CN117070442B - 静脉内皮细胞及其制备方法、静脉血管畸形模型及其制备方法 - Google Patents

静脉内皮细胞及其制备方法、静脉血管畸形模型及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种静脉内皮细胞及其制备方法、静脉血管畸形模型及其制备方法，静脉内皮细胞的制备方法包括：将诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养，得到增殖干细胞；将增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞；第一分化培养基包括第一基础培养基和第一培养基添加剂；第一培养基添加剂包括GSK‑3抑制剂；将中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养，第二分化培养基包括第二基础培养基和第二培养基添加剂；第二培养基添加剂包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ‑分泌酶抑制剂和维甲酸，得到具有较强的血管生成能力和重构能力的静脉内皮细胞。

Description

静脉内皮细胞及其制备方法、静脉血管畸形模型及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种静脉内皮细胞及其制备方法、静脉血管畸形模型及其制备方法。
背景技术
静脉畸形(venous malformations，VMs)主要是由静脉内皮细胞先天畸形发育造成的常见疾病，常在出生时出现，好发于头、面部，也可累及四肢、躯干。临床上往往表现为血管病变部位的肿胀、膨隆，并常伴有疼痛，甚至溃疡、出血，给患者带来巨大的生活负担，严重者甚至引起器官移位、骨骼畸形、功能障碍。近年来，VMs的生物学特性、临床和病理分类及其治疗一直是本领域研究的热点，因此，静脉内皮细胞作为VMs形成机制的首要参与者，在VMs的形成过程中起着至关重要的作用，高效、简便的静脉内皮细胞原代培养的方法，建立静脉血管畸形模型是对静脉血管畸形发病机制的研究和临床药物治疗的筛选的基础。但现有的关于VMs的模型是基于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs）过表达多拷贝突变基因，如TIE2（受体酪氨酸激酶亚家族中的一员）的方式，与静脉畸形患者内皮细胞单拷贝基因突变的情况不符，因此该种方法不能很好的模拟实际发病原因，且HUVECs在体外传代次数有限，限制了可采取的基因编辑手段。并且现有内皮细胞可通过诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells， iPSCs)分化获得，但现有iPSCs分化成内皮细胞的方法并不能很好区分动脉内皮细胞和静脉内皮细胞。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种静脉内皮细胞及其制备方法、静脉血管畸形模型及其制备方法，通过建立将诱导多能干细胞高效分化为静脉内皮细胞的方法，获得了在体内具有较强的血管生成能力和重构能力的静脉内皮细胞，且通过引入TIE2 L914F基因突变，能够为体外建立静脉血管畸形模型创造一个良好的血管微环境。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种静脉内皮细胞的制备方法，包括以下过程：
将诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养，得到增殖干细胞；
将所述增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞；其中，所述第一分化培养基包括第一基础培养基和第一培养基添加剂；所述第一培养基添加剂包括GSK-3抑制剂；
将所述中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养，得到所述静脉内皮细胞；其中，所述第二分化培养基包括第二基础培养基和第二培养基添加剂；所述第二培养基添加剂包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ-分泌酶抑制剂和维甲酸。
本发明还公开了一种采用上述的制备方法制备得到的静脉内皮细胞。
本发明还公开了一种静脉血管畸形模型的制备方法，包括以下过程：
将诱导多能干细胞置于干细胞培养基中进行培养后加入细胞解离剂，解离所述诱导多能干细胞的聚集体，得到分散成单个细胞的诱导多能干细胞的悬浮液；
将所述悬浮液与含有TIE2 L914F的质粒混合进行转染，得到转染后的培养物；
将所述转染后的培养物置于含有ROCK抑制剂的干细胞培养基进行培养，选择阳性细胞进行单克隆化培养，并通过测序筛选，得到具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞；
将所述具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养，得到增殖干细胞；
将所述增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞；其中，所述第一分化培养基包括第一基础培养基和第一培养基添加剂；所述第一培养基添加剂包括GSK-3抑制剂；
将所述中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养，得到突变的静脉内皮细胞，所述突变的静脉内皮细胞即为所述静脉血管畸形模型；其中，所述第二分化培养基包括第二基础培养基和第二培养基添加剂；所述第二培养基添加剂包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ-分泌酶抑制剂和维甲酸。
本发明还公开了一种采用如上述的静脉血管畸形模型的制备方法制备得到的静脉血管畸形模型。
实施本发明实施例，将具有如下有益效果：
本发明实施例通过在基础培养基中添加多种诱导小分子和能干预Notch等通路的关键因子组合，建立了将诱导多能干细胞高效分化为静脉内皮细胞的方法，获得了在体内具有较强的血管生成能力和重构能力的静脉内皮细胞。同时，整个诱导过程操作简单，不涉及动物源性细胞和成分，大大提高了诱导多能干细胞来源的静脉内皮细胞的高效性、功能性、安全性。
本发明实施例通过将杂合的TIE2 L914F(2740 C>T)突变引入诱导多能干细胞中，并将具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞定向分化为具有TIE2 L914F基因突变的静脉内皮细胞，由此构造静脉血管畸形模型，能够为体外建立静脉血管畸形模型创造一个良好的血管微环境，对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的实践意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1是TIE2 L914F型iPSCs和野生型iPSCs的Sanger测序图。
图2是流式细胞术分析表达CD31的动脉内皮细胞（AECs）和静脉内皮细胞（VECs）在不同分化时间点上CD73和CXCR4的表达图。
图3是动脉内皮细胞（AECs）和静脉内皮细胞（VECs）的动脉和静脉标记物免疫染色图（标尺:100 μm）。
图4是Western blot分析动脉内皮细胞（AECs）和静脉内皮细胞（VECs）中NOS3、Notch1和NR2F2的表达图。
图5是野生型和突变型的动脉内皮细胞（AECs）和野生型和突变型的静脉内皮细胞（VECs）中AKT激活水平的Western blot分析图。
图6是野生型和突变型的动脉内皮细胞（AECs）和野生型和突变型的静脉内皮细胞（VECs）的成管腔实验对比图（比例尺:200μm）。
图7是突变型的静脉内皮细胞（VECs）和野生型的静脉内皮细胞（VECs）的静脉内皮细胞构建的静脉血管畸形模型对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一种静脉内皮细胞的制备方法，包括：
S110，将诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养，得到增殖干细胞。
在一具体实施例中，干细胞维持培养基包括99vol%的ncEpic Basal Medium、0.8vol%的ncEpic Supplement和0.2vol%的Pen/Strep。
在一具体实施例中，S110具体包括以下步骤：
S111，干细胞的复苏
S1111，在6孔板中以1μg/cm2加入用DMEM/F12稀释后的Matrigel，轻摇6孔板使溶液均匀铺于孔中，室温包被培养板至少30min。
S1112，从液氮中取出1管冻存好的hPSC细胞系H1。
S1113，用镊子夹持细胞在37℃水浴锅中迅速摇晃解冻，将解冻细胞转移至50ml离心管。
S1114，用10 ml移液管吸取10 ml DMEM/F12培养基，缓慢滴加至含有解冻细胞的50 ml离心管中，同时持续摇晃离心管使溶液混匀。全部滴加完毕后，在离心机中以300 g离心3 min。
S1115，弃去上清，用4 ml干细胞维持培养基重悬细胞，同时在细胞悬液中添加终浓度为5μM的Y27632，轻摇离心管使细胞混匀。
S1116，弃去包被好的培养板中的DMEM/F12，将S1015中的细胞悬液以每孔2 ml加入6孔板的2个孔中，上下左右移动培养板10次以使细胞均匀铺在孔中，将细胞放于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
S112，干细胞的换液
每隔24h，弃去6孔板中的培养基，并按每孔2 ml更换干细胞培养基。
S113，干细胞的传代
当细胞密度达到80%~90%时，进行干细胞的传代。
S1131，以步骤S1111操作包被1块6孔板。
S1132，弃去6孔板中的培养基，按每孔2 ml加入1×PBS洗涤，轻摇6孔板洗去孔中的死细胞，随后弃去PBS。
S1133，按每孔1 ml加入0.5 mM EDTA，将细胞放回37℃、5% CO2细胞培养箱中。
S1134，6 min后取出细胞，轻柔吹打使细胞脱落并形成均匀的细胞悬液，每孔加入1 ml DMEM/F12终止消化，将细胞转移至离心管中。在离心机中以300 g离心3 min。
S1135，弃去离心管中上清液，并用12 ml干细胞维持培养基重悬细胞，同时在细胞悬液中添加终浓度为5μM的Y27632，轻摇离心管使细胞混匀。
S1136，弃去包被好的培养板中的DMEM/F12，将S1135中的细胞悬液以每孔2 ml加入6孔板中，上下左右移动培养板10次以使细胞均匀铺在孔中，将细胞放于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。
S120，将增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞；其中，第一分化培养基包括第一基础培养基和第一培养基添加剂；第一培养基添加剂包括GSK-3抑制剂。
具体的，添加GSK-3抑制剂以激活Wnt信号通路促进诱导多能干细胞向中胚层祖细胞的诱导分化进程。
在一具体实施例中，GSK-3抑制剂包括CHIR99021。
在一具体实施例中，GSK-3抑制剂在第一分化培养基中的浓度为6μM。
在一具体实施例中，第一基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep。
在一具体实施例中，步骤S120具体包括以下步骤：
S121，按步骤S113中的传代方法对增殖干细胞进行传代。
S122，将传代24h后的增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段传代培养72h，其中，每隔24 h进行一次换液，得到中胚层祖细胞。
S130，将中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养，得到静脉内皮细胞；其中，第二分化培养基包括第二基础培养基和第二培养基添加剂；第二培养基添加剂包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ-分泌酶抑制剂和维甲酸（RA）。
具体的，通过在第二分化培养基中添加成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ-分泌酶抑制剂和维甲酸，各组分可协同诱导中胚层祖细胞定向分化为静脉内皮细胞，其中，通过添加纤维细胞生长因子，可以促进内皮细胞增殖和迁移、血管生长；添加血管内皮生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用；通过添加γ-分泌酶抑制剂，能选择性的抑制γ-分泌酶的功能，特异性的阻断Notch通路；通过添加维甲酸能够促进细胞分化。
在一具体实施例中，成纤维细胞生长因子在第二分化培养基中的浓度为30ng/mL；血管内皮生长因子在第二分化培养基中的浓度为10ng/mL；γ-分泌酶抑制剂在第二分化培养基中的浓度为10μM；维甲酸在第二分化培养基中的浓度为2μM。
在一具体实施例中，成纤维细胞生长因子包括FGF2；血管内皮生长因子包括VEGFA；γ-分泌酶抑制剂包括DAPT。
在一具体实施例中，第二基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep。
在一具体实施例中，步骤S130具体包括以下步骤：
S131，按步骤S113中步骤S1131-步骤S1135对中胚层祖细胞进行消化传代，在血球计数板中进行计数，弃去离心管中的上清，并使用第二分化培养基重悬得到细胞溶液，中胚层祖细胞在细胞溶液中的密度为1×105~2×105/ml，轻摇离心管使细胞混匀，得到细胞悬液。
S132，将细胞悬液以每孔2 ml加入未经表面处理的6孔板中，上下左右移动培养板10次以使细胞均匀铺在孔中，将细胞放于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养72h，每隔24h进行一次换液，得到静脉内皮细胞。
本发明还公开了一种如本发明任意实施例的方法制备得到的静脉内皮细胞。
具体的，本发明通过在基础培养基中添加多种诱导小分子和能干预Notch等通路的关键因子组合，建立了将诱导多能干细胞高效分化为静脉内皮细胞的方法，获得了在体内具有较强的血管生成能力和重构能力的静脉内皮细胞。同时，整个诱导过程操作简单，不涉及异源血清，大大提高了诱导多能干细胞来源的静脉内皮细胞的高效性、功能性、安全性。
本发明还公开了一种静脉血管畸形模型的制备方法，包括以下过程：
S210，将诱导多能干细胞置于干细胞培养基中进行培养后加入细胞解离剂，解离诱导多能干细胞的聚集体，得到分散成单个细胞的诱导多能干细胞的悬浮液。
S220，将悬浮液与含有TIE2 L914F的质粒混合进行转染，得到转染后的培养物。
S230，将转染后的培养物置于含有ROCK抑制剂的干细胞培养基进行培养，选择阳性细胞进行单克隆化培养，并通过测序筛选，测序结果正确的基因编辑干细胞即为具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞。
S240，将具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养，得到增殖干细胞。
在一具体实施例中，步骤S240对具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养的方法与步骤S111-步骤S113中的方法相同。
S250，将增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞；其中，第一分化培养基包括第一基础培养基和第一培养基添加剂；第一培养基添加剂包括GSK-3抑制剂。
在一具体实施例中，步骤S250对增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养的方法与步骤S121-步骤S122中的方法相同。
S260，将中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养，得到点突变静脉内皮细胞，点突变静脉内皮细胞即为静脉血管畸形模型；其中，第二分化培养基包括第二基础培养基和第二培养基添加剂；第二培养基添加剂包括成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ-分泌酶抑制剂和维甲酸。
在一具体实施例中，步骤S260对中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养的方法与步骤S131-步骤S132中的方法相同。
在一具体实施例中，转染采用电转的方式将含有TIE2 L914F的质粒导入诱导多能干细胞中。
具体的，将诱导多能干细胞置于基质胶Matrigel包被的干细胞培养基上进行培养。为了将外源的含有TIE2 L914F的质粒成功导入到细胞中，利用细胞解离剂将诱导多能干细胞解离成单个细胞后，将分散成单个细胞的诱导多能干细胞的悬浮液与含有TIE2L914F的质粒混合重悬于电转液中，加入到电转杯后，调用Lonza 电转仪（型号：Nucleofector 2B）中与干细胞电转配套的程序B-016，完成电转后，将电转后的培养物加到含有ROCK抑制剂的干细胞培养基进行培养48h后，添加相应的药物（例如puromycin），筛选出具有阳性的细胞进行单克隆，获得高纯度的具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞。
在一具体实施例中，细胞解离剂包括乙二胺四乙酸。
在一具体实施例中，细胞解离剂在悬浮液中的浓度为0.5mM。
在一具体实施例中，ROCK抑制剂包括Y27632。
在一具体实施例中，ROCK抑制剂在干细胞培养基中的浓度为5μM。
在一具体实施例中，干细胞培养基包括ncEpic培养基。
在一具体实施例中，成纤维细胞生长因子在第二分化培养基中的浓度为30ng/mL；血管内皮生长因子在第二分化培养基中的浓度为10ng/mL；γ-分泌酶抑制剂在第二分化培养基中的浓度为10μM；维甲酸在第二分化培养基中的浓度为2μM；GSK-3抑制剂在第一分化培养基中的浓度为6μM。
在一具体实施例中，GSK-3抑制剂包括CHIR99021；成纤维细胞生长因子包括FGF2；血管内皮生长因子包括VEGFA；γ-分泌酶抑制剂包括DAPT。
在一具体实施例中，干细胞维持培养基包括99vol%的ncEpic Basal Medium、0.8vol%的ncEpic Supplement和0.2vol%的Pen/Strep。
在一具体实施例中，第一基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep。
在一具体实施例中，第二基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep。
本发明还公开了一种采用如本发明任意实施例的静脉血管畸形模型的制备方法制备得到的静脉血管畸形模型。
具体的，导致静脉畸形发病的重要原因为TIE2突变，众多突变中又以TIE2的L914F体细胞突变最常见。对于一些范围局限、边界清楚、不波及重要功能结构的静脉畸形病变可以单纯通过手术切除达到治愈目的，但手术治疗仍面临复发的可能性。并且静脉畸形引起畸形、疼痛和局部血管内凝血病，随着时间的推移而扩大，针对这种情况的靶向药物治疗是不可用的。因此，本发明通过将杂合的TIE2 L914F(2740 C>T)突变引入诱导多能干细胞中，并将具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞定向分化为具有TIE2 L914F基因突变的静脉内皮细胞，由此构造静脉血管畸形模型，对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的实践意义。
以下为具体实施例
实施例1
1、干细胞的复苏
表1 干细胞维持培养基配制
1）在6孔板中以1μg/cm2加入用DMEM/F12稀释后的Matrigel，轻摇6孔板使溶液均匀铺于孔中，室温包被培养板至少30 min。
2）从液氮中取出1管冻存好的hPSC细胞系H1。
3）用镊子夹持细胞在37℃水浴锅中迅速摇晃解冻，将解冻细胞转移至50 ml离心管。
4）用10 ml移液管吸取10 ml DMEM/F12培养基，缓慢滴加至含有解冻细胞的50 ml离心管中，同时持续摇晃离心管使溶液混匀。全部滴加完毕后，在离心机中以300 g离心3min。
5）弃去上清，用4 ml干细胞维持培养基重悬细胞，同时在细胞悬液中添加终浓度为5μM的Y27632，轻摇离心管使细胞混匀。
6）弃去包被好的培养板中的DMEM/F12，将5）中的细胞悬液以每孔2 ml加入6孔板的2个孔中，上下左右移动培养板10次以使细胞均匀铺在孔中，将细胞放于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
2、干细胞的换液
每隔24 h，弃去6孔板中的培养基，并按每孔2 ml更换干细胞培养基。
3、干细胞的传代
当细胞密度达到80%~90%时，进行干细胞的传代。
1）以步骤1中的步骤1）操作包被1块6孔板。
2）弃去6孔板中的培养基，按每孔2 ml加入1×PBS洗涤，轻摇6孔板洗去孔中的死细胞，随后弃去PBS。
3）按每孔1 ml加入0.5 mM EDTA，将细胞放回37℃、5% CO2细胞培养箱中。
4）6 min后取出细胞，轻柔吹打使细胞脱落并形成均匀的细胞悬液，每孔加入1 mlDMEM/F12终止消化，将细胞转移至离心管中。在离心机中以300 g离心3 min。
5）弃去离心管中上清液，并用12 ml干细胞维持培养基重悬细胞，同时在细胞悬液中添加终浓度为5μM的Y27632，轻摇离心管使细胞混匀。
6）弃去包被好的培养板中的DMEM/F12，将5）中的细胞悬液以每孔2 ml加入6孔板中，上下左右移动培养板10次以使细胞均匀铺在孔中，将细胞放于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4、静脉内皮细胞的分化
表2 第一分化培养基配制
表3第二分化培养基配制
1）按步骤3中方法进行增值干细胞的传代
2）将传代24h后的增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段传代培养72h，其中，每隔24 h进行一次换液，得到中胚层祖细胞。
3）按3中步骤1）-步骤5）对中胚层祖细胞进行消化传代，在血球计数板中进行计数，弃去离心管中的上清，并使用第二分化培养基重悬得到细胞溶液，中胚层祖细胞在细胞溶液中的密度为1×105~2×105/ml，轻摇离心管使细胞混匀，得到细胞悬液。
4）将细胞悬液以每孔2 ml加入未经表面处理的6孔板中，上下左右移动培养板10次以使细胞均匀铺在孔中，将细胞放于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养72h，每隔24h进行一次换液，得到静脉内皮细胞。
实施例2
1、获得具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞
将诱导多能干细胞置于基质胶Matrigel包被的干细胞培养基上进行培养，干细胞培养基为ncEpic。为了将外源的含有TIE2 L914F的质粒成功导入到细胞中，加入浓度为0.5mM的EDTA将诱导多能干细胞解离成单个细胞后，将分散成单个细胞的诱导多能干细胞的悬浮液与含有TIE2 L914F的质粒混合重悬于电转液中，加入到电转杯后，调用Lonza 电转仪（型号：Nucleofector 2B）中与干细胞电转配套的程序B-016，完成电转后，将电转后的培养物加到含有浓度为5μM的ROCK抑制剂的ncEpic培养基进行培养48h后，添加相应的药物（例如puromycin），筛选出具有阳性的细胞进行单克隆，并通过测序筛选，测序结果如图1所示，图1为TIE2 L914F型iPSCs和野生型iPSCs的Sanger测序图，获得高纯度的具有TIE2L914F基因突变的诱导多能干细胞。
2、具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞的传代培养
表4 干细胞维持培养基配制
将具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中按照实施例1中的1-3中的方法进行传代培养，得到增殖干细胞。
3、获得静脉血管畸形模型
表5 第一分化培养基配制
表6第二分化培养基配制
将增殖干细胞置于第一分化培养基中按照实施例1中的静脉内皮细胞的分化中步骤1）-步骤2）的方法进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞。
将中胚层祖细胞置于第二分化培养基中按照实施例1中的静脉内皮细胞的分化中步骤3）-步骤4）的方法进行第二阶段分化培养，得到突变的静脉内皮细胞，即获得静脉血管畸形模型。
对比例1
本对比例采用野生型动脉内皮细胞。
对比例2
本对比例采用具有TIE2 L914F基因突变的动脉内皮细胞。
对比例3
本对比例采用野生型静脉内皮细胞。
测试例
1、验证静脉内皮的功能
根据静脉内皮细胞在体内能产生一氧化氮（NO），对血流剪切应力的敏感性较低，相比动脉内皮细胞，静脉内皮细胞招募免疫细胞能力更强，因此对实施例1制备得到的静脉内皮细胞与对比例1的野生型动脉内皮细胞相比较，结果如图2-4所示，图2为流式细胞术分析表达CD31的动脉内皮细胞（AECs）和静脉内皮细胞（VECs）在不同分化时间点上CD73和CXCR4的表达图，图3为动脉内皮细胞（AECs）和静脉内皮细胞（VECs）的动脉和静脉标记物免疫染色图（标尺:100 μm），图4为Western blot分析动脉内皮细胞（AECs）和静脉内皮细胞（VECs）中NOS3、Notch1和NR2F2的表达图，结果发现，本发明通过利用诱导多能干细胞分化得到的静脉内皮细胞具有静脉内皮特异性表达的标志物；且在功能上，由诱导多能干细胞分化得到的静脉内皮细胞相比于动脉内皮细胞表现出黏附更多的巨噬细胞，和表达更多的NOS3。
2、对实施例2和对比例1-3进行验证表型，结果如图5-6所示，图5为野生型和突变型的动脉内皮细胞（AECs）和野生型和突变型的静脉内皮细胞（VECs）中AKT激活水平的Western blot分析图，图6为野生型和突变型的的动脉内皮细胞（AECs）和野生型和突变型的静脉内皮细胞（VECs）的成管腔实验对比图（比例尺:200μm），其中，成管腔实验测试过程具体为：取50微升/孔预冷的 Matrigel 溶液(Corning, #354230)加入96孔板中，加入时避免产生气泡，置于培养箱中30min待其凝固。内皮细胞计数后重悬细胞并调整细胞密度为10万个/mL。待Matrigel凝固后取出96孔板，每孔加入100微升细胞悬液，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养4h~6h，拍照记录，利用ImageJ统计成管长度。结果发现，与野生型静脉内皮细胞相比，携带突变的静脉内皮细胞异常增殖，成管腔能力减弱。
3、体外验证静脉血管畸形模型
为了验证由具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞分化的具有TIE2 L914F基因突变的静脉内皮细胞在体内成血管的能力。将实施例2得到的具有TIE2 L914F基因突变的静脉内皮细胞和对比例3的野生型静脉内皮细胞分别移植到免疫缺陷NSG小鼠肾包囊下。取出移植物后，利用组织切片HE染色和免疫荧光染色验证具有突变的静脉内皮细胞在体内形成畸形人源血管的密度和能力，结果如图7所示，图7为突变型的静脉内皮细胞（VECs）和野生型的静脉内皮细胞（VECs）的静脉内皮细胞构建的静脉血管畸形模型对比图，结果发现，将具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞来源的突变的静脉内皮细胞植入免疫缺陷小鼠的肾包囊中，突变的静脉内皮细胞表现出血管异常扩张，缺乏正常的血管结构，造成出血和血栓形成，重现了患者的表型。
综上，本发明首先通过在基础培养基中添加多种诱导小分子和能干预Notch等通路的关键因子组合，建立了将诱导多能干细胞高效分化为静脉内皮细胞的方法，获得了在体内具有较强的血管生成能力和重构能力的静脉内皮细胞。本发明其次由具有TIE2 L914F基因突变的诱导多能干细胞定向分化为突变的静脉内皮细胞，由此构造静脉血管畸形模型，能够为体外建立静脉血管畸形模型创造一个良好的血管微环境，对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的实践意义。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种静脉内皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下过程：
将诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养，得到增殖干细胞；
将所述增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞；其中，所述第一分化培养基包括第一基础培养基和第一培养基添加剂；所述第一培养基添加剂为GSK-3抑制剂；所述第一基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep；
将所述中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养，得到所述静脉内皮细胞；其中，所述第二分化培养基包括第二基础培养基和第二培养基添加剂；所述第二培养基添加剂为成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ-分泌酶抑制剂和维甲酸；所述第二基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep；
所述成纤维细胞生长因子在所述第二分化培养基中的浓度为30ng/mL；
所述血管内皮生长因子在所述第二分化培养基中的浓度为10ng/mL；
所述γ-分泌酶抑制剂在所述第二分化培养基中的浓度为10μM；
所述维甲酸在所述第二分化培养基中的浓度为2μM；
所述GSK-3抑制剂在所述第一分化培养基中的浓度为6μM。
2.根据权利要求1所述的静脉内皮细胞的制备方法，其特征在于，所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021；
所述成纤维细胞生长因子包括FGF2；
所述血管内皮生长因子包括VEGFA；
所述γ-分泌酶抑制剂包括DAPT。
3.根据权利要求1所述的静脉内皮细胞的制备方法，其特征在于，所述干细胞维持培养基包括99vol%的ncEpic Basal Medium、0.8vol%的ncEpic Supplement和0.2vol%的Pen/Strep。
4.一种静脉血管畸形模型的制备方法，其特征在于，包括以下过程：
将诱导多能干细胞置于干细胞培养基中进行培养后加入细胞解离剂，解离所述诱导多能干细胞的聚集体，得到分散成单个细胞的诱导多能干细胞的悬浮液；
将所述悬浮液与含有TIE2L914F的质粒混合进行转染，得到转染后的培养物；
将所述转染后的培养物置于含有ROCK抑制剂的干细胞培养基进行培养，选择阳性细胞进行单克隆化培养，并通过测序筛选，得到具有TIE2L914F基因突变的诱导多能干细胞；
将所述具有TIE2L914F基因突变的诱导多能干细胞置于干细胞维持培养基中进行传代培养，得到增殖干细胞；
将所述增殖干细胞置于第一分化培养基中进行第一阶段分化培养，得到中胚层祖细胞；其中，所述第一分化培养基包括第一基础培养基和第一培养基添加剂；所述第一培养基添加剂为GSK-3抑制剂；所述第一基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep；
将所述中胚层祖细胞置于第二分化培养基中进行第二阶段分化培养，得到突变的静脉内皮细胞，所述突变的静脉内皮细胞即为所述静脉血管畸形模型；其中，所述第二分化培养基包括第二基础培养基和第二培养基添加剂；所述第二培养基添加剂为成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、γ-分泌酶抑制剂和维甲酸，所述第二基础培养基包括94.8vol%~98vol%的Advanced DMEM/F12、1vol%的GlutaMAX、0vol%~3.2vol%的Vc和0.2vol%的Pen/Strep；
所述成纤维细胞生长因子在所述第二分化培养基中的浓度为30ng/mL；
所述血管内皮生长因子在所述第二分化培养基中的浓度为10ng/mL；
所述γ-分泌酶抑制剂在所述第二分化培养基中的浓度为10μM；
所述维甲酸在所述第二分化培养基中的浓度为2μM；
所述GSK-3抑制剂在所述第一分化培养基中的浓度为6μM。
5.根据权利要求4所述的静脉血管畸形模型的制备方法，其特征在于，所述转染采用电转的方式将含有TIE2L914F的质粒导入所述诱导多能干细胞中。
6.根据权利要求4所述的静脉血管畸形模型的制备方法，其特征在于，所述细胞解离剂包括乙二胺四乙酸；
所述细胞解离剂在所述悬浮液中的浓度为0.5mM；
所述ROCK抑制剂包括Y27632；
所述ROCK抑制剂在所述干细胞培养基中的浓度为5μM；
所述干细胞培养基包括ncEpic培养基。
7.根据权利要求4所述的静脉血管畸形模型的制备方法，其特征在于，
所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021；
所述成纤维细胞生长因子包括FGF2；
所述血管内皮生长因子包括VEGFA；
所述γ-分泌酶抑制剂包括DAPT；
所述干细胞维持培养基包括99vol%的ncEpic Basal Medium、0.8vol%的ncEpicSupplement和0.2vol%的Pen/Strep。
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