TW201902467A

TW201902467A - 用於細胞植入的補釘移植物組成物

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Publication number: TW201902467A
Application number: TW107120078A
Authority: TW
Inventors: 羅拉 M. 瑞德; 張文成; 艾雷尼瓦西爾
Original assignee: 北卡羅來納大學教堂山
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2019-01-16
Also published as: IL271146B2; WO2018231726A1; MX2019014912A; US20180361028A1; RU2020100063A3; EP3976122A1; CA3140912A1; US20190388584A1; US20180353651A1; SG11201911701SA; AU2018282728A1; JP2020523173A; AU2020283472A1; BR112019026444A2; EP3638310A1; US20240082461A1; IL271146B; EP3976122A4; US20180361027A1; IL271146A

Abstract

係提供一種藉由移植策略，將移植細胞植入實質器官(尤其是內部器官)中之組成物與方法。這些方法與組成物可用於修復患病器官或用於在實驗宿主中建立疾病狀態模式。該方法涉及在組織或器官表面上貼覆上補釘移植物，一種“類似OK繃”之覆蓋物，其含有上皮細胞與支持性早期譜系階段間質細胞。該細胞整合入軟凝膠形成生物材料中，其在無血清、完全定義條件下製備，該條件包含營養素、脂質、維生素和調控信號，其共同支持供體細胞的幹細胞性。該移植物以生物可分解、生物相容性、生物可吸收之背襯覆蓋，其用於將移植物固定到目標部位。移植物中的細胞遷移進入並分散於該組織各處，使其可於幾週內均勻分散在受體(宿主)組織內。供體細胞植入與整合至器官或組織中的機制，涉及多種膜-結合和分泌形式之MMPs。

Description

用於細胞植入的補釘移植物組成物

相關申請案之相互參考本申請案根據 35 U.S.C. § 119(e)申明於2017年6月12日提申之美國申請案號 62/518,380，以及於2018年4月30日提申之美國申請案號62/664,694之優先權，在此併入本案以作為參考資料。

發明領域本發明一般相關於細胞移植或組織移植領域。更特別的是，由實體器官或組織移植入實體器官或組織，尤其是內部器官。本發明相關於一種組成物或方法，其可提供快速移植、植入與整合細胞至固體器官與組織中的策略，以治療實體器官或組織之疾病或病症，或建立疾病之模式系統。此潛能之代表性範例為用於治療肝臟或胰臟疾病之細胞治療。

發明背景長期以來，一直需要由實體器官移植細胞的策略，這些策略與用於移植造血細胞或間質幹/前驅細胞的策略不同。Turner, R., et al.Transplantation 90, 807-810 (2010); Gattinoni, L. et al.Nature Medicine 23, 18-27 (2017); Trounson A. et al.Cell Stem Cell 17, 11-22 (2015); Sun B.K. et al.Science 346, 941-945 (2014); Lainas, P. et al. J Hepatol 49, 354-362 (2008)。造血細胞和間質細胞的移植通常是經由血管通道輸送細胞進行，且由於微環境訊息傳導，一種稱為“歸巢”之過程，當位於相關目標位置時，會依賴移植細胞中附著分子的活化。用於皮膚的方法(與眼部目標相似的方法)係採用移植法，將細胞直接施加至目標位置。Sun B.K. et al.Science 346, 941-945 (2014)。許多用於皮膚的移植方法可用於來自實體內部器官的細胞，但需要大幅修飾以適應這些內部器官的微環境。移植物必須與組織和器官相互作用所產生的機械力相抗衡; 範例包括呼吸時肺部的作用，或肝臟對橫膈肌的壓迫，或處理食物期間腸道對鄰近組織施加的機械力的瞬時影響。由於考慮到器官結構的尺寸、形狀和複雜性，以及明顯的動態機械力，移植物，特別是內部器官的移植物，設計上受到相當大的挑戰。

數十年來，來自皮膚以外的實體器官細胞之細胞治療，嘗試使用經由血管途徑的移植或直接注射到組織中。當以這些策略傳送時，大多數移植的細胞不是死亡就是被運送到異位部位，在那裡它們可以存活幾個月並且在非恰當的部位產生組織，因而可能在臨床上產生不利影響。Turner, R., et al.Transplantation 90, 807-810 (2010); Lanzoni, G. et al.Stem Cells 31, 2047-2060 (2013)。藉由使用玻尿酸包覆細胞，並將它們經血管傳送至肝臟，可增進於肝臟之植入；植入效率的提高是由於肝臟之玻尿酸清除自然過程。Nevi et al.Stem Cell Research & Therapy 8, 68 , 2017。然而，這種增進仍然不如植入(engraft)策略效率更高，且重要的是，仍會使細胞遞送至異位部位。

目前仍然需要增進細胞植入實體器官的方法。本揭示滿足此種需求並提供相關優點。

發明概要長期以來，一直需要由實體器官移植細胞的策略(Turner, R., et al. Transplantation 90, 807-810 (2010)，這些策略與用於移植造血細胞或間質幹細胞或皮膚的策略不同。造血細胞和間質細胞的移植通常是經由血管通道輸送細胞進行，且由於微環境訊息傳導，一種稱為“歸巢”之過程，當位於相關目標位置時，會依賴移植細胞中附著分子的活化。用於皮膚的方法(與眼部目標相似的方法)係採用移植法，將細胞直接施加至目標位置。

由皮膚以外的實體器官移植細胞，長期以來一直使用血管遞送。這是不合邏輯的，因為這些細胞上的附著分子總是會被活化，而導致快速(數秒內)細胞聚集，因而可能產生威脅生命的血栓。即使成功控制血栓而盡量降低健康風險，但細胞植入效率低，成年細胞只有~20%，幹細胞/前驅細胞甚至更低(＜5%)。大多數移植的細胞不是死亡就是被運送到異位部位，在那裡它們可以存活幾個月並且在非恰當的部位產生組織，因而可能在臨床上產生不利影響。低百分比植入目標組織的細胞整合地相當緩慢，需要數週到數月才能成為組織的顯著部分。如果藉由使用玻尿酸包覆細胞，並經血管傳送至肝臟，則可增進於肝臟之植入，這是由於組織(如肝臟)之玻尿酸清除自然過程所致 (Nevi et al. Stem Cell Research & Therapy 8, 68 , 2017)。

本申請人提出了完全不同的方法，發現甚至比用玻尿酸包覆細胞更成功：將移植物直接放置在目標位置的表面上，並且在可加強移植生物材料移植的條件下，使用移植生物材料和某類型細胞的獨特表型特徵。這與皮膚細胞治療策略的某些方面相似，但需要對內部器官進行大幅修改，以提供彼此接近的器官之機械效應、磨損或壓縮，並提供特定器官周圍獨特的流體微環境，以及器官尺寸、結構和複雜性。

於此描述一種將細胞移植至組織或實體器官中之新穎補釘移植物組成物與方法。在某些實施例中，該方法與移植物係用於內部器官，設計特徵取決於細胞的成熟度，不論該細胞為幹細胞或成熟細胞。在某些實施例中，該用於補釘移植物之供體細胞(任擇地為自體或同種異體)，係加入移植生物材料中，任擇地為細胞混合物或類器官形式，上皮幹細胞與其原始、譜系階段適合之間質細胞夥伴- 例如，間質幹細胞/前驅細胞，如早期譜系期間充質細胞(ELSMCs)- 之聚集體。在某些實施例中，該供體細胞為加至移植材料中之成體細胞，為成體上皮細胞並搭配有間質幹細胞／前驅細胞，任擇地為ELSMC，之懸浮液，二者之比例經設計以使其可最佳化表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)。在某些實施例中，其他重要變數為移植生物材料與背襯材料，二者皆必須對於供體細胞不產生分化作用。

本發明之一觀點係相關於一種補釘移植物，用於維持並保持混合細胞群，包含：(a) 具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由存在於水凝膠基質中之培養液所支持，該水凝膠基質具有足以允許該混合群移動的黏彈性，可選地，在該水凝膠中移動或移動遠離該水凝膠及/或在該補釘移植物中移動或移動遠離該補釘移植物；(b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往該背襯之方向上移動之黏彈性，(c)覆蓋於該背襯漿膜(即外側)表面之水凝膠，該漿膜表面位於該混合群所接觸表面的對向，以及在其中該補釘移植物附著於目標位置之實施例中，該漿膜表面位於目標位置(如器官或組織)接觸側的對向。在一些實施例中，此層可預防或抑制被其他組織或器官沾黏。在一些實施例中，該補釘移植物係配置為可維持並保持該混合細胞群，同時抑制該至少一早期譜系細胞種類進行分化，或更進一步成熟為晚期譜系階段，其無法表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)。

在一些實施例中，該背襯為孔狀或非孔狀。在一些實施例中，該背襯包含多孔網狀物、支架或膜。在一些實施例中，該背襯包含絲、羊膜、胎盤、網膜、合成紡織品或其組合。在一些實施例中，該背襯包含注入有水凝膠之多孔網狀物。在其他實施例中，此種注入可預防細胞自目標器官或組織中移出。在一些實施例中，該背襯包含固體材料。

在一些實施例中，該水凝膠之一或多者包含玻尿酸。

在一些實施例中，該培養液包含Kubota培養液，或另一可支持幹細胞並維持幹細胞特性之培養液。

在一些實施例中，該混合群包含間質細胞與上皮細胞。在一些實施例中，該上皮細胞可為外胚層、內胚層或中胚層。在一些實施例中，該間質細胞包含早期譜系階段間質細胞(ELSMCs)。在一些實施例中，該ELSMCs包含一或多種血管新生細胞、內皮細胞之前驅細胞，或星狀細胞之前驅細胞，或間質幹細胞(MSCs)。在一些實施例中，該上皮細胞包含上皮幹細胞。在一些實施例中，該上皮細胞包含膽系幹細胞 (BTSCs)。在一些實施例中，該上皮細胞包含定型及/或成熟上皮細胞。在一些實施例中，該定型及/或成熟上皮細胞包含成熟實質細胞。在一些實施例中，該成熟實質細胞包含肝細胞、膽系細胞與胰島細胞之一或多者。在一些實施例中，該間質細胞與上皮細胞皆包含幹細胞。

在一些實施例中，該混合群包含自體及/或同種異體細胞。

在一些實施例中，一或多種細胞種類係經基因修飾。

其他觀點係相關於使用本發明補釘移植組成物之方法。因此，於此提供一種將細胞移植入目標組織之方法，包含將該目標組織與一補釘移植物接觸，該步驟包含、由下列組成，或實質上由該目標組織與本發明之補釘移植物接觸之步驟組成。

在該方法的一些實施例中，該目標組織選自於由肝臟、胰臟、膽系、甲狀腺、胸腺、胃腸、肺臟、前列腺、乳房、腦、膀胱、脊髓、皮膚、子宮、腎臟、肌肉、血管、心臟、軟骨、肌腱和骨骼組織組成之群組。在該方法的一些實施例中，該目標組織為肝臟組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為胰臟組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為膽系組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為胃腸組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織已患病、受傷或有症狀。在一些實施例中，該目標組織為腎臟組織。

在該方法的一些實施例中，該目標組織為一器官。在該方法的一些實施例中，該器官為肌肉骨骼系統、消化系統、呼吸系統、泌尿系統、女性生殖系統、男性生殖系統、內分泌系統、循環系統、淋巴系統、神經系統或皮膚系統之一器官。在一些實施例中，該器官選自於由肝臟、胰臟、膽系、甲狀腺、胸腺、胃、腸、肺臟、前列腺、乳房、腦、膀胱、脊髓、表皮與下方真皮組織、子宮、腎臟、肌肉、血管、心臟、軟骨、肌腱和骨骼組成之群組。在一些實施例中，該目標組織已患病、受傷或有症狀。

亦提供一種治療患有肝臟疾病或病症之個體的方法，該方法包含、由下列組成，或實質上由將該個體之肝臟與本發明之補釘移植物接觸之步驟組成。在該方法的一些實施例中，該肝臟疾病或病症為肝纖維化、肝硬化、血色素沉著症、肝癌，膽道閉鎖、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自體免疫性肝炎、肝蛭症、酒精性肝病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、第II型肝糖儲存症、轉甲狀腺素蛋白-相關之遺傳性澱粉樣變性、吉爾伯特症候群(Gilbert’s syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、布加症候群(Budd-Chiari syndrome)、肝外傷，或威爾遜氏症(Wilson disease)。

在其他觀點中，於此係提供一種治療患有胰臟疾病或病症之個體的方法，該方法包含、由下列組成，或實質上由將該個體之胰臟與本發明之補釘移植物接觸之步驟組成。在該方法的一些實施例中，該胰臟疾病或病症為糖尿病、胰外分泌功能不全、胰臟炎、胰臟癌、歐蒂氏括約肌功能障礙(sphincter of Oddi dysfunction)、囊性纖維化、胰臟分裂症、環狀胰臟、胰臟外傷或胰血管炎(hemosuccus pancreaticus)。

在其他觀點中，於此係提供一種治療患有胃腸疾病或病症之個體的方法，該方法包含、由下列組成，或實質上由將該個體之腸與本發明之補釘移植物接觸之步驟組成。在該方法的一些實施例中，該胃腸疾病或病症為腸胃炎、腸胃癌、迴腸炎、發炎性腸症、克羅恩氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、腸躁症後群、消化性潰瘍病、乳糜瀉、纖維化、血管發育不良、先天性巨結腸症(Hirschsprung’s disease)、假膜性結腸炎或胃腸外傷。

在其他觀點中，於此係提供一種治療患有腎臟疾病或病症之個體的方法，該方法包含、由下列組成，或實質上由該個體之腎臟與本發明之補釘移植物接觸之步驟組成。在該方法的一些實施例中，該腎臟疾病或病症為腎炎、腎病、腎炎症候群、腎病症候群、慢性腎病、急性腎損傷、腎外傷、囊性腎病、多囊腎病、腎小球腎炎、IgA腎病、狼瘡腎炎、腎癌、Alport症候群、澱粉樣變性、古德帕斯特症候群(Goodpasture syndrome)或韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)。

較佳實施例之詳細說明以下將更全面地描述本揭示之實施例。然而，本揭示的各方面可以不同形式具體化，且不應該被解釋為受限於此述的實施例。相反地，提供這些實施例是為了使本揭示透徹和完整，並將本發明的範圍完全傳達給本領域技術人員。於此描述中使用的術語僅用於描述特定實施例的目的，而不旨在限制本發明。本文提及的所有文獻、專利申請案、專利和其他參考文獻的完整內容在此併入本案以作為參考資料。

除非另外定義，否則這裡使用的所有術語(包括技術和科學術語)皆具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。將進一步理解的是，諸如通常使用的詞典中定義的那些術語，應被解釋為具有與其在本揭示和相關領域內容的含義一致的含義，且不應理解為理想化或過度形式意義，除非在此明確地如此定義。儘管以下沒有明確定義，但這些術語應該根據它們的通用含義來解釋。

除非另有說明，本技術的實施將採用常規組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA技術，這些技術在本領域的技術範圍內。請見如 Sambrook and Russell eds. (2012)Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 4rd edition; the series Ausubelet al . eds. (2012)Current Protocols in Molecular Biology ; the seriesMethods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPhersonet al . (1991)PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPhersonet al . (1995)PCR 2: A Practical Approach ; Harlow and Lane eds. (2014)Antibodies, A Laboratory Manual , 2d edition; Freshney (2011)Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique , 6th edition; Gait ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis ; 美國專利號4,683,195; Hames and Higgins eds. (1985)Nucleic Acid Hybridization ; Anderson (1999)Nucleic Acid Hybridization ; Hames and Higgins eds. (1984)Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984)A Practical Guide to Molecular Cloning ; Miller and Calos eds. (1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells ; Mayer and Walker eds. (1987)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); and Herzenberget al . eds (1996)Weir’s Handbook of Experimental Immunology 。

除非內文另有說明，否則本發明的各種特徵可以任何組合使用。此外，本揭示亦考量在一些實施例中，可排除或省略本文中闡述的任何特徵或特徵組合。為了說明，如果說明書指出複合物包含組成A、B和C，特別指A、B或C或其組合之任一者，可單獨或以任何組合省略且放棄。

所有數字標記，例如pH值、溫度、時間、濃度和分子量，包括範圍，皆為近似值，在適當的情況下以1.0或0.1的增量變化( + )或( - )，或者經由變化+/- 15%，或10%，或5%，或2%。應理解的是，儘管並非總是明確說明，但所有數字標記前面都有術語“約”。亦應理解的是，儘管並非總是明確說明，本文所述的試劑僅是示範性的，且為本領域中已知者之等效物。定義

如在本發明描述和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式“一”、“一個”和“該”旨在亦包括複數形式，除非內文另有明確說明。

當提及諸如含量或濃度或類似的可測量值時(例如，生物基質支架中的總蛋白質之膠原蛋白百分比)，術語“約”，意指包括特定量之20%、10%、5%、1 %、0.5%或甚至0.1 %。

當用於描述本揭示的任何成分、範圍、劑型等選擇時，術語或“可接受的”、“有效的”或“足夠的”係指該成分、範圍、劑型等，適用於所揭示目的。

亦如本文所使用的，“及/或”係指且涵蓋一或多個相關所列項目的任何和所有可能組合，以及當以或者(alternative)(“或(or)”)解釋時，則無組合。

使用於此，術語“包含”係指該組成物和方法包括所列舉的要素，但不排除其他要素。使用於此，過渡術語“基本上由......組成”(和語法變體)應被解釋為包含所引用的材料或步驟“以及不會實質上影響所述實施例的基本和新穎特徵者”。請見In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (強調於原著中)；亦請見MPEP § 2111.03。因此，於此所使用的術語“基本上由......組成”不應解釋為等同於“包含”。“由......組成”意指排除多於其他成分的微量要素，以及用於施加本發明組合物的實質方法步驟。以這些過渡術語每一者定義的各觀點皆落於本揭示範圍內。

使用於此，術語“補釘移植物”係指埋入或包含於適當生物材料中的細胞組成物，其允許將供體細胞(同種異體或自體)移植到宿主中。在一些實施例中，該術語是指埋入或包含於適當生物材料中的細胞組成物，其允許將供體細胞移植到宿主中。生物材料為可於完整定義的條件下製備者(例如，任擇性補充的基礎培養液及/或營養因子、維生素、胺基酸、碳水化合物、礦物質、胰島素、轉鐵蛋白/ 鐵，及/或脂質的培養液(經純化之游離脂肪酸，其與純化白蛋白和脂蛋白載體分子(如高密度脂蛋白)複合)，並包含，任擇地固化為軟凝膠(200 Pa以下，任擇地約100 Pa以下)，並以具有足夠拉伸強度的背襯覆蓋，可用於手術附著或以其他方式連附於宿主組織或器官，並對於供體細胞的分化具有最小影響的化學性質。避免補充可能會導致細胞，尤其是早期譜系期間質細胞(ELSMCs)分化的因子；這些包括影響ELSMCs的血清、生長因子和細胞因子，以及成熟的基質成分(例如第I型膠原蛋白)。

於此使用之術語“背襯”係指在補釘移植物表面上作為背襯或屏障之材料，其能將移植物束縛於目標位置，及/或促進其中細胞遷移至目標位置，及/或防止或抑制細胞向背襯遷移。背襯為或包含“生物可分解、生物相容性材料”、“生物相容、生物可分解的材料”或其任何變化，指的是(i)與待移植之個體生物相容的材料，(ii)具有機械彈性，可承受器官和組織(特別是內部組織)上產生的壓縮力和剪切力，因而使這種材料能夠作為手術用組織，以及(iii)對於因為與材料接觸而產生的細胞分化狀態具有中性或極小的影響。在一些實施例中，補釘移植物的背襯包含此類材料。在此類實施例中，(ii)的機械彈性應使得背襯可將移植物束縛到目標位置。在進一步的此類實施例中，背襯引導細胞遷移到目標位置 - 例如，藉由影響遷移遠離目標位置的細胞分化，或藉由物理方式阻斷該遷移。在此方面，合適的材料包括但不限於Seri-Silk、任擇地包含Seri-Silk或其衍生物、羊膜或其萃取物(例如，面向胚及/或含PGA及/或PLLA之補釘或紡織品側)。適當之合成材料補釘之非限制性範例包括包含91% PGA-共-9% PLLA的編織補釘、包含91% PGA-共-9% PLLA的編織補釘，或由100% PGA組成的非編織物補釘。更一般地，合適的背襯可包括Bombyx蛾絲形式，例如Seri^R Surgical Silk Scaffolds(Sofregen，New York，NY)、Bombyx蛾絲的其他衍生物，以及合成紡織物，例如聚乙醇酸-共-聚-L- 乳酸(PGA / PLLA)形式。

在一些實施例中，背襯亦可為生物可再吸收性。使用於此，“生物可再吸收性”是指可經移植物的宿主或接受者的身體分解，而不需要機械移除的材料。在一些實施例中，生物可再吸收的背襯在約2至約10週、約2至約20週、約2至約52週、約4至約16週、約4至約12週或約4到8週的周期內為生物可再吸收性。在一些實施例中，生物可再吸收的背襯在約4周至約8週、約4至約12週、約4至約16週、約4至約20週，以及約4至約52週的範圍內為生物可再吸收性。

使用於此，移植物的生物材料，獨立於背襯，包括可形成水凝膠者。術語“凝膠”是指固體膠狀物質，其具有從柔軟和弱至堅硬和堅韌的性質。凝膠定義為實質上稀薄的交聯系統，其在穩定態時不流動。按重量計，凝膠大多是液體，但由於液體中的三維交聯網狀，它們的行為類似於固體。正是流體內的交聯賦予凝膠立體性(硬度、剛度、機械或黏彈性)，並有助於其附著性。在此方式中，凝膠為液體分子分散於固體內的分散物，其中固體為連續相，液體為不連續相。“水凝膠”，於此亦稱為“水凝膠基質”，為包含由聚合物鏈網絡構成的巨分子聚合物凝膠之非限制性範例。水凝膠由親水性單體或親水性二聚體(例如在玻尿酸的情況下)經由鏈或逐步生長，隨著網絡形成而合成。網狀類似結構與空隙缺陷可增強水凝膠通過氫鍵吸收大量水的能力。結果為，水凝膠形成特有的堅固而有彈性的機械特性。當舊的鍵結在材料內被破壞時，它們能夠自發形成新鍵結。水凝膠的結構以及靜電吸引力可經由非共價氫鍵驅動新鍵結形成。

使用作為移植物的生物材料具有機械性質、剛度，其可更嚴格地定義為生物材料的黏彈性。請參閱https://en.wikipedia.org/wiki/Viscoelasticity。有利於植入的移植生物材料必須非常柔軟(例如，約100Pa)，且允許供體細胞保持未成熟的條件(Lozoya et al. Biomaterials 2011; 32 (30): 7389-7402)，因此能夠產生膜結合/或分泌形式的MMPs。

使用於此，術語“黏彈性”是指在經歷變形時表現出黏性和彈性特性的材料性質。黏性材料，如蜂蜜，在應力施加時能夠抵抗剪切流動並隨時間線性應變。彈性材料在拉伸時會產生應變，並在應力消除後迅速恢復到原始狀態。黏彈性材料具有這兩種性質的元件，因此表現出隨時間變化的應變。彈性通常是在有序固體中沿結晶平面鍵結伸展的結果，而黏度是原子或分子在無定形材料內擴散的結果。儘管有許多儀器可以測試材料的機械和黏彈性反應，但寬帶黏彈性光譜(BVS)和共振超音波光譜(RUS)更常用於測試黏彈性特性，因為它們可以在環境溫度以上和以下使用，並且更特異於測試黏彈性。這兩種儀器於不會產生時間 - 溫度疊加之各種頻率和時間範圍下，使用阻尼機制。使用BVS和RUS研究材料的機械性能，對於理解具有黏彈性的材料將如何表現非常重要。

使用於此，術語“玻尿酸(hyaluronan)”或“玻尿酸(hyaluronic acid)”係指由葡萄醣胺和葡醣醛酸[1-3]組成之雙醣單元的聚合物，其通過b1-4、b1-3鍵連接，及其鹽類。因此，術語玻尿酸是指天然和合成形式的玻尿酸二者。天然存在的玻尿酸(HA)，包含D-葡醣醛酸(GlcUA)與N-乙醯基-D-葡糖胺(GlcNAc)雙醣單元的水溶性多醣，其交替連接，形成線性聚合物。高分子量HA可包含100至10,000個雙醣單元。HA通常以鈉鹽，玻尿酸鈉，的形式天然存在。 HA；玻尿酸鈉，以及HA或玻尿酸鈉的製劑通常被稱為“玻尿酸”。可接受的玻尿酸鹽非限制性範例包括玻尿酸鉀、玻尿酸鎂和玻尿酸鈣。

其他糖胺聚醣(GAGs)也可用於水凝膠中。這些包括硫酸軟骨素(CSs)和硫酸皮膚素(DSs)形式、葡醣醛酸和半乳糖胺的聚合物，以及硫酸乙醯肝素(HSs)和肝素(HPs)、葡醣醛酸和葡糖胺的聚合物。這些GAGs硫酸化的程度和模式至關重要，因為硫酸化模式決定可否與多個蛋白質家族形成複合物(例如凝血蛋白、生長因子、細胞因子、中性粒酶)。請見如 Powell AK, Yates EA, Fernig DG, Turnbull JE. Interactions of heparin/heparan sulfate with proteins: appraisal of structural factors and experimental approaches. Glycobiology. 2004 Apr;14(4):17R-30R] 。適用於最佳化植入補釘移植物者包括玻尿酸、非硫酸化GAGs和具有最小硫酸化者，例如在幹細胞凹壁中發現的硫酸軟骨素形式，如Karumbaiah L, et al. Chondroitin Sulfate Glycosaminoglycan Hydrogels Create Endogenous Niches for Neural Stem Cells. Bioconjug Chem. 2015 Dec 16;26(12):2336-49 and Hayes AJ, et al. Chondroitin sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. 2008 Feb;56(2):125-38(引用併入本文)。

使用於此，術語“細胞”是指移植物中的一或多種細胞。本揭示的細胞為真核細胞。在一些實施例中，該細胞是動物來源的，任擇地來自人類器官，且可為幹細胞、成熟體細胞、前驅細胞或自幹細胞到成熟細胞譜系階段的中間體。術語“細胞群”或“細胞”是指一群具有相同或不同來源的相同或不同細胞種類的一或多種細胞；該術語在本文中可與術語“供體細胞”互換使用，其意指可為自體或同種異體細胞。在一些實施例中，該細胞群可衍生自一細胞株、來自新鮮分離的細胞，或在一些實施例中，該細胞群可衍生自器官或組織的一部分，任擇地來自供體或受體。

術語“幹細胞”是指可自我複製(產生與親代細胞相同的子細胞)且為多潛能的細胞群，即可產生多於一種類型的成體細胞。於此使用之術語“前驅細胞”或“前驅物”廣義地定義為包括幹細胞的後代及其後代。前驅細胞可為多潛能、雙潛能或單潛能的細胞群，但具有最小自我複製能力(如果有的話)。定型前驅細胞為單潛能且可分化為僅走向一種成熟細胞類型的特定譜系。幹細胞的非限制性範例包括但不限於胚胎幹(ES)細胞、誘導多能幹(iPS)細胞、胚層幹細胞、定型幹細胞(外胚層、中胚層或內胚層)、周產期幹細胞、羊膜液衍生幹細胞、間質幹細胞(MSCs)、血管新生細胞，以及衍生自臍帶、沃頓氏膠(Wharton’s jelly)及/或胎盤者。幹細胞和定向前驅細胞之間的中間體包括細胞群如肝母細胞和胰腺導管前驅細胞，以及其他形式的短暫倍增細胞，其可能為多潛能但具有廣泛的增殖潛力，但自我複製能力(如果有的話)更有限。

術語“間質細胞”是指衍生自間質的細胞，包括但不限於血管新生細胞、內皮細胞前驅細胞、星狀細胞前驅細胞、內皮細胞、星狀細胞、基質細胞、成熟和前驅細胞的各種亞群，以及間質幹細胞(MSCs)，其為多潛能基質細胞，以及成熟和前驅細胞間質細胞的各種亞群。 MSCs是經由組織培養篩選過程而製備的細胞群(Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015;PMID: 26273305)。至少有兩大類成熟間質細胞：(a)成熟間質細胞(星狀/基質細胞)，其由纖維狀膠原蛋白(例如第I型、第III型、第V型)，和相關基質的細胞外基質成分(纖連蛋白、硫酸軟骨素蛋白聚醣、硫酸皮膚素蛋白聚醣)，和形成複合物之結合訊號(例如生長因子/細胞因子)，以及形成與一般為直線形(串狀)細胞群之細胞結合之結合訊號(例如生長因子，細胞因子)產生與包圍。此類細胞的非限制性範例包括星狀細胞、肌腱、基質和肌母纖維細胞。(b)成熟間質細胞如內皮細胞，其產生並被細胞外基質形式包圍，該細胞外基質包含網絡膠原蛋白(例如第IV型、第VI型、第VIII型、第X型)，和相關的基質分子(層黏連蛋白、硫酸乙醯肝素蛋白聚醣、肝素蛋白多醣)，和結合訊號(例如生長因子、細胞因子)，它們共同與具有更多鱗狀或立方形或鵝卵石形態的細胞結合。這種細胞的非限制性範例包括內皮細胞和肌上皮細胞。

這些間質細胞類型的前驅物包括但不限於血管母細胞，其可以分化為內皮細胞(其後期是有孔內皮細胞)或星狀細胞(其後期是肌纖維母細胞(基質))的譜系。前驅細胞亦包括間質幹細胞(MSCs)，其為多潛能細胞且以分化為纖維母細胞(基質)、成骨細胞(骨細胞)、軟骨細胞(軟骨細胞)、肌細胞(肌肉細胞)和脂肪細胞(脂肪細胞))。MSC可任擇地經由培養篩選方法製備 (Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015;PMID: 26273305。

術語“上皮細胞擴增”與上皮細胞集落的直徑相關，其通常形成具有立方形或鵝卵石形態的集落，並以集落細胞直徑組合預估生長情況。相對地，間質細胞集落的生長預估與集落密度相關，因為間質細胞更具遷移性和運動性，且集落密度為保留在集落邊界內的細胞淨總和的反映。

術語“上皮細胞”是指衍生自上皮之特化細胞，其提供宿主組織及/或系統需要之多種功能。它們由可變化為前驅細胞或未成熟細胞之能力所辨識出；隨著成熟，它們變得靜止並形成鱗狀或鵝卵石狀或柱狀極化細胞層，具有頂端、基部和側面，並經由各種連接(連接蛋白、緊密連接、附著)彼此結合。它們的膨脹潛能係由菌落直徑(而不是其密度)表示。成熟的上皮細胞提供多種功能，例如分泌特定產物，或有助於代謝(肝細胞、膽管細胞)、解毒(肝細胞)、酵素產生(腺泡細胞)、內分泌因子產生(例如胰島或其他內分泌細胞))，電性活動(神經細胞)和吸收(腸細胞)。

術語“膽系幹細胞”(BTSCs)是指在整個膽系中發現的上皮幹細胞，位於膽囊周圍腺體(PBGs)、布魯納氏腺、壁外和壁內，以及膽囊絨毛的隱窩內。它們具有轉變為定型肝臟及/或胰臟前驅細胞的能力。肝臟後代細胞經由Hering通道進入肝竇；胰臟前驅細胞在胰臟導管腺體(PDGs)內，位於胰臟內的膽管區域發現。

到目前為止，已經鑑定出至少7個幹細胞亞群具有重疊性狀，範圍由原始BTSCs至可定義為肝或胰臟幹細胞的幹細胞群。下面提供這些已知細胞的描述。最原始的是在外壁的膽管周圍腺體中發現 - 一些附在膽管表面 –以及；壁內膽管周圍腺體-在膽管壁內發現。在膽管壁中心的纖維肌肉層附近的壁內膽管周圍腺體(PBGs)亦可視為隱窩(與腸隱窩相似)，其中的凹壁發現有最原始的幹細胞群。膽管網絡中最大數量的PBGs位於肝-胰共同管內和大肝內膽管內。膽囊中沒有PBGs，而在膽囊內取代幹細胞凹壁的是膽囊絨毛底部，其含有作為肝臟幹細胞前驅細胞的中期至晚期幹細胞群。BTSCs為肝臟和胰腺二者的前驅細胞。它們產生肝臟幹細胞、肝臟前驅細胞和胰臟幹細胞、胰臟前驅細胞，這些在整個膽管中都有發現，但數量受到肝臟與胰臟接近程度的影響。因此，少量胰臟幹細胞和大量肝臟幹細胞位於大肝內膽管的PBGs中，而少量肝臟幹細胞和大量胰臟幹細胞位於肝-胰共同管的PBGs中。

基因特徵的摘要附於圖中。一般而言，所有BTSCs亞群皆表現通用生物標誌物，包括肝臟和胰臟的內胚層轉錄因子(例如SOX9、SOX17、PDX1)、多潛能性基因(例如OCT4、SOX2、NANOG、SALL4、KLF4/KLF5、BMI-1)；CD44的一或多種玻尿酸受器異型體(標準及/或變體異型體)；CXCR4；以及細胞角蛋白8與18。膽系和PBG中的幹細胞亞群包括 (1) 位於十二指腸黏膜下層之布魯納氏腺幹細胞，表現CK7、TRA-160和181，具有與腸道幹細胞不同之特徵；(2) 表現碘化鈉同向轉運體(NIS)與CXCR4、OCT4、SOX2、NANOG，但不表現LGR5或EpCAM的早期壁內膽系幹細胞(BTSCs)；(3) 表現較少NIS但獲得LGR5而非EpCAM表現之中間階段的壁內BTSCs；(4) 晚期壁內BTSCs(在膽囊中發現的唯一BTSCs)也在大型肝內膽管和肝-胰腺共同管中發現大量BTSCs。它們表現LGR5和EpCAM。這些是肝臟幹細胞的前驅細胞(在肝臟中，表現SOX17但不表現PDX1)和胰臟幹細胞(在肝-胰腺共同管中，表現PDX1但不表現SOX17)；(5) 肝細胞可見於Hering通道中、大肝內膽管的PBGs中、肝外膽管的PBGs；以及在肝-胰腺共同導管的PBGs中，但大量在肝臟內部。肝臟幹細胞保留了自我複製的能力，並為多潛能。這些細胞的生物標記物包括SOX9、SOX17、HNF-4 alpha、 ITGB1 (CD29)、ONECUT 2、SALL4、LGR5、CD44、在細胞質和細胞膜上發現的上皮細胞附著分子(EpCAM)、神經細胞附著分子(NCAM)、CD133(prominin)、位準可忽略不計(或無)之白蛋白、完全缺乏a-胎蛋白(AFP)、缺乏P450 A7、缺乏促胰液素受體(SR)。肝幹細胞和肝母細胞表現細胞角蛋白8、18與19；(6) 在整個膽系中發現少量胰腺幹細胞(即使在大肝內膽管的PBGs中亦是)，但在肝-胰臟共同管的PBGs中發現了大量胰腺幹細胞。它們具有多潛能性基因，並表現所有幹細胞群體中的其他基因，但不同之處在於，它們不再具有SOX17；譜系限制於胰島表現NGN3之亞群。它們在整個細胞和細胞膜上表現EpCAM，並表現低(或無)胰島素。它們的成熟與增加的胰島素表現，以及其他胰島激素(例如升糖素)的表現相關。成熟為腺泡群者將表達MUC6和澱粉酶。

值得注意的是，肝臟和胰臟幹細胞在發育早期時，亦可於各自的來源器官中發現(例如，作為ESCs或其他)，且本發明的任何這些細胞亦可經由誘導產生(即作為iPSCs)。

使用於此，術語“支持性”用於描述能夠幫助細胞自另一譜系階段繁殖，或通過產生“旁泌信號”來提供對鄰近細胞輔助的細胞，該“旁泌信號”是對鄰近細胞之存活、擴增、遷移、分化和成熟方面產生影響的具活性因子。例如，支持性間質細胞可經由它們影響上皮細胞的能力來定義，任擇地經由基質金屬-蛋白酶(MMP)及/或一或多種旁泌信號或生長因子的分泌。其中許多摘錄於最近的評論文獻中。(Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015;PMID: 26273305)。

術語“譜系階段夥伴”於此係指間質細胞及/或上皮細胞，其為適於支持細胞植入的譜系階段。對於肝或膽系幹細胞，這些包括血管母細胞(CD117+、CD133+、VEGFr+、CD31陰性)及其直接後代、內皮細胞前驅細胞(CD133+、VEGFr+、CD31+、溫韋伯氏因子(Van Wildebrand factor+)(vWF +))，以及星狀細胞的前驅細胞(CD146+、ICAM-1+、a-平滑肌肌動蛋白+ (ASMA)、維生素A陰性)。它們可部分地及/或在某種程度上，藉由使用間質幹細胞(MSCs)來模擬，例如但不限於衍生自骨髓或脂肪組織的間質幹細胞。不受理論束縛，一般相信這些細胞應在從組織中分離後立即使用，或理想地在無血清條件下，最小分代後使用。這些細胞在本文中統稱為早期譜系間質細胞(ELSMCs) 。

譜系網絡中的中間體被稱為“短暫倍增細胞”，它們可以是雙潛能(或多潛能)細胞，具有可觀的增生潛力，但非常少的(如果有的話)真正自我複製，具有低至中等(或甚至無)多潛能性基因表現，和表現定型為肝臟(例如白蛋白、a-胎蛋白)或胰臟(例如胰島素、MUC6、澱粉酶)命運的表現特徵。這些包括肝母細胞(可產生肝臟的網絡)和胰腺導管前驅細胞(可產生胰腺的網絡)。

使用於此，術語“胰導管前驅細胞”是指在胰臟內的胰導管腺(PDGs)內發現，並可產生腺泡細胞和胰島的雙潛能細胞。在我們的研究中，我們發現它們表現SOX9、PDX1、PTF1a、HNF1β、EpCAM、LGR5、ICAM-1、CD44，並表現NGN3或MUC6或澱粉酶之亞群。它們被其他人廣泛地鑑定出。請見如Rezanejad H, Ouziel-Yahalom L, Keyzer CA, Sullivan BA, Hollister-Lock J, Li WC, Guo L, Deng S, Lei J, Markmann J, Bonner-Weir S. Heterogeneity of SOX9 and HNF1β is dynamic. Stem Cell Reports. 2018 Mar 13;10(3):725-738。

使用於此，術語“肝母細胞”是指能夠產生肝細胞和膽管細胞譜系的雙潛能肝細胞，並且存在於Hering通道中或附近或在大肝內膽管內的PBGs中。它們具有非凡的增生能力(即擴增)，但相對於在肝臟幹細胞或BTSCs中觀察到的自我複製能力較低(如果有的話)。這些細胞的特徵在於生物標記物分布與肝臟幹細胞或膽系幹細胞重疊，但不同。它們表現SOX9、低位準(或甚至可忽略不計)的SOX17、高位準的LGR5、HNF4-α與EpCAM，主要在細胞膜上發現，並表現P450A7、細胞角蛋白7、分泌素受器、與所有肝母細胞中的白蛋白表現一致、高位準的a-胎蛋白(AFP)、細胞間附著分子(ICAM-1)，但無NCAM表現、多潛能性基因(例如SALL4、KL4/KLF5、OCT4、SOX2、NANOG)的表現可忽略不計或無表現，以及未表現成熟的肝實質標記物(例如P450s，如P4503A)。

使用於此，術語“定型前驅細胞”是指可產生單細胞類型的單潛能前驅細胞，例如定型之肝細胞前驅細胞。在一些實施例中，它們不表現多潛能性基因。定型之肝細胞前驅細胞係藉由白蛋白、AFP、肝糖、ICAM-1、涉及肝糖合成的各種酵素，以及間隙連接基因、連接蛋白28的表現而辨識出。這些細胞會產生肝細胞。定型之膽管(或膽管細胞)前驅細胞會產生膽管細胞，並藉由EpCAM、細胞角蛋白7和19、水通道蛋白、CFTR(囊性纖維化跨膜電導調節子)和與膽汁產生相關的細胞膜幫浦的表現而辨識出。在一些實施例中，定型胰前驅細胞會表現胰島素、升糖素和其他胰島激素，儘管位準較低；隨著成熟，胰島激素的表現位準增加，但特定細胞優先表現某些激素。

使用於此，術語“聚集體”是指聚集在一起的多個細胞。聚集體的尺寸和形狀可以變化，或者在尺寸和/或形狀上可為實質上均勻。這裡使用的細胞聚集體可為各種形狀，例如球形、圓柱形(較佳具有相同的高度和直徑)，或桿狀等。儘管可使用其他形狀的聚集體，但在本發明之一實施例中，通常較佳之細胞聚集體為球形或圓柱形。術語“非聚集的”是指單獨或單細胞的幹細胞及/或前驅細胞或成熟細胞。在一些實施例中，於此提供的組合可包含實質上聚集的細胞、實質上非聚集的細胞或其混合物。

術語“類器官”於此係指具有間質細胞的供體上皮細胞之特定細胞聚集體，其經由於此所述的簡單淘選(panning)方法自組裝。在一些實施例中，間質細胞為支持性間質細胞。在一些實施例中，係於低附著培養皿上培養後，並在無血清、完全定義的條件下形成類器官，所述條件適合於懸浮液之聚集細胞的譜系階段。其他製備類器官之方法利用特定的基質萃取物，如Matrigel。實際上，這已知是工業標準。請見Hindley et al. Dev. Biology 2016; 420:251-261. PMID:27364469。保持這些類器官的條件將無法成功地在本發明補釘移植物中使用這些類器官。因子如Matrigel將停止或實質上減少細胞產生MMP，此為補釘移植物成功所必須。此外，Matrigel不能成為臨床上用於人體或獸醫目的之細胞條件成分。

術語“培養物”或“細胞培養物”是指在人工的體外環境中維持細胞。“細胞培養系統”於此係指培養條件，其中細胞群可以離體生長(體外)。

“培養液”在本文中係指用於細胞培養、生長或增生的營養液。培養液的特徵可為功能特性，例如但不限於將細胞維持在特定狀態(例如多潛能狀態、增生狀態、靜止狀態等)至成熟細胞的能力 - 在某些情況下，特別是，促進前驅細胞分化成特定譜系的細胞。培養液的非限制性範例為血清補充培養液(SSM)，其為補充有血清的任何基礎培養液，血清含量通常為約10%至約20%。血清可為自體性(與細胞相同的物種)，或者更常見的是來自經常為商業目的屠宰動物(例如雞、牛、豬等)的血清。值得注意的是，本實施例涉及幹細胞使用避免摻入會驅動分化的血清及/或血清成分的培養液。Kubota培養液，一種無血清培養液，設計用於內胚層幹/前驅細胞，由基礎培養液(營養素、胺基酸、維生素、鹽類、碳水化合物)組成，不含銅、低鈣(＜0.5 mM)，並補充硒、鋅、胰島素、轉鐵蛋白、脂質，但不含細胞因子或生長因子。其他已知支持幹細胞的培養液亦可使用，但必須避免任何導致細胞分化的因子，因為成熟過程會導致膜結合型及/或分泌型MMP的製造發生靜默作用。

基礎培養液為用於細胞培養的緩衝液，且組成物中包含胺基酸、糖、脂質、維生素、礦物質、鹽類、微量元素和各種營養素，其模擬細胞周圍間質液的化學成分。此外，細胞培養液通常包含補充有少量(通常2-10%)血清的基礎培養液。對於本文的移植技術，使用將細胞維持於幹細胞或早期前驅細胞之條件，因此避免使用血清或任何可能驅使細胞朝向成熟細胞命運的典型補充物。除了常規的基礎培養液，各種營養補充劑、脂質(與白蛋白複合的游離脂肪酸混合物，以及如高密度脂蛋白的載體分子)。僅添加兩種激素/生長因子：碳水化合物代謝所需的胰島素，以及作為聚合酶之Fe載體所需的轉鐵蛋白。Kubota培養液是一種為內胚層幹/前驅細胞設計的無血清培養液，由基礎培養液組成(不含銅、低鈣(＜0.5 mM)，補充鋅、硒、胰島素、轉鐵蛋白、脂質)，但無細胞因子或生長因子。應避免使用其他生長因子和細胞因子，特別是血清，因為它們會誘導供體細胞分化，而使植入和遷移過程所需的MMP之產生最小化。

於此所述，“Kubota培養液”是指不含銅、鈣(＜0.5mM)、硒、鋅、胰島素、轉鐵蛋白/Fe，與純化白蛋白結合的游離脂肪酸之混合物，以及任選的高密度脂蛋白(HDL)的任何培養液。在一些實施例中，Kubota培養液包含不含銅、低鈣(例如，0.3 mM)、~10^-9 M硒、~0.1%牛血清白蛋白或人血清白蛋白(高純度和無脂肪酸)、~4.5 mM煙鹼醯胺、~0.1 nM硫酸鋅七水合物、~10^-8 M氫化可的松(hydrocortisone)(用於肝而非胰前驅細胞的任擇性成分)、~5 μg/ ml轉鐵蛋白/鐵、~5 mg / ml胰島素、~10 mg/ ml高密度脂蛋白的任何培養液(例如，RPMI 1640或DMEM-F12)，並將純化的游離脂肪酸與純化的血清白蛋白結合後加入。游離脂肪酸混合物由~100 mM的棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和硬脂酸組成。用於製備該培養液的非限制性示範性方法已於別處公開，例如 Kubota H, Reid LM,Proc. Nat. Acad. Scien. (USA) 2000; 97:12132-12137，在此併入本案以作為參考資料。

因此，在一些實施例中，這些補釘移植物的條件與常規使用補充有少量百分比(通常2-10%)血清的培養液相反。血清已長久使用，以提供驅動生物過程(例如增生、分化)所需的必要信號分子(激素、生長因子、細胞因子)。在一些實施例中，不包括血清，以避免細胞分化及/或避免MMP，特別是分泌形式之產生失活或靜默。

於此所述，術語“有效的量”或“有效量”係指足以治療疾病狀態或病症(例如肝臟或胰腺疾病)的量。有效量可以一次或多次投藥、施加或劑型給藥。這種傳送取決於許多變數，包括各個劑量單位的使用期間、組合物的生物可利用性、投藥途徑等。然而，應理解的是，任何特定患者之特定量組合物取決於多種因素，包括所用特定藥劑的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別和患者的飲食、投藥時間、排泄率、組成物之組合、待治療的特定疾病(如肝臟或胰腺疾病)的嚴重程度，以及投藥形式。

當提及特定分子、生物或細胞材料時，術語“等效物”或“生物等效物”可互換使用，並且意指那些具有最小同源性，同時仍保持所需結構或功能的物質。

使用於此，術語“表現”是指聚核苷酸轉錄成mRNA，及/或轉錄的mRNA隨後被轉譯成胜肽、多肽或蛋白質的過程。若該聚核苷酸衍生自基因組DNA，則該表現可包括在真核細胞中剪接mRNA。基因的表現位準可藉由測量細胞或組織樣品中mRNA或蛋白質的含量來確定；此外，可鑑定多個基因的表現位準，以建立特定樣本的表現分布。

使用於此，術語“功能性”可用於修飾任何分子、生物性或細胞性材料，以使其實現特定的具體效果。

使用於此，術語“基因”廣泛地包括轉錄成RNA分子的任何核酸序列，無論RNA是編碼(例如mRNA)還是非編碼(例如，ncRNA)。

使用於此，當提及使本發明類器官存在的方法步驟時，術語“產生”及其等效語(例如產生(generating)、產生(generated)等)可與“製造”及其等效語互換使用。

使用於此，術語“經分離”是指實質上不含其他材料的分子或生物性或細胞性材料。

術語“核酸”、“聚核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，係指任何長度的核苷酸聚合形式，不論是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。聚核苷酸可具有任何三維(3D)結構，並可執行已知或未知的任何功能。以下是聚核苷酸的非限制性範例：基因或基因片段(例如，探針、引子、EST或SAGE標籤)、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉移RNA、核醣體RNA、RNAi、核酶、 cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質體、載體、任何序列的經分離DNA、任何序列的經分離RNA、核酸探針與引子。

聚核苷酸可包含經修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。若存在，可在組裝多核苷酸之前或之後，加入對核苷酸結構的修飾。核苷酸序列可被非核苷酸成分打斷。聚合後可進一步修飾聚核苷酸，例如經由與標記成分結合。該術語尚指雙股和單股分子。除非另有說明或要求，否則作為聚核苷酸技術的任何觀點，皆包括雙股形式和已知或預測構成雙股形式的兩種互補單股形式中的每一種。

術語“蛋白質”、“胜肽”和“多肽”可互換使用，並在其最廣泛的意義上是指二或更多個次單元胺基酸、胺基酸類似物或胜肽模擬物的化合物。次單元可經由胜肽鍵連接。在另一觀點中，次單元可經由其他鍵結連接，例如酯、醚等。蛋白質或胜肽必須含有至少兩個胺基酸，且胺基酸最大數量沒有限制，其可包含一蛋白質或胜肽序列。於此所述，術語“胺基酸”是指天然及/或非天然或合成的胺基酸，包括甘胺酸以及D與L光學異構物二者、胺基酸類似物與胜肽模擬物。

使用於此，術語“個體”和“患者”可互換使用，係指任何動物。在一些實施例中，該個體可為哺乳動物。在一些實施例中，該哺乳動物為牛、馬、豬、犬、貓、猿猴、鼠、人或大鼠。在一些實施例中，該個體為人。

術語“組織”於此係指活體或死亡生物體的組織，或衍生自或設計為模擬活體或死亡生物體的任何組織。該組織可為健康的、患病的、受創傷損傷、受傷及/或具有基因突變。於此使用之術語“天然組織”或“生物組織”及其變異物是指生物組織，因為其以天然狀態存在或處於由其衍生自生物體時未修飾的狀態。“微器官”是指模仿“天然組織”的“生物工程改造組織”片段。

生物組織可包括任何單一組織(例如，可互相聯結的細胞集合)或構成生物體的器官或部分或區域的一群組織。組織可包括均質的細胞材料，或可為複合結構，例如在身體內發現的，包括胸部區域，例如可包括肺組織、骨骼組織，及/或肌肉組織。示範性組織包括但不限於衍生自肝、胰、膽系、肺、腸、甲狀腺、胸腺、胸腺、腎、前列腺、子宮、乳房、皮膚和其下方的真皮組織、腦、脊髓、血管(例如主動脈、髂靜脈)、心臟、肌肉，包括其任何組合。

使用於此，個體中疾病的“治療(treating)”或“治療(treatment)”是指(1)預防在易感或尚未表現出疾病症狀的個體中發生症狀或疾病；(2)抑制疾病或阻止其發展；或(3)改善或導致疾病或疾病症狀的消退。如本領域所理解的，“治療”為獲得有益或期望結果，包括臨床結果，之方法。就本技術目的而言，有益或期望的結果可包括一或多種，但不限於，緩解或改善一或多種症狀、減輕病症(包括疾病)的程度、穩定(即，不惡化)症狀(包括疾病)的狀態、延遲或減緩症狀(包括疾病)、狀態的進展，以及緩解(無論是部分還是全部)，無論是可檢測或不可檢測。縮寫

AFP ，a-胎蛋白；ALB ，白蛋白；BTSCs ，膽管幹細胞；CD ，共同決定區；CD44 ，玻尿酸受體；CD133 ，prominin；CFTR ，囊性纖維化跨膜傳導調節子；CK ，細胞角蛋白；CXCR4 ，CXC-趨化因子受體4(也稱為fusin或CD184；也稱為血小板因子4)；EGF ，表皮生長因子；ELSMCs ，早期譜系期間質細胞，由血管母細胞及其後代、內皮細胞和星狀細胞的前驅細胞組成；EpCAM ，上皮細胞附著分子；FGF ，纖維母細胞生長因子；HBs ，肝母細胞；HGF ，肝細胞生長因子；HpSCs ，肝臟幹細胞；KM ，Kubota培養液，為內胚層幹細胞設計的無血清培養液；KRT ，細胞角蛋白基因；LGR5 ，富含亮胺酸的重複序列G蛋白偶聯受體5，其與R-spondin結合；MMPs ，基質金屬蛋白酶，為與細胞外基質溶解相關的蛋白酶大家族，具有細胞遷移和再生反應；NANOG ，為與自我更新密切相關的轉錄因子；NCAM ，神經細胞附著分子；NIS ，鈉/碘轉運因子；OCT4 ，(八聚體-結合轉錄因子4)也稱為POU5F1 (POU結構域，第5族，轉錄因子1)，由幹細胞表現的基因；PDX1 ，胰臟和十二指腸同源框1，一種對胰臟發育至關重要的轉錄因子；PBG ，膽管周圍腺體、膽管幹細胞的幹細胞凹壁；SALL4 ，Sal樣蛋白4，被發現為幹細胞自我複製的重要組成部分；SOX ，Sry-相關HMG框；SOX2 ，一種轉錄因子，對於維持胚胎和確定幹細胞自我更新或多潛能性至關重要。SOX9 ，與內胚層組織(肝、腸和胰臟)相關的轉錄因子；SOX17 ，肝臟分化必需的轉錄因子；VEGF ，血管內皮細胞生長因子；vWF ，血管性血友病因子。實施本發明之模式

在本文提供的範例中，申請人建立補釘移植，一種用於將細胞移植到內部器官之新穎方法，其設計特徵取決於該細胞為幹細胞或成熟細胞。申請人以具有膽系幹細胞(BTSCs)的移植物、肝臟和胰腺的前驅細胞二者，以及移植到肝臟或胰臟來呈現這些方法。用於發展這些方法之宿主為豬Sus scrofa domestics 品種。牠們為轉植研究、外科模型和手術訓練中使用的主要動物物種，在臨床前研究中愈來愈常使用作為猴子的替代。

使用膽系幹細胞(BTSCs)的類器官、肝臟和胰臟前驅細胞，與早期譜系期間質細胞(ELSMCs)合作，並包含在柔軟的(~100 Pa)玻尿酸(HA)水凝膠中，達成成功的範例。將含有類器官的HA水凝膠置於Seri-Silk背襯(一種網狀材料)上，用更硬的HA水凝膠(~700 Pa)浸漬其漿膜側，並通過外科手術或其他方式連結至肝臟或胰臟的表面。在一週內，移植物引起器官囊和鄰近組織，以及任擇的遠端實質組織的重塑，隨後為供體和宿主細胞的合併。至兩週時，供體細胞已成熟為功能性成體命運，例如肝細胞(白蛋白)或胰島(b-細胞 - 胰島素)。至三週後，隨著HA的清除，器官囊和正常組織的組織學回復。已證實植入/遷移/整合過程，係依賴由細胞表現的多種細胞膜結合型及分泌型基質 - 金屬蛋白酶。

這些範例結果與過去將細胞由實體器官移植到內部器官，其中該移植通過直接注射或通過血管途徑遞送細胞來完成(參見Bhatia等人，Lanzoni等人、韋伯等人與其他的評論)，的努力相反。過去的移植方法導致僅有少量細胞植入、具有危及生命的栓塞風險，以及顯著位準的異位細胞分佈。這些問題導致內部實體器官之細胞療法的使用最小化或根本無法使用。

補釘移植策略為細胞療法提供了另一種方法，即能夠提供足夠的細胞數量，並將其整合到組織中，以提供顯著的功能恢復。這些範例證明具安全性，只要生物材料和所用的背襯支持物可維持一些或所有供體細胞處於不成熟之狀態，並因此能產生相關的MMPs庫。常見的失敗原因為導致供體細胞分化的任何因素。不受理論束縛，本文考慮可將純化的MMPs摻入移植物生物材料中，及/或可使用重組表現系統或其他遺傳修飾技術轉化細胞，以分泌MMPs，作為提供移植物內細胞的替代物，該移植物可自然產生必需的MMPs。在此實施例中，經由構建體加入或轉導的MMPs組合，應包括在以下範例中提供的表現分布中辨識出者。補釘移植物之組成

於此揭示的觀點相關於一種補釘移植物，其包括含有二或更多個細胞群之一層(如可為自體或同種異體的供體細胞)，以及MMPs的來源，以及包含生物可相容、生物可分解材料的背襯，其可用於將移植物束縛到目標部位。在一些實施例中，細胞群包括上皮細胞群和間質細胞群。在一些實施例中，細胞群必須維持在特定狀態或“譜系階段”，而作為移植物的一部分，這意味著它們在加入該器官之前不會進一步分化或成熟。這可經由平衡與細胞來源、MMP含量、使用的培養液和背襯品質有關的變數來達成。在下文中更詳細地描述了這些觀點中的每一者。

不受理論束縛，一般相信補釘移植物可以成功地具有(1)最佳細胞配對 - 例如，供體上皮細胞和支持性間質幹/前驅細胞群，其在培養液和水凝膠中產生膜結合型及/或分泌型MMPs- 其不會導致支持性間質幹/前驅細胞群的分化，以及(2)適用於將移植物連結到目標處，並防止移植物中的細胞向背襯移動而遠離目標部位的背襯。示範細胞

不受理論束縛，細胞可處於任何成熟中的譜系階段，包括胚胎幹(ES)細胞、誘發性多潛能幹(iPS)細胞、定型幹細胞、定型前趨細胞、短暫倍增細胞或成熟細胞。然而，在某些實施例中，MMPs的來源必須存在於補釘移植物中。因此，本文考慮的是用於補釘移植物之MMPs的細胞來源。此類細胞來源必須處於能夠表達膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶的早期譜系階段。此類早期譜系階段的非限制性範例為早期譜系期間質幹細胞(ESMLCs)。

在一些實施例中，待移植的細胞為與間質細胞合作的上皮細胞。在一些實施例中，上皮細胞包含上皮幹細胞。在一些實施例中，上皮細胞包含定型及/或成熟上皮細胞。在一些實施例中，定型及/或成熟上皮細胞包含成熟實質細胞。在一些實施例中，成熟實質細胞包含肝細胞、膽管細胞或胰島細胞之一或多者。在一些實施例中，間質細胞包含ELSMCs。在一些實施例中，ELSMCs包含血管母細胞、內皮細胞前驅細胞、星狀細胞前驅細胞與MSCs之一或多者。在一些實施例中，上皮細胞和間質細胞為彼此的譜系階段夥伴。在一些實施例中，上皮細胞和間質細胞並非彼此的譜系階段夥伴，例如，分別處於大致相同的譜系階段或成熟階段。在一些實施例中，上皮細胞為成熟細胞。在一些實施方案中，間質細胞為ELSMCs。

在一些實施例中，上皮細胞和間質細胞之至少一者衍生自供體。在一些實施例中，供體為需要組織移植的個體。在一些實施例中，供體為需要組織移植的健康細胞來源。在一些實施例中，上皮細胞和間質細胞之至少一者與補釘移植物的預期接受者為自體同源。在一些實施例中，所有細胞(即上皮細胞和間質細胞)與移植物的預期接受者為自體同源。在一些實施例中，細胞供體可為接受者(同種異體移植物)以外的細胞供體，或者亦可為具有處於患病或功能障礙狀態的內部器官的個體(自體)，任擇地，其中從沒有患病或功能失調及/或細胞已經遺傳修飾之內部器官的一部分獲得，以恢復功能。

在另一觀點中，間質細胞是供體細胞的譜系階段夥伴，例如，在可比較或相對應的譜系階段。在另一觀點中，間質細胞不是供體細胞的譜系階段合適夥伴。間質譜系階段細胞可為血管母細胞、內皮細胞及/或星狀細胞的早期譜系前驅細胞、間質幹細胞、內皮細胞或星狀細胞，或這些細胞群的衍生物。

就幹細胞移植而言，上皮細胞應與其天然的譜系階段夥伴間質細胞(血管母細胞及/或內皮細胞或星狀細胞的前驅細胞)合作。對於成人上皮細胞，適當的夥伴包括早期譜系期間質細胞(ELSMCs)，其由血管母細胞及/或星狀細胞和內皮細胞的前驅細胞組成。申請人已經表明，可以將間質幹細胞(MSsC)的製備物與成體細胞組合使用，以完成植入。在一些實施例中，某些MSCs可能優於其他MSCs。不受理論束縛，一般相信移植物可經由篩選細胞組合而最佳化，該細胞組合需要最小化(如果有的話)培養細胞，並避免可能驅動細胞分化的血清和基質成分。不受理論束縛，應進一步理解，上皮 - 間質的關係相當重要，因為旁泌訊息傳遞支持MMPs的產生。然而，與成熟內皮細胞合作的成熟上皮細胞，將會在移植物中存活並將為功能性細胞，但不會植入。因此，如果成熟的上皮細胞與成熟的基質合作形成移植物，則所得的移植物可能變成纖維化。

用於治療患病或功能失調的器官，細胞可來自接受者以外的供體(同種異體移植物)，或者亦可為自體移植物，因此來自具有患病或功能障礙的內部器官之個體，任擇地，其中從沒有患病或功能失調及/或細胞已經遺傳修飾之內部器官的一部分獲得，以恢復功能。

用於建立研究疾病的模型系統，細胞可為患病且被移植到實驗宿主中的正常組織上/中者。

在一些實施例中，上皮細胞可為與支持性間質細胞，任擇地，ELSMCs組合的幹細胞，以形成類器官，任選地為自我組裝性。這些類器官可包埋或包含在玻尿酸水凝膠中。本發明的幹細胞及/或前驅細胞可包括本領域已知的任何幹細胞及/或前驅細胞，包括例如胚胎幹細胞(ESC)、胚胎生殖細胞(EGC)、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、胰腺幹細胞(PSC)、肝幹細胞(HpSC)、膽系幹細胞(BTSC)、肝細胞、胰腺導管前驅細胞、定型胰前驅祖細胞或定型肝前驅細胞。在一些實施例中，細胞群僅包含幹細胞，例如胰幹細胞、肝幹細胞、膽系幹細胞(BTSC)或布魯納氏腺幹細胞。在其他實施例中，細胞僅包含多潛能前驅細胞亞群，例如肝母細胞或胰腺導管前驅細胞，或移植物可含有定型的單能前驅細胞(例如肝細胞或膽汁或胰島或腺泡定型前驅細胞)。在其他實施例中，細胞包含幹細胞和前驅細胞的混合物。

若使用成體上皮細胞，則可以將它們與ELSMC以相關比例混合到移植生物材料中。細胞混合物的比例可經確定，以模擬目標組織。另外或此外，該比例可經由類器官的自我組裝來確定比率。將類器官或細胞混合物包埋在軟移植生物材料中，例如軟玻尿酸水凝膠。若為幹細胞移植物，則本發明的幹細胞及/或前驅細胞可包括本領域已知的任何幹細胞及/或前驅細胞，包括例如胚胎幹細胞(ESC)、胚胎生殖細胞(EGC)、誘導性多潛能幹細胞(iPSC)、布魯納氏腺幹細胞(BGSCs)、膽系幹細胞(BTSC)、胰幹細胞(PSC)、肝幹細胞(HpSC)、短暫倍增細胞(如肝母細胞或胰腺導管前驅細胞)和定型單能前驅細胞(例如定型胰前驅細胞或肝細胞或膽管細胞前驅細胞)。在一些實施例中，細胞群僅包含幹細胞。在其他實施例中，細胞僅包含前驅細胞亞群。在其他實施例中，細胞包含幹細胞和前驅細胞的混合物，或幹/前驅細胞和更成熟細胞的混合物。在另一些實施例中，可存在成體細胞(例如肝細胞、膽管細胞、腸細胞、胰島)和ELSMC的嵌合型混合物。

幹細胞及/或前驅細胞可經由本領域技術人員已知的任何方法辨識出。非限制性範例包括使用定義自我複製能力的測定，以及經由形態學分析、基因及/或蛋白質表現、細胞表面標誌物等，證明多潛能性的測定組合。在一些實施例中，幹細胞及/或前驅細胞表現至少一種指示早期肝細胞譜系細胞的標誌物(例如，SOX17、HNF-4a、HNF6、HES1、CK19)，以及至少一種指示早期階段胰細胞譜系的標誌物(例如，PDX1、PROX1、NGN3、HNFβ1)。例如，幹細胞及/或前驅細胞，特別是BTSCs，可經由SOX9、SOX17、PDX1、CD133、NCAM、音猬蛋白(SHH)、碘化鈉同向轉運體(NIS)、LGR5、LGR6、EpCAM、 CD44、CXCR4和各種多潛能性基因(例如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、KLF5、SALL4、BMi-1)或其任何組合的異型體而辨識出。

在一些實施例中，幹細胞及/或前驅細胞表現至少一種指示早期親代階段細胞譜系的標誌物，例如肝和胰的親代譜系。因此，他們將表現由肝和胰譜系共享的蛋白質(例如SOX9、LGR5 / LGR6、EpCAM、CD133、CK19)，以及肝譜系的蛋白質(例如，SOX17、HNF-4-α、HNF6、HES1)和早期胰細胞譜系的蛋白質(例如，PDX1、PROX1、NGN3、HNFβ1)。例如，幹細胞及/前驅細胞，特別是BTSC，可經由表現SOX9、SOX17、PDX1、CD133、NCAM、音猬蛋白(SHH)、碘化鈉同向轉運體(NIS)、LGR5、LGR6、EpCAM，以及各種多潛能性基因(例如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、KLF5、SALL4、BMi-1)或其任何組合而辨識出。成熟細胞類型之產生

如果需要，幹細胞及/或前驅細胞也可以分化為更成熟的細胞類型。這可經由自發分化及/或經由定向分化於體外進行。定向分化可涉及使用確定的培養液、遺傳修飾幹細胞及/或前驅細胞，以表現有興趣的基因或其組合。

用於分化細胞的經定義培養液之非限制性範例，包括用於內胚層幹細胞向成體命運分化的激素-限定培養液(HDM)。補充物可添加到Kubota的培養液中，以產生無血清的激素-限定培養液(HDM)，其將促進正常肝或膽系幹細胞朝向特定成體命運分化。這些包括補充鈣，達到或高於0.6 mM濃度、1 nM三碘甲腺胺酸(T3)、10^-12 M之銅、10 nM氫化可的松，以及20 ng/ml鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)。超過以上要求，可選擇性產生肝細胞(HDM-H)對應膽管(HDM-C)與胰島(HDM-P)，所需的培養液條件為： 1) HDM-H：進一步補充7 μg/L升糖素、2 g/L半乳糖、10 ng/ml表皮生長因子(EGF)，以及20 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)； 2) HDM-C：進一步補充20 ng/ml血管內皮細胞生長因子(VEGF)與10 ng/ml HGF；以及 3) HDM-P：製備不含糖皮質激素者，並進一步補充1%之B27、0.1 mM抗壞血酸、0.25 µM環巴胺、1 µM視黃酸、20 ng/ml FGF-7，進行4天，然後更換為補充有50 ng/ml exendin-4 和20 ng / ml HGF，誘導生長6天。

於此提供的HDM可補充有額外的生長因子，包括但不限於Wnt信號、表皮生長因子(EGFs)、纖維母細胞生長因子(FGFs)、肝細胞生長因子(HGFs)、胰島素樣生長因子(IGFs)、轉化生長因子(TGFs)、神經生長因子(NGFs)、神經營養因子、各種介白素、白血病抑制因子(LIFs)、血管內皮細胞生長因子(VEGFs)、血小板衍生生長因子(PDGFs)、幹細胞因子(SCFs)、集落刺激因子(CSFs)、GM-CSFs、促紅細胞生成素、血小板生成素、肝素結合生長因子、IGF結合蛋白，及/或胎盤生長因子。

於此提供的HDM可補充有細胞因子，包括但不限於介白素、淋巴因子、單核因子、集落刺激因子、趨化因子、干擾素和腫瘤壞死因子(TNF)。

申請人已表明，玻尿酸可影響幹細胞及/或前驅細胞，以表現可調節細胞附著和細胞 - 細胞交互作用所需的關鍵細胞附著分子的因子，並防止幹細胞及/或前驅細胞在細胞懸浮製備、冷凍保存或移植後，內化這些附著因子。此類附著因子的非限制性範例包括整聯蛋白(integrin)。整聯蛋白為異二聚體跨膜糖蛋白的大家族，其功能是將細胞附著於基底膜的細胞外基質蛋白、其他細胞上的配位體和可溶性配位體。整聯蛋白含有大小次單元，分別稱為α與β。該次單元形成αβ異二聚體，且在人類中已知有至少18個a和8個b次單元，產生24個異二聚體。在某些實施例中，該幹細胞及/或前驅細胞表現較高位準之整聯蛋白次單元，如ITGα1 、ITGα2 、ITGα2B 、ITGα3 、ITGα4 、ITGα5 、ITGα6 、ITGα7 、ITGα8 、ITGα9 、ITGα10 、ITGα11 、ITGαD 、ITGαE 、ITGαL 、ITGαM 、ITGαV 、ITGαX 、ITGβ1 、ITGβ2 、ITGβ3 、ITGβ4 、ITGβ5 、ITGβ6 、ITGβ7 與 ITGβ8 。在一較佳實施例中，該幹細胞及/或前驅細胞表現較高位準之整聯蛋白次單元β1 (ITGβ1 )及/或整聯蛋白次單元β4 (ITGβ4 )。Takada Y. et al. (2007)Genome Biol. 8(5): 215。

在一些實施例中，本發明之幹細胞及/或前驅細胞不同於天然發生之幹細胞及/或前驅細胞，其中至少在整聯蛋白次單元之表現量上，高出未經修飾之幹細胞及/或前驅細胞之整聯蛋白次單元表現量的10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、200% 。預期整聯蛋白次單元的增加可以幫助幹細胞及/或前驅細胞附著，形成細胞 - 細胞交互作用，而且如果需要，可以防止幹細胞及/或前驅細胞內化。MMPs

MMPs為促進植入和整合的關鍵因素之一。 MMPs包含許多異型體(至少28種；在豬中，已知有24種異型體)，其中一些為分泌型(例如MMP1、MMP2、MMP7、MMP9)，一些為細胞膜結合型(例如MMP14、MMP15)。不受理論束縛，一般相信這些混合物，尤其是分泌形式的混合物為植入所需要的。所有經檢驗的細胞皆產生不同量的分泌和膜相關形式，但幹/前驅細胞產生非常高位準的分泌形式。植入依賴於這些分泌型MMPs(且細胞膜結合形式具有一些已知的協同作用)。這些細胞來源提供必需MMPs達成植入的實用方案。作為替代方案，申請人考慮將純化形式的MMPs加至移植物中的生物材料及/或經基因工程改造之細胞中，以產生必需的MMPs。

只要有多種基質金屬蛋白酶(MMPs)來源，任擇地為分泌型和膜結合型的一或二者，理想地為細胞來源，細胞就能成功地植入。MMPs可由所有細胞類型產生，包括未成熟細胞和成熟細胞，但產生何種異型體和特定MMPs的表現位準方面各不同。代表性的分泌型包括MMP1、MMP2、MMP7和MMP9。代表性的膜結合型包括MMP14和MMP15。根據經驗，已發現分泌型MMPs的最高產量是由早期譜系階段細胞、幹細胞和早期前驅細胞產生。移植物的生物材料支持上皮細胞和間質細胞產生這些多種形式的基質金屬蛋白酶(MMPs)的能力，該基質金屬蛋白酶(MMPs)會溶解器官或組織周圍的囊，並藉由多種形式的細胞外基質成分的溶解使細胞遷移。

更普遍地，基質金屬蛋白酶(MMPS)為鋅-依賴性蛋白酶大家族，其涉及細胞外基質成分的降解和調節，並涉及正常和致病過程中的植入、侵襲、血管新生、血管形成和遷移。至少有28種異型體，其包含基質蛋白、蛇毒蛋白酶(adamalysins)、蝦紅素(astacins)、serralysins等。它們的角色已在正常過程如植入胎盤，以及在致癌過程如癌症的侵襲和轉移中鑑定出。

於此所述的研究提供了MMPs的全新角色證據，其有助於移植細胞的植入、遷移和整合。幹/前驅細胞，包括上皮細胞和間質細胞，表現多種MMP異型體，其在這些角色中特別有效。細胞的成熟導致一或多種有效的幹/前驅細胞相關MMPs的表現靜默，因而減少侵襲和遷移過程。成體細胞亦表現MMPs，主要是結合至膜上者(MT-MMPs)，該MMPs參與可塑性過程，但不涉及細胞植入和整合至組織中。然而，MT-MMPs與分泌形式之間存在一些協同作用。此種實現的淨總和為移植物生物材料、背襯和其他條件必須為，除了其他特徵之外，使各種MMPs(例如分泌型MMPs)的表現最佳化，而能夠發生移植和遷移過程的條件。因此，驅動移植細胞分化的因素將同時使複雜的MMP反應靜默。這種實現意味著要避免的因素包括血清(會驅動分化)、驅動分化的可溶性信號(例如某些生長因子、細胞因子和激素)；驅動分化的細胞外基質成分(例如膠原蛋白、附著分子、高度硫酸化糖胺聚醣/蛋白多醣)；有助於移植物剛性的機械力(黏彈性特性，其可驅動分化)。

在一些實施例中，混合物中的一或多種細胞為分泌型及/或膜結合型MMPs來源。分泌型MMPs可任擇地由一或多種上皮細胞或間質細胞天然產生，或任擇地由於一或多種上皮細胞或間質細胞，經載體轉化而進行重組表現，或用於MMP產生的基因編輯而產生。在一些實施例中，例如但不限於，涉及天然分泌MMPs之幹/前驅細胞群、可靜默MMP表現- 任擇地為膜結合型及/或分泌型MMP表現 -之變數，係於補釘移植物中經控制。此類變數的非限制性範例包括導致幹/前驅細胞成熟的變數，例如但不限於對培養液或移植物生物材料的血清補充、激素或其他影響上皮及/或間質細胞分化的可溶信號、氧氣位準(由於厭氧條件下可保持細胞不成熟，而較高的氧氣位準會促進分化)，以及移植材料的剛性(由於剛性或機械力如剪切力和壓縮，可能驅動分化)。

就幹細胞移植物而言，上皮細胞和它們的間質細胞夥伴皆為最佳幹細胞或前驅細胞，因為兩者都提供多種類型MMP的貢獻。為了移植成體細胞，上皮細胞或間質細胞之一應最佳地提供膜結合型及/或分泌型MMP的細胞來源，例如任擇地使用ELSMC作為膜結合型及/或分泌型MMP的細胞來源。因此，其中上皮細胞和間質細胞都是成熟細胞類型的移植物，不能成功植入。若為成熟的內皮細胞，那麼上皮細胞很可能存活並增生，並發揮作用，但不會植入；若為成熟的基質，則移植物很可能變成纖維化。

簡言之，若上皮 - 間質細胞夥伴都是幹/前驅細胞，或者若上皮細胞或間質細胞中的至少一者為幹細胞，例如任擇地使用ELSMCs作為基質金屬蛋白酶(MMPs)的基質結合型及/或分泌型異型體的來源，或者若在移植物生物材料中提供純化形式的MMPs，便可發生植入。適用於補釘移植物質的早期譜系間充質細胞(ELSMCs)可為血管母細胞、內皮細胞前驅物、早期譜系期內皮細胞、星狀細胞前驅物、早期星狀細胞或間質幹細胞(MSCs)，或這些的混合物。

因此，本文考慮的是使用作為補釘移植物的組合物，其包含至少一細胞群(例如上皮細胞和間質細胞)，以及一MMPs來源(即在早期譜系階段能夠表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)的細胞群)，任擇地由培養液及/或水凝膠的條件支持。培養液成分

為了與本文揭示的細胞和MMPs來源組合使用，可使用任何培養液(其包含營養素、維生素、鹽類等)加上關鍵的可溶性因子，例如胰島素、轉鐵蛋白/ Fe和脂質，其被發現可用於幹/前驅細胞的擴增及/或存活。必須避免導致細胞成熟的所有因素，因為成熟將導致MMPs表現減少或靜默。要避免的因素包括血清、驅動分化的可溶性信號、驅動分化的細胞外基質成分，以及剛性或機械力(壓縮、磨損)。此類培養液的非限制性範例為Kubota培養液。因此，本文考慮的是使用作為補釘移植物的組合物，其包含至少一細胞群和MMP來源(即在早期譜系階段能夠表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMP)的細胞群，經適當培養液支持)。適當培養液的非限制性範例為Kubota培養液。其他幹細胞培養液同樣適用。水凝膠

補釘移植物包含一或多種水凝膠成分。在某些觀點中，可形成水凝膠或平行不溶性複合物的生物材料包含玻尿酸、經硫醇修飾的玻尿酸、其他糖胺聚醣(GAG)或其組合。凝固的觸發因素可為引起基質成分進行交聯，或使可凝膠化成分進行凝膠化的任何因素。交聯劑可包括聚(乙二醇)(PEG)或PEG-二丙烯酸酯(PEGDA)水凝膠或其含二硫化物的衍生物。值得注意的是，包含在水凝膠中的生物材料應經篩選，以支持已揭示用於補釘移植物的一或多個細胞群，如ELSMCs中的幹細胞特性。

可使用維持幹細胞特性的支持性基質成分，但不能使用會驅動分化的成分。支持性成分的非限制性範例包括玻尿酸或非硫酸化(或最小硫酸化)糖胺聚醣。這些特別適用，因為可以“微調”，可將其修飾為具有不同的剛性位準(任擇地以黏彈性測量)。因此，在某些觀點中，細胞群，任擇地為經分離的內部器官細胞，可在將細胞引入宿主之前，於生物材料內離體固化，或者作為流體物質注射，並允許在體內固化。

非常柔軟(例如約100 Pa)的水凝膠對於將供體細胞保持在未成熟狀態是相當理想的。較硬者(例如＞ 500 Pa)可用於使細胞足夠成熟，以阻斷MMP產生，並因此阻止遷移。較硬者亦可使與鄰近組織的沾黏最小化。在某些實施例中，細胞群和MMPs來源，任擇地為另一細胞群(即在早期譜系階段能夠表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)的細胞群。

不受理論束縛，一般相信在羊膜中發現的細胞外基質形式，能夠使供體細胞保持未成熟狀態。因此，預期羊膜既可用於水凝膠，亦可任擇地使用作為另一生物可相容、生物可分解之材料。

值得注意的是，已知會導致成熟的物質包括衍生自成熟細胞外基質的某些成分，例如但不限於第I型膠原蛋白。這些材料應排除在補釘移植物的所有成分之外，包括但不限於細胞、水凝膠、培養液、背襯及/或任何其他成分。

因此，本文考慮的是用於補釘移植物的組成物，其包含至少一細胞群和MMPs來源(即在早期譜系階段能夠表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)的細胞群，其由適當的培養液支持並包含在水凝膠中)。

如上所述，剛性可驅動細胞分化的能力。更具剛性的水凝膠可能對細胞遷移能力有影響。由於細胞必須遷移到器官中，其中包含細胞的水凝膠應具有足以允許該細胞遷移的黏彈性，任擇地，存在水凝膠及/或補釘移植物內，或遠離。這種黏彈性的非限制性範例包括但不限於約50至約100Pa或約250Pa，例如至少約50Pa、至少約100Pa、至少約150Pa、至少約200Pa，至多約250Pa、至多約200Pa、至多約150Pa、至多約100Pa，及/或之間的任何單獨值，例如但不限於約50Pa、約100Pa、約 150 Pa、約200 Pa，以及約250 Pa。

不受理論束縛，一般相信當細胞從補釘移植物遷移到目標器官或組織中時，它們會與一些與其結合或包覆它們的水凝膠一起遷移。水凝膠屏蔽細胞免受組織微環境中的信號影響，這些信號將影響細胞分化或成熟，並使細胞保持不成熟。這有利於細胞遷移通過實質組織。當水凝膠中的玻尿酸逐漸被分解和去除，細胞開始分化或成熟，並開始成體細胞功能。產生類器官的方法

不受理論束縛，已確定早期譜系細胞在整合入類器官或聚集體時，會有高移植成功率。此種組織可任擇地包括上皮細胞和間質細胞二者的早期譜系階段。

因此，本文提供了形成類器官的方法，該方法包括，由或基本上由在適合組織培養的容器中，於培養液存在下，培養上皮細胞和間質細胞的混合物，經由淘選去除附著在容器表面上的成熟細胞，並由培養液中的細胞懸浮液中回收自我組裝的類器官等方法組成。於此亦揭示包含如此產生的類器官之組成物。

在一些實施例中，該方法包括在無血清條件和37℃下，選擇性地、快速地 (15-30分鐘)將成熟細胞附著至常規培養皿上，進行淘選來消除成熟細胞，因為即使在這些條件下，成熟細胞也會表現各種可使細胞附著的基質成分。這種淘選過程的多次循環(例如4-5次)可富集早期譜系階段細胞的細胞懸浮液。然後將細胞懸浮液轉移到低附著培養皿中，再次轉移到無血清培養液中，此為一種針對早期譜系細胞設計的培養液，並在37℃的培養箱中放置過夜。這些條件可促進譜系階段-匹配的上皮細胞和間質細胞自我組裝成類器官。類器官可以從上皮細胞的早期階段(ES細胞、iPS細胞、定型幹細胞、短暫倍增細胞，前驅細胞)與間質細胞的早期階段(血管母細胞、內皮細胞的前驅細胞、星狀細胞的前驅細胞)混合而獲得。

成體上皮細胞與成熟間質細胞，以及成熟上皮細胞與早期譜系間質細胞(ELSMCs)的嵌合混合物，通常不會產生類器官，但可作為移植物生物材料中的懸浮細胞混合物。如果成熟上皮細胞(例如肝細胞、膽管細胞、胰島、腺泡細胞、腸細胞等)與成熟間質細胞(例如內皮細胞、星狀細胞、基質細胞、肌纖維母細胞)合作，則混合物不會使移植物成功整合入目標部位或器官，而是持續存在於器官或組織的表面。若使用包含成體和幹/前驅細胞的嵌合混合物(例如具有血管母細胞的成熟肝細胞)，則植入可發生，因為存在能夠使細胞植入和遷移的MMPs來源。

在另一觀點中，自內部器官分離出的細胞，可在細胞導入宿主之前，於生物材料內離體固化，或者作為流體物質注射，並允許在體內固化成移植物。較佳地，該細胞可在患病或功能障礙的組織處或附近導入，並可通過注射或移植到組織上/內，或者使用適當的手術方法。

在另一觀點中，可形成水凝膠或平行不溶性複合物的生物材料，可包含玻尿酸、經硫醇修飾的玻尿酸或其他糖胺聚醣(GAGs)。凝固的觸發因素可為引起基質成分交聯或使該可成膠成分凝膠化的任何因素。交聯劑可包括聚(乙二醇)(PEG)或PEG-二丙烯酸酯(PEGDA)水凝膠或其含二硫化物衍生物。

在另一觀點中，本發明提供使用一或多種第二型細胞(間質細胞)培養第一型細胞(上皮細胞)，來形成類器官的方法，其中該第二型細胞處於成熟中階段，為第一型細胞的合適譜系夥伴。在一些實施例中，這可藉由淘選除去附著於培養皿的成熟細胞來達成；將未附著的細胞轉移到低附著培養皿中與適當的培養液中；並回收在這些條件下自我組裝的類器官。第一型細胞可為上皮幹細胞、上皮細胞的定型前驅細胞或成熟細胞(例如肝細胞)。第二型細胞可為間質譜系幹細胞(例如血管母細胞、間質幹細胞)、這些譜系的前驅細胞(例如內皮細胞或星狀細胞前驅細胞)，或早期譜系階段間質細胞的混合物。重要的是，此種形成不可能在所有條件下發生。例如，在Matrigel中培養，不會產生適用於成功補釘移植的類器官。儘管基質Matrigel-製備的類器官可能會植入，但相對於在完全確定條件下製備的類器官，植入的程度將減弱。此外，Matrigel不能成為臨床產品所用條件的成分。

在另一觀點中，本發明提供一種將細胞植入一器官中的方法，包括接觸包含多層物之補釘移植物，該多層物包括生物相容性、可生物分解性背襯，其對供體細胞的分化具有中性作用；第二層，其包含一或多種生物材料，例如玻尿酸，其可以固化成水凝膠；上皮細胞和支持性間質細胞的混合物，其摻入固化的生物材料中；這種類似OK繃(Bandaid)的結構可經由縫合線或外科膠水附著在目標部位。在背襯的漿膜表面上加入一層製備為達到400 Pa或更高剛性的固化生物材料，該剛性位準為摻入供體細胞的軟性生物材料之至少兩倍。補釘移植物內的細胞能夠植入並遷移到整個組織/器官中，以成熟至相關的成體命運，此由它們所處的微環境決定。嵌入或包含在多孔背襯中的生物材料之較高帕斯卡位準，可阻止細胞沿錯誤方向遷移，且添加至移植物漿膜表面的生物材料，可使來自其他器官和組織的細胞沾黏最小化。類器官

根據於此揭示的實施例，類器官、膽系幹細胞(之後稱為“BTSCs”)和早期譜系期間質細胞(之後稱為“ELMCs”)的漂浮聚集體，證實為將細胞加入移植物中最成功的方法。於此揭示BTSCs和ELMCs可藉由淘選以消除成熟的星狀細胞/基質細胞，而自我篩選為類器官，且已證明可更有效率且有效地建立移植物譜系階段合適的上皮-間質夥伴。在另一觀點中，本發明提供以第二型細胞培養第一型細胞形成類器官的方法，其中第二型細胞為第一型細胞的階段適當譜系夥伴，藉由淘選去除附著於培養皿上的成熟細胞，並從培養物懸浮液中回收自我組裝的類器官。第一型細胞可為上皮幹細胞或定型上皮細胞。第二型細胞可為間質譜系、間質幹細胞或早期譜系期間質細胞的細胞。其他觀點涉及自我組裝類器官及其用途。

在一些實施例中，供體細胞和/或支持間質細胞會表現基質金屬蛋白酶(之後稱為MMPs)。不受理論限制，一般相信MMPs允許供體和宿主細胞合併，以及格利森氏囊(或組織或器官周圍的等效囊)溶解。於此揭示的內容提供，在一些實施例中，早期幹細胞或ELMCs表現高位準MMPs，而成熟肝細胞表現低位準MMPs。在一些實施例中，與成熟竇狀內皮細胞(CD31+++、VEGF-受器+、第IV型膠原蛋白+，以及CD117陰性)配對，及與成體膽管細胞配對的成熟肝細胞，會與成熟星狀細胞和基質細胞(ICAM-1+、ASMA+、維生素A++、第I型膠原蛋白+)結合，導致細胞聚集體維持在器官表面，且不能有效地植入。在一些實施例中，成熟上皮細胞的植入需要它們與未成熟間質細胞合作，該未成熟間質細胞可產生植入和遷移所需的MMPs。

根據於此揭示之一實施例，幹細胞/前驅細胞如BTSCs和ELSMCs的類器官、漂浮聚集體，已證實是最成功的細胞呈現，可成功移植補釘物。於此揭示BTSCs和ELSMCs可在無血清條件下，藉由附著於常規培養皿細胞的標準淘選程序，去除成熟間質細胞，而自我篩選為類器官，之後在低附著培養皿和無血清、完全定義的培養液中，培養剩餘細胞(未附著的細胞)。類器官可於這些條件下自我組裝。

在另一觀點中，本發明提供藉由培養第一型細胞(上皮細胞)與第二型細胞(間質細胞)，以形成類器官的方法，其中第二型細胞為第一型細胞的階段適合譜系夥伴，藉由淘選程序去除附著在常規培養皿上的成熟細胞，並從培養皿的低附著物培養皿中回收自我組裝的類器官。第一型細胞可為上皮幹細胞、短暫倍增細胞定型上皮前驅細胞。第二型細胞可為間質細胞譜系幹細胞、短暫倍增細胞或定型間質前驅細胞。

在一些實施例中，供體細胞及/或支持性間質細胞會表現基質金屬蛋白酶(之後稱為MMPs)。不受理論限制，一般相信MMPs會導致組織或器官周圍的囊溶解，並允許供體和宿主細胞合併。於此揭示的內容提供了在一些實施例中，早期幹細胞或ELMCs會表現高位準的MMPs，而成熟肝細胞表現低位準的MMPs。在一些實施例中，與成熟竇狀內皮細胞(CD31+++、VEGF-受器+、第IV型膠原蛋白+，以及CD117陰性)配對，及與成體膽管細胞配對的成熟肝細胞，會與成熟星狀細胞和基質細胞(ICAM-1+、ASMA+、維生素A++、第I型膠原蛋白+)結合，導致細胞聚集體維持在器官表面，且不能有效地植入。在一些實施例中，成熟上皮細胞的植入需要它們與未成熟間質細胞配對，該未成熟間質細胞產生植入和遷移所需的MMP。

依據本文揭示的一個實施例，幹細胞/前驅細胞，如BTSCs和ELSMCs的類器官、漂浮聚集體，證明是最成功的細胞呈現，以成功進行補釘移植。本文揭示BTSCs和ELSMCs可藉由消除成熟充質細胞而自我選擇成類器官，此經由在無血清條件下附著於常規培養皿的細胞之標準淘選程序而進行，之後於低附著盤和無血清、完全定義的培養液中培養剩餘細胞(未附著的細胞)。類器官會在這些條件下自我組裝。

在另一觀點中，本發明提供藉由培養第一型細胞(上皮細胞)與第二型細胞(間質細胞)形成類器官的方法，其中該第二型細胞為第一型細胞的階段適合譜系夥伴，經由淘選程序去除附著在常規培養皿上的成熟細胞，並由低附著培養皿上的培養懸浮物中回收自我組裝的類器官。該第一型細胞可為上皮幹細胞、短暫倍增細胞定型上皮前驅細胞。該第二型細胞可為間質細胞譜系幹細胞、短暫倍增細胞或定型間質前驅細胞。

在一些實施例中，為了使補釘移植策略成功，供體細胞及/或支持性間質細胞必須表現多種基質金屬蛋白酶(之後稱為MMPs)，尤其是分泌形式的MMPs。不受理論限制，一般相信MMPs之多種異型體會使器官或組織周圍的囊溶解，之後供體細胞會快速遷移到宿主組織中。於此揭示的內容說明，早期上皮幹細胞及/或ELSMCs會表現高位準的膜結合型及/或分泌型MMPs，而成熟細胞(例如肝細胞)則表現低位準的分泌型MMPs，即使它們會表現膜結合型MMPs。此類成體細胞(例如肝細胞、膽管細胞、胰島、腸細胞等)的植入，需要作為MMPs細胞來源的間細胞夥伴，特別是分泌形式的MMPs，如果植入發生的話。另一種方法是在移植物的生物材料中提供MMPs的相關異型體，其為純化形式。

依據此揭示內容，可使用補釘移植物移植的細胞數量是相當可觀的(＞10⁸ )，並且由移植物尺寸、類器官的數量和大小(或細胞的數量 - 如果不是類器官的一部份)、供體細胞為幹細胞或成熟細胞，以及分泌型與膜結合型MMPs(無論是來自上皮細胞及/或來自間質細胞)的表現情況決定。這些發現與經由血管遞送或注射移植可用的受限數量細胞(如10⁵ -10⁶ )非常不同。

於此揭示移植物的製備包括將細胞與會變為不可溶並使細胞定位於目標位置的適當生物材料混合。在另一觀點中，內部器官的分離細胞可在將細胞導入宿主之前，於生物材料內離體固化，或者，作為流體物質注射並允許在體內固化。在另一觀點中，可形成水凝膠或平行不溶性複合物的生物材料，可包含玻尿酸或其他非硫酸化或最低限度硫酸化的糖胺聚醣、經硫醇修飾的玻尿酸鈉或植物衍生的材料(例如海藻酸鹽)。凝固的觸發因素可為引起基質成分進行交聯或使可成膠者進行凝膠化的任何因素。交聯劑可包括聚二丙烯酸乙二酯或其二硫化物衍生物。較佳地，細胞和生物材料的不溶性複合物具有約0.1至200 Pa，較佳約0.1至約1 Pa，約1至約10 Pa，約10至100 Pa，或約100至約200 Pa的黏彈性。

較佳地，細胞係於患病或功能障礙的組織處或附近導入，並可經由注射或手術傳送導入。不受理論限制，假設較硬的HA水凝膠(例如＞ 500 Pa)會引發細胞分化並減少植入，這是由於成熟時MMP的表現降低，同時遷移能力亦降低。背襯

對供體細胞成熟狀態呈中性的生物相容性、生物可分解性背襯有多種選擇。其包括Bombyx蛾絲形式，如SeriR外科絲支架或Contour Seri-Silk(Sofregen, New York, NY)、Bombyx蛾絲、羊膜衍生物、網膜、胎盤和合成紡織品或材料等形式的其他衍生物，如聚乙醇酸 - 共-聚-L-乳酸(PGA/PLLA)。背襯有效性的關鍵在於它對供體細胞的分化具有最小影響。因此，臨床上使用的許多形式的背襯無法用於補釘移植，因為它們係由會誘導供體細胞分化的成分(例如成熟類型的細胞外基質形式)組成。

背襯必須具有足夠的拉伸強度，以允許藉由縫合線或手術膠將移植物附著到目標部位。其應由生物相容性、生物可分解性材料組成，能夠在幾個月內分解，但分解產物不會改變供體細胞的成熟化。因此，產品應對pH值或環境的其他方面具有最小的影響。背襯亦必須能夠貼合目標部位的表面；因此，有彈性的背襯將有助於在具有顯著曲率的位置使用移植物。Seri-Silk為用於背襯的合適材料之非限制性範例。羊膜(aminion)衍生替代物亦被認為是用於背襯的合適材料，例如但不限於由Osiris Therapeutics, Inc (Columbia, MD)生產的羊膜衍生材料。

背襯可源自支架或膜，例如但不限於絲、羊膜、胎盤、網膜、另一種天然材料、合成紡織品或材料，或其組合。背襯可替代地或另外地為多孔網狀物，在此情況下，應該以抑制該細胞群在背襯方向上遷移，即遠離目標部位的材料注入/浸漬。背襯材料的關鍵特徵為生物相容性、生物可分解性，如上述定義的中性，並具有如上所述的足夠拉伸強度。此外，該材料可任擇地為生物可再吸收性。

可依據用途進一步最佳化該背襯。例如，在一些實施例中，補釘移植物可用於皮膚與其下方的真皮組織，若它包含設計為可於空氣乾燥效果下存活的背襯。

如上所述的水凝膠基質亦可用於補釘移植物的其他部分。例如，若該生物相容性、生物可分解性背襯為多孔性，則可使用水凝膠來抑制該細胞群在背襯方向上的遷移。與水凝膠相較，這種水凝膠需要更高的黏彈性，例如，高1.5至15倍，例如高2倍。適當黏彈性的非限制性範例包括但不限於約250至約600 Pa的黏彈性，例如至少約250 Pa、至少約300 Pa、至少約350 Pa、至少約400 Pa、至少約450 Pa、至少約500 Pa、至少約550 Pa，至多約600 Pa、至多約550 Pa、至多約500 Pa、至多約450 Pa、至多約400 Pa、至多約350 Pa、至多約200 Pa，及/或其間的任何單一值，例如但不限於約250 Pa、約300 Pa、約350 Pa、約400 Pa、約450 Pa、約500 Pa、約550 Pa ，以及約600 Pa。適當黏彈性的其他非限制性範例包括但不限於約600至約800 Pa的黏彈性，例如至少約600 Pa、至少約650 Pa、至少約700 Pa、至少約750 Pa，至多約800 Pa、至多約750 Pa、至多約700 Pa、至多約650 Pa、至多約600 Pa，及/或之間的任何單一值，例如但不限於約600 Pa、約 650 Pa、約700 Pa、約750 Pa，以及約800Pa。更進一步的非限制性範例包括約250 Pa至約800 Pa的範圍。

此外，於此揭示的水凝膠可使用作為塗層，以防止沾黏在背襯漿膜表面上，其與鄰近細胞和MMP來源的背襯側相對。此種水凝膠可具有介於適用於其中包含細胞的水凝膠和適用於密封背襯的水凝膠之間的黏彈性。適當之黏彈性非限制性範例包括但不限於約250至約400 Pa或約500 Pa的黏彈性，例如至少約250 Pa、至少約300 Pa、至少約350 Pa、至少約400 Pa、至少約450 Pa，至多約500 Pa、至多約450 Pa、至多約400 Pa、至多約350 Pa、至多約200 Pa及/或之間的任何單一值，例如但不限於約250 Pa、約300 Pa、約350 Pa、約400 Pa、約450 Pa，以及約500 Pa。移植物，一般性

一般而言，補釘移植物可設計為使用上述用於將供體(同種異體或自體)移植到實體器官或組織的方法和成分，以及在早期成熟譜系階段維持並保持供體細胞的條件。在一些實施例中，供體細胞為上皮細胞和間質細胞的混合物。在一些實施例中，兩種供體細胞群均為幹/前驅細胞。在一些實施例中，該上皮細胞為成熟細胞(例如肝細胞、胰島等)，以及間質細胞為幹/前驅細胞。在一些實施例中，移植物生物材料的條件，例如，培養液和基質成分，可使供體細胞群二者或至少間質細胞群維持於幹/前驅細胞。在一些實施例中，培養液包含基礎培養液和可溶性信號。在進一步實施例中，該基礎培養液和可溶性信號可支持在二供體群體中或至少在間質細胞群體中維持幹細胞性。在一些實施例中，任擇地包含細胞外基質成分的基質，且其剛性位準可支持在二供體群體中或至少在間質細胞群體中維持幹細胞性。在一些實施例中，該基質包含玻尿酸，任擇地製備為具有約50 Pa至約150 Pa黏彈性的軟性水凝膠。在一些實施例中，該補釘移植物包含背襯，其具有足夠的機械穩定性，使移植物能夠固定至目標位置，並由生物相容、生物可分解材料組成，其不會顯著改變供體細胞的成熟化譜系階段。任擇地，無需進一步修飾，背襯本身應足以保護含有供體細胞之層，而不會顯著影響供體細胞的成熟化譜系階段。在一些實施例中，背襯為網狀物或支架，並進一步使用具有足夠高黏彈性的生物材料如玻尿酸浸漬，以使任何遷移至其中的細胞足夠成熟，以消除供體細胞朝向目標位置之外的方向上遷移。在一些實施例中，該黏彈性為約500 Pa或更高。在一些實施例中，移植物的漿膜表面塗覆有生物材料，以使與鄰近組織或器官的沾黏最小化。在一些實施例中，這些生物材料具有約200 Pa至約300 Pa的黏彈性。具有 MMPs 細胞來源的移植物

本發明觀點相關於用於維持並保持混合細胞群的補釘移植物，包含：(a)具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現分泌型及/或膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由存在於水凝膠基質中之培養液所支持，該水凝膠基質具有足以允許該混合群移動的黏彈性，可選地，在該水凝膠中移動或移動遠離該水凝膠及/或在該補釘移植物中移動或移動遠離該補釘移植物；(b)一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往該背襯之方向上移動的黏彈性；以及，任擇地，(c)覆蓋於該背襯漿膜(即外側)表面之水凝膠，其位於與該混合細胞群接觸位置之對側，在實施例中，該處有補釘移植物固定在目標位置上，位於與目標位置 (如器官或組織)接觸面的對側。在一些實施例中，該層可防止或抑制其他組織或器官的沾黏。在一些實施例中，補釘移植物配置為維持並保持該混合群體，同時抑制該至少一種早期譜系階段細胞類型分化或進一步成熟至後期譜系階段，其不再能夠表現膜結合型及/或分泌型MMPs。

在一些實施例中，該背襯為多孔性或無孔性。在一些實施例中，背襯包含多孔網、支架或膜。在一些實施例中，背襯包含絲；合成紡織品；或天然物質，如羊膜、胎盤或網膜；或其組合。在一些實施例中，該背襯包含注入水凝膠的多孔網。在進一步的實施例中，此種灌注可防止細胞遷移遠離目標器官或組織。在一些實施例中，該背襯包含固體材料。

在一些實施例中，該一或多種水凝膠包含玻尿酸。

在一些實施例中，該培養液包含Kubota培養液，或支持幹細胞並能維持幹細胞特性的另一種培養液。

在一些實施例中，該混合群包含間質細胞與上皮細胞。在一些實施例中，該上皮細胞可為外胚層、內胚層或中胚層。在一些實施例中，該間質細胞包含早期譜系期間質細胞(ELSMCs)。在一些實施例中，該ELSMCs包含血管母細胞、內皮細胞前驅細胞、星狀細胞前驅細胞和間質幹細胞(MSCs)之一或多者。在一些實施例中，該上皮細胞包含上皮幹細胞。在一些實施例中，該上皮細胞包含膽系幹細胞(BTSCs)。在一些實施例中，該上皮細胞包含定型及/或成熟上皮細胞。在一些實施例中，該定型及/或成熟上皮細胞包含成熟實質細胞。在一些實施例中，該成熟實質細胞包含肝細胞、膽管細胞和胰島細胞之一或多者。在一些實施例中，該間質細胞和上皮細胞二者均包含幹細胞。

在一些實施例中，該混合群包含自體及/或同種異體細胞。

在一些實施例中，該一或多種細胞類型係經基因修飾。“ 層化 ” 移植物

在一些實施例中，補釘移植物應理解為多層移植物。例如，於此提供補釘移植物，其包含，由或基本上由多層組成，包括，至少：(a) 柔軟的第一層水凝膠，其包含供體細胞、任擇的上皮細胞及/或間質細胞；(b)硬的第二層水凝膠；(c)第三層，包含生物相容性、生物可分解的背襯。在一些實施例中，特別是第三層為多孔性者，係將第二層摻入、浸漬及/或注入第三層中。在一些實施例中，該補釘移植物質尚包含第四層水凝膠。在補釘移植物的一些實施例中，係將第四層包覆或塗在移植物漿膜表面上。在補釘移植物的一些實施例中，第一層適於直接接觸目標組織或器官。

於此使用，“柔軟”是指展現低內壓的水凝膠層，藉由帕斯卡(Pascal) (Pa)測量法定量測定。帕斯卡(Pascal)定義為每平方公尺一牛頓。在一些實施例中，柔軟層的黏度為約10 Pa至約300 Pa、約50 Pa至約250 Pa、約100 Pa至約250 Pa、約50 Pa至約200 Pa、約150 Pa至約200 Pa，或約100 Pa至約200 Pa。在一特定實施例中，柔軟水凝膠層具黏度小於或約為200 Pa。

使用於此，“硬”是指展現高內壓的水凝膠層，藉由帕斯卡(Pascal) (Pa)測量法定量測定。在一些實施例中，硬層具有約300 Pa至約3000 Pa、約300 Pa至約1000 Pa、約400 Pa至約750 Pa、約400 Pa至約550 Pa、約450 Pa至約600 Pa，或約500 Pa至約600 Pa的黏度。在一特定實施例中，硬水凝膠層的黏度大於或約為500 Pa。

較佳地，就層化移植物的第一層而言，細胞和生物材料之不溶性複合物具有約0.1至200 Pa，較佳約0.1至約1 Pa、約1至約10 Pa、約10至100 Pa，或約100至約200 Pa，或約50至約250 Pa，或約200 Pa的黏度或黏彈性。較佳地，就層化移植物的第一層而言，細胞和生物材料的不溶性複合物具有約0.1至200 Pa的黏彈性，較佳約0.1至約1 Pa、約1至約10 Pa、約10至100 Pa，或約100至約200 Pa。

在一些實施例中，混合物之一或多種細胞為分泌型及/或膜結合型MMPs的來源。在一些實施例中，例如但不限於涉及可天然分泌MMPs的幹/前驅細胞群者，可靜默MMP表現的變數- 任擇地為分泌型MMP的表現，係於補釘移植物中控制。此類變數的非限制性範例包括導致幹/前驅細胞成熟的變數，例如但不限於對培養液或移植物生物材料的血清補充、激素或影響上皮及/或間質細胞分化的其他可溶性信號、氧氣位準(由於厭氧條件會保持細胞不成熟，而較高的氧氣位準會促進分化)，以及移植材料的剛性(由於剪切力和壓縮等機械力可驅動分化)。

在補釘移植物之一些實施例中，該第一層之黏度為約50至約250 Pa。在補釘移植物之一些實施例中，該第一層之黏度為約200 Pa。在補釘移植物之一些實施例中，該第二層之黏度為約250 Pa至約600 Pa。在補釘移植物之一些實施例中，該第二層之黏度為約500 Pa。在補釘移植物之一些實施例中，該第四層之黏度為約250至約500 Pa。在補釘移植物之一些實施例中，該第四層之黏度為約400 Pa。在補釘移植物之一些實施例中，該第二層之黏度大於第一層。在補釘移植物之一些實施例中，該第二層之黏度為約 1.5至約15倍高於第一層之黏度。在補釘移植物之一些實施例中，該第二層之黏度為約2倍高於第一層之黏度。

在一實施例中，補釘移植物包含、由或基本上由各層組成，起始於與目標位置接觸，並由埋入軟(＜ 200 Pa)水凝膠中的供體細胞組成之層，該水凝膠係由無血清、完全定義的培養液(這些細胞將植入並遷移到組織中)製備；第二層水凝膠，於相同培養液中製備，且被觸發以具有更高的剛性(例如~500 Pa或更高)，為供體細胞向目標組織以外的任何方向遷移提供屏障；第三層，為生物相容性、生物可分解性、生物可回收性背襯，其對供體細胞的成熟化具有中性作用，並可藉由外科手術或其他方式將移植物固定至目標位置；以及最後一層水凝膠，其剛性介於軟水凝膠和硬水凝膠之間，並在表面上塗有或覆有足夠的流體，以盡量減少附近組織的沾黏。

在補釘移植物的一些實施例中，第一層和第二層各自包含一或多種玻尿酸。在補釘移植物的一些實施例中，第四層包含一或多種玻尿酸。

在補釘移植物的一些實施例中，上皮細胞和間質細胞形成一或多種聚集體。在補釘移植物的一些實施例中，該一或多種聚集體為類器官。在補釘移植物的一些實施例中，該上皮細胞包含上皮幹細胞。在補釘移植物的一些實施例中，該上皮細胞包含膽管上皮細胞。在補釘移植物的一些實施例中，該上皮細胞包含定型及/或成熟上皮細胞。在補釘移植物的一些實施例中，定型及/或成熟上皮細胞包含成熟實質細胞。在補釘移植物的一些實施例中，該成熟實質細胞包含肝細胞、膽管細胞與胰島細胞之一或多者。

在補釘移植物的一些實施例中，間質細胞為支持性間質細胞。在補釘移植物的一些實施例中，間質細胞包含早期譜系階段間質細胞(ELSMCs)。在補釘移植物的一些實施例中，ELSMCs包含血管母細胞、內皮細胞前驅細胞、星狀細胞前驅細胞和間質幹細胞(MSC)之一或多者。

在補釘移植物的一些實施例中，上皮細胞和間質細胞並非彼此的譜系階段夥伴。在補釘移植物的一些實施例中，該上皮細胞為成熟細胞。在補釘移植物的一些實施例中，該間質細胞為ELSMCs。

在補釘移植物的一些實施例中，該上皮細胞和間質細胞之至少一者係衍生自供體。在一些實施例中，該供體為需要組織移植的個體。在一些實施例中，該供體為用於組織移植的健康細胞來源。在補釘移植物的一些實施例中，該上皮細胞和間質細胞之至少一者，為補體移植物的預期接受者之自體同源物。在一些實施例中，所有細胞(即上皮細胞和間質細胞)為移植物的預期接受者之自體同源物。在一些實施例中，該細胞供體可為接受者以外者(同種異體移植)，或為內部器官處於患病或功能障礙狀態的個體(自體移植)，任擇地，其得自沒有患病或功能失調內部器官的一部分，及/或經基因修飾以恢復功能之細胞。為了建立研究疾病的模型系統，供體細胞可為患有疾病，並被移植到實驗宿主的正常組織上/中者。

在補釘移植物的一些實施例中，上皮細胞或間質細胞之至少一者係經修飾。在一些實施例中，所有細胞皆經修飾。在一些實施例中，該修飾為基因修飾。在一些實施例中，該一或多種細胞係經修飾，以表現治療用核酸或多胜肽。在一些實施例中，該一或多種細胞係經修飾，以表現核酸或多胜肽的野生型等位基因。

在補釘移植物的一些實施例中，生物相容性、生物可分解性背襯為可生物再吸收性。在補釘移植物的一些實施例中，該生物相容性、生物可分解性背襯包含多孔材料。在補釘移植物的一些實施例中，該生物相容性、生物可分解性背襯包含支架或膜。在補釘移植物的一些實施例中，該支架或膜包含絲、羊膜、合成織物或其組合。在一些實施例中，該生物相容性、生物可分解性背襯不包含誘導或阻止細胞分化的任何因子。在補釘移植物的一些實施例中，該生物相容性、生物可分解性背襯不包括一或多種衍生自成熟細胞外基質的成分。在補釘移植物的一些實施例中，衍生自成熟細胞外基質的成分為第I型膠原蛋白。

在補釘移植物的一些實施例中，該補釘移植物進一步包含一或多種基質金屬蛋白酶(MMPs)。在補釘移植物的一些實施例中，MMP為膜結合型MMP。在補釘移植物的一些實施例中，膜結合型MMP由一或多種上皮細胞或間質細胞提供。在補釘移植物的一些實施例中，MMP為分泌型MMP。分泌型MMPs可任擇地由一或多種上皮細胞或間質細胞天然產生，或者任擇地由於一或多種上皮細胞或間質細胞經重組表現載體轉化，而產生MMP。

在一些觀點中，於此提供一種補釘移植物，其包含、由或基本上由多層組成，包括至少：包含膽管幹細胞的柔軟第一層水凝膠；硬的第二層水凝膠；以及包含生物相容性、生物可分解性背襯的第三層。

在一實施例中，補釘移植物由多層材料和細胞組成，其共同形成“OK繃狀移植物”，其可經由外科手術或以其他方式固定至目標位置。該第一層，對向於目標位置，包含一柔軟(200 Pa以下)水凝膠層，其中種入有上皮細胞與支持性間質細胞，其懸浮於完全定義、無血清、富含營養物之培養液，設計用於細胞擴增及/或存活；第二層，含有於相同培養液中製備，且被觸發以具有更高的剛性(例如更高帕斯卡位準)之水凝膠，並形成阻斷細胞向目標組織以外的任何方向遷移之屏障；第三層，包含生物相容性、生物可分解性背襯，其對供體細胞的分化不具或具最小作用，但可作為補釘的機械性支撐結構物；第四層，包含可塗性水凝膠(也稱為玻尿酸)，其剛性位準介於軟水凝膠與硬水凝膠之間，並用於使鄰近組織的細胞與移植物的沾黏最小化。水凝膠必須由生物相容性、生物可分解性和“可調”性材料組成，這意味著在剛性方面可調節。用於水凝膠之一成功材料為經硫醇修飾的玻尿酸，當暴露於氧氣及/或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)時，可被驅動形成水凝膠，且藉由透明質酸和PEGDA濃度的精確比例( 及/或氧氣位準)，可立即成為“可調性”。

在另一個實施例中，補釘移植物包含複數層。面對於目標位置，第一層為軟水凝膠，其為最小硫酸化或非硫酸化的GAG，或其他非硫酸化或中性生物材料，其可凝膠化或固化，且其中放置供體細胞。第二層水凝膠或生物材料更堅硬，並加入背襯中/上或內部，其為一種生物相容性、生物可分解性、生物可再吸收之背襯，允許補釘可用於手術或其他目的，並作為強制細胞朝向目標組織遷移的屏障。背襯漿膜側在手術時塗有生物材料，例如玻尿酸(或其他最低或未硫酸化GAGs，或其他可凝膠化或固化的材料)，其中帕斯卡位準至少是軟質生物材料層的帕斯卡位準之二倍；此有助於最小化鄰近組織的沾黏。補釘移植物與目標器官或組織相連，且細胞能夠遷移至組織或器官中並完全融入。

在一特定實施例中，補釘移植物包含第一層軟生物材料(＜200 Pa)，例如軟玻尿酸水凝膠，且其中置有供體細胞，其待移植到依據細胞譜系階段量身定製的無血清、完全定義培養液中。此層置於更具剛性之層(例如更具剛性的水凝膠)頂上作為屏障，迫使供體細胞朝向目標組織遷移。更堅硬之層在背襯上提前製備，該背襯為生物相容性、生物可分解的背襯，其能夠使補釘用於外科手術或其他程序，以便將補釘固定到目標部位。最後一層為生物材料，其剛性介於目標組織側的供體細胞和屏障中間。此層係添加到移植物的漿膜側，並在手術時作為使來自鄰近組織的沾黏最小化。該生物相容性、生物可分解背襯可為Seri-silk或其衍生物。使用與傳送補釘移植物之方法

本揭示之各觀點相關於用於將細胞植入至器官中之組合物與方法。將移植細胞自實體器官移植到內部器官中，通常使用直接注射或經由血管途徑傳送細胞。Lanzoni, G. et al.Stem Cells 31, 2047-2060 (2013)。這些移植方法導致僅有少量細胞被移植到目標部位，並且存在可能危及生命的血栓風險。若經由“注射移植”傳遞細胞，其中細胞懸浮於玻尿酸中或以玻尿酸包覆，之後與觸發劑(PEGDA)共同注射，使玻尿酸原位凝膠化，則可增進移植，如描述於Turner R. et al. Hepatology 57, 775-784 (2013)。注射移植法使細胞侷限於特定位置，儘管數量很少，通常為10⁵ -10⁷ 、10⁶ -10⁷ ，或10⁵ -10⁶ 細胞每注射處。此策略消除或使異位細胞分佈最小化，並使細胞整合入該處最佳化。然而，若使用成熟功能細胞，它們可能具有高度免疫原性，需要長期免疫抑制。而且，能夠注射的細胞數量可能不足以達到必須的臨床結果。

這些障礙和關注點可經由此述之“補釘移植”策略克服。在一些實施例中，“類似OK繃”的移植物經由外科手術或其他方式固定到器官或組織表面；移植的條件使得細胞可完全植入該部位、在整個器官/組織中遷移，然後成熟為相關的成體細胞類型。移植大量細胞(＞10⁸ 個細胞)的可能性，取決於補釘尺寸、移植物內的細胞混合物數量，以及多種形式MMPs的來源，理想情況為MMPs的細胞來源。此外，在一些實施例中，使用類器官對於儲存供體細胞的能力有助益，因為在完全定義的無血清條件下，類器官可容易地冷凍保存。

於此提供的補釘移植物組合物涉及將細胞導引移植至實體器官上。該方法為安全的，可避免血栓與異位細胞分佈，並使細胞植入數量與分布到整個組織最佳化。

因此，於此提供一種移植細胞至目標組織中之方法，包含、由或基本上由將目標組織與上述揭示之補釘移植物接觸而組成。

在該方法的一些實施例中，該目標組織選自於肝、胰臟、膽系、甲狀腺、胸腺、胃、腸、肺、前列腺、乳房、腦、膀胱、脊髓、皮膚與其下的真皮組織、子宮、腎臟、肌肉、血管、心臟、軟骨、肌腱和骨組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為肝組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為胰組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為膽系組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為胃腸組織。在該方法的一些實施例中，該目標組織為患病、受損或具有病症。在該方法的一些實施例中，該目標組織為腎組織。

在該方法的一些實施例中，該目標組織為一器官。在該方法的一些實施例中，該器官為肌肉骨骼系統、消化系統、呼吸系統、泌尿系統、女性生殖系統、男性生殖系統、內分泌系統、循環系統、淋巴系統、神經系統或皮膚系統的器官。在該方法的一些實施例中，該器官選自肝、胰臟、膽系、甲狀腺、胸腺、胃、腸、肺、前列腺、乳房、腦、膀胱、脊髓、皮膚與其下的真皮組織、子宮、腎臟、肌肉、血管、心臟、軟骨、肌腱和骨骼。在一些實施例中，該器官為患病、受損或具有病症。

於此亦提供治療患有肝臟疾病或病症的個體之方法，該方法包含、由或基本上由將個體肝臟與上述揭示的補釘移植物接觸組成。在該方法的一些實施例中，該肝臟疾病為肝纖維化、肝硬化、血色素沉著症、肝癌，膽道閉鎖、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自體免疫性肝炎、肝蛭症、酒精性肝病、a1-抗胰蛋白酶缺乏症、第II型糖原儲存症、轉甲狀腺素蛋白-相關之遺傳性澱粉樣變性、吉爾伯特症候群(Gilbert’s syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、布加症候群(Budd-Chiari syndrome)、肝外傷，或威爾遜氏症(Wilson disease)。

在其他觀點中，於此亦提供治療患有胰臟疾病或病症的個體之方法，該方法包含、由或基本上由將個體胰臟與上述揭示的補釘移植物接觸組成。在該方法的一些實施例中，該胰臟疾病或病症為糖尿病、胰外分泌功能不全、胰臟炎、胰臟癌、歐蒂氏括約肌功能障礙、囊性纖維化、胰臟分裂症、環狀胰臟、胰臟外傷或胰血管炎。

在其他觀點中，於此亦提供治療患有胃腸疾病或病症的個體之方法，該方法包含、由或基本上由將個體之一或更多個腸，與上述揭示的補釘移植物接觸組成。在一些實施例中，該胃腸疾病或病症為腸胃炎、腸胃癌、迴腸炎、發炎性腸症、克羅恩氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、腸躁症後群、消化性潰瘍病、乳糜瀉、纖維化、血管發育不良、先天性巨結腸症(Hirschsprung’s disease)、假膜性結腸炎或胃腸外傷。

在其他觀點中，於此亦提供治療患有腎臟疾病或病症的個體之方法，該方法包含、由或基本上由將個體之一或更多個腎臟，與上述揭示的補釘移植物接觸組成。在該方法的一些實施例中，該腎臟疾病或病症為腎炎、腎病、腎炎症候群、腎病症候群、慢性腎病、急性腎損傷、腎外傷、囊性腎病、多囊腎病、腎小球腎炎、IgA腎病、狼瘡腎炎、腎癌、Alport症候群、澱粉樣變性、古德帕斯特症候群(Goodpasture syndrome)或韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)。

在治療方法的一些實施例中，上皮細胞與間質細胞之至少一者衍生自供體。在一些實施例中，該供體為需要組織移植的個體。在一些實施例中，供體為組織移植的健康細胞來源。在一些實施例中，上皮細胞和間質細胞之至少一者對於補釘移植物的預期接受者為自體同源性。在一些實施例中，所有細胞(即上皮細胞和間質細胞)對於移植物的預期接受者為自體同源性。在一些實施例中，細胞供體可為接受者(同種異體移植物)以外的細胞供體，或者亦可為具有處於患病或功能障礙狀態的內部器官的個體(自體性)，任擇地，其中得自未患病或功能障礙的內部器官一部分，及/或經基因修飾以恢復功能之細胞。

在一些實施例中，上述揭示的方法中使用的補釘移植物為包含多層的補釘移植物，該多層包括至少：第一層水凝膠，包含上皮細胞和間質細胞；第二層水凝膠；第三層，包括生物相容性、生物可分解背襯；以及任擇地，第四層水凝膠。在一些實施例中，該方法更包括將包含於補釘移植物內的細胞加入組織中。在該方法的一些實施例中，第一層水凝膠為軟性。在該方法的一些實施例中，第二層水凝膠為硬性。在該方法的一些實施例中，該間質細胞為支持性間質細胞。

在另一觀點中，本發明提供一種用於將細胞植入器官中的方法，包含使用補釘移植物，其為一種具有多層材料，以及可經由外科手術或以其他方式連接到目標位置的細胞之OK繃狀複合物。相對於目標部位，該第一層包含軟水凝膠(200 Pa以下)，其中種入有上皮細胞和支持間質細胞的混合物，其懸浮於完全定義、無血清之營養豐富培養液中，用於擴增及 /或細胞存活；第二層含有在相同培養液中製備的水凝膠，但凝膠化至更硬之為準(即更高的帕斯卡位準)，並形成阻擋細胞朝目標位置以外的方向上遷移之屏障；第三層包含生物相容性、生物可分解背襯，其不影響或最小地影響供體細胞的分化位準，因此為“中性的”；第四層包含可塗覆的水凝膠(再次地，例如玻尿酸)組成，其剛性位準介於柔軟與硬水凝膠之間，以使鄰近組織細胞與移植物的沾黏最小化。水凝膠必須由生物相容性、生物可分解和“可調整”的材料組成，亦即在剛性方面可調整。水凝膠的成功材料之一為經硫醇修飾的玻尿酸，當暴露於氧氣和/或聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)時，可被觸發形成水凝膠，並經由玻尿酸與PEGDA濃度的精確比例( 及/或氧氣位準)容易地成為“可調整”。在移植生物材料條件下的細胞，可產生多種基質 - 金屬-蛋白酶(MMPs)，其促進供體細胞植入、遷移和整合至接受者組織中。接受者組織的微環境決定了移植細胞的成體命運。

在另一觀點中，本發明提供一種將細胞植入器官中的方法，包括接觸包含多層的補釘移植物，該多層包括至少第一層，其包含生物相容性、生物可分解性背襯、第二層，其包含一或多種玻尿酸，包括上皮細胞和支持性間質細胞混合物，以及第三層，其包含一或多種玻尿酸，其中埋入細胞之層非常柔軟(低於200 Pa)；與背襯結合之層較硬(約500 Pa或更高)；以及第三層為帕斯卡位準居於中間之層，有助於減少附近組織或器官的沾黏。在另一觀點中，細胞可植入選自於肝臟、胰腺、膽系、甲狀腺、胸腺、肺、前列腺、乳房、腦、脊髓、神經節、皮膚與其下真皮組織、子宮、骨骼、胸腺、腸、子宮、骨骼、腎臟、肌肉、血管或心臟的器官中。

在又一觀點中，細胞可植入選自於由肝臟、胰腺、膽系、甲狀腺、胸腺、腸、肺、前列腺、乳房、腦、脊髓、神經節、皮膚與其下真皮組織、子宮、骨骼、肌腱、軟骨、腎臟、肌肉、血管或心臟組成群組之一器官。

適用於本文之補釘移植物的非限制性範例包含：(a) 具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現分泌型及/或膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由存在於水凝膠基質之培養液支持，該水凝膠基質具有足以允許該混合群移動的黏彈性，可選地，在該水凝膠中移動或移動遠離該水凝膠及/或在該補釘移植物中移動或移動遠離該補釘移植物；(b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往該背襯之方向上移動的黏彈性；以及，任擇地，(c)覆蓋於該背襯之漿膜(即外側)表面之水凝膠，其位於該混合群所接觸表面的對向，以及，在實施例中，補釘移植物固定至目標位置，係位於與目標位置(如器官或組織)接觸側的對面。在實施例中，此層預防或抑制沾黏至其他組織或器官。在實施例中，該補釘移植物配置為可維持並保持該混合群，同時抑制該至少一早期譜系細胞種類進行分化，或更進一步成熟為晚期譜系階段，其無法表現膜結合及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)。

在一些實施例中，該背襯是多孔性或無孔性。在一些實施例中，該背襯包含多孔網、支架或膜。在一些實施例中，該背襯包含絲；合成紡織品；或天然物質，如羊膜、胎盤或網膜；或其組合。在一些實施例中，該背襯包含注入水凝膠的多孔網。在進一步的實施例中，此種灌注可預防細胞遷移遠離目標器官或組織。在一些實施例中，該背襯包含固體材料。

在一些實施例中，該補釘移植物更包含覆蓋在該背襯漿膜表面上的水凝膠，位於與該混合群體接觸的水凝膠對面。

在一些實施例中，該一或多種水凝膠包含玻尿酸。

在一些實施例中，該培養液包含Kubota培養液，或可支持幹細胞並維持幹細胞性的另一種培養液。

在一些實施例中，該混合群包含間質細胞和上皮細胞。在一些實施例中，該上皮細胞可為外胚層、內胚層或中胚層。在一些實施例中，該間質細胞包含早期譜系期間質細胞(ELSMCs)。在一些實施例中，該ELSMCs包含血管母細胞、內皮細胞前驅細胞、星狀細胞前驅細胞和間質幹細胞(MSCs)之一或多者。在一些實施例中，該上皮細胞包含上皮幹細胞。在一些實施例中，該上皮細胞包含膽管幹細胞(BTSCs)。在一些實施例中，該上皮細胞包含定型及/或成熟上皮細胞。在一些實施例中，該定型及/或成熟上皮細胞包含成熟實質細胞。在一些實施例中，該成熟實質細胞包含肝細胞、膽管細胞和胰島細胞之一或多者。在一些實施例中，該間質細胞和上皮細胞二者均包含幹細胞。

在一些實施例中，該混合群包含自體及/或同種異體細胞。

在一些實施例中，一或多種細胞類型係經基因修飾。範例

以下範例為非限制性與說明性，可用於實施本揭示的各種情況。此外，以下揭示之所有參考文獻皆在此併入本案以作為參考資料。範例 1: 用於補釘移植物驗證之豬模型 動物

使用作為宿主或作為細胞供體的動物保存於NCSU(北卡羅來納州羅利市)獸醫學院設施中。在這些設施進行手術、屍檢和所有生物液體和組織的收集。所有程序均經過NCSU之IACUC委員會批准。使用作為接收者的豬隻為六種不同品種的混合種：由Yorkshires、大白豬、Landraces(來自母豬)、Durocs、Spots和Pietrans(來自公豬)組成的六向交叉。這種高度異質的遺傳背景是希望的，因為它與人類的異質遺傳構成相似。宿主動物均為雌性，大約6週齡及約15 kg。

可分為兩類。 a)雄性豬，約6週齡和約15kg，作為細胞供體移植到雌性中； b)攜帶GFP轉基因的基因轉殖供體動物。GFP+供體動物係經由標準人工授精技術，將基因轉殖H2B-GFP之公豬與野生型母豬育種獲得。該模型經由CRISPR-Cas9介導的IRES-pH2B-eGFP的同源定向修復(HDR)，進入內源性b-肌動蛋白(ACTB)基因座而建立。基因轉殖動物在所有組織中皆顯示出pH2B-eGFP的普遍表現。GFP與H2B的融合導致GFP標記物定位於核小體，並允許清晰的核可視化以及染色體動力學的研究。起始株系列已被廣泛分析，普遍存在，且核定位表現已得到證實。此外，育種已證實H2B-GFP傳至下一代。所有動物都是健康的，並且已經建立多胎妊娠，後代顯示出pH2B-eGFP傳遞的預期孟德爾比率。雄性後代在出生時進行基因分型，對轉基因呈陽性的後代進行人道安樂死，用於進行組織收集和供體細胞的分離。

對於每個供體和接受者動物而言，豬白細胞抗原第I類(SLA-I)和第II類(SLA-II)基因座進行PCR倍增，使用設計用於倍增這些區域中已知等位基因的引子，其依據PCR-序列-特異性引子策略設計。該系統由47個區分性SLA-I引子組成，用於倍增SLA-1、SLA-2和SLA-3基因座⁵³ ，以及47個區分性SLA-II引子組倍增DRB1、DQB1和DQA基因座。這些引子已發展為可藉由共享相似序列模體區分(differentiate)出等位基因，並顯示出可容易且明確地檢測出已知的SLA-I和SLA-II等位基因。當一起使用時，這些引子組可有效地提供每一測試動物之單倍型，因而提供可容易確認出供體和接受動物中匹配或錯配單倍型之試驗。培養液與溶液

所有培養液經無菌過濾(0.22 µm濾器)，並在使用前於4℃黑暗保存。基礎培養液和胎牛血清(FBS)購自GIBCO/Invitrogen。所有生長因子均購自R＆D Systems。除了所述之外，所有其他試劑均來自Sigma。

以599毫升基礎培養液(例如RPMI 1640； Gibco#11875-093)配製細胞清洗液，補充0.5克血清白蛋白(Sigma, #A8896-5G，不含脂肪酸)、10^-9 M硒，和5毫升抗生素(Gibco #35240-062, AAS)。其用於在加工過程中清洗組織和細胞。

製備膠原蛋白酶緩衝液，由100毫升補充有膠原蛋白酶(Sigma # C5138)的細胞清洗液組成，最終濃度為600 U/ml(R1451 25 mg)，用於膽系(管道)組織，以及300 U/ml(12.5 mg)用於器官-實質組織(肝臟、胰臟)。

Kubota培養液，一種完全定義的無血清培養液，設計用於內胚層幹/前驅細胞，係用於製備細胞懸浮液、類器官和HA水凝膠。該培養液由任何基礎培養液組成(此處為RPMI 1640)，不含銅、含低鈣(0.3 mM)、1 nM硒、0.1%牛血清白蛋白(純化的，無脂肪酸；V部分)、4.5 mM煙醯胺、0.1 nM硫酸鋅七水合物、5 μg/ml轉鐵蛋白/Fe、5 μg/ml胰島素、10 μg/ml高密度脂蛋白和純化的游離脂肪酸混合物，其與不含脂肪酸的高純度白蛋白複合。其製備詳述於方法中⁵⁷ 。此外，它可購自PhoenixSongs Biologicals(Branford，CT)。

可溶性、長鏈形式HA(Sigma Catalog# 52747)用於穩定類器官培養物和冷凍保存。它們用於製備水凝膠、經硫醇修飾HA，係得自Biotime的子公司Glycosan Biosciences。這些硫醇修飾之HA成分是藉由使用枯草芽孢桿菌作為宿主的專有細菌發酵方法，於ISO 9001:2000 製程中製備(www.biopolymer.novozymes.com/)。這些成分由Novozymes生產，商品名為HyaCare®，且100%不含動物來源的原料和有機溶劑殘餘物。在生產中不使用動物來源的成分，蛋白質含量非常低且沒有內毒素。生產遵循歐洲藥典規定的標準。HA水凝膠使用Glycosil (HyStem® HAs, ESI BIO-CG313)製備，為經硫醇修飾的HA，可使用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)觸發形成二硫鍵橋。使用除氣水將Glycosil®重製為1%硫醇化HA於1%磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，或者，在本案情況下，於Kubota培養液中的溶液。重製後，它會維持液狀幾小時，但若暴露於氧氣中，則會發生些許凝膠化。在沒有溫度或pH值變化的情況下，會發生更精確的凝膠化，若Glycosil以交聯劑如PEGDA處理，則會導致在幾分鐘內發生凝膠化。

交聯位準決定了剛性位準，並可藉由經硫醇修飾之HA與PEGDA的比例精確地定義。在先前的研究中，幹細胞群在具有不同剛性位準的HA水凝膠中進行測試，發現只有在剛性位準低於200 Pa的情況下，在抗原性和功能上(例如，就遷移能力而言)仍然維持幹細胞狀態²³ 。我們利用此一發現設計移植物，其具有非常柔軟的層，並在漿膜側具有更硬的玻尿酸水凝膠層，以形成往目標組織以外的方向上遷移的屏障，以及使附近組織的細胞沾黏最小化。具有不同剛性位準的3種版本水凝膠於圖 2 中顯示，其特徵在於包括流變性質的直接測量。最硬的屏障，10X HA水凝膠(剛度=760 Pa)，係於背襯上提前製備，如果需要可以冷凍保存。在手術時，供體細胞係於柔軟的1X HA水凝膠(剛性=60 Pa)中製備；放置在更硬的10X水凝膠上(已位於背襯上)；補釘固定在目標位置上。固定後，使用帶有BD Micro-Fine™ IV永久性針頭的NORM-JECT 4010.200V0塑膠注射器，以2X HA水凝膠(剛性= 106 Pa)塗佈或塗覆移植物的漿膜側。

水凝膠的宏觀流變性質係使用應力控制錐板流變儀(TA Instruments，AR-G2，40 mm錐直徑，1°角)測定。凝膠在流變儀上主動聚合，同時以1 rad / s頻率和0.6Pa應力振幅振盪，連續監測模數以確認交聯反應的充分完成。一旦達到平衡，水凝膠便進行振盪頻率掃描(應力幅度：0.6 Pa，頻率範圍：0.01-100 Hz)。所使用的3種玻尿酸水凝膠之黏彈性(流變學)性質摘錄於圖 2 中。

最常用的供體細胞衍生自如上所述的轉基因H2B-GFP豬。它們為細胞移植研究提供了顯著的優勢，因為所有細胞皆以GFP標記。使用螢光蛋白作為分子標籤使得供體細胞在移植後的遷移和植入過程中得以追踪。該融合蛋白靶向核小體，產生核/染色質GFP信號。在所描述的移植物中，幹細胞完全在細胞核中表現GFP，但那些限於成體細胞類型的譜系，則可使其在細胞質或細胞核中。請注意，細胞質GFP的位準在第一週特別高，並隨著時間而降低。這是因為植入/侵入/整合過程導致對細胞的影響，其可導致在細胞質中發現與H2B連接的GFP。這並不意味著細胞正在死亡，而是它們對於高位準MMP，以及重塑區域部分相關的信號做出反應。實際上，檢測到的GFP+細胞明顯存活並增生，均表現各種成體功能(例如白蛋白、HNF4a、AFP、胰島素、升糖素或澱粉酶)。

如移植物特徵中更詳細的描述，成熟肝細胞中的背襯(春綠色)和脂褐質(深綠色)的自發螢光出現挑戰，因為其波長與GFP重疊。因此，申請人使用GFP的抗體將GFP+信號轉變為粉紅色或玫瑰色，其次使用具有紅色螢光探針的抗體。此導致幹細胞被識別為具有粉紅色核的小細胞(細胞核的藍色DAPI染色與抗體標記的玫瑰色GFP+標記之合併)。成熟為肝細胞的任何供體細胞辨識為薰衣草色，為來自綠色自發螢光(脂褐質)、藍色(DAPI)和玫瑰色(GFP) 的合併(圖4 )。

由轉基因豬獲得豬肝外膽系組織(膽囊、膽總管、肝管)。組織以滅菌的不鏽鋼槌敲打，以消除實質細胞，小心地保持肝內和肝外膽管的連接。然後以“細胞沖洗”緩衝液洗滌膽管，該緩衝液包含補充有抗生素、0.1%血清白蛋白，和1 nM硒(10^-9 M)的無菌、無血清基礎培養液。之後以交叉式手術刀機械解離，並將聚集體酵素性分散到RPMI-1640中的細胞懸浮液中，該RPMI-1640補充有0.1%牛血清白蛋白(BSA)、1 nM硒、300 U/ml 第IV型膠原蛋白酶、0.3 mg/ml去氧核糖核酸酶(DNAse)和抗生素。於32℃下進行酵素切割，頻繁攪拌30-60分鐘。大多數組織需要兩輪酵素切割，然後在4℃以1100 rpm離心。合併細胞沉澱物，並重新懸浮於細胞洗滌液中。細胞懸浮液於4℃，30 G離心5分鐘，以去除紅血球。將細胞沉澱物再次重懸於細胞洗滌液中，並通過40 mm尼龍細胞過濾器(Becton Dickenson Falcon＃352340)過濾，並以新鮮細胞洗滌液洗滌。測定細胞數，並使用Trypan Blue評估存活率。常規觀察到細胞存活率高於90-95%。

在先前的研究中，申請人已定義出間質細胞群的抗原分布，其提供肝和膽系幹細胞所需的關鍵旁分泌信號，對應成熟實質細胞所需的其他信號。與BTSCs配對的間質細胞為缺乏MHC抗原的亞群，具有低側向散射，並可辨識為血管母細胞(CD117+、CD133+、VEGF-受體+，以及CD31陰性)、內皮細胞前驅細胞(CD133+、VEGF-受體+，以及CD31+)，和星狀細胞前驅細胞(CD146+、ICAM1+、VCAM+、a-平滑肌肌動蛋白(ASMA)+，以及維生素A陰性)。此3個亞群統稱為早期譜系間質細胞(ELSMC)。相對地，成體肝細胞則與成熟的竇狀內皮細胞(CD31+++、第IV型膠原蛋白+、VEGF受體+、CD117陰性)相關，以及成體膽管細胞與成熟星狀細胞和基質細胞(ICAM-1+、ASMA+、維生素A++、第I型膠原蛋白+)相關。

將細胞懸浮液加入到Multiwell Flat Bottom Cell Culture Plates (Corning #353043)中的無血清Kubota培養液中，並於37℃培養約1小時，以促進成熟間質細胞的附著。成熟間質細胞在10-15分鐘內附著在培養皿上，即使培養液不含血清。將維持於懸浮液中的細胞轉移到另一個培養皿中，並再次培養至多一小時。這種情況的重複導致絕大部分成熟間質細胞消耗。在耗盡成熟的間質細胞後，將剩餘的漂浮細胞以每孔約2 X 10⁵ 個細胞接種在Corning超低附著培養皿(Corning #3471)中的無血清Kubota培養液中，並在CO₂ 培養箱中於37℃培養整夜。類器官包含膽系幹細胞(BTSCs)與整夜形成的ELMSCs(圖1 )。這些類器官培養物在Kubota培養液中存活數週，特別是如果培養液補充(0.1%)可溶形式的HA(Sigma)；如下所述，它們亦可冷凍保存。由每克新生豬膽系組織中，吾人可獲得約1.5X10⁷ 個細胞。吾人在6孔超低附著板的每孔中，使用約3-6X10⁵ 個細胞，並在無血清的Kubota培養液中培養。細胞平均產生6000至20,000個小的類器官(約50-100個細胞/類器官/孔)。對於移植物，吾人使用至少100,000個類器官(＞10⁷ 個細胞)。根據背襯尺寸，申請人能夠增加移植物中的類器官數量，最多可將10⁸ 個類器官(即~10⁹ 個細胞)或更多，埋入3 cm X 4.5 cm背襯上的約1 ml軟玻尿酸水凝膠中。

分離的幹細胞類器官於CS10中冷凍保存，CS10為含有抗凍因子、葡聚醣和DMSO的等滲冷凍保存緩衝液(Bioliife, Seattle, Washington; https://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.html)。細胞存活率藉由進一步補充0.1% HAs (Sigma #52747)而增進。使用CryoMed™ Controlled-Rate Freezers進行冷凍保存。解凍後的存活率大於90%，解凍後的細胞可附著、離體及體內倍增，並在體外和體內產生預期的成熟細胞。

分離該細胞並組裝移植物，其特徵示於圖 1 中，並詳細總結於圖 2 中。藉由使用背襯(表1 )形成移植物，在其上放置埋入軟玻尿酸水凝膠中的幹細胞類器官。這些可立即提前製備，並在培養皿中，於培養箱中保持過夜。在實驗期間，證實移植物在目標位置上是穩定的。類器官可立即低溫保存，但在軟水凝膠內的類器官則不行。這意味著必須在手術前將類器官埋入軟水凝膠中。手術

經由靜脈注射氯胺酮(ketamine)/甲苯噻嗪(2-3 mg/kg體重)，或肌肉內注射20 mg/kg氯胺酮加2 gm/kg甲苯噻嗪誘發麻醉，並經由封閉迴路氣體麻醉單元投予氧氣中的異氟烷維持麻醉。

將動物置於背側臥位，自劍突到恥骨夾住腹側腹部。用碘酒和酒精溶液交替擦洗皮膚消毒。進入手術室後，使用無菌技術重複皮膚的準備，並在施加無菌手術單之前以碘溶液局部覆蓋該區域。外科醫生使用適當的無菌技術。進行中央-腹部切口，通過皮膚，通過皮下組織和白線(linea alba )，從劍突開始並向尾部延伸8-12 cm。暴露出左肝切口，並將3×4.5 cm補釘移植物施加於肝臟腹側表面，該補釘移植物包含1X HA(~60Pa)，其埋有類器官並置於含有10X HA(~760Pa)之背襯上，並將補釘直接接觸肝囊表面上。使用4-6個簡單間斷縫合之4-0聚丙烯，將補釘移植物縫合到肝臟。之後以2毫升2X HA水凝膠(~106 Pa)處理移植物的暴露表面，該水凝膠的剛性位準足以允許其流動塗佈或塗覆在移植物的漿膜側上；它可使鄰近組織的沾黏最小化。放置外科移植物後，使用0-PDS經由簡單連續縫合線縫合白線(linea alba )。白線使用2 mg/kg 0.5%布比卡因(bupivacaine)IM堵住。皮下組織和皮膚分別使用連續2-0 PDS和3-0 Monocryl縫合線縫合。將組織黏合劑置於皮膚表面上。

轉基因豬的移植物與接受移植者為同種異體性，因此需要免疫抑制。使用的免疫抑制流程是由他人建立的。在手術前24小時開始，所有豬隻每天兩次接受口服劑型之免疫抑製藥物他克莫司(Tacrolimus) (0.5 mg/kg)和黴酚酸酯(Mycophenolate) (500 mg)。在整個實驗期間連續給予藥物。如果與其喜歡的食物混合，這些可以很容易地給予動物。

所有動物皆於指定時間點進行人道安樂死，以氯胺酮/甲苯噻嗪(Ketamine/Xylazine)鎮靜和異氟烷麻醉，之後靜脈內注射致死劑量的戊巴比妥鈉(pentobarbital)。確認死亡後，仔細解剖屍體，取出目標器官，放入冷卻的Kubota培養液中，運送到實驗室。除肝臟外，收集肺、心臟、腎臟和脾臟，並以10%中性福爾馬林固定。移植物之鑑定

固定48小時後，將組織樣品置於70%乙醇中的標記匣中，並在Leica ASP300S Tissue Processor中，以60度長循環處理約10小時。在完成整夜處理後，使用Leica EG1160 Embedding Station包埋樣品。用蠟填充模具，並將樣品放置在正確的方向，以便收集所需的部分。將盒子冷卻，直到蠟塊(block)和組織樣品可融合為一體由模具中取出。使用Leica RM2235切片機將該蠟塊切成5微米；將切片漂浮在水浴中並置於載玻片上。載玻片在染色前風乾過夜。使用Richard Allan Scientific Histology Products並按照製造商建議的流程，該流程編入Leica Autostainer XL中，對切片進行蘇木精(Haematoxylin)和伊紅(Eosin) (H&E; Reagents#7211與#7111)或Masson's Trichrome(Masson’s Trichrome Stain: Blue Collagen Kit# 87019)染色。

將組織包埋並於OCT中冷凍，並在-20℃下快速冷凍以進行冷凍切片。依照上述流程對冷凍切片進行IHC染色。就免疫螢光而言，將冷凍切片於室溫下解凍1小時，然後依據抗體規格於10%緩衝的甲醛、丙酮或甲醇中固定。固定後，將切片在1%磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中清洗3次，之後在室溫下以含2.5%馬血清的PBS進行阻斷1小時。加入於PBS中的10%山羊血清中稀釋的一級抗體，並4℃培養過夜。第二天早上，以PBS清洗切片3次，並與於PBS中的2.5%山羊血清中稀釋的二級抗體在室溫下培養2小時。使用Zeiss CLSM 710光譜共聚焦雷射掃描顯微鏡(Carl Zeiss Microscopy)拍攝圖像。抗體列於表 3 中。

對於圖 5 中的圖像，依據標準方案，將切片(3 μm)以蘇木精 - 伊紅和天狼星紅染色。就免疫組織化學而言，內源性過氧化酶活性係以於過氧化氫之甲醇溶液(2.5%)中靜置30分鐘而阻斷。如供應商所示，藉由於室溫下施加蛋白酶K(代碼S3020，Dako，Glostrup，Denmark)10分鐘來回收抗原。之後將切片於4℃下與一級抗體(pan-Cytokeratin，Dako，代碼：Z0622，稀釋度：1：100; Sox9，Millipore，代碼：AB5535，稀釋度：1：200)靜置過夜。以PBS沖洗樣本兩次，每次5分鐘，在室溫下以二級生物素化抗體(LSAB+ System-HRP，代碼K0690; Dako，Glostrup，Denmark)靜置20分鐘，之後與鏈黴抗生物素蛋白-HRP(LSAB+ System-HRP，代碼K0690，Dako，Glostrup，丹麥)靜置20分鐘。使用二氨基聯苯胺(Dako，Glostrup，丹麥)作為受質，並以蘇木精(PMID：29248458)對切片進行對比染色。對於免疫螢光，非特異性蛋白質結合係以5%正常山羊血清阻斷。樣本於4℃下與一級抗體一同靜置過夜(雞抗-GFP抗體，Abcam，代碼：ab13970，稀釋度= 1：200；兔抗-HNF4a抗體，Abcam，代碼：92378，稀釋度：1：50，兔抗-白蛋白抗體，ab2406，稀釋度= 1：500)。將標本清洗並與經同位素標記的同型特異性二級抗體(抗雞AlexaFluor-546抗體、抗小鼠Alexafluor-488抗體、抗兔Alexafluor-488抗體，Invitrogen，Life Technologies Ltd，Paisley，UK)一起靜置1小時，並以4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行對比染色，以使細胞核可視化(PMID：26610370)。對於所有免疫反應，尚包括陰性對照組(一級抗體以免疫前血清代替)。藉由Leica Microsystems DM 4500 B Light和螢光顯微鏡(Leica Microsystems，Weltzlar，Germany)，其配備有Jenoptik Prog Res C10 Plus Videocam(Jena，Germany)，以編碼方式檢查切片。亦藉由共聚焦顯微鏡(Leica TCS-SP2)分析免疫螢光染色。載玻片進一步使用圖像分析系統(IAS - Delta Sistemi, Roma- Italy)處理，並由兩位研究人員以盲目方式獨立評估。以數位掃描儀(Aperio Scanscope FL System, Aperio Technologies, Inc, Oxford, UK)掃描免疫螢光染色，並以ImageScope處理。

鑑於肝細胞(脂褐素)中的高自發螢光和Seri-Silk背襯的螢光，冷凍切片會產生問題。申請人藉由使用針對GFP的兔多株抗體(Novus Biologicals，NE600-308)製備石蠟切片並染色GFP，獲得更大的成功；兔抗GFP抗體與驢抗兔IgG H＆L二抗(Alexa Fluor 568; ab175470，Invitrogen)聯合使用，而驢抗山羊IgG Alexa Fluor 488抗體則用於排除肝臟自發性螢光之非特異性染色。藉由使用染料和包括Trypan Blue淬滅來減少自發性螢光。Trypan Blue使用於組織/細胞上之濃度為0.4%，於PBS溶液中。此顯著降低了背景值。

使用Trizol(Invitrogen)由類器官或移植物中提取總RNA。使用Primescript第一股cDNA合成試劑套組(Takara)合成的第一股cDNA，作為PCR倍增的模板。使用Faststart Universal Probe Master(Roche Diagnostics)和ABI PRISM 7900HT序列檢測系統(Applied Biosystems)進行mRNA位準的定量分析。使用Universal Probe Library Assay Design Center(Roche Applied Science)設計引子。引子序列列於表 4 。引子在50℃下退火2分鐘，在95℃下退火10分鐘，然後進行40個95℃(15秒)和60℃(1分鐘)的循環。通常使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表現作為對照組和標準組。

使用Qiagen RNeasy Kit從細胞中純化RNA。使用Agilent 2000生物分析儀進行RNA完整性(RIN)分析。使用Illumina TruSeq Stranded mRNA製備套組製備cDNA庫，並於Illumina HiSeq 2500平台上定序。每個泳道對兩個樣品進行定序，所有樣本(一個流動池)總共佔用8個泳道。使用FastQ完成品質控制分析。使用預設參數，以MapSplice2進行人類基因組(hg19)序列讀取拼圖。藉由RSEM分析進行轉錄物定量，並使用DESeq來標準化基因表現，並辨識出有差異表現的基因。MapSplice2也用於檢測候選融合轉錄物。融合識別(Fusion calls)係基於跨越候選融合連接的讀取深度和複雜性。使用Pearson相關分析比較基因表現分布，並在R中進行分層聚類。在DESeq組中提供的方差穩定轉化(Variance Stabilizing Transformation)之後進行分層聚類。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)軟體進行途徑富集分析(Pathway enrichment analysis)。差異基因表現分析法僅於至少一類中，具有最小平均標準化計數＞ 50的基因上進行。

以Student's雙尾t檢定計算樣品之間的統計學顯著差異，結果表示為平均值±標準偏差(SD)。P值小於0.05被認為具有統計學意義。結果

在先前關於注射移植的研究中，發現移植需要上皮細胞與其譜系階段適當的間質細胞夥伴共移植。對於肝和膽系幹細胞，這些間質細胞由血管母細胞(CD117+、CD133+、VEGFr+、CD31-陰性)及其直接後代、內皮細胞前驅細胞(CD133+、VEGFr+、CD31+、Van Willebrand因子+)，以及星狀細胞前驅細胞(CD146+、ICAM-1+、a-平滑肌肌動蛋白+(ASMAs)、維生素A-陰性)組成。申請人將這些統稱為早期譜系期間質細胞(ELSMCs)。申請人亦藉由其他方法部分成功地製備經分離之豬間質幹細胞(MSCs)，並由新生豬肝中分離出細胞。

在先前的研究中，申請人藉由使用多參數流式細胞儀來確定上皮細胞和間質細胞階段的匹配，以確定細胞懸浮液中，上皮細胞和間質細胞的譜系階段夥伴比例，之後在移植物質中使用這些比例，使用免疫選出的細胞。在這些研究中，申請人發現經由重複淘選程序，然後在低附著培養皿和無血清Kubota培養液中，培養剩餘細胞懸浮液6-8小時，來消耗成熟間質細胞的細胞懸浮液，更有效率。類器官自我組裝，每個聚集體含有約50-100個細胞。標記物分析指出BTSCs與ELSMCs的結合(圖1 )。如圖 1A 示意圖所總結，它們可立即使用或在先前確定的完全定義條件下冷凍保存，並依據移植物的需要解凍。使用免疫螢光(IF)、qRT-PCR和RNA-seq鑑定BTSCs/ELSMCs的類器官，並顯示其表現BTSCs(圖1 )和ELSMCs(數據未顯示)的經典特徵。類器官中的BTSCs不表現成熟的肝臟或胰臟基因，而是表現低位準的多潛能性基因(例如OCT4、SOX2)和內胚層幹細胞基因(例如EpCAM、SOX9、SOX17、PDX1、LGR5、CXCR4、MAFA、NGN3和NIS)。代表性qRT-PCR試驗確認移植前細胞之IF和IHC觀察(圖1D )。IHC試驗指出，更原始的細胞(例如表現多潛能性基因的細胞)會被分配到類器官的內部和周邊的後期成熟譜系階段(例如表現EpCAM或白蛋白的細胞)(圖1C )。

將補釘移植物的結果與先前建立方法的注射移植物結果進行比較，先前方法包括注射細胞並藉由使用聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)觸發玻尿酸在幾分鐘內凝膠化，而定位於該部位。注射移植物進入豬肝實質，導致基本上100%植入，但具有最小(如果有的話)遷移，並在數週中緩慢整合至宿主組織(數據未顯示)。該研究結果與之前觀察到的肝幹細胞注射移植物相似。注射移植物進入與肝管/門靜脈分支相鄰的腸附膜，直接到肝葉的尾側，在大導管中可行，但較小者會由於HA水凝膠的腫脹作用造成阻塞，而導致膽汁淤積(圖13 )。補釘移植的成功使我們捨棄注射移植策略的進一步努力。

用於幹細胞的移植物組成物涉及使用具有3個不同層的玻尿酸(HA)水凝膠的條件，其具有精確的HA比PEGDA濃度，以達到其剛性位準，經由流變測定評估(圖 2C )。將供體細胞包埋在軟HA層(~100 Pa)中，並置於肝/胰臟表面；軟水凝膠維持幹細胞特性，這些研究證明其為植入所必須。將該層置於硬HA層(10X；~700Pa)頂部，該HA層在背襯上提前製備，並作為遷移屏障。使用縫合線或手術膠將補釘附著於目標部位。2X HA水凝膠，足夠柔軟(剛性= ~200Pa)，允許在手術時塗抹或塗覆於移植物漿膜表面，並用於進一步減少附近組織的沾黏。

將補釘移植物置於肝臟表面，即格利森氏囊或胰腺囊的表面，並藉由縫合線或藉由手術膠附著於角落處(圖2F )。Seri-Silk的剛度導致移植物物被放置在具有最小曲率的位置，並遠離具有顯著機械力的位置(例如在隔膜附近)。若移植到胰腺上，移植物則被卡入十二指腸和胰腺之間。

嘗試之後放棄的唯一補釘移植物變數，是以手術切除囊。由於血清對供體細胞的不利影響，出血現象大大不利於未來在具肝功能衰竭相關的止血功能變化之宿主中，或甚至於正常宿主中的使用。由於不需改變器官囊，補釘移植物證實容易用於外科手術。

嘗試了許多背襯，重點放在臨床上用於腹部手術者(表 1 和表 2 )。除Seri-Silk之外，其他背襯都會產生問題，使其無法進一步考慮使用。問題包括脆弱性(例如Seprafilm、Retroglyde)；誘導壞死或纖維化，以及顯著程度的沾黏(例如Surgisis、Vetrix)；以及與絲狀海綿版本Seri-Silk或任何補充有羧甲基纖維素(“腹部果凍”)的背襯，會形成嚴重腹部沾黏。在所測試者中，SERI Surgical Silk(Allergan，Inc.Irvine，CA)提供機械支撐和最小沾黏的最佳組合，藉由在附著到目標位置後，將2X HA施加至SeriSilk的漿膜表面，而進一步增強效果。該產品是Bombyx蛾絲的純化絲素蛋白，由David Kaplan(Tuft大學，波士頓，麻薩諸塞州)開發。申請人發現它是硬的，這種特性對手術操作和放置在像肝臟這樣的扁平/剛性器官上是有用的。該剛性使其難以施加至具有顯著曲率或需要彈性的部位。儘管如此，它的硬度在供體細胞的成熟效應方面證明是中性的，此一發現使得這種背襯可用於補釘移植。在移植3週內，Seri-Silk被膠原蛋白包裹，顯示出輕微的異物反應。其他候選背襯(例如合成紡織品)目前正在進行評估。

手術後第一週重塑的證據係使用三色染色(Trichrome staining)(圖 3 、 7 )或番紅O(Safranin O)驗證，其具有可染色膠原蛋白和其他細胞外基質成分的染料。以三色染色的移植物(圖 3A-B )圖像，係與在相同位置以蘇木精/伊紅(hematoxylin/eosin)染色的圖像進行比較(圖 3C-D )。格利森氏囊和小葉的重建發生在3週內，同時有HA再吸收現象。包含重塑區域的條帶出乎意料地大(圖3-5 、7 )。

衍生自轉基因GFP+豬的供體細胞係經由IHC測定GFP的表現而容易地鑑定出。在胰腺中，供體細胞係藉由綠色螢光鑑定。然而，在肝臟中，肝細胞中脂褐質的自發螢光波峰位置，係與GFP波峰的波長處重疊。因此，我們在肝臟中鑑定出具有抗GFP抗體(兔抗GFP抗體; Novus，NB600-308)的供體細胞，並偶聯至與具有紅色螢光探針(Donkey anti-rabbit 555，Invitrogen)的二級抗體，導致供體細胞具有粉紅色核(紅色螢光探針加上藍色DAPI)。宿主細胞係以藍色核(DAPI染色)但無GFP表達(圖 4 )而辨識出。

成熟肝細胞的肝小葉為森林綠，來自自發螢光(脂褐質)(圖 4B )。由於來自GFP的紅色螢光探針，來自DAPI的藍色和來自脂褐質的自發螢光深綠色的合併，已成熟為肝細胞聚集體的供體GFP+細胞為淡紫色並具粉紅色核(圖 4C )。肝細胞，無論是衍生自宿主還是供體，皆由宿主間質細胞(內皮細胞，星狀細胞)聚集環繞，具有明亮的黃色/綠色自發螢光，吾人假設是由於成熟星狀細胞中的維生素A所引起(圖 4C )；並未顯示內皮細胞和星狀細胞的IHC數據。

在一週內，BTSCs/ELSMCs類器官的補釘移植物導致器官囊和相鄰小葉的重塑，之後宿主細胞和供體細胞合併(圖 3-5 、 7 )。供體細胞的手指狀延伸物延伸至宿主組織的肝小葉中；類似地，宿主細胞延伸到移植物的HA中(圖 4 )。在胰臟中，移植物被卡入胰腺和十二指腸之間，在手術後一週，供體細胞的植入既發生在胰臟中，也發生在十二指腸黏膜下層的布魯納氏腺中(圖 6 )。肝臟(或胰臟)大區域內的細胞整合在2週內完成，此時HA層已大部分被吸收；供體細胞的譜系侷限於成體肝實質組織命運，膽管細胞和肝細胞皆是(圖 5 )，或胰臟命運(圖 6 )。

到3週時，HA層完全被再吸收，僅留下背襯。這與器官囊的再現，以及囊附近(圖 3 、 5 、 6 )或胰臟囊與胰臟組織(圖 6 )結構附近組織的組織學結構相關。在胰臟腺中，成熟細胞經功能性標記物辨識出，其包括用於胰島細胞(β細胞)的胰島素，以及用於腺泡細胞的澱粉酶。

肝臟和胰臟的一週內移植效率接近100%，因為發現所有辨識出的供體細胞都存活，且在肝臟或胰臟內；而非在器官囊上方移植物的殘餘物中；且在其他器官(例如肺)中可忽略或沒有異位細胞分佈的證據。

在BTSC/ELSMC移植物中的供體細胞，通過肝臟和通過胰臟的遷移速度證實是顯著的，導致供體細胞可在一週內存在於器官的大部分區域(肝臟或胰腺)，且在2-3週內細胞均勻分散整個組織(肝臟/胰腺)(圖 3-6 )。

多種MMPs的表現增加，係與格利森氏囊(或胰腺囊)和鄰近肝小葉(或胰腺組織)的溶解和重塑相關，並與顯著植入相關，MMP為一種已知可溶解細胞外基質成分並與細胞遷移相關的酵素。在圖 7 中，摘錄來自RNA-seq的研究數據，以及由幹/前驅細胞與成體細胞表現的MMPs之IHC試驗。BTSCs表現高位準的多種MMPs，包括分泌形式(例如MMP2、MMP7)以及膜結合形式(例如MMP14和MMP15)。ELSMCs，一種內皮細胞和星狀細胞的前驅細胞，亦對多種MMPs有貢獻。

來自RNA-seq數據的發現，係經由IHC試驗確認，辨識出經MMP基因編碼的蛋白質(圖 7 )。IHC試驗證實分泌形式MMP(例如MMP1、MMP2、MMP7、MMP9)的存在，尤其是在重塑區域。MMP1的蛋白質表現見於BTSCs / ELSMCs類器官以及移植物的重塑區域中；然而，RNA-seq發現的現有數據庫不包括MMP1，因為缺乏用於分析豬MMP1的參考物種。因此，其表現的識別係以IHC試驗為基礎。

引起供體細胞分化的變數導致MMPs表現靜默，特別是分泌形式，同時喪失植入和遷移的可能性(數據未顯示)。這些因素包括已知影響供體細胞分化的血清、各種可溶性調節信號(生長因子、細胞因子、激素)、細胞外基質成分，無論是在水凝膠中或在背襯中(特別是含有第I型膠原蛋白的背襯)，以及HA水凝膠剛性(即Pa位準)。若ELSMCs傾向分化為基質，則移植物會變得纖維化；若分化為內皮細胞，則移植物會保留活細胞和組織，但仍保持在器官囊的表面(數據未顯示)。

BTSCs/ELSMCs的類器官被證實是用於移植細胞最成功的安排。在過去，我們經由使用其獨特的表面抗原，通過流式細胞術從細胞懸浮液中免疫性篩選出共同移植上皮 - 間質夥伴，然後根據在新鮮分離組織中的細胞懸浮液中發現的比例混合它們。於此吾人發現，藉由淘選成熟間質細胞，使其自我選擇成類器官，證明可更有效率和有效地建立譜系階段適當的上皮 - 間質夥伴與移植物的相關旁泌信號，以及在完全定義(無血清)條件下產生類器官，使其容易地和安全地冷藏保存。

移植物的主要設計係為將細胞與適當的生物材料混合，該生物材料可變為不可溶並使細胞定位於目標位置。就移植物而言，理想的生物材料證實為非硫酸化或最小硫酸化的糖胺聚醣(GAGs)，例如在所有幹細胞壁凹壁中發現的玻尿酸(HAs)，其中HAs的受體為典型幹細胞特徵。維持細胞為幹/前驅細胞可使分泌型和膜結合型MMPs的表現最佳化，而可有效植入。

植入過程的證據在移植物和宿主組織界面處發生的重塑區域內特別顯著。為了驗證重塑的結果，使用三色(Trichrome)染色和番紅O(Safranin O)，其具有染色細胞外基質成分的染料，並同時分析以蘇木精/曙紅(hematoxylin/eosin)染色的相鄰切片 (圖 3 、 7 )。確認手術後一週內器官囊和鄰近組織有重塑現象。在手術後3週，這些試驗證實，在清除HA後，器官囊和正常組織的組織學重建。重塑區域非常大(圖 3 、 7 )，特別是在手術後一週，並顯示出涉及多種形式MMP(圖 7 )。

雖然有許多HAs來源與類型，其中最有用的是由Glenn Prestwich(University of Utah, Salt Lake City, UT)建立的經硫醇修飾者，並可以PEGDA觸發形成具有精確生化和機械特性的水凝膠。HAs的這些特性賦予了完美的彈性，允許血液、淋巴或間質液中的所有可溶性信號進入移植物，並使供體細胞的成熟最小化，直到植入和遷移發生。藉由HA和PEGDA濃度的簡單變化來改變流變學因素的能力，提供可引導細胞遷移方向，以及使沾黏最小化的額外優勢。軟HA水凝膠，即模擬幹細胞凹壁特性者，允許表現幹細胞/前驅細胞相關的MMPs譜。因此，多年來在骨骼組織功能中研究的HAs機械性質，在管理移植策略中也是相當重要的²³ 。

含有幹/前驅細胞的補釘移植物導致移植物在幾天內“融入”組織中的驚人現象，隨後是供體和宿主細胞的整合，以及在二周內細胞分佈於大部分區域中。此後，供體細胞的成熟和器官囊的恢復，與HAs的組織清除同時發生。

植入和整合過程與多種MMPs的表現相關，該MMPs為一種鈣依賴性的含鋅內肽酶，其可降解細胞外基質成分。使用RNA-seq研究，吾人發現了幹/前驅細胞相關的MMPs模式，其由高位準的分泌形式(例如MMP2、MMP7)以及膜結合形式(例如MMP14、MMP15)組成。IHC試驗顯示，分泌型MMPs(例如MMP1、MMP2、MMP7)之蛋白質位準，在重塑區域中豐富地表現(圖7 )。導致供體細胞分化而降低MMPs，特別是分泌形式，減少的條件(可溶性生長因子、細胞因子、血清、基質成分、機械力)，可同時消除植入過程。

移植物的生物材料，尤其是HAs，已於體外和體內顯示其可維持細胞的幹細胞特性。由於移植物質缺乏可觸發決定命運的已知信號，供體細胞成熟為不同成體命運，取決於移植物是否放置在肝臟或胰腺上，暗示宿主組織的局部微環境為成熟過程的相關因子合理來源。

可植入的細胞數量相當可觀(＞10⁸ )，並由移植物尺寸、細胞的數量以及分泌型和膜結合型MMPs的所有組成決定。這些發現與經由血管傳送或經由注射移植可行的有限數量細胞(例如10⁵ -10⁶ )形成對比。

補釘移植是一種安全的策略，藉由該策略將大量細胞移植到實體器官中，包括內部器官，並證實可用於患者治療，特別是若植入可以在疾病條件下充分發生。儘管如此，亦可能在組織纖維化或受肝硬化影響的情況下，發生異常植入。因此，於此提供用於確定此方法各觀點中補釘移植物功效的範例。範例 2: 肝疾病之治療

本範例描述使用補釘移植物治療患有肝臟疾病或病症之個體的示範性方法。供體細胞製備為膽系幹細胞(BTSCs)、肝臟和胰臟的前驅細胞，與早期譜系間質細胞(ELSMCs)聚集之類器官，該早期譜系細胞由血管母細胞及其早期譜系後代、內皮細胞前驅細胞和星狀細胞前驅細胞組成，如此所述。將BTSC/ELSMCs類器官包埋在軟玻尿酸水凝膠(＜ 200 Pa)中，該軟玻尿酸水凝膠置於背襯上，其固定在受試者肝臟的目標位置上。

在施加補釘移植物後，監測到個體的肝功能增進。通常用於檢查肝功能的測試包括但不限於，丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸胺基轉移酶(AST)、鹼性磷酸酶(ALP)、白蛋白和膽紅素測試。ALT和AST測試係測量肝臟由於損傷或疾病而釋放的酵素。白蛋白和膽紅素測試係測量肝臟產生白蛋白(一種蛋白質)的正常程度，以及它如何處理血液中的膽紅素(一種血液中的廢棄物)。預計在約2週至約36週後，將檢測到肝功能的增進。該增進係藉由檢測一或多種肝功能測試，相對於移植物施加前之值，及/或肝臟疾病或病症的一或多種症狀之改善或減輕而確定。範例 3 ：胰臟疾病之治療

本範例描述使用補釘移植物治療患有胰臟疾病或病症個體之示範性方法。供體細胞製備為膽系幹細胞(BTSCs)與早期譜系間充質細胞(ELSMCs)聚集的類器官，該早期譜系間質細胞由血管母細胞及其早期譜系後代、內皮細胞前驅細胞和如此所述的星狀細胞前驅細胞組成。將BTSC/ELSMCs類器官埋入置於背襯上的軟玻尿酸水凝膠(＜ 200 Pa)中，該背襯固定於該個體胰臟的目標位置上。

在施加補釘移植物後，監測到個體的胰功能增進。通常用於檢查胰功能的測試包括但不限於，胰酶澱粉酶和脂肪酶位準的血液測試、投予促胰液素或膽囊收縮素後的直接胰腺功能測試、糞便彈性蛋白酶測試、對比染料的CT掃描、腹部超音波掃描、內視鏡逆行胰膽管造影術(ERCP)、內視鏡超音波和磁共振胰膽管造影術。預計在約2週至約36週後，將檢測到胰功能的增進。該增進係藉由檢測一或多種胰功能測試，相對於移植物施加前之值，及/或胰臟疾病或病症的一或多種症狀之改善或減輕而確定。範例 4 ：腎臟疾病之治療

本範例描述使用補釘移植物治療患有腎臟疾病或病症個體之示範性方法。供體細胞製備為膽系幹細胞(BTSCs)與早期譜系間充質細胞(ELSMCs)聚集的類器官，該早期譜系間質細胞由血管母細胞及其早期譜系後代、內皮細胞前驅細胞和如此所述的星狀細胞前驅細胞組成。將BTSC/ELSMCs類器官埋入置於背襯上的軟玻尿酸水凝膠(＜ 200 Pa)中，該背襯附於該個體腎臟的目標位置上。

在施加補釘移植物後，監測個體的腎功能增進情況。通常用於檢查腎功能的測試包括但不限於本領域已知的臨床相關腎功能終點。預計在約2週至約36週後，將檢測到腎功能的增進。該增進係藉由檢測一或多種腎功能測試，相對於移植物施加前之值，及/或腎臟疾病或病症的一或多種症狀之改善或減輕而確定。範例5 ：腸胃疾病之治療

本範例描述使用補釘移植物治療患有腸胃疾病或病症個體之示範性方法。供體細胞製備為膽系幹細胞(BTSCs)與早期譜系間充質細胞(ELSMCs)聚集的類器官，該早期譜系間質細胞由血管母細胞及其早期譜系後代、內皮細胞前驅細胞和如此所述的星狀細胞前驅細胞組成。將BTSC/ELSMCs類器官埋入置於背襯上的軟玻尿酸水凝膠(＜ 200 Pa)中，該背襯固定於該個體之腸的目標位置上。

在施加補釘移植物後，監測個體的腸功能增進情況。通常用於檢查腸功能的測試包括但不限於本領域已知的臨床相關腸功能終點。預計在約2週至約36週後，將檢測到腸功能的增進。該增進係藉由檢測一或多種腸功能測試，相對於移植物施加前之值，及/或腸疾病或病症的一或多種症狀之改善或減輕而確定。

圖1A-1D 提供用於補釘移植物之豬供體細胞的資訊。圖 1A 為準備類器官、組裝補釘移植物並進行手術所需過程和預估時間的示意圖。在圖 1B 中，由基因轉殖豬的膽系組織中，分離出用於幹細胞補釘移植物之供體細胞；該細胞係於無血清Kubota培養液與低附著培養皿中製備為類器官。膽系幹細胞(BTSCs)及早期譜系間質細胞(ELSMCs)夥伴(partner)、血管新生細胞和內皮細胞與星狀細胞前驅物的類器官。在相位差顯微照片中，它們顯示出表現有轉基因綠色螢光蛋白(GFP)。由於轉基因同時存在於上皮細胞和間質細胞中，因此所有堆積細胞都是綠色的。轉基因與組蛋白(H-2B)基因座偶聯幹細胞的組織學研究係以石蠟包埋、切片並用蘇木精/伊紅染色進行。(d) BTSC和ELSMC的類器官放大圖像。圖1C 顯示免疫組織化學(IHC)圖，顯示幹細胞、肝臟和胰臟標記物之表現，指出這些細胞為肝臟和胰臟的前驅細胞。IHC試驗指出具有中間階段幹細胞標記物如EpCAM的外層和內部細胞，會表現非常原始的基因如多潛能性基因與內胚層轉錄因子 (如SOX17、SOX9、PDX1)。圖 1D 為 qRT-PCR試驗的代表圖，評估類器官中各種基因之表現，並指出該細胞為幹細胞或早期前驅細胞。對照組是來自小豬肝臟的成熟肝細胞。

圖2A-2F 提供補釘移植物主要成分之資訊。圖 2A 為固定在豬肝臟上的補釘移植物示意圖，右圖為移植物的組成。早期譜系階段細胞，包括上皮細胞和間充質細胞二者，為製造基質金屬-蛋白酶(MMPs)的來源，MMPs為植入的主要調節因子。置放供體細胞的移植生物材料之基質成分為柔軟的(~100 Pa)、無(或具有最小量的)硫酸化者，例如玻尿酸水凝膠。移植物的結構由生物材料層和附著到目標部位的細胞組成。培養液成分不含對供體細胞分化有影響的血清、生長因子和細胞因子，且應為針對早期譜系階段細胞如幹/前驅細胞的存活和擴增而定製者。該背襯具有可用於外科手術的足夠拉伸強度，但不對供體細胞分化產生作用(例如應避免使用第I型膠原蛋白)。該背襯以更硬的10X水凝膠(~ 700 Pa)浸漬或塗覆而作為屏障，以定位供體細胞朝向目標組織遷移，並使沾黏最小化。在附著到目標部位之後，加入2X HA水凝膠，此為一種具有足夠流動性以塗覆或塗在漿膜表面上的水凝膠，並用於進一步使沾黏最小化。圖 2B 描述了固定於宿主肝臟或胰臟的移植物。圖 2C 為移植物示意圖，顯示構成移植組合物的各層。圖 2D 描繪了根據經驗評估特定水凝膠層的流變學或黏彈性性質(剪切力和壓縮機械力)的試驗結果。圖 2E 提供了3層水凝膠的黏彈性配方。圖 2F 為縫合在豬肝表面的補釘移植物的特寫圖像。

圖3A-3D 顯示肝臟補釘移植物的免疫組織化學(IHC)與組織學結果。圖 3A 顯示一週後補釘移植物的三色染色結果。三色染色辨識膠原蛋白(藍色)、細胞質(紅色)和細胞核(黑色)，並用於辨識格利森氏囊(Glisson’s Capsule)(通常與肝小葉表面相鄰)和沾黏(在移植物的漿膜表面)。在漿膜表面各層中存在高位準的藍色染色，且涉及移植物的沾黏。此外，移植物在背襯和宿主之間的界面處與宿主組織分開；已發現此現象經常是由於在此界面製造的大量MMPs所致。重塑區域提供了肝臟典型小葉結構損失的證據；它們產生一區域，其中供體細胞遷移到組織中，同時改變該宿主組織的結構。在低放大圖像(a)中，置入肝臟的移植物之三色染色驗證了格利森氏囊的廣泛重塑正在發生，並且通常導致移植物與宿主肝臟之間的分離。在更高放大倍數的圖像(b)中，重塑區域非常寬，並且由靠近肝臟小葉結構完全缺失的移植物區域(c)，與(d)在重塑過程中正在進行分解的其餘肝小葉內的區域組成。圖 3B 顯示了補釘移植物在三週時的三色染色結果。移植物中的玻尿酸已被吸收，只剩下背襯(a)。隨著HA的再吸收，格利森氏囊再次出現(b)，且移植物附近的肝小葉再次穩定為其典型的組織學模式，例如肝小葉和腺泡。(b)中的箭頭表示格利森氏囊重建中膠原蛋白的再現。圖 3C 和圖 3D 顯示移植物在移植後一週(C)和移植後兩週(D)的切片之蘇木精/伊紅染色結果。上圖為40X放大。圖中(a,b,c)處為放大100倍的放大圖；每一圖下方矩形圖像放大為200倍。示出移植物的3個位置：(a)背襯內與結合移植物生物材料的位置；(b)移植物與宿主組織之間的界面處位置；和(c)肝小葉內位置。蘇木精/伊紅染色產生的圖像有助於了解植入和遷移過程，其結合發炎過程的特徵。

圖4A-4C 顯示了在一週內，植入、遷移和快速成熟至成體的命運。圖 4A 為一週後豬肝表面補釘移植物的低倍圖像。虛線表示移植物和宿主肝臟的界面。經由使用GFP抗體標記，之後耦合至Novo Red(一種紅色螢光探針)的供體GFP+細胞(具有粉紅色核；白色箭頭指出具有大量供體GFP+幹細胞的區域)而可視化。以4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)將細胞核染成藍色，而能辨識出僅具有藍色核的宿主細胞和具有粉紅色核的供體細胞(合併DAPI和Novo Red圖)。宿主組織(a)延伸到移植物的玻尿酸中(HA，黑色背景)中；背襯組織包含偶見的類器官(插圖)，但大多數供體細胞分散成單一細胞；在整個宿主組織中可見大量分散的供體GFP+幹細胞(b)。並無證據指出此區域有構成重塑區域的格利森氏囊。圖 4B 顯示供體細胞的植入和遷移相當快速；在一週內，所有的供體細胞都在宿主肝臟內；在移植部位附近存在供體細胞，並且在肝葉的相對側也存在供體細胞(估計距移植物距離至少1.5 cm)。正在進行的研究分析更遠距離(即其他肝葉)的小豬肝臟區域，以更精確地定義供體細胞在限定時間段內可以遷移多遠。圖上顯示宿主成熟肝細胞小葉(脂質體自體螢光的森林綠色)附近的供體細胞(粉紅色核)，位於移植處肝葉的遠端。圖 4C 顯示供體細胞成熟至成體的命運，與HA被吸收同時發生。包含供體GFP+細胞(具有粉紅色核的單細胞)的宿主肝細胞附近的區域(a)擴大，顏色呈森林綠色(脂褐質的自體螢光)，且可與成熟供體衍生的(b)薰衣草色(即粉紅色-GFP、藍色-DAPI和綠色-脂褐質的合併)的肝細胞快速分辨出，亦即，其譜系限制為供體GFP+幹細胞。對於其他IHC檢測而言(數據未顯示)，明亮的嫩綠色細胞介於宿主和供體肝細胞板之間，證實為內皮細胞與星狀細胞。

圖5A-5C 比較移植後1週和2週，肝補釘移植物中細胞的植入和成熟情況。圖5A 是補釘移植後1週的豬肝檢查。使用天狼星紅(Sirius red)染色，一種偶氮染料膠原蛋白，並進行免疫組織化學檢測泛細胞角蛋白(pCK)和Sox9；並在一系列3-mm切片上進行免疫螢光(IF)染色。在補釘移植位置，移植的供體細胞與肝小葉合併。在上圖中(原始放大倍數= 5X)，補釘移植物由間質和上皮pCK⁺ 細胞(箭頭處)組成。在中間圖中，提供更高的放大率(20倍)。上皮細胞顯示典型的表現膽管細胞角蛋白(pCK)和內胚層幹細胞標記Sox9的膽系幹細胞(BTSCs)的免疫表型。補釘移植物內的BTSC排列成細胞串，重新組裝成膽小管(箭頭)，並與相鄰肝小葉的肝細胞板(箭頭)直接連續。小葉中的宿主肝細胞是pCK和Sox9陰性。在下圖(原始放大倍數= 20X)，GFP的免疫螢光允許識別出單一移植細胞及其後代。與補體移植物相鄰小葉中的肝細胞呈GFP陽性，表明它們是衍生自與宿主肝實質(parenchyma)重合的供體細胞。在補釘移植物和肝小葉之間的界面處，pCK⁺ /GFP⁺ 小管(即供體衍生之膽管細胞)與小葉內(箭頭)的GFP⁺ /pCK^- 細胞(供體來源的肝細胞)直接連續，說明移植細胞的成熟化朝向肝細胞的命運。圖 5B 是補釘移植後2週豬肝的檢查。 IF染色顯示GFP⁺ 細胞存在於遠離移植部位的小葉內。它們均勻地分散，因此處於宿主細胞(具有DAPI藍色核的細胞)和供體細胞(具有DAPI的藍色和GFP標記的紅色之合併粉紅/紫色核)的混合物中。它們共同表現成熟肝細胞標記物，例如肝細胞核因子(HNF)4α(綠色和粉紅/紫色核的混合物)和白蛋白(綠色細胞質和粉紅/紫色核)。單獨或合併通道包含於內。細胞核以藍色顯示(DAPI)。原始放大倍數：40倍。圖 5C 為補釘移植後一週對豬肝臟的評估，證明了補釘移植物與宿主組織之間界面處發生的重構大區域。在低放大圖像和放大圖像中的部分1為蘇木精/伊紅(輕微染色)；部分2被載體-SG染色，產生藍/灰色；部分3為以蘇木精/伊紅背景染色之a-胎蛋白。5C內的特定位置被編號並與指示小葉內發生變化的放大相關聯。由於大量MMPs與供體細胞一起湧入該區域，宿主肝小葉和腺泡細胞正在分解。在小葉的邊界區域觀察到供體細胞，該處亦顯示出肝特異性標記，如HNF4-a和a-胎蛋白，這意味著細胞正在成熟化為肝命運。這些性狀並未被BTSC表現，因此這些跡象表明供體細胞正在成熟化為肝命運。

圖6A-6D 提供有關附著於胰臟的幹細胞類器官之補釘移植物資訊。圖 6A 是GFP+供體細胞的低放大率(全景掃描)圖像，其已移植到大部分胰臟中和十二指腸的黏膜下層(包含布魯納氏腺(Brunner’s Glands)的區域)中。豬胰臟、肝臟和十二指腸在補釘移植部位的免疫螢光染色。 GFP(綠色)、胰島素(紅色)、DAPI(藍色)。供體衍生的GFP+細胞出現在補體移植物定位處附近，且呈現出整合入胰臟實質中。觀察到SERI手術支架的絲網插入胰臟、肝臟和十二指腸之間。圖 6B 顯示供體細胞成熟為功能性胰島。在更高的放大倍數下，觀察到供體衍生的GFP+/胰島素+之β細胞(黃色 - 來自GFP和來自胰島素染色的紅色的合併)與胰臟實質中的宿主GFP-/胰島素+(紅色)之b細胞混合。圍繞胰島細胞的是大量GFP+細胞，其顯示與胰臟外分泌細胞，包括腺泡細胞和導管細胞，一致的形態。支持這種解釋的是C和D中的發現，實際上，這些細胞產生澱粉酶，一種經典的腺泡標記物。圖 6C 和圖 6D 顯示衍生自供體幹細胞的功能性腺泡細胞的證據。免疫螢光染色為來自補釘移植物處之同一組織塊的連續切片，且集中在移植GFP+供體細胞區域。澱粉酶(綠色)、胰島素(紅色)、升糖素(白色 - 在C的全景掃描中不可見，但在D中以較高放大倍數可見)、DAPI(藍色)。澱粉酶+腺泡細胞佔胰腺外分泌組織的絕大部分。藉由比較在低和高放大倍數下連續切片中呈現的染色，可推論出胰腺中大多數供體衍生的GFP+細胞已獲得澱粉酶+腺泡命運。

圖7A-7H 提供基質-金屬蛋白酶(MMPs)的鑑定。 MMPs由溶解細胞外基質成分的鈣依賴性含鋅酶之大基因家族組成。在豬中已知有至少24種異型體，其中一子家族為分泌型因子(例如MMP1、MMP2、MMP7、MMP9)，而另一子家族為膜結合型(例如MMP14、MMP15)。 MMP1經由IHC辨識出，特別是在重塑區域，而非經由RNA-seq鑑定，因為尚未有用於RNA seq分析的註釋形式豬MMP1。圖 7A 、圖7B 、圖7C 和圖7D 顯示以幹細胞/前驅細胞和成熟細胞表現之分泌型和細胞膜結合類型的異型體。表現位準定量指出，在幹細胞/前驅細胞和成熟細胞中，細胞膜結合形式之表現是相似的(注意圖 7D 中的比較)。相較之下，分泌形式在幹細胞/前驅細胞中以非常高的位準表現，在成熟細胞類型中則以低或可忽略的位準表現。進行分析的成體細胞細胞群係分離自小豬的肝和膽系組織懸浮液，由CD45+細胞(造血細胞)、CD146+細胞(星狀細胞)、CD31+細胞(內皮細胞)、EpCAM+ /CD45-細胞(成體二倍體肝細胞和膽管細胞)。這些EpCAM+/CD45-細胞是在小豬肝臟中發現的成熟實質細胞。依據範例之流程由膽系中分離出BTSC。圖 7E 顯示在BTSC/ELSMC重塑區域中，代表性MMP之表現。與BTSCs/ELSMC補釘移植物相鄰的部分係以三色法(Trichrome)染色，指示出重塑的區域(括號)。該區域出現紅色和藍色的線性條紋，此為被MMPs“海洋”溶解的細胞和基質成分。條紋終止於小葉的邊緣，小葉仍然大部分是完整的，但由於入侵細胞衍生之MMPs作用，開始在邊界處出現“磨損”。圖 7F 顯示MMP1(Novo-紅+)之IHC試驗代表性圖像。甲基綠為背景染色。肝臟的小葉/腺泡結構已溶解至細胞的起伏漩渦中，並經由MMPs分泌型異型體MMP1的強烈表現而顯著。圖 7G 顯示MMP2(Novo-紅+)的染色切片。蘇木為背景染色。肝臟的小葉/腺泡結構已經消失，並被MMP2(鏽褐色)強烈染色的細胞混合所取代。圖 7H 顯示肝小葉內正在進行重塑過程。肝小葉轉變為入侵細胞穿插的細胞條帶；MMP2+表現量(鏽色)非常高，並且導致小葉/腺泡結構的喪失。隨著玻尿酸的清除(2-3週)，小葉結構再次出現。

圖8 為肝臟和胰臟植入和整合現象的示意圖。

圖9A-9E 提供關於與成熟間質細胞(MMCs)，例如內皮細胞或星狀細胞，合作的成熟(成體)肝細胞之補釘移植物資訊。這些補釘移植物無法植入。若肝細胞與早期譜系期間質細胞(ELSMCs)合作則可植入，於此為豬間質幹細胞(MSCs)。若出現ELSMC，則植入發生，但限制在移植物附近區域。圖 9A 顯示正常豬肝的三色染色。低倍率圖像(a)的指標尺為200 µm，高倍率圖像(b)的指標尺為50 µm。注意格利森氏囊中的膠原蛋白和肝臟腺泡之間的界限。圖 9B 顯示與成熟間質細胞(MMCs)、內皮細胞和星狀細胞結合的正常成體肝細胞之補釘移植物的三色染色，它們並未植入。在低放大圖像(a)中注意到格利森氏囊完好無損，細胞仍保持在囊上。 (b)在較高的放大倍數下，有證據指出在移植物旁小葉中出現一些細胞(肝細胞內斑駁紅色的)重塑(可塑性現象)。這種可塑性假設是由於已知存在於幹細胞和成體細胞上之膜結合型MMP。圖 9C 顯示與成熟間充質細胞(MMCs)合作的正常成體肝細胞補釘移植物之IHC試驗。切片係以RBMY-1抗體和蘇木精作為複染劑染色。格利森氏囊完好無損，小葉之間的邊界區亦如此。在更高的放大倍數(b)下，顯然沒有發生植入。(d)陰性對照組(無一級抗體之染色)指示非特異性染色。圖 9D 顯示與ELSMCs合作的正常成體肝細胞之補釘移植物的三色染色，此為豬間質幹細胞(MSCs)，其為MMPs細胞來源。移植物在移植物和宿主組織間的界面處分開。括號表示重塑的區域。請注意，肝小葉失去了通常構成它們之間邊界區的基質，並在邊緣出現磨損。在較高的放大率(a)中可以看到整個圖像都是供體細胞(比較淺紅色處與小葉中央的深紅色)；在(b)中是某一區域的放大圖，顯示出在補釘下方(與方格左側的區域相較)和(c)中格利森氏囊明顯更薄。在與移植物(c)相鄰的細胞中，明顯進行了廣泛的重塑。圖 9E 顯示一週後與ELSMCs(豬MSCs)合作的肝細胞補釘移植物。(a)部分以抗RBMY-1(棕色)抗體染色，並以甲基綠作為對比染色。供體細胞植入(鏽紅色區域)並在移植物附近的腺泡中成熟為成體實質細胞。(b)部分顯示靠近薄化格利森氏囊殘留物的圖像放大圖，顯示供體細胞(深棕色核)與宿主細胞均勻分散(核為甲基綠色)。(c)部分為(b)的陰性對照組。(d)部分以抗GFP抗體(與Novus紅相結合，產生鏽褐色)染色，並以甲基綠作為對比染色。大多數細胞已植入宿主肝臟腺泡內，並形成暗紅色供體(成熟)肝細胞帶。格利森氏囊仍然存在，但厚度減少。在實驗的三週時間範圍內，並未觀察到太多移植物遷移至附近肝臟區域上。

圖10 為比較幹細胞與成體細胞植入之示意圖。

圖11 顯示植入過程涉及細胞在宿主組織內遷移可觀距離的證據。於此顯示在移植一週後的BTSCs/ELSMCs類器官移植物。將肝臟分成8個不同區域的示意圖，用於指示評估有供體細胞存在的區域。切片製備自區域1-8，之後染色以辨識出供體細胞。在表中總結移植物與每個區域之間的距離，以及發現的GFP+細胞比例。表格左側的圖像為每個區域代表性切片的掃描圖像。暗褐色染色在靠近移植物的6區最強，並且隨著移植物的距離增加而變淡，最淡的區域為1區。

圖12A-12E 提供供體細胞在整個宿主肝臟中遷移的證據。GFP+細胞以Novo-紅(鏽棕色)染色；宿主細胞以甲基綠染色。圖 12A 為移植物與宿主肝臟界面的低倍圖像。移植物與宿主肝臟分離是經常觀察到的(請注意這也在圖3中看到)，並顯示出此與特別高位準的分泌型MMP相關。以下提供區域(a)和(b)的放大圖。注意低放大率圖像中的區域和(b)中的放大區域，其中染色為斑點，並具有顯示出洗出外觀的區域，並由組織中的玻尿酸位準證明。圖 12B 描繪細胞遷移之中間區域。供體細胞遍布整個組織，膽管和腺泡的薄壁組織二者皆是。圖 12C 顯示細胞遷移的距離區域。請注意，只有膽管被染色。圖 12D 提供膽管中供體細胞的放大圖。圖 12E 和圖 12F 提供實質內的放大圖，以顯示供體細胞在核中具有GFP標記。

圖13 顯示具有某些類型背襯(亦參見表1和2)的補釘移植物所獲得的不利條件。這些包括壞死、沾黏和發生膽汁淤積的部位，當移植物靠近一些導管時發生腫脹而導致導管堵塞。

圖14A-B 顯示上皮細胞(圖14A )和間質細胞(圖14B )的兩個譜系階段的圖表，和相對應的生物標記物分布。

圖15 顯示移植到腎臟上的H2B-GFP+ BTSCs/ELSMCs補釘物之類器官。移植後1週進行評估。圖A顯示移植腎之三色染色。將腎製備為橫切面，以暴露植入物的較深層，呈“V”形。具明亮藍色染色的下半部分“V”為腎臟的移植側；圖中的上部“V”為移植層的更深層。圖B顯示移植腎同一切片的H＆E染色。圖C為補釘移植腎的較高放大倍數。移植物下方的腎臟囊呈鬆散狀(由於被MMPs溶解)，類似於肝臟的情況。圖D顯示在補釘下一層已植入腎中的GFP+細胞(深紅色)之IHC染色。圖E顯示腎臟深層的GFP+細胞植入(深紅色)。屍檢報告指出，動物之移植腎或其他置有補釘移植物之部位沒有發現壞死。表格簡要說明

表1 提供補釘移植物之手術或其他方法摘要。

表2 提供示範性補釘移植物背襯測試之比較。

表3 提供範例中用於IHC與IF之抗體摘要。

表4 提供用於qRT-PCR試驗之引子摘要。表 1.

Claims

一種用於維持並保持混合細胞群之補釘移植物，包含： (a) 一具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由水凝膠中之培養液所支持，該水凝膠具有足以允許該混合群在該補釘移植物中移動或移動遠離該補釘移植物的黏彈性；以及 (b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往該背襯或屏障之方向上移動的黏彈性，該補釘移植物配置為可維持並保持該混合群，同時抑制該至少一早期譜系細胞種類進行分化，或更進一步成熟為無法表現膜結合型及/或分泌型MMPs的晚期譜系階段。
如請求項1之補釘移植物，其中該背襯包含一注入有水凝膠之多孔網狀物。
如請求項1之補釘移植物，更包含： (c)覆蓋於該背襯之一漿膜表面之水凝膠，該漿膜表面位於該混合群所接觸表面的對面。
如請求項1之補釘移植物，其中該元件(a)之水凝膠包含一或多種玻尿酸。
如請求項2之補釘移植物，其中該元件(b)之水凝膠包含一或多種玻尿酸。
如請求項3之補釘移植物，其中該元件(c)之水凝膠包含一或多種玻尿酸。
如請求項1之補釘移植物，其中該培養液包含Kubota培養液。
如請求項1之補釘移植物，其中該混合群包含間質細胞與上皮細胞。
如請求項8之補釘移植物，其中該間質細胞包含早期譜系階段間質細胞(ELSMCs)。
如請求項9之補釘移植物，其中該ELSMCs包含一或多種血管新生細胞、內皮細胞之前驅細胞，或星狀細胞之前驅細胞，或間質幹細胞(MSCs)。
如請求項8之補釘移植物，其中該上皮細胞包含上皮幹細胞。
如請求項12之補釘移植物，其中該上皮細胞包含膽系幹細胞 (BTSCs)。
如請求項8之補釘移植物，其中該上皮細胞包含定型及/或成熟上皮細胞。
如請求項13之補釘移植物，其中該定型及/或成熟上皮細胞包含成熟實質細胞。
如請求項14之補釘移植物，其中該成熟實質細胞包含肝細胞、膽管細胞與胰島細胞之一或多者。
如請求項8之補釘移植物，其中該間質細胞與上皮細胞皆包含幹細胞。
如請求項9之補釘移植物，其中該混合群包含自體及/或同種異體細胞。
如請求項1之補釘移植物，其中一或多種細胞種類係經基因修飾。
如請求項1之補釘移植物，其中該背襯包含多孔網狀物、支架或膜。
如請求項1之補釘移植物，其中該背襯包含絲、羊膜、胎盤、網膜、合成紡織品或其組合。
一種將細胞植入目標組織之方法，包含將該目標組織與一補釘移植物接觸，該補釘移植物包含: (a) 一具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由水凝膠中之培養液所支持，該水凝膠具有足以允許該混合群移向及移入目標組織的黏彈性；以及 (b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群移動遠離目標組織及通過該背襯或屏障的黏彈性。
如請求項21之方法，更包含允許該補釘移植物內含之細胞整合入該組織中。
如請求項21之方法，其中該目標組織選自於由肝臟、胰臟、膽系、甲狀腺、胸腺、胃腸、肺臟、前列腺、乳房、腦、膀胱、脊髓、皮膚、子宮、腎臟、肌肉、血管、心臟、軟骨、肌腱和骨骼組織組成之群組。
如請求項23之方法，其中該目標組織為肝臟組織。
如請求項23之方法，其中該目標組織為胰臟組織。
如請求項23之方法，其中該目標組織為膽系組織。
如請求項23之方法，其中該目標組織為胃腸組織。
如請求項23之方法，其中該目標組織為腎臟組織。
如請求項23之方法，其中該目標組織為一器官。
如請求項29之方法，其中該器官為肌肉骨骼系統、消化系統、呼吸系統、泌尿系統、女性生殖系統、男性生殖系統、內分泌系統、循環系統、淋巴系統、神經系統或皮膚系統之器官。
如請求項29之方法，其中該器官選自於由肝臟、胰臟、膽系、甲狀腺、胸腺、腸、肺臟、前列腺、乳房、腦、膀胱、脊髓、皮膚、子宮、腎臟、肌肉、血管、心臟、軟骨、肌腱和骨骼組成之群組。
一種治療患有肝臟疾病或病症之個體的方法，該方法包含將該個體之肝臟與一補釘移植物接觸，該補釘移植物包含 (a)一具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由水凝膠中之培養液所支持，該水凝膠具有足以允許該混合群移向及移入目標組織的黏彈性；以及 (b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往遠離該目標組織及通過該背襯或屏障之方向上移動的黏彈性，以及允許該補釘移植物內含之細胞整合入該肝臟中，因而復原某些肝功能。
如請求項32之方法，其中該肝臟疾病或病症為肝纖維化、肝硬化、血色素沉著症、肝癌，膽道閉鎖、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、病毒性肝炎、自體免疫性肝炎、肝蛭症、酒精性肝病、a1-抗胰蛋白酶缺乏症、第II型肝醣儲存症、轉甲狀腺素蛋白-相關之遺傳性澱粉樣變性、吉爾伯特症候群(Gilbert’s syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、布加症候群(Budd-Chiari syndrome)、肝外傷，或威爾遜氏症(Wilson disease)。
一種治療患有胰臟疾病或病症之個體的方法，該方法包含將該個體之胰臟與一補釘移植物接觸，該補釘移植物包含 (a) 一具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由水凝膠中之培養液所支持，該水凝膠具有足以允許該混合群移向及移入目標組織的黏彈性；以及 (b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往遠離該目標組織及通過該背襯或屏障之方向上移動的黏彈性，以及允許該補釘移植物內含之細胞整合入該胰臟中，因而復原某些胰臟功能。
如請求項34之方法，其中該胰臟疾病或病症為糖尿病、胰外分泌功能不全、胰臟炎、胰臟癌、歐蒂氏括約肌功能障礙(sphincter of Oddi dysfunction)、囊性纖維化、胰臟分裂症、環狀胰臟、胰臟外傷或胰血管炎(hemosuccus pancreaticus)。
一種治療患有胃腸疾病或病症之個體的方法，該方法包含將該個體之腸與一補釘移植物接觸，該補釘移植物包含(a)一具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由水凝膠中之培養液所支持，該水凝膠具有足以允許該混合群移向及移入目標組織的黏彈性；以及 (b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往遠離該目標組織及通過該背襯或屏障之方向上移動的黏彈性，以及允許該補釘移植物內含之細胞整合入該腸中，因而復原某些腸功能。
如請求項36之方法，其中該胃腸疾病或病症為腸胃炎、腸胃癌、迴腸炎、發炎性腸病、克羅恩氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、腸躁症後群、消化性潰瘍病、乳糜瀉、纖維化、血管發育不良、先天性巨結腸症(Hirschsprung’s disease)、假膜性結腸炎或胃腸外傷。
一種治療患有腎臟疾病或病症之個體的方法，該方法包含將該個體之腎臟與一補釘移植物接觸，該補釘移植物包含(a) 一具有二或多種細胞種類之混合群，其中至少一種處於可表現膜結合型及/或分泌型基質金屬蛋白酶(MMPs)之早期譜系階段，該混合群由水凝膠中之培養液所支持，該水凝膠具有足以允許該混合群移向及移入目標組織的黏彈性；以及 (b) 一包含生物相容性、生物可分解材料的背襯，其具有足以抑制該混合群往遠離該目標組織及通過該背襯或屏障之方向上移動的黏彈性，以及允許該補釘移植物內含之細胞整合入該腎臟中，因而復原某些腎功能。
如請求項38之方法，其中該腎臟疾病或病症為腎炎、腎病、腎炎症候群、腎病症候群、慢性腎病、急性腎損傷、腎外傷、囊性腎病、多囊腎病、腎小球腎炎、IgA腎病、狼瘡腎炎、腎癌、歐珀特症候群(Alport syndrome)、澱粉樣變性、古德帕斯特症候群(Goodpasture syndrome)或韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)。