 분자 생물 기술, 예컨대, RT-PCR이 대사의 발현(예를 들어, 계면활성제 단백질, 뮤신-1) 및 분화 마커(예를 들어, TTF-1, p63, 계면활성제 단백질 C)를 정량하기 위해 사용될 수 있다. 임의의 적합한 RT-PCR 프로토콜이 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 총 RNA는 생물학적 샘플(예를 들어, 텐돈(tendon) 샘플)을 균질화하고, 클로로포름 추출을 수행하고, 스핀 컬럼(예를 들어, RNeasy® 미니스핀 컬럼(QIAGEN, Valencia, CA)) 또는 다른 핵산-결합 기재를 사용하여 총 RNA를 추출함으로써 수집될 수 있다. 다른 경우에, 폐 세포 유형과 관련된 마커 및 이러한 세포 유형에 대한 상이한 단계의 분화는 항체 및 표준 면역검정법을 이용하여 검출될 수 있다.
기도 장기 생물반응기 장치
예시적인 기도 장기 생물반응기 및 이의 사용 방법은 그 전체가 본원에 참조로 통합된 WO 2015/138999에 기술되어 있다. 기타 예시적인 생물반응기는 문헌 [Charest et al., Biomaterials. 2015 Jun;52:79-87]; [Gilpin et al., Ann Thorac Surg. 2014 Nov;98(5):1721-9; discussion 1729]; [Price et al., Tissue Eng Part A 2010;16(8):2581-91]; [Petersen et al., Cell Transplant 2011;20(7):1117-26]; [Bonvillain et al., J Vis Exp 2013;(82):e50825]; [Nichols et al., J Tissue Eng Regen Med. 2016 Jan 12. doi: 10.1002/term.2113]에 기술되어 있다.
실시예
본 발명은 특허청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이다.
실시예 1. 폐 상피 공학에서 인간 기도 줄기 세포의 재생 가능성
통상적으로, 폐 상피 유지 및 수복에서 제한적인 계열 개념은 고정되어 있다. 기저 상피 세포는 전사 인자 Trp-63(p63) 및 사이토케라틴 5 및 14(Krt5/14)를 비교적 비분화적으로 및 특징적으로 발현하며, 수복 동안 폐 기도를 위한 줄기 세포로서 기능한다(32). 이는 생체내에서 벗겨진 기도 수복 모델에서 입증되었다(43). 기저 폐 상피 세포는 다능성 성인 조직 줄기 세포로 분류되었으며, 이는 손상 후 기저(자기-재생), 섬모 및 클라라(곤봉) 세포를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있다(21, 44). 원위 폐포 상피의 계열 체계의 전통적인 모델은 타입 2 폐세포를 말단에 분화된 타입 1 폐세포에 대한 기원 세포로서 정의한다(45,46). 폐 상피 계열 능력에서 새로운 파라다임의 예로는 기관지 곤봉 세포 및 폐포 세포 둘 모두에 대한 제안된 기원 세포 집단인 기관지폐포 줄기 세포(BASC)를 포함한다(47). 출생 후 성숙한 타입 II 폐세포 선조 세포로 전이될 수 있는 폐 발달에는 이분화성 폐포 기원 세포가 보고되었다(48). 고전적 폐포 타입 II/타입 I 분화 체계 또한 도전받아 왔으며, 새로운 양방향 가능성이 보고되었다(49). 인플루엔자 손상 후, Krt5+ 기도 줄기 세포의 전달은 원위 폐 통합 및 타입 1 및 타입 II 폐세포 계열 둘 모두로의 기여를 드러냈다(36). 이들 연구는 전통적인 세포 체계 및 정체에 대한 발전하는 이해를 강조한다. 노치 신호 전달은 또한 손상 후 상피 운명 결정에 있어서 근본적인 것이다(27). 낮은 수준의 노치 신호전달은 정상-상태(steady-state) 폐 상피에 존재하며, 기도 손상 후 증가되어, 기저 줄기 세포의 분비 계열로의 분화를 추진한다(39). 상피 회복 및 원위 폐세포 분화에 있어서 노치 신호 전달의 크기 및 시기 둘 모두에 대한 더 깊은 이해가 진전되고 있다.
본 실험은 이러한 쉽게 접근할 수 있고, 확장 가능한 기저 줄기 세포 집단의 상해에 반응하는 능력을 이용하고, 전체 장기 공학의 맥락에서 상피 통합성 및 기능 조직화를 재확립하는 것을 목표로 삼았다(13, 44). 천연 세포외 기질 내에서 유지된 구조적 및 생물학적 니치는 유효한 주형을 제공하여 세포 생착을 안내하고 폐 조직 수복(50, 51)의 기작을 조사하고, 확장된 생체모방 배양과 조합되어 인간 폐 구조물의 재생을 위한 중요한 플랫폼을 제공한다.
방법
하기 재료 및 방법은 하기 실시예에 사용되었다.
연구 승인
뉴 잉글랜드 장기 은행(New England Organ Bank)에서 이식에 부적절한 그 외의 공여자 폐를 정보에 입각한 동의하에 얻었다. 실험은 MGH IRB 및 동물 이용 프로토콜(Animal Utilization Protocol)에 의해 승인되었다.
표 1: 폐 공여자 정보
Figure pct00007
데이터는 연령(년), 성별(남성(M) 또는 여성(F)), 체질량 지수(BMI), 및 공여자 상태(심장 사망 이후 공여(DCD) 또는 뇌사 후 공여(DBD))를 나타낸다. 연령과 BMI는 요약 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
세포 분리 및 확장
공여자의 폐 주변 조직(1 인치 입방체)을 αMEM으로 세척한 후, 가위로 ~ ¼ 인치 조각으로 썬 다음, 0.1 mg/ml DNAse (Sigma) 및 1.4 mg/ml 프로나제(Roche, 11459643001)로 24 시간/4℃ 동안 분해하였다(52). 분해된 조직을 SAGM 중에서 비코팅 배양 플라스크 상에 30분/37℃로 배양한 다음 비-유착 세포를 인간 콜라겐-IV (Sigma-Aldrich C7521)-코팅된 플라스크에 옮기고 유착시켰다. 상피 세포를 SAGM (Lonza, CC-3118) 중에서 유지시키고, 80% 컨플루언트(대략 3-5 일/계대)로 계대배양하였다. γ-분비효소 억제제 (1) 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (100 μg/ml IBMX, Sigma-Aldrich, I5879) 및 (2) N-[(3,5-디플루오로페닐)아세틸]-L-알라닐-2-페닐]글리신-1,1-디메틸에틸 에스테르 (50 μg/ml DAPT, Selleck Chemicals, S2215)로 처리된 세포에 있어서, 배지를 매일 교체하였다. 일차 내피 세포를 동일한 분해 프로토콜을 사용하여 공여자 폐의 큰 혈관으로부터 분리하였다. 내피 집단은 유동 세포계측에 의해 CD31+ 순도에 대해 분류하고, 인간 폐 재세포화를 위해 사용될 때까지 EGM2 (Lonza, CC-3162)의 젤라틴 코팅 플라스크에서 유지시키고 연장시켰다(도 7a-b 참조).
공기-액체 계면 배양
계대 3의 일차 상피 세포를 콜라겐 IV로 코팅된 0.4 μM 트랜스웰 인서트(Transwell insert) 상에 플레이팅하고, 5일 동안 SAGM으로 액침 배양물에 유지시켰다. 배지를 기저부 챔버에서만 PneumaCult™-ALI 배지(Stemcell Technologies, 05001)로 교체하고, 공기-액체 계면에서 21일 동안 유지하면서 격일로 배지를 교체하였다.
3-차원 구체 검정
계대 3의 일차 상피 세포를 40 μm 메쉬를 통해 여과하여 임의의 세포 덩어리를 제거한 후, 이전에 공개된 프로토콜(46)에 따라 0.4 μM 트랜스웰 인서트 상에 50:50 마트리겔-대-SAGM 기질의 5000 세포/90 uL 밀도로 옮겼다. 단일 세포 현탁액을 광학 현미경 관찰(40x)로 확인하였다. 배양은 7일 동안만 기저 챔버에서 SAGM으로 유지하였다.
폐 탈세포화
래트 및 인간 공여자 폐를 종래 기술된 바와 같이 탈세포화시켰다(2,6).
기질 슬라이스 배양 검정
인간 폐 기질 슬라이스를 종래 기술된 바와 같이 준비하였다(6). 일차 상피 세포(계대 3)를 기질에 50,000 세포/슬라이스로 시딩하고, SAGM으로 5일 동안 유지시켰다.
래트 폐 재세포화 및 배양
일차 폐 상피 세포(계대 3)를 2-D 배양으로부터 수확하고, 계수하고, 중력에 의해 용액(20ml) 중에서 스캐폴드 기도에 재도입하였다. 폐 동맥을 통과하는 연속 배지 관류를 연동 펌프에 의해 4ml/분으로 유지하고, 매일 교체하였다.
연속 기도 양압(CPAP) 래트 폐 배양에 있어서, 상피 재세포화 및 SAGM을 이용한 7일간의 일정 관류 배양 후, 배지를 PneumaCult™-ALI(Stemcell Technologies, 05001)로 교체하고, CPAP는 20cmH2O에서 시작하였다. 제2 저장소 챔버에 기관을 연결함에 의한 기도 양압으로서, 20cmH2O로 지속적으로 가압시켰다.
인간 폐 재세포화 및 생체모방 배양
단일 엽을 손상되지 않은 탈세포화된 인간 폐에서 외과적으로 분리하고, 캐뉼라를 폐 동맥, 폐 정맥 및 기관지에 위치시켰다. 엽을 4% 에탄올 중 0.1% 과아세트산에 60분/25℃로 담궈 멸균시킨 다음 3xPBS 세척하고, 그 후, 2 시간에 걸쳐 10,000 Rad의 γ-조사에 노출시켰다. 분리된 엽을 무균적으로 생물반응기에 탑재시키고, 조직을 SAGM 관류로 밤새 프라이밍하였다.
총 160-240x106의 일차 공여자-유래된 CD31+ 내피 세포를 먼저 50mmHg의 일정압에서 펌프에 의해 폐 동맥을 통해 맥관구조로 전달하였다. 90분 후, 총 220-280×106 상피 세포(계대 4)를 펌프에 의해 50 ml/분로 용액 (500 ml 총 배지) 중에서 주요 기도에 전달하였다. 총 n = 4의 독립된 엽을 각 실험으로 재세포화시켰다.
40 ng/ml VEGF를 사용한 SAGM의 일정한 관류를 20-40 ml/분으로 7일(n = 3) 또는 10일(n = 1) 동안 유지하였다. 관류 압력을 지속적으로 모니터링하고, 생리학적 범위 내에 유지시켰다(평균 = 21.39 ± 4.53mmHg, 도 5c 참조). 챔버 압력 진동을 통해 음압 환기를 발생시켜 6회 호흡 주기/분의 호흡률을 달성하였다. 환기는 배양 3일째에 시작하고 2-시간/일 동안 유지하였다. 폐동맥, 폐 정맥 및 챔버로부터의 배지 샘플을 매일 iSTAT 카트리지(CG4+/CG8+, Abbott)로 검사하였다.
양압력 환기 도전은 배양 마지막 날에 수행하였다. 용량-제어 환기는 Drager Evita 4 벤틸레이터를 사용하여 가하되, 1회 환기량은 150-200mL이며, PEEP는 5mmHg이고, 호흡율은 12 호흡/분이다. GC3+iSTAT 카트리지를 사용하여 21%의 FiO2로 10분 환기 후 및 다시, 100%의 FiO2로 10분 환기 후 샘플을 분석하였다.
배양 마지막 날에, 0.05 mM 레사주린 용액을 90분 동안 30 ml/분의 일정 흐름으로 순환시킨 다음, 조직을 염료 색상의 대사 전환에 대해 시각적으로 검사하였다. 그 후, 조직 샘플을 5% 포르말린에 고정시키거나, 후속 분석을 위해 RNAlater(Qiagen)에 저장하였다.
정량적 PCR
RNA를 RNEasy Plus(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. Superscript III 키트(Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 전사하였다. Taqman 프로브 및 OneStep Plus 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 정량적 유전자 발현을 분석하였다. 사체 폐 조직 대조군 샘플과 비교하여 β-액틴 발현으로 발현을 표준화시켰다.
면역염색
일차 항체(1:100): p63(Santa Cruz, sc-25268), Krt5(Abcam, ab24647), E-카드헤린(BD, 610181), 계면활성제 단백질-B (Millipore, AB3430), 프로-계면활성제 단백질-C(Abcam, ab3786), 아쿠아포린-5(Abcam, ab92320), 아세틸화된 α-투불린(Abcam, ab24610), α2β1 인테그린(Abcam, ab24697), α3β1 인테그린(Abcam, ab24696), 및 CD31(Daki, M082301-2). 이차 항체(1:400): Alexafluor 488 및 594 (Life Technologies).
결과
먼저 인간 사체 말초 폐 조직으로부터 고도로 증식성 세포 집단을 분리하였다. Krt5+p63+ 기저 줄기 세포 집단의 활발한 확장은 연속 계대 배양에 걸쳐 재현가능하게 관찰되었다(도 1a-b). 분리된 세포 집단의 증식 능력은 계대 3까지 유지되었으며(염색에 의한 Ki67+ 세포, 63.4 ± 8.08%), 계대 4에서 감소하기 시작하였다(도 1c). 표현형 안정성은 계대 1 및 계대 4 세포의 유동 세포계측 분석에 의해 추가로 검사하였으며, Krt5+p63+ 기저 줄기 세포 계열의 확장을 확인하였다(도 1d). 유전자 발현을 종단적으로 프로파일링하여(도 1e), 타입 1 및 타입 2 폐세포, 및 CCSP+ 분비 세포의 나란한 손실 및 기도 줄기 세포 집단의 풍부를 추가로 확인하였다. 세포 확장 동안 중간엽성 유전자 비멘틴 또는 평활근 액틴(SMA)의 발현 증가는 측정되지 않았으며, 상피에서 중간엽으로의 전이 관련 전사 인자 ZEB1과 SNAIL의 발현 증가도 측정되지 않았다. 또한, 계대 3에서 최대 세포 증식을 Ki67의 유전자 발현에 의해 확인하였다. 본 실험에서, 세포 분리 및 계대 배양 동안 ROCK 억제제 Y-27632(53)의 사용은 기저 세포 집단을 증진시키지 않거나, 증식 (Ki67, PCNA) 또는 노화(노화 관련 사이클린-의존성 키나제 억제제 2A, CDKN2A)(54)(도 8a-c)를 변경시키고, 시험관내 확장에는 사용되지 않았다.
무세포 폐 스캐폴드 상의 기능성 상피의 성공적인 형성은 다중 세포 계열을 함유하는 복합 조직의 재-확립을 필요로 할 것이다. 따라서, 분리되고 확장된 세포의 재생 가능성을, 시험관내 공기-액체 계면(ALI)에서 배양되었을 때 섬모발생에 대한 이들의 능력을 확인함으로써 시험하였다(도 2a). 아세틸화된 α-투불린+ 섬모 상층, 기저 Krt5+p63+ 세포층, 포크헤드 박스 단백질-J1(FOXJ1)의 핵 발현, 및 세포 간 밀착 접합 형성(E-카드헤린)을 포함하는 거짓중층 상피가 관찰되었으며, 이는 함께 표현형 다양성, 분화 가능성, 및 생리학적 자가-조직화 능력을 함께 나타낸다(도 2b). 전체 장기 재세포화에서 이러한 가능성을 시험하기 위해, 재-상피화된 래트 폐를 일정 배지 관류 하에 7일 동안 유지시키고, 그 후 추가의 7일 동안 연속 기도 양압(CPAP) 모델로 이동시켜 폐 스캐폴드 상에서 ALI를 발생반복시키거나, 생체외 배양으로 총 14일 동안 맥관 관류만으로 유지시켰다(도 2c). 광범위한 기저 세포(Krt5+) 재증식을 CPAP 배양 후 유지시켰으며, 기도 및 폐포 구조물을 라이닝하였다. FOXJ1 발현의 유도, E-카드헤린 세기의 증가 및 증식의 감소(Ki67)가 관찰되었다(도 2d-e). 섬모 상피 표현형으로의 이러한 초기 유도는 유전자 발현 정량화에 의해 확인되었으며, 이는 7일 및 14일 배양일에서 맥관 관류만 수행한 폐 대비 CPAP 폐에서 FOXJ1 및 E-카드헤린의 현저한 증가를 드러냈다(도 2f).
다음으로 세포 가소성은 γ-분비효소 활성을 통한 노치 신호전달을 억제함으로써 검사하였다. 단일 제제를 사용한 결과는 공여자 세포에 따라 다소 가변적이지만, 시험관내에서 계대 3 세포에 대한 노치 억제제 IBMX와 DAPT의 조합물로의 처리는 핵 Nkx2.1 및 세포질 proSP-C 발현 둘 모두를 유도하였다(도 3a). 이는 노치 억제 후 타입 II 폐세포 마커 계면활성제 단백질-B(SP-B) 및 SP-C를 현저하게 증가시킨 반면(22.06 ± 0.29배 증가), 기저 줄기 세포 집단(p63)을 보존함을 입증하는, 유전자 발현 분석에 의해 추가로 확인되었다(도 3b). 타입 1 폐세포 마커인 아쿠아스포린 5(AQP5) 및 HOPX1의 손실과 분비 세포 마커 발현의 손실(CCSP)을 또한 노치 신호 억제 후 정량화하였다. 계면활성제 단백질-C 생성 또한 ELISA에 의한 조건부 배지에서 측정할 경우 증가되었다(0.33±1.13 pg/ml 비처리 vs 1.13 ± 0.09 pg/ml 노치 억제 처리 후). GSI X와 LY411575로의 처리 또한 AQP5 발현을 증가시켰으나 (이는 타입 2 세포가 아닌 타입 1 세포의 마커이나, 타입 2 세포는 타입 1 세포로 분화됨), IBMX + DAPT 처리는 AQP5 발현을 지지하지 않았다(도 3 및 도 11 참조).
기질 지지체(Matrigel)에서 배양된 단일 상피 세포는 시험관내에서 7일에 걸쳐 3D 구체를 형성할 수 있으며, 루멘 발달(도 3d) 및 상피 극성의 증거(도 3c)를 갖는다. 이중 노치 억제(IBMX+DAPT)로 처리된 배양물은 현저하게 더 적은 구체를 형성하였다(도 3e-f). 유전자 발현 분석은, 3D 배양에서 노치 신호전달 경로가 타입 II 폐세포 집단(SP-B, SP-C)으로의 전이, 타입 I 폐세포(AQP5, HOPX1)의 손실, 곤봉 세포(CCSP)의 손실, 및 기저 줄기 세포 마커 발현(p63)의 현저한 무변화를 촉진할 수 있음을 추가로 확인시켜주었다(도 3g).
시험관내에서 인간 탈세포화된 폐 슬라이스에 시딩된 세포는, 인테그린 α2β1 및 α3β1을 통한 기질로의 특정 세포 유착, 기질 유착 영역을 따라서 밀착 접합의 형성(E-카드헤린), 및 연속된 구형체 증식(Ki67+)을 입증하였다(도 4a). 노치 억제 후 유전자 발현은 신생아 공여자(HL38, 생후 3일) 및 건강한 성인 폐(HL30)로부터의 폐 기질 상으로 시딩된 세포에서 분석하였다. 타입 II 폐세포 집단의 유도는 노치 억제제로 처리된 두 배양물 모두에서 발견되었다(도 4b). 전체 설치류 폐 재-상피화 및 배양으로의 규모 확장시(도 4c), 타입 II 폐세포 집단으로의 전이는 배지 단독 대비 노치 억제제로 관류된 폐를 이용한 연속 배지 관류 5일 후에 입증되었다(도 4d-e).
대규모의 전체 장기 배양을 가능하게 하기 위해, 본 분리된 폐 생물반응기 시스템을 무손상 인간 폐 스캐폴드의 재세포화에 맞추었다(55)(도 5a). 확장된 기저 줄기 세포 집단을 인간 폐 스캐폴드의 기도에 전달하였으며, 또한 일차 인간 폐-유래 내피 세포(CD31+)를 혈관 구획에 전달하였다(도 5b). 생물반응기는 생체외 재생 장기의 생리학적 관류 범위(평균 = 21.39 ± 4.53mmHg)를 유지시키는 반면(도 5c), 세포 생존 및 대사 활성을 7-10일 동안 비-침습적 방식으로 모니터링하였다. 48시간 마다 관류액 중 글루코스 소모량 및 락트산 생성량의 증가가 측정되었다(도 5d-e). 폐 구조물의 음압 환기는 설정된 챔버 압력 목표 사이에서 진동시킴으로써 6회 호흡/분에서 달성되었으며(도 5f), 15.58mmHg(14.42-21.73mmHg, n = 2447 호흡)의 중간 피크 경벽압 및 138.08 ml/호흡(78.08-183.32 ml, n = 2447 호흡)의 중간 1회 환기량을 발생시켰다(도 5g-i). 양압 환기는 잠재적 장기 기능의 종점 테스트로서 수행하였으며(도 5j), 관류액 배지로의 산소 전달을 21% 및 100%의 FiO2에서 10분의 환기 후 측정하였다. 72mmHg의 pO2 발생 (PaO2/FiO2 = 343mmHg)이 측정되었으며, 이는 412mmHg (PaO2/FiO2 = 412mmHg)로 증가하였으며, 각각 17.5mmHg 및 24.9mmHg의 pCO2에 상응하였다(도 5k). 이는 재생된 인간 폐 구조물이 재세포화 및 배양 후 최소 장기 기능 및 가스 이동을 지지할 수 있음을 시사한다.
조직 재세포화 및 세포 생존력은 레사조린-함유 관류액의 대사 후 육안으로 평가하였으며, 생존가능 세포에 의해 대사를 핑크 색상으로 나타낸다(도 6b). 적용 범위 및 세포 형태는 각 폐의 여러 영역에 걸쳐 조직학적 염색으로 조사하였다(도 6b). 보존된 기질 구조에 따른 세포 배열을 갖는, 상기도로부터 원위 폐 영역까지 재증식된 스캐폴드 전반에 걸친 광범위한 세포 분포가 발견되었다. 기질 내부에서 재도입된 세포의 계속해서 확장할 수 있는 능력이 확인되었다. 75% 이하의 세포가 장기 배양 말기에 증식되었다(61.7% ± 10.4)(도 6c-d). 내피 세포와의 기저 줄기 세포 집단의 공동-배양이 시험관내에서 상피 증식을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며(도 9a-b), 이는 전체 폐 배양 효과를 지지한다. 활발한 Krt5+p63+ 기저 줄기 세포 표현형이 재생된 폐 조직 전반에 걸쳐 관찰되었으며(도 6ei), 비-유착성 프로SP-B+ 세포의 매우 작은 기여가 확인되었다(도 6eii). 큰 기도로의 상피 세포 유착이 또한 래트 및 폐 전체 폐 배양물에서 관찰되었다(도 6f). 이종성 내피 세포 적용범위가 맥관 구획 전반에 걸쳐 관찰되었으며, 이는 시딩된 초기 세포 수를 기반으로 하여 예측된 분포에 상응하였다. 가장 기본적인 가스 교환 단위체가 확인되었으며, 폐포-모세관 계면을 라이닝하는 단일 층 내피 및 상피 세포에 의해 나타내어 지며(도 6gi), 재증식된 혈관 도관이 발견되었다(도 6gii). 배양된 폐내에서 보유된 상피 세포 집단을 유전자 발현에 대해 추가로 분석하여, 정상 폐에 비해, 기저 줄기 세포 집단의 유지(정상적인 사체 폐 조직보다 25배 높은 p63 발현) 및 매우 낮은 발현 수준의 다른 성숙한 폐 상피 계열(CCSP, FOXJ1, Nkx2.1 및 SP-B)을 확인시켜주었다(도 6h).
또한, 원위 타입 2 폐세포 운명의 유도는 5일 동안 맥관 관류액을 통한 억제제 DAPT + IBMX의 전달(SP-C 발현의 13.08 ± 1.15배 증가)과 함께 무세포 래트 폐 스캐폴드의 기도로의 BESC의 전달 및 생체외 생체모방 배양 후에 확인되었으며, 도 4a-b 및 e 참조하시오. BESC는 또한, 재세포화 전에 시험관내에서 사전-분화될 수 있으며, 그 후, 폐 스캐폴드 재생 및 억제제 회수 후 일관된 원위 운명을 유지하는 것으로 나타났다(도 10a 참조). 재생된 폐 조직의 분석으로 조직화된 조직 구성 및 형태를 갖는 광범위한 폐포 재세포화를 확인하였다(도 10b 참조).
실시예 2. 테나스신 -C 및 피브릴린 -2에 의한 천연 인간 스캐폴드 상에서 향상된 상피 재생
전형적으로, 천연 기질 스캐폴드를 기반으로 하는 장기 공학은 재생적 세포 집단을 상응하는 생물학적 기질과 조합하여 요구에 따라 기능성 이식편을 형성하는 것을 포함한다. 폐 탈세포화 후 유지되는 세포외 기질(ECM)은 재세포화 후 전체 장기 재생을 위한 필수적인 구조 및 생물리학적 신호를 제공한다. 활성 폐포발생 동안 초기 출생 후 폐에서 고유의 ECM 조성물은 세포 유착, 생존 및 증식 추진을 보조할 수 있는 구별되는 신호를 가질 수 있다.
방법
하기 재료 및 방법이 실시예 2에 사용되었다.
연구 승인. 이식에 부적절한 그 외의 공여자 폐를 뉴 잉글랜드 장기 은행(New England Organ Bank)(표1 참조)으로부터 정보에 입각한 동의하에 얻었다. 실험은 매사추세츠 종합 병원 내부 검토위원회와 동물 이용 규약에 의해 승인되었다. 공여자 인구통계가 표 1에 기록되어 있다.
표 1 - 공여자 인구 통계. 연령 일(D, 신생아) 및 년(성인). 주(week)로 목록화된 임신 기간(신생아, 성인 공여자에게는 적용불가능(N/A)). 남성(M) 또는 여성(F)로 기록된 성별. 두 군 모두에 있어서 기록된 체질량 지수(BMI).
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세포 분리 및 확장. 상피 세포를 상기 기술된 바와 같은 성인 공여자 폐 말초 조직으로부터 분리하고, 계대 3에서 실험에 사용할 때까지 작은 기도 성장 배지(SAGM(Small Airway Growth Media), Lonza, CC-3118) 중에 인간 콜라겐 IV(Sigma-Aldrich, C7521)-코팅된 플라스크 상에서 시험관내 유지하였다.
폐 탈세포화. 래트 및 인간 공여자 폐를 종래 기술된 바와 같이 탈세포화하였다(Gilpin et al., The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 2014;33(3):298-308; Guyette et al., Nature protocols. 2014;9(6):1451-68). 간략하게는, 사체 래트 폐를 수컷 Sprague-Dawley 래트(250-300g, >8 주령, Charles River Laboratories)로부터 외식(explant)하고, 40mmHg에서 폐동맥을 통한 0.1% SDS 용액의 관류에 의해 탈세포화시킨 후 세척하였다. 인간 폐 탈세포화를 30 mmHg 내지 60 mmHg의 일정압에서 폐동맥을 통한 0.5% SDS 용액의 관류에 의해 수행하였다.
시험관내 코팅 및 배양을 위한 폐 ECM 분해. 탈세포화된 폐로부터의 조직 샘플(신생아, n=3 및 성인, n=3)을 동결건조시키고, 실온에서 24h 동안 10 mg/mL의 펩신 완충액(0.1 M 멸균 HCl의 mL 당 1 mg의 펩신) 중에 기계적으로 균질화시켰다. 코팅 전에, 펩신 분해된 조직을 0.1M 아세트산 중에 1:100으로 희석하여 0.1 mg/mL의 최종 농도가 되게 하였다. 코팅을 조직 배양 플레이트에 첨가하고 5분 동안 300xg에서 원심분리하였다. 총 1x106 BESC(p63 및 Krt5 발현에 의해 확인됨)를 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, SAGM에서 7d 동안 배양하였다.
세포독성 검정을 상기 기술된 바와 같이 ECM으로 코팅된 96-웰 플레이트에서 각 웰에 총 1x105 BESC를 첨가하여 수행하였다. 5일 배양 후, MultiTox-Fluor Multiplex Cytotoxicity Assay(Promega)을 제조업자의 지시에 따라 수행하였으며, 생-세포 형광은 400Ex/505Em에서 판독하고; 죽은 세포 형광은 485Ex/520Em에서 측정하였다.
단백질체 샘플 제조. 탈세포아된 신생아 및 성인 폐 조직을 종래 기술된 바와 같이 단백질체 분석을 위해 제조하였다(Li et al., Biomaterials. 2016;75:37-46; Li et al. Biomaterials. 2016;81:104-13). 대략 90 mg의 각 조직을 얼음 상에서 갈고, 1.5-mL 튜브에서 1분 동안 일회용 펠렛 막자로 분쇄한 후, 300 μL SDT 용액 - 4% SDS, 0.1 M Tris-HCl(pH 7.6) 및 0.1 M 디티오트레이톨(DTT) (모든 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 입수)-을 첨가하였다. 그 후, 샘플을 95℃에서 7분 동안 가열하고, 프로브 초음파분쇄기(Misonix XL2015, Misonix microtip PN/418, Farmingdale, NY)로 얼음 상에서 초음파 처리하고 - 6분 동안 교대로 20초 키고, 20초는 끔- 그 후, 16,100xg에서 5분 동안 22℃에서 원심분리하였다. 샘플 상청액의 분취액(2×30 μL)을 30K MW Vivacon 500 필터(Sartorius, Bohemia, NY)에서 2×200 μL의 8M 우레아/0.1 M Tris 완충액(pH 8.0)과 혼합하였다. 샘플을 세척하고, 아이오도아세트아미드로 알킬화시키고, 추가로 세척하고, 그 후 트립신(Promega, Madison, WI; 50:1 (w/w)의 단백질:효소 비율)으로 밤새 37℃에서 분해하고, 분해된 펩티드를 원심분리에 의해 수집하였다. 그 후, 분해물을 10% 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 0.5% TFA의 최종 농도로 켄칭하였다.
켄칭된 분해물을 Kinetex® C18 컬럼 (5 μm, 100 Å, 250×4.6 mm, Penomenex, Torrance, CA)을 사용하여 HPLC 시스템(Shimadzu, Columbia, MD) 상에서 고 pH 분별화로 처리하였다. 이동상 A는 수성 20 mM 암모늄 포르메이트이며, 이동상 B는 70% 아세토니트릴(ACN) 중의 20 mM 암모늄 포르메이트이며; 0-100% 이동상 B의 구배가 20분에 걸쳐 발생하였다. HPLC 유량은 1 mL/분이었으며, 용리액을 수집하고, 6개 분획으로 조합하였으며, 이들 각각은 SpeedVac에서 증발 건조시키고, 5% ACN, 2% 포름산(FA)에 재구성하였다.
액체 크로마토그래피-이중 질량 분석법(LC-MS/MS)을 이용한 단백질체 분석. 재구성된 펩티드 용액을 ESI 이온-트랩/Orbitrap 질량 분광계(LTQ Orbitrap Velos, Thermo Scientific, Waltham, MA)에 결합된 Waters nanoAcquity HPLC에 주입하였다. 펩티드를 20 cm의 1.7 μm BEH C18 입자(Waters, Milford, MA)로 패킹된 100 μm 내부 직경 컬럼 상에서 분리하고, 2.5 h에 걸쳐 증가하는 구배의 ACN을 갖는 0.1% FA로 0.3 μL/분에서 용리시켰다. 히터 카트리지를 사용하여 60℃에서 모세관 컬럼에서 유지시켰다. 전체-질량 스캔(300-1500 m/z)을 60,000의 해상도로 Orbitrap에서 수행하였다. 가장 강한 10개의 피크를 보다 높은 에너지의 충돌 해리(HCD)에 의한 단편화를 위해 42% 충돌 에너지에서 선택하였으며, 그 후, 7500의 해상도 및 2.5 m/z의 절연 폭으로 분석하였다. 역동적 배제는 30s에 걸친 1의 반복 카운트 및 120s의 여기 기간으로 가능하게 되었다.
단백질체 데이터 분석. 획득한 미처리 파일을 MaxQuant 버젼 1.5.2.8(Cox et al., Nat Biotech. 2008;26(12):1367-72)에 의해 분석하였다. 사용된 UniProt 데이터베이스는 2013년 12월 5일 다운로딩되고, 262개의 공동 오염물이 보충된 호모사피엔스로부터의 20,278개의 검토된 서열을 함유하였다. 전구체 및 단편 이온 질량 내성을 각각 4.5 ppm 및 20 ppm으로 설정하였다. 정적 시스테인 카르바미도메틸화(+57.0215 Da) 및 7개 이하의 가변 메티오닌 및 프롤린 산화 (+15.9949 Da)를 지정하였다. 펩티드 및 단백질 수준 둘 모두에서 1%의 위발견률이 허용되었다. 2개 이하의 누락된 절단이 허용되었으며, 단백질 당 최소 2개의 고유의 펩티드가 필요하였다. 역전된 데이터베이스 또는 오염으로부터의 단백질에 대한 매치를 함유하는 단백질 군을 폐기하였다. 단지 고유의 라조르 펩티드를 정량화에 사용하였으며, 2의 최소 카운트를 필요로 하였다. 각 샘플 내의 단백질의 상대적 존재량은 세기 기반 절대 정량화(iBAQ)에 의해 측정되었으며, MaxQuant 소프트웨어 패키지에 포함된 라벨-비함유 정량화(LFQ) 알고리즘을 사용하여 상이한 샘플 간의 단백질의 존재량을 비교하였다. Perseus 소프트웨어(버젼 1.5.0.15)를 다운스트림 데이터 처리에 사용하였다. 적어도 하나의 샘플 군(신생아 또는 성인)에서 적어도 2개의 유효 값을 요구함으로써 단백질을 여과하였다. 보정된 세기는 log2로 변환시키고, 누락 값은 0.3의 폭 및 0.9의 다운시프트를 사용함으로써 데이터 대체를 이용하여 대체되었다. Benjamini-Hochberg 보정을 이용한 2-샘플 t-테스트를 수행하여 신생아 및 성인 조직에서 개별 단백질의 LFQ 값을 통계적으로 비교하였다.
시험관내 배양 및 이동 검정. 24-웰 플레이트를 인간 콜라겐 IV(10 μg/ml) Sigma-Aldrich C7521)로 2h 동안 37℃에서 사전-코팅하였다. 이어서, 콜라겐 용액의 제거 후, TN-C(10 μg/ml, R&D 3358-TC-050) 또는 인간 FBN-2의 재조합 N-말단 절반(FBN-2-N) 또는 C-말단 절반(FBN-2-C)(10 μg/ml)(Lin et al., The Journal of biological chemistry. 2002;277(52):50795-804)을 첨가하여 웰을 선택하고, 2h 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 후속하여 총 1×105 BESC를 각 웰에 플레이팅시키고, SAGM에서 7d 동안 배양하였다.
이동 검정에 있어서, 상기와 같은 코팅 후, 작은 인서트(IBIDI)를 세포 시딩 전에 웰에 첨가하였다. 총 1x104 세포를 인서트 내부에 시딩하고, 인서트를 제거하기 전에 12h 동안 인큐베이션하였다. 명시 야상을 180분 동안 30분 마다 취하여 세포 이동을 추적하였다. 이미지는 ImageJ 소프트웨어(Schneider et al., Nature methods. 2012;9(7):671-5)로 분석하여 세포-비함유 영역에서 변화를 정량화하였다.
생체외 래트 폐 재세포화 및 배양. 탈세포화된 폐 스캐폴드를 기관을 통한 전달에 의해 (A) PBS 대조군, (B) TN-C, 10 μg/ml, (C) FBN-2, (FBN-2의 N- 및 C-말단 단편 각각 10 μg/ml), 또는 (D) TN-C+FBN-2 (FBN-2의 N- 및 C-말단 및 TN-C 각각 10 μg/ml)로 사전-코팅하였다. 용액을 37℃에서 90분 동안 기관으로 재순환시켰다. 그 후, 총 20x106 일차 폐 상피 세포(계대 3)를 중력에 의해 20 ml의 SAGM 중에서 스캐폴드 기도에 전달하였다. 폐동맥을 통과하는 SAGM의 일정 배지 관류는 4 ml/분(15-20 mmHg 압력)으로 유지하고, 매일 교체하였다. 재세포화된 폐를 7일 동안 배양물에 유지시키고, 시점 분석을 위해 3일째에 오른쪽 폐를 제거하였다.
정량적 PCR . mRNA를 분리하고 (Qiagen RNeasy Plus Kit), cDNA로 전사하였다(Invitrogen SuperScript III). Taqman 프로브 및 OneStep Plus 시스템(Applied Biosystems)을 사용하여 유전자 발현을 분석하였다. 각 생물학적 샘플을 반복 실험으로 분석하고 (n = qPCR 반응의 2개의 반복된 웰), 각 반복 실험의 Ct 값을 평균화시키고, n=1 고유한 생물학적 샘플로서 제공되었다. 각 샘플에 대한 발현은 사체 말초 폐 조직 대조군 샘플(ΔΔCt)과 비교하여 β-액틴 (ACTA1) 유전자 발현 (ΔCt)으로 표준화시키고, 배수 발현은 2-ΔΔCt에 의해 계산하였다(Livak and Schmittgen, Methods. 2001;25(4):402-8). 총 n = 3의 고유한 생물학적 샘플을 각 보고된 실험에 대해 분석하였다.
면역염색. 탈-파라핀화 및 재수화 후, 5 μm 조직 절편을 적절한 경우 세포내 항원에 있어서 0.1% Triton X-100으로 투과시켰다. 배양물 중 세포를 염색 전에 아이스-콜드 메탄올로 고정시켰다. 모든 샘플을 1시간 동안 1% 당나귀 혈청으로 차단하였다. 일차 항체 모두를 하기로 1:100 희석하였다: p63(Biocare Medica, CM163A), Krt5(Abcam, ab24647), E-카드헤린(BD Biosciences, 610181), Ki67(Abcam, ab16667). 이차 항체 모두는 하기로 1:400 희석하였다: Alexa Fluor 488 또는 594 (Life Technologies)에 컨쥬게이션된 당나귀 항-마우스, 래빗, 또는 염소. 샘플을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하여 핵을 시각화시키고, Nikon Ti-Eclipse 현미경을 사용하여 이미지화하였다.
이미지 분석은 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 수행하고, 중격 두께를 n=3 고유 절편 상에서 측정하고, 절편당 n=5 영역을 측정하였다(도 18 참조).
통계학적 분석. 모든 실험에 있어서, 언급된 n 값은 독립적인 생물학적 샘플을 나타낸다. 데이터는 GraphPad Software를 사용하여 적절한 경우 1-원 또는 2-원 ANOVA에 의해 분석하였다. 이에 따라 모든 통계학적 유의성을 보고하였다. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001.
결과
그외 임상 이식에 적합하지 않은 것으로 여겨지는 공여된 인간 폐를 먼저 0.5% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 용액(도 17a-b 참조)의 일정-압력 맥관 관류에 의해 탈세포화 한 다음, 잔류 세제 및 세포 성분을 제거하기 위해 광범위하게 세척하여 세포외 기질 단백질 스캐폴드를 생성시켰다(문헌 [Gilpin et al., The Journal of heart and lung transplantation: the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 2014;33(3):298-308; Guyette et al., Nature protocols. 2014;9(6):1451-68)]에 종래 기술됨). 총 n=3 신생아(생후 1주 미만) 폐 스캐폴드 및 n=3 성인 폐 스캐폴드는 후속 분석을 위해 이러한 방식으로 제조하였다(표 1 참조).
본 발명자들은 먼저 성인 폐와 비교하여 신생아 폐로부터 유래된 ECM 상에서 배양할 경우, 일차 공여자 조직-유래 기저 상피 줄기 세포(BESC)의 반응을 평가하는 것을 목표로 하였다. 이를 위해, 각 신생아 및 성인 공여자로부터의 무세포 폐 ECM을 시험관내 상피 세포 배양을 위한 코팅으로서 제조하였다(도 12a). 7d 동안 각 기재상에서 BESC의 배양 후, 신생아 ECM 상의 세포가 성인 폐 ECM 상에서 성장한 세포와 비교하여 현저하게 더 많은 증식(Ki67 및 PCNA 발현) 및 더 적은 노화(CDKN2A 발현)를 나타냄이 발견되었다(도 12b). 상피 표현형에서의 현저한 차이는 발견되지 않았으며(E-카드헤린, p63 발현), 중간엽 마커 평활근 액틴(SMA)의 발현의 증가로 관찰되지 않았다. 전체 세포 평가에 의해, 7d의 배양까지 성인 폐 ECM보다 신생아 ECM 코팅 상에 현저하게 더 많은 생 세포가 생착되었으며, 죽은 세포의 수에 있어서는 차이가 발견되지 않았다(도 12c).
그 후, 이러한 효과를 매개할 수 있는 단백질 조성의 차이를 조사하기 위해, 본 발명자들은 액체 크로마토그래피-이중 질량 분광법(LC-MS/MS)을 이용한 단백질체 분석을 통해 성인 대비 신생아 공여자 폐로부터 무세포 폐 스캐폴드를 평가하였다. 도 13a의 히트 맵은 각 생물학적 샘플로부터 각 단백질의 존재량 변화를 보여준다. 두 군 모두에서, 적은 수의 높은-존재량의 단백질(적색) 이외에 많은 낮은-존재량의 단백질(녹색)이 측정되었다. 마트리솜의 하위범주의 추가 분석(도 13b)은 신생아 폐 스캐폴드가 다량의 콜라겐을 함유하는 반면, 다른 하위범주(당단백질, 프로테오글리칸, ECM 조절인자, 등)는 성인 스캐폴드에서 더 풍부함을 보여주었다.
그 후, 각 개별 기질 단백질의 측정된 존재량을 성인 대비 신생아 스캐폴드로 비교하였다. 볼케이노 플롯을 생성시켰으며, 이는 통계학적 p-값에 대하여 플롯팅된 단백질 존재량의 배수 변화(성인 대 신생아)를 보여준다. 신생아 또는 성인 스캐폴드에서 부화된 선택된 단백질은 도 14a에서 강조하였으며, 도 14b에서 상세하게 기록하였다.
피브릴린 2 및 3은 성인 샘플에 비해 신생아 스캐폴드에서 부화된 것으로 밝혀졌다 (피브릴린-2 = 202.74배 변화, p=2.8x10-2). 피브릴린은 엘라스틴 분해 및 탄성 섬유의 형성에 필수적인 당단백질로서, 폐포 발달 및 구조를 지지한다(Peirce et al., Ciba Foundation symposium. 1995;192(199-212; discussion -4). 특히, FBN-2의 발현 패턴은 발달하는 태아 조직에 크게 제한된다(Zhang et al., The Journal of cell biology. 1994;124(5):855-6). 또한, FBN-2는 발달 및 조직 수복 둘 모두에서 TN-C와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다(Brinckmann et al., Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 2010;90(5):739-52). TN-C는 또한 출생 후 폐 ECM에서 발견되며, 형태형성 분지화 과정을 돕는 것으로 나타났다(Young et al., Developmental biology. 1994;161(2):615-25). 신생아 폐 스캐폴드에서 이러한 두 단백질의 풍부화는 본 발명자들이 신생아 폐 ECM 코팅에서 발견되는 향상된 상피 수복 반응의 잠재적 매개인자로서 이들의 역할을 추가로 분석하도록 조장하였다.
본 발명자들은 이러한 개별 단백질이 시험관내 BESC에 대한 신생아 ECM의 유익한 효과를 되풀이할 수 있는지 시험하였다. BESC를 콜라겐 IV로 먼저 코팅된 플레이트에서 배양한 다음 TN-C 및/또는 FBN-2 재조합 N- 및 C-말단 절반을 보충하고, 이를 코팅되지 않은 웰에서의 배양과 비교하였다(도 15a). BESC가 분리된 신생아 ECM 코팅에서 배양되었을 때 관찰된 바와 같이, 본 발명자들은 FBN-2 및 TN-C 코팅된 플레이트에서 성장한 BESC에 의해 유의하게 더 큰 증식 및 덜한 노화를 발견하였으며, 가장 현저한 반응은 TN-C+FBN-2-C 말단 절반 코팅에서 측정되었다. 코팅되지 않은 또는 콜라겐 IV로 코팅된 웰과 비교할 경우, 상피 표현형의 차이는 발견되지 않았다. 상이한 단백질 코팅에 대한 반응으로 TN-C, FBN-2, 또는 비멘틴 발현에서 현저한 변화가 검출되지 않았다(도 15a). 또한, 평활근 액틴(SMA) 발현 및 전사 인자 SNAIL 및 ZEB에 의해 평가된 바와 같이, 상이한 코팅 상에서 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)의 증거가 확인되지 않았다(도 15a). 상이한 ECM 코팅에서 성장시킨 BESC의 면역형광 염색은 유전자 발현 분석의 발견을 확인시켜 주었으며, Ki67 발현을 정량화할 경우, FBN-2 및 TN-C 코팅 플레이트에서 유의한 차이가 발견되었다(도 15b-c). 또한, BESC 이동을, 세포 이동 검정을 정량화함으로써 다양한 단백질 코팅 상에서 조사하였다. FBN-2의 N- 및 C-말단 절반의 혼합물을 이동 검정에 사용하였다. 콜라겐 IV 코팅 단독과 비교할 경우, FBN-2 및 TN-C 코팅된 플레이트에서 3시간에 걸쳐 현저하게 더 높은 속도의 BESC 이동이 확인되었다(p <0.001, 도 15d). 또한, 세포 이동의 추가 지표인 초점성 유착 키나제(FAK)의 유전자 발현(Mitra et al., Nature reviews Molecular cell biology. 2005;6(1):56-6)을 다양한 코팅 상에서 측정하였으며, TN-C+FBN-2 C-말단 단편 코팅된 플레이트상에서 성장한 BESC는 현저하게 더 높은 발현 수준을 갖는다(도 15e).
전체 폐 상피 조직 재생과 관련하여 이러한 발견을 궁극적으로 평가하기 위해, 본 발명자들은 상피 재세포화 전에 무세포 폐 스캐폴드의 FBN-2 (혼합된 N 및 C-말단 단편) 및 TN-C 전처리의 효과를 평가하였다. 사전-코팅 및 BESC 재-상피화 후, 폐를 7d 동안 생체외 생체모방 배양으로 유지하였으며, 시점 분석을 위해 3일째에 오른쪽 폐를 제거하였다.
또한 조직 분석은 스캐폴드 전-처리를 이용하여 3일 및 7일의 재생 둘 모두에서 현저하게 더 많은 상피 증식을 확인하였다(도 16a). 배양 7일째에 세포 노화 증가는 FBN-2+TN-C 스캐폴드 코팅에 의해 현저하게 감소되었다. E-카드헤린 발현의 증가는 FBN-2+TN-C 처리 후 3일째에 측정되었지만, 그 외의 상피 운명은 스캐폴드 코팅에 의해 변화되지 않았다. FBN-2 또는 TN-C 어느 것도 처리에 의해 상향조절되지 않았다. 중간엽 표현형 또는 EMT-관련 전사 인자 발현의 증가는 관찰되지 않았다. 헤마톡실린과 에오신 염색에 의한 재상피화된 폐 조직의 총 형태학적 분석은 처리되지 않은 것과 비교할 경우, 개선된 조직 구조, 기질에 대한 세포 정렬, 및 코팅된 폐에서의 덜한 세포 비대를 드러냈다(도 16b). 이들 관찰은 배양 7일째에 가장 분명하였다.
면역형광 염색은 상피 운명 및 증식을 평가하기 위해 수행하였다. Krt5+ BESC의 Ki67 발현의 정량화는 폐 스캐폴드를 FBN-2 및 TN-C로 사전-코팅한 경우 증식의 현저한 증가를 확인시켜 주었으며, 두 단백질 모두가 스캐폴드 코팅을 위해 조합되었을 때 가장 큰 세포 반응이 발견되었다(도 16c-d).
중격 두께의 측정에 의한 조직 형태의 정량화는 또한, 스캐폴드의 사전-코팅이 재생된 폐 조직에서 더 많은 세포 정렬 및 덜한 중격 비후를 초래한다는 관찰을 확인시켜주었다(도 16e 및 도 18). 이러한 결과는 크기 및 구조 둘 모두에 있어서 천연 폐 조직과 더욱 유사한 외형을 갖는 폐포 구조를 발생시켰다.
종합하면, 이들 결과는 FBN-2 및 TN-C 단백질로의 무세포 폐 기질의 처리가 기저 상피 줄기 세포 이동, 증식을 향상시킬 수 있으며, 폐 조직 수복을 도울 수 있음을 입증한다.
참고 문헌
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
기타 구체예
본 발명은 이의 상세한 설명과 결합하여 기재되었고, 상기 명세서는 본 발명의 범위를 한정하여 설명하는 것으로 의도되지 않고, 첨부된 특허청구범위의 범위에 의해 규정됨이 이해된다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 하기의 특허청구범위의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The General Hospital Corporation <120> Human Airway Stem Cells in Lung Epithelial Engineering <130> 35954-0006WO1 <140> PCT/US2017/031076 <141> 2017-05-04 <150> US 62/483,760 <151> 2017-04-10 <150> US 62/426,146 <151> 2016-11-23 <150> US 62/337,041 <151> 2016-05-16 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2201 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val Phe Leu Ala Phe Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys Val Ile Arg His Lys 20 25 30 Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val 35 40 45 Val Phe Asn His Val Tyr Asn Ile Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys 50 55 60 Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro 65 70 75 80 Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn 85 90 95 Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly 100 105 110 Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu 115 120 125 Leu Glu Asn Leu Val Ser 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1365 Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln Val Gln Glu 1370 1375 1380 Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser 1385 1390 1395 Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr 1400 1405 1410 Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val 1415 1420 1425 Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn 1430 1435 1440 Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro Glu Ser Phe Asn Leu Ser Trp 1445 1450 1455 Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr Phe Thr Ile Glu Ile Ile 1460 1465 1470 Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr Asn Ile Ser Gly 1475 1480 1485 Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Thr Asp 1490 1495 1500 Phe Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile Arg Thr Lys 1505 1510 1515 Thr Ile Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu 1520 1525 1530 Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr Gly Phe Thr Val Ser 1535 1540 1545 Trp Met Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe Leu Val Thr Val 1550 1555 1560 Val Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe Thr Leu Ser 1565 1570 1575 Gly Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr Gly Ile 1580 1585 1590 Gly Tyr Glu Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln Thr 1595 1600 1605 Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val 1610 1615 1620 Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp Gly Phe Arg Leu 1625 1630 1635 Ser Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp Asn Phe Val Leu Lys 1640 1645 1650 Ile Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Leu Glu Ile Thr Leu 1655 1660 1665 Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg Asp Ile Thr Gly Leu Arg Glu Ala 1670 1675 1680 Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly Arg Arg 1685 1690 1695 Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met Gly Ser Pro 1700 1705 1710 Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val 1715 1720 1725 Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr 1730 1735 1740 Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp 1745 1750 1755 Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val 1760 1765 1770 Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser 1775 1780 1785 Glu Pro Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser 1790 1795 1800 Gly Leu Val Thr Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Arg 1805 1810 1815 Trp Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile Ser Tyr 1820 1825 1830 Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly Asn 1835 1840 1845 Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 1850 1855 1860 Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gln Lys Ser Ser Thr 1865 1870 1875 Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp Leu 1880 1885 1890 Thr Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg 1895 1900 1905 Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu Val Tyr Glu Ser 1910 1915 1920 Val Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro Asp Thr Thr 1925 1930 1935 Ser Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr Thr Ala 1940 1945 1950 Lys Ile Gln Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met Ile Gln 1955 1960 1965 Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Lys Asp 1970 1975 1980 Cys Ser Gln Ala Met Leu Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr 1985 1990 1995 Thr Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Ala Glu Ala Leu Glu Val Phe 2000 2005 2010 Cys Asp Met Thr Ser Asp Gly Gly Gly Trp Ile Val Phe Leu Arg 2015 2020 2025 Arg Lys Asn Gly Arg Glu Asn Phe Tyr Gln Asn Trp Lys Ala Tyr 2030 2035 2040 Ala Ala Gly Phe Gly Asp Arg Arg Glu Glu Phe Trp Leu Gly Leu 2045 2050 2055 Asp Asn Leu Asn Lys Ile Thr Ala Gln Gly Gln Tyr Glu Leu Arg 2060 2065 2070 Val Asp Leu Arg Asp His Gly Glu Thr Ala Phe Ala Val Tyr Asp 2075 2080 2085 Lys Phe Ser Val Gly Asp Ala Lys Thr Arg Tyr Lys Leu Lys Val 2090 2095 2100 Glu Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met Ala Tyr His Asn 2105 2110 2115 Gly Arg Ser Phe Ser Thr Phe Asp Lys Asp Thr Asp Ser Ala Ile 2120 2125 2130 Thr Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe Trp Tyr Arg Asn 2135 2140 2145 Cys His Arg Val Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp Asn Asn His 2150 2155 2160 Ser Gln Gly Val Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu His Ser 2165 2170 2175 Ile Gln Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg Asn 2180 2185 2190 Leu Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala 2195 2200 <210> 2 <211> 2912 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Arg Arg Arg Arg Leu Cys Leu Gln Leu Tyr Phe Leu Trp Leu 1 5 10 15 Gly Cys Val Val Leu Trp Ala Gln Gly Thr Ala Gly Gln Pro Gln Pro 20 25 30 Pro Pro Pro Lys Pro Pro Arg Pro Gln Pro Pro Pro Gln Gln Val Arg 35 40 45 Ser Ala Thr Ala Gly Ser Glu Gly Gly Phe Leu Ala Pro Glu Tyr Arg 50 55 60 Glu Glu Gly Ala Ala Val Ala Ser Arg Val Arg Arg Arg Gly Gln Gln 65 70 75 80 Asp Val Leu Arg Gly Pro Asn Val Cys Gly Ser Arg Phe His Ser Tyr 85 90 95 Cys Cys Pro Gly Trp Lys Thr Leu Pro Gly Gly Asn Gln Cys Ile Val 100 105 110 Pro Ile Cys Arg Asn Ser Cys Gly Asp Gly Phe Cys Ser Arg Pro Asn 115 120 125 Met Cys Thr Cys Ser Ser Gly Gln Ile Ser Ser Thr Cys Gly Ser Lys 130 135 140 Ser Ile Gln Gln Cys Ser Val Arg Cys Met Asn Gly Gly Thr Cys Ala 145 150 155 160 Asp Asp His Cys Gln Cys Gln Lys Gly Tyr Ile Gly Thr Tyr Cys Gly 165 170 175 Gln Pro Val Cys Glu Asn Gly Cys Gln Asn Gly Gly Arg Cys Ile Gly 180 185 190 Pro Asn Arg Cys Ala Cys Val Tyr Gly Phe Thr Gly Pro Gln Cys Glu 195 200 205 Arg Asp Tyr Arg Thr Gly Pro Cys Phe Thr Gln Val Asn Asn Gln Met 210 215 220 Cys Gln Gly Gln Leu Thr Gly Ile Val Cys Thr Lys Thr Leu Cys Cys 225 230 235 240 Ala Thr Ile Gly Arg Ala Trp Gly His Pro Cys Glu Met Cys Pro Ala 245 250 255 Gln Pro Gln Pro Cys Arg Arg Gly Phe Ile Pro Asn Ile Arg Thr Gly 260 265 270 Ala Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys Gln Ala Ile Pro Gly Ile Cys Gln 275 280 285 Gly Gly Asn Cys Ile Asn Thr Val Gly Ser Phe Glu Cys Arg Cys Pro 290 295 300 Ala Gly His Lys Gln Ser Glu Thr Thr Gln Lys Cys Glu Asp Ile Asp 305 310 315 320 Glu Cys Ser Ile Ile Pro Gly Ile Cys Glu Thr Gly Glu Cys Ser Asn 325 330 335 Thr Val Gly Ser Tyr Phe Cys Val Cys Pro Arg Gly Tyr Val Thr Ser 340 345 350 Thr Asp Gly Ser Arg Cys Ile Asp Gln Arg Thr Gly Met Cys Phe Ser 355 360 365 Gly Leu Val Asn Gly Arg Cys Ala Gln Glu Leu Pro Gly Arg Met Thr 370 375 380 Lys Met Gln Cys Cys Cys Glu Pro Gly Arg Cys Trp Gly Ile Gly Thr 385 390 395 400 Ile Pro Glu Ala Cys Pro Val Arg Gly Ser Glu Glu Tyr Arg Arg Leu 405 410 415 Cys Met Asp Gly Leu Pro Met Gly Gly Ile Pro Gly Ser Ala Gly Ser 420 425 430 Arg Pro Gly Gly Thr Gly Gly Asn Gly Phe Ala Pro Ser Gly Asn Gly 435 440 445 Asn Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Thr Gly Phe Ile Pro Ile Pro Gly Gly 450 455 460 Asn Gly Phe Ser Pro Gly Val Gly Gly Ala Gly Val Gly Ala Gly Gly 465 470 475 480 Gln Gly Pro Ile Ile Thr Gly Leu Thr Ile Leu Asn Gln Thr Ile Asp 485 490 495 Ile Cys Lys His His Ala Asn Leu Cys Leu Asn Gly Arg Cys Ile Pro 500 505 510 Thr Val Ser Ser Tyr Arg Cys Glu Cys Asn Met Gly Tyr Lys Gln Asp 515 520 525 Ala Asn Gly Asp Cys Ile Asp Val Asp Glu Cys Thr Ser Asn Pro Cys 530 535 540 Thr Asn Gly Asp Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Tyr Tyr Cys Lys Cys 545 550 555 560 His Ala Gly Phe Gln Arg Thr Pro Thr Lys Gln Ala Cys Ile Asp Ile 565 570 575 Asp Glu Cys Ile Gln Asn 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Met Glu Gln Cys Tyr Leu Lys Trp Asp 995 1000 1005 Glu Asp Glu Cys Ile His Pro Val Pro Gly Lys Phe Arg Met Asp 1010 1015 1020 Ala Cys Cys Cys Ala Val Gly Ala Ala Trp Gly Thr Glu Cys Glu 1025 1030 1035 Glu Cys Pro Lys Pro Gly Thr Lys Glu Tyr Glu Thr Leu Cys Pro 1040 1045 1050 Arg Gly Ala Gly Phe Ala Asn Arg Gly Asp Val Leu Thr Gly Arg 1055 1060 1065 Pro Phe Tyr Lys Asp Ile Asn Glu Cys Lys Ala Phe Pro Gly Met 1070 1075 1080 Cys Thr Tyr Gly Lys Cys Arg Asn Thr Ile Gly Ser Phe Lys Cys 1085 1090 1095 Arg Cys Asn Ser Gly Phe Ala Leu Asp Met Glu Glu Arg Asn Cys 1100 1105 1110 Thr Asp Ile Asp Glu Cys Arg Ile Ser Pro Asp Leu Cys Gly Ser 1115 1120 1125 Gly Ile Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys Glu Cys Phe 1130 1135 1140 Glu Gly Tyr Glu Ser Gly Phe Met Met Met Lys Asn Cys Met Asp 1145 1150 1155 Ile Asp Glu Cys Glu Arg Asn Pro Leu Leu Cys Arg Gly Gly Thr 1160 1165 1170 Cys Val Asn Thr Glu Gly Ser Phe Gln Cys Asp Cys Pro Leu Gly 1175 1180 1185 His Glu Leu Ser Pro Ser Arg Glu Asp Cys Val Asp Ile Asn Glu 1190 1195 1200 Cys Ser Leu Ser Asp Asn Leu Cys Arg Asn Gly Lys Cys Val Asn 1205 1210 1215 Met Ile Gly Thr Tyr Gln Cys Ser Cys Asn Pro Gly Tyr Gln Ala 1220 1225 1230 Thr Pro Asp Arg Gln Gly Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Met Ile 1235 1240 1245 Met Asn Gly Gly Cys Asp Thr Gln Cys Thr Asn Ser Glu Gly Ser 1250 1255 1260 Tyr Glu Cys Ser Cys Ser Glu Gly Tyr Ala Leu Met Pro Asp Gly 1265 1270 1275 Arg Ser Cys Ala Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Asn Pro Asp Ile 1280 1285 1290 Cys Asp Gly Gly Gln Cys Thr Asn Ile Pro Gly Glu Tyr Arg Cys 1295 1300 1305 Leu Cys Tyr Asp Gly Phe Met Ala Ser Met Asp Met Lys Thr Cys 1310 1315 1320 Ile Asp Val Asn Glu Cys Asp Leu Asn Ser Asn Ile Cys Met Phe 1325 1330 1335 Gly Glu Cys Glu Asn Thr Lys Gly Ser Phe Ile Cys His Cys Gln 1340 1345 1350 Leu Gly Tyr Ser Val Lys Lys Gly Thr Thr Gly Cys Thr Asp Val 1355 1360 1365 Asp Glu Cys Glu Ile Gly Ala His Asn Cys Asp Met His Ala Ser 1370 1375 1380 Cys Leu Asn Ile Pro Gly Ser Phe Lys Cys Ser Cys Arg Glu Gly 1385 1390 1395 Trp Ile Gly Asn Gly Ile Lys Cys Ile Asp Leu Asp Glu Cys Ser 1400 1405 1410 Asn Gly Thr His Gln Cys Ser Ile Asn Ala Gln Cys Val Asn Thr 1415 1420 1425 Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Ala Cys Ser Glu Gly Phe Thr Gly Asp 1430 1435 1440 Gly Phe Thr Cys Ser Asp Val Asp Glu Cys Ala Glu Asn Ile Asn 1445 1450 1455 Leu Cys Glu Asn Gly Gln Cys Leu Asn Val Pro Gly Ala Tyr Arg 1460 1465 1470 Cys Glu Cys Glu Met Gly Phe Thr Pro Ala Ser Asp Ser Arg Ser 1475 1480 1485 Cys Gln Asp Ile Asp Glu Cys Ser Phe Gln Asn Ile Cys Val Phe 1490 1495 1500 Gly Thr Cys Asn Asn Leu Pro Gly Met Phe His Cys Ile Cys Asp 1505 1510 1515 Asp Gly Tyr Glu Leu Asp Arg Thr Gly Gly Asn Cys Thr Asp Ile 1520 1525 1530 Asp Glu Cys Ala Asp Pro Ile Asn Cys Val Asn Gly Leu Cys Val 1535 1540 1545 Asn Thr Pro Gly Arg Tyr Glu Cys Asn Cys Pro Pro Asp Phe Gln 1550 1555 1560 Leu Asn Pro Thr Gly Val Gly Cys Val Asp Asn Arg Val Gly Asn 1565 1570 1575 Cys Tyr Leu Lys Phe Gly Pro Arg Gly Asp Gly Ser Leu Ser Cys 1580 1585 1590 Asn Thr Glu Ile Gly Val Gly Val Ser Arg Ser Ser Cys Cys Cys 1595 1600 1605 Ser Leu Gly Lys Ala Trp Gly Asn Pro Cys Glu Thr Cys Pro Pro 1610 1615 1620 Val Asn Ser Thr Glu Tyr Tyr Thr Leu Cys Pro Gly Gly Glu Gly 1625 1630 1635 Phe Arg Pro Asn Pro Ile Thr Ile Ile Leu Glu Asp Ile Asp Glu 1640 1645 1650 Cys Gln Glu Leu Pro Gly Leu Cys Gln Gly Gly Asn Cys Ile Asn 1655 1660 1665 Thr Phe Gly Ser Phe Gln Cys Glu Cys Pro Gln Gly Tyr Tyr Leu 1670 1675 1680 Ser Glu Asp Thr Arg Ile Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Phe Ala 1685 1690 1695 His Pro Gly Val Cys Gly Pro Gly Thr Cys Tyr Asn Thr Leu Gly 1700 1705 1710 Asn Tyr Thr Cys Ile Cys Pro Pro Glu Tyr Met Gln Val Asn Gly 1715 1720 1725 Gly His Asn Cys Met Asp Met Arg Lys Ser Phe Cys Tyr Arg Ser 1730 1735 1740 Tyr Asn Gly Thr Thr Cys Glu Asn Glu Leu Pro Phe Asn Val Thr 1745 1750 1755 Lys Arg Met Cys Cys Cys Thr Tyr Asn Val Gly Lys Ala Trp Asn 1760 1765 1770 Lys Pro Cys Glu Pro Cys Pro Thr Pro Gly Thr Ala Asp Phe Lys 1775 1780 1785 Thr Ile Cys Gly Asn Ile Pro Gly Phe Thr Phe Asp Ile His Thr 1790 1795 1800 Gly Lys Ala Val Asp Ile Asp Glu Cys Lys Glu Ile Pro Gly Ile 1805 1810 1815 Cys Ala Asn Gly Val Cys Ile Asn Gln Ile Gly Ser Phe Arg Cys 1820 1825 1830 Glu Cys Pro Thr Gly Phe Ser Tyr Asn Asp Leu Leu Leu Val Cys 1835 1840 1845 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Asn Gly Asp Asn Leu Cys Gln Arg 1850 1855 1860 Asn Ala Asp Cys Ile Asn Ser Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Glu Cys 1865 1870 1875 Ala Ala Gly Phe Lys Leu Ser Pro Asn Gly Ala Cys Val Asp Arg 1880 1885 1890 Asn Glu Cys Leu Glu Ile Pro Asn Val Cys Ser His Gly Leu Cys 1895 1900 1905 Val Asp Leu Gln Gly Ser Tyr Gln Cys Ile Cys His Asn Gly Phe 1910 1915 1920 Lys Ala Ser Gln Asp Gln Thr Met Cys Met Asp Val Asp Glu Cys 1925 1930 1935 Glu Arg His Pro Cys Gly Asn Gly Thr Cys Lys Asn Thr Val Gly 1940 1945 1950 Ser Tyr Asn Cys Leu Cys Tyr Pro Gly Phe Glu Leu Thr His Asn 1955 1960 1965 Asn Asp Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Ser Phe Phe Gly Gln 1970 1975 1980 Val Cys Arg Asn Gly Arg Cys Phe Asn Glu Ile Gly Ser Phe Lys 1985 1990 1995 Cys Leu Cys Asn Glu Gly Tyr Glu Leu Thr Pro Asp Gly Lys Asn 2000 2005 2010 Cys Ile Asp Thr Asn Glu Cys Val Ala Leu Pro Gly Ser Cys Ser 2015 2020 2025 Pro Gly Thr Cys Gln Asn Leu Glu Gly Ser Phe Arg Cys Ile Cys 2030 2035 2040 Pro Pro Gly Tyr Glu Val Lys Ser Glu Asn Cys Ile Asp Ile Asn 2045 2050 2055 Glu Cys Asp Glu Asp Pro Asn Ile Cys Leu Phe Gly Ser Cys Thr 2060 2065 2070 Asn Thr Pro Gly Gly Phe Gln Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Val 2075 2080 2085 Leu Ser Asp Asn Gly Arg Arg Cys Phe Asp Thr Arg Gln Ser Phe 2090 2095 2100 Cys Phe Thr Asn Phe Glu Asn Gly Lys Cys Ser Val Pro Lys Ala 2105 2110 2115 Phe Asn Thr Thr Lys Ala Lys Cys Cys Cys Ser Lys Met Pro Gly 2120 2125 2130 Glu Gly Trp Gly Asp Pro Cys Glu Leu Cys Pro Lys Asp Asp Glu 2135 2140 2145 Val Ala Phe Gln Asp Leu Cys Pro Tyr Gly His Gly Thr Val Pro 2150 2155 2160 Ser Leu His Asp Thr Arg Glu Asp Val Asn Glu Cys Leu Glu Ser 2165 2170 2175 Pro Gly Ile Cys Ser Asn Gly Gln Cys Ile Asn Thr Asp Gly Ser 2180 2185 2190 Phe Arg Cys Glu Cys Pro Met Gly Tyr Asn Leu Asp Tyr Thr Gly 2195 2200 2205 Val Arg Cys Val Asp Thr Asp Glu Cys Ser Ile Gly Asn Pro Cys 2210 2215 2220 Gly Asn Gly Thr Cys Thr Asn Val Ile Gly Ser Phe Glu Cys Asn 2225 2230 2235 Cys Asn Glu Gly Phe Glu Pro Gly Pro Met Met Asn Cys Glu Asp 2240 2245 2250 Ile Asn Glu Cys Ala Gln Asn Pro Leu Leu Cys Ala Phe Arg Cys 2255 2260 2265 Met Asn Thr Phe Gly Ser Tyr Glu Cys Thr Cys Pro Ile Gly Tyr 2270 2275 2280 Ala Leu Arg Glu Asp Gln Lys Met Cys Lys Asp Leu Asp Glu Cys 2285 2290 2295 Ala Glu Gly Leu His Asp Cys Glu Ser Arg Gly Met Met Cys Lys 2300 2305 2310 Asn Leu Ile Gly Thr Phe Met Cys Ile Cys Pro Pro Gly Met Ala 2315 2320 2325 Arg Arg Pro Asp Gly Glu Gly Cys Val Asp Glu Asn Glu Cys Arg 2330 2335 2340 Thr Lys Pro Gly Ile Cys Glu Asn Gly Arg Cys Val Asn Ile Ile 2345 2350 2355 Gly Ser Tyr Arg Cys Glu Cys Asn Glu Gly Phe Gln Ser Ser Ser 2360 2365 2370 Ser Gly Thr Glu Cys Leu Asp Asn Arg Gln Gly Leu Cys Phe Ala 2375 2380 2385 Glu Val Leu Gln Thr Ile Cys Gln Met Ala Ser Ser Ser Arg Asn 2390 2395 2400 Leu Val Thr Lys Ser Glu Cys Cys Cys Asp Gly Gly Arg Gly Trp 2405 2410 2415 Gly His Gln Cys Glu Leu Cys Pro Leu Pro Gly Thr Ala Gln Tyr 2420 2425 2430 Lys Lys Ile Cys Pro His Gly Pro Gly Tyr Thr Thr Asp Gly Arg 2435 2440 2445 Asp Ile Asp Glu Cys Lys Val Met Pro Asn Leu Cys Thr Asn Gly 2450 2455 2460 Gln Cys Ile Asn Thr Met Gly Ser Phe Arg Cys Phe Cys Lys Val 2465 2470 2475 Gly Tyr Thr Thr Asp Ile Ser Gly Thr Ser Cys Ile Asp Leu Asp 2480 2485 2490 Glu Cys Ser Gln Ser Pro Lys Pro Cys Asn Tyr Ile Cys Lys Asn 2495 2500 2505 Thr Glu Gly Ser Tyr Gln Cys Ser Cys Pro Arg Gly Tyr Val Leu 2510 2515 2520 Gln Glu Asp Gly Lys Thr Cys Lys Asp Leu Asp Glu Cys Gln Thr 2525 2530 2535 Lys Gln His Asn Cys Gln Phe Leu Cys Val Asn Thr Leu Gly Gly 2540 2545 2550 Phe Thr Cys Lys Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gln His His Thr Ala 2555 2560 2565 Cys Ile Asp Asn Asn Glu Cys Gly Ser Gln Pro Ser Leu Cys Gly 2570 2575 2580 Ala Lys Gly Ile Cys Gln Asn Thr Pro Gly Ser Phe Ser Cys Glu 2585 2590 2595 Cys Gln Arg Gly Phe Ser Leu Asp Ala Thr Gly Leu Asn Cys Glu 2600 2605 2610 Asp Val Asp Glu Cys Asp Gly Asn His Arg Cys Gln His Gly Cys 2615 2620 2625 Gln Asn Ile Leu Gly Gly Tyr Arg Cys Gly Cys Pro Gln Gly Tyr 2630 2635 2640 Ile Gln His Tyr Gln Trp Asn Gln Cys Val Asp Glu Asn Glu Cys 2645 2650 2655 Ser Asn Pro Asn Ala Cys Gly Ser Ala Ser Cys Tyr Asn Thr Leu 2660 2665 2670 Gly Ser Tyr Lys Cys Ala Cys Pro Ser Gly Phe Ser Phe Asp Gln 2675 2680 2685 Phe Ser Ser Ala Cys His Asp Val Asn Glu Cys Ser Ser Ser Lys 2690 2695 2700 Asn Pro Cys Asn Tyr Gly Cys Ser Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Leu 2705 2710 2715 Cys Gly Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Arg Val Gly Gln Gly His Cys 2720 2725 2730 Val Ser Gly Met Gly Phe Asn Lys Gly Gln Tyr Leu Ser Leu Asp 2735 2740 2745 Thr Glu Val Asp Glu Glu Asn Ala Leu Ser Pro Glu Ala Cys Tyr 2750 2755 2760 Glu Cys Lys Ile Asn Gly Tyr Ser Lys Lys Asp Ser Arg Gln Lys 2765 2770 2775 Arg Ser Ile His Glu Pro Asp Pro Thr Ala Val Glu Gln Ile Ser 2780 2785 2790 Leu Glu Ser Val Asp Met Asp Ser Pro Val Asn Met Lys Phe Asn 2795 2800 2805 Leu Ser His Leu Gly Ser Lys Glu His Ile Leu Glu Leu Arg Pro 2810 2815 2820 Ala Ile Gln Pro Leu Asn Asn His Ile Arg Tyr Val Ile Ser Gln 2825 2830 2835 Gly Asn Asp Asp Ser Val Phe Arg Ile His Gln Arg Asn Gly Leu 2840 2845 2850 Ser Tyr Leu His Thr Ala Lys Lys Lys Leu Met Pro Gly Thr Tyr 2855 2860 2865 Thr Leu Glu Ile Thr Ser Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Lys Glu Leu 2870 2875 2880 Lys Lys Leu Glu Glu Ser Asn Glu Asp Asp Tyr Leu Leu Gly Glu 2885 2890 2895 Leu Gly Glu Ala Leu Arg Met Arg Leu Gln Ile Gln Leu Tyr 2900 2905 2910

Claims (15)

  1. 생체인공 폐 장기를 제공하는 방법으로서,
    인간 공여자, 바람직하게는, 공여자의 기도로부터 수득된 증식성 기저 줄기 세포의 집단을 제공하는 단계로서, 세포는 Krt5+p63+ 세포인 단계;
    임의적으로, 5회 이하의 계대배양(바람직하게는, 세포는 60-100%, 바람직하게는, 80% 컨플루언시(confluency)로 계대배양됨)으로 배양물에서 임의적으로, ROCK 억제제의 부재하에 세포를 유지하고 확장시키는 단계;
    기도 및 실질적인 맥관구조를 포함하는 (무세포) 폐 조직 기질을 제공하는 단계;
    기도를 통해 줄기 세포 및 맥관구조를 통해 내피 세포를 폐 조직 기질에 시딩하는 단계; 및
    기도에서 기능성 상피 및 기능성 맥관구조의 형성에 충분한 조건하에 기질을 유지시키는 단계로서, 기질 유지가, 제1의 요망되는 장기 성숙 정도가 발생하기에 충분한 시간 동안 노치(notch) 억제제, 바람직하게는, 감마 분비효소 억제제를 포함하는 액체 배지를 사용하여 습식 환기를 폐 조직 기질에 제공하여 습식-성숙한 장기를 생성시키고; 임의적으로, 습식 환기 동안 장기 챔버에서 실질적으로 일정한 유체 수준을 유지하는 것을 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 장기 챔버가 챔버 압력 센서에 의해 송신된 데이터에 반응하여 양방향 배수 펌프를 제어하는 제어 모듈에 의해 각각 제어되는 양방향 배수 챔버 펌프 및 챔버 압력 센서를 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 정맥 라인의 압력 수준을 배지 저장소의 압력 수준과 평형을 이루게 함으로써 경폐압 구배를 방지하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 장기 챔버가 장기 챔버에 연결된 공압 제어 모듈을 추가로 포함하며, 공압 제어 모듈은
    흡기 단계(inspiration phase) 동안 장기 챔버에서 음압을 발생시키고;
    고조기(plateau phase) 동안 장기 챔버 압력을 유지하고;
    호기 단계(expiration phase) 동안 장기 챔버에서 양압을 발생시키는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 습식 환기가
    기관 라인을 배지 저장소에 연결시키는 단계로서, 기관 라인은 제어기에 연결된 양방향 기관 펌프를 포함하는 단계;
    양방향 기관 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 배지로 팽창시키는 단계; 및
    양방향 기관 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 수축시켜 폐 조직 기질로부터 배지를 회수하는 단계를 포함하며,
    배지는 습식 환기 동안 연속적으로 새로 공급(refresh)되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 습식 환기가
    기관 라인을 배지 저장소에 연결시키는 단계로서, 기관 라인은 제어기에 각각 연결된 제1 펌프 및 제2 펌프를 포함하는 단계;
    제1 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 배지로 팽창시키는 단계; 및
    제2 펌프를 사용하여 폐 조직 기질을 수축시켜 폐 조직 기질로부터 배지를 회수하는 단계를 포함하며,
    배지는 습식 환기 동안 연속적으로 새로 공급되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제어기가 기관 라인에 연결된 기관 압력 센서에 의해 송신된 데이터에 반응하여 양방향 기관 펌프를 제어하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 2, 5, 7 또는 10일 동안 노치 억제제를 포함하는 액체 배지를 사용하여 습식 환기를 제공하고, 임의적으로 그 후, 노치 억제제를 포함하지 않는 액체 배지를 사용하여 추가의 습식 환기를 수행하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 폐 조직 기질이 외인적으로 첨가된 테나스신-c 및/또는 외인적으로 첨가된 피브릴린-2 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 시딩 전에 폐 조직 기질을 테나스신-c 또는 피브릴린-2 중 하나 또는 둘 모두와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 기능성 폐.
  12. 제11항에 있어서, 장기가 전체 폐 또는 이의 맥관화된 부분인, 기능성 폐.
  13. 손상되거나 감소된 폐용량을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제11항의 폐를 대상체에 이식하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 손상되거나 감소된 폐용량을 갖는 대상체를 치료하는 방법에서 제11항의 기능성 폐의 용도.
  15. 제11항에 있어서, 손상되거나 감소된 폐용량을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 기능성 폐.
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