ES2219432T3 - Cabestrillos o parches fasciales artificiales. - Google Patents

Cabestrillos o parches fasciales artificiales.

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ES2219432T3 ES00986394T ES00986394T ES2219432T3 ES 2219432 T3 ES2219432 T3 ES 2219432T3 ES 00986394 T ES00986394 T ES 00986394T ES 00986394 T ES00986394 T ES 00986394T ES 2219432 T3 ES2219432 T3 ES 2219432T3
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Abstract

Cabestrillo o parche fascial artificial, que comprende: una policapa de células secretoras de colágeno derivadas de una población celular cultivada sobre un sustrato biocompatible; y una policapa de células secretoras de elastina derivada de una segunda población de células cultivadas sobre la policapa de la población de células secretoras de colágeno, de forma que las células de las dos poblaciones diferentes forman una interfase quimérica.

Description

Cabestrillos o parches fasciales artificiales.
Antecedentes de la invención
El campo técnico de la presente invención se refiere al tratamiento de la incontinencia urinaria. Es sabido en la práctica de la cirugía que se pueden tratar pacientes con incontinencia urinaria de esfuerzo mediante la construcción de un cabestrillo para aguantar la vejiga. Normalmente los cabestrillos están diseñados para prevenir las pérdidas proporcionando una presión circunférica a nivel del cuello de la vejiga. Típicamente la construcción de tales cabestrillos implica la rotación de varios músculos y sus fascias asociadas (Mohenfellnev (1986) Sling Procedures in Surgery, en Stanton SI, Tanaglo E (eds) Surgery of Female Incontinence, 2ª edición, Berlín; Springer-Verlag).
Se han utilizado muchos materiales naturales y sintéticos para construir estos cabestrillos, tales como el cabestrillo de Martex (Morgan, et al. (1985) Amer. J. Obst. Gynec.: 151: 224-226); el cabestrillo de fascia lata (Beck, et al. (1988) Obst. Gynec. 72: 699-703); el cabestrillo de pared vaginal (Juma, et al. (1992) Urology, 39: 424-428); el cabestrillo de Aldridge (McIndoe et al. (1987) Aust. N. Z. J. Obst. Gynaecol. 27: 238-239); y el cabestrillo de corium porcino (Josif (1987) Arch. Gynecol. 240: 131-136). También se han preparado cabestrillos a partir de injertos alogénicos, particularmente si el paciente presenta un fascia de mala calidad.
Sin embargo, existen una serie de problemas asociados con la utilización de estos procedimientos y materiales. Entre los problemas asociados con la utilización de un material natural como cabestrillo se incluyen el encogimiento, necrosis, y adelgazamiento de la fascia que finalmente afecta a la eficiencia y durabilidad a largo plazo del cabestrillo (Blaivas (1991) J. Urol. 145: 1214-1218). Otra desventaja importante en la utilización de un material natural es que resulta necesario practicar una cirugía extensa, la cual puede causar morbosidad, típicamente a consecuencia de un daño nervioso o infección de la herida (McGuire et al. (1978) J. Urol. 119: 82-84; Beck et al. (1974) Am. J. Obstet. Gynecol. 129: 613-621). Adicionalmente, los cabestrillos naturales obtenidos a partir de donantes humanos conllevan el riego adicional de causar una reacción inmune en el receptor.
Como alternativa, se han utilizado materiales sintéticos en pacientes que presentaban tejido fascial de mala calidad o insuficiente para fines reconstructivos. Sin embargo, la utilización generalizada de estos materiales se ha visto limitada por los informes de rechazo de injerto, formación de senos, obstrucción uretral y erosión uretral (ver, p. ej., Nichols (1973) Obstet. Gynecol. 41: 88-93; Morgan et al. (1985) Am. J. Obstet. 151: 224-226; y Chin et al. (1995) Br. J. Obstet. Gyneacol., 102: 143-147).
El documento WO-A 98/35632 da a conocer un cabestrillo prefabricado de suspensión uretral realizado en un material biocompatible para evitar los problemas de los cabestrillos existentes realizados en tejido natural o materiales sintéticos.
Sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una solución alternativa a los problemas asociados con los cabestrillos y parches fasciales existentes para el tratamiento de la incontinencia urinaria.
Este objetivo se alcanza mediante el cabestrillo o parche artificial definido en la reivindicación 1.
La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que las células mesenquimáticas que secretan elastina y colágeno, dos proteínas extracelulares responsables de la elasticidad y resistencia, respectivamente, pueden ser utilizadas para conseguir fascia artificial in vitro.
Descripción detallada
En primer lugar se definen algunos términos para que la invención se entienda más fácilmente:
El término "policapa" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una disposición que comprende múltiples capas de una población celular cultivada homogénea que se sobreponen entre sí. El procedimiento de preparar una "policapa" implica depositar una capa de una población celular sobre una superficie, p. ej., un sustrato biocompatible. Las células depositadas se cultivan en medio de crecimiento hasta que se desarrollan y proliferan para formar una monocapa que comprende células con un fenotipo y morfología deseados. Cuando la primera monocapa ha alcanzado la densidad celular deseada, se deposita una segunda capa de la misma población celular sobre la primera monocapa. La segunda capa de células depositadas se cultiva en medio de crecimiento que proporciona nutrientes tanto a la segunda capa celular como a la primera monocapa, hasta que las células de la segunda capa se desarrollan y proliferan para formar una bicapa que presenta células con un fenotipo y morfología deseados. Se puede depositar una tercera capa de la misma población celular sobre la bicapa, y las células se cultivan en medio de crecimiento que proporciona nutrientes a la bicapa y a las células de la tercera capa, hasta que las células de la tercera capa se desarrollan y proliferan hasta una densidad deseada para formar una tricapa que presenta células con un fenotipo y morfología deseados. Este procedimiento se puede repetir hasta preparar una policapa que comprende muchas capas de una población celular homogénea. Las características de la policapa son tales que se parecen mucho a la morfología y características funcionales del tejido parenquimatoso equivalente de un órgano in vivo. Por ejemplo, una policapa que comprenda una población celular de músculo liso puede tener características funcionales del tejido muscular liso de una vejiga, es decir, el detrusor.
El término "interfase quimérica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la frontera formada entre dos poblaciones celulares diferentes. La interfase quimérica también incluye la frontera formada entre una población celular y una población no celular, por ejemplo, una población celular de fibroblastos y colágeno aislado.
El término "biomaterial intersticial" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la formación de material celular en la interfase quimérica donde dos poblaciones celulares diferentes se encuentran en contacto entre sí. El término "biomaterial intersticial" en su sentido más amplio incluye la formación de cualquier material celular nuevo formado cuando dos o más poblaciones celulares diferentes se encuentran en contacto entre sí. El material celular nuevo se parece al material celular equivalente producido en el desarrollo celular normal in vivo de un órgano.
El término "sustrato biocompatible" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un material que es apropiado para la implantación en un sujeto sobre el que se puede depositar una población celular. Un sustrato biocompatible no ocasiona efectos tóxicos o dañinos una vez implantado en el sujeto.
El término "células secretoras de colágeno" se refiere a células que producen colágeno, tales como células mesenquimáticas, por ejemplo, fibroblastos, condroblastos, osteoblastos y odontoblastos. Sobre el sustrato biocompatible también se puede depositar colágeno que ha sido extraído a partir de una fuente de origen mamífero, tal como colágeno extraído a partir de piel o tendones.
El término "células secretoras de elastina" se refiere a células que producen elastina, tales como células mesenquimáticas, por ejemplo, células de músculo liso, condrocitos, y fibroblastos. Sobre el sustrato biocompatible también se puede depositar elastina que ha sido extraída a partir de una fuente de origen mamífero, tal como elastina extraída a partir de piel.
El término "sujeto" tal como se utiliza en la presente memoria incluye organismos vivos en los que se elicita una respuesta inmune. Los sujetos preferidos son los mamíferos. Entre los ejemplos de sujetos se incluyen, pero no están limitados a, humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cerdos, cabras y ovejas.
El término "estructura urinaria" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una estructura responsable de la incontinencia urinaria la cual requiere un reposicionamiento utilizando un cabestrillo artificial. El reposicionamiento de la estructura urinaria resulta en una mejora de la incontinencia urinaria. Entre los ejemplos de estructura urinaria se incluyen, pero no se limitan a, la vejiga, uretra y uréter.
En los siguientes apartados se describen más detalladamente varios aspectos de la invención:
I. Sustratos biocompatibles
Un sustrato biocompatible se refiere a materiales que no presentan efectos tóxicos o dañinos sobre las funciones biológicas. Entre los ejemplos de sustratos biocompatibles se incluyen, pero no se limitan a, ácido poliglicólico y poliglactina, desarrollado como un material de sutura sintético absorbible. Las fibras de ácido poliglicólico y poliglactina se pueden utilizar tal como las suministra el fabricante. Entre otros materiales biodegradables se incluyen el éter de celulosa, celulosa, éster celulósico, polietileno fluorado, fenólico, poli-4-metilpenteno, poliacrilonitrilo, poliamida, poliamidaimida, poliacrilato, polibenzoxazol, policarbonato, policianoarileter, poliéster, poliestercarbonato, poliéter, polieteretercetona, polieterimida, polietercetona, polietersulfona, polietileno, polifluoroolefina, poliimida, poliolefina, polioxadiazol, óxido de polifenileno, polifenileno, sulfuro, polipropileno, poliestireno, polisulfuro, polisulfona, politetrafluoroetileno, politioeter, politriazol, poliuretano, fluoruro de polivinilideno, celulosa regenerada, urea-formaldehído, o copolímeros o mezclas físicas de estos materiales. El material se puede impregnar con agentes antimicrobianos apropiados y se les puede dar color con un aditivo colorante para mejorar la visibilidad y ayudar en los procedimientos quirúrgicos.
II. Cultivo celular
Un aspecto de la invención se refiere a la preparación de cabestrillos artificiales que comprenden una o más poblaciones celulares. Los cabestrillos artificiales pueden ser cabestrillos artificiales alogénicos, en los que las poblaciones celulares cultivadas derivan del tejido del propio sujeto. Los cabestrillos artificiales también pueden ser xenogénicos, en los que las poblaciones celulares cultivadas derivan de una especie de mamífero distinta a la del sujeto. Por ejemplo, las células pueden derivar de órganos de mamíferos tales como monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cerdos, cabras y ovejas.
Las células se pueden aislar a partir de varias fuentes, por ejemplo, a partir de biopsias, o autopsias. Preferentemente, las células aisladas son autólogas, obtenidas por biopsia a partir del sujeto. Por ejemplo, una biopsia de músculo liso del área tratada con anestesia local con una pequeña cantidad de lidocaína inyectada subcutáneamente. Las células del tejido biopsiado se pueden expandir en cultivo. La biopsia se puede obtener utilizando una aguja para biopsia, una aguja de acción rápida que hace que el procedimiento sea rápido y sencillo. Seguidamente, el pequeño núcleo de la biopsia se puede expandir y cultivar tal como se describe en Atala, et al. (1992) J. Urol. 148, 658-62; Atala, et al. (1993) J. Urol. 150: 608-12. También se pueden utilizar células de parientes u otros donantes de la misma especie con una inmunosupresión apropiada, por ejemplo, células endoteliales de venas diseccionadas, o células fibroblásticas de prepucios (ver ejemplos 1 y 2 respectivamente).
La disociación de las células hasta una etapa de células individuales no resulta esencial para el cultivo primario inicial ya que se puede alcanzar una suspensión de células individuales después de un período de cultivo in vitro. La disociación del tejido se puede realizar mediante rotura mecánica o enzimática de la matriz extracelular y las uniones intracelulares que mantienen las células unidas. Entre los tipos celulares preferidos se incluyen, pero no se limitan a, células mesenquimáticas, especialmente células de músculo liso, células de músculo esquelético, miocitos (células estaminales musculares), fibroblastos, condrocitos, osteoblastos, condroblastos, ondoblastos, adipocitos, fibromioblastos, y células ectodérmicas, incluyendo células dúctiles y de piel, hepatocitos, y otras células perenquimáticas. En una forma de realización preferida, se aíslan células fibroblásticas.
Las células se pueden cultivar in vitro para incrementar el número de células disponibles para recubrir el sustrato biocompatible. Para evitar el rechazo tisular es preferible la utilización de células alogénicas, y más preferentemente células autólogas. Sin embargo, si se produce una respuesta inmunológica en el sujeto después de la implantación del órgano artificial, el sujeto pude ser tratado con agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina o FK506, para reducir la probabilidad de rechazo. En ciertas formas de realización, el sustrato biocompatibles se puede recubrir con células quiméricas o células de un animal transgénico.
Las células pueden ser transfectadas con material genético antes del recubrimiento. Un material genético útil puede ser, por ejemplo, secuencias genéticas capaces de reducir o eliminar una respuesta inmune en el huésped. Por ejemplo, se puede suprimir la expresión de antígenos de superficie celular tales como antígenos de histocompatibilidad de clase I y clase II. Lo anterior puede permitir que las células transplantadas presenten una baja probabilidad de ser rechazadas por el huésped. Además, la transfección también puede ser utilizada para la modificación de un gen.
Los cultivos celulares se pueden preparar con o sin una etapa de fraccionamiento celular. El fraccionamiento celular se puede llevar a cabo utilizando técnicas conocidas en la técnica, tal como la separación de células activadas por fluorescencia. El fraccionamiento celular se puede realizar en base al tamaño celular, contenido en ADN, antígenos de la superficie celular, y viabilidad.
Las células aisladas pueden ser normales o manipuladas genéticamente para proporcionar funciones adicionales. Se pueden utilizar procedimientos para preparar células modificadas por ingeniería genética con vectores retrovirales, polietilenglicol, u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen la utilización de vectores de expresión que transportan y expresan moléculas de ácido nucleico en las células. (Ver Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
El ADN del vector se puede introducir en las células mediante técnicas convencionales de transformación o transfección. Los procedimientos apropiados para transformar o transfectar células huésped se pueden encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989) y otros manuales de laboratorio.
III. Preparación de cabestrillos artificiales
En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para preparar cabestrillos artificiales utilizando una o más poblaciones celulares cultivadas sobre un sustrato biocompatible. Las células se pueden expandir tal como se describe en la Sección II, y se pueden utilizar para crear policapas sobre un sustrato biocompatible. Las poblaciones celulares cultivadas pueden ser utilizadas para preparar policapas heterogéneas sobre una o más superficies de un sustrato biocompatible. Los ejemplos de sustratos biocompatibles apropiados se describen la Sección I.
En una forma de realización, una superficie del sustrato biocompatible se utiliza para preparar un cabestrillo artificial. Lo anterior se puede realizar depositando una suspensión de una población celular secretora de colágeno (p. ej., células mesenquimáticas tales como fibroblastos, condroblastos, osteoblastos y ondoblastos) en una cara del sustrato biocompatible. Las células secretoras de colágeno se incuban hasta que las células se desarrollan y proliferan para formar por lo menos una monocapa de células. Seguidamente, se puede depositar una segunda suspensión de células secretoras de colágeno sobre la primer capa, y las células se incuban hasta que se desarrollan y proliferan para formar una bicapa. Este procedimiento se repite para preparar una policapa de células secretoras de colágeno.
En otra forma de realización, se puede añadir colágeno al sustrato biocompatible. Por ejemplo, el colágeno puede derivar de cualquiera de las fuentes de origen mamífero, típicamente piel y tendones bovinos, porcinos u ovinos. El colágeno se puede extraer con ácido a partir de la fuente de colágeno utilizando un ácido débil, tal como ácido acético, cítrico, o fórmico. Una vez extraído en solución, el colágeno se puede precipitar con sal utilizando NaCl y recuperar, utilizando procedimientos estándar tales como la centrifugación o la filtración, Los detalles del colágeno extraído con ácido se dan a conocer, por ejemplo, en la patente US nº 5.106.949, de Kemp et al.
En otra forma de realización, se puede añadir colágeno adicional entre las policapas heterogéneas para promover el crecimiento y desarrollo entre las células de las policapas heterogéneas. Aún en otra forma de realización, entre las policapas heterogéneas se pueden añadir factores tales como nutrientes, factores de crecimiento, citocinas, componentes de la matriz extracelular, inductores de diferenciación o desdiferenciación, productos de secreción, inmunomodulación y/o compuestos biológicamente activos que potencian o permiten el crecimiento de la red celular.
Después de que se establezca la policapa de colágeno, se puede crear una policapa de elastina utilizando una suspensión de una población celular secretora de elastina (p. ej., células de músculo liso, condrocitos y fibroblastos). Las células de las células secretoras de elastina se incuban hasta que las células se desarrollan y proliferan para formar por lo menos una monocapa de células. Seguidamente, se deposita una segunda suspensión de células secretoras de elastina sobre la primera capa, y las células se incuban hasta que se desarrollan y proliferan para formar una bicapa. Este procedimiento se repite para preparar una policapa de células secretoras de elastina.
Se produce una interfase quimérica cuando dos o más policapas heterogéneas se encuentran en contacto mutuo entre sí. Esto permite que se produzca una interacción limpia entre las células de las policapas. Las interacciones extensas entre poblaciones celulares diferentes resultan en la producción de un material intersticial, el cual puede desarrollarse para formar un biomaterial intersticial que es distinto respecto cada una de las policapas. El biomaterial intersticial puede proporcionar unas propiedades biológicas y funcionales únicas al cabestrillo artificial.
Los expertos en la técnica apreciarán que cualquier biomaterial intersticial producido cuando interaccionan dos o más policapas heterogéneas que comprenden poblaciones celulares diferentes, se encuentra comprendido en el alcance de la invención. El diferente biomaterial intersticial producido dependerá del tipo de células de la policapa heterogénea.
En otra forma de realización, se utilizan por lo menos dos superficies del sustrato biocompatible para preparar el cabestrillo artificial. Lo anterior se puede realizar depositando una suspensión de unas células secretoras de colágeno (p. ej., células mesenquimáticas tales como fibroblastos, condroblastos, osteoblastos y ondoblastos) sobre una superficie del sustrato biocompatible. Las células secretoras de colágeno se incuban hasta que las células se desarrollan y proliferan para formar una monocapa de células. Este procedimiento se repite para formar una policapa de células secretoras de colágeno. Seguidamente, se puede depositar una suspensión de células secretoras de elastina (p. ej., células de músculo liso, condrocitos y fibroblastos) sobre una segunda superficie, la cual está frente a la primera superficie de un sustrato biocompatible. Las células secretoras de elastina se incuban hasta que las células se desarrollan y proliferan para formar una monocapa de células. El procedimiento se repite para preparar una policapa de células secretoras de elastina.
Los expertos en la técnica apreciarán que la longitud y anchura del cabestrillo artificial se puede seleccionar en función del tamaño del sujeto y la estructura urinaria que requiere ser reposicionada para mejorar la incontinencia urinaria. La longitud y anchura del cabestrillo artificial se pueden modificar fácilmente dando forma al sustrato biocompatible para que tenga la longitud y anchura deseadas. En una forma de realización, el cabestrillo fascial artificial presenta un
sustrato biocompatible con una longitud (definida por un primer y segundo extremo largo) comprendida entre aproximadamente 10 cm y aproximadamente 30 cm. El cabestrillo fascial artificial puede tener además una longitud comprendida entre aproximadamente 15 cm y aproximadamente 25 cm. En una forma de realización preferida, el cabestrillo fascial artificial incluye un sustrato biocompatible con una longitud de aproximadamente 20 cm. En otra forma de realización, el sustrato biocompatible presenta una anchura (definida por un primer y segundo extremo corto) comprendida entre aproximadamente 0,5 cm y aproximadamente 4,0 cm. El cabestrillo fascial artificial puede tener además una anchura comprendida entre aproximadamente 1,0 cm y aproximadamente 3,0 cm. En una forma de realización preferida, el cabestrillo fascial artificial presenta un sustrato biocompatible con una anchura de aproximadamente 2,0 cm.
El cabestrillo artificial se puede fijar a una estructura de soporte del sujeto. La estructura de soporte para fijar el cabestrillo artificial se puede seleccionar en base a la anatomía del sujeto, por ejemplo, la estructura de soporte para un sujeto macho puede ser diferente de la estructura de soporte para un sujeto hembra. Entre los ejemplos de estructuras de soporte se incluyen, pero no se limitan a, el hueso del pubis, hueso pélvico y arco púbico inferior.
El cabestrillo artificial se puede fijar a una estructura de soporte con un agente de fijación. Entre los ejemplos de agentes de fijación se incluyen, pero no se limitan a, matriz de fieltro, parche de malla y para suturas. Los procedimientos para fijar el cabestrillo artificial a la estructura de soporte son conocidos en la técnica. (ver, p. ej., Horbach et al. (1988) Obst. and Gyn. 71: 648-652; Raz et al. (1988) J. Urol. 139: 528-531; Mickey et al. (1990) Obst. and Gyn. 75: 461-463; Handa et al. (1996), Obst. and Gyn. 88: 1045-1049; Barbalias et al. (1997) Eur. Urol., 31: 394-400; Govier et al. (1997) J. Urol. 157: 117-121; Jorion (1997) J. Urol 157: 926-928; Wright et al. (1998) J. Urol. 160: 759-762).
La tensión del cabestrillo artificial dispuesto alrededor de la estructura urinaria también puede ser ajustada para proporcionar la mejora requerida de la incontinencia. Esto se puede realizar, por ejemplo, ajustando el cabestrillo fascial artificial sobre sí mismo, lo cual proporciona la capacidad de cambiar la tensión del cabestrillo artificial en incrementos pequeños y también mueve la estructura urinaria a la posición deseada.
En otra forma de realización, también se puede utilizar la invención para preparar un parche fascial artificial que se puede sujetar a la base de la vejiga y la uretra. El parche fascial artificial puede entonces ser fijado a una estructura de soporte del sujeto para reposicionar la base de la vejiga y la uretra de forma que mejore la incontinencia urinaria.
Se pueden realizar evaluaciones urodinámicas para determinar el grado de mejora de la incontinencia urinaria. Los procedimientos para la evaluación urodinámica son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, videourodinámica con mediciones de la presión intravascular e intrauretral (ver, p. ej., Barbalias et al. (1997) Eur. Urol., 31: 394-400).
Un experto en la técnica apreciará otras características y ventajas de la invención en base a las formas de realización descritas anteriormente. Por consiguiente, la invención no se encuentra limitada por lo que se ha expuesto y descrito en particular, excepto por lo indicado en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo preparativo 1
Cultivo in vitro de células fibroblásticas
Este ejemplo describe uno de los muchos procedimientos posibles para aislar y cultivar células fibroblásticas. Se aisló tejido dérmico a partir del prepucio y se cortó en fragmentos de 2-3 mm de tamaño. Los fragmentos se dispusieron en una placa de cultivo celular de 100 mm y se dejó que se adhirieran a la placa durante aproximadamente 10 min. Después de que los fragmentos se adhirieran a la placa, se añadieron a la placa 15 ml de medio de cultivo (Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, HyClone Laboratories Inc., Logan, Utah) con un 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco) y penicilina/estreptomicina (Sigma, St. Louis, MO)), y las placas se incubaron sin movimiento durante 5 días a 37ºC con un 5% de CO^{2}. Cuando aparecieron pequeñas islas de células fibroblásticas, se cambió el medio de cultivo y se eliminaron los fragmentos de tejido no adherentes. Las células fibroblásticas adheridas se cultivaron hasta que se formó un número suficiente de células fibroblásticas. Estas células fibroblásticas se tripsinizaron, se contaron y se plaquearon en placas de 100 mm que contenían 10 ml de medio para una expansión adicional. El medio se cambió cada 3 días dependiendo de la densidad celular. Las células fibroblásticas se cultivaron hasta que presentaban una confluencia de aproximadamente el 80-90%.
Las células fibroblásticas se transfirieron eliminando el medio de cultivo, añadiendo 10 ml de PBS/EDTA (1 litro de PBS 1X que contiene 530 \mul, EDTA 0,5 M, con el pH ajustado a pH 7,2 con HCl 1M y esterilizado por filtración) e incubando durante 4 minutos. La separación de las células se confirmó utilizando un microscopio de contraste de fases. Después de una incubación de 4 minutos, se eliminó la solución de PBS/EDTA y se reemplazó por 5 ml de Tripsina/EDTA (0,05% tripsina, EDTA 0,53 mM) para dispersar las células. Las células dispersadas se plaquearon en placas de cultivo de 10 ml con un volumen total de células y medio de cultivo de 10 ml. Las células fibroblásticas se expandieron hasta conseguir una cantidad celular suficiente. A continuación se tripsinizaron las células, se recogieron, se lavaron y se contaron para la siembra.
Ejemplo preparativo 2
Cultivo in vitro de células endoteliales
Se aislaron células endoteliales a partir de una vena diseccionada. Se utilizó una solución perivenosa de heparina/papaverina (3 mg de papaverina diluida con HCl en 25 ml de solución salina balanceada de Hank (HBSS) que contenía 100 unidades de heparina (concentración final 4 u/ml)) para mejorar la conservación de las células endoteliales. Se dispuso un lazo de seda proximal alrededor de la vena y se fijó con un lazo. Se realizó una pequeña venotomía proximal al lazo y se insertó la punta de la cánula venosa y se inmovilizó con un segundo lazo. Se realizó una segunda venotomía pequeña por debajo del lazo proximal y la vena se limpió suavemente con Medio 199/solución de heparina Medio 199 (M-199) suplementado con suero bovino fetal al 20%, ECGF (100 \mug/ml),
L-glutamina, heparina (Sigma, 17,5 u/ml) y antibiótico-antimicótico), para eliminar la sangre y los coágulos sanguíneos. Se utilizó aproximadamente 1 ml de una solución de colagenasa (0,2% de colagenasa de tipo I de Worthington disuelta en 98 ml de M-199, 1 ml de FBS, 1 ml de PSF, a 37ºC durante 15-30 min, y esterilizada por filtración) para lavar la vena diseccionada. La solución de colagenasa también se utilizó para dilatar suavemente la vena y la vena dilatada se introdujo en un tubo de 50 ml que contenía solución salina balanceada de Hank (HBSS). El tubo que contenía la vena dilatada con colagenasa se incubó durante 12 minutos a 37ºC para digerir el revestimiento interno de la vena. Después de la digestión, el contenido de la vena, que contenía las células endoteliales, se pasó a un tubo estéril de 15 ml. La suspensión de células endoteliales se centrifugó a 125 x g durante 10 minutos. Las células endoteliales se resuspendieron en 2 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco con un 10% de FBS y penicilina/estreptomicina (DMEM/FBS 10%) y se plaqueó en una placa de 24 pocillos recubierta con difcogelatina al 1%. Las células endoteliales se incubaron durante una noche a 37ºC.
Después de incubar durante una noche, las células se lavaron con HBSS y se introdujeron en 1 ml de DMEM/ FBS 10% nuevo. El medio se cambió 3 veces por semana. Cuando los cultivos alcanzaron la confluencia (al cabo de 3-7 días), las monocapas confluentes se subcultivaron mediante tratamiento con tripsina al 0,05%, EDTA 0,53 mM, durante 3-5 min hasta que las células se dispersaron. Las células dispersadas se plaquearon en placas de cultivo recubiertas con difcogelatina al 1% a una relación de separación de 1:4-1:6. Las células endoteliales se expandieron hasta conseguir una cantidad celular suficiente. A continuación se tripsinizaron las células, se recogieron, se lavaron y se contaron para la siembra.
Ejemplo 3 Creación de un cabestrillo fascial artificial
Una matriz polimérica sintética de ácido poliglicólico se cortó a una longitud media de aproximadamente 15 cm y una anchura de aproximadamente 2 cm. La matriz de ácido poliglicólico se recubrió con un copolímero licuado, a una mezcla de aproximadamente 50% de poli-DL-lactato-co-glucósido y aproximadamente 50% de 80 mg/ml de cloruro de metileno, para obtener las características mecánicas deseadas. Después de la esterilización, el polímero se guardó en un desecador hasta que estuvo preparado para ser utilizado.
Para cada cabestrillo fascial, aproximadamente 32 placas confluentes de 25 cm de cada tipo celular, células secretoras de colágeno, células secretoras de elastina y células fibroblásticas, se procesaron para el recubrimiento sobre la matriz de ácido poliglicólico. Las células se resuspendieron en medio de cultivo y se aplicaron a una densidad celular de aproximadamente 10^{7} células/ml a una superficie de la matriz polimérica. El polímero recubierto se incubó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) suplementado con suero fetal de ternero al 10% (Biowhittaker Inc., Walkersville, MD). El medio se cambió a intervalos de 12 horas para asegurar un suministro suficiente de nutrientes. Las células se cultivaron hasta que se engancharon a la superficie del polímero y comenzaron a crecer y desarrollarse. Seguidamente, una segunda suspensión de células secretoras de colágeno se aplicó para recubrimiento sobre la capa de colágeno existente. Las células se incubaron hasta que crecieron y se desarrollaron para formar una capa de células de colágeno. El procedimiento se repitió hasta desarrollar una policapa de colágeno.
La población de células secretoras de elastina se aplicó para recubrimiento sobre la policapa de colágeno. Las células se incubaron hasta formar una interfase con la policapa de colágeno y se desarrollaron para formar una monocapa de células de elastina. Seguidamente, una segunda suspensión de células secretoras de elastina se aplicó a la monocapa de elastina y se dejó desarrollar hasta formar una segunda monocapa. El procedimiento se repitió hasta desarrollar una policapa de células de elastina sobre la policapa de células de colágeno. Finalmente, una población de células fibroblásticas se aplicó para recubrimiento sobre la policapa de células secretoras de elastina. Las células de cultivaron hasta desarrollar una monocapa de células fibroblásticas. Una segunda suspensión de células fibroblásticas se aplicó a la monocapa de células fibroblásticas, y las células se cultivaron hasta que crecieron y se desarrollaron para formar una segunda monocapa. El procedimiento se repitió hasta formar una policapa de fibroblastos.

Claims (8)

1. Cabestrillo o parche fascial artificial, que comprende:
una policapa de células secretoras de colágeno derivadas de una población celular cultivada sobre un sustrato biocompatible; y
una policapa de células secretoras de elastina derivada de una segunda población de células cultivadas sobre la policapa de la población de células secretoras de colágeno, de forma que las células de las dos poblaciones diferentes forman una interfase quimérica.
2. Cabestrillo o parche fascial artificial según la reivindicación 1, que además comprende una policapa de fibroblastos derivada de una población celular de fibroblastos cultivados de forma que la policapa de fibroblastos forma una interfase quimérica con la policapa de células secretoras de colágeno.
3. Cabestrillo o parche fascial artificial, que comprende:
una policapa de células secretoras de colágeno derivadas de una población celular cultivada sobre una primera superficie de un sustrato biocompatible; y
una policapa de células secretoras de elastina derivada de una segunda población celular cultivada sobre una segunda superficie del sustrato biocompatible, en el que la segunda superficie está frente a la primera superficie.
4. Cabestrillo o parche fascial artificial según la reivindicación 3, que además comprende una policapa de fibroblastos derivada de una población celular de fibroblastos cultivados de forma que la policapa de fibroblastos forma una interfase quimérica con por lo menos una policapa seleccionada de entre el grupo que consiste en una policapa de colágeno o una policapa de elastina.
5. Cabestrillo o parche fascial artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sustrato biocompatible se selecciona de entre el grupo que consiste en éter de celulosa, celulosa, éster celulósico, polietileno fluorado, fenólico, poli-4-metilpenteno, poliacrilonitrilo, poliamida, poliamidaimida, poliacrilato, polibenzoxazol, policarbonato, policianoarileter, poliéster, poliestercarbonato, poliéter, polieteretercetona, polieterimida, polietercetona, polietersulfona, polietileno, polifluoroolefina, poliimida, poliolefina, polioxadiazol, óxido de polifenileno, polifenileno, sulfuro, polipropileno, poliestireno, polisulfuro, polisulfona, politetrafluoroetileno, politioeter, politriazol, poliuretano, fluoruro de polivinilideno, celulosa regenerada, urea-formaldehído, o copolímeros o mezclas físicas de los mismos.
6. Cabestrillo o parche fascial artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un sustrato biocompatible de ácido poliglicólico.
7. Cabestrillo o parche fascial artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células secretoras de colágeno se seleccionan de entre el grupo que consiste en fibroblastos, condroblastos, osteoblastos y odontoblastos.
8. Cabestrillo o parche fascial artificial según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células secretoras de elastina se seleccionan de entre el grupo que consiste en células de músculo liso, condrocitos y fibroblastos.
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