JP2021176319A - 機能的肺血管床の再生 - Google Patents
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Abstract
Description
数は増加する需要に一致しない一方、慢性免疫抑制および拒絶の効果が長期転帰を制限す
る。肺移植のための典型的な待機時間は2年以上であり得、待機リスト上の者について3
0%の致死率をもたらす。
に内皮および血管周囲細胞を再増殖させ、多段階培養プログラムを使用して肺血管床を成
熟させることにより機能的肺血管床を再生し得るデバイス(例えば、バイオリアクター)
および方法の開発に基づく。実施態様としては、以下の特徴部の1つ以上を挙げることが
できる。
細胞を肺足場に送達すること;および多段階培養プログラムを足場に提供することを含み
、多段階培養プログラムは、40〜100ng/mlの血管新生促進因子を有する血管新
生培地を送達することを含む第1の段階、ならびに0.5〜2%の血清および1〜20n
g/mlの血管新生因子を有する安定化培地を送達することを含む第2の段階を含む血管
再生の方法が提供される。
G1、EGFおよびPDGFの少なくとも1つ以上、例えば、2、3、4、または5つ全
てを含む。
ンの少なくとも1つを含む。
持することを含み、バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含む。
一部の実施形態において、肺足場は、気道および血管系を含み、方法は、気道を気管経路
に接続すること;肺足場を動脈経路および静脈経路に接続すること;ならびに肺足場に動
脈経路および静脈経路を介して細胞を播種することを含む。
第1の段階の間に血管新生培地を肺足場に送達すること;および第2の段階の間に安定化
培地を肺足場に送達することを含み得る血管再生の方法も提供される。
持することを含み、バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含み、
HUVECおよび血管周囲支持hMSCを動脈経路および静脈経路に通して送達する。
周囲細胞を分化させる方法が提供される。方法は、hiPSCを少なくとも1つのGSK
3阻害剤の存在下で培養すること;hiPSCを完全分化培地の存在下で培養すること;
hiPSCをTGF−β1阻害剤が補給された分化培地により培養すること;およびhi
PSC由来血管周囲前駆細胞(hiPSC−PPC)とhiPSC由来内皮細胞(hiP
SC−EC)とを分離することを含む。
ある。一部の実施形態において、少なくとも1つのTGF−β1阻害剤は、SB4315
42である。
含む。
D31およびVE−カドヘリン発現により定義される内皮被覆の増加のプラトーを計測す
ることを含む。
する。一部の実施態様において、機器および/またはシステムは、記載の方法を実施する
ためのコンピュータ制御を含む制御システムを含み得る。制御システムは、1つ以上のプ
ロセッサに連結しており、保存される指示を有する非一時的コンピュータ可読保存媒体を
含み得、1つ以上のプロセッサにより実行された場合、1つ以上のプロセッサに、上記実
施態様または本明細書に記載の実施形態のいずれか1つに従って血管再生のための動作を
実施させる。
流から空気中への二酸化炭素の放出、吸入空気の加湿、肺胞中の表面張力を減少させるた
めのサーファクタントの産生、ならびに吸入された粒子状物質を末梢気道から近位気道に
除去するための粘液の産生および輸送を可能とすることを含む正常健康肺の機能のほとん
どまたは全てを実行する。一部の実施形態において、「機能的」肺組織は、少なくとも、
空気から血流中への酸素の輸送および血流から空気中への二酸化炭素の放出を可能とする
。
染色手順を使用する組織学的切片中の検出可能な細胞内物質、内皮細胞、上皮細胞、およ
び核の完全またはほぼ完全な不存在として使用または定義される。好ましくは、必須では
ないが、脱細胞化臓器または組織から残留細胞残屑も除去されている。
マトリックス足場の血管再生を改善するための特定の利点を有し得る。例えば、ある実施
態様は、細胞、例えば、内皮細胞または前駆細胞を、肺動脈および肺静脈の両方に通して
送達し、慣用の動脈内皮送達方法から得られるものよりも2倍の内皮被覆をもたらし得る
一方、肺全体にわたる均一な内皮被覆も提供する方法を提供し得る。他の例において、あ
る実施態様は、血管新生培地とそれに続く安定化培地を含み得る2段階臓器培養プログラ
ムを提供し得る。この多段階組合せは、最初に効率的な内皮リモデリングを促進し、次い
で血管安定化および障壁機能の機能性を促進するのに役立ち得る。2段階培養プログラム
は、患者由来細胞源と組み合わせて臨床関連細胞源を使用して機能的肺血管系を生成する
ことができる。
明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に
記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用す
ることができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。本明細書において挙げら
れる全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照により全体として組み
込まれる。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めて優先される。さらに、材料、方法お
よび実施例は説明のためのものにすぎず、限定するものではない。
明らかである。
肺足場の血管コンパートメントに内皮および血管周囲細胞を再増殖させ、多段階培養プロ
グラムを使用して肺血管床を成熟させることにより機能的肺血管床を再生し得るデバイス
(例えば、バイオリアクター)および方法の開発が、本明細書に記載される。
供される方法に従って生成または再生することができる。一部の実施形態において、方法
は、本明細書において提供される生体人工肺組織をそれが必要とされる対象(例えば、ヒ
ト患者)に移植することを含む。一部の実施形態において、生体人工肺組織は、疾患また
は損傷組織の部位に移植される。例えば、生体人工肺組織は、非機能的または機能不十分
の肺に代えて(またはそれとともに)対象の胸腔中に移植することができ;肺移植を実施
する方法は当技術分野において公知であり、例えば、Boasquevisque et
al.,Surgical Techniques:Lung Transplant
and Lung Volume Reduction,Proceedings o
f the American Thoracic Society 6:66−78(
2009);Camargo et al.,Surgical maneuvers
for the management of bronchial complica
tions in lung transplantation,Eur J Card
iothorac Surg 2008;34:1206−1209(2008);Yo
shida et al.,“Surgical Technique of Expe
rimental Lung Transplantation in Rabbits
,”Ann Thorac Cardiovasc Surg.11(1):7−11(
2005);Venuta et al.,Evolving Techniques
and Perspectives in Lung Transplantation
,Transplantation Proceedings 37(6):2682−
2683(2005);Yang and Conte,Transplantatio
n Proceedings 32(7):1521−1522(2000);Gais
sert and Patterson,Surgical Techniques o
f Single and Bilateral Lung Transplantat
ion in The Transplantation and Replaceme
nt of Thoracic Organs,2d ed.Springer Net
herlands(1996)参照。
は肺切除の間に本明細書において提供される生体人工肺またはその一部を移植することを
含み得る。方法は、生存ドナーまたは死体から肺またはその一部を回収することおよび本
明細書に記載のバイオリアクター中で肺を保存または再生することも含み得る。一部の場
合、本明細書において提供される方法を使用して対象、例えば、ヒトまたは動物対象にお
ける肺組織および機能を置き換え、または補給することができる。
脱細胞化肺組織マトリックスを調製するための種々の方法および材料が存在する。任意
の適切な材料を使用してそのようなマトリックスを調製することができる。ある実施形態
において、組織マトリックスは、脱細胞化肺組織から発生させた無細胞組織足場であり得
る。例えば、組織、例えば、ヒト肺、例えば、ヒト肺またはその一部の1つまたはペア、
例えば、ヒト、ブタ、ウシ、霊長類、または鳥類死体肺またはその一部を、組織から天然
細胞を除去する一方、組織または組織部分の形態統合性および血管系を維持し、細胞外マ
トリックス(ECM)タンパク質を保存するために適切な方法により脱細胞化することが
できる。哺乳動物肺組織を脱細胞化する方法は、例えば、O’Neill JD et
al.,Decellularization of human and porci
ne lung tissues for pulmonary tissue eng
ineering.Ann Thorac Surg.2013 Sep;96(3):
1046−55;Nichols JE et al.,Production and
assessment of decellularized pig and hu
man lung scaffolds,Tissue Eng Part A.201
3 Sep;19(17−18):2045−62;Gilpin SE et al.
,Perfusion decellularization of human an
d porcine lungs:Bringing the matrix to c
linical scale.Journal of Heart and Lung
Transplantation.In press;Song JJ et al.,
Bioartificial lung engineering.Am J Tran
splant.2012 Feb;12(2):283−8;Guyette,J.P.
et al.Perfusion decellularization of who
le organs.Nat Protoc 9,1451−1468(2014)、お
よびOtt HC et al.,Regeneration and orthoto
pic transplantation of a bioartificial l
ung.Nat Med.2010 Aug;16(8):927−33に記載されてい
る。例示的な脱細胞化法は、組織(例えば、肺組織)を、例えば、液体窒素を使用する反
復冷凍−解凍サイクルに供することを含み得る。他の場合、組織をアニオン性またはイオ
ン性細胞破壊培地、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ポリエチレングリコー
ル(PEG)、またはTritonXに供することができる。組織は、ヌクレアーゼ溶液
(例えば、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ)により処理し、滅菌リン酸緩
衝生理食塩水中で穏やかに撹拌しながら洗浄することもできる。例示的な方法は、当技術
分野において公知であり、例えば、O’Neill JD et al.,Decell
ularization of human and porcine lung ti
ssues for pulmonary tissue engineering.A
nn Thorac Surg.2013 Sep;96(3):1046−55。一部
の場合、脱細胞化は、当技術分野において公知の方法および材料を使用して臓器または組
織の血管、管、および/または空洞をフラッシュすることにより実施することができる。
例えば、Maghsoudlou P et al.,Preservation of
micro−architecture and angiogenic poten
tial in a pulmonary acellular matrix obt
ained using intermittent intra−tracheal
flow of detergent enzymatic treatment.Bi
omaterials.2013 Sep;34(28):6638−48に記載のとお
りである。フラッシュ工程に続き、臓器または組織に、経路を介して上記の細胞破壊培地
、例えば、脱イオン水中1%のSDSを灌流させることができる。組織に通す灌流は、順
行性または逆行性であり得、方向性を入れ替えて灌流効率を改善することができる。臓器
または組織のサイズおよび重量、ならびに特定のアニオン性またはイオン性洗浄剤および
細胞破壊培地中のアニオン性またはイオン性洗浄剤の濃度に応じて、組織には、一般に、
細胞破壊培地を組織10グラム当たり約2〜約12時間灌流させる。洗浄を含め、臓器に
は、組織10グラム当たり最大約12〜約72時間灌流させることができる。灌流は、一
般に、流量および圧力を含む生理学的条件、例えば、5〜100mmHgの圧力、および
資源生物または個体の生理学的心拍出量の0.1〜10倍の流量に調整する。
2)2%のデオキシコール酸ナトリウム(SDC)、または(3)8mmol/リットル
の(3)3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスル
ホネート(CHAPS)(pH12)洗浄剤を30cmH2Oの定圧において肺動脈に通
して灌流させることを含む。3つ全ての洗浄剤についてのプロトコルは、以下を含む:
1.リン酸緩衝生理食塩水(PBS)による10分間の初回順行洗浄、
2.混濁半透明マトリックス(脱細胞化を示す)を可視化するために要求される時間とそ
の初回時間の追加の20%(例えば、70分+14分)にわたる洗浄剤灌流、
3.15分間の脱イオンH2O洗浄、および
4.抗菌薬および抗真菌薬を添加する追加の172時間のPBS洗浄。
浄を含み得る。SDCプロトコルは、SDC前の0.1%のTriton−X灌流および
SDC後の1mol/リットルのNaCl洗浄を含み得る。
脱細胞化剤の灌流と、それに続くH2O、1%のTriton−X溶液、およびPBSに
よる連続洗浄を含み得る。ラット肺と同様に、脱細胞化は、混濁半透明マトリックスの目
視調査および外観に基づき完了したとみなすことができる。出発臓器の変動性は、主に回
収の間の予備フラッシュの拡張性に起因し、任意の得られる塊状物は、要求される灌流の
長さに寄与し得る。一般に、脱細胞化灌流の時間は、例えば、4〜7日間で変動し得る。
どの領域の細胞外マトリックス(ECM)構成成分からなり得る(例えば、少なくとも8
5%純粋、90%純粋、92%純粋、95%純粋、96%純粋、97%純粋、98%純粋
、および99%純粋、重量基準)。ECM構成成分は、以下のいずれかまたは全てまたは
以下の任意の組合せを含み得る:明確な構造、例えば、基底膜として組織化されたままで
あり得るフィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリ
ーのメンバー(例えば、コラーゲンI、III、およびIV)、グリコサミノグリカン、
基質、細網線維およびトロンボスポンジン。ある実施形態において、脱細胞化肺組織マト
リックスは、インタクトな脱細胞化血管系を保持する。実質的にインタクトな脱細胞化血
管系の保存は、移植時における対象の血管系への組織マトリックスの接続を可能とする。
さらに、脱細胞化組織マトリックスは、例えば、照射(例えば、UV、ガンマ)によりさ
らに処理して脱細胞化組織マトリックス上またはその中に残留するあらゆるタイプの微生
物の存在を低減させ、または排除することができる。
当技術分野において公知であり、例えば、Liao et al,Biomateria
ls 29(8):1065−74(2008);Gilbert et al.,Bi
omaterials 27(9):3675−83(2006);Teebken e
t al.,Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.19:381−86
(2000)参照。米国特許出願公開第2009/0142836号明細書;同第200
5/0256588号明細書;同第2007/0244568号明細書;および同第20
03/0087428号明細書も参照。
本明細書に記載の生体人工肺組織(例えば、全臓器またはその一部)は、肺組織成長、
保存、修復、改変、またはそれらの組合せに寄与する現実的な環境を提供するように構成
されたバイオリアクターを使用して生成することができる。例示的な気道臓器バイオリア
クターを図1〜3に提示する。本明細書全体にわたり、肺は、臓器または気道臓器の一例
として提供する。他の例は、階層血管系構造、例えば、葉または区域を含む肺の一部を含
み得る。図1〜3に提示される例示的なバイオリアクターは、生存ドナーまたは死体から
回収された肺を支持し得る。本明細書に記載のバイオリアクターのいずれも、伏臥位での
肺の培養を許容するように構成することができる。
ュベーターチャンバ102、培地容器103、動脈灌流ポンプ104、排出ポンプ105
、動脈圧センサ106、チャンバ圧センサ107、気管圧センサ108、静脈圧センサ1
09、動脈経路110、静脈経路111、気管経路112、滅菌フィルタ113、酸素供
給器114、制御モジュール115、静脈弁116、フィルタ閉塞器117、平衡化経路
118、経肺圧制御(PPC)モジュール300、および陽圧マニホールド(PPM)2
00を含む。
ックス中での播種細胞の成長を可能とする。灌流は、肺動脈への動脈経路110に通して
、および肺静脈への静脈経路111に通して行う。この構成は、細胞および培地が動脈側
および静脈側の両方から毛細血管床に到達するのを許容し、培地が無細胞基底膜を通り拡
散し、気管を介して、または胸膜を通過してマトリックスを流出するのを許容する。
して流動する。再循環させるため、培地は酸素供給器114を通過する。酸素供給された
培地は、動脈灌流ポンプ104を通り流動する。このポンプは、動脈圧センサ106およ
び静脈圧センサ109それぞれからの圧力測定値に基づき速度を制御する制御モジュール
115により制御される。動脈および静脈灌流圧を細胞のサイズおよび数に基づき改変し
て細胞送達を最適化することができる。制御モジュール115はまた、データ(例えば、
動脈圧センサ106、および静脈圧センサ109からの抵抗測定値を記録し得る。培地は
回路を完了し、動脈経路110に戻る。初回順行播種の間、培地は、その毛細血管床への
到達前または到達時に肺マトリックスを通り拡散する。培地を足場に通してガイドするた
め、陽圧マニホールド200は、肺内圧を改変し得る。一部の場合、逆行播種を使用する
ことができる。
管耐性は、肺マトリックスの再内皮化に起因して増加する)、バイオリアクター100は
順行灌流に切り替わる。血管系耐性は、動脈圧センサ106により経時的に計測される。
血管系が集合した場合、血管膜を通過する拡散は減少し、動脈センサ106により計測さ
れる圧力の増加(すなわち、血管耐性の増加)をもたらす。一部の例において、粒子(例
えば、マイクロスフェア)をバイオリアクター100に通して灌流させ、その進行をモニ
タリングして血管膜を通過する拡散率を測定する。
スは、肺チャンバ101中に配置される。流動灌流系は、肺の肺動脈に接続された動脈経
路110を使用する。培地は培地容器103により吸引され、酸素供給器114を通過す
る。酸素供給器114は、空気とインキュベーターチャンバ102を包囲する環境とを交
換する。酸素供給器114を通り通過した後、動脈圧センサ106は動脈圧を記録し、こ
のデータを制御モジュール115に伝送する。次いで、動脈圧測定値は、容器から肺動脈
に培地をポンプ輸送するローラーポンプを調節する。次いで、培地は退出経路を通り肺チ
ャンバ101の外を循環し、排出ポンプ105を使用して培地容器103中にポンプ輸送
される。排出ポンプ105は二方向性であり、それを使用して培地を培地容器103およ
び肺チャンバ101間で循環させることができる。この再循環は、肺チャンバ101中の
正確なpHを維持するためにも役立つ。制御モジュール115は、チャンバ圧センサ10
7に記録された圧力測定値に基づき排出ポンプ105、例えば、速度および/または方向
を制御する。肺チャンバ101中のチャンバ圧が変動する場合、液体は気管経路112中
および外を流動する。静脈経路111は培地容器103に対して開口しているため、静脈
圧は、チャンバ圧に平衡化し、したがって、動脈から組織中への流体の流動をもたらし得
る経肺圧勾配を防止する。チャンバ圧をモニタリングし、それに応じてポンプ輸送するこ
とにより、肺チャンバ101中の培地レベルを維持することができる。
センサ109も含む。気管圧センサ108は、気道(例えば、気管)内の圧力を計測する
。
103との間の培地交換率を能動的にモニタリングし得る。系中への静脈の後負荷は、静
脈弁116が閉口された場合に容器のレベルにより、または開口位置である場合に静脈弁
116に取り付けることができる抵抗弁により制御される。例えば、静脈弁116は、一
般に開口位置である。低い圧力測定値(例えば、<−5mmHg)は、静脈弁116の閉
口を誘発し得(例えば、自動的または操作者による)、したがって、より多くの静脈背圧
を提供して後毛細血管の血管虚脱を防止する。圧力測定値が高い場合(例えば、>20m
mHg、静脈弁116は開口して静脈の後負荷を低減させ、間質腔および気道中への流体
移動を最小化し得る。
周囲環境(例えば、インキュベーターチャンバ102)と平衡化される。この交換は、イ
ンキュベーターチャンバ102と培地容器103との間の気体(例えば、二酸化炭素)の
交換も許容し、それは系中の培地の適切なpH値を維持するために役立つ。培地容器10
3の高さは、肺チャンバ101の高さに対して調整することができる。これは、陽圧湿式
呼吸圧(positive wet respiratory pressure)をも
たらし、肺に関する気管気道内圧に影響する。例えば、培地容器103は、培地中に浸漬
させた肺よりも4cm高く設定される。これは、陽圧気道内圧をもたらす。
する生理学的範囲内である。例えば、動脈範囲は平均10〜35mmHgであり得、肺チ
ャンバ101は平均−40〜40mmHgであり得る。
の間の圧力平衡化経路118は、肺チャンバ101と培地容器103との間の圧力を平衡
化する。これは、呼吸サイクルの全ての段階の間の両方のチャンバにわたる等しい圧力を
確保する。この改変は、本明細書において考察される全てのバイオリアクター(小型動物
および大型動物/ヒトの両方)に適用することができ、陽圧および陰圧換気モードならび
に湿式および乾式換気(wet and dry ventilation)モードの両
方で使用することができる。この圧力平衡化経路118の導入は、二方向性経肺勾配の作
出を可能とする。換言すると、肺は、Ppm200を介して内側から圧縮し(それにより
、陽圧気道内圧を作出する)、PPCモジュール300を介して外側から圧縮することが
できる(それにより、陽圧チャンバ圧を作出する)。
とおよび間質液を血管系中に押圧し、したがって、肺機能(例えば、コンプライアンス、
拡散、重量およびサイズ)を改善することにより既に形成された浮腫(例えば、既に損傷
した肺中のもの)を治療することである。この勾配は、静脈圧をチャンバ圧に対して調整
することができる場合に達成することができる。培地容器103の高さを調整し、それに
より静脈カニューレ中の水柱の高さを調整し、肺静脈を培地容器103に戻して排出させ
ることにより、静脈圧をチャンバ圧よりも高いまたは低い一定レベルに保持することがで
きる。本質的には、2つのチャンバ間の平衡化は、陰圧換気の間の一定肺静脈排出を可能
とする。対照的に、平衡化が維持されず、Pvが一定に保持される場合、肺チャンバ10
1中の陰圧は、静脈流中の静脈排出または逆流(例えば、部分的または完全)の減少をも
たらす一方、肺チャンバ101中の陽圧は、肺静脈を崩壊させ、流出障害をもたらす。
たりバイオリアクター100が陰圧換気を生成し、陽圧気道内圧を生成および維持するこ
とを可能とする(気管経路112を介する)。バイオリアクター100は、さらに、大型
マトリックスサイズ(例えば、ヒト成人肺およびヒト幼児肺)に適合するように、ならび
に平衡化経路118およびフィルタ閉塞器117の追加に起因する長期培養のために構成
される。
1に示される気管経路112の一部)、圧力容器302、圧力放出弁301、圧縮器30
3(例えば、加圧気体源)、インフレータブル呼吸バッグ306、およびマニホールド圧
センサ308を含む。気管経路304は、肺の気道に接続されている(示さず)。圧縮器
303は陽圧を圧力容器302に提供し、圧力容器302中の圧力レベルは圧力放出弁3
01により改変することができる(例えば、圧力を低減させることができる)。ある実施
形態において、陽圧マニホールド200は、気道中の吸気および呼気関連圧力変動(例え
ば、気管圧センサ108により、またはマニホールド圧センサ308により記録される)
に応答して圧力容器302中の圧力を能動的に調節するコンピュータ化システムである。
インフレータブル呼吸バッグ306は、圧力容器302に取り付けられており、吸気およ
び呼気の間の急激な体積変化を調整する一方、チャンバ、気管、および肺中の圧力を一定
に保持する。インフレータブル呼吸バッグ306の体積は、培養されている肺のサイズに
応じて変動し得る。例えば、インフレータブル呼吸バッグ306の体積は、250cc〜
4000cc、少なくとも250cc、4000cc未満、300cc〜3500cc、
400cc〜3000cc、500cc〜2500cc、600cc〜2000cc、7
00cc〜1500cc、および800cc〜1000ccであり得る。インフレータブ
ル呼吸バッグ306の材料は、任意のフレキシブルな空気不透過性および滅菌可能な材料
(例えば、ラテックスまたはゴム)であり得る。マニホールド圧センサ308は、呼気終
末圧のモニタリングおよび換気経路における流動計算の実現の両方を容易にする。
および呼気圧放出弁326も含み得る。気管経路304は、肺の気道に接続されている(
示さず)。図3Aを参照して記載されるとおり、圧縮器303は陽圧を圧力容器302に
提供し、圧力容器302中の圧力レベルを圧力放出弁324により改変することができる
(例えば、圧力を低減させることができる)。気管経路304は、吸気弁322および呼
気弁324にも接続されている。吸気弁322および呼気弁324は、流体、例えば、空
気が一方向で流動することを可能とし、逆流を防止する一方向弁である。呼気段階の間、
空気は気管経路304から呼気弁324および呼気圧弁326を通り排出系統(示さず)
に流動する。呼気流体は、吸気弁322に起因して圧力容器301には流入しない。吸気
段階の間、空気は圧力容器から吸気弁322を通り気管経路304を介して肺の気道に流
動する。呼気圧放出弁324は、呼気経路が吸入段階の間に陽圧を保持することを確保し
、したがって、空気が吸入段階の間に呼気経路を通り流動するのを防止する。
705、入口圧縮器701、入口経路707、出口圧力弁704、出口圧力容器706、
出口圧縮器702、出口経路708、およびPPC制御器709を含む。入口経路707
および出口経路708は、チャンバ圧センサ710を含む肺チャンバ101に接続されて
いる。入口および出口圧縮器701、702は、入口および出口圧力容器705、706
に気体(例えば、空気)を入れる。入口および出口圧力弁703、704(例えば、ソレ
ノイド弁)ならびに入口および出口圧縮器701、702は、PPC制御器709により
制御される。吸気段階の間、出口弁704は開口し、肺チャンバ101中で陰圧を生成す
る。陰性目標圧がチャンバ圧センサ710により記録されると(例えば、−20cmH2
O)、出口弁704は閉口する。チャンバ圧力は、吸気および呼気の間で−50〜+10
0cmH2Oの範囲であり得る。肺コンプライアンスが正常肺のものに接近すると、チャ
ンバ圧は、胸腔内圧の生理学的範囲(例えば、−10〜+25cmH2O)をより厳密に
模倣する。適切なプラトー段階後、入口圧力弁703が開口し、肺チャンバ101内側で
陽圧の生成を可能とする呼気段階が開始する。陽圧目標圧がチャンバ圧センサ710によ
り記録されると(例えば、25cmH2O)、入口弁703が閉口する。入口および出口
圧力容器705、706は、肺チャンバ101中の圧力の急速な調整を可能とするように
適切にサイズ化される。入口および出口圧力容器705、706は、入口または出口圧縮
器701、702により生成される振動アーティファクトを防止し、および/または低減
させる。一部の実施形態において、圧力平衡の傾きは、入口経路707および/または出
口経路708中に配置される追加の抵抗弁(示さず)により調整することができる。換気
は圧力制御(PC)または体積制御(VC)することができる。
605号明細書(2015年3月13日出願、表題Lung Bioreactor)、
および米国特許第9,005,885号明細書(2/24/2012年2月24日出願、
表題Bioartificial Lung)(それらの内容は、参照により全体として
本明細書にそれぞれ組み込まれる)に記載されている。
本明細書に記載の方法の一部において、肺組織マトリックス、例えば、脱細胞化肺組織
マトリックスまたは人工肺マトリックスに、細胞、例えば、分化または再生可能な細胞を
播種する。
して肺組織マトリックスに播種することができる。細胞は、種々のステージ、例として、
限定されるものではないが、幹細胞ステージ(例えば、誘導後)、前駆細胞ステージ、血
管芽細胞ステージ、または分化ステージ(例えば、CD31+、vWF+、CD140b
+)において播種することができる。本明細書において使用される再生可能な細胞として
は、限定されるものではないが、前駆細胞、プレカーサー細胞、および「成体」由来幹細
胞、例として、臍帯細胞(例えば、ヒト臍静脈内皮細胞)、胎盤由来細胞、および胎児幹
細胞を挙げることができる。再生可能な細胞としては、分化または委任細胞タイプを挙げ
ることもできる。本明細書において提供される方法および材料に適切な幹細胞としては、
ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)および誘導体(例えば、未分化、分化内胚葉、前方化
内胚葉、TTF−1陽性肺前駆細胞、内皮前駆細胞、および中胚葉性前駆細胞、血管周囲
細胞、筋肉前駆細胞)、ヒト間葉幹細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、多能性成体前駆細胞(M
APC)、iPS由来間葉細胞、または胚性幹細胞を挙げることができる。一部の場合、
他の組織に由来する再生可能な細胞を使用することもできる。例えば、皮膚、骨、筋肉、
骨髄、滑膜、胎盤、または脂肪組織に由来する再生可能な細胞を使用して幹細胞播種組織
マトリックスを発生させることができる。
らに分化細胞タイプ、例えば、(好ましくは、ヒト)上皮細胞および内皮細胞を播種する
ことができる。例えば、肺マトリックスに、血管系を介して(例えば、動脈経路110、
静脈経路111、または動脈経路110および静脈経路111の両方に通して)内皮細胞
を播種し、気道を介して(例えば、気管経路112に通して)上皮細胞を播種することが
できる。肺マトリックスに、1つ以上の細胞タイプ(例えば、上皮および間葉細胞、成体
末梢血由来内皮細胞、臍帯血由来内皮細胞、iPS由来上皮および内皮細胞、前駆段階の
細胞(例えば、平滑筋)、成体肺由来細胞混合物(例えば、ラットヒト)、市販の末梢気
道上皮細胞または肺胞上皮細胞、胚性幹(ES)細胞由来上皮細胞、および/またはヒト
臍静脈内皮細胞(HUVEC)のタイプの1つ以上)を播種することもできる。
の送達は、細胞分布および分布を改善するために役立つ。例えば、肺チャンバ101内で
、細胞マトリックスに細胞および培地を順行灌流させて肺マトリックス上での播種細胞の
成長を可能とする。灌流は、肺動脈への動脈経路110に通して、および肺静脈への静脈
経路111に通して行う。この構成は、細胞および培地が動脈側および静脈側の両方から
毛細血管床に到達するのを許容し、培地が無細胞基底膜を通り拡散し、気管を介して、ま
たは胸膜を通過してマトリックスを流出するのを許容する。
上記の細胞タイプおよび細胞密度を灌流播種により播種することができる。例えば、流動
灌流系を使用して組織マトリックス中で保存される血管系を介して(例えば、動脈経路1
10に通して)肺チャンバ101内で脱細胞化肺組織マトリックスに播種することができ
る。一部の場合、自動化流動灌流系を適切な条件下で使用することができる。このような
灌流播種法は播種効率を改善し、組成物全体にわたる細胞のより均一な分布を提供し得る
。定量的生化学的および画像分析技術を使用して静置または灌流播種法に続く播種細胞の
分布を評価することができる。細胞は、動脈および静脈経路を介して(内皮細胞)または
気道(気管)経路に通して(上皮細胞)マトリックス中に導入することができる。組織マ
トリックスに、少なくとも1つの細胞タイプをインビトロで任意の適切な細胞密度におい
て播種することができる。マトリックスの播種のための細胞密度は、少なくとも1×10
3個の細胞/マトリックス1グラムであり得る。細胞密度は、約1×105〜約1×10
10個の細胞/マトリックス1グラム(例えば、少なくとも100,000、1,000
,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,00
0、または10,000,000,000個の細胞/マトリックス1グラム)の範囲であ
り得、それを使用することができる。
上記の細胞タイプおよび細胞密度を灌流播種により播種することができる。例えば、流動
灌流系を使用して組織マトリックス中で保存される血管系を介して(例えば、動脈経路1
10に通して)脱細胞化肺組織マトリックスに播種することができる。一部の場合、自動
化流動灌流系を適切な条件下で使用することができる。このような灌流播種法は播種効率
を改善し、組成物全体にわたる細胞のより均一な分布を提供し得る。定量的生化学的およ
び画像分析技術を使用して静置または灌流播種法に続く播種細胞の分布を評価することが
できる。
な細胞の分化を刺激することができる。例えば、組織マトリックスに、本明細書において
提供される方法および材料に適切な成長因子、例えば、血管内皮成長因子(VEGF)、
TGF−β成長因子、骨形成タンパク質(例えば、BMP−1、BMP−4)、血小板由
来成長因子(PDGF)、塩基性線維芽細胞成長因子(b−FGF)、例えば、FGF−
10、インスリン様成長因子(IGF)、上皮成長因子(EGF)、または成長分化因子
−5(GDF−5)を含浸させることができる。例えば、Desai and Card
oso,Respire.Res.3:2(2002)参照。これらの成長因子をカプセ
ル封入して時間的放出を制御することができる。足場の異なる部分を異なる成長因子によ
り向上させて成長因子刺激の空間的制御を追加することができる。
インキュベートして組織マトリックス中の細胞の固定および透過を改善することができる
。播種された組織マトリックスは、再生可能な細胞の少なくとも一部が無細胞組織マトリ
ックス内またはその上で増殖および/または分化し得る条件下で維持することができる。
このような条件としては、限定されるものではないが、適切な温度(35〜38摂氏度)
および/または圧力(例えば、大気圧)、電気的および/または機械的活動(例えば、1
〜20cmH2Oの呼気終末陽圧、5〜50cmH2Oの平均気道内圧、および5〜65
cmH2Oのピーク吸気圧を伴う陽圧または陰圧を介する換気)、適切量の流体、例えば
、O2(1〜100%のFiO2)および/またはCO2(0〜10%のFiCO2)、
適切量の湿度(10〜100%)、ならびに滅菌または準滅菌条件を挙げることができる
。このような条件としては、湿式換気、湿式乾式換気(wet to dry vent
ilation)および乾式換気を挙げることもできる。一部の場合、栄養サプリメント
(例えば、栄養素および/または炭素源、例えば、グルコース)、外因性ホルモン、また
は成長因子を播種された組織マトリックスに添加することができる。組織学的検査および
細胞染色を実施して播種細胞繁殖をアッセイすることができる。任意の適切な方法を実施
して播種細胞分化についてアッセイすることができる。一般に、本明細書に記載の方法は
、例えば、本明細書に記載の気道臓器バイオリアクター機器中で実施される。
ラフトのいずれかとしてガス交換を患者に提供し得る肺を生成することができる。本明細
書に記載のとおり、移植可能な組織は、好ましくは、患者の血管系に接続することができ
る十分にインタクトな血管系を保持する。
することができる。製品を生産するための構成要素および方法が存在する。生体人工組織
に加えて、製品またはキットは、例えば、1つ以上の接着防止剤、滅菌水、医薬担体、緩
衝液、ならびに/またはインビトロでおよび/もしくは移植後に機能的肺組織の発生を促
進するための他の試薬をさらに含み得る。さらに、それに含有される組成物をいかに使用
することができるかを記載する印刷説明書をそのような製品中に含めることができる。製
品またはキットの構成要素は、種々の好適な容器中で包装することができる。
単離臓器培養における血管成熟を容易にするため、2段階培養プログラムを使用して無
細胞肺足場をベースとして肺血管系全体または血管系の一部を再生させることができる。
例えば、血管周囲支持細胞との組合せで、再生細胞を高い血管新生状態から低い血管新生
状態に移行させる2段階培養プログラムは、典型的な血管発生のインビボ管腔形成に類似
する再生肺における血管成熟プロセスを促進するために役立ち得る。
PPC)は、灌流播種を使用して無細胞肺足場上に播種することができる(例えば、他箇
所に記載のPAおよびPVの両方から)。場合により、静置培養に続き灌流播種を行って
血管基底膜への細胞の初回付着を可能とすることができる。PAに通す培地の灌流は、培
養の終了まで継続し得る。
の段階の間、播種された肺足場を、他箇所に記載の安定化培地中で培養する。一部の例に
おいて、第1の段階は第2の段階よりも長い。例えば、第1の段階は6日間であり得る一
方、第2の段階は2日間のみである。CD31およびVE−カドヘリン発現により定義さ
れるプラトーに到達するための内皮被覆の増加は、培養の第1の段階の主目的である十分
な血管リモデリングが達成されたことを示す。
細胞は相互接続ネットワークを形成し、血管周囲細胞は血管ネットワーク周囲に個々に接
着する。これは、単一細胞懸濁液として無細胞血管床中への内皮細胞の送達を許容し、次
いでそれらの内皮細胞は付着およびリモデリングを受ける。これは、内皮被覆の増加なら
びに灌流流体の流動を包囲し、それに耐え得る連続的および極性化血管腔の形成をもたら
す。再生肺におけるインビトロ血管成熟の間のこれらの形態的変化は、インビボ血管発生
の間の管腔形成のプロセスに類似する。
本明細書に記載の方法の一部において、肺組織マトリックス、例えば、脱細胞化肺組織
マトリックスまたは人工肺マトリックスに、細胞、例えば、分化または再生可能な細胞を
播種する。無細胞肺足場中への効率的な内皮送達および単離臓器培養条件は、効率的な血
管成熟に寄与し得る。
、hiPSCは、臓器再構築に必要な全ての細胞タイプを単一細胞源から生成する潜在性
を提供するためである。例えば、hiPSC由来血管細胞タイプを使用して肺血管系を再
生させることができる。hiPSC由来血管細胞タイプは、高度に効率的な内皮分化を受
け、総分化細胞のかなりの部分(例えば、総分化細胞の少なくとも50、60、70、8
0、90%)を構成する周皮細胞の生成を伴う。
培養の両方を使用し得る。例えば、hiPSCは、二次元表面(例えば、6ウェルプレー
ト、またはコラーゲンコートされた6ウェルプレート)上に播種することができる。播種
の間、細胞を阻害剤(例えば、GSK−3阻害剤、例えば、CHIR99021、塩化リ
チウム(LiCl)、プルバラノールA、オロモウシン、アルステルパウロン、ケンパウ
ロン、ベンジル−2−メチル−1,2,4−チアジアゾリジン−3,5−ジオン(TDZ
D−8)、2−チオ(3−ヨードベンジル)−5−(1−ピリジル)−[1,3,4]−
オキサジアゾール(GSK3阻害剤II)、2,4−ジベンジル−5−オキソチアジアゾ
リジン−3−チオン(OTDZT)、(2’Z,3’E)−6−ブロモインジルビン−3
’−オキシム(BIO)、α4ジブロモアセトフェノン(すなわち、Tauタンパク質キ
ナーゼI(TPKI)阻害剤)、2−クロロ−1−(4,5−ジブロモ−チオフェン−2
−イル)−エタノン、N−(4−メトキシベンジル)−N’−(5−ニトロ−1,3−チ
アゾール−2−イル)ウレア(AR−A014418)、インジルビン−5−スルホンア
ミド;インジルビン−5−スルホン酸(2−ヒドロキシエチル)−アミドインジルビン−
3’−モノキシム;5−ヨード−インジルビン−3’−モノキシム;5−フルオロインジ
ルビン;5,5’−ジブロモインジルビン;5−ニトロインジルビン;5−クロロインジ
ルビン;5−メチルインジルビン、5ブロモインジルビン、4−ベンジル−2−メチル−
1,2,4−チアジアゾリジン−3,5−ジオン(TDZD−8)、2−チオ(3−ヨー
ドベンジル)−5−(1−ピリジル)−[1,3,4]−オキサジアゾール(GSK3阻
害剤II)、2,4−ジベンジル−5−オキソチアジアゾリジン−3−チオン(OTDZ
T)、(2’Z,3’E)−6−ブロモインジルビン−3’−オキシム(BIO)、α4
ジブロモアセトフェノン(すなわち、Tauタンパク質キナーゼI(TPKI)阻害剤)
、2−クロロ−1−(4,5−ジブロモ−チオフェン−2−イル)−エタノン、(vi)
N−(4−メトキシベンジル)−N’−(5−ニトロ−1,3−チアゾール−2−イル)
ウレア(AR−A014418)、H−KEAPPAPPQSpP−NH2(L803)
およびMyr−N−GKEAPPAPPQSpP−NH2(L803−mts))により
処理することができ;一部の実施形態において、GSK3−ベータ阻害剤は、CHIR9
9021(例えば、5〜20uM、例えば、10〜15uM、例えば、約12μMにおい
て使用、Stemgent))であり、培地(例えば、mTeSRTM))を使用するこ
とができる(例えば、1〜24時間)。細胞の90%超におけるBrachyury遺伝
子(中胚葉性前駆細胞マーカー)の発現は、この段階の完了を示す。
配置する。分化培地は、補給血清または血清代用物、化合物、アミノ酸、培地サプリメン
ト、および/またはタンパク質(例えば、BIT9500(STEMCELL Tech
nologies)、モノチオグリセロール(450mM、Sigma Aldrich
)、MEM非必須アミノ酸(Gibco)、1%のGlutaMAX、1%のP/S、組
換えヒトBMP4(PeproTech)、VEGF(PeproTech)およびbF
GF(PeproTech))も含み得る。
血管周囲前駆細胞(hiPSC−PPC)を、それらの内皮のアイデンティティも増殖潜
在性も損失させずにヒトサイズ化肺エンジニアリングに十分なスケールに拡張することが
できる。例えば、分化細胞を、単一細胞に解離させ(例えば、酵素的細胞解離試薬、例え
ば、トリプシンまたはTrypLE(Gibco)を使用することによる)、1つ以上の
抗体またはアイソタイプ対照(例えば、抗ヒトCD31−BV605、CD140b+、
およびCD140b−PE抗体(BD Biosciences))により染色し、分離
することができる(例えば、FACSAriaII(BD Biosciences)を
使用する蛍光活性化細胞選別(FACS)による)。
ences)コートフラスコ中で、例えば、20%の規定FBS(Hyclone)、1
%のペニシリン/ストレプトマイシン、およびTGFβ受容体I(ALK5)阻害剤、例
えば、SB431542、SB525334、SD−208、EW−7197、SB50
5124、またはガルニセルチブ(LY2157299)の1つ以上が補給されたヒドロ
コルチゾンを有さないEGM−2であるEGM−FBS−SB培地を使用して培養するこ
とができ;一部の実施形態において、阻害剤はSB431542(例えば、5〜20μM
、例えば、8〜15μM、例えば、10μM)である。
ニンタンパク質の上方調節まで(例えば、6日間)、hiPSC−PPCをSmooth
Muscle Growth Medium−2(SmGm2,Lonza)中で培養
した。
任意の適切な方法を実施して移植前または後の肺機能についてアッセイすることができ
る。例えば、組織治癒を評価し、機能性を評価し、および細胞内方成長を評価する方法を
実施することができる。一部の場合、組織の一部を回収し、固定剤、例えば、中性緩衝ホ
ルマリンなどにより処理することができる。このような組織の一部は、組織学的分析のた
めに脱水し、パラフィン中で包埋し、ミクロトームにより切片化することができる。切片
は、ヘマトキシリンおよびエオシン(HおよびE)により染色し、次いで形態および細胞
充実性の顕微鏡評価のためにガラススライド上でマウントすることができる。例えば、組
織学的検査および細胞染色を実施して播種細胞繁殖を検出することができる。アッセイと
しては、移植組織マトリックスの機能的評価または画像化技術(例えば、コンピュータ断
層撮影(CT)、超音波、または磁気共鳴画像化(例えば、造影MRI))を挙げること
ができる。アッセイは、静止および生理学的ストレス下での機能的試験(例えば、全身プ
レチスモグラフィー、肺機能試験)をさらに含み得る。細胞を播種したマトリックスの機
能性は、種々の方法、例えば、組織学的検査、電子顕微鏡、および機械的試験(例えば、
体積およびコンプライアンスの)を使用してアッセイすることができる。ガス交換を別の
機能性アッセイとして計測することができる。細胞増殖についてアッセイするため、チミ
ジンキナーゼ活性を、例えば、チミジン取り込みを検出することにより計測することがで
きる。一部の場合、血液試験を実施して血中の酸素レベルに基づき肺の機能を評価するこ
とができる。あるいは、またはさらに、蛍光標識デキストラン溶液を使用するエクスビボ
灌流を実施して血管統合性および灌流可能性を示した血管内デキストラン保持率を定量す
ることができる。新鮮単離死体ラット肺は、100%の血管内デキストラン保持率を有す
る。移植に適合性である臨床関連低グレード損傷モデルである6時間の低温虚血後の死体
肺は、典型的には、約87.0%±5.4%(例えば、80.6%〜92.9%の範囲)
の血管内デトラン(detran)保持率を有する。
の任意の経路は、機能性パラメータ(例えば、pH、グルコース、乳酸塩、Na、K、C
a、Cl、重炭酸塩、O2、CO2、飽和度)の単一またはリアルタイム計測を可能とす
るためのサンプリングポートを含み得る。代謝産物を使用して比色アッセイを使用して細
胞数および生存率をモニタリングすることもでき、生化学的アッセイを使用して細胞成熟
をモニタリングすることができる(例えば、サーファクタントタンパク質の計測など)。
例えば、サーファクタントの濃度増加は、培養肺が乾式換気に耐えるために十分な上皮細
胞を有することを示し得る。一部の場合、内皮障壁機能を血管成熟のマーカーとして使用
することができる。肺に、異なるサイズの分子(例えば、規定サイズのデキストランおよ
びアルブミン)、マイクロビーズまたはマイクロスフェア(0.2〜5umの増加サイズ
)および単離赤血球を灌流させることができる。次いで、気管支肺胞洗浄液をサンプリン
グして肺胞腔中へのそれらのマーカーの漏出を評価することができる。例えば、500k
Daデキストランを気管支肺胞洗浄アッセイとの組合せで使用して血管コンパートメント
内に保持されるデキストランの割合を決定することができる。保持されるデキストランの
割合の増加は、障壁機能の改善を示す。それというのも、デキストランに対する障壁機能
は生存および機能的内皮に依存的である一方、デキストランは一定灌流の間に経時的に露
出血管基底膜(例えば、無細胞肺中)を通過して拡散するためである。例えば、死体肺は
血管コンパートメント内のデキストランの実質的に全てを保持し得る一方、無細胞肺はわ
ずかな割合のデキストランを保持し得る(例えば、10.0%±8.0%、例えば、3〜
20%、例えば、3.1%〜18.7%)。許容される最小値(例えば、4umマイクロ
ビーズの>10%(例えば、10%〜100%または20%〜100%は、肺が乾式換気
に耐えるために十分でないことを示す)、または0.2umマイクロビーズの20%超(
20%〜100%、または30%〜100%は、肺が乾式換気に耐えるために十分でない
ことを示す)よりも多い肺胞腔中へのこれらのマーカーの漏出は、肺が乾式換気に耐える
ために十分に成熟でないことを示す。
ーファクタントタンパク質mucin−1)および分化マーカー(例えば、TTF−1、
p63、サーファクタントタンパク質C)の発現を定量することができる。任意の適切な
RT−PCRプロトコルを使用することができる。手短に述べると、生物試料(例えば、
腱試料)をホモジナイズし、クロロホルム抽出を実施し、スピンカラム(例えば、RNe
asy(登録商標)Miniスピンカラム(QIAGEN,Valencia,CA))
または他の核酸結合基板を使用してトータルRNAを抽出することにより、トータルRN
Aを回収することができる。他の場合、抗体および標準的なイムノアッセイを使用して肺
細胞タイプおよびそのような細胞タイプについての分化の異なるステージに関連するマー
カーを検出することができる。
無細胞肺血管床の試験
本実施例の目的は、インビトロマイクロスフェア灌流アッセイを使用して全肺足場中の
無細胞血管床の灌流特性を同定することである。PV、気管および肺末梢から回収される
マイクロスフェアを定量することにより、本発明者らは、脱細胞化後の血管基底膜の連続
性および統合性の両方を実証し、それにより無細胞肺足場におけるコンパートメント特異
的細胞送達の可能性を裏付けた。マイクロスフェア定量は、流体駆動静水圧損失が低い導
通効率の主な理由であるが、粒子漏出はその主な理由でないことをさらに示した。これら
の知見を再細胞化に適用することにより、効率的および均一な内皮被覆が動脈および静脈
細胞送達の組合せにより達成される。
死体肺を、雄Sprague−Dawleyラット(250〜300g、Charle
s River Laboratories)から全身ヘパリン化後に外植した。肺動脈
(PA)に18Gカニューレ(McMaster−Carr)をカニューレ挿入し、肺静
脈(PV)にチップバスケットを有するミニボールカニューレ(miniball ca
nnula with tip basket)(1.9mm ID)(Harvard
Apparatus)を使用して左心耳(LAA)に通してカニューレ挿入し、大動脈
を結紮した。脱細胞化は、PA(定圧、40mmHg)にヘパリン化(10単位/ml)
リン酸緩衝生理食塩水(PBS、10分間)、脱イオン水中0.1%のドデシル硫酸ナト
リウム(2時間)、脱イオン水(15分間)および脱イオン水中1%のTriton X
−100(10分間)を連続的に灌流させることにより行った。得られた足場を、抗生物
質および抗有糸分裂薬(antimytotics)を含有するPBSにより72時間洗
浄して残留洗浄剤および細胞残屑を除去した。全ての試薬はSigma Aldrich
製である。
、脱細胞化肺にPAに通して20mmHg下で、1:100希釈緑色FluoSpher
es(0.2μm、505/515、Invitrogen)を含有する30mlのPB
Sを灌流させた。PAおよびPVの両方からのマイクロスフェア灌流後の脱細胞化肺のホ
ールマウント画像化のため、脱細胞化肺にPAに通して、PVカニューレを開口させて1
:100希釈緑色FluoSpheres(0.2μm、505/515)を含有する3
0mlのPBSを灌流させ、次いでPVに通して、PAカニューレを開口させて1:10
0希釈赤色FluoSpheres(0.2μm、580/605)を含有する30ml
のPBSを灌流させた。マイクロスフェア灌流後に個々の葉を脱細胞化肺から解剖し、N
ikon Eclipse TE200顕微鏡を4倍の倍率で使用して画像化した。
カニューレ(McMaster−Carr)をカニューレ挿入した。脱細胞化肺にPAに
通して、40mmHg下で、1:10希釈緑色FluoSpheres(0.2μm、5
05/515)および赤色FluoSpheres(0.02μm、580/605)の
混合物を含有する30mlのPBSを灌流させた。灌流の間、PVカニューレおよび肺末
梢から排出させた流体を回収した。灌流の間、気管カニューレを閉口させ、灌流後に気管
カニューレを解放することにより気道中で蓄積した流体を回収した。3つのコンパートメ
ント(PV、気管および末梢)全てから回収された流体の体積を計測し、Spectra
Max Microplate Readerを0.2μm緑色FluoSpheres
については485nm(ex)/538nm(em)および0.02μm赤色FluoS
pheresについては544nm(ex)/590nm(em)において使用してそれ
らの蛍光強度を計測した。
得られた全肺足場中の無細胞肺血管床の特性を試験するため、左心耳を介するPV、気
管、およびPAにカニューレ挿入した(図5A)。予測されるとおり、脱細胞化は、障壁
機能のほぼ完全な損失、ならびに晶質溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の
PAおよびPVから間質腔への血管基底膜を通過する自由濾過、胸膜を通過する自由濾過
、ならびに肺胞腔および気道中への自由濾過をもたらした。PA中に灌流させたPBSの
大多数が肺末梢および気管から排出した一方、体積の12.4%±0.7%のみをPVか
ら回収することができた(図11)。これは、脱細胞化の間、PAに通して灌流させた洗
浄剤が肺血管系に透過し、肺実質全体において細胞構成成分を効率的に溶解させた観察と
一致する。
灌流をモデリングするため、無細胞全肺に、蛍光マイクロスフェア(0.2μm)を含有
するPBSを灌流させた。PAに通す生理学的圧力(20mmHg)下での灌流の間の気
道中への、または胸膜を通過するマイクロスフェアの明らかな漏出も、PVからの明らか
なマイクロスフェア排出も観察されなかった。肺ホールマウントを使用して、灌流させた
マイクロスフェアの肺内捕捉(図5B)が確認された。PAに通す灌流圧が20mmHg
から40mmHgに増加した場合、マイクロスフェアは、インプットに近い濃度(74.
6%±20.8%)において、気管(Tr、22.7%±12.2%、p<0.05)お
よび肺末梢(末梢、5.7%±5.1%、p<0.05)から回収された流体のものより
も有意に多くPVから回収することができた(図5C)。この知見は、脱細胞化後の肺血
管基底膜の保存された統合性および連続性を裏付けた。しかしながら、PVから回収され
たマイクロスフェアの総量は、総注入量の10.3%±0.9%にすぎなかった。これは
、マイクロスフェアが、動脈側から灌流させた場合、効率的に毛細血管床を通過しないこ
とを示した。この非効率性は、血管床内の静水圧の急速な損失に関連し得る。それという
のも、水相は極めて透過可能な基底膜を通り拡散し、残留溶液中の血管内マイクロスフェ
ア濃度が増加するためである(図5D)。
せることにより、動脈マイクロスフェアも静脈マイクロスフェアも、肺胞腔中へも気道中
へも漏出しなかったことが明らかである。その代わり、マイクロスフェア混濁血管チャネ
ルは、一般に、相互排他的であった(図5E)。これは、効率的な血管細胞送達が、肺血
管床全体に到達する動脈側および静脈側の両方からの灌流から利益を受けることを示す。
マイクロメートル直径粒子は、生理学的圧力下で無細胞肺毛細血管床を効率的に通過し
ないことを見出した。
内皮送達の改善
本実施例の目的は、無細胞ラット肺足場上の生存内皮の再確立を実証すること、および
脱細胞化後の血管基底膜の統合性を裏付けることである。
脱細胞化ラット肺中への細胞播種を本明細書に記載のものと類似するバイオリアクター
中で実施し、PAおよびPVの両方からの細胞送達および灌流を可能とした。気管にカニ
ューレ挿入し、PAの高さよりも約5cm高いポートに通してバイオリアクターの内側に
開口した。脱細胞化肺足場を、ヒトフィブロネクチン(2.5μg/ml)を有する10
0mlのハンクス平衡塩溶液による1ml/分における灌流により1時間プライミングし
、ハンクス平衡塩溶液により1時間洗浄し、それぞれの培養培地中で少なくとも1時間平
衡化してから細胞播種した。PAに通す内皮送達のため、100mlのEGM−2を有す
る単一播種チャンバ中で4000万個のHUVECを再懸濁させ、30mmHg重力下で
PAに通して播種した(n=3)。PAおよびPVに通す内皮送達のため、4000万個
のHUVECを2つの別個の播種チャンバ(それぞれ100mlのEGM−2中2000
万個のHUVECを有する)中で再懸濁させ、30mmHg重力下でPAおよびPVに通
して同時に播種した(n=3)。2時間の静置培養を実施して細胞付着を可能とし、次い
で灌流を1ml/分においてPAおよびPVの両方から開始した。組織学的分析のために
培養の1日後に再播種肺を回収した。
蛍光画像を同一の視野から別個に撮影した。ImageJ(NIH)を使用して画像を二
値画像に変換し、骨組化し、拡大した。ImageJを使用して処理画像のピクセル数を
計数し、それは視野全体における内皮細胞(CD31)または肺マトリックス(ラミニン
)のいずれかの被覆を示した。再生肺の内皮被覆を、ラミニン被覆に正規化されたCD3
1被覆として定義した。それぞれの再生肺について、写真を5つの代表的な視野から4倍
の倍率で撮影した。それぞれの肺の内皮被覆を、5つの視野からのものの平均被覆として
提示した。内皮被覆を、PAからHUVECが播種された無細胞ラット肺に対して培養の
1日後に定量し(n=3)、PAおよびPVからHUVECが播種された無細胞ラット肺
に対して培養の1日後に定量した(n=3)。
無細胞ラット肺足場上の生存内皮を再確立するため、蛍光標識ヒト臍静脈内皮細胞(H
UVEC)をPAに通す灌流を介して播種した。これは、マイクロスフェア灌流を用いて
既に観察されたものと類似する生着細胞の分布パターンをもたらした(図6および図5B
)。これは、PA単独からのHUVEC送達1日後における斑点状の内皮分布を示す組織
学的評価によっても裏付けられた(図5F)。
方に通す灌流により送達した。再播種無細胞ラット肺の内皮被覆を定量的に評価するため
、豊富な肺細胞外マトリックスタンパク質ラミニンについての免疫染色と、CD31染色
(図5F−I)により標識される再内皮化の区域との間の重複の程度を計測する。
たらした(図5F−iv、H)。播種1日後に得られた内皮被覆の定量は、動脈および静
脈送達の組合せから得られた内皮被覆が、動脈送達単独により産生されたものよりも有意
に高いことを示した(33.2%±2.9%対16.3%±1.4%、p<0.01)(
図5G)。マイクロスフェア灌流下で観察されるとおり、定圧下での動脈および静脈内皮
送達の組合せは、主要気道枝中の内皮細胞の不存在下で血管コンパートメントに高度に特
異的であり(図8)、それにより脱細胞化後の血管基底膜の統合性を裏付けた。
インビトロ培養の間の血管成熟
本実施例の目的は、複雑な三次元足場(例えば、無細胞肺足場)中でインビボ血管発生
を厳密に模倣する効率的および能動的な血管リモデリングを実証することである。細胞送
達および保持後、内皮細胞が充填された無細胞血管床から、灌流可能な血管腔への移行は
、インビボ血管発生を厳密に模倣する能動的な血管リモデリングに依存する。
HUVECを用いて再生させる無細胞ラット肺の長期インビトロ培養のため、約400
0万個のHUVECを無細胞肺足場中に上記のとおりPAおよびPVの両方からに播種し
、EGM−2中で14日間培養し(n=3)、PAおよびPVの両方から1ml/分にお
いてそれぞれの側から灌流させた。培地を1日おきに交換した。
肺と称される)の2段階培養のため、4000万個のHUVECを2000万個のhMS
Cと混合し、無細胞肺足場中に上記のとおりPAおよびPVの両方から播種した。2時間
の静置培養後、灌流を1ml/分においてPAおよびPVの両方から再開した。1日目か
ら開始して、PVカニューレを解放し、灌流をPA単独からの4ml/分に切り替え、そ
れを培養の終了まで保持した。HUVEC−hMSC再生肺を合計8日間培養し、最初の
6日間は血管新生培地中で、後続の2日間は安定化培地中で培養した。
ibco)、アスコルビン酸(50mg/ml、STEMCELL Technolog
ies)、組換えヒトVEGF(40ng/ml)、bFGF(40ng/ml)および
1%のP/Sが補給されたMedium199(Gibco)であった。
ルビン酸(50mg/ml)、組換えヒトVEGF(20ng/ml)、bFGF(20
ng/ml)、ホルスコリン(10μM、Cayman Chemical)、ヒドロコ
ルチゾン(110nM、Sigma Aldrich)および1%のP/Sが補給された
Medium199であった。機能的および組織学的評価のためにHUVEC−hMSC
再生肺を8日目に回収した。
段階Iの間、肺を高レベルの血清および血管新生成長因子(血管新生培地と称される)
に曝露して内皮生存、遊走および血管リモデリングを促進した。しかしながら、血管新生
促進因子は、内皮透過性の増加および障壁機能の減少をもたらし得る。この傾向を弱める
ため、培養の段階2は、内皮透過性を低減させ、障壁機能を改善するより低いレベルの血
清および血管新生成長因子(例えば、ホルスコリンおよびヒドロコルチゾン)を含有する
安定化培地を使用して予め形成された血管系を安定化させ、障壁機能を強化する(図7A
)。血管新生培地は、10%のFBS、1%のインスリン−トランスフェリン−セレン(
Gibco)、アスコルビン酸(50mg/ml、STEMCELL Technolo
gies)、組換えヒトVEGF(40ng/ml)、bFGF(40ng/ml)およ
び1%のP/Sが補給されたMedium199(Gibco)であった。安定化培地は
、2%のFBS、1%のインスリン−トランスフェリン−セレン、アスコルビン酸(50
mg/ml)、組換えヒトVEGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、
ホルスコリン(10μM、Cayman Chemical)、ヒドロコルチゾン(11
0nM、Sigma Aldrich)および1%のP/Sが補給されたMedium1
99であった。
果を試験するため、デキストランtranswell透過性アッセイを使用した。再生肺
の長期インビトロ培養の間の内皮透過性に対する培地の機能を評価するため、デキストラ
ンtranswell透過性アッセイを、血管新生培地および安定化培地にHUVEC単
層を2日間曝露させることにより改変してそれらの慢性効果を試験した。安定化培地中で
培養されたHUVEC単層は、血管新生培地中で培養されたものと比較して有意に改善さ
れた障壁機能を示した(図7B)。
周囲支持hMSCを同時播種し、再生肺(HUVEC−hMSC肺と称される)を血管新
生培地中で6日間培養し、次いで安定化培地中で2日間培養した。血管リモデリングおよ
び再生に対するこの同時播種および培養方針の効力を評価するため、内皮被覆を定量した
。内皮送達1日後におけるものと比較した2段階培養の終了時におけるHUVEC−hM
SC肺の内皮被覆の有意な増加(54.0%±5.0%対33.2%±2.9%、p<0
.01)(図7C)。広視野結合画像は、肺全体にわたる内皮被覆の均一性をさらに裏付
けた(図7D)。比較として、無細胞ラット肺足場に、血管周囲細胞を用いずにHUVE
Cのみを播種し、この再生肺(HUVEC肺と称される)を慣用のEGM−2培地中で1
4日間培養した。内皮細胞は培養期間全体にわたりHUVEC肺中で生存したままであっ
たが、慣用の培養の終了時における内皮被覆は、播種1日後におけるものと比較してわず
かに増加したにすぎず(34.5%±1.6%対33.2%±2.9%、p=0.55)
、2段階培養後のHUVEC−hMSC肺中のものよりも有意に低かった(34.5%±
1.6%対54.0%±5.0%、p<0.01)。これは、再生肺培養における血管リ
モデリングの促進において血管周囲支持細胞および成長因子刺激を含める利益を実証する
(図7C)。
続されてネットワークを形成した一方、hMSCは血管ネットワークに接着している個々
の細胞として出現した(図7E〜I)。これは、天然肺における内皮−周皮細胞組織化を
厳密に模倣した。頂側膜−基底膜極性の確立は、血管腔形成についての主要な形態学的布
石の1つである。血管腔表上のポドカリキシン様(PODXL)および基底表面上のコラ
ーゲンIV(COLIV)の特異的局在化は、培養の終了時においてHUVEC−hMS
C再生肺中で観察することができる(図7E−ii)。これは、大血管および毛細血管レ
ベルの両方における管腔形成を裏付けた。障壁特性を評価するため、タイトジャンクショ
ンをZO−1染色、および2段階培養の終了までの内皮境界におけるZO−1タンパク質
の濃縮観察により試験した(図7E−iii)。
血管機能のインビトロおよびインビボ評価
本実施例の目的は、単離臓器培養の間の再生肺の血管機能を評価する非侵襲的方法を実
証することである。
試験肺を150cmペトリ皿の頂部上に伏臥位で配置し、PAを灌流経路に接続させ、
PVカニューレを肺の高さに開口させ、気管カニューレをPAのものよりも約5cm高い
高さに開口させた。25mlのPBSまたは500kDaデキストラン(0.2mg/m
l)を含有する培地を肺中に20mmHgに等しい重力下で灌流させた。灌流の間、PV
カニューレおよび肺末梢から排出させた流体をそれぞれPV流体および末梢流体として回
収した。灌流後、気管カニューレを下げ、気道中に蓄積した流体が別個のペトリ皿中に気
管流体として排出することを可能とした。次いで、シリンジを使用して5mlのブランク
灌流液を気管カニューレ中に投与した。シリンジの除去後に気管カニューレから受動的に
排出された流体をBAL流体として回収した。PV、末梢、気管およびBAL流体中のデ
キストランの総量を、蛍光強度および体積の計測により定量した。
ランを血管内デキストランと称した一方、末梢、気管およびBAL流体中のデキストラン
を血管外デキストランと称した。デキストラン灌流およびBALアッセイを、新鮮単離死
体ラット肺(n=3)に対して、無細胞ラット肺(n=3)に対して、および6時間の低
温虚血への曝露後の死体ラット肺(n=4)に対して実施した。6時間の低温虚血は、新
鮮単離ラット肺を氷冷PBS中で4℃において6時間インキュベートすることにより生成
した。デキストラン灌流およびBALアッセイは、HUVEC−hMSC再生ラット肺に
対しても培養の3、6および8日目に実施し(n=3)、hiPSC再生ラット肺に対し
ては培養の2、4および6日目に実施した(n=3)。
は、PressureMAT Single−Use Sensor(PendoTEC
H)を使用して毎日計測し、HART−Regenソフトウェア(Harvard Ap
paratus)を使用して記録した。それぞれの計測前、PA灌流を5〜10分間中断
し、圧力がベースラインに戻り、安定化することを可能とし、ベースライン圧を5分間記
録した。次いで、PA灌流を4ml/分において再開し、PA圧を2時間記録した。それ
ぞれの計測の終了時、PA灌流を再度5分間中断して記録前後の圧力ベースラインの有意
なドリフトが存在しないことを確保した。PA圧は、灌流の間の平均圧力をベースライン
のものだけ差し引くことにより計算した。
0秒間配置し、流体が主要血管から排出することを可能とし、次いで湿重量を計測した。
同一副葉の乾重量を、一晩凍結乾燥させた後に計測した。湿/乾比は、湿重量を乾重量に
より割ることにより計算した。湿/乾比の計測は、デキストラン灌流およびBALアッセ
イ直後、死体ラット肺(n=3)に対して、無細胞ラット肺(n=3)に対して、および
6時間の低温虚血への曝露後の死体ラット肺(n=4)に対して実施した。湿/乾比の計
測は、培養の終了時にHUVEC−hMSC(n=3)およびhiPSC(n=3)再生
肺に対して実施した。
350〜400g)に対して実施した。免疫抑制は、移植前日から開始する90%のオリ
ーブ油(Sigma−Aldrich)および10%のエタノール(Sigma−Ald
rich)中で調製されたシクロスポリンA(Sigma−Aldrich)の10mg
/kg/日における皮下注射により達成した。同所移植は、改変して既に記載されている
とおり実施した2。手短に述べると、再生肺グラフト(HUVEC−hMSC再生肺につ
いてn=3およびhiPSC再生肺についてn=3)を、移植直前に20mmHg下で1
00mlの氷冷ヘパリン化(10単位/ml)PBSによりフラッシュした。再生左肺を
解剖し、左主要気管支を結紮し、16Gカフを左主要PAおよびPV中で配置した。レシ
ピエントラットを加熱パッド上で右側臥位で配置し、5%のイソフルラン(Abbott
)により麻酔し、16G気管内チューブ(Becton−Dickinson)を挿管し
、100%のO2(Airgas)を供給するげっ歯類換気装置(Harvard Ap
paratus)により換気した。全身ヘパリン化は、皮下注射を介して実施した。左前
開胸術後、左主要気管支を識別し、結紮し、結紮の遠位側で切開した。左主要PAおよび
PVを識別し、円周方向に解剖し、左門近くで切開した。肺動脈および静脈カフをレシピ
エントの血管中に挿入し、7−0絹縫合糸(Ethicon)により固定した。移植2時
間後にエノキサパリン(2mg/kg、NOVAPULS)を皮下投与し、次いで1日2
回投与した。移植3日後、レシピエントラットを安楽死させ、再生グラフトを解剖した。
グラフトの灌流可能性を蛍光マイクロ血管造影により分析した。
単離臓器培養の間の再生肺の血管機能を評価する非侵襲的方法を、連続的気管支肺胞洗
浄(BAL)を使用して実施して再生肺の灌流可能性および障壁機能を試験した。肺微小
血管水透過性および血管灌流可能性を試験するためのトレーサーとして500kDaのデ
キストランが使用されており、その溢出は巨大分子漏出を示す。FITCコンジュゲート
500kDaデキストランをインビトロ肺灌流のためのトレーサーとして使用して肺血管
灌流可能性および脱細胞化前後の漏出を評価し、無細胞足場の再内皮化後の潜在的な変化
を評価した。デキストラン溶液を、PAに通して20mmHg下で灌流させ、次いで5m
lのブランク灌流液を気管中に投与して気道コンパートメント中に漏出したデキストラン
を回収した(図7F)。次いで、PV、気管(BALを含む)および肺末梢から排出した
デキストランの総量を、蛍光強度および体積の計測により定量した。
て、6時間の低温虚血への曝露後の肺に対して、および無細胞肺に対して実施した。死体
肺は、血管コンパートメント内で100.0%±0.0%のデキストランを保持した一方
、無細胞肺のそれは10.0%±8.0%(p<0.01、死体肺と比較)(図7G)で
あり、それは予測されたものであった。それというのも、デキストランに対する障壁機能
が生存および機能的内皮に依存的である一方、デキストランが一定灌流の間に経時的に露
出血管基底膜を通過して拡散するためである。6時間の低温虚血後の肺は、障壁機能の減
衰および87.0%±5.4%のデキストランの保持率を示し、それは死体肺のものより
も有意に低く(p<0.05)、無細胞肺のものよりも有意に高かった(p<0.01)
(図7G)。次に、インビトロ灌流およびBALアッセイを、HUVEC−hMSC再生
肺に対して2段階インビトロ培養の間の3つの異なる時点(3、6および8日目)におい
て実施した。HUVEC−hMSC再生肺のデキストラン保持率は、培養期間にわたり、
3日目の52.8%±4.2%から、6日目の75.9±3.1%、8日目の80.2%
±5.3%に徐々に増加した(図7H)。培養の終了時におけるHUVEC−hMSC再
生肺中のデキストラン保持率は、無細胞肺のものよりも有意に高く(p<0.01)、死
体肺のものよりも有意に低く(p<0.05)、6時間の低温虚血後の肺のものよりもわ
ずかに低いが有意に異なることはなかった(p=0.16)。観察された培養にわたる血
管コンパートメント内のデキストラン保持率の増加は、血管成熟を伴う障壁機能の改善を
示した。
流(4ml/分)下での毎日のPA圧モニタリングにより、培養期間にわたるPA圧の定
常減少および1日目と比較した培養の終了時における48.2%±15.0%への到達(
p<0.05)が明らかになった(図7I)。球状グラフト流体ホメオスタシスのマーカ
ーとして、単離臓器培養の終了時における湿乾比を計測した。再生肺の湿/乾比は26.
6±1.9であり、それは無細胞肺のものよりも有意に低く(55.7±7.9、p<0
.05)、死体肺のものよりも有意に高く(9.2±0.2、p<0.01)、6時間の
低温虚血後の肺よりも有意に高かった(12.8±2.0、p<0.01)(図7J)。
これは、肺流体バランスが内皮、間質、および上皮機能、例えば、肺胞内液の能動的吸収
、およびリンパ管を介する間質液の除去に依存する事実により説明することができる26
,27。本実験において、能動的構成要素の1つのみ、内皮が再生された。
ラット中に同所位置で免疫抑制を用いて移植した。再生グラフト全体にわたる均一血液灌
流は、再灌流直後に観察することができる(図7K)。肺血管は、蛍光マイクロ血管造影
により確認されるとおり移植3日後に灌流可能なままであった(図7L)。
臨床関連内皮および血管周囲細胞の誘導ならびに小型動物モデルにおける肺血管再生のた
めのそれらの使用
本実施例の目的は、二次元培養をベースとするスケーラブルな細胞分化プロトコルを実
証することである。例示的なスケーラブル細胞分化プロトコルは、分化前の間のCHIR
99021によるWnt活性化、分化の終了時におけるSB431542によるTGF−
β阻害および分化全体の間の低酸素培養を取り込む。低酸素培養条件は、細胞を培養する
インキュベーター中4%のO2として定義される。
内皮および血管周囲細胞分化を、低(4%)酸素下で実施した。−2日目、BJRiP
S細胞をaccutase(STEMCELL Technologies)により単一
細胞に解離させ、10μMのRock阻害剤(Y−27632、Cayman Chem
ical)を有するmTeSR(商標)1中で再懸濁させ、コラーゲンIV(BD Bi
osciences)によりコートされた6ウェルプレート上に200,000個の細胞
/ウェルにおいて播種した。−1日目、BJRiPS細胞をCHIR99021(12μ
M、Stemgent)によりmTeSR(商標)1中で24時間処理した。0日目から
開始して、BJRiPS細胞を完全分化培地中で分化させ、培地を1日おきに交換した。
完全分化培地は、20%のBIT9500(STEMCELL Technologie
s)、モノチオグリセロール(450μM、Sigma Aldrich)、1%のME
M非必須アミノ酸(Gibco)、1%のGlutaMAX、1%のP/S、組換えヒト
BMP4(50ng/ml、PeproTech)、VEGF(50ng/ml、Pep
roTech)およびbFGF(50ng/ml、PeproTech)が補給されたI
MDM(Gibco)であった1。4日目から6日目まで、完全分化培地にSB4315
42(10μM、Stemgent)をさらに補給した。
CD31−BV605およびCD140b−PE抗体(BD Biosciences)
または適切なアイソタイプ対照により染色し、FACSAriaII(BD Biosc
iences)を使用する蛍光活性化細胞選別(FACS)により分離した。BJRiP
S由来内皮細胞(hiPSC−EC)をCD31+CD140b−集団として定義し、B
JRiPS由来血管周囲前駆細胞(hiPSC−PPC)をCD31−CD140b+集
団として定義した。FACS単離後、hiPSC−ECおよびhiPSC−PPCを20
%の規定FBS(Hyclone)、SB431542(10μM)および1%のP/S
が補給されたヒドロコルチゾンを有さないEGM−2であるEGM−FBS−SB培地を
使用してコラーゲンI(BD Biosciences)コートフラスコ中で培養した。
平滑筋細胞様表現型への分化のため、hiPSC−PPCをSmooth Muscle
Growth Medium−2(SmGm2、Lonza)中で6日間培養した。
コラーゲンIコートT75フラスコ上にトリプリケートで播種し、EGM−FBS−SB
培地中で培養した。それぞれの細胞継代の間、それぞれのフラスコの細胞数を計数し、次
の継代のために150,000個のhiPSC−ECを播種した。
成体肺中で、CD31およびCD140bは内皮細胞および周皮細胞をそれぞれ標識す
る。分化した細胞を両方のマーカーの発現についてフローサイトメトリーによりアッセイ
した。分化の終了時、得られた細胞混合物は、2つの主要な細胞タイプから構成された:
CD31+CD140b−内皮細胞(hiPSC−EC、55.1%±4.2%)および
CD31−CD140b+血管周囲前駆細胞(hiPSC−PPC、22.1%±2.9
%)。これら2つの血管細胞タイプは分化全体の77.2%±6.3%を構成し(図9B
、C)、血管細胞タイプへのこの分化の高効率および特異性を実証した。hiPSC−E
Cは、内皮マーカー(CD31、VE−カドヘリンおよびKDR)を均一に発現したが、
血管周囲マーカー(CD140b)も、平滑筋マーカー(α−平滑筋アクチン、α−SM
A)も、造血マーカー(CD45)も発現しなかった(図9Dおよび図10A〜C)。
れている(Melero−Martin et al.In vivo vasculo
genic potential of human blood−derived e
ndothelial progenitor cells.Blood 109,47
61−4768(2007))。SB431542は、ヒト胚性幹細胞由来内皮細胞のイ
ンビトロ拡張を改善することが示されている。(James et al.,Expan
sion and maintenance of human embryonic
stem cell−derived endothelial cells by T
GFbeta inhibition is Id1 dependent.Nat B
iotechnol.28,161−166(2010))。ヒト肺は、2200億個の
細胞を含有することが予測され、その30%は毛細血管内皮細胞である。本明細書におい
て、記載される培地は、20%のFBSおよびSB431542の両方をEGM−2への
サプリメントとして組み合わせる(EGM−FBS−SB培地と称される)。このEGM
−FBS−SB培地は、精製hiPSC−ECの、ヒトサイズ化肺のエンジニアリングに
十分なレベルへの効率的な拡張を可能とした(図9E)。
PSC−PPCはCD140bを均一に発現したが、内皮CD31を均一に発現しなかっ
た。hiPSC−PPCの半数超は、周皮細胞マーカーNG2も発現した(図9F)。
それはインビボ血管リモデリングおよびインビトロ分化の間に観察されている。この潜在
性を示すため、平滑筋分化をhiPSC−PPCにおいて、培養培地をSmooth M
uscle Growth Medium−2(SmGm−2)に切り替えることにより
誘導した。拡張培地(EGM−FBS−SB)中で拡張される細胞の目標数に応じて数日
〜数週間培養した場合、hiPSC−PPCは増殖性のままであり、低レベルの平滑筋マ
ーカー(α−SMAおよびカルポニン)を発現した。培養期間は、拡張から達成すべき細
胞の目標数に応じて数日間〜数週間の範囲であり得る。SmGm−2中での6日間の培養
後、hiPSC−PPCは増殖性が低くなり、高レベルのα−SMAおよびカルポニンを
発現した(図9G、H)。
の2段階培養
4000万個のhiPSC−ECを2000万個のmCherry標識hiPSC−P
PCと混合し、無細胞肺足場中に上記のとおりPAおよびPVの両方から播種した。2時
間の静置培養後、灌流を1ml/分においてPAおよびPVの両方から再開させた。1日
目から開始して、PVカニューレを解放し、灌流をPA単独からの4ml/分に切り替え
、それを培養終了まで維持した。hiPSC再生肺を、最初の4日間の間、ホルボール−
12−ミリステート−13−アセテート(PMA、50ng/ml、Cell Sign
aling Technology)が補給された血管新生培地中で培養し、次いでさら
に2日間、安定化培地中で培養した。6日目に機能的および組織学的評価のためにhiP
SC再生肺を回収した。
C−ECおよびPPCを同時播種し、それらのhiPSC再生肺を連続的に、血管新生培
地を用いて連続灌流下で4日間培養し、さらに2日間安定化させた。ホルボール12−ミ
リステート13−アセテート(PMA)は、効率的な血管リモデリングを容易にすること
が示されており、したがって、血管新生培地に、hiPSC再生肺培養のためのPMAを
補給して内皮生存および血管リモデリングを促進した。
の2段階培養
培養の終了まで、生存内皮ネットワークは肺全体にわたり存在した。さらに、血管周囲
腔中へのhiPSC−PPCのホーミングは、トランスジェニックmCherry標識お
よびCD140b発現の両方により確認した(図11A、B)。生理学的頂側膜−基底膜
極性をhiPSC再生肺中で再確立させ、hiPSC由来血管細胞を使用する血管腔形成
を示した(図11C)。HUVEC−hMSC再生肺における機能的なリードアウトと同
様に、hiPSC再生肺におけるデキストラン保持率は培養期間にわたり徐々に増加し、
2日目に39.6%±1.2%、4日目に61.2%±4.2%および6日目に67.3
%±2.5%に達した(図11D)。毎日のPA圧モニタリングは、1日目と比較して3
日目に64.8%±10.6%に達した培養の最初の3日間の間のPA圧の定常減少を示
し、それはその後も安定したままであった(図11E)。hiPSC再生肺の湿/乾比は
25.1±6.1(図11F)であり、それはHUVEC−hMSC再生肺のものと有意
に異なることはなかった(p=0.83)。hiPSC再生左肺内の灌流可能な血管は、
蛍光マイクロ血管造影により示されるとおり同所移植の3日後において検出することがで
きる(図11G)。
系を再生させ、一次ヒト内皮および血管周囲細胞を使用して達成されたものと類似する形
態学的および機能的布石を達成した。
ヒトスケールの肺血管系の再生および肺組織の機能性の評価
本実施例の目的は、ヒトスケールの肺血管系を再生させる能力を実証し、肺組織の機能
性を評価することである。スケーラブル細胞分化プロトコルは、分化前の間のCHIR9
9021によるWnt活性化、分化の終了時におけるSB431542によるTGF−β
阻害および分化全体の間の低酸素培養を取り込む。
2段階培養
脱細胞化ヒト肺の右上葉を解剖し、バーブ型ルアーアダプター(Cole−Parme
r)を使用して主要PAおよびPVの両方にカニューレ挿入した。無細胞ヒト肺葉を、ヒ
トフィブロネクチン(2.5μg/ml)を有する1Lのハンクス平衡塩溶液によるPA
およびPVの両方からの10ml/分における灌流により1時間プライミングし、次いで
ハンクス平衡塩溶液により1時間洗浄し、培地中で平衡化した。2億8200万個のhi
PSC−ECおよび1億2500万個のmCherry−標識hiPSC−PPCを混合
し、1Lの培地中で再懸濁させ、2つの播種チャンバ(それぞれ、500mlの細胞懸濁
液を有する)中に分離した。細胞を50mmHgに等しい重力下でPAおよびPVの両方
から同時に播種した。2時間の静置培養後、灌流を10ml/分においてPAおよびPV
の両方から再開した。hiPSC再生ヒト肺葉を血管新生培地(PMA、50ng/ml
を含有)中で最初の4日間培養し、次いで安定化培地中でさらに2日間培養した。6日目
に機能的および組織学的評価のためにhiPSC再生ヒト肺葉を回収した。
hiPSC再生ヒト肺葉中で生存細胞を可視化するため、レザズリン灌流を培養の6日
目に実施した。手短に述べると、40mlのPrestoBlue試薬(Molecul
ar Probes)を約1.5Lの培養培地中で希釈し、再生ヒト肺葉に通して10m
l/分においてPAおよびPVの両方から2時間灌流させた。
げっ歯類モデルを使用する本明細書に記載の方法を、ヒトサイズ化肺の肺血管系の再生
にアップスケールした。例えば、上記のとおり生成した2億8200万個のhiPSC−
ECおよび1億2500万個のhiPSC−PPCの混合物を、無細胞ヒト肺葉の主要P
AおよびPV中に送達した(図12A、B)。再播種ヒト肺葉を血管新生培地(PMAを
含有)中で4日間培養し、次いで安定化培地中でさらに2日間培養した。葉全体にわたる
血管細胞の一般的分布を可視化し、それらの生存を評価するため、レザズリン灌流アッセ
イを開発した。レザズリンベース試薬は、生存細胞により代謝可能になる場合に赤色に変
化し、したがって、生存細胞の分布を示す。2時間のレザズリン灌流後、再生ヒト肺葉の
推定60%超が、細胞化を示す赤色により強調された(図12B−iv)。これは、培養
の終了時における組織学的分析により裏付けられ、ラット肺再生において達成されたもの
と類似する最適な内皮分布を示した(図12C)。血管ネットワーク周囲のhiPSC−
PPCの厳密な会合も、トランスジェニックmCherry標識およびCD140b染色
の両方により示される再生ヒト肺葉中で再現された(図12D)。血管腔構造は容易に検
出することができ(図12C)、その灌流可能性は蛍光マイクロ血管造影により実証され
た(図12E)。まとめると、本明細書に記載の、および無細胞ラット肺をベースとする
細胞送達および臓器培養方針をアップスケールしてhiPSC由来細胞を使用してヒト肺
血管系を再生させることができる。
本発明をその詳細な説明とともに記載した一方、上記の説明は本発明を説明するもので
あり、その範囲を限定するものではないことを理解すべきである。本発明の主旨および範
囲から逸脱せずに種々の改変を行うことができることを理解されたい。したがって、他の
実施形態は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は以下の態様を含みうる。
[1]血管再生の方法であって、
(a)内皮細胞を肺足場に送達すること;
(b)血管周囲細胞を前記肺足場に送達すること;
(c)多段階培養プログラムを前記足場に提供すること
を含み、前記多段階培養プログラムは、
(1)40〜100ng/mlの血管新生促進因子を有する血管新生培地を送達することを含む第1の段階、ならびに
(2)0.5〜2%の血清および1〜20ng/mlの血管新生因子を有する安定化培地を送達することを含む第2の段階
を含む方法。
[2]前記血管新生促進因子が、組換えヒトVEGF、bFGF、ANG1、EGFおよびPDGFの少なくとも1つを含む、上記[1]に記載の方法。
[3]前記安定化培地が、ホルスコリンまたはヒドロコルチゾンの少なくとも1つを含む、上記[1]に記載の方法。
[4]前記肺足場を包囲するバイオリアクター中で前記肺足場を維持することをさらに含み、前記バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含む、上記[1]に記載の方法。
[5]前記肺足場が、気道および血管系を含み、
(a)前記気道を前記気管経路に接続すること;
(b)前記肺足場を前記動脈経路および前記静脈経路に接続すること;ならびに
(c)前記肺足場に前記動脈経路および前記静脈経路を介して細胞を播種すること
をさらに含む、上記[4]に記載の方法。
[6]血管再生の方法であって、
(a)HUVECおよび血管周囲支持hMSCを肺足場に送達すること;
(b)第1の段階の間に血管新生培地を前記肺足場に送達すること;ならびに
(c)第2の段階の間に安定化培地を前記肺足場に送達すること
を含む方法。
[7]前記肺足場を包囲するバイオリアクター中で前記肺足場を維持することをさらに含み、前記バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含み、前記HUVECおよび血管周囲支持hMSCを前記動脈経路および前記静脈経路に通して送達する、上記[6]に記載の方法。
[8]ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)から内皮細胞および血管周囲細胞を分化させる方法であって、
(a)前記hiPSCを少なくとも1つのGSK3阻害剤の存在下で培養すること;
(b)前記hiPSCを完全分化培地の存在下で培養すること;
(c)前記hiPSCをTGF−β1阻害剤が補給された前記分化培地により培養すること;および
(d)hiPSC由来血管周囲前駆細胞(hiPSC−PPC)とhiPSC由来内皮細胞(hiPSC−EC)とを分離すること
を含む方法。
[9]前記少なくとも1つのGSK3阻害剤が、CHIR99021である、上記[8]に記載の方法。
[10]前記少なくとも1つのTGF−β1阻害剤が、SB431542である、上記[8]に記載の方法。
[11]4%以下のO2の低酸素培養条件を維持することをさらに含む、上記[8]に記載の方法。
[12]十分な血管および培養の第1の段階の終了を示すCD31およびVE−カドヘリン発現により定義される内皮被覆の増加のプラトーを計測することをさらに含む、上記[8]に記載の方法。
[13]血管再生のための気道臓器バイオリアクター機器であって、
肺チャンバ;
前記肺チャンバに移動可能に連結され、肺足場への内皮細胞の送達および前記肺足場への血管周囲細胞の送達のために構成された少なくとも1つの進入経路;ならびに
ポンプに連結された制御モジュールを含み、前記制御モジュールは、多段階培養プログラムの施与を前記肺足場にもたらすように構成されており、前記多段階培養プログラムは、
第1の段階において、40〜100ng/mlの血管新生促進因子を有する血管新生培地を送達すること、および
第2の段階において、0.5〜2%の血清および1〜20ng/mlの血管新生因子を有する安定化培地を送達すること
を含む機器。
Claims (13)
- 血管再生の方法であって、
(a)内皮細胞を肺足場に送達すること;
(b)血管周囲細胞を前記肺足場に送達すること;
(c)多段階培養プログラムを前記足場に提供すること
を含み、前記多段階培養プログラムは、
(1)40〜100ng/mlの血管新生促進因子を有する血管新生培地を送達すること
を含む第1の段階、ならびに
(2)0.5〜2%の血清および1〜20ng/mlの血管新生因子を有する安定化培地
を送達することを含む第2の段階
を含む方法。 - 前記血管新生促進因子が、組換えヒトVEGF、bFGF、ANG1、EGFおよびP
DGFの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記安定化培地が、ホルスコリンまたはヒドロコルチゾンの少なくとも1つを含む、請
求項1に記載の方法。 - 前記肺足場を包囲するバイオリアクター中で前記肺足場を維持することをさらに含み、
前記バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含む、請求項1に記載
の方法。 - 前記肺足場が、気道および血管系を含み、
(a)前記気道を前記気管経路に接続すること;
(b)前記肺足場を前記動脈経路および前記静脈経路に接続すること;ならびに
(c)前記肺足場に前記動脈経路および前記静脈経路を介して細胞を播種すること
をさらに含む、請求項4に記載の方法。 - 血管再生の方法であって、
(a)HUVECおよび血管周囲支持hMSCを肺足場に送達すること;
(b)第1の段階の間に血管新生培地を前記肺足場に送達すること;ならびに
(c)第2の段階の間に安定化培地を前記肺足場に送達すること
を含む方法。 - 前記肺足場を包囲するバイオリアクター中で前記肺足場を維持することをさらに含み、
前記バイオリアクターは、気管経路、動脈経路、および静脈経路を含み、前記HUVEC
および血管周囲支持hMSCを前記動脈経路および前記静脈経路に通して送達する、請求
項6に記載の方法。 - ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)から内皮細胞および血管周囲細胞を分化させる方
法であって、
(a)前記hiPSCを少なくとも1つのGSK3阻害剤の存在下で培養すること;
(b)前記hiPSCを完全分化培地の存在下で培養すること;
(c)前記hiPSCをTGF−β1阻害剤が補給された前記分化培地により培養するこ
と;および
(d)hiPSC由来血管周囲前駆細胞(hiPSC−PPC)とhiPSC由来内皮細
胞(hiPSC−EC)とを分離すること
を含む方法。 - 前記少なくとも1つのGSK3阻害剤が、CHIR99021である、請求項8に記載
の方法。 - 前記少なくとも1つのTGF−β1阻害剤が、SB431542である、請求項8に記
載の方法。 - 4%以下のO2の低酸素培養条件を維持することをさらに含む、請求項8に記載の方法
。 - 十分な血管および培養の第1の段階の終了を示すCD31およびVE−カドヘリン発現
により定義される内皮被覆の増加のプラトーを計測することをさらに含む、請求項8に記
載の方法。 - 血管再生のための気道臓器バイオリアクター機器であって、
肺チャンバ;
前記肺チャンバに移動可能に連結され、肺足場への内皮細胞の送達および前記肺足場への
血管周囲細胞の送達のために構成された少なくとも1つの進入経路;ならびに
ポンプに連結された制御モジュールを含み、前記制御モジュールは、多段階培養プログラ
ムの施与を前記肺足場にもたらすように構成されており、前記多段階培養プログラムは、
第1の段階において、40〜100ng/mlの血管新生促進因子を有する血管新生培地
を送達すること、および
第2の段階において、0.5〜2%の血清および1〜20ng/mlの血管新生因子を有
する安定化培地を送達すること
を含む機器。
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